COPOLÍMEROS DE BLOQUES PARA SISTEMAS AUTO-ENSAMBLADOS, MULTI-FUNCIONALES
Antecedentes de la Invención Las partículas coloidales, tales como nanoesferas, liposomas y micelios, han sido estudiadas de manera extensa para entrega de fármacos específica al sitio. Generalmente, tales partículas deben escapar la captura por el sistema reticulo-endotelial (RES) del hígado y la gran actividad de filtración de los pulmones si van a entregar fármacos a otros tejidos. En años recientes, la supervivencia de sistemas coloidales en la sangre ha sido mejorada por el uso de amífilos que contienen PEG (Lasic y colaboradores, editores, Stealth Liposomes, CRC Press; Boca Ratón, Florida, 1995) . Como resultado del PEG, se ha reducido drásticamente la eliminación de macrofagos de liposomas a base de PEG reduciendo la opsonización por proteínas de plasma (Torchilin y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1994, 1195, 11-20) . A mayor abundamiento, una variedad de ligandos, tales como anticuerpos, factores de crecimiento, y citocínas, ha servido para acrecentar las capacidades de entrega de liposomas revestidos con PEG, y se ha demostrado que se muestra actividad máxima por ligandos atados al extremo distante de las cadenas de PEG (Blume y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1993, 1149, 180-184; Zalipsky y colaboradores, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 705-708;
Zalipsky, J. Controlled Reléase, 1996, 39, 153-161; Gabizon, Bioconjugate Chem. 1999, 10, 289-298) . Algunos de estos ligandos pueden llevar a una toma celular sumamente eficiente, tal como el uso de factores de crecimiento, por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos para efectuar la toma celular de formulaciones de ADN. Compendio de la Invención Polímeros con novedosas estructuras de bloques, que contienen partes hidrófobas e hidrófilas separadas espacialmente (en lo sucesivo llamados polímeros amfifílieos) , han sido desarrollados para aplicaciones en encapsulación de materia orgánica e inorgánica y la entrega controlada de compuestos bioactivos. Estos polímeros son únicos (a) en su método de preparación, que permite la síntesis de copolímeros de dibloques, tri-bloques simétricos y asimétricos, multi-bloques , de estrella, o dendríticos, y la presencia de materiales biológicos sensibles en al menos uno de los bloques; (b) en su preparación de estructuras auto-ensambladas, que varían de micelios a estructurales lamelares y vesículas (también llamadas liposomas poliméricos) ; y (c) en la posibilidad de degradación del polímero mismo y de las estructuras auto-ensambladas por reacciones oxidativas de los bloques hidrófobos. Estos aspectos permiten la preparación de portadores para materiales lipo-solubles o solubles en agua, bioactivos, que tienen los beneficios de incorporación en tales estructuras, incluyendo objetivación celular acrecentada en presencia de anti-cuerpos o péptidos de adhesión sobre la superficie. Los polímeros de la invención pueden también ser preparados para contener eslabones inestables hidrolítica o proteolíticamente que son usados para disparar la liberación de los agentes bioactivos. Los polímeros de la invención pueden ser formados en presencia de materiales biológicos sensibles, debido a la alta auto-selectividad de la reacción de adición de Michael. De esta manera, se puede acoplar al menos un bloque pre-formado al resto del material macro-molecular, permitiendo la posibilidad de incorporación de una molécula biológica como un componente de los materiales . En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para la preparación de copolímeros de multi-bloques, implicando generar y purificar un precursor de tiol polimérico; producir un tiol polimérico a partir del precursor de tiol polimérico; y usar el tiol polimérico sin aislamiento para polimerización por apertura de anillos de episulfuro. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la preparación de copolímeros de bloques múltiples, implicando generar y purificar un precursor de tiol polimérico; producir un tiol polimérico a partir del precursor de tiol polimérico; y usar el tiol polimérico sin aislamiento para polimerización por apertura de anillos de episulfuro; y explotar el tiol polisulfuro terminal para enlazar un agente de remate de extremos pre-formado o para participación en un segundo paso de polimerización . En una forma de realización de los aspectos anteriores de la invención, el copolimero de multi-bloques consiste en bloques tanto hidrófilos como hidrófobos. En otra forma de realización, el precursor de tiol es un tioéster, un ditioéster, un tiocarbamato, un ditiocarbamato, un tiocarbonato, un xantato, o un tritiocarbonato . De preferencia, el precursor de tiol es también un poliéter o un copolimero de bloques donde al menos uno de los bloques es un poliéter, y donde el precursor de tiol es funcionalizado en un extremo con un tioéster, un ditioéster, un tiocarbamato, un ditiocarbamato, un tiocarbonato, un xantato, o un tritiocarbonato. En otra forma de realización preferida, el precursor de tiol es funcionalizado en los dos extremos si es lineal, o en cada extremo si es de forma de estrella o ramificado. En otra forma de realización, el precursor de tiol incluye una secuencia peptidica o sacaridica. En otras formas de realización de los aspectos anteriores de la invención, el episulfuro tiene la siguiente fórmula :
donde R o R' es hidrógeno, o un grupo alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, fenilo, fenilo sustituido, acilo, o carboxialqui-lo .
En una forma de realización preferida del segundo aspecto de la invención, el agente de remate de extremos es un poliéter o copolimeros de bloques donde al menos uno de los bloques es un poliéter, y es funcionalizado con un grupo aceptante de Michael o con un buen grupo que sale capaz de sustitución nucleófila por un nucleófilo de azufre. De preferencia, el agente de remate de extremos contiene secuencias peptidicas o sacaridicas o es un copolimero de bloques que contiene grupos éster alifático o anhídrido y puede sufrir degradación hidrolítica. En otras formas de realización del anterior aspecto de la invención, el remate de extremos es dado por la dimerización del polímero mismo, al ocurrir formación de enlaces bisulfuro en el tiol polisulfuro terminal. En un tercer aspecto, la invención se refiere a dispersiones de los polímeros de los anteriores dos aspectos de la invención en agua. En una forma de realización, las dispersiones contienen agregados auto-ensamblados en la forma de micelios esféricos, micelios similares a gusano o cilindricos, o estructuras lamelares y otras estructuras liotrópicas. En un cuarto aspecto, la invención se refiere a vesículas mono o multi-lamelares gue incluyen los polímeros de los dos primeros aspectos de la invención en agua. En formas de realización preferidas, las vesículas o los micelios están contenidos dentro de una formulación farmacéu-ticamente aceptable. En otra forma de realización, las vesículas o los micelios contienen un fármaco y están contenidos dentro de una formulación farmacéuticamente aceptable. En todavía otra forma de realización, las vesículas o los micelios, en los cuales el copolimero de bloques contiene al menos un bloque que consiste en polietilenglicol, están contenidos dentro de una formulación farmacéuticamente aceptable. De preferencia, una fracción de objetivación es inmovilizada adicionalmente sobre la superficie de la vesícula contenida dentro de una formulación farmacéutica-mente aceptable. En todavía otra forma de realización, las vesículas o los micelios contienen heparina o una fracción de ligadura a heparina que es inmovilizada adicionalmente sobre la superficie de la vesícula o el micelio dentro de una formulación farmacéuti-camente aceptable. En todavía otra forma de realización, las vesículas o los micelios contienen un factor de crecimiento que se liga a heparina que es inmovilizado adicionalmente sobre la superficie de dicha vesícula contenida dentro de una formulación farmacéuti-camente aceptable. En una forma de realización preferida de los aspectos tercero y cuarto, los tamaños absoluto y relativo de los bloques hidrófilo e hidrófobo son optimizados de manera experimental para rendir vesículas o micelios que escapan reconocimiento por los mecanismos del cuerpo de liberación de partículas vasculares, tales como el reconocimiento en el sistema reticulo-endotelial . En otra forma de realización preferida de los aspectos tercero y cuarto, el copolimero de multi-bloques responde al pH, tal que los micelios o las vesículas que son estables a un pH de 7.4 se tornen desestabilizados a valores menores de pH, incluyendo los valores de pH encontrados