MXPA03004127A - Plaguicida biologico a base de quitosano y nematodos entomopatogenos. - Google Patents

Abstract

Plaguicida biologico que contiene quitosano y nematodos entomopatogenos. La invencion consiste en una nueva formulacion plaguicida, bioestimulante y con efectos funguicidas que une la accion de bioestimulacion por parte del quitosano a la de control biologico de plagas en cultivos agricolas y forestales debida a insectos fitopatogenos, por parte de nematodos entompatogenos de las familias Steinernematidae y Heterohabditidae. Hay una accion sinergica entre el bioestimulante y el plaguicida biologico debido a la accion de bacterias simbioticas de los generos Xenorhabdus y Photorhabdus que portan los nematodos de estas familias. La accion anteriormente mencionada se ve potenciada sinergicamente por el efecto bioestimulante del quitosano sobre las plantas, al favorecer el desarrollo radicular y su grado de lignificacion y provocar la elicitacion de genes productores de fitoalexinas.

Description

Plaguicida biológico a base de quitosano y nemátodos entomopatógenos CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención trata sobre el control de insectos-plaga,. empleando agentes biológicos, nemátodos entomopatógenos, y un compuesto activo: quitosano, se mejora y se aumenta asi la resistencia de los cultivos a las plagas, enfermedades y su supervivencia en condiciones ambientales adversas, obteniendo unas mejoras en el crecimiento y rendimiento de dichos cultivos.

ESTADO DE LA TÉCNICA La protección de cultivos juega un papel vital e integral en la producción agrícola contemporánea. La exigencia de rendimientos cada vez mayores y las previsiones de una producción insuficiente para satisfacer la demanda futura ha dado lugar a la optimización de las prácticas agrícolas respetuosas con el medio ambiente en todo el mundo. El intento de satisfacer la creciente demanda ha aumentado el riesgo de daños por plagas y la necesidad de reprimir las mismas.

En la actualidad, la producción de cultivos en estos sistemas agrícolas se basa casi exclusivamente en la utilización de productos fitosanitarios químicos. El carácter no selectivo de los plaguicidas afecta negativamente al equilibrio entre las plagas agrícolas. Por lo tanto existe aún la necesidad de proporcionar un método de protección de cultivos mejor y más eficaz. Se calcula que un 37% de la producción agrícola mundial se pierde debido a plagas y enfermedades. Por razones ecológicas y por la cada vez mayor importancia comercial de la agricultura ecológica, existe una demanda creciente de productos naturales, no tóxicos, biodegradables y de lucha biológica. Las plantas no tienen sistema inmunológico, como tal, pero en su evolución han adquirido un sistema de defensa activo que implica la activación de genes defensivos de las plantas hospedantes. Dichos genes pueden producir cambios físicos y bioquímicos. Por ejemplo, pueden cambiar las propiedades de la pared celular de la planta. Se incluye como ejemplos de este tipo de cambios la acumulación de glicoproteinas con alto contenido de hidroxiprolina1,2, la lignificación y suberización3, la deposición callosa4,5,6 y la acumulación de compuestos fenólicos7' 8. Además la activación de estos sistemas defensivos puede dar lugar a la biosíntesis y acumulación de fitoalexí as , compuestos antimicrobianos tóxicos para bacterias y hongos9, 10' u' 1 , y a la liberalización de oligosacáridos de origen animal inductores de la respuesta a ataques de patógenos, una nueva clase de proteínas llamadas "proteínas relacionadas con la patogénesis" o proteínas Ri3,i4,i5,i6_ Entre los compuestos antimicrobianos inducidos contra patógenos fúngicos están las enzimas líticas quitosanasa y beta-1 , 3-glucanasa . Estas enzimas digieren el quitosano y la glucosamina, constituyentes principales de la pared de varios patógenos fúngicos15,16. Asimismo están implicadas en la resistencia de las plantas a los ataques de insectos, ya que el quitosano está presente de forma mayoritaria en el exoesqueleto de los mismos. Los fragmentos resultantes de esta lisis enzimática pueden inducir la biosíntesis por el hospedante de metabolitos de respuesta al estrés. Por lo tanto, estas enzimas parecen estar implicadas en la señalización al hospedante, además de en la degradación del patógeno Los nemátodos entomopatógenos son un grupo de invertebrados no segmentados, con Aparato Excretor, Sistema Nervioso, Aparato Reproductor y Sistema Muscular.

El orden de mayor interés por su eficacia para el control de insectos es el orden Rhabditida, donde muchos de los miembros son parásitos de insectos. Destacando entre ellos las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae20.

Los nemátodos poseen un ciclo de vida simple que incluye: el huevo, cuatro estadios juveniles (separados entre si por mudas) y los adultos. Es decir: huevo, Ll, L2, L3 (infectivo juvenil), L4 y adultos (machos y hembras). El estadio juvenil (L3) se denomina infectivo juvenil o larva "dauer", que presenta la peculiaridad de ser resistente a condiciones ambientales adversas qracias a una cutícula que desarrollan. Los infectivos juveniles transportan en su intestino bacterias simbióticas, sirviendo de este modo como "transportadores de la bacteria" entre un hospedante y el otro21. Los nemátodos entomopatóqenos de la familia Steiner-nematidae y Heterorhabditidae son aplicados para el control biológico de un amplio espectro de insectos plaga, debido a que los infectivos juveniles "IJ" penetran en el hospe-dador a través de diferentes orificios naturales del mismo. En el interior del hospedador liberan una bacteria simbiótica (Xenorhabdus o Photorhabdus , dependiendo de la especie de nemátodo que se trate) que ocasiona la muerte del insecto diana por septicemia2C . Las bacterias para favorecer su desarrollo durante la infección del insecto, producen una serie de antibióticos y metabolitos secundarios que inhiben el crecimiento de otras bacterias y hongos. Asimismo, también produce quitosanasas que favorecen la asimilación del quitosano por parte de la planta22. Una vez eliminada la plaga, son nota-bles los efectos bioestimulantes debido a la movilización del quitosano. Sin embargo la aplicación en la actualidad de plaguicidas biológicos presenta como principal limitación la lenta o nula recuperación de los cultivos agrícolas dañados. Es decir, los efectos producidos sobre los tejidos por parte de la plaga, una vez combatida esta por el plaguicida biológico, hacen que la recuperación de los cultivos agrícolas enfermos sea complicada o muy lenta y una fuente de entrada de enfermedades como Fusarium, Verticilium, Phytopthora. La presente invención pretende solucionar este problema mediante la selección de un compuesto regenerador de los tejidos dañados y que, a su vez, sea inocuo o incluso beneficioso, para que el plaguicida biológico pueda ser almacenado y aplicado conjuntamente con él, sin que pierda su efecto plaguicida.

