MXPA02005954A - Procesos y organismos para la produccion de proteinas anticongelantes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para preparar un nuevo peptido anticongelante y a los peptidos obtenidos a partir de la bacteria y a un ambiente acuoso de temperatura baja, tal como Marinomonas protea y a una nueva especie de Pseudomonas. Estos peptidos anticongelantes pueden ser adecuadamente incorporados en productos alimenticios congelados tales como vegetales congelados y confituras congeladas tales como helados.

Description

PROCESOS Y ORGANISMOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS ANTICONGELANTES Campo de la Invención La presente invención se refiere a un proceso para la producción de proteínas anticongelantes. Además se relaciona con nuevos organismos útiles en el proceso, a nuevas proteínas obtenidas de ese modo y a composiciones y usos de tales proteínas nuevas. En un aspecto, se refiere a cultivos del nuevo organismo Marinomonas protea; a proteínas anticongelantes nuevas derivadas del mismo; al uso de tales proteínas en el control de procesos de congelamiento, especialmente en la producción de alimentos congelados; y los alimentos obtenidos de tal modo.

Antecedentes de la Invención Las ?proteínas anticongelantes' (AFPs) así nombradas, tienen la propiedad de modificar el crecimiento de cristales de hielo. Las mismas difieren en su acción a partir de agentes anticongelantes iónicos más simples tales como sal común. Por ejemplo, las soluciones acuosas de AFP típicamente tienen un punto de congelamiento que es inferior que su punto de fusión (histéresis) . Las mismas estabilizan los cristales REF.:13#&|4 de hielo en un intervalo de temperaturas, e inhiben la recristalización. Parece que las mismas contribuyen a que los organismos sobrevivan a temperaturas alrededor del punto de congelamiento del agua, y por consiguiente se encuentran en varios tipos diferentes de organismos. Sus propiedades les dan un intervalo de usos potenciales: en particular en alimentos que son comidos mientras están congelados, inhibiendo la recristalización y manteniendo una textura cremosa. En alimentos que están congelados para conservación, las AFPs pueden inhibir la recristalización durante el congelamiento, almacenado, transporte, y deshielo, preservando así la textura del alimento al reducir el daño celular y también minimizar la pérdida de nutrientes por la reducción de goteo (véase Griffith, M. y Vanya E art, K. Biotechnology Advances, 13_, pp 375-402) . Varias fuentes de AFPs son conocidas: las más comunes son el pescado y las plantas. Algunas bacterias exhiben propiedades anticongelantes (véase Griffith et al, supra, p 382) . En algunos casos, se ha reportado el aislamiento de proteínas anticongelantes a partir de bacterias (véase por ejemplo: Xu H, Griffith M, Patten CL, et al., Can J Microbiol 44: (1) 64-73 Ene. 1998). Dadas las ventajas para un organismo de resistencia al congelamiento, se puede considerar sorprendente que las proteínas anticongelantes no estén distribuidas más ampliamente en la Naturaleza y se encuentren más fácil. Esto puede ser a causa de que los organismos tienen otras formas de superar tales problemas . En tanto que, la AFP del pescado que puede contribuir en la producción de estructuras duras, sólidas, tiene ventajas para algunas aplicaciones especializadas, una AFP que es Rl-activa pero no produce estructuras duras tiene sus propias ventajas diferentes. Por ejemplo, las moléculas que activamente inhiben la recristalización de hielo en almacenamiento se pueden usar para mantener texturas cremosas de los productos congelados durante el almacenamiento. Para algunos alimentos congelados, tales como helado de leche, podría ser preferible si el uso de una molécula no endurece el producto excesivamente. Por lo tanto, existe un deseo por péptidos anticongelantes los cuales están activos en la inhibición por recristalización durante el deshielo y ciclos de congelamiento, y los cuales se pueden usar para mantener texturas cremosas de productos alimenticios durante el almacenamiento. De manera deseable, estos péptidos anticongelantes son estables en calor de modo que los mismos i .: * ! se pueden incorporar en productos alimenticios los cuales son pasteurizados o esterilizados, mientras que los mismos mantienen su funcionalidad. La hipótesis en la cual la presente invención se basa (en parte) , es que las bacterias se desarrollan más probablemente en proteínas AFP si las mismas habitan en un ambiente acuoso líquido el cual frecuentemente está por debajo del punto de congelamiento normal del agua: en tales ambientes (está postulado) las AFPs pueden ser una forma eficiente de proporcionar bacterias a una ventaja competitiva.