durante tráfico endosomal y lisosomal . En un quinto aspecto, la invención se refiere a un ambiente protector dentro de un agregado auto-ensamblado que es provisto a un fármaco ahí incorporado. Por ejemplo, muchos fármacos han sido abandonados debido a su pobre estabilidad, tales como oligonucleótidos anti-sentido, los cuales, si se hacen usando secuencias normales de ADN y ARN y no análogos o derivados químicos, demuestran una pobre estabilidad a enzimas que degradan ADN y ARN. Estos análogos o derivados generalmente despliegan una ligadura mas pobre a sus objetivos intra-celulares . Sin embargo, como el micelio o la vesícula sirve para proteger el fármaco dentro del agregado auto-ensamblado, pueden emplearse fármacos menos estables, tales como secuencias normales de ADN y ARN, mas que el análogo o derivado menos efectivo pero mas estable. Este efecto es el caso con varias formas de fármacos. En un sexto aspecto, la invención se refiere a otros excipientes incorporados dentro de un agregado auto-ensamblado, por ejemplo junto con un fármaco para acrecentar la función de ese fármaco. Tales excipientes pueden ser agentes de permeabili-zación de membrana, para ayudar en el transporte del fármaco incorporado a través de las membranas de la célula. Como la física de los lámelos hidrófobos formados a partir del bloque hidrófobo es muy diferente de la física de las membranas de fosfolípidos naturales de la célula, pueden incorporarse agentes que tornen la membrana celular menos estable o mas permeable sin afectar de manera adversa la estabilidad o la permeabilidad de los micelios o las vesículas. Esta capacidad de alterar la permeabilidad o estabilidad de una membrana es útil, por ejemplo, para entregar fármacos al citoplasma y el núcleo, donde el agregado auto-ensamblado puede ser diseñado para tornarse menos estable al entrar al endosoma o lisosoma y de esta manera liberar los excipientes incorporados, que entonces afectan de manera favorable la permeabilidad de la membrana endosomal o lisosomal. Pueden incluirse otros excipientes también, por ejemplo estabilizadores de fármacos. En un séptimo aspecto, la invención se refiere ai-mecanismo de degradación oxidativa y los productos de los polímeros de los primeros dos aspectos de la invención. Por "precursor de tiol" se quiere decir cualquier compuesto capaz de generar tioles como iniciadores para la polimerización in situ de episulfuros. El precursor de tiol puede ser tioésteres, ditioésteres, xantatos, ditiocarbamidas, tritiocarbonatos, o cualquier compuesto que, por ataque nucleófi-lo, sufra una reacción de trans-esterificación o trans-amidación;
un tiol libre es generado y luego desprotonado por medio de una base, que puede ser el nucleófilo mismo o un compuesto no nucleófilo,, tal como una amina terciaria (figura 1) . Todos los precursores de tiol son producidos mediante ataque de un nucleófilo a base de azufre (v.gr., tioactetato de sodio o potasio, xantato de alquilo) en bloques hidrófilos activados. Por "polimerización aniónica de apertura de anillos de sulfuros cíclicos" se quiere decir un proceso que ocurre como sigue. El ataque de un nucleófilo en una estructura cíclica deformada que contiene al menos un átomo de azufre, y la abertura sucesiva del anillo, son referidos como apertura de anillo de un sulfuro cíclico. Si tiene lugar una reacción en cadena, donde cada sulfuro cíclico genera un tiolato que es un nucleófilo adecuado para otra reacción, ésta es referida como polimerización por apertura de anillos de un sulfuro cíclico (figura 2) . Pueden usarse anillos de tres miembros, pero en ocasiones también de cuatro miembros. También pueden usarse mezclas de diferentes sulfuros cíclicos, añadiéndolas de manera secuencial (copolisul-furo en bloques) o directamente en mezcla (copolisulfuro aleatorio) . Los tiolatos inician esta polimerización de apertura de anillos mucho mas efectivamente que los alcoholatos o aminas y reaccionan mucho mas rápidamente: en el caso donde se usa un iniciador a base de oxígeno o nitrógeno, ocurrirá competencia entre éstos y el extremo de tiolato de cadena creciente, ocasionando bajo rendimiento en el paso de iniciación, mayor peso molecular y mas amplia dispersión de pesos moleculares en el polímero . Por "reacción tipo Michael" se quiere decir la reacción de 1,4 adición de un nucleófilo en un sistema insaturado, conjugado (figura 3) . Los ácidos de Lewis o las especies de enlace de hidrógeno diseñadas apropiadamente pueden actuar como catalizadores. El término "con ugación" se refiere en este caso a la alternancia de carbono-carbono, carbono-heteroátomo, o enlaces múltiples heteroátomo-heteroátomo con enlaces sencillos, y no al eslabonamiento de un grupo funcional a una macromolécula, tal como un polímero sintético o una proteína. Enlaces dobles espaciados con una unidad CH o CH2 son referidos como "enlaces dobles homo-conjugados". La adición tipo Michael a grupos insaturados puede tener lugar en rendimientos buenos a cuantitativos a temperatura de habitación y en condiciones tenues con una amplia variedad de nucleófilos. Los grupos insaturados, tales como vinil sulfonas o acrilamidas, han sido usados para enlazar PEG o polisacáridos a proteínas mediante reacciones tipo Michael con grupos amino o mercapto; los acrilatos y muchos otros grupos insaturados han sido hechos reaccionar con troles para producir materiales reticulados para una variedad de aplicaciones biológicas. La posibilidad de incorporar material péptido o proteínico es contemplada principalmente a fin de obtener un material proteoliticamente degradable o para procesos de reconocimiento específicos dentro del mismo, pero principalmente por reacción con residuos cisteina incorporados de manera intencional; la PEG-ilación de proteina pura está fuera del ámbito de esta invención. Pueden usarse nucleófilos de azufre en la reacción tipo Michael: en el caso de una reacción de siembra, el extremo tiolato del polímero reaccionará directamente con el electrofilo. Como electrófilos, se pueden usar bloques hidrófilos funcionali-zados con grupos insaturados reactivos, tales como acrilatos, itaconatos, acrilamidas, itaconamidas, maleimidas, vinil sulfonas, quinonas, quinonas multi-sustituidas, quinonas fusionadas (naftoquinona y derivados) , iones vinil piridina y vinil piridinio, y mas generalmente, cualquier insaturación conjugada con grupos de retiran electrones. Ejemplos adicionales de reacciones tipo Michael son dados en Hubbell (solicitud de patente US 09/496,231) y Hubbell y colaboradores (solicitud de patente US 09/586,937). Por "reacción de sustitución nucleófila" se quiere decir la reacción de sustitución de un nucleófilo en un electro-filo portador de un buen grupo que sale. La reacción nucleófila usa el extremo tiolato del polímero como nucleófilo. Como electrófilos, se pueden usar bloques hidrófilos o compuestos de bajo peso molecular funcionalizados con buenos grupos que salen, tales como cloruros, bromuros, yoduros, tosilatos, mesilatos, triflatos y, de manera mas general, cada grupo que después de sustitución nucleófila puede generar un anión estable y no reactivo . El polímero AB puede ser aislado, si se hace reaccionar un agente de remate de extremos de bajo peso molecular con el extremo tiolato de la cadena de polisulfuro; de esta manera, se puede producir y aislar un material que, en condiciones apropiadas, todavía exhibe una reactividad tipo Michael. Como e emplo, el agente de remate de extremos puede ser una sulfona cíclica (anillo de tres o de cuatro miembros), que se convierte a un ácido sulfínico por ataque nucleófilo. El ácido sulfínico puede ser usado adicionalmente para reaccionar con especies que contienen quinona (figura 4) . Se pretende P como una estructura polimérica que contiene el bloque hidrófilo (A, A' o C) . Por "bloque hidrófilo" se quiere decir polímeros hidrófilos, por ejemplo poli (etilenglicol) , copolímeros de dibloques o bloques múltiples de poli (óxido de etileno)-co-poli (óxido de propileno, poli (alcohol vinílico) , poli (etileno-co-alcohol vinílico) , poli (vinil pirrolidona) , poli (ácido acrllico) , poli (etiloxazolina) , poli (alquilacrilatos) , poli (acrilamida) , poli (N-alquilacrilamidas) , polipéptido o polisacárido, o poli (?,?