Definiciones Nemátodos entomopatógenos : nemátodos que son parásitos de una o más especies de insectos.

Infectivo juvenil (IJ): etapa del ciclo biológico (L3) del nematodo que invade e infecta a un determinado insecto. Está constituido por boca, ano con la apertura cerrada, esófago, intestino colapsado y la cola en punta. Su longitud varia aproximadamente entre 400 a 800 mieras y su anchura de 20 a 40 mieras dependiendo de la especie de nematodo que se trate. Poseen una cubierta exterior llamada camisa que les protege de las condiciones ambientales adversas y como reserva para permanecer en el campo hasta la captura de un hospedador.

Contaminación Plantas, suelos o materiales agricolas infectados por plagas, de insectos o sus larvas.

Grado polarimétrico : es la forma de medir la producción de azúcar comercial que se extraerá por tonelada de tubérculo de remolacha.

Eficacia : Se mide como el porcentaje (%) de insectos muestras frente a testigos.

Steinernematidae y Heterorhabditidae Los miembros de estas dos familias son parásitos obligados y patógenos de insectos. Se trata de nemátodos incoloros y segmentados que presentan la siguiente clasificación taxonómica: Phylum: Nematoda Clase: Secernentea Orden: Rhabditida Suborden: Rhabditina Superfamilia : Rhabditoidea Familias: Steinernematidae y Heterorhabditidae Dentro de la familia Steinernematidae se halla el género Steinernema (Travassos) (=Neoaplectana, Steiner) , en el que se encuentran las siguientes especies de interés comercial: Steinernema carpocapsae (Weiser) , Steinernema feltiae (Filipjev) , Steinernema scapterisci (Nguyen y Smart) , Steinernema glaseri (Steiner) y Steinernema riobravis ( Cabanillas, Poinar y Raulston) . Por otro lado en la familia Heterorhabditidae se encuentra el género Heterorhabditis cuyas especies de interés comercial son: Heterorhabditis bacteriophora (Poinar) y Heterorhabditis megidis (Poinar, Jackson y Klein) . Steinernema y Heterorhabditis están simbióticamente asociados con bacterias del género Xenorhabdus (Thomas y Poinar) y Photorhabdus (Boemare et al.) respectivamente. Ese complejo nematodo/bacteria puede ser cultivado in vivo e in vitro a gran escala y los estadios infectivos (L3 ó IJ) pueden ser almacenados por largos periodos, conservando su capacidad infectiva y posteriormente pueden ser aplicados a través de los métodos agronómicos convencionales empleados con insecticidas quimicos20. Steinernema y Heterorhabditis presentan distintas formas dependiendo de los estadios y sexo que presenta a lo largo de su ciclo biológico23.

Estos nemátodos presentan un amplio rango de hospedadores , la mayor parte de ellos en algún momento de su ciclo de vida permanecen en el suelo, asimismo también son susceptibles1 insectos que no habitan el suelo en ningún momento de su ciclo de vida. La mayor parte de insectos susceptibles pertenecen a los órdenes: Lepidóptera (como por e emplo) : -Chilo spp . , -Gallería mellonella, -Spodoptera littoralis, -Pieris rapae, -Melolontha melolontha, -Agrotis segetum, -Thaumetopoea pytiocampa, -Zeuzera pyrina Coleóptera (como por ejemplo) : -Vesperus xatarti, -Cosmopolites sordidus, -Capnodis tenebionis, -Cleonus mendicus También son susceptibles órdenes: Diptera (como por ejemplo) : -Ceratitis capitata, -Bemisia spp, -Trialeudores vaporarium, -Liriomyza trifolii Acari (como por ejemplo) : -Boophilus pinniperda, -Dermacentor vaviabilis, -Amblyoma cajennense Heteróptera (como por ejemplo) -Dysdercus peruvianus) Homóptera (como por ejemplo) : -Dysmicoccus vaccini Isóptera (como por ejemplo) : -Reticulotermes spp., - alotermes flavicollis, -Glyptotermes dilatatus Gastrópoda (como por ejemplo) : -Deroceras reticulatum) , Orthóptera (como por ejemplo) : -Locusta migratoria, -Melanoplus sanguinipes, -Scapteriscus vicinus Ixódida (como por ejemplo) : -Ripicephalus sanguineus Blatodea (como por ejemplo) : -Periplaneta brunne) Hymenóptera (como por ejemplo): -Tirathaba rufivena, -Elasmopalpus lignosellu -Hoplocampa testudínea Otras especies a las que los nemátodos parasitan son: Especies Acalyma vittatum Chilo spp Acrolepia assectela Choristeneura occidentalis Adoryphorus couloni Cirphis compta Agrotis ípsilon Conopia myopasformis Agrotis palustris Conorhynchus mendicus Agrotis segetum Cosmopolites sordidus Amyelois transitella Costrelytra zealandica Anabrus simplex Curalio caryae Anómala spp. Cyclocephala borealis Anoplophora Cydia pomonella malasiaca Apriona cinérea Cydocephala hirta Blastophagus Cylus formicarius pinniperda Boophilus annulatus Dacus cucurbitae Bradysia coprophila Delia antiqua Capnodis tenebrionis Delia floralis Carpocapsa pomonella Delia platura Carposina Delia radicum nipponensis Castnia dedalus Dendroctonus frontalis Cephalcia abietis Dermacentor vaviabilis Cephalcia Deroceras reticulatum lariciphila Ceratitis capitata Diabrotica balteata Ceuthorrynchus napi Diabrotica barberi Diabrotica Limonius califormicus virginifera Diaprepes Liriomyza trifolii abbreviatus Dysdercus peruvianus Listronotus orej onensis Dysmicoccus vaccini Locusta migratoria Earias insulana Lycoriella auripila Eldana spp. Maladera motrica Galería melonella Manduca sexta Germán cockroach Megaselia halterata Glyptotermes Melanoplus sanguinipes dilatatus Grapholita funebrana Migdolus spp. Grapholita molesta Monochanus alternatus Graphonathus Musca domestica peregrinus Helicoverpa zea Nemocestes incomptus Heliothis armígera Oamona hirta Heliothis zea Operhoptera brumata Hylenia brasicae Opogona sacchari Hylobius abietia Ostrinia nubilalis Hylobius Otiorhynchus ovatus trans erso ittatus Hypantria cunea Otiorhynchus sulcatus Ixodes scapularis Pachnaeus litus Ixodid ticks Panisetia marginata Laspeyresia Pantomorus spp. pomonella Leptinotarsa Pectinophora decenlineata gossyprella Periplaneta brunnea Strobilomyia appalachensis Phlyctinus callosus Thaumetopoea pytiocampa Phyllotreta Tirathaba rufivena cruciferae Phylophaga spp. Tornicus pinniperda Pieris rapae Tryporysa incertulas Platiptilia Vietacea polistiformis carduidactyla Plutella xylostella Wiseana copularis Polyphylla spp. Zeiraphera canadensis Pseudaletia separata Zeusera pyrina Pseudexentera malí Zophodis grossulatariata Psylliodes Phyllonictis citrella chrysocephala Pyrrbalta luteola Xylotrechus arvícola Rhipicephalus Trialeudores sanguineus vaporarium Rhizotropus majalis Melolontha melolontha Rhyacionia buolinana Típula paludosa Rhyacionia frustrana Blatella germánica Rusidrina depravata Vespula spp Scapteriscus vicinus Lixus spp Sitoma lineatus Reticulitermes lucifugus Sitona discoideus Parapediasia teterrella Sphenophorus Fumibotys fumalis parvulus Spodoptera exigua Bemisia spp Spodoptera litura Longitarsus waterhorsei Bibliografía 1) Esquerre - Tugaye, M. T., Lafitte, C, Mazau, D. , Toppan, A-, and Tonse, a., Plant physiol.64, 320 - 326 (1979). 2) Showalter, A. M. , Bell, J.N., Craver, C.L., Bailery, J.A. , Varner, J.E. And Lamb, C.I., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82, 6551 - 6555 (1985). 3) Vanee, CP., Kirt, T.K., and Sherwood, R.T., Espelie, K.E., Francheschi, V.R., and Kolattukdy, P.E.; Plant Physiol. 81, 487 - 492 (1986) 4) Ride, J.P.; In Biochemical Plant Pathology (Ed.

