LUPUS ERITEMATOSO SISTÉ ICO
Cam po de la Invención La presente invención se refiere a métodos y materiales comprendidos en el diagnóstico del l upus eritematoso sistémico (SLE). Más particularmente, la invención se refiere a métodos y materiales comprendidos en el d iagnóstico del SLE, el diagnóstico del SLE severo , y la evaluación de la susceptibilidad de un mamífero para desarrol lar el SLE severo. Antecedentes de la I nvención El SLE es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica caracterizada por la prod ucción de autoanticuerpos q ue tiene carácter específico por una amplia gama de autoantígenos. Los autoanticuerpos del SLE median el daño a los órganos uniéndose directamente a los tejidos del hospedero, y formando complejos i n munes que se depositan en tejidos vasculares y activan a las células i nmunes. Los órganos di rigidos en el SLE incluyen la piel , los ríñones, la vasculatura, las articu laciones, varios elementos sangu íneos y el sistema nervioso central (SNC). La severidad de la enfermedad , el espectro de la intervención clínica y la respuesta a la terapia, varían ampliamente entre los pacientes. Esta heterogeneidad cl ínica hace desafiante diagnosticar y manejar el lupus. Sumario de la Invención La invención se refiere a métodos y materiales comprendidos en el diagnóstico del SLE. Más particularmente, la invención se refiere a métodos y materiales comprendidos en el diagnóstico del SLE, el diagnóstico del SLE severo y la evaluación de la susceptibilidad de un mamífero para desarrollar el SLE severo. Por ejemplo, la invención provee disposiciones de ácido nucleico que se pueden usar para diagnosticar el SLE en un mamífero. Dichas disposiciones pueden permitir que los médicos clínicos diagnostiquen el SLE con base en una determinación de los niveles de expresión de muchos genes que se expresan diferencialmente en pacientes con SLE, en comparación con controles sanos. Además, la invención provee métodos y materiales comprendidos en el diagnóstico de condiciones del SLE que van acompañadas de la activación de una vía de interferón. Para el propósito de esta invención, el término "SLE acompañado por activación de una vía de interferón" (abreviado como "SLE-AIP"), se refiere a cualquier condición del SLE que coexiste con, o es causada por, la activación de una vía de interferón. La activación de una vía de interferón se refiere a un estado en donde genes regulados por interferón que son sobrerregulados en respuesta al interferón son sobrerregulados, y en donde genes regulados por el interferón que son subregulados en respuesta al interferón, son subregulados. Típicamente, la activación de una vía de interferón da como resultado la presencia de un perfil de expresión de genes que es similar al perfil de expresión de genes observado en células que fueron tratadas con interferón. Una vía de interferón se puede activar sin importar la presencia o ausencia de niveles detectables de interferón. Por ejemplo, un paciente con SLE puede tener bajos niveles de interferón detectables, mientras exhibe un perfil de expresión de genes característico de una vía de interferón activada. Se puede diagnosticar que dicho paciente tiene SLE-AIP. El diagnóstico de pacientes que tienen SLE-AI P, puede ayudar a los médicos clínicos a determinar tratamientos apropiados para esos pacientes. Por ejemplo, un clínico que diagnostique que un paciente tiene SLE-AIP puede tratar a ese paciente con medicación que mejore los síntomas del SLE del paciente y activación aberrante de una vía de interferón. En algunos casos, se puede usar una sola medicación para invertir la activación de una vía de interferón del paciente, de modo que los síntomas del SLE del paciente son reducidos o aliviados. De esta manera, el tratamiento de un paciente que tiene SLE-AI P, modulando el nivel de activación de la vía de interferón, puede mejorar la salud y calidad de vida de ese paciente, por ejemplo, disminuyendo los síntomas asociados con el SLE. Típicamente, se puede hacer un diagnóstico del SLE con base en 1 1 criterios definidos por el American College of Rheumatology (ACR). Estos criterios incluyen rash malar, rash discoide, fotosensibilidad, úlceras orales, artritis, serositis, trastorno renal, trastorno neurológico, trastorno hematológico, trastorno inmunológico y anticuerpo antinuclear (Tan et al. (1982) Arthritis Rheum. 25: 1 271 -1277). Un mamífero (por ejemplo, un humano) puede ser diagnosticado clínicamente con SLE, si cubre por lo menos cuatro de los once criterios. El término "SLE severo", como se usa en la presente, se refiere a una condición de SLE en donde el paciente tiene uno o más de los siguientes: compromiso renal, del sistema nervioso central o hematológico. La invención se basa en el descubrimiento de genes que se expresan diferencialmente entre pacientes con SLE y controles sanos. La invención se basa también en el descubrimiento de que los niveles de expresión de estos genes se pueden usar para distinguir mamíferos con SLE de mamíferos sanos. Por ejemplo, los niveles de expresión para los genes incluidos en el cuadro I se pueden evaluar para diagnosticar el SLE. Además, la invención se basa en el descubrimiento de que una porción de pacientes con SLE puede tener SLE asociado con o causado por activación de una vía de interferón. Por ejemplo, los pacientes son SLE que tienen SLE severo pueden ser, por lo menos parcialmente, dependientes de la presencia de una vía de interferón activada. Además, la invención se basa en el descubrimiento de genes que se expresan diferencialmente entre pacientes con SLE-AIP y pacientes con SLE no asociados con una vía de interferón activada. Por ejemplo, los niveles de expresión para los genes incluidos en el cuadro IV se pueden evaluar para diagnosticar SLE-AIP. En un aspecto, la invención provee un método para diagnosticar lupus eritematoso sistémico severo. El método puede implicar determinar si un mamífero contiene o no células que expresan por lo menos dos de los genes incluidos en el cuadro 4, a un grado mayor que o menor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de uno o más mamíferos control, en donde el mamífero y los uno o más mamíferos control son de la misma especie, y diagnosticar que el mamífero tiene lupus eritematoso sistémico severo si el mamífero contiene las células, y diagnosticar que el mamífero no tiene lupus eritematoso sistémico severo si el mamífero no contiene las células. El mamífero puede ser un humano. Los mamíferos control, pueden ser humanos sanos o humanos con lupus eritematoso sistémico moderado. Las células y las células control pueden ser células mononucleares de sangre periférica. El método puede implicar determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos 5 o por lo menos 10 de los genes, a un grado mayor que o menor que el nivel de expresión exhibido en las células control. El grado puede ser menor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de por lo menos 10 o por lo menos 20 mamíferos control. El paso de determinación puede implicar medir el nivel de ARN mensajero expresado a partir de por lo menos 2 de los genes. En otro aspecto, la invención provee un método para evaluar la predisposición de un mamífero para desarrollar lupus eritematoso sistémico severo. El método puede implicar determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos dos de los genes incluidos en el cuadro 4, a un grado mayor que o menor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de uno o más mamíferos control, en donde el mamífero y los uno o más mamíferos control son de la misma especie, y clasificar al mamífero como susceptible a desarrollar lupus eritematoso sistémico severo si el mamífero contiene las células, y clasificar al mamífero como no susceptible a desarrollar lupus eritematoso sistémico severo si el mamífero no contiene las células. El mamífero puede ser un humano. Los mamíferos control, pueden ser humanos sanos. Las células y las células control pueden ser células mononucleares de sangre periférica. El método puede implicar también determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos 5 o por lo menos 1 0 de los genes, a un grado mayor que o menor que el nivel de expresión exhibido en las células control. El método puede implicar determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos 10 de los genes, a un grado mayor que o menor que el nivel de expresión exhibido en las células control. El grado puede ser mayor que o menor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de por lo menos 10 o por lo menos 20 mamíferos control. El paso de determinación puede implicar medir el nivel de ARN mensajero expresado a partir de por lo menos 5 de los genes. En otro aspecto, la invención provee un método para diagnosticar lupus eritematoso sistémico en un mamífero. El método puede implicar determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos 10 de los genes incluidos en el cuadro 1 , a un grado mayor que o menor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de uno o más mamíferos control, en donde el mamífero y los uno o más mamíferos control son de la misma especie, y diagnosticar que el mamífero tiene lupus eritematoso sistémico si el mamífero contiene las células, y diagnosticar que el mamífero no tiene lupus eritematoso sistémico si el mamífero no contiene las células. En otro aspecto, la invención provee un método para diagnosticar lupus eritematoso sistémico en un mamífero. El método puede implicar determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos 5 de los genes incluidos en el cuadro 2, a un grado mayor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de uno o más mamíferos control, en donde el mamífero y los uno o más mamíferos control son de la misma especie, y diagnosticar que el mamífero tiene lupus eritematoso sistémico si el mamífero contiene las células, y diagnosticar que dicho mamífero no tiene lupus eritematoso sistémico si el mamífero no contiene las células. La invención provee también un método para diagnosticar lupus eritematoso sistémico en un mamífero. El método puede implicar determinar si el mamífero contiene o no células que expresan por lo menos 5 de los genes incluidos en el cuadro 3, a un grado menor que el nivel de expresión promedio exhibido en células control de uno o más mamíferos control, en donde el mamífero y los uno o más mamíferos control son de la misma especie, y diagnosticar que el mamífero tiene lupus eritematoso sistémico si el mamífero contiene las células, y diagnosticar que el mamífero no tiene lupus eritematoso sistémico si el mamífero no contiene las células.