Descripción de la invención Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención consiste de un proceso para la producción de AFPs, que comprende colectar una o más muestras de bacterias a partir de un ambiente acuoso a baja temperatura, cultivar la bacteria y extraer las proteínas de las muestras, someter a prueba las proteínas para propiedades anticongelantes, seleccionar la proteína que tiene propiedades anticongelantes superiores, y producir la proteína seleccionada en cantidades suficientes para el uso como un aditivo alimentario de AFP.

La invención además comprende nuevas proteínas anticongelantes obtenibles por el proceso, su uso en el procesamiento de alimentos, y composiciones de alimentos que las contienen.

Descripción Detallada de la Invención La invención se describirá adicionalmente con referencia a los dibujos anexados e identificaciones de secuencia, en los cuales: Secuencia ID 1 es una secuencia de ADN del gen de ARNr 16S de Marinomonas protea; Secuencia ID 2 es una secuencia de .ADN del gen de .ARNr 16S de la especie Pseudomonas (aislada como "aislado 20") . Secuencia ID 3 es la secuencia de aminoácidos N-ter inal del péptido anticongelante aislado de Mapnomonas protea . La Figura 1 muestra la alineación de secuencia de la secuencia de ARNr 16S de Marinomonas protea (Figura 3) a la secuencia correspondiente de Marinomonas communis; La Figura 2 es un árbol filogenético que compara Marinomonas protea con sus relativos filogenéticos más cercanos .

La Figura 3 muestra la alineación de secuencia de ARNr 16S del aislado 20 (sec ID 2, caso superior) a ARNr 16S de Marinononas protea (Sec ID 1; caso inferior) que muestra 89.4% de similitud. La Figura 4 muestra la alineación de la secuencia de .ARNr 16S de aislado 20 (sec ID 2) a su relativo filogenético más cercano Pseudomonas synxantha que muestra 99.4% de similitud. La Figura 5 es un árbol filogenético basado en las secuencias de .ARNr 16S que compara Aislado 20 (SEC ID 2) con sus relativos más cercanos. Las alineaciones de secuencias múltiples se crearon usando el método Clustal con una penalidad de extensión de 10. La Figura 6 muestra el resultado de un experimento Rl en tiempo = 0 (6A) y en tiempo = 60 minutos (6B) . Las Figuras 7, 8, 9 con relación a la prueba de dureza de Vic ers como se describe en el ejemplo. Los términos péptido anticongelante y proteína anticongelante se usan en forma intercambiable en el contexto de esta invención. Estos términos son abreviados como AFP. Por un ambiente de baja temperatura, acuoso, se entiende un ambiente que comprende predominantemente agua que está a una temperatura inferior a 0°C por al menos parte del año. Se prefieren ambientes salinos, por ejemplo que tengan un contenido de sal (salinidad) suficiente para disminuir el punto de congelamiento de hielo significativamente (por ejemplo, por 0.2°C o más). La salinidad puede ser mayor o menor que aquella del agua de mar (35ppt) . Los ambientes preferidos a partir de los cuales se pueden colectar las bacterias, son lagos salinos (incluyendo hipersalinos) , loci o lugares en tales lagos. En particular se prefieren colectar bacterias adecuadas para el uso en la invención a partir de ambientes .Antarticos. Los lagos salinos en la Antartica frecuentemente son meromícticos o monomícticos. Los lagos mero ícticos tienen una columna de agua químicamente y térmicamente estratificadas, permanente. Los mismos tienen aguas menos salinas, más frías, por encima y aguas más calientes, más salinas, en las profundidades. En la antartica tales lagos están cubiertos de hielo la mayoría del año, sólo se rompe por poco tiempo en verano. Los lagos monomícticos en la Antartica son lagos hipersalinos, demasiado salinos para convertirse en una cubierta de hielo apropiada en invierno. La cubierta de hielo actúa igual a un manto térmico. Sin que las aguas de lagos en contacto con el aire se enfríen a muy bajas temperaturas. En invierno sus columnas de agua se . m-i l. ,-* st iií-? estratifican térmicamente, aguas más frías por arriba, aguas más calientes por abajo. En breve la estratificación se rompe y la columna de agua tiene una temperatura uniforme. En el caso de lagos tanto monomícticos como meromícticos de .Antartica existen periodos en el invierno cuando las temperaturas de agua están muy por debajo de 0°C. La invención además se refiere a nuevos cultivos bacterianos