-dialquilacrilamidas) , potencialmente portadores de grupos polares, iónicos o ionizables en las cadenas alifáticas. Esta no es una lista exhaustiva, y también pueden usarse otros polímeros hidrófilos. Pueden usarse compuestos de bajo peso molecular con suficiente hidrofilicidad también. Todos los bloques hidrófilos usados para el inicio de la polimerización por apertura de anillos de episulfuros deben llevar grupos que puedan ser convertidos en precursores de tiol; por ejemplo, grupos hidroxi pueden ser transformados en silato, mesilato, triflato, u otros ésteres activos y tratados con un nucleófilo a base de azufre; o pueden convertirse en derivados alilo y luego añadidos a un tioácido mediante adición de radicales libres (figura 5) . En la presente invención, se provee la generación in sltu de tioles en bloques hidrófilos. Por "balance hidrófilo/lipófilo" (HLB) se quiere decir una escala arbitraria de 0 a 40, bosquejando la amfifilicidad de un tensioactivo . Los productos con bajo HLB son mas solubles en aceite. Un alto HLB representa buena solubilidad en agua. Generalmente, el HLB es un número calculado numéricamente con base en la estructura molecular de los tensioactivos y no es un parámetro medido . Por "péptidos de adhesión" se quiere decir un péptido que se liga a un receptor promotor de adhesión. Es totalmente directo incorporar una variedad de péptidos promotores de adhesión que se ligan a receptores promotores de adhesión sobre las superficies de células, tales como la secuencia RGD de fibronectina o la secuencia YIGSR de laminina. Esto puede hacerse, por ejemplo, simplemente mezclando un péptido que contiene cisteina con diacrilato de PEG. Durante este paso, el péptido promotor de adhesión , se torna incorporado en un extremo del diacrilato de PEG; después de la purificación del producto, el otro extremo reacciona entonces con una cadena polimérica tiol terminada. En este caso, el sitio de adhesión está incorporado en el material de manera colgante. Se puede también incorporar el sitio de adhesión en la columna del material. Por ejemplo, se puede sintetizar el péptido de adhesión (v.gr., usando química en fase de solución) directamente sobre un polímero, tal como PEG, e incluir al menos un tiol (v.gr., cisteína) por extremo de cadena y llevar a cabo la misma operación antes descrita. De manera alternativa, se pueden incluir dos o mas tioles (v.gr., cisteína) en el péptido o proteína de adhesión y dejar reaccionar con acrilato de PEG y el segundo iniciar la polimerización por episulfuros. De manera alternativa, se puede unir un péptido de adhesión a la superficie de un agregado auto-ensamblado pre-formado, tal como la superficie de un micelio o una vesícula pre-formado. Por ejemplo, el copolímero puede ser rematado en extremos con un aceptante de Michael, tal como aquellos grupos descritos anteriormente. Este remate de extremos puede ser fácilmente logrado haciendo reaccionar el copolímero de bloques AB que contiene tiol con un exceso de diacrilato de PEG para rendir un copolímero ABA' que es funcionalizado terminalmente con un grupo acrilato. Pueden formarse micelios o vesículas a partir de este material. Un péptido que contiene una cisteína libre puede ser disuelto en una suspensión de estos micelios o vesículas y el pH ajustado a un rango donde una adición tipo Michael entre el acrilato ligado al agregado auto-ensamblado reacciona con el tiol libre en el péptido de adhesión. Por "proteolíticamente degradable" se quiere decir que contiene un sustrato para plasmina, elastasa o metalo-proteinasas de matriz (MMPs) , tales como colagenasa, que pueden introducirse en la cadena principal del bloque hidrófilo; las características de degradación del polímero y del portador pueden ser manipuladas cambiando los detalles del péptido. Se puede tomar un material que es degradable por colagenasa, pero no plasma, o por plasmina, pero no colagenasa. A mayor abundamiento, es posible hacer que el material degrade mas rápida o mas lentamente en respuesta a una enzima tal, simplemente cambiando la secuencia de aminoácidos de modo de alterar los valores Km y Kcat de la reacción enzimática. La degradación del péptido puede influenciar el comportamiento del portador y la eventual liberación de sustancias activas: si el sitio de proteasa es incorporado en una manera que su corte, ocasione un gran cambio en el balance hidrófilo/lipófilo del polímero amfifílico, la proteólisis determinará cambios estructurales en el portador, v.gr., el colapso de liposomas, y así amplificará la liberación. De manera alternativa, el sitio de proteasa puede ester enlazado directamente al grupo farmacológicamente activo; la hidrólisis enzimática lo liberará directamente. Por "fracción de objetivación" se quiere decir cualquier ligando de reconocimiento biológico unido al agregado auto-ensamblado, tal como un micelio o una vesícula, que acrecienta la ligadura del agregado en un sitio particular en el cuerpo. Las fracciones de objetivación incluyen una fracción de ligadura de receptor de factor de crecimiento, una fracción de ligadura de receptor de superficie celular, una fracción de ligadura de ADN, una fracción de ligadura de ARN, péptidos de adhesión, sacáridos ramificados promotores de adhesión, tales como sialil Lewis X y estructuras relacionadas de ligadura de selectina, péptidos descubiertos de manera combinatorzal, peptido-miméticos, sacáridos, sacáridos y péptidos que se ligan a un receptor promotor de adhesión, ligandos orgánicos, factores de crecimiento, sitios de ligadura de factor de crecimiento, anti-cuerpos, fragmentos de anti-cuerpos, anti-cuerpos de cadena sencilla, secuencias de ADN y AR , secuencias de localización nuclear, miméticos de patógenos, heparina y péptidos y ligandos de ligadura de proteoglicano, por ejemplo. Ejemplos adicionales de fracciones de objetivación son dados en Hubbell (solicitud de patente US 09/496,231) y Hubbell y colaboradores (solicitud de patente US 09/586,937). Por "sitios de ligadura de factcr de crecimiento" se quiere decir péptidos de ligadura de heparina empleados para ligar heparina que, a su vez, son empleados para ligar factores de crecimiento de ligadura de heparina, tales como aFGF, bFGF, VEGF, BMP o TGF. Como tales, si el factor de crecimiento de ligadura de heparina y heparina son mezclados con el copolimero de bloques funcionalizado con péptido de ligadura de heparina (por ejemplo, como se describe en la sección de sitios de adhesión) , el material resultante liberará lentamente el factor de crecimiento; si el péptido presenta una secuencia capaz de cortarse proteoliticamente, el portador retendrá la mayor parte de la misma hasta que un evento enzimático libere el factor de crecimiento por degradación de la cadena polimérica. Esta liberación enzimática es una de las funciones naturales de la matriz extra-celular in vivo, para servir como un depósito para factores de crecimiento que son liberados en lesiones por la actividad celular local. Otra manera relacionada de secuestrar factores de crecimiento de ligadura de heparina es mas directamente a través del uso de mímicos de heparina incorporados de manera covalente, v.gr., péptidos con cadenas laterales cargadas negativamente que se ligan directamente a factores de crecimiento. Los factores de crecimiento ligados a agregados auto-ensamblados tales como micelios y vesículas pueden ser útiles como fracciones de ob etivación. Otros aspectos y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones . Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una representación esquemática de los precursores de tiol . En esta figura, R' y R" = H, alquilo, R = bloque hidrófilo, u = amina primaria o secundaria, o alcoholato, y base = una amina primaria, secundaria o terciaria, o alcoholato, o bases inorgánicas. La figura 2 es una representación esquemática de un ejemplo de polimerización aniónica por apertura de anillos de sulfuros cíclicos. En esta figura, R, R' , R" = H, alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, fenilo, fenilo sustituido, acilo, o carboxialquilo . La figura 3 es una representación esquemática de una reacción tipo Michael. La figura 4 es una representación esquemática de cómo un polímero ?? puede ser aislado si se hace reaccionar un agente de remate de extremos con el extremo tiolato de la cadena de polisulfuro. De esta manera, se puede producir y aislar un material que, en condiciones apropiadas, todavía exhibe una reactividad tipo Michael . La figura 5 es una representación esquemática de grupos en bloques hidrófilos que pueden ser usados" para el inicio de polimerización por apertura de anillos de episulfuros. La figura 6 es una representación esquemática de la degradación de los portadores auto-ensamblados de la presente invención . Las figuras 7A y 7B son TEMs de estructuras micelares similares a gusano de la presente invención. La figura 8 es una imagen de microscopía óptica de luz polarizada, cruzada (amplificación 10X) de una mezcla al 50% en peso de un copolimero de tri-bloques hecho de sulfuro de propileno y etilenglicol y agua. Las figuras 9A, 9B y 9C son imágenes obtenidas por TEMs de fractura congelada de vesículas formadas a partir de un