En otro aspecto, la invención provee una disposición de ácido nucleico, que contiene por lo menos 20 moléculas de ácido nucleico. Cada una de las por lo menos 20 moléculas de ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente, y por lo menos 50 por ciento de las moléculas de ácido nucleico de la disposición puede contener una secuencia de gen seleccionado del grupo que consiste de los genes incluidos en el cuadro 1. La disposición puede contener por lo menos 50 moléculas de ácido nucleico, y cada una de las por lo menos 50 moléculas de ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente. La disposición puede contener por lo menos 100 moléculas de ácido nucleico, y cada una de las por lo menos 100 moléculas de ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente. Cada una de las moléculas de ácido nucleico que contiene una secuencia de un gen seleccionado del grupo puede contener no más de tres no apareamientos. Por lo menos 75 por ciento o por lo menos 95 por ciento de las moléculas de ácido nucleico de la disposición, puede contener una secuencia de un gen seleccionado del grupo. La disposición puede contener vidrio. En otro aspecto, la invención provee una disposición de ácido nucleico, que contiene por lo menos 5 moléculas de ácido nucleico. Cada una de las por io menos 5 moléculas de ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente, y por lo menos 50 por ciento de las moléculas de ácido nucleico de la disposición puede contener una secuencia de gen seleccionado del grupo que consiste de los genes incluidos en el cuadro 4. La disposición puede contener por lo menos 10 moléculas de ácido nucleico, y cada una de las por lo menos 10 moléculas de ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente. La disposición puede contener por lo menos 20 moléculas de ácido nucleico, y cada una de las por lo menos 20 moléculas de ácido nucleico puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente. Cada una de las moléculas de ácido nucleico que contiene una secuencia de un gen seleccionado del grupo puede contener no más de tres no apareamientos. Por lo menos 75 por ciento o por lo menos 95 por ciento de las moléculas de ácido nucleico de la disposición, puede contener una secuencia de un gen seleccionado del grupo. La disposición puede contener vidrio. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente, tienen el mismo significado como lo entienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, estará bajo control. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos, y no se pretende que sean limitativos. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una gráfica que muestra puntuaciones de IFN que se calcularon para pacientes con SLE y sujetos control usando los niveles de expresión normalizados de los 14 genes regulados por I FN que comprenden la rúbrica de I FN; p=2.8x10"7 La figura 2 es una gráfica que muestra el número de criterios del SLE observados en 24 pacientes con SLE con las puntuaciones más altas de IFN y en los 24 pacientes con SLE con las puntuaciones más bajas de IFN; p=0.002. La figura 3 es una gráfica que muestra el número de criterios del SLE cubiertos por cada paciente contra la puntuación de I FN de cada paciente. La figura 4 es una gráfica de barras que muestra el porcentaje de pacientes en los grupos con alta puntuación de I FN y baja puntuación de IFN con criterios definidos por la ACR para enfermedad renal y/o del sistema nervioso central (p=7.7x10 6) o compromiso hematológico (p=6.1 x1 0"9). Descripción Detallada de la Invención La invención provee métodos y materiales usados en el diagnóstico del SLE. Más particularmente, la invención se refiere a métodos y materiales usados en el diagnóstico del SLE, el diagnóstico del SLE severo, y la evaluación de la susceptibilidad de un mamífero para desarrollar SLE severo. Por ejemplo, la Invención provee disposiciones de ácido nucleico que se pueden usar para diagnosticar SLE, SLE severo y/o SLE-AIP en un mamífero. Dichas disposiciones pueden permitir que los médicos clínicos diagnostiquen el SLE, SLE severo y/o SLE-AI P con base en una determinación de los niveles de expresión de muchos genes que se expresan diferencialmente. Diagnóstico del SLE La invención provee métodos para diagnosticar que un mamífero (por ejemplo, un humano) tiene SLE. En una modalidad, se puede diagnosticar que un mamífero tiene SLE, si se determina que el mamífero contiene células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 1 , a un nivel que es mayor o menor que el nivel de expresión promedio de los mismos uno o más genes observados en células control obtenidas de mamíferos control. En otra modalidad, se puede diagnosticar que un mam ífero tiene SLE si se determina que el mamífero contiene células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 2, a un nivel que es mayor que el nivel de expresión promedio de los mismos uno o más genes observados en células control obtenidas de mamíferos control. En otra modalidad más, se puede diagnosticar que un mamífero tiene SLE si se determina que el mamífero contiene células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 3, a un nivel que es menor que el nivel de expresión promedio de los mismos uno o más genes observados en células control obtenidas de mamíferos control.
El mamífero puede ser cualquier mamífero tal como un humano, perro, ratón o rata. Se puede aislar y evaluar cualquier tipo de célula. Por ejemplo, se pueden aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), glóbulos blancos totales, células de nodulos linfáticos, células de bazo o células de amígdala de un paciente humano, y se pueden evaluar para determinar si ese paciente contiene células que ( 1 ) expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 1 , a un nivel que es mayor o menor que el nivel de expresión promedio observado en células control, (2) expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 2, a un nivel que es mayor que el nivel de expresión promedio observado en células control, o (3) expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 3, a un nivel que es menor que el nivel de expresión promedio observado en células control. La expresión de cualquier número de los genes incluidos en los cuadros 1 , 2 ó 3 se puede evaluar para diagnosticar el SLE. Por ejemplo, se puede usar la expresión de uno o más de uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 1 5, 20, 25, 30, o más de 30) de los genes incluidos en los cuadros 1 , 2 ó 3. El nivel de expresión puede ser mayor que o menor que el nivel promedio observado en células control, obtenidas de mamíferos controi . Típicamente, un gen se puede clasificar por ser expresado a un nivel que es mayor que o menor que el nivel promedio observado en células control, si los niveles de expresión difieren por cuando menos 1 vez (por ejemplo 1 .5 veces, 2 veces, 3 veces, o más de 3 veces). Además, las células control son típicamente el mismo tipo de células que las aisladas del mamífero que está siendo evaluado. En algunos casos, las células control se pueden aislar de uno o más mam íferos que son de la misma especie que el mamífero que está siendo evaluado. Cuando se diagnostica el SLE, las células control se pueden aislar de mamíferos sanos tales como humanos sanos que no tienen SLE. Se puede usar cualquier número de mamíferos control para obtener las células control. Por ejemplo, las células control se pueden obtener de uno o más mamíferos sanos (por ejemplo, por lo menos 5, por lo menos 1 0, por lo menos 15, por lo menos 20, o más de 20 mamíferos control). Se puede usar cualquier método para determinar si un gen específico es expresado o no a un nivel que es mayor o menor que el nivel de expresión promedio observado en células control. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen particular se puede medir evaluando el nivel de expresión del ARN mensajero del gen. Los niveles de expresión del ARN mensajero se pueden evaluar usando, sin limitación, northern blotting, slot blotting , reacción en cadena de polimerasa - transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), o técnicas de hibridación de chips. Los métodos para las pruebas de hibridación de chips incluyen , sin limitación, los descritos en la presente. Dichos métodos se pueden usar para determinar simultáneamente los niveles de expresión relativos de moléculas de ARN mensajero múltiples. En forma alternativa, el nivel de expresión de un gen particular se puede med i r eval uando los niveles de polipéptidos. Los niveles de polipéptidos se pueden medir usando cualquier método tal como pruebas basadas en reacciones inmu nologicas (por ejemplo, ELISA) , western blotting o tinción con plata . CUADRO 1 Genes con niveles de expresión q ue difieren entre pacientes con S LE y controles normales