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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las cepas de nemátodos entomopatogenos: Las cepas de nemátodos entomopatogenos que se utilizan están aisladas en la Península Ibérica, Canarias, Baleares y otros países del mundo , esto es fundamental debido a que estas cepas se encuentran mejor adaptadas a las condiciones de los ecosistemas edáficos en el que se desarrolla su ciclo biológico. Por otra parte existen en nuestra legislación normas que regulan la introducción de organismos no autóctonos que pudieran romper el equilibrio ecológico y que establecen la necesidad de realizar los correspondientes estudios del impacto ambiental que supondría su introducción. Estas especies de nemátodos se encuentran en otros puntos del resto de los continentes, también aislados por nosotros5. Dichas cepas fueron sometidas a bioensayos para establecer su patogenicidad . Los bioensayos consistían en exponer larvas de Gallería mellonella a infectivos juveniles de distintas cepas. La invención se basa en el hecho de que los nemátodos Steinernema y Heterorhabditis pueden vivir con normalidad en soluciones de quitosano. De esta forma el nematodo lleva a cabo su acción contra la plaga que afecta a los cultivos agrícolas-forestales y, además, impide el desarrollo futuro de bacterias y hongos fitopatógenos aumentando la resistencia de la planta a los mismos y colaborando también en la asimilación del quitosano por parte de la planta. La acción del bioestimulante consiste, por una parte, en ayudar a regenerar los tejidos dañados. Además aumenta el desarrollo del sistema radicular, fortalece el grado de lignificación, reduce la deshidratación y por último ejerce un efecto fungistático . La acción sinérgica de plaguicida y bioestumulante consiste en inducir en la planta una secreción secundaria de lignina, giberelinas y fitoalexinas , lo que acelera su desarrollo y fortaleza, una vez erradicada la plaga que le afectaba. Todos estos efectos positivos conllevan a un aumento en calidad y rendimiento del cultivo sin efectos pe judiciales para el medio ambiente.

Acción sinérgica quitosano-nemátodos entomopatógenos Cuando una planta es atacada por una plaga, lo esencial es eliminarla, pero también hay que tener en cuenta las lesiones y efectos secundarios (carencias, estrés, posibles infecciones o re-infecciones...) que la plaga ha ocasionado. La novedad de la combinación de un insecticida biológico con un estimulante del crecimiento hace que el tratamiento dirigido a plagas sea sorprendentemente más efectivo . Por un lado el nemátodo entomopatogeno mata y elimina eficazmente la plaga. Asimismo la bacteria que lleva asociada, durante el proceso de infección del insecto hospedador, comienza a liberar una serie de metabolitos tales como enzimas quitinoliticas22 y antibióticos26. La acción quitinolitica de las enzimas liberadas por la bacteria hace que el proceso de asimilación del quitosano por parte de la planta sea más rápido, dado que dichas enzimas actúan rompiendo los polímeros de N-acetil-glucosamina a moléculas (monómeros y dimeros de azúcares N-acetilados) más fácilmente asimilables por la planta. Por otro lado la actividad antifúgica del quitosano se ve coadyuvada por la actividad antimicótica de dichas enzimas, y la actividad de los compuestos antibióticos liberados por la bacteria inhiben la proliferación de posibles microorganismos patógenos facultativos. Todo esto hace que el proceso de recuperación de la planta promovido por el quitosano sea aun más rápido y eficaz. Dentro de la composición del quitosano se encuentran ciertos iones, como el Mn(II) y el Mg. Se ha comprobado que en concreto estos dos estos iones producen una estimulación química en los nemátodos entomopatógenos aumentando su patogenicidad y su productividad27. La combinación de nemátodos entomopatógenos con quitosano tiene los siguientes efectos biológicos: • Los nemátodos entomopatógenos eliminan la plaga, impiden el desarrollo de posibles bacterias y hongos fitopatógenos mientras que su bacteria simbionte colabora en la asimilación del quitosano. • Los iones Mg y Mn(II) que lleva el quitosano estimulan químicamente la patogenicidad y productividad del nematodo. • El quitosano aumenta el desarrollo del sistema radicular, fortalece significativamente el vigor y el grado de lignificación de las plantas, ejerce un efecto fungistático y reduce la deshidratación post- transplante en especies de semillero y/o t ransplante .

• La actuación sinérgica de los nemátodos entorno- patógenos con el quítosano induce que la planta de forma secundaria segregue lignina, giberelinas y fitoalexinas para su desarrollo y fortalecimientos.