copolimero de tri-bloques hecho de sulfuro de propileno y etilenglicol . La figura 10 es una fotografía de un compuesto modelo encapsulado dentro de vesículas; las vesículas están contenidas en un tubo de diálisis y el compuesto modelo no difunde fuera de la membrana, demostrando encapsulación . Las figuras HA, 11B y 11C son micrografías ópticas de células (HFFs) , tratadas (A) con vesículas que contienen un fármaco modelo encapsulado (AS-bFGF) , (B) con fármaco modelo no encapsulado, o (C) vehículo de solución salina, en cada caso después de cuatro días de cultivo después del tratamiento. La figura 12 es una gráfica que muestra la dependencia _ en el tiempo de la turbidez exhibida por una suspensión vesicular de un copolimero de tri-bloques hecho de sulfuro de propileno y etilenglicol en ambiente oxidante (10% en peso de H202) . La figura 13 es una representación esquemática de ejemplos de vesículas sensibles al pH; las esferas negras representan grupos, v.gr., imidazolas, que después de la protonación incrementan su volumen hidrodinámico y su carga, dando lugar a fuerzas de auto-repulsión y a una mayor presión osmótica. Se supone que los agregados finales muestran una estructura micelar, pero también pueden formarse partículas coloidales mas grandes u otros agregados. La figura 13A ilustra la sensitividad al pH por fracciones que responden al pH cerca del bloque hidrófobo, en el caso en que el cambio de pH se difunde hacia la cavidad interna o no . La figura 13B ilustra la sensitividad al pH por fracciones que responden al pH dentro del bloque hidrófobo, y la figura 13C ilustra la sensitividad al pH por fracciones que responden al pH unidas terminalmente en secuencia al bloque hidrófilo, en caso que el cambio de pH se difunda hacia la cavidad interna o no. Descripción Detallada de la Invención Las reacciones químicas usadas para síntesis de copolimeros de bloques Se ha desarrollado un novedoso' esquema para la síntesis en una maceta (recipiente sencillo) de copolimeros en bloques; en lo sucesivo, se describe el método de preparación de copolimeros en bloques simétricos (ABA o AB-S-S-BA) o asimétricos (ABC, o ABA' si el tercer bloque es física, pero no químicamente diferente) . Estos copolimeros pueden contener grupos reactivos en uno o ambos grupos hidrófilos y en el último caso, los dos grupos reactivos pueden ser de naturaleza diferente (designados * y #) , para rendir, por ejemplo, ABA* , #ABA* , *AB-S-S-BA*, ABC*, o #ABC*. La posibilidad de formar estructuras de bloques complejas, la tolerancia a una variedad de grupos funcionales (debido a la presencia de tiolatos como especie de propagación) ,. la explotación del extremo de tiolato para adición tipo Michael, sustitución nucleófila y reactividad a enlace bisulfuro, y el uso de un precursor de tiol, diferencian el presente esquema de polimerización del único reporte en la literatura sobre la síntesis de copolimeros en bloques conteniendo bloques polisulfu-ro y poliéter (Inoue y colaboradores, Macromolecules 1990, 23, 3887-3892, y 1991, 24, 3970-3972), que hace uso de foto-polimerización iniciada por tiolato de epóxidos para rendir copolimeros BA. Estructura del bloque A: el polietilenglicol (PEG) provee un bloque de construcción sumamente conveniente para las partes hidrófilas (A, A', C) , pero también pueden usarse otros polímeros, tales como poli (N-vinil pirrolidona) extremo funeiona-lizada (PNVP) , poli (acrilamida) (PAM) , poli (N-alquil o N, N-dialquilacrilamidas ) , y poli (acrilatos ) conteniendo grupos hidrófilos y ionizables (sigue una descripción mas exhaustiva) . Las secuencias peptídicas pueden estar contenidas en uno de los bloques hidrófilos, o de hecho pueden ser uno de los grupos hidrófilos, y pueden usarse para modificar la funcionalidad y el comportamiento de los portadores auto-ensamblados; por ejemplo, secuencias proteolíticamente degradables pueden influenciar la estabilidad del portador en presencia de enzimas, con una liberación de un fármaco portado disparada enzimáticamen-te.
Estructura del bloque B: los poli ( sulfuros de alquile-no) proveen un bloque de construcción conveniente para el bloque B, debido a su alta hidrofobicidad y baja temperatura de transición al vidrio con relación a la temperatura de trabajo. Un bajo valor de temperatura de transición al vidrio es necesario para la movilidad y la capacidad de formación de membrana de las cadenas poliméricas; los valores preferidos son aquéllos por debajo de -20°C. Sulfuro de propileno, sulfuro de ciclohexeno, y cualquier otro episulfuro derivado de enlaces dobles terminales o internos pueden usarse para la preparación de bloques hidrófobos copoliméricos-aleatorios y homopoliméricos o en bloques.' También pueden usarse copolimeros en bloques o aleatorios, amorfos, de sulfuro de etileno; en una formulación preferida, la longitud promedio de las secuencias de sulfuro de etileno no excede de diez unidades de repetición. Estructura de los grupos de remate de extremo: los aceptantes tipo Michael proveen una estructura sumamente conveniente para reacciones de remate de extremos en condiciones tenues; pueden usarse polímeros hidrófilos u oligómeros extremo funcionalizados con un grupo aceptante de Michael. Homopolíme-ros, copolimeros aleatorios y en bloques de los compuestos mencionados en la definición de bloques hidrófilos pueden ser usados. En una formulación preferida, se usa un poliéter con peso molecular mayor de 300, llevando un enlace doble pobre en electrones como grupo terminal. En otra formulación, el polímero hidrófilo u oligómero es extremo funcionalizado con un grupo que puede sufrir reacciones de sustitución nucleófila con aniones tiolato, tales como yodo o bromo acetatos o acetamidas, bromuros o yoduros de bencilo sustituidos o no sustituidos/ y otros. La lista no pretende ser exhaustiva. En una formulación preferida, el agente de remate de extremos polimérico u oligomérico también es portador de funcionalidades, tales como estructuras peptidicas o sacaridicas para funcionalidad biológica, ásteres, anhídridos, bases de Schiff o acétales para degradación hidrolitica. En otra formulación, el agente de remate de extremos es un compuesto de bajo peso molecular portador de un aceptante de Michael o un sustrato para reacciones de sustitución nucleófila del tipo antes mencionado. El compuesto de bajo peso molecular puede ser el único sustrato de adición tipo Michael o sustitución nucleófila o portador de otras funcionalidades, tales como estructuras peptidicas para funcionalidad biológica, ásteres, anhídridos, bases de Schiff, o acétales para degradación hidrolitica. Estructura relativa de los bloques A y B: variar la fracción de peso del bloque hidrófobo B provee una manera fácil de controlar la formación de meso-fases liotrópicas. Cuando la longitud del bloque B en arquitectura ABA o AB es mucho menor que la longitud de los bloques A hidrófilos, entonces se forman micelios preferencialmente en un amplio rango de concentraciones. La concentración crítica de micelios (CMC) es por tanto desplazada a valores superiores en comparación con copolímeros ABA teniendo bloques B mas grandes. En una formulación preferida a una concentración de 1% en agua, un copolímero de tri-bloques conteniendo una fracción en peso de 0.5 del bloque B forma un agregado lamelar o vesicular. En otra formulación a una concentración de 1% en agua, un copolimero de tri-bloques conteniendo una fracción de peso de 0.1 del bloque B formará un agregado liotrópico micelar. A una fracción de peso constante del bloque hidrófobo, la longitud de A y del grupo de remate de extremos puede influenciar la estabilidad del agregado liotrópico; cadenas idrófilas largas pueden por ejemplo estabilizar agregados vesiculares contra agregados micelares. Estructura relativa de A, B y los grupos de remate de extremos: grupos que pueden sufrir ionización o reacciones de hidrólisis pueden estar presentes en A, B y en el grupo de remate de extremos; su transformación química provee una manera conveniente de cambiar el balance hidrófilo/lipófilo de la molécula y por tanto disparar la desestabilización de los agregados. En una formulación preferida, en la unión entre A y B o entre B y el grupo de remate de extremos o en ambas uniones, están presentes grupos capaces de protonación a pH < 7.3, tales como imidazola (v.gr., en residuos histidina de una estructura peptídica) , o desprotonación a pH > 7.5, tales como fenoles (v.gr., en residuos tirosina de una estructura peptídica). Al ocurrir exposición a solución en agua a pH < 7.3 o > 7.5, respectivamente, la ionización de los residuos mencionados anteriormente incrementará la energía libre de la interfaz A/B, ocasionando un re-arreglo, por ejemplo de