No. de acceso Gen U60060 Proteína zeta 1 de fasciculación y elongación (zigina I)
AF057036 Subunidad de cola tipo colágena (cadena sencilla de homotrímero) de acetilcolinesterasa asimétrica M93107 3-hidroxibutirato deshidrogenasa (del corazón, mitocondrial) U 14575 Proteína fosfatasa 1 , subunidad reguladora (inhibidora) 8 X 5882 Dominio globular C-terminal alfa-2 de colágena VI
S68805 Glicina amidinotransferasa (L-arginina:glicina amidinotransferasa) U75744 Desoxirribonucleasa I tipo 3 AF091071 Similar a RER1 de S. cerevisiae A1651806 Neurona motora 1 rica en cisteína AB028994 Proteína KIAA1071 S75168 Tirosina cinasa asociada a megacariocitos X73617 Locus delta del receptor de células T X07730 Calicreína 3 (antígeno específico de próstata)
AF009787 Locus beta del receptor de células T M21624 Locus delta del receptor de células T AB009598 Beta-1,3-glucuroniltransferasa 3 (glucuronosiltransferasa I) AL021154 Factor de transcripción 2 de E2F L25444 ARN polimerasa II de TAF6, proteína de unión a caja TATA (TBP) - factor asociado, 80 kD AJ001383 Homólogo de antígeno 94 de linfocitos, receptor de NK de activación; NK-p46 (ratón) AJ001383 Homólogo de antígeno 94 de linfocitos, receptor de NK de activación; NK-p46 (ratón) U75370 Polimerasa (ARN) mitocondrial (dirigida por ADN)
AL049365 DKFZp586A0618 M16801 Subfamilia 3 de receptores nucleares, grupo C, miembro 2 M28827 Antígeno CD1C, polipéptido c U51712 Proteína hipotética SMAP31 X66079 Factor de transcripción Spi-B (relacionado a Spi- 1/PU.1) U11276 Subfamilia de receptores B tipo lectina de células asesinas, miembro 1 U11276 Subfamilia de receptores B tipo lectina de células asesinas, miembro 1 36881 Proteína tirosina cinasa específica de linfocitos
M31523 Factor de transcripción 3 (factores de unión E12/E47 del intensificador de inmunoglobulina de E2A)
M26062 Receptor de interleucina-2, beta AF026031 Receptor de incorporación de proteína de membrana exterior mitocondríal putativo AB011115 Proteína K1AA0543 AF041261 Receptor tipo inmunoglobulina de leucocitos, subfamilia A (sin dominio TM), miembro 4 D55716 Deficiente en mantenimiento de minicromosomas 7 de MCM7 (S. cerevisiae) L04282 Proteína del dedo de zinc 148 (pHZ-52) AJ001687 Segmento de ADN en la secuencia expresada 2849 del cromosoma 12 (único) AI524873 Tipo proteína E46 de cerebro de ratón U76421 Adenosina desaminasa, específica de ARN, B1 (homólogo de RED1 de rata) AF031137 Antígeno 17 de linfocitos X59871 Factor de transcripción 7 (específico de células T, caja HMG) U43408 Tirosina cinasa, no receptora, 1 AB018289 Proteína KIAA0746 ?1761647 IMAGE-2370113 ? 18737 Granzima A (granzima 1 , serina esterasa 3 asociada a linfocitos T citotóxicos) ??023220 Proteasa 20 específica de ubiquitina W26633 Antígeno de melanoma, familia D, 1 ?68892 Integrina, beta 7 AJ236885 Proteína del dedo de zinc 148 (pHZ-52) L13858 Homólogo 2 de son of sevenless (Drosophlla) AF094481 Proteína de unión 1 de repetición del triplete CGG ?28215 RAB5A, familia de oncogenes del miembro RAS U43083 Proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), polipéptido q ?02344 Tubulina, beta, 2 ?22324 Alanilaminopeptidasa (de membrana) (aminopeptidasa N, aminopeptidasa , aminopeptidasa microsomal, CD13, p150)
?07566 Tipo Ric, expresado en muchos tejidos (Drosophila) U50553 Polipéptido 3 de caja DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His)
?54134 Proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, E L40388 Proteína 15 de interacción con receptores de tiroides L19872 Receptor de hidrocarburos de arilo U78 07 Proteína de unión a factor sensible a N-etilmaleimida, gamma
AL050272 Proteína D FZP566B183 U56998 Cinasa inducible por citocina ??189226 RAB31 , familia de oncogenes del miembro RAS Z50781 Péptido delta inductor del sueño, inmunorreactor
S87759 Proteína fosfatasa 1A (antes 2C), dependiente de magnesio, isoforma alfa U88629 ARN polimerasa II relacionada a ELL, factor de elongación AF006513 Proteína de unión 1 a ADN de helicasa de cromodomlnio Al 138605 Proteína hipotética DKFZp566A 524 L16794 Factor intensificador 2 de transcripción de caja MADS, polipéptido D (factor intensificador 2D de miocitos)
AL080235 Senescencia 1 inducida por Ras L17418 Receptor 1 componente del complemento (3b/4b), incluyendo sistema del grupo sanguíneo de Knops
Y00816 Receptor 1 componente del complemento (3b/4b), incluyendo sistema del grupo sanguíneo de Knops 63835 Fragmento Fe de IgG, la de alta afinidad, receptor para (CD64) L13943 Glicerol cinasa U89278 Regulador 2 del desarrollo temprano (homólogo de pollhomeótico 2) U58334 Proteína de unión a p53 de proteína tumoral, 2
X54134 Proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, E X59834 Glutamato-amoníaco ligasa (glutamina sintasa)
AL047596 Homólogo de capicúa (Drosop ila) AB0232 Peptidil arginina deiminasa tipo II D43945 Factor de transcripción EC U79273 Clon 23933 Z18956 Familia 6 de vehículos de solutos (transportador de neurotransmisores, taurina), miembro 6 Y10313 Regulador del desarrollo 1 relacionado a interferón
AF004849 Proteína cinasa 3 de interacción con homeodominio
AI808958 Proteína KIAA0870 U47634 Tubulina, beta, 4 X55988 Ribonucleasa, familia de ribonucleasa A, 2 (del hígado, neurotoxina derivada de eosinófilos) W29030 Proteína CGI-49 U12471 Trombospondina-1 AF013591 Homólogo de sudD (supresor de bimD6, Aspergillus nidulans) X52015 Antagonistas de receptores de interleucina- M 16967 Factor de coagulación V (proacelerina, factor lábil)
U57094 RAB27A, familia de oncogenes del miembro RAS U66711 Complejo de antígeno 6 de linfocitos, locus E AA52 060 IMAGE-826408 X68090 Clase NA del receptor Fe de IgG Y08 36 Fosfodiesterasa tipo esfingomielinasa acida AL049685 Proteína hipotética similar a proteínas G pequeñas, especialmente RAP-2A L28957 Fosfato citidililtransferasa 1 , colina, isoforma alfa
Z22576 Antígeno CD69 (p60, antígeno de activación temprana de células T) U41766 Un dominio 9 de desintegrina y metaloproteinasa (meltrina gamma) M57230 Transductor de señal de interleucina-6 (gp 30, receptor M de oncostatina) X17094 Enzima proteolítica de aminoácidos básicos pareados (furina, proteína receptora asociada a membrana)
AC005192 Regulador del desarrollo 1 relacionado a interferón
AI547258 etalotioneína 2A L22075 Proteína de unión a nucleotidos de guanina (proteína G), alfa 13 U22431 Factor 1 inducible por hipoxia, subunidad alfa (factor de transcripción básico de hélice-bucle-hélice)
AB006746 Escramblasa 1 de fosfolípidos AF030196 Estanina AA010078 Familia de histonas H4, miembro D X56807 Desmocolina 2 AL080156 Proteína DKFZP434J214 AF017257 Homólogo 2 del oncogen E26 del virus de eritroblastosis v-ets (aves) AL049340 DKFZp564P056 24283 Molécula de adhesión intercelular 1 (CD54), receptor de rinovirus de humanos D49817 6-fosfofructo-2-cinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa 3
AF016903 Agrina U77914 Jagged 1 (síndrome de Alagille) M33882 Resistencia a mixovirus 1 (influenza), homólogo de murino (proteína p78 inducible por interferón) U68385 Meisl , homólogo 3 del sitio de integración viral ecotrópico mieloide 1 (ratón) L05515 Proteína de unión CRE-BPa a elementos de respuesta a AMPc U 15555 Serina palmitoiltransferasa, subunidad básica 2 de cadena larga L42025 Proteína de unión a Rev de VIH-1 X07834 Superóxido dismutasa 2, mitocondrial D90144 Pequeña citocina A3 inducible M 13755 Proteína estimulada por interferón, 15 kDa M83670 Anhidrasa carbónica IV 55047 Sinaptotagmina I U91512 Ninjurina 1 AB008775 Acuaporina 9 X79535 Tubulina, polipéptido beta J04102 Homólogo 2 del oncogen E26 del virus de eritroblastosis v-ets (aves) D10040 Ligasa de ácido graso-coenzima A, cadena larga 2
AW044649 Polipéptido asociado a sin-3, 30KD D10040 Ligasa de ácido graso-coenzima A, cadena larga 2 AW044649 Polipéptido asociado a sin-3, 30KD X03473 Familia de histonas H1, miembro 0 AB007448 Familia 22 de vehículos de solutos (trasportador de cationes orgánicos), miembro 4 Z14138 Proteína cinasa cinasa cinasa 8 activada por mitógenos