aislados de los lagos .Antarticos anteriores, preferiblemente a partir de lagos meromícticos o monomícticos. Adicionalmente se proporcionan cultivos bacterianos puros de la especie de Marinomonas que generan proteínas anticongelantes, los cultivos bacterianos que muestran al menos 990% y preferiblemente 95% de homología en la secuencia del gen de ARNr 16S con la secuencia correspondiente en el organismo Marinomonas protea (Secuencia ID no 1) . La invención también se refiere a cultivos bacterianos puros de especies de Pseudomonas que generan proteínas anticongelantes, los cultivos bacterianos que muestran al menos 90% y preferiblemente por lo menos 95% de homología de secuencia en la secuencia de ARNr 16S con la secuencia del gen de acuerdo con sec ID no 2. Los cultivos son obtenidos en el curso de la realización del proceso de la invención. El proceso de la invención comprende cuatro fases: la colección de muestras de una o más bacterias; cultivo de la bacteria y extracción de proteínas; prueba y selección de proteínas; y producción de proteínas. 1. Colección de muestras Las muestras de bacterias para su uso en el procesó de la invención, son colectadas a partir de ambientes acuosos de baja temperatura. Como se señala, por ambientes de ?baja temperatura' se entiende aquellos en los cuales las formas de hielo por al menos parte del año. Tales ambientes ocurren a altitudes superiores y latitudes superiores, o ambas. Se prefiere colectar bacterias a partir de ambientes salinos, especialmente lagos de agua salada. Particularmente los ambientes preferidos se encuentran en la .Antartica, y pueden incluir lagos meromícticos o monomícticos. Tales lagos comprenden loci o lugares que tienen una variedad de **~ propiedades, por ejemplo, temperaturas y concentraciones de sal, y se pueden colectar muestras bacterianas desde un intervalo de locí o lugar para la investigación de laboratorio subsecuente. 2. Extracción de proteínas Cada muestra de bacterias es cultivada bajo condiciones adecuadas, de modo que la proteína anticongelante es producida, y la proteína es extraída del caldo de cultivo por métodos estándares, por ejemplo por centrifugación de células, formación de pelotillas y por vórtice con perlas de vidrio en la presencia de amortiguador. 3. Prueba de proteínas Las proteínas extraídas en la etapa 2 son clasificadas probando sus propiedades anticongelantes. Una variedad de pruebas adecuadas están disponibles. Se prefiere usar una prueba de inhibición por recristalización: como se describe con más detalle posteriormente. Esto mide la tendencia de cristales de hielo para incrementar en tamaño cuando se almacena bajo condiciones de congelamiento en la presencia de la proteína. Por el uso de esta prueba, se pueden seleccionar las proteínas AFP efectivas, en la presencia de las cuales la recristalización y el crecimiento de cristales son detenidos o reducidos. Las proteínas con propiedades anticongelantes son definidas como proteínas las cuales preferiblemente muestran en un ensayo de recristalización como se define en los ejemplos, un crecimiento de cristales de hielo de 6 µm o menos a una concentración de a lo mucho 1 mg/ml . 4. Producción de proteínas Las proteínas seleccionadas de acuerdo con el proceso de la invención, son producidas en cantidad para el uso como aditivos alimenticios de AFP. Esto se puede dar en una variedad de formas. Por ejemplo, el proceso original usado para obtener la proteína (cultivo bacteriano seguido por la extracción de proteína) puede ser agrandado. Por la experimentación con condiciones de cultivo (temperatura, medio, etc.) y la selección bacteriana, los rendimientos se pueden incrementar. También es posible aislar de la bacteria la secuencia de ADN que codifica la AFP seleccionada, la introduce en un cásete de expresión y genera la proteína recombinante en una célula hospedante diferente. En un proceso preferido, el aislado que contiene la proteína es sometido a un tratamiento térmico tal como pasteurización o esterilización para inactivar las bacterias vivas y las proteínas las cuales pueden afectar el péptido anticongelante formado tal como las proteasas. Por consiguiente, es una característica muy importante de la invención que las AFPs aisladas sean preferiblemente resistentes al calentamiento. Sin la capacidad para inactivar proteasas por el tratamiento térmico, los inhibidores