una estructura vesicular a micelar, y al mismo tiempo la liberación de cualquier molécula encapsulada. En otra formulación, grupos hidrolizables son presentados en la unión A/B; anhídridos, esteres, acétales, bases de Schiff pueden proveer estructuras hidrolizables convenientes, pero también pueden usarse otros grupos. Al ocurrir hidrólisis, el grupo A será cortado o disociado,. desestabilizando el agregado y ocasionando la liberación de moléculas encapsuladas en la manera antes descrita. En otra formulación preferida, los grupos que pueden sufrir protonación o desprotonacion o reacciones de hidrólisis están presentes en el bloque B la polimerización de monómeros episulfuro conteniendo los grupos antes mencionados provee un método conveniente para la. incorporación de estas estructuras en el bloque B, pero también puede usarse funcionalización de los polímeros pre-forinados . Al ocurrir reacción, la hidrofobicidad del bloque B será reducida y tendrá lugar un re-arreglo con la liberación de las moléculas encapsuladas en la manera antes descrita. En otra formulación, los grupos que pueden sufrir protonación o desprotonacion o reacciones de hidrólisis están presentes en el extremo del bloque A o en el extremo del grupo de remate de extremos o en el extremo de ambos . Al ocurrir reacción, se incrementará la hidrofilicidad del grupo A o del grupo de remate de extremos, y este incremento ocasionará una expansión del serpentín molecular. En una formulación preferida, los grupos reactivos estarán presentes en una secuencia; la expansión del serpentín molecular será una función del número de grupos en la secuencia y se incrementará con este número, debido a la repulsión electrostática y la presión osmótica local incrementadas después de la reacción. La expansión del serpentín determinará un re-arreglo de la estructura del agregado, con la liberación de las moléculas encapsuladas en la manera antes descrita. Inicio: en general, el bloque A es terminado con un grupo que puede ser convertido a un tiol vía ataque nucleófilo; el tiol es generado en la mayoría de los casos como tiolato y no es aislado, sino usado de inmediato. La gran ventaja de esta técnica es que el precursor puede ser aislado, purificado, y almacenado sin formación de enlaces bisulfuro. En polimerizaciones iniciadas por tiol, la presencia de bisulfuros a menudo hace imposible una estimación precisa de la concentración requerida del iniciador. En la presente invención, los precursores son tioésteres y compuestos similares que no están sujetos a acoplamiento oxidativo (sigue mas adelante una descripción mas detallada) . Técnicas de polimerización: pueden usarse varias técnicas de polimerización diferentes, empleando tioles como iniciadores o agentes de transferencia de cadenas: v.gr., polimerización por apertura de anillos de sulfuros cíclicos (anillos de tres miembros, en lo sucesivo llamados episulfuros) , polimerización por radicales libres, o adición tipo Michael. La técnica de polimerización determinará la estructura quimica del bloque hidrófobo (B) ; ejemplos de la aplicación de diferentes técnicas de polimerización son listados a continuación: A) El resultado de la polimerización por apertura de anillos de episulfuros, aniónica, viva, es un copolimero de dibloques AB potencialmente reactivo, tiolato terminado; este grupo puede ser usado para la introducción de un tercer bloque con una olefina pobre en electrones, tal como un acrilato, una quinona, una maleimida, una vinil sulfona, u otras olefinas pobres en electrones. El sistema de reacción quimica de uso en esta invención explota reacciones de adición tipo Michael, en las cuales un componente, el término del bloque B, posee un fuerte nucleófilo y el otro componente, el término del bloque C con el cual se llevará a cabo la reacción para acoplarlo al término del bloque B, posee una insaturación . Estas reacciones son sumamente rápidas y auto-selectivas, y puede tolerarse una variedad de grupos funcionales en la estructura C o A' . Una variación al procedimiento antes presentado es el uso de un reactivo para rematar los extremos de la cadena de polisulfuro; este remate de extremos permite el aislamiento del copolimero de di-bloques sin formación de enlaces bisulfuro; la reactividad tipo Michael puede ser obtenida en una segunda etapa con un tratamiento químico apropiado.
Si pueden generarse tioles en un número mayor que uno en el bloque A, se obtienen copolímeros de bloques múltiples; si la funcionalidad de A es dos, se obtiene un penta-bloque lineal (CBABC o A'BABA'); si la funcionalidad de A es mas de dos, el polímero resultante tiene una forma de estrella y el número de tioles determina el número de brazos de la estrella. B) La generación in situ de tioles puede ser usada también para poli-adición tipo Michael, sin hacer uso de episulfuros; usando bloques C terminados con grupos aceptantes Michael, pueden producirse copolímeros de bloques con estructuras AC (con A y C teniendo, cada uno, un grupo reactivo) , ACA (con A teniendo uno y C dos) , CAC (con A teniendo dos, y C uno) , y (AC)n (con A y C cada uno teniendo dos) . C) Si se generan tioles en la forma protonada, pueden usarse como agentes de transferencia de cadenas para una polimerización de radicales: puede añadirse un monómero o una mezcla de monómeros después de la preparación del tiol, junto con un iniciador. Puede usarse polimerización de radicales iniciada térmica o foto-químicamente: en el primer caso, el iniciador es un compuesto que contiene azo o peróxido, tal como AIBN o peróxido de benzoilo; en el segundo caso, es un foto-sensibilizador, tal como benzofenona, o una mezcla de un sensibilizador y un iniciador, tal como riboflavina o Eosin y trietanolamina . Con tal técnica de polimerización, se producirá una mezcla de estructuras AB y ABA, con una composición dependiente del balance entre el acoplamiento y el desproporcionamiento de los radicales poliméricos, pero generalmente con AB como componente mayor. D) Finalmente, es posible preparar el polímero AB y oxidar in situ simplemente por exposición al aire, convirtiendo el grupo de extremo tiolato en bisulfuro y generando un polímero ABBA; esta reacción puede ser acelerada por la presencia de iones de metal, tales como hierro o cobre, incluso en trazas. Este polímero puede ser degradado a la estructura AB original bajo condiciones de reducción. Grupos funcionales: el uso de polimerización de episulfuros para la síntesis del bloque hidrófobo hace posible que el precursor de tiol hidrófilo (#A) lleve cada grupo funcional no sensible a tiolatos o a bases, usados para la desprotección del precursor de tiol. Por ejemplo, amidas, alcoholes, éteres, nitrilos, olefinas, grupos aromáticos, bases de Schiff, acétales, estructuras primordialmente sacarídicas, y esteroidales . El uso de adición tipo Michael o de sustitución nucleófila como reacciones de remate de extremos hace posible que el agente de remate de extremos (A*) lleve cada grupo funcional no sensible a tiolatos. Por ejemplo, alcoholes, carboxilatos, ésteres, amidas, éteres, nitrilos, anhídridos, bases de Schiff, acétales, estructuras primordialmente peptídicas (con la condición de ausencia de cisteínas no protegidas y la previa desprotonación de cualesquiera residuos ácidos), estructuras primordialmente sacaridicas, y esteroidales . Los pasos de degradación A fin de evitar la acumulación irreversible en los órganos objetivo, los portadores auto-ensamblados deben demostrar alguna forma de degradación. Se conoce que los polisulfuros sufren oxidación fácilmente a polisulfóxidos e incluso a polisulfonas (figuras 6), v.gr., por la acción de agentes oxidantes tenues, tales como peróxido de hidrógeno. Bajo condiciones biológicas, esta oxidación puede llevarse a cabo de manera extra-celular, v.gr., por macrófagos, o intra-celularmente después de toma en un compartimiento endosomal o lisosomal. Un tipo similar de reacción es usado para oxidar PEGs tioéter terminados (usados como emulsificantes en procesamiento de pulpa y papel) a fin de romper las espumas de aguas de desecho (Wood y colaboradores, patente US 4, 618, 400), pero no se ha usado en degradación en materiales médicos bajo condiciones fisiológicas. La conversión de los polisulfuros en polisulfóxidos puede solubilizar los polímeros amfifílicos en agua, permitiendo la eliminación a través de la excreción. La conversión puede disparar la inestabilidad de los agregados auto-ensamblados, v.gr., la conversión de geles en micelios o polímeros solubles, la conversión de vesículas en micelios o polímeros solubles, o la conversión de micelios en micelios de diferente tamaño y forma o en polímeros solubles. Desestabilizar el agregado puede también disparar la