X02419 uPA U 10473 UDP-Gai:betaGIcNAc beta 1 ,4-gaIactosiItransferasa, polipéptido 1 A1679353 Familia 11 de vehículos de solutos (transportadores de iones metálicos divalentes acoplados a protones), miembro 1 AA203213 Proteína estimulada por interferón, 15 kDa AB018259 Producto del gen KIAA0716 AF055993 Polipéptido asociado a sin-3, 30 kD X54486 Inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clade G (inhibidor C1), miembro 1 AJ225089 Tipo 2'-5'-oligoaden¡iato sintetasa AL022318 Similar a APOBEC1 S59049 Regulador de señalización 1 de proteína G Y10032 Cinasa regulada por glucocorticoides/suero AI924594 Tetraspan 2 D21205 Proteína del dedo d zinc 147 (proteína del dedo de zinc sensible a estrógeno) U37707 Proteína de membrana, palmitoilada 3 (miembro 3 de la subfamilia p55 de AGUK) L40387 Tipo 2'-5'-oligoadenilato sintetasa ?78711 Glicerol cinasa D 10923 Receptor putativo de quimiocina; proteína de unión a GTP
AW006742 IMAGE-2489058 AL109730 EUROIMAGE 68600 ?99699 Factor 1 asociado a XIAP ??000115 Proteína hipotética, expresada en osteoblastos L13210 Proteína de unión 3, soluble, de unión a galactósidos, lectina
U22970 Interferón, proteína inducible alfa (clon IFI-6-16) U96721 Síndrome de Hermansky-Pudlak L10126 Receptor A de activina, tipo IB S62138 TLS/CHOP 33684 Proteína tirosina fosfatasa, tipo no receptor 1 ?63978 Factor de crecimiento endotelial vascular ?89101 Superfamiiia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 6 ?60278 Receptor de toxina de difteria (factor de crecimiento tipo factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina) ?59770 Receptor de interleucina-1 , tipo II ?04500 lnterleucina- , beta D30783 Epirregulina U43774 Fragmento Fe de IgA, receptor para CUADRO 2 Genes del cuadro 1 que son superiores en pacientes con SLE. en com paración con los controles L 3858 Homólogo 2 de son of sevenless (Drosophila) AF094481 Proteína de unión 1 de repetición del triplete CGG 28215 RAB5A, familia de oncogenes del miembro RAS U43083 Proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), polipéptido q X02344 Tubulina, beta, 2 22324 Alanil aminopeptidasa (de membrana) (aminopeptidasa N, aminopeptidasa M, aminopeptidasa microsomal, CD13, p150) Y07566 Tipo Ric, expresado en muchos tejidos (Drosophila)
U50553 Polipéptido 3 de caja DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His)
X54134 Proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, E L40388 Proteína 15 de interacción con receptores de tiroides
L19872 Receptor de hidrocarburos de arilo U78 07 Proteína de unión a factor sensible a N-etilmaleimida, gamma AL050272 Proteína DKFZP566B183 U56998 Cinasa inducible por citocina Al 189226 RAB31 , familia de oncogenes del miembro RAS Z50781 Péptido delta inductor del sueño, inmunorreactor S87759 Proteína fosfatasa 1A (antes 2C), dependiente de magnesio, isoforma alfa AF006513 Proteína de unión 1 a ADN de helicasa de cromodominlo Al 138605 Proteína hipotética DKFZp566A1524 L16794 Factor intensificador 2 de transcripción de caja MADS, polipéptido D (factor intensificador 2D de miocitos)
AL080235 Senescencia 1 inducida por Ras L17418 Receptor 1 componente del complemento (3b/4b), incluyendo sistema del grupo sanguíneo de Knops
Y00816 Receptor 1 componente del complemento (3b/4b), incluyendo sistema del grupo sanguíneo de Knops 63835 Fragmento Fe de IgG, la de alta afinidad, receptor para (CD64) L13943 Glicerol cinasa U89278 Regulador 2 del desarrollo temprano (homólogo de polihomeótico 2) U58334 Proteína de unión a p53 de proteína tumoral, 2
X54134 Proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, E X59834 Glutamato-amoníaco ligasa (glutamina sintasa)
AL047596 Homólogo de capicúa (Drosophila) AB023211 Peptidil arginina deiminasa, tipo II D43945 Factor de transcripción EC U79273 Clon 23933 Z18956 Familia 6 de vehículos de solutos (transportador de neurotransmisores, taurina), miembro 6 Y10313 Regulador del desarrollo 1 relacionado a interferón AF004849 Proteína cinasa 3 de interacción con homeodominio
A1808958 Proteína KIAA0870 U47634 Tubulina, beta, 4 X55988 Ribonucleasa, familia de ribonucleasa A, 2 (del hígado, neurotoxina derivada de eosinófilos) W29030 Proteína CGI-49 U 12471 Trombospondina-1 AF013591 Homólogo de sudD (supresor de bimD6, Aspergillus nldulans) X52015 Antagonistas de receptores de interleucina- M 16967 Factor de coagulación V (proacelerina, factor lábil)
U57094 RAB27A, familia de oncogenes del miembro RAS
U66711 Complejo de antígeno 6 de linfocitos, locus E AA521060 IMAGE-826408 X68090 Clase NA del receptor Fe de IgG Y08136 Fosfodiesterasa tipo esfingomielinasa ácida AL049685 Proteína hipotética similar a proteínas G pequeñas, especialmente RAP-2A L28957 Fosfato citidililtransferasa 1 , colina, ¡soforma alfa
Z22576 Antígeno CD69 (p60, antígeno de activación temprana de células T) U41766 Un dominio 9 de desintegrina y metaloproteinasa (meltrina gamma) M57230 Transductor de señal de interleucina-6 (gp130, receptor M de oncostatina) X17094 Enzima proteolítica de aminoácidos básicos pareados (furina, proteína de receptores asociados a membrana)
AC005192 Regulador de desarrollo 1 relacionado a interferón
AI547258 etalotioneína 2A L22075 Proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), alfa 13 U22431 Factor 1 inducible por hipoxia, subunidad alfa (factor de transcripción básico de hélice-bucle-hélice)
AB006746 Escramblasa 1 de fosfolípidos AF030196 Estanina AA010078 Familia de histonas H4, miembro D X56807 Desmocolina 2 AL080156 Proteína DKFZP434J214 AF017257 Homólogo 2 del oncogen E26 del virus de eritroblastosis v-ets (aves) AL049340 DKFZp564P056 M24283 Molécula de adhesión intercelular 1 (CD54), receptor de rinovirus de humanos D49817 6-fosfofructo-2-cinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa 3
AF016903 Agrina U77914 Jagged 1 (síndrome de Alagille) M33882 Resistencia a mixovirus 1 (influenza), homólogo de murino (proteína p78 inducible por interferón) U68385 Meisl , homólogo 3 del sitio de integración viral ecotrópico mieloide 1 (ratón) L05515 Proteína de unión CRE-BPa a elementos de respuesta a AMPc U 15555 Serina palmitoiltransferasa, subunidad básica 2 de cadena larga L42025 Proteína de unión a Rev de VIH-1 X07834 Superóxido dismutasa 2, mitocondrial D90144 Pequeña citocina A3 inducible M13755 Proteína estimulada por interferón, 5 kDa M83670 Anhidrasa carbónica IV M55047 Sinaptotagmina I U91512 Ninjurina 1 AB008775 Acuaporina 9 X79535 Tubulina, polipéptido beta J04102 Homólogo 2 del oncogen E26 del virus de eritroblastosis v-ets (aves) D10040 Ligasa de ácido graso-coenzima A, cadena larga 2
AW044649 Polipéptido asociado a sin-3, 30 kD X03473 Familia de histonas H1, miembro 0 AB007448 Familia 22 de vehículos de solutos (trasportador de cationes orgánicos), miembro 4 Z14138 Proteína cinasa cinasa cinasa 8 activada por mitógenos X02419 uPA U 10473 UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1 ,4-galactosiltransferasa, polipéptido 1 A1679353 Familia 11 de vehículos de solutos (transportadores de iones metálicos divalentes acoplados a protones), miembro 1 AA203213 Proteína estimulada por interferón, 15 kDa AB018259 Producto del gen KIAA0716 AF055993 Polipéptido asociado a sin-3, 30 kD X54486 Inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clade G (inhibidor C1), miembro 1 AJ225089 Tipo 2'-5'-oligoadenilato sintetasa AL022318 Similar APOBEC1 S59049 Regulador de señalización 1 de proteína G Y10032 Cinasa regulada por glucocorticoides/suero AI924594 Tetraspan 2 D21205 Proteína del dedo de zinc 147 (proteína del dedo zinc sensible a estrógeno) U37707 Proteína de membrana, palmitoilada 3 (miembro 3 de la subfamilia p55 de MAGUK) L40387 Tipo 2'-5'-oligoadenilato sintetasa X78711 Glicerol cinasa D10923 Receptor putativo de quimiocina; proteína de unión a GTP
AW006742 IMAGE-2489058 AL109730 EUROI AGE 68600 X99699 Factor 1 asociado a XIAP AB000115 Proteína hipotética, expresada en osteoblastos
L13210 Proteína de unión 3, soluble, de unión a galactósidos, lectina U22970 Interferón, proteína inducible alfa (clon IFI-6-16)
U96721 Síndrome de Hermansky-Pudlak L10126 Receptor A de activina, tipo IB S62138 TLS/CHOP M33684 Proteína tirosina fosfatasa, tipo no receptor 1 M63978 Factor de crecimiento endotelial vascular X89101 Superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 6 M60278 Receptor de toxina de difteria (factor de crecimiento tipo factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina) X59770 Receptor de interleucina-1 , tipo II X04500 lnterleucina-1, beta D30783 Epirregulina U43774 Fragmento Fe de IgA, receptor para U88629 ARN polimerasa II relacionada a ELL, factor de elongación
CUADRO 3 Genes del cuadro 1 que son inferiores en pacientes con SLE, en com paración con los controles
No. de acceso Gen U60060 Proteína zeta 1 de fasciculación y elongación (zigina I)