químicos de proteasa podrían necesitar en muchos casos ser usados y la mayoría de estos son tóxicos y por lo tanto no son compatibles con el uso en alimentos. De manera sorprendente, las proteínas aisladas de las fuentes antarticas como se indica, son estables al calor, a pesar de su ambiente natural, original, que está a 10 temperaturas muy frías . Las proteínas estables al calor en el contexto de la invención, se definen como proteínas las cuales muestran, después de un tratamiento de pasteurización, una actividad anticongelante remanente de al menos 50%, preferiblemente al 15 menos 80% de la actividad anticongelante de la proteína antes del tratamiento térmico. Esta cantidad de activada más preferida permanece después de un tratamiento de esterilización. En un aspecto adicional, la invención se relaciona 20 con una proteína que muestra propiedades anticongelantes, obtenidas por el proceso de la invención o aisladas de un cultivo como se especificó anteriormente. En forma más específica, la invención comprende la X ; nueva proteína marinomonina que tiene propiedades anticongelantes. Además comprende isoformas y derivados, por ejemplo, formas glicosiladas, o propiedades anticongelantes que poseen marinomomna. Estas proteínas más preferidas que muestran propiedades anticongelantes son estables al calor. Como se muestra en los ejemplos el péptido anticongelante aislado de Marinomonas protea muestra una secuencia de aminoácidos de N-terminal de Ala-Glu-Gly-Ser- Thr-Gly/Val-Asp-Val-Tyr-Gln-Asn-Ile-Gln-Tyr-Ala-Gly- (Sec ID no 3) . Preferiblemente los derivados muestran al menos 75%, en forma más preferida 85% y en particular al menos 95% de homología en la secuencia de aminoácido N terminal, con la secuencia del péptido de 16 elementos proporcionado anteriormente. Las isoformas y derivados de la secuencia de aminoácidos de SEC ID no 3 que tiene propiedades anticongelantes también se incluye en el alcance de la invención. La invención además comprende secuencias de ácido nucleico, especialmente ADN, que codifica las nuevas proteínas de la invención. Estas pueden ser fácilmente obtenidas a partir de un conocimiento de la secuencia de proteína mostrada anteriormente. En un aspecto preferido adicional la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido de la secuencia ID no 3. El proceso de la invención comprende cultivar un organismo que contiene una secuencia de ADN que codifica para mannomonina u otra proteína anticongelante de conformidad con la invención, bajo condiciones en las cuales es producida la marino onina o la proteína anticongelante, y recuperar esta proteína. Un organismo adecuado para el uso en la invención es la bacteria Marinomonas protea recientemente descubierta. Las condiciones y medios adecuados para cultivar este organismo se dan en los ejemplos. Se pueden descubrir otros organismos que contienen ADN que codifica marinomonina, los cuales prueban utilidad en el proceso de la invención. Una alternativa es emplear un organismo genéticamente transformado que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína anticongelante la cual es marinomonina o una análoga de la misma, la secuencia que está bajo el control de un promotor de genes adaptado para causarlo para producir la proteína anticongelante en el organismo transformado. La secuencia de ADN que codifica la proteína anticongelante puede ser insertada en un vector de expresión adecuado que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción en la proteína deseada bajo las condiciones apropiadas, incluyendo la orientación apropiada de la secuencia, la estructura de lectura correcta, y la formación de objetivos y secuencias de expresión adecuadas. Los métodos para producir vectores adecuados, y para usarlos para transformar muchos tipos diferentes de organismos, son bien entendidos en la técnica. Los organismos genéticamente transformados adecuados para realizar el proceso de la invención, también forman un aspecto adicional de la invención. En principio, cualquier organismo puede ser modificado para producir la proteína deseada en esta forma, por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, o células vegetales, células de insectos o células animales. Las bacterias, levaduras y plantas o sistemas de células vegetales son generalmente preferidas. También es posible proporcionar organismos genéticamente transformados, adecuados, adaptados