liberación de los compuestos encapsulados , v.gr., un fármaco. En este sentido, la palabra "degradación" se refiere mas al tamaño y la estructura por eliminarse del cuerpo o la capacidad del cuerpo para eliminarla que al peso molecular del polímero mismo. Como tal, esta "degradación" oxidativa representa un nuevo método de eliminación de biomateriales del cuerpo, especialmente en aplicaciones de entrega de fármacos. Sin embargo, los mecanismos Redox pueden también ser usados para" afectar mas dramáticamente el peso molecular del polímero. Este efecto es cierto, por ejemplo, con los copolímeros AB-S-S-BA, que aproximadamente reducen el peso molecular a la mitad durante la reducción. La oxidación a sulfonas puede incrementar la solubilidad en agua y al mismo tiempo la despolimerización y otra degradación química hidrolítica. Los mecanismos de eliminación de polímeros solubles son relativamente bien comprendidos . El mas importante de tales mecanismos es la eliminación vía filtración renal, el corte de peso molecular efectivo de la cual es de aproximadamente 30,000. Las partículas de tamaño de menos de aproximadamente 100 nm pueden ser eliminadas de la corriente sanguínea en el hígado. La toma linfática también juega un papel importante . Auto-ensamble del portador Por largo tiempo se han usado copolímeros de bloques amfifílicos como tensioactivos y dispersantes en una amplia variedad de aplicaciones; la formación de estructuras organizadas en un solvente que es selectivo a uno de los bloques está en la base de este compor-amiento . Estructuras auto-ensambladas bien definidas, tales como micelios, lámelos o vesículas esféricos o cilindricos (Booth y colaboradores, Macromol . Chem. r Rapid Commun. 2000, 21, 501-527; Won, Science 1999, 283, 960-963; Discher y colaboradores, Science 1999, 284, 1143-1146; y Eisenberg y colaboradores, Macromolecules 1998, 31, 3509) han sido observadas en copolímeros de bloques de poli (oxialquileno) . La concentración de la solución polimérica y la temperatura influenciaron en gran medida el tipo de agregados que pueden formarse: cambiantes, v.gr., de fases micelares esféricas líquidas a fases cúbicas de micelios esféricos y finalmente a fases hexagonales de micelios cilindricos al ocurrir un incremento en la temperatura (Mortensen, Progr. Coll. Polym. Sci. 1993, 93). El diagrama de fases y las estructuras accesibles de los copolímeros de bloques amfifílicos exhiben una dependencia de la longitud y el número de bloques, es decir, básicamente, del balance hidrófilo/lipófilo . Los copolímeros de bloques de PEG con poli (etiletileno) han mostrado una propensidad a formar micelios similares a gusanos a una relación 55/45 entre unidades recurrentes hidrófi-las e hidrófobas (peso molecular total = 4,900), y a formar estructuras lamelares a una relación 40/37 (peso molecular total = 3, 900) . En condiciones adecuadas para la generación de micelios, el portador auto-ensamblado puede ser usado para la encapsulación de fármacos hidrófobos. Cuando van a formarse las fases lamelares, pueden generarse vesículas a partir del doblez de la estructura lamelar; de esta manera, los fármacos disueltos en agua pueden ser atrapados en la cavidad interna de la vesícula . Esta invención describe materiales capaces de' generar una amplia variedad de estructuras; por ejemplo, un material que contiene secuencias largas de grupos hidrófilos es capaz de formar micelios, mientras que un alto contenido hidrófobo facilita la formación de geles lamelares y, bajo condiciones adecuadas, vesículas. La formación de vesículas puede también ser lograda añadiendo al agua una solución o suspensión coloidal del copolímero en un solvente orgánico y posteriormente removiendo el solvente orgánico. Mediante esta invención, se describe también la preparación de copolímeros en bloques teniendo una estructura de tri-bloques, entre otras, de la forma ABA', donde A y A' solamente difieren en el peso molecular. En este caso, cuando se forman vesículas poliméricas, puede tener lugar bajo algunas, condiciones una localización preferencial del residuo mas grande en el lado externo de la vesícula. De esta manera, la funciona-lización de los grupos bioactivos puede estar dirigida selectivamente hacia el lado interno o externo de la vesícula, dependiendo de qué residuo hidrófilo ha sido derivado. Incluso en ausencia de tal localización preferencial, puede lograrse fácilmente la presentación de amplias cantidades de un ligando de objetivación u otra fracción biológica. Aplicaciones biomedicas para portadores auto-ensamblados Se han estudiado extensamente las partículas coloidales tales como nanoesferas, liposomas y micelios, para entrega de fármacos específica al sitio. Amenos que este sea un objetivo, las partículas deben escapar de la captura por el sistema retículo-endotelial (RES) del hígado y la gran actividad de filtración de los pulmones. En años recientes, se ha obtenido supervivencia prolongada de sistemas coloidales en la sangre mediante el uso de amfifílicos que contienen PEG (Lasic y colaboradores, editores, Stealth Liposomes; CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1995) ; gracias a la marcada reducción de opsonización por las proteínas de plasma, la eliminación de macrófagos de liposomas a base de PEG ha sido drásticamente reducida (Torchilin y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1994, 1195, 11-20) . Una variedad de ligandos, tales como anti-cuerpos, factores de crecimiento, citocinas, factores de adhesión, secuencias de oligonucleótidos y secuencias de localización nuclear, ha servido para acrecentar las capacidades de entrega de liposomas revestidos con PEG, y se ha demostrado que la máxima actividad es mostrada por ligandos atados al extremo distante de las cadenas de PEG (Blume y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1993, 1149, 180-184; Zalipsky y colaboradores, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 705-708; Zalipsky, J. , Controlled Reléase 1996, 39, 153-161; Gabizon, Bioconjugate Chem. 1999, 10, 289-298) . Algunos ligandos pueden llevar a toma celular sumamente eficiente, tal como el uso de factores de crecimiento, por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos, para efectuar toma celular de formulaciones de ADN. Otros ligandos pueden llevar a tráfico intra-celular sumamente eficiente, tales como secuencias de localización nuclear, que es particularmente útil en aplicaciones tales como entrega de genes no virales. Los polímeros de la presente invención son útiles para cualquier aplicación en la liberación controlada de un fármaco, donde un portador auto-ensamblado puede ser usado. Las ventajas de usar los copolímeros de bloques descritos en la presente son: (i) la flexibilidad de la estructura: con el mismo proceso y con la misma familia de reactivos, puede generarse una variedad de estructuras (v.gr., justo variando la cantidad de episulfuro monomérico en la polimerización iniciada por tiolato, se puede obtener una diferente longitud del bloque hidrófobo y un comportamiento diferente en agua) ; (ii) la facilidad de inserción de fracciones de objetivación (también referidas como grupos de objetivación) que acrecientan la selectividad de la entrega de fármaco; (iii) la posibilidad de degradación proteolítica objetivada, por inserción de secuencias péptidas especificas, o degradación oxidativa, mediante oxidación lenta u oxidación inducida celularmente durante la toma celular; (iv) la cantidad de PEG que puede desplegarse sobre la superficie del sistema auto-ensamblado, en donde esencialmente cada molécula componente dentro del sistema contiene un PEG injertado u otro polímero hidrófilo que impide la opsonización; (v) la posibilidad de proteger fármacos de otra manera sensibles dentro del ambiente protector de un agregado auto-ensamblado, tal como un micelio o una vesícula, para proteger el fármaco contra degradación o eliminación antes de alcanzar su objetivo pretendido; (vi) la posibilidad de disparar la liberación de los . contenidos, v.gr., un fármaco, del agregado auto-ensamblado, tal como un micelio o una vesícula, mediante la sensitividad del agregado al ambiente, tal como disparar una liberación con base en reducir el pH, incrementar el grado de oxidación, e incrementar la concentración de proteasas durante el proceso de tráfico intra-celular den endosoma al lisosoma; y (vii) la posibilidad de incorporar excipientes junto con un fármaco para ayudarle a alcanzar su objetivo biológico final, tal como incorporación de agentes que ayuda a desestabilizar o permeabilizar membranas biológicas, tales como las membranas endosomales o lisosomales, para acrecentar el transpor-te del fármaco al citoplasma o finalmente al núcleo.