AF057036 Subunidad de cola tipo colágena (cadena sencilla de homotrímero) de acetilcolinesterasa asimétrica 93107 3-hidroxibutirato deshidrogenase (del corazón, mitocondrial) U14575 Proteína fosfatasa 1 , subunidad reguladora (inhibidora) 8 X 5882 Dominio globular C-terminal alfa-2 de colágena VI
S68805 Glicina amidinotransferasa (L-arginina:glicina amidinotransferasa) U75744 Desoxirribonucleasa I tipo 3 AF091071 Similar a RER1 de S. cerevisiae AI651806 Neurona motora 1 rica en cisteína AB028994 Proteína KIAA 071 S75168 Tirosina cinasa asociada a megacariocitos X73617 Locus delta del receptor de células T X07730 Calicreína 3 (antígeno específico de próstata) AF009787 Locus beta del receptor de células T 21624 Locus delta del receptor de células T AB009598 Beta-1 ,3-glucuroniltransferasa 3 (glucuronosiltransferasa I) AL021154 Factor de transcripción 2 de E2F L25444 ARN polimerasa II de TAF6, proteína de unión a caja TATA (TBP) - factor asociado, 80 kD AJ001383 Homólogo de antígeno 94 de linfocitos, receptor de NK de activación; NK-p46 (ratón) U75370 Polimerasa (ARN) mitocondrial (dirigida por ADN)
AL049365 DKFZp586A0618 M16801 Subfamilia 3 del receptor nuclear, grupo C, miembro 2
M28827 Antígeno CD1C, polipéptido C U51712 Proteína hipotética SMAP31 X66079 Factor de transcripción Spi-B (relacionado a (Spi- 1/PU.1) U11276 Subfamilia de receptores B tipo lectina de células asesinas, miembro 1 M36881 Proteína tirosina cinasa específica de linfocitos
M31523 Factor de transcripción 3 (factores de unión E12/E47 del intensificador de inmunoglobulina de E2A) 26062 Receptor de interleucina 2, beta AF026031 Receptor de incorporación de proteína de membrana exterior mitocondrial putativo AB011115 Proteína K1AA0543 AF041261 Receptor tipo inmunoglobulina de leucocitos, subfamilia A (sin dominio TM), miembro 4 D55716 Deficiente en mantenimiento de minicromosomas 7 de MC 7 (S. cerevisiae) L04282 Proteína del dedo de zinc 148 (pHZ-52) AJ001687 Segmento de ADN en la secuencia expresada 2849 del cromosoma 12 (único) AI524873 Tipo proteína E46 de cerebro de ratón U76421 Adenosina desaminasa, específica de ARN, B1 (homólogo de RED1 de rata) AF031137 Antígeno 117 de linfocitos X59871 Factor de transcripción 7 (específico de células T, caja HMG) U43408 Tirosina cinasa, no receptora, 1 AB018289 Proteína KIAA0746 AI761647 IMAGE-2370113 M18737 Granzima A (granzima 1, serina esterasa 3 asociada a linfocitos T citotóxicos) AB023220 Proteasa 20 específica de ubiquitina W26633 Antígeno de melanoma, familia D, 1 M68892 Integrina, beta 7 AJ236885 Proteína del dedo de zinc 148 (pHZ-52)
Diagnóstico de SLE severo y S LE-AI P La invención provee también métodos para diagnosticar que un mamífero (por ejemplo , un humano) tiene SLE severo o SLE-AI P. En una modalidad , se puede d iagnosticar que un mam ífero tiene SLE severo o SLE-AI P , si se determina que el mamífero contiene células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 4, a un nivel que es mayor que el nivel de expresión promedio de los mismos uno o más genes observados en células control obtenidas de mamíferos control. Como se describió anteriormente, el mamífero puede ser cualquier mamífero tal como un humano, perro, ratón o rata. Se puede aislar y evaluar cualquier tipo de célula. Por ejemplo, se pueden aislar células mononucleares de sangre periférica (PMBC), glóbulos blancos totales, células de nodulos linfáticos, células de bazo o células de amígdala de un paciente humano, y se pueden evaluar para determinar si ese paciente posee células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 4, a un nivel que es mayor que el nivel de expresión promedio observado en células control . La expresión de cualquier número de los genes incluidos en el cuadro 4, se puede evaluar para diagnosticar SLE severo o SLE-AIP. Por ejemplo, se puede usar la expresión de uno o más de uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 1 1 , 12, 13 ó 14) de los genes incluidos en el cuadro 4. El nivel de expresión puede ser mayor que o menor que el nivel promedio observado en células control, obtenidas de mamíferos control. Típicamente, un gen se puede clasificar por ser expresado a un nivel que es mayor que o menor que el nivel promedio observado en células control, si los niveles de expresión difieren por cuando menos 1 vez (por ejemplo 1 .5 veces, 2 veces, 3 veces, o más de 3 veces). Además, las células control son típicamente el mismo tipo de células que las aisladas del mamífero que está siendo evaluado. En algunos casos, las células control se pueden aislar de uno o más mamíferos que son de la misma especie que el mamífero que está siendo evaluado. Cuando se diagnostica SLE severo o SLE-AIP, las células control se pueden aislar de mamíferos que tienen SLE moderado o de mamíferos sanos tales como humanos sanos que no tienen SLE. Se puede usar cualquier número de mamíferos control para obtener las células control. Por ejemplo, las células control se pueden obtener de uno o más mamíferos sanos (por ejemplo, por lo menos 5, por lo menos 1 0, por lo menos 15, por lo menos 20, o más de 20 mamíferos control). Se puede usar cualquier método para determinar si un gen específico es expresado o no a un nivel que es mayor o menor que el nivel de expresión promedio observado en células control. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen particular se puede medir evaluando el nivel de expresión del ARN mensajero del gen. Los niveles de expresión del ARN mensajero se pueden evaluar usando, sin limitación, northern blotting, slot blotting, reacción en cadena de polimerasa - transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), o técnicas de hibridación de chips. Los métodos para las pruebas de hibridación de chips incluyen, sin limitación , los descritos en la presente. Dichos métodos se pueden usar para determinar simultáneamente los niveles de expresión relativos de moléculas de ARN mensajero múltiples. En forma alternativa, el nivel de expresión de un gen particular se puede medir evaluando los niveles de polipéptidos. Los niveles de polipéptidos se pueden medir usando cualquier método tal como pruebas basadas en reacciones inmunológicas (por ejemplo, ELISA), western blotting o tinción con plata. CUADRO 4 Genes con niveles de expresión que difieren entre pacientes con SLE que tienen puntuaciones bajas y altas de IFN
No. de acceso Gen M63835 Fragmento Fe de IgG, la de alta afinidad, receptor para (CD64) X54486 Inhibidor de serina (o cisteína) proteinasa, clade G (inhibidor de C1), miembro 1 L13210 Proteína de unión 3, soluble, de unión a galactósidos, lectina
M33882 Resistencia a mixovirus (influenza) 1, homólogo de murino (proteína p78 inducible por interferón) AA203213 Proteína estimulada por interferón, 15 kDa X99699 Factor 1 asociado a XIAP AJ225089 Tipo 2'-5'-oligoadenilato sintetasa U22970 Proteína inducible por interferón alfa (clon IFI-6-16)
AB000115 Proteína hipotética, expresada en osteoblastos AL047596 Homólogo de capicúa (Drosophila) AB006746 Escramblasa de fosfolípidos 1 AL022318 Similar a APOBEC1 U66711 Complejo de antígeno 6 de linfocitos, locus E X55988 Ribonucleasa, familia de ribonucleasa A, 2 (del hígado, neurotoxina derivada de eosinófilos) Identificación de m uamíferos predispuestos a desarrollar SLE severo y SLE-AI P La invención provee también métodos para diagnosticar que un mamífero (por ejemplo, un humano) está predispuesto a desarrollar SLE severo o SLE-AI P. En una modalidad, se puede diagnosticar que un mamífero está predispuesto a desarrollar SLE severo o SLE-AI P, si se determina que el mamífero contiene células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 4, a un nivel que es mayor que el nivel de expresión promedio de los mismos uno o más genes observados en células control obtenidas de mamíferos control. Como se describió anteriormente, el mamífero puede ser cualquier mamífero tal como un humano, perro, ratón o rata. Se puede aislar y evaluar cualquier tipo de célula. Por ejemplo, se pueden aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), glóbulos blancos totales, células de nodulos linfáticos, células de bazo o células de amígdala de un paciente humano, y se pueden evaluar para determinar si ese paciente posee células que expresan uno o más de los genes incluidos en el cuadro 4, a un nivel que es mayor que el nivel de expresión promedio observado en células control. La expresión de cualquier número de los genes incluidos en el cuadro 4, se puede evaluar para diagnosticar que un mamífero está predispuesto a desarrollar SLE severo o SLE-AI P. Por ejemplo, se puede usar la expresión de uno o más de uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 1 1 , 12, 1 3 ó 14) de los genes incluidos en el cuadro 4.