para producir las AFPs de la invención, las cuales son por ellas mismas útiles en consideración de su resistencia incrementada al congelamiento. En particular esto se aplica a plantas: las cuales pueden ser cereales tales como trigo o maíz; o dicotiledóneas tales como soya, tomate o lechuga. Tales plantas también forman parte de esta invención. Los péptidos anticongelantes de conformidad con la invención pueden ser usados de manera conveniente en varios productos, preferiblemente en productos alimenticios los cuales son congelados o propuestos para congelar. Los ejemplos de tales productos alimenticios son: productos alimenticios congelados tales como vegetales, salsas, sopas, refrigerios, productos lácteos y confitería congelada, bajo este término se incluyen el sorbete, helado de agua, granitos, purés de fruta congelada y confituras congeladas que contienen leche tales como helado, yoghurt congelado o natillas, nieves y helados de leche. Los productos alimenticios preferidos son vegetales congelados y confitería congelada, por ejemplo, helado, helado de agua. Si se usan mezclas en seco o concentrados, la concentración puede ser superior para asegurar que el nivel en el producto congelado final esté dentro del intervalo deseado. Los niveles preferidos de AFP son desde 0.00005 a 0.3%, particularmente desde 0.0001 a 0.2% en peso del producto final. No es necesario adicionar la AFP en forma altamente purificada: la misma se puede adicionar como una composición que contiene la AFP, por ejemplo, un extracto del organismo que produce la AFP. La confitería congelada de acuerdo con la invención puede ser producida por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Preferiblemente todos los ingredientes de la formulación son completamente mezclados conjuntamente a o por arriba de la temperatura ambiente antes del congelamiento. El nivel de sólidos en la confitura congelada (por ejemplo, azúcar, grasa, saborizante) se ajusta adecuadamente para estar al menos 3% y normalmente en el intervalo de 10 a 70%, particularmente 40 a 70%, en peso del producto final. La invención se ilustrará ahora por los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 19 aislados se colectaron de varios sitios en lagos Antarticos. Dos se encontraron por dar origen a proteínas anticongelantes (véase Tabla 1 abajo) , el aislado 196 y aislado 20. Estas bacterias se aislaron del Lago Ace y Lago Club, respectivamente. El lago Ace es meromíctico: el lago Club es monomíctico. Ambas bacterias se aislaron de cerca de la superficie del lago. El aislado 196 fue aislado de la interfase hielo/agua. El aislado 20 fue aislado de la superficie de 50 cm de la columna de agua lejos del borde del lago. Más detalles de los dos lagos se proporcionan abajo: Lago Ace Salino en la superficie - 18 ppt; salinidad que incrementa con la profundidad a 34 ppt. Cubierta de hielo por 10-11 meses del año 10 Meromíctico - químicamente y térmicamente estratificado Lago Club Hipersalino (250 ppt) 15 Sin cubierta de hielo Monomíctico - estratificado térmicamente en invierno, columna de agua mezclada en verano Cultivo de Aislados 20 Los aislados bacterianos se inocularon en 200 ml de Caldo de So a Tríptico (Oxide) . El aislado 196 (Marinomonas protea) también se cultivo en 200 ml de Caldo de Sales de Mar y 200 ml de H de ,»..... »-.»«• . i Sales de Agua de Mar Caldo de Soya Tríptico ["TBS"] Digestión pancreática de Caseína (Oxoide) : 11.3g/L Digestión Papaica de Frijol Soya 2g/L Fosfato potásico dibásico 1.7g/L Glucosa 1.7g/L NaCl 3.3 g/L pH 7.3 +/- 0.2 Caldo de Sales de Mar ["SBS"] : Sales de Mar (Sigma) 40g/L Peptona (BDH) 5g/L Extracto de levadura (Merck) 2g/L Caldo de Agua de Mar ["SWS"] : "Océano Instantáneo" 38g/L (Sistemas Aquariu , Francia) Extracto de Levadura (Merck) 1 g/L Peptona (BDH) Ig/L % de Caldo de Agua de Mar ["^SWB"] : "Océano Instantáneo" 19g/L (Sistemas Aquarium, Francia) Extracto de Levadura (Merck) 1 g/L Peptona (DBH) lg/L Todos los cultivos se incubaron a 15°C hasta la notable turbidez (esto tomó 2-6 días dependiendo de la velocidad de crecimiento de cada cultivo) . Todos los cultivos entonces se sacudieron en frío a 5°C por 4 días. 200 mis de un cultivo de E. coli también se produjeron como un control negativo. Este fue la cepa W3110. Se cultivó en medio de caldo Lauria-Bertaní ["LB"] en un recipiente sacudidor a 37°C durante la noche.