Formulación Contiene el nematodo entomopatógeno, preferentemente de los géneros Steinernema o Heterorabditidae, en una concentración de 1.000-2,000.000 por m2 de superficie a tratar. El nematodo se disuelve en una solución de quitosano de una viscosidad (medida a 25°C, en una concentración al 1%, en Ac. Acético 1%, en un viscosimetro Brookfield) entre 150-2000 cps . , preferentemente 150-450 cps, y más preferentemente 200-250 cps, con un grado de desacetilación (DAC) entre el 50-99%, preferentemente 65-99% y a una concentración entre el 0.06-0.25%, preferentemente entre el 0.08-0.18%, en un ácido débil (acético, adipico, cítrico, fórmico, láctico, málico, oxálico, pirúvico, tartárico, o similar) a concentración 0,5-10% (v/v) , ajusfando el pH a un rango de 4-7 con una base (hidróxido sódico, carbonato sódico, hidróxido potásico, etc.). Esta formulación contiene iones Mn (II) y Mg en rangos 1-400 ppm y 1-200 ppm, respectivamente.

Forma de aplicación La forma de aplicar este producto biológico en el campo puede realizarse por distintos métodos, según sea el cultivo, entendiendo que las formas de aplicación ni son exhaustivas, es decir, que pueden existir otras similares, ni excluyentes, por lo que pueden utilizarse sucesiva o simultáneamente sobre la misma o diferentes plantas. Los IJ pueden soportar presiones de hasta 21 atmósferas. Dado que los equipos agrícolas convencionales trabajan habitualmente a estas presiones, los nemátodos pueden ser aplicados mediante cualquiera de los métodos convencionales . Para plagas que tienen algún estadio de su ciclo de vida en el suelo la aplicación del producto se puede hacer tanto por irrigación o por inmersión radicular o cualquier sistema que cree un bulbo húmedo alrededor de la planta. Sin embargo, para plagas foliares el producto se aplica directamente sobre las partes aéreas de las plantas con los distintos sistemas convencionales agrícolas de pulverización . El quitosano forma un film que estabiliza y mejora la adhesión del agente que va con él, y además dicho film disminuye la cantidad de luz UV que llega al agente. En una aplicación foliar de nemátodos con quitosano, el quitosano actúa como agente protector contra la desecación y la acción de la luz UV, principales enemigos de los nematodos cuando éstos no se aplican en suelo. Las formas de aplicación anteriormente mencionadas no son limitativas. La solución de quitosano + nematodos de la invención puede aplicarse también como: pasta untable, en spray, etc.... Asimismo, además del quitosano y los nematodos, puede contener agentes fijadores, humectantes, hidratante, etc... Las formulaciones de la invención no son solo de aplicación en el tratamiento de plantas para prevenir o combatir plagas, pueden aplicarse a semillas, suelos o estructuras agrícolas, preferentemente de madera, de forma preventiva o en tratamientos contra la contaminación de las mismas.

Dosis y ensayos realizados Se realizaron ensayos de campo y de laboratorio en placa petri, macetas y bandejas. Dichos ensayos se realizaron conjuntamente con la empresa Aplicaciones Bioquímicas S.L., oficialmente reconocida con el número EOR28/97 por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación para la realización de ensayos oficiales cumpliendo sus protocolos y procedimientos normalizados de trabajo bajo las directivas E.P.P.O. (European Plant Protection Organization) de la Comunidad Europea.

Los ensayos se realizaron sobre familias de insectos-plaga. Se seleccionaron los ejemplos más representativos por los daños ocasionados al cultivo, no siendo excluyentes otros insectos de la misma familia.

En todos los ejemplos se han empleado soluciones de quitosano cuya composición es del 1.25%, con un grado de deacetilación DAC del 70%, disuelto en ácido acético al 1%, el pH es del 4.9. Estas soluciones se aplican diluidas.

En todos los ejemplos el nematodo que se utilizó fue Steinernema spp., excepto en los ejemplos X, XI, XII y XIV que se usó Heterorhabditis spp. Con el término spp. agrupamos todas las especies presentes en dicho género.

El quitosano contiene de forma natural iones de Mn y g en proporciones de 5 y 7 ppm respectivamente que actúan como activadores de la patogenicidad del nematodo (no obstante estos iones en forma de sales comerciales se pueden añadir a a) .

En los cultivos en placa Petri se sigue la técnica descrita por Kaya & Stock (Ejemplo III) . La concentración de larvas utilizadas fueron 20/placa, excepto en el ejemplo V que se utilizaron 100 larvas/placa. En macetas utilizamos un sustrato de 50% vermiculita y 50% de tierra estéril y la concentración de las larvas fueron 20 larvas/macetas en todos los casos.

Todos los ejemplos están sujetos a las normas EPPO que describen el diseño estadístico y evaluaciones de los ensayos realizados. El aumento de producción lo medimos en Kg de peso. El término recuperación lo empleamos cuando comenzamos a observar la cicatrización de los daños ocasionados por la plaga.

Los agentes fijadores, humectantes e hidratantes que se pueden utilizar en la invención se podrían englobar en el término de coadyuvantes de uso general en agricultura. Como ejemplo: aceite mineral parafínico, ácido propiónico, alquilamidas grasas, ceras, dioctil sulfosuccinato sódico, resinas, látex sintético, ácidos grasos, tensioactivos iónicos y no iónicos, abonos, fertilizantes.

Las sales de Mn y Mg son de uso común en agricultura y se encuentran en diversas formas comerciales, como por ejemplo, agentes complejantes (ácido lignosulfónico) y agentes quelatantes (EDTA) y soluciones de fosfito de Mn o Mg 2-13%) .

Se aplicó el producto disuelto en agua como vehículo de aplicación mediante distintos sistemas: riego por goteo, inmersión radicular, pulverización...

Se han realizado varios ensayos con distintos tipos de plaga y de cultivo. En todos los ensayos la dosis de quitosano aplicada fue de 50cc de una solución de quitosano/1.000.000 nemátodos.

Los resultados obtenidos en dichos ensayos fueron los siguientes : EJEMPLO I: El producto se aplicó en frutales de hueso (cerezos, albaricoqueros, ciruelos,...) afectados por Capnodis tenebrionis (Coleóptero) mediante distintos sistemas: riego por goteo, mochilas de inyección y pocetas alrededor de las raices del árbol. Las dosis empleadas fueron: 300.000 nemátodos/árbol, 500.000 nemátodos/árbol, 1.000.000 nemátodos/árbol y 2.000.000 nemátodos/árbol, algunas de ellas combinándolas con una solución de quitosano. La temperatura del suelo rondaba los 25°C. La eficacia sobre la mortalidad obtenida fue del 75%, 90%, 100% y 100% respectivamente, en comparación con los testigos, no encontrándose diferencias en el método de aplicación. También se comprobó que en los árboles en los que no se añadió quitosano la recuperación de las lesiones ocasionadas por la plaga comenzó a los 8 meses, por el contrario la cicatrización de las lesiones en árboles tratados con quitosano comenzó a los 30 días. Además se consiguió un aumento de media en la producción de un 32% (en kg) .