El nivel de expresión puede ser mayor que o menor que el nivel promedio observado en células control, obtenidas de mamíferos control. Típicamente, un gen se puede clasificar por ser expresado a un nivel que es mayor que o menor que el nivel promedio observado en células control , si los niveles de expresión difieren por cuando menos 1 vez (por ejemplo 1 .5 veces, 2 veces, 3 veces, o más de 3 veces). Además, las células control son típicamente el mismo tipo de células que las aisladas del mamífero que está siendo evaluado. En algunos casos, las células control se pueden aislar de uno o más mamíferos que son de la misma especie que el mamífero que está siendo evaluado. Cuando se determina la susceptibilidad de un mamífero a desarrollar SLE severo o SLE-AI P, las células control se pueden aislar de mamíferos que tienen SLE moderado o de mamíferos sanos tales como humanos sanos que no tienen SLE. Se puede usar cualquier número de mamíferos control para obtener las células control. Por ejemplo, las células control se pueden obtener de uno o más mamíferos sanos (por ejemplo, por lo menos 5, por lo menos 1 0, por lo menos 15, por lo menos 20, o más de 20 mamíferos control). Se puede usar cualquier método para determinar si un gen específico es expresado o no a un nivel que es mayor o menor que el nivel de expresión promedio observado en células control. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen particular se puede medir evaluando el nivel de expresión del ARN mensajero del gen. Los niveles de expresión del ARN mensajero se pueden evaluar usando, sin limitación, northern blotting, slot blotting , reacción en cadena de polimerasa - transcriptasa inversa cuantitativa ( T-PCR), o técnicas de hibridación de chips. Los métodos para las pruebas de hibridación de chips incluyen, sin limitación, los descritos en la presente. Dichos métodos se pueden usar para determinar simultáneamente los niveles de expresión relativos de moléculas de ARN mensajero múltiples. En forma alternativa, el nivel de expresión de un gen particular se puede medir evaluando los niveles de polipéptidos. Los niveles de polipéptidos se pueden medir usando cualquier método tal como pruebas basadas en reacciones inmunológicas (por ejemplo, ELISA), western blotting o tinción con plata. Disposiciones La invención provee también disposiciones de ácido nucleico. Las disposiciones provistas en la presente pueden ser disposiciones bidimensionales, y pueden contener por lo menos 1 0 moléculas de ácido nucleico diferentes (por ejemplo, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 50, por lo menos 1 00, o por lo menos 200 moléculas de ácido nucleico diferentes). Cada molécula de ácido nucleico puede tener cualquier longitud. Por ejemplo, cada molécula de ácido nucleico puede tener entre 10 y 250 nucleótidos (por ejemplo, entre 12 y 200, 14 y 175, 15 y 1 50, 16 y 125, 1 8 y 100, 20 y 75 ó 25 y 50 nucleótidos) de longitud. Además, cada molécula de ácido nucleico puede tener cualquier secuencia. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de las disposiciones provistas en la presente, pueden contener secuencias que están presentes dentro de los genes incluidos en los cuadros 1 , 2, 3 y/o 4. Típicamente, por lo menos 25% (por ejemplo, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50% , por lo menos 60%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% ó 100%) de las moléculas de ácido nucleico de una disposición provista en la presente, contiene una secuencia que tiene (1 ) por lo menos 1 0 nucleotidos (por ejemplo, por lo menos 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1 9, 20, 25 o más nucleotidos) de longitud, y (2) por lo menos aproximadamente 95 por ciento (por ejemplo, por lo menos 96, 97, 98, 99 ó 100) idénticas, sobre esa longitud, con una secuencia presente dentro de un gen incluido en los cuadros 1 , 2, 3 y/o 4. Por ejemplo, una disposición puede contener 100 moléculas de ácido nucleico localizadas en posiciones conocidas, en donde cada una de las 100 moléculas de ácido nucleico tiene 100 nucleotidos de longitud, mientras contiene una secuencia que tiene (1 ) 30 nucleotidos de longitud , y (2) 100 por ciento idénticas, sobre esa longitud de 30 nucleotidos, con una secuencia de uno de los genes incluidos en el cuadro 4. De esta manera, una molécula de ácido nucleico de una disposición provista en la presente, puede contener una secuencia presente dentro de un gen incluido en los cuadros 1 , 2, 3 y/o 4, en donde esa secuencia contiene uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más) no apareamientos. Las disposiciones de ácido nucleico provistas en la presente pueden contener moléculas de ácido nucleico unidas a cualquier superficie adecuada (por ejemplo, plástico o vidrio). Además, se puede usar cualquier método para obtener una disposición de ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de aplicación y técnicas de síntesis ¡n situ para obtener disposiciones de ácido nucleico. Además, se pueden usar los métodos descritos en las patentes de E. U.A. Nos. 5,744,305 y 5, 143,854 para obtener disposiciones de ácido nucleico. La invención se describirá en mayor detalle en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación de genes que se pueden usar para diagnosticar el SLE Se colectaron PB Cs de 48 pacientes con SLE y 42 individuos control sanos de igual edad y género. Todos los pacientes tenían SLE verificado por el médico, y cubrían por lo menos cuatro de los once criterios de la ACR para el lupus. La edad promedio de los pacientes con SLE era de 45 ± 1 1 años, y la edad promedio de los controles era de 34 + 13 años. Cada muestra de PB C contenía monocitos/macrófagos, linfocitos B y T y células asesinas naturales. Para los primeros 1 1 pacientes y 1 1 controles, se extrajo ARN mensajero poly A+ de las muestras de PBMC colectadas. En resumen, se extrajeron 60 mi de sangre periférica en una jeringa heparinizada. La sangre entera fue estratificada sobre un volumen igual de Histopaque, y centrifugada a 400 x g durante 30 minutos a 25°C. El plasma fue cosechado y almacenado a -80°C. Los PBMCs fueron cosechados, y lavados dos veces en 1 X de PBS , y e! ARN mensajero fue aislado usando un equipo de aislamiento de ARN mensajero FastTrack (I nvitrogen Carlsbad, CA). Para los siguientes 37 pacientes y 31 controles, se extrajo ARN total de las muestras de PBMC colectadas. En resumen , se extrajo sangre periférica en tubos CPT (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), y se colectaron plasma y PBMCs de acuerdo al protocolo del fabricante. El plasma se almacenó a -80°C, y se aisló a ARN total de los PBMCs usando Trizol (Gibco-BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de una limpieza con RNeasy (Qiagen , Valencia, CA). Se usaron aproximadamente 5 a 1 0 de ARN total o aproximadamente 100-200 ng de ARN poly A\ para preparar ARNc biotinilado para hibridación usando el protocolo estándar de Affymetrix (Expression Analysis Technical Manual, Affymetrix, Inc. , 2000). En resumen, el ARN fue convertido a la primera cadena de ADNc usando un iniciador oligo(dT) enlazado a T7 (Genset, La Jolla, CA), seguido de la síntesis de la segunda cadena (Gibco-BRL). El ADNdsc se usó entonces como molde para reacciones de transcripción in vitro marcadas usando ribonucleotidos biotinilados (Enzo, Farmingdale, NY). Quince µg de cada ARNc marcado fueron hibridados con Affymetrix U95A GeneChips (Affymetrix, Santa Clara, CA), usando condiciones estándar en una estación de Affymetrix fluidics.