Los siguientes e emplos son para ilustrar la invención. No pretenden limitar la invención en forma alguna. Ejemplo 1: preparación de los precursores de tiol Preparación de tioacetato de PEG, ruta A: Preparación de tosilato de monometoxi-PEG (MPEGOTs) : se introdujeron 2 g (2.7 x 10"1 moles) de monometoxi poli(etilen-glicol) (peso molecular de 750 D) - MPEG 750 (Fluka) , en un matraz de reacción de dos cuellos, bajo una atmósfera seca de Ar y se disolvieron en 30 mi de CH2C12. Se añadieron 2.2 mi de trietilamina (TEA) (0.016 moles) y, bajo agitación vigorosa, se añadieron 2.57 g (0.0135 moles) de cloruro de p-tolueno sulfonilo a la mezcla. La mezcla de reacción fue dejada por 24 horas a temperatura de habitación y luego filtrada para remover las sales formadas durante la reacción (hidrocloruro de trietilamonio) . La solución recolectada fue concentrada en el evaporador giratorio y filtrada en un lecho de celita. La solución fue entonces tratada con alúmina neutra, filtrada sobre papel, y precipitada en éter frió. Preparación de tioacetato de monometoxi-PEG: se disolvieron 2 g de MPEGOTs (peso molecular de aproximadamente 900 D, aproximadamente 2.22 x 10~3 moles) en 30 mi de acetona. Se añadieron 0.76 g de tioacetato de potasio (aproximadamente 6.67 x 10~3 moles) a la mezcla de reacción y se dejaron bajo agitación vigorosa durante la noche a temperatura de habitación. Las sales no disueltas fueron eliminadas por filtración en papel. La solución fue concentrada en el evaporador giratorio, y se recolectó tioacetato de PEG por precipitación en éter frió. El producto fue entonces disuelto en CH2C12 y la solución fue extractada con agua varias veces. La solución en CH2C12 fue secada con Na2S04 y luego precipitada en éter frió. Preparación de tioacetato de PEG, ruta B: Preparación de alil PEG: se introdujeron 2 g (2.7 x 10-3 moles) de monometoxi poli (etilenglicol) (peso molecular de 750 D) -MPEG 750 (Fluka)- en un matraz de reacción de dos cuellos bajo una atmósfera seca de Ar y se disolvieron en 30 mi de CH2C12. Se añadieron 2.2 mi de trietilamina (TEA) (0.016 moles), y bajo agitación vigorosa, se añadieron a la mezcla 1.63 g (0.0135 moles) de bromuro de alilo. La mezcla de reacción es dejada por 24 horas a temperatura de habitación y luego filtrada para remover sales formadas durante la reacción (hidrocloruro de trietilamonio) . La solución recolectada es a continuación concentrada en el evaporador giratorio y filtrada en un lecho de celita. La solución es entonces tratada con alúmina neutra, filtrada sobre papel, y precipitada en éter frió. Preparación de tioacetato de PEG: se disolvieron 2 g de. alil PEG (peso molecular de aproximadamente 790 D, aproximadamente 2.53 x 10"3 moles) en 30 mi de THF junto con 0.4 g de ácido tioacético (5.26 x 10^3 moles) y 0.85 g de azo-bis-isobutironitri-lo (AIBN) . La solución es calentada a 60°C por 20 horas, luego es concentrada en el evaporador giratorio, y es precipitada en éter frío. Preparación de xantato de 0-etil-S-m.onometoxi-PEG: Se disolvieron 2 g de MPEG-OTs (monometoxi PEG, activado terminalmente con tosilo, peso molecular de aproximadamente 900 D, aproximadamente 2.2 x 10"3 moles) en 30 mi de NMP. Se añadieron 1.07 g de O-etil xantato de potasio (aproximadamente 6.67 x 10~3 moles) a la mezcla de reacción bajo agitación vigorosa durante la noche a temperatura de habitación. La solución fue concentrada en el evaporador giratorio, disuelta en CH2C12 y luego filtrada con un papel filtro. Se recolectó xantato de O-etil-S-monometoxi PEG por precipitación en éter frió. El producto fue disuelto entonces en CH2C12 y la solución fue extractada con agua varias veces. La solución en CH2C12 fue secada con Na2S04 y luego precipitada en éter frió. Preparación de PVA tioacetato funcionalizado : Preparación de poli (alcohol vinílico) parcialmente tosilado: se hacen reaccionar 2 g de poli (alcohol vinilico) (peso molecular de 15, 000, 4.5 x 10"2 moles OH) con 5 g (5.3 x 10"2 moles) de cloruro de tosilo y 4.8 mi de TEA (0.063 moles), como se describe en el ejemplo para la preparación de tioacetato de PEG (ruta A) . La solución polimérica es entonces precipitada en hexano . Preparación de PVA parcialmente tioacetato funcionalizado: el polímero antes obtenido fue hecho reaccionar con tioacetato de potasio como en el ejemplo para la preparación de tioacetato de PEG (ruta A) . La solución polimérica es entonces precipitada en hexano . Ejemplo 2: preparación en un paso de copolimeros de bloques no funcionalizados y funcionalizados Generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG, polimerización de epilsulfuros, y remate de extremos de la cadena de polisulfuro con monoacrilato de PEG Se introdujeron 0.3 g de tioacetato de monometoxi PEG 750 en un matraz de dos cuellos bajo una atmósfera seca de Ar y se disolvieron en THF recién destilado. Se añadió un equivalente de MeONa en una solución 0.5 M en MeOH y se dejó a temperatura de habitación por 30 minutos. El episulfuro (sulfuro de propileno) fue entonces añadido en una cantidad apropiada (generalmente entre 25 y 50 equivalentes; el número de equivalentes determina el peso molecular del bloque de polisulfuros) , bajo agitación vigorosa. Después de aproximadamente 30 minutos, estuvo completa la polimerización, y se introdujeron 10 equivalentes de monoacrilato de PEG como agente de remate de extremos para reaccionar durante la noche a temperatura de habitación. El copolimero fue recolectado por precipitación en MeOH. Preparación de monoacrilato de PEG funcionalizado en extremos con péptido Se deja disolver diacrilato de PEG de peso molecular 8,000 (230 mg/ml) en solución salina amortiguada con HEPES (HEPES 10 mmol (Sigma) , 8 g/1 NaCl, pH 7.4) por una hora. Se añade trietanolamina (Aldrich, 15.3 µ?/ml) , y se ajusta el pH de la solución a 8 con HC1 6N. Péptidos conteniendo cisteina son disueltos en 5 mi de solución salina amortiguada con HEPES y añadidos a 40 mi de solución de diacrilato de PEG, con operación de un dispositivo de vórtice. Los reactivos son incubados por 6 horas. La solución es entonces dializada contra agua pura por 24 horas y secada con congelamiento. El polímero es disuelto en 5 mi de diclorometano y precipitado en hexano. Generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG, polimerización de epilsulfuros, y remate de extremos de la cadena de polisulfuro con monoacrilato de PEG terminado con péptido Se lleva a cabo el mismo procedimiento que en el ejemplo para la generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG, polimerización de episulfuros, y remate de extremos de la cadena de polisulfuro con monoacrilato de PEG, pero usando el monoacrilato de PEG terminado con péptido, sintetizado como en el ejemplo para la preparación de monoacrilato de PEG funcionalizado en extremos con péptido, en vez de monoacrilato de PEG. Generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG, polimerización de episulfuros, y dimerización oxidativa del tiol terminal de la cadena de polisulfuro Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el ejemplo para la generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG y polimerización de episulfuros, pero no se usó agente de remate de extremos . La solución fue entonces expuesta a aire para 12 horas. El copolimero fue recolectado por precipitación en MeOH. Ejemplo 3: preparación de copolímeros de bloques en dos pasos La generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG, polimerización de episulfuros, y remate de extremos de la cadena de polisulfuro con bióxido de tiirano fue llevada a cabo como en el ejemplo para la generación de tiolato a partir de tioacetato de PEG, polimerización de episulfuros, y remate de extremos de la cadena de polisulfuro con monoacrilato de PEG, bióxido de tiirano usando en lugar de monoacrilato de PEG. Ejemplo 4 : análisis de estructuras lamelares poliméricas Análisis microscópico óptico en películas Un copolimero de tri-bloques hecho de una secuencia 16:25:8 de unidades monoméricas de, respectivamente, etilengli-col, sulfuro de propileno, y etilenglicol, fue disuelto en CH2Cl2, y el solvente fue evaporado para obtener una película polimérica. Esta película fue hidratada con agua bi-destilada y un patrón de bi-refringencia inmediatamente desarrollado bajo observación microscópica óptica con polarizadores cruzados. Análisis TEM Un copolimero de tri-bloques hecho de una secuencia 16:25:8 de unidades monoméricas de, respectivamente, etilenglicol, sulfuro de propileno, y etilenglicol, fue disuelto en CH2C12, y el solvente fue evaporado para obtener una película polimérica. Se añade agua a fin de producir una dispersión al 50% peso/peso en la forma de un gel que fue homogeneizado por operación de dispositivo de vórtice por cinco minutos. Se añadió agua adicional para reducir la dispersión a una concentración de 20% del polímero peso/peso, y la muestra fue entonces fracturada por congelamiento utilizando la técnica de enfriamiento ultra-rápido con propano líquido (Gulik-Krzywicki y colaboradores, Langmuir 1996, 12, 4668-4671). Imágenes de TEM fueron registradas en réplicas de grafito (figuras 9A y 9B) . Ejemplo 5: morfología Se prepararon copolímeros de multi-bloques con los métodos descritos en la presente de auto-ensamble en agua; por e emplo, un polímero constituido por 25 unidades monoméricas de sulfuro de propileno y 24 de etilenglicol , en una secuencia 16:25:8, fue dispersado en agua a una concentración de 0.1% peso/ peso, luego secado lentamente; la investigación por TEM mostró la formación de estructuras micelares similares a gusanos (figuras 7A y 7b) , con una cierta tendencia a la formación de agregados de orden superior en espiral. Un copolímero de tri-bloques, hecho de sulfuro de propileno y etilenglicol (figura 4) exhibió estructuras lamelares típicas en el microscopio óptico con polarizadores cruzados (figura 8); después de tratamiento sónico, la dispersión en agua fue fracturada por congelamiento: la imagen TEM correspondiente mostró la formación de vesículas multi-lamelares coexistentes con estructuras lamelares residuales (figura 9A y 9B) o con vesículas mono-lamelares (figuras 9?, 9B y 9C) . Ejemplo 6: preparación de suspensiones vesiculares Pueden prepararse agregados vesiculares de sustancias amfifílicas por dispersión de agregados liotrópicos lamelares o por intercambio con solventes a partir de soluciones orgánicas . En el primer caso, el material amfifílico es primero expuesto al agua, a fin de generar una fase lamelar en capas, que luego se desintegra por acción mecánica y genera estructuras vesiculares esféricas. En el segundo caso, una solución del polímero en un solvente orgánico soluble en agua es dejada caer al agua, y el intercambio de solventes genera estructuras liotrópicas. Las sustancias por encapsularse son, en el primer caso, disueltas en el agua usada para la hidratación de película y, en el segundo caso, co-disueltas en el solvente orgánico. En ambos casos, la suspensión es entonces extrudida o filtrada para reducir y homogeneizar el diámetro de las estructuras vesiculares y dializadas a fin de remover material no encapsulado. Preparación a partir de películas hidratadas Una solución en CH2C12 de un copolímero de tri-bloques, hecho de una secuencia 16:25:8 de unidades monoméricas de, respectivamente, etilenglicol, sulfuro de propileno, y etilengli-col, fue evaporada en un matraz para rendir una película polimérica. Se añadió agua para producir una concentración de 2% del polímero en peso. La mezcla fue entonces tratada con un dispositivo de vórtice por 5 minutos y tratada con tres ciclos de congelamiento-descongelamiento en nitrógeno liquido. La suspensión fue finalmente filtrada 10 veces a través de membranas de policarbonato teniendo un tamaño de poro de 100 o 200 nm. Los radios hidro-dinámicos de las vesículas fueron caracterizados con dispersión dinámica de luz. Preparación a partir de una solución orgánica Una solución en tetrahidrofurano de un copolímero de tri-bloques hecho de una secuencia 16:25:8 de unidades monoméri-cas de, respectivamente, etilenglicol, sulfuro de propileno, y etilenglicol, es añadida gota a gota a una membrana de diálisis inmersa en agua. La concentración final del polímero en el volumen delimitado por la membrana es estimada ser de 3% en peso. Después de un día de diálisis, la suspensión fue purificada con el mismo procedimiento que en el ejemplo de preparación a partir de película hidratada. Ejemplo 7: uso de una suspensión de vesículas para encapsulación de derivados de ácido nucleico Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el ejemplo para la preparación de suspensiones de vesículas a partir de películas hidratadas, pero se usó una solución 10"6 M de oligodesoxinucleótido (ODN) anti-sentido (para b-FGF en la posición 57 a 63 en la proteína de 21 kD 196 ??) (Inoue y colaboradores, Clinical Cáncer Research 2000, 6, 4422-4431) , etiquetado fluorescentemente con fluoresceína . Se llevó a cabo diálisis hasta la desaparición de la fluorescencia de fluoresceí-na (Ex. 497 nm, Em. 520 nm) en la solución de diálisis. Ejemplo 8: uso de una suspensión de vesículas que encapsulan derivados de ácido nucleico para entrega de genes a células cultivadas Se cultivaron fibroblastos de la frente humanos en poliestireno de cultivo de tejidos (TCPS) en una placa de 24 cavidades hasta que hubo 60% de confluencia. Una suspensión vesicular al 0.5% en peso fue añadida en un volumen apropiado para añadir 1 mg de ODN por cavidad y se dejó en contacto con la capa celular por 60 minutos. Después del lavado, fue reemplazada con medio Eagle de Dulbecco, modificado con 10% de suero fetal de bovino y ????. Se tomaron imágenes de células a diversos intervalos de tiempo y se compararon con la administración de la misma cantidad de ODN anti-sentido no encapsulado. Los experimentos de control mostraron un efecto despreciable sobre el comportamiento celular, mientras que el material encapsulado inhibió el crecimiento celular y la proliferación. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente mencionadas en esta descripción son incorporadas en la presente por referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente independiente fuese indicada específica e individualmente ser incorporada por referencia.