EJEMPLO II: Se trataron cítricos, afectados por Phyllonictis citrella mediante pulverización sobre las hojas. Las dosis empleadas fueron de 500.000 nemátodos/árbol y 1.000.000 nemátodos/árbol, combinándolos con una solución de quitosano. La temperatura ambiental oscilaba los 27°C y había una humedad relativa alta. Se obtuvo una eficacia sobre la mortalidad del 85% y del 100% respectivamente, comparándolos con los testigos, tanto sobre larvas como sobre adultos. Los brotes nuevos de las ramas continuaron su normal desarrollo.

EJEMPLO III: Por un lado se trataron cuadros de colmenas de abejas afectadas por la plaga Gallería mellonelal (Lépidóptera) , y por otro larvas en placas petri con papel de filtro (Kaya, H.K., Stock, P., Chapter VI Manual of techniques in insect nematology, Laurence Lacey Ed., Biological Technique series, p. 281-324, 1997, Academic Press) en el laboratorio. El producto se aplicó mediante pulverización a una dosis de 5.000.000 nemátodos/colmena y a dosis de 100 nemátodos /larva en placas con 20 larvas cada una, combinándolo en ambos casos con una solución de quitosano. La temperatura se mantuvo entre 23-27°C y con una humedad relativa de entre el 80-90%. Se obtuvo una eficacia sobre la mortalidad de G. mellonella del 90% en los cuadros de las colmenas y del 100% en las placas petri, comparándolos con cuadros y placas testigos.

EJEMPLO IV: Se trataron macetas y placas petri con papel de filtro (Kaya, H.K., Stock, P., Chapter VI Manual of techniques in insect nematology, Laurence Lacey Ed., Biological Technique series, p. 281-324, 1997, Academic Press) en el laboratorio con larvas de Melolontha melolontha (Lepidóptera ) . Las macetas, con 20 larvas cada una, contenían tierra estéril 50% mezclada con vermiculita 50%, con una humedad relativa del 80-90% y una temperatura entre 20-28°C. Se aplicó una dosis en maceta de 300.000 nemátodos/maceta y de 100 nemátodos/larva en las placas petri (cada una con 20 larvas), combinándolos en todos los casos con una solución de quitosano. Se obtuvo una eficacia, sobre la mortalidad de larvas del 100% en ambos casos, respecto a las macetas testigos, al cabo de 12 días en las macetas y de 5 dias en las placas petri.

EJEMPLO V: Se trataron viñas afectadas por alotermes flavicollis (Isóptera) empleando distintos métodos de aplicación: pulverización sobre el tronco, inyección alrededor de las raíces y microinyección en el tronco. Las dosis empleadas fueron de 1.000.000 nemátodos/cepa y de 2.000.000 nemátodos/cepa. En todas las aplicaciones se- empleó conjuntamente con una solución de quitosano. La temperatura oscilaba entre los 23-28°C. La eficacia sobre la mortalidad de K. Flavicollis que se obtuvo fue: - Pulverización a 1.000.000 nemátodos/cepa: 90% - Pulverización a 2.000.000 nemátodos/cepa: 95% - Inyección a 1.000.000 nemátodos/cepa: 80% - Inyección a 2.000.000 nemátodos/cepa: 95% - Microinyección en el tronco a 1.000.000 nemátodos/cepa: 90% - Microinyección en el tronco a 2.000.000 nemátodos/cepa: 95% También se hicieron pruebas en placas petri papel de filtro y 100 de estos isópteros, pulverizándolas con nemátodos en una dosis proporcional a la superficie de la placa, consiguiéndose una eficacia del 100% al cabo de 5 días . El orden Isóptera tiene la propiedad de la "trofalaxia" , produciéndose así un efecto en cadena por todo el termitero y sus partes afectadas, llegando a la reina para matarla y así romper la cadena social del termitero, acabando definitivamente con él.

EJEMPLO VI: Se aplicó el producto en plataneras afectadas por Cosmopolites sordidus de diferentes maneras: microaspersión, inyección con mochila y por aplicación sobre trampas con feromonas. Las dosis empleadas fueron: 500.000 nemátodos/árbol, 1.000.000 nemátodos/árbol y 1.500.000 nemátodos/árbol, todas ellas combinadas con una solución de quitosano. Con una temperatura que osciló entre 20-28°C y la humedad relativa entre el 70%-80%. La eficacia sobre la mortalidad de C. sordidus obtenida fue de: - Microaspersión a 500.000 nemátodos/árbol: 80% - Microaspersión a 1.000.000 nemátodos/árbol: 90% - Microaspersión a 1.500.000 nemátodos/árbol: 100% - Inyección por mochila a 500.000 nemátodos/árbol: 80% - Inyección por mochila a 1.000.000 nemátodos/árbol: 95% - Inyección por mochila a 1.500.000 nemátodos/árbol: 100% Sobre las trampas con feromonas a 500.000 nemátodos/árbol: 95% Sobre las trampas con feromonas a 1.000.000 nemátodos/árbol: 100% Sobre las trampas con feromonas a 1.500.000 nemátodos/árbol: 100% En los testigos las plantas cedían al peso de la piña de plátanos por el daño ocasionado por el picudo en la base del tallo. En las plantas tratadas sin embargo, esto no se observó .

EJEMPLO VII: Se trataron macetas que contenían 10 larvas de Capnodis tenebrionis y 10 de Gallería mellonella. Esta prueba pretendía comprobar a que altura podría subir el nematodo en busca de un hospedador. La maceta contenía tierra y vermiculita. Se añadieron nemátodos a una dosis de 100.000 nemátodos/maceta . Se colocó una malla por la cual podían pasar los nemátodos pero no las larvas de Capnodis. Esta malla se puso a unos 20-35cm de altura, echando a continuación tierra con las larvas. Manteniendo un alto grado de humedad en la maceta y con temperatura ambiental entre 23-26°C, se observó que el producto tuvo una eficacia del 100% (larvas muertas respecto a testigo) al cabo de 20 días. Concluyendo que dichos nemátodos perciben estímulos de las larvas (exudados, CO2 emitido, e incluso la propia temperatura corporal) a una distancia de hasta lm de longitud .