Después de la hibridación de los chips y el análisis inicial de los datos, los valores de expresión para 1 0,260 genes representados en el chip, fueron comparados entre pacientes con SLE y controles usando una prueba T no pareada de Student. Se usó el programa Affymetrix Microarray Suite (MAS) 4.0 para generar valores de expresión (referidos como una "diferencia promedio" AD) para cada gen. Cada chip fue aumentado a escala hasta una intensidad total de 1500 para corregir diferencias menores en la intensidad de hibridación general de los chips, y para permitir comparaciones entre los chips. Se asignó un valor mínimo de 20 unidades AD a cualquier gen que se denominara "ausente" mediante MAS. Además, a cualquier gen con una AD menor de 20, se le asignó este valor mínimo. Los datos de los chips U95Av1 y U95Av2 fueron alineados desechando los 51 juegos de sondas que no estaban presentes en ambos chips. El análisis permitió identificar 161 genes únicos que fueron expresados diferencialmente usando los siguientes criterios: p < 0.001 , cambio de veces > 1 .5, diferencia promedio del valor de expresión > 1 00 unidades. A pesar del uso del mismo iniciador oligo(dT) para la síntesis de ADNc, se observaron diferencias consistentes entre los valores de AD básicos obtenidos de muestras de ARN total y ARN poly A+, que no fueron corregidas mediante aumento a escala de los chips. Además, cada serie de datos (es decir, ARN polyA+ y ARN total) mostró expresión diferencial similar de genes entre los grupos respectivos de pacientes y controles. Por ejemplo, la serie de datos 1 1 /1 1 inicial permitió identificar un número mayor del esperado de regiones reguladas por interferón. De esta manera, se usó un procedimiento de aumento a escala de gen por gen, de modo que las dos series de datos se pudieran combinar y examinar en conjunto. La estrategia de aumento a escala se basó en la suposición de que el nivel de expresión medio (AD media) de genes entre los dos grupos control (ARN total contra ARN polyA+), debe ser igual. Para cada gen, se comparó la media de los dos grupos control para generar el factor de aumento a escala específico de genes. Las muestras de poIyA+ fueron corregidas mediante el factor de aumento a escala, de modo que las medias de los dos grupos control (ARN total y polyA+) fueran idénticas. Esta serie de datos aumentada a escala se usó entonces para todos los análisis subsecuentes. Identificación de genes de respuesta al estrés Durante el curso de la colecta y el análisis de las varias muestras, se determinó que muchos de los genes en las células de sangre periférica sufren respuestas notables al estrés después de incubación ex vivo, incluso durante períodos un poco limitados (es decir, menos de 1 hora). Se diseñó y se llevó a cabo un experimento formal para identificar aquellos genes que fueran regulados mediante la incubación de células ex vivo. Se examinaron los cambios en la expresión global de genes usando sangre entera después de envío nocturno por un vehículo comercial. Este estudio usó muestras de ocho individuos control sanos. Se extrajeron aproximadamente 30 mi de sangre en cuatro tubos CPT. Se aislaron PBMCs de dos tubos, y se resuspendieron en RNAIater (Ambion, Austin TX). El RNAIater lisa inmediatamente las células, y protege al ARN de la degradación, proveyendo de esta manera un perfil preciso de expresión de genes inmediatamente ex vivo. El ARN preservado en RNAIater, y los dos tubos CPT son sangre entera, fueron enviados por el vehículo durante la noche. Se extrajo y se preparó ARN total para hibridación como se describió anteriormente. De esta manera, se obtuvieron perfiles globales de expresión de genes de una muestra de sangre fresca y de sangre enviada durante la noche, proviniendo ambas muestras de la misma extracción de sangre. Los datos se analizaron usando MAS 4.0, y cada chip fue aumentado a escala hasta 1500. A los valores ausentes y de baja expresión se les asignó un valor mínimo de 20 unidades AD como se describió anteriormente. Se usó una prueba T pareada para comparar los perfiles de expresión de genes de sangre fresca contra sangre enviada por el vehículo durante la noche. Con base en este experimento, se identificaron 2076 genes que exhibieron cambios significativos en la expresión bajo estas tensiones ambientales (p < 0.01 ). Estos genes, muchos de los cuales intervienen en varias vías de estrés celular, se excluyeron del análisis posterior debido al alto nivel de variabilidad que exhibieron. Análisis de comparación Se compararon los niveles de expresión de genes individuales de pacientes con SLE y controles, usando una prueba T no pareada de Student. Los genes seleccionados para otros análisis cubrieron los tres criterios siguientes: (i) p < 0.001 mediante prueba T no pareada, (¡i) cambio en la expresión de por lo menos 1 .5 veces cuando se comparan las medias de los dos grupos, y (iii) diferencia de expresión de por lo menos 100 cuando se comparan las medias de los dos grupos. En general, 484 genes fueron expresados diferencialmente al nivel de p < 0.001 , mientras que 178 genes fueron expresados diferencialmente al nivel de p < 0.001 , y mostraron valores promedio de AD que difirieron en más de 1 .5 veces. La serie de datos final de 161 genes individuales (representada por 1 71 números de acceso del Banco de Genes), cubrió los tres criterios. Estos genes, que demostraron expresión diferencial entre pacientes con SLE y controles normales, se citan en el cuadro 1 . Los valores de expresión para cada uno de los 161 genes fueron convertidos a "diferencias de veces", dividiendo cada valor entre el promedio de los valores de expresión control. Se aplicó entonces agrupación jerárgica no supervisada a la serie de datos. La agrupación jerárquica se llevó a cabo usando Cluster, y se visualizó usando TreeView ( . Eisen, Stanford; disponible en la Internet en rana.Ibl.gov). Este análisis permitió identificar patrones de expresión de genes que diferenciaron a la mayoría de los pacientes con SLE de los controles sanos. Treinta y siete de los 48 pacientes con SLE se agruparon firmemente entre sí, mientras que 1 1 de los pacientes se coagruparon con los controles. Seis de los 42 sujetos control fueron agrupados junto con el gran grupo de pacientes. La mayoría (124 de 1 61 , 77%) de los genes que distinguieron mejor el SLE de los PBMCs control, fueron expresados a niveles mayores en pacientes con SLE que en sujetos normales. Estos datos se muestran en el cuadro 2. Un número de estos genes tiene funciones conocidas o supuestas en el sistema inmune. Por ejemplo, se encontró que muchos de los pacientes con SLE sobreexpresan el ARN mensajero para los siguientes marcadores de superficie celular: FNTR6 (Fas/CD95), un receptor de muerte; I CAM- (CD54), una molécula de adhesión; CD69, un antígeno de activación; y receptor 1 de complemento. De interés, tres receptores Fe diferentes fueron expresados a niveles elevados; el receptor Fe para IgA (FCAR, CD89), y los receptores de IgG FcRyI IA (CD32) y FcRyl (CD64). Tres moléculas de la vía de citocina IL-1 inflamatoria — I L- 1 ß , el receptor II de I L-1 (I L-1 RI I) y el antagonista del receptor de I L-1 - fueron también sobreexpresados en general. Lo que es interesante observar, Jagged 1 , un ligando para Notch 1 localizado en el intervalo de susceptibilidad de SLE en el cromosoma 20p, fue también sobreexpresado en algunos pacientes. Otros genes notables que fueron sobreexpresados en pacientes con SLE, incluyen las moléculas de señalización MAP3K-8, RAB27, el transductor de señal de interleucina-6, los factores de transcripción v-ets 2, el factor de transcripción 2 de la caja MADS, y la proteína del dedo de zinc 147 sensible a estrógeno. Varios genes fueron expresados a niveles menores en pacientes que en los controles. Estos se muestran en el cuadro 3, e incluyeron genes de células T tales como Lck, TCR delta y TCR beta. Se usaron citometría de flujo y PBMCs recién teñidos para confirmar que había una linfopenia de células T en muchos de los pacientes (es decir, una disminución de aproximadamente 20%, en promedio, en el porcentaje de células T CD3+). Los pacientes demostraron también un incremento significativo en el porcentaje de monocitos, en comparación con el porcentaje de monocitos en controles. En forma específica, las poblaciones de PBMC de pacientes con SLE (n = 1 8) contenían 52% de células T, 5% de células B, 28% de monocitos/macrófagos y 15% de células NK. Las poblaciones de PMBC de sujetos control (n=28) contenían 65% de células T, 6% de células B, 13% de monocitos/macrófagos y 1 6% de células NK. Los porcentajes de células T (p=0.014) y monocitos (p=0.00001 ), difirieron de esta manera entre pacientes con SLE y los controles. Estas diferencias en las poblaciones de células de la línea de base favorecen claramente algunas de las diferencias en la expresión de genes observada, y destacan la importancia de documentar los porcentajes de células en poblaciones de células mixtas. Identificación de genes regulados por IFN Uno de los grupos de ARN mensajero más notables, contenía varios genes identificados previamente como regulados por ¡nterferón (Der et al. ( 998) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. 