EJEMPLO VIII: Se aplicó el producto en viñas de uva de mesa atacadas por Vesperus xatarti por inyección sobre el goteo con una dosis de 1.000.000 nemátodos/árbol, combinándolo con quitosano. Se mantuvo una humedad con el riego habitual en el bulbo de las raíces y la temperatura rondó los 27°C. La eficacia que se obtuvo fue del 100% (insectos muertos respecto a testigo) controlándose la plaga y consiguiéndose un aumento en la producción de fruto en cada cepa.

EJEMPLO IX: Se trataron viñas atacadas por Xylotrechus arvicola.

La aplicación se realizó por distintos métodos, combinándolos todos con quitosano. Los resultados fueron: - Aplicación por pulverización a una dosis de 750.000 nemátodos/cepa, se obtuvo una eficacia del 75% (insectos muertos respecto a testigo) . - Aplicación por pulverización a una dosis de 750.000 nemátodos/cepa, con una dosis de recuerdo de 750.000 nemátodos/cepa al mes siguiente, se obtuvo una eficacia del 85% (insectos muertos respecto a testigo). - Microinyección sobre el tronco a una dosis de 750.000 nemátodos/cepa, se obtuvo una eficacia del 85% (insectos muertos respecto a testigo) . - Microinyección sobre el tronco a una dosis de 750.000 nemátodos/cepa, con una segunda aplicación de recuerdo de otros 750.000 nemátodos/cepa al mes siguiente, se obtuvo una eficacia del 95% (insectos muertos respecto a testigo).

En todos se observó una rápida recuperación, comenzando la cicatrización de las lesiones ocasionadas a los 30 dias. Al año siguiente se observó que brazos totalmente colapsados presentaban yemas de primavera (inicio de brotación) .

EJEMPLO X: Se trataron cultivos de hortalizas (lechuga, tomate, pimiento, zanahoria...) atacados por Agrotis segetum por pulverización sobre hojas y sobre el terreno. Se empleó una dosis de 1.000.000 nemátodos/m2, manteniendo una humedad alrededor de la planta y una temperatura que varió entre 23-28°C. La eficacia producida en el control de la plaga fue del 100% respecto al testigo tanto en las partes aéreas de la planta como en las partes subterráneas.

EJEMPLO XI: Se trataron frutales de pepita (manzano y peral) atacados por Hoplocampa testudínea. La aplicación se realizó por pulverización con una dosis de 1.500.000 nemátodos/árbol combinándose con 50 ce de la solución de quitosano por pie de planta. La eficacia en el control de la plaga que se produjo fue del 90% respecto al testigo. Esto junto a la cicatrización de heridas llevó a un aumento medio de producción del 45% (en kg) .

EJEMPLO XII: Se trataron coniferas atacadas por Thaumetopoea pytiocampa. La aplicación se realizó sobre los bolsones (por pulverización) y suelo (por irrigación) que rodeaba al árbol. Se empleó una dosis de 500.000 nemátodos/árbol en suelo y de 500.000 nemátodos/bolsón combinándolas ambas con quitosano. Se obtuvo una eficacia del 100% sobre el control de la plaga respecto al testigo. Además, el tratamiento se vio favorecido porque las larvas se desarrollan en el bolsón hasta una temperatura de 30°C, y aquellas larvas que caían al suelo desde el bolsón también resultaban infectadas por nemátodos dado que el suelo también se trató.

EJEMPLO XIII: Se trataron frutales de pepita afectados (manzano y peral) por Cossus cossus. La aplicación se realizó por inyección en el goteo a una dosis de 1.000.000 nemátodos/árbol y a una temperatura que osciló entre 24-27°C. La eficacia fue del 100% (insectos muertos respecto el testigo) al cabo de 6 meses.

EJEMPLO XIV: Se trataron cultivos industriales de remolacha azucarera atacados por Cleonus mendicus, Lixus junci y Lixus scabricollis . Se aplicó el producto combinando dos sistemas: inyección alrededor de la planta y pulverización sobre las hojas, matando tanto las larvas del suelo como los adultos de las hojas. La temperatura del suelo fue de 25°C y la ambiental de 30°C. La dosis empleada fue de 500.000 nemátodos/m2 y de 1.000.000 nemátodos/m2. La eficacia respecto al testigo sobre el control de la plaga que se produjo fue del 80% y del 95% respectivamente. Se observó un cierre de las heridas causadas por las plagas, que consecuentemente llevó a un aumento medio de producción del 10% (en kg) y de 0.75 grados polarimétricos de azúcar medidos con refractómetro .

EJEMPLO XV: Se trataron hortalizas (tomate, pimiento...) afectadas por Liriomyza trifolii. La aplicación fue por pulverización sobre las hojas combinándola con la solución de quitosano. Las dosis empleadas fueron de 250.000 nemátodos/m2, 500.000 nemátodos/m2, 1.000.000 nemátodos/m2. La eficacia sobre la mortalidad de la plaga fue del 100% en todas las dosis respecto al testigo, pero se observó que cuanto mayor era la dosis empleada más rápidamente hizo efecto, asi la dosis más alta tuvo efectividad 100% a los 2 dias, mientras que la más baja alcanzaba esa eficacia a los 6 dias.

EJEMPLO XVI: Se trataron pimientos y cultivos de algodón en campo afectados por Heliothis armígera mediante pulverización a una dosis de 500.000 nemátodos/m2 y de 1.000.000 nemátodos/m2. La temperatura ambiental del invernadero era de 30°C y la humedad del 75-80%. La eficacia fue del 100% (insectos muertos respecto al testigo) en ambas dosis.

EJEMPLO XVII: Se trataron plantas de tomate y pimiento atacadas por Trialeudores vaporariorum mediante pulverización y microaspersión . Las dosis empleadas fueron de 500.000 nemátodos/m2 y de 1.000.000 nemátodos/m2. La temperatura ambiental del invernadero era de 30°C y la humedad relativa de 85%. La eficacia sobre la mortalidad de la plaga fue del 100% respecto al testigo en ambas dosis tanto en adultos como en larvas.

EJEMPLO XVIII: Se trataron frutales de pepita (manzano y peral) afectados por Zeuzera pyrina mediante inyección sobre los taladros producidos por la plaga. Se empleó una dosis de 10.000 nemátodos/taladro, humedeciendo posteriormente. La efectividad sobre la mortalidad de la plaga fue del 80% respecto al testigo. Otro método que se usó para la aplicación fue la pulverización de ramas, tronco y hojas con sintomas. La pulverización se llevó a cabo a última hora del día para aprovechar el frescor y el rocío del amanecer. En este tratamiento la efectividad sobre la mortalidad de la plaga fue del 100% respecto al testigo.

EJEMPLO XIX: En invernaderos, los pimientos afectados por Spodoptera littoralis se trataron mediante pulverización sobre las hojas y el terreno, a una dosis de 1.000.000 nemátodos/m2 combinada con quitosano. La temperatura ambiental varió entre 25-27°C, con humedad relativa alta. La eficacia del tratamiento fue del 100% (insectos muertos respecto al testigo) al cabo de 2 meses. Se observó que los nemátodos llegaban a insectos alojados en el interior del fruto .

EJEMPLO XX: Se trataron cultivos de coliflor atacados por Pieris rapae. La aplicación del producto se realizó por pulverización sobre las plantas y el terreno. Las dosis empleadas fueron de 500.000 nemátodos/m2 y de 1.000.000 nemátodos/m2, ambas combinadas con quitosano. La temperatura ambiental era de 28°C. Al cabo de 2 meses la efectividad sobre el control de la plaga fue del 75% y del 95% respectivamente, comparada con el testigo.

EJEMPLO XXI: Se trataron manzanos atacados por Cydia pomonella. La aplicación del producto se realizó por pulverización sobre hojas y ramas, con una dosis inicial de 500.000 nemátodos/árbol y otra de recuerdo de 500.000 nemátodos/árbol al mes siguiente. La efectividad que se produjo sobre la mortalidad de la plaga fue de un 90% respecto al testigo al cabo de 4 meses desde el último tratamiento.

EJEMPLO XXII: Se trataron ciruelos atacados por Ceratitis capitata por pulverización sobre hojas y ramas La dosis inicial empleada fue de 500.000 nemátodos/árbol y la de recuerdo de 500.000 nemátodos/árbol aplicada al mes siguiente. La efectividad sobre la mortalidad de la plaga fue del 95% respecto al testigo al cabo de 4 meses.

EJEMPLO XXIII: Se trataron plantaciones de arroz afectados por Chilo suppressalis por pulverización sobre las cañas con una dosis de 500.000 nemátodos/m2 en Junio y otra de 500.000 nemátodos/m2 en Agosto, ambas combinadas con quitosano. La efectividad sobre la mortalidad de la plaga fue del 85% respecto al testigo.

EJEMPLO XXIV: Se trató una casa afectada por Reticulitermes lucifugus. La aplicación del producto se realizó por pulverización sobre los distinto focos. La dosis empleada fue de 500.000 nemátodos/m2, manteniéndose la humedad durante los cinco días siguientes al tratamiento. La efectividad sobre la mortalidad de la plaga fue del 90% respecto al testigo al cabo de 30 días. En este caso también ocurre el fenómeno de trofalaxia, que favorece la efectividad del tratamiento.

EJEMPLO XXV: Se trató una casa infectada por Hylotrupes bajulus. La aplicación se realizó por inyección en los conductos de la madera afectada. La dosis empleada fue de 1.000 nemátodos/orificio . La humedad se mantuvo durante los siguientes cuatro dias. La efectividad sobre la mortalidad de la plaga fue del 100% respecto a los testigos al cabo de 45 dias.

EJEMPLO XXVI: En cerezos y ciruelos, sobre Capnodis tenebrionis, por inyección al sistema de goteo, se observó que a dosis de 500.000 nemátodos/árbol combinado con 40 mi de la solución de quitosano, con una humedad relativa del 80% y una temperatura ambiental y del suelo alrededor de 25°C, la efectividad fue entre el 90-92% sobre la plaga infectiva al cabo de 21 días; también se comprobó que en aquellos árboles en los cuales no se les añadió quitosano la recuperación fue más lenta. En concreto, usando el plaguicida con quitosano empiezan a salir nuevos brotes del árbol enfermo una vez curado a las 6 semanas después del tratamiento. Usando el plaguicida sin quitosano los brotes no emergen hasta después de 4 o 5 meses.

EJEMPLO XXVII: En naranjo, sobre Phyllonictis citrella, el método empleado fue la pulverización de las hojas de la planta infectada. Después del estudio de varias concentraciones de nemátodos entomopatógenos más quitosano, comprobamos que la dosis más eficaz contra dicha plaga es de 1.000.000 de nemátodos/árbol combinado con 40 mi de la solución de quitosano. Con esta dosis observamos que los nuevos brotes del árbol no fueron atacados por dicha plaga. Estudiando las pruebas de persistencia del nematodo en el campo, comprobamos que dicha persistencia fue entre 6 y 9 meses .

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de plaguicida biológico consistente en: « Un nematodo entomopatógeno . • Quitosano de una viscosidad entre 150 y 450 cps y un grado de desacetilación entre el 50-99%, a una concentración entre el 0.08 y el 0.18%. • Un ácido débil en una concentración de 1 a 10% (v/v) , estando el pH de dicha formulación ajustado en un rango de 4-7. 2. Una formulación de plaguicida biológico consistente en

Un nematodo entomopatógeno. Quitosano con una grado de desacetilación entre el 50-99%, a una concentración entre el 0.06 y el 0.25%. Un ácido débil en una concentración de 0,5 a 10% (v/v) , estando el pH de dicha formulación ajustado en un rango de 4-7. Iones Mn(II) y Mg que van asociados y/o añadidos al quitosano.

3. Formulación según las reivindicaciones 1 y 2, en la cual el nemátodo entomopatógeno pertenece a la familia Steinernematidae o Heterorhabditidae .

4. Formulación según las reivindicaciones 1 a 3, en que la concentración de nematodo oscila entre 1.000- 2.000.000 por m2 de superficie a tratar.

5. Formulación según las reivindicaciones 1 a 4, en la que el quitosano tiene una viscosidad que oscila entre 150 y 2000 cps.

6. Formulación según las reivindicaciones 1 a 5, en la que el ácido débil se selecciona entre el ácido acético, el ácido adipico, el ácido cítrico, el ácido fórmico, el ácido láctico, el ácido mélico, el ácido oxálico, el ácido pirúvico y el ácido tartárico.

7. Formulación según las reivindicaciones 1 a 6, en la que el pH se ajusta mediante una base seleccionada preferentemente entre el hidróxido sódico, el carbonato sódico y el hidróxido potásico.

8. Formulación según las reivindicaciones 2 a 7, en que la concentración de iones Mn(II) y Mg oscila en un rango de l-400ppm y l-200ppm respectivamente.

9. Formulación según las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además coadyuvantes comerciales agrícolas, particularmente seleccionados entre agentes fijadores, humectantes e hidratantes o mezclas de los mismos.

10. Un método para incrementar la resistencia de una planta frente a una plaga que consiste en aplicar a la misma la formulación de las reivindicaciones 1 a 9 mediante inmersión de raices.