95: 1 5623). Los interferones son citocinas altamente activas importantes para mantener la inmunidad viral (I FN-a e I FN-ß), y para mediar las respuestas inmunes de TH 1 (I FN-?). Los genes de este grupo fueron sobrerregulados en casi la mitad de los pacientes con SLE, y fueron expresados a bajos niveles en la mayoría de los sujetos control. Se llevaron a cabo experimentos para examinar el grado al cual los genes en este grupo podrían ser regulados en PBMCs mediante tratamiento con IFN in vitro. Se extrajo sangre periférica de cada uno de cuatro individuos sanos control. Se aislaron PBMCs sobre medio de separación de linfocitos (Mediatech Cellgro, Herndon, VA) de acuerdo al protocolo del fabricante. Después del último lavado, las células fueron resuspendidas en medios completos (RPMI 1640, FBS a 10% inactivado con calor, L-glutamina a 2 mM, penicilina/streptomicina) a una concentración final de 2x 06 células/ml. Los PBMCs fueron cultivados durante seis horas a 37°C con las siguientes adiciones: (i) PBS + control de BSA a 0.1 %, (ii) I FN-a e IFN-ß (R&D Systems, Minneapolis, MN), cada uno a 1000 U/mL en PBS + BSA a 0.1 %, y (iii) IFN-? (R&D Systems, Minneapolis, MN), 1 000 U/mL en PBS + 0.1 %. Después de la incubación, se aisló ARN total, y se prepararon sondas de ARNc para hibridación de los chips. Los datos se analizaron en MAS 4.0, y todos los chips fueron aumentados a escala hasta 1 500. Se asignaron valores de ausente y de baja expresión a un valor mínimo de 20 unidades AD como se describió anteriormente. Los genes que cubrían los criterios siguientes en los cuatro experimentos, fueron identificados como regulados por I FN: (i) cambio en expresión de por lo menos dos veces, cuando se compara con el control no tratado, y (ii) diferencia en expresión de por lo menos 500 unidades AD, cuando se compara con el control no tratado. Se evaluaron los cambios en la expresión de genes después del tratamiento con I FN respecto a un cultivo control de seis horas. Este análisis permitió identificar 286 genes que demostraron un cambio en más del doble de la expresión a partir de la línea de base, y una diferencia promedio absoluta en el nivel de expresión mayor de 500 unidades. La inducción de muchos genes conocidos regulados por I FN, tales como Statl , gen 1 de resistencia a mixovirus (Mx- ) e ISGF-3, validó el procedimiento. Usando esta lista de genes regulados por IFN, 1 3 de 14 genes únicos en el grupo fueron identificados como transcritos regulados por I FN auténticos. En general, se encontró que 23 de los 1 61 genes (14.3%) son regulados por IFN, en comparación con 7 genes (4.3%) que se habrían esperado sólo por azar. La sobrerrepresentacion de genes regulados por interferón en la lista de transcritos, que discriminó mejor los pacientes con SLE de los controles, se observó consistentemente cuando se usaron varios filtros diferentes para definir genes de SLE y regulados por IFN. Los niveles de ARN mensajero de los I FNs mismos, no fueron significativamente diferentes entre los pacientes y los controles. Las proteínas de IFN-? e IFN-a en plasma/sero, fueron medidas mediante ELISA (Pierce Endogen, Rockford, I L). El IFN-? fue ¡ndetectable en todas las muestras (menos de 25 pg/mL). El I FN-a fue detectable en sólo dos pacientes (26 y 29 pg/mL) y un sujeto control (56 pg/mL). Se calculó una "puntuación" de I FN para cada paciente y control, con base en la expresión de genes del grupo de I FN. Las puntuaciones se calcularon normalizando primero los valores de expresión dentro de cada grupo de genes, de modo que el valor máximo en cada hilera fuera de 1 .0. Entonces, se sumaron las columnas (muestras) para obtener la puntuación. La puntuación de IFN (media ± SD) para los pacientes fue de 3.7 ± 2.6, en com paraci ón con los controles , q ue fue de 1 .5 + 0.5 , p=4.2x1 0"7. Casi la mitad de los pacientes con SLE exhibió una puntuación de IFN elevada, mientras que los otros tuvieron puntuaciones indistinguibles de los controles (figura 1 ). La población de pacientes con lupus se dividió en dos grupos, en donde el grupo de alta puntuación de IFN contenía los 24 pacientes con las puntuaciones más altas de IFN, y el grupo de baja puntuación de I FN contenía los 24 pacientes con las puntuaciones más bajas. Se examinaron las diferencias en la expresión de genes. El cuadro 4 contiene una lista de los genes que exhibieron expresión diferencial entre los grupos de alta puntuación de I FN y baja puntuación de IFN . Todos los genes incluidos en el cuadro 4 fueron expresados a un nivel mayor en el grupo de alta puntuación de I FN, que en el grupo de baja puntuación de I FN. Entonces se llevaron a cabo estudios para determinar si la rúbrica de expresión de genes de IFN se correlacionaba con las características clínicas del SLE. Típicamente, el SLE se diagnostica usando 1 1 criterios desarrollados por la ACR (Hochberg (1997) Arthritis Rheum. 40: 1 725). Estos criterios abarcan el espectro clínico del SLE, e incluyen criterios de la piel (rash malar, úlceras orales, fotosensibilidad y rash discoide), criterios sistémicos (pleuritis o pericarditis, artritis, enfermedad renal o compromiso del SNC) y criterios de laboratorio (citopenias, Abs anti-ADNds o anti-fosfolípidos y anticuerpos antinucleares). Un paciente debe cubrir cuatro de estos criterios para que se clasifique que tiene SLE definido. El número de criterios del SLE cubierto por cada paciente, se gráfico contra su puntuación de IFN (figura 2). Este análisis reveló que la puntuación de I FN se correlacionó con el número de criterios del SLE exhibidos en cada paciente. En un análisis similar, se compararon las características clínicas de los 24 pacientes con SLE con las puntuaciones más altas de IFN (IFN alto), con las características clínicas de los 24 pacientes con SLE con las puntuaciones más bajas (I FN bajo). Como se muestra en la figura 3, los pacientes del grupo de IFN alto tuvieron un número significativamente mayor de criterios del SLE (6.8 ± 1 .3), que los del grupo de IFN bajo (5.7 + 1 .1 ; p = 0.004). Los pacientes del grupo de I FN alto mostraron también tendencia a ser diagnosticados con SLE en una etapa más temprana (25 ± 12, en comparación con 30 + 1 3 años; p = 0.1 92). Lo que es importante destacar, 15 de los 24 pacientes (63%) del grupo de IFN alto, cubrieron los criterios de la ACR para compromiso de ríñones y/o el SNC, las complicaciones más serias del lupus, en comparación con 5 de 24 pacientes (21 %) del grupo de I FN bajo (figura 14). Además, 1 8 de 24 pacientes con I FN alto (75%) mostraron compromiso hematológico en su enfermedad (leucopenia, anemia hemolítica o trombocitopenia severas), en comparación con sólo 5 de 24 pacientes con IFN bajo (21 %). Una puntuación de interferón elevada se correlacionó de esta manera con las manifestaciones más severas del SLE. La hipótesis de que los I FNs son importantes en la patogénesis del lupus, es apoyada por varias observaciones. Ratones transgénicos para IFN-? desarrollan autoinmunidad tipo lupus (Seery et al. (1 997) J. Exp. Med. 186: 1451 ), y ratones NZB/NZW F1 susceptibles al lupus, tratados con Abs anti-IFN-? o cruzados en la base de I FN-?, muestran mejora de la enfermedad (Jacob et al. (1 987) J. Exp. Med. 1 66:798: y Balomenos eí al. (1998) J. Clin. Invest. 101 :364). El gen IFI-202 inducible por interferón, ha sido identificado como un gen de SLE dentro del locus del SLE Nba2 en el cromosoma 1 del ratón; ratones NZB, la cepa parental para este locus, muestran constitutivamente alta expresión de este factor de transcripción (Rozzo eí al. (2001 ) Immunity 15:435). En humanos, se han reportado niveles elevados de I FN-a en los sueros de algunos pacientes con SLE (para una revisión, véase Ronnblom y Alm (2001 ) J. Exp. Med. 194:59), y un porcentaje importante de individuos tratados con I FN-a para hepatitis viral, desarrolla autoanticuerpos relacionados al lupus (Fukuyama et al. (2000) Am. J. Gastroenterol. 95:31 0). Por último, el I FN-a en los sueros de algunos pacientes pediátricos con SLE, induce maduración de monocitos en células dendríticas plasmacitoides que presentan antígeno altamente activas (Blanco et al. (2001 ) Science 294: 1540). Aunque los genes en las vías de señalización de I FN exhibieron expresión disregulada en algunos pacientes con lupus, los niveles de ARN mensajero de los IFNs mismos no fueron significativamente diferentes entre los pacientes y los controles. La proteína de I FN-y no fue detectable mediante ELISA en muestras control o de pacientes, y el I FN-oc fue detectable en sólo 2 de 48 pacientes y 1 de 42 controles. De esta manera, otras citocinas que usen las vías de señalización de Jak/Stat corriente abajo de sus receptores, tales como IL-4, IL-13 o I L-2 (Hirano et al. (2000) Oncogene 19:2548), favorecerían los patrones de expresión de genes observados. OTRAS MODALIDADES Se entenderá que aunque la invención se ha descrito en conjunto con la descripción detallada de la misma, se pretende que la descripción anterior ilustre y no limite el alcance de la invención, el cual es definido por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.