11. Un método de incrementar la resistencia de una planta frente a una plaga que consiste en aplicar a la misma la formulación de las reivindicaciones 1 a 9 mediante irrigación o cualquier otro método agrícola convencional de aplicación hasta que la superficie de las raices se humedezca sustancialmente para transplantarla, plantarla o mantenerla bajo irrigación durante su ciclo vital.

12. Un método de incrementar la resistencia de una planta frente a una plaga que consiste en aplicar a la misma la formulación de las reivindicaciones 1 a 9 mediante pulverización preferentemente foliar.

13. Un método de incrementar la resistencia de una planta frente a una plaga que consiste en aplicar a la misma la formulación de las reivindicaciones 1 a 9 mediante la inyección al pie del árbol.

14. Un método de incrementar la resistencia del terreno frente a una plaga previamente a la plantación que consiste en aplicar al mismo la formulación de las reivindicaciones 1 a 9.

15. Uso de cualquiera de las formulaciones de las reivindicaciones 1 a 9 según cualquiera de los métodos de tratamiento de las reivindicaciones 10 a 14, para el tratamiento de plantas frente a plagas causadas por cualquier especie seleccionada de: entre el orden Lepidóptera, preferentemente las especies: -Chilo spp . , -Gallería mellonella, -Spodoptera littoralis, -Pieris rapae, -Melolontha melolontha, -Agrotis segetum, -Thaumetopoea pytiocampa, -Zeuzera pyrina, o el orden Coleóptera, preferentemente las especies: -Vesperus xatarti, -Cosmopolites sordidus, -Capnodis tenebionis, -Cleonus mendicus -Hylotrepes bajulus, o el orden Díptera, preferentemente las especies: -Ceratitis capitata, -Bemisia spp, -Trialeudores vaporarium, -Liriomyza trifolii, o el orden Acari, preferentemente las especies: -Boophilus pinniperda, -Dermacentor vaviabilis, -Amblyoma cajennense, o el orden Heteróptera, referentemente la especie: -Dysdercus peruvianus, orden Homópt referentemente la especie: -Dysmicoccus vaccini, o el orden Isóptera, referentemente las especies: -Reticulotermes spp., - alotermes flavicollis, -Glyptotermes dilatatus, orden Gastrópoda referentemente la especie: -Deroceras reticulatum, el orden Orthóptera, referentemente las especies: -Locusta migratoria, -Melanoplus sanguinipes, -Scapteriscus vicinus, el orden Ixódida, referentemente la especie: -Ripicep alus sanguineus, el orden Blatodea, referentemente la especie: -Periplaneta bruñe, o el orden Hymenóptera, referentemente las especies: -Tirathaba rufivena, -Elasmopalpus lignosellus, -Hoplocampa testudínea o cualquier otra especie de entras las citadas en la siguiente tabla: Especies Acalyma vittatum Chilo spp Acrolepia assectela Choristeneura occidentalis Adoryphorus couloni Cirphis corapta Agrotis ípsilon Conopia myopasformis Agrotis palustris Conorhynchus mendicus Agrotis segetum Cosmopolites sordidus Amyelois transitella Costrelytra zealandica Anabrus simplex Curalio caryae Anómala spp. Cyclocephala borealis Anoplophora Cydia pomonella malasiaca Apriona cinérea Cydocephala hirta Blastophagus Cylus formicarius pinniperda Boophilus annulatus Dacus cucurbitae Bradysia coprophila Delia antiqua Capnodis tenebrionis Delia floralis Carpocapsa pomonella Delia platura Carposina Delia radicum nipponensis Castnia dedalus Dendroctonus frontalis Cephalcia abietis Dermacentor vaviabilis Cephalcia Deroceras reticulatum lariciphila Ceratitis capitata Diabrotica balteata Ceuthorrynchus napi Diabrotica barberi Diabrotica Limonius califormicus virginifera Diaprepes Liriomyza trifolii abbreviatus Dysdercus peruvianus Listronotus orej onensis Dysmicoccus vaccini Locusta migratoria Earias insulana Lycoriella auripila Eldana spp. Maladera motrica Galería melonella Manduca sexta Germán cockroach Megaselia halterata Glyptotermes Melanoplus sanguinipes dilatatus Grapholita funebrana Migdolus spp. Grapholita molesta Monochanus alternatus Graphonathus Musca domestica peregrinus Helicoverpa zea Nemocestes incomptus Heliothis armígera Oamona hirta Heliothis zea Operhoptera brumata Hylenia brasicae Opogona sacchari Hylobius abietia Ostrinia nubilalis Hylobius Otiorhynchus ovatus transversovittatus Hypantria cunea Otiorhynchus sulcatus Ixodes scapularis Pachnaeus litus Ixodid ticks Panisetia marginata Laspeyresia Pantomorus spp. pomonella Leptinotarsa Pectinophora decenlineata gossyprella Periplaneta brunnea Strobilomyia appalachensis Phlyctinus callosus Thaumetopoea pytiocampa Phyllotreta Tirathaba rufivena cruciferae Phylophaga spp. Tomicus pinniperda Pieris rapae Tryparysa incertulas Platiptilia Vietacea polistiformis carduidactyla Plutella xylostella Wiseana copularis Polyphylla spp. Zeiraphera canadensis Pseudaletia separata Zeusera pyrina Pseudexentera mali Zophodis grossulataríata Psylliodes Phyllonictis citrella chrysocephala Pyrrbalta luteola Xylotrechus arvícola Rhipicephalus Trialeudo es sanguineus vaporarium Rhizotropus majalis Melolontha melolontha Rhyacionia buolinana Tipula paludosa Rhyacionia frustrana Blatella germánica Rusidrina depravata Vespula spp Scapteriscus vicinus Lixus spp Sitoma lineatus Reticulitermes lucifugus Sitona discoideus Parapediasia teterrella Sphenophorus Fumibotys fumalis parvulus Spodoptera exigua Bemisia spp Spodoptera litura Longitarsus waterhorsei

16. Uso de la formulación de las reivindicaciones 1 a 9, en forma de pasta untable .

17. Uso de la formulación de las reivindicaciones 1 a 9, en forma seca en "Spray", mezclada con la solución de nemátodos .

18. Uso de la formulación de las reivindicaciones 1 a 7, para aplicación a semillas contaminadas.

19. Uso de la formulación de las reivindicaciones 1 a 9, para aplicación en estructuras o aperos agrícolas, especialmente de madera, que tengan algún grado de contaminación.

20. Uso de la formulación de las reivindicaciones 1 a 9, aplicada en suelos y plantas en forma preventiva, para evitar el desarrollo de plagas en los mismos .