Medio LB Bacto-tpptona lOg/L Extracto de Levadura 5g/L NaCl lOg/L Ajustado a pH 7.0 Extracción de Proteína El siguiente protocolo da el método usado para la extracción de proteína celular total. 1. Las células se colectaron de los cultivos por centrifugación. Se usó una centrífuga de enfriamiento Beckman, con un rotor de ángulo fijo JA-14. Las muestras se centrifugaron a una temperatura constante de 4°C y a una velocidad de 10,000 rpm (15,300g) por 10 minutos. El sobrenadante fue cuidadosamente removido dejando la pelotilla. 2. La pelotilla se resuspendió en 1 ml de 10 M de amortiguador Tris/HCl (pH 7.0). Este se formó nuevamente en pelotillas usando las mismas condiciones de centrífuga como en el paso 1. El sobrenadante se descargó cuidadosamente dejando justamente la pelotilla. 3. La pelotilla entonces se suspendió nuevamente en 1 ml de amortiguador de extracción de proteína (véase abajo) y después se mantuvo en hielo por 5 minutos para permitir la lisis celular. La pelotilla resuspendida entonces se sometió a sonicación en una botella de pared gruesa usando un Soniprep Sanyo 150 a 15 A por 30 segundos. 4. La mezcla sometida a sonicación entonces se transfirió nuevamente a un tubo centrífugo y se centrifugó como se resume en el paso 1. El sobre nadante se removió y congeló a -20°C hasta que se requirió.

Amortiguador de Extracción de Proteína: 25 M Tris/HCL (pH 7.0) 1 mM EDTA 1 mM PMSF (Sigma) 2ug/ml Pepstatina A (Sigma) Ensayo Laminar El siguiente protocolo es el método usado para revisar el nivel de inhibición de re-cristalización del hielo logrado por cada una de las extracciones de proteínas. Es una modificación del ensayo descrito en Byass et al. [Unilever O-A-98/04148] . 1. Se preparó una solución de sacarosa al 60%. Una muestra de 20 µl de cada extracto de proteína se mezcló con 20 µl de la solución de sacarosa. Estas mezclas se elaboraron en tubos Eppendorf de 1.5 ml. Las soluciones de extracto de sacarosa/proteína al 30% se centrifugaron en un micro-centrífugo superior Micro Centaur Desk MSE por 10 segundos para asegurar que todo el líquido se mezcló en la parte inferior del tubo. 2. 5 µl de la solución resultante se colocaron entre dos cubiertas de laminilla de 16 mm de diámetro circulares, después de lo cual el número del extracto se escribió con el marcador impermeable. Estas entonces se mancharon en seco. 3. Las cubiertas de laminillas entonces se separaron en 2, 2, 4-trimetil pentano que ha sido pre-enfriado a -70°C (usando hielo seco) . Se super-enfriaron en esto por 2 minutos . 4. Un baño frío se llenó Z de completo de 2,2,4- trimetil pentano, el cual se pre-enfrió a -6°C usando un circulador de baño de agua Haake C y dos unidades de control de temperatura Haake (PG40 y F4) . 5. Las cubiertas de laminillas se removieron del proceso de super-enfriamiento y colocaron directamente en el balo a -6°C por 30 minutos para permitir la recristalización. 6. Las cubiertas de laminillas entonces se revisaron mientras en el baño de -6°C, usando un objetivo EF L 20/0.30 160/0-2 en un portaobjetos Leitz Dialux 20 EB. 7. La forma del cristal observado, tamaño y densidad fueron relacionadas con el nivel de actividad AFP usando el Sistema de Registro Laminar resumido abajo.

Sistema de Registro Morfologías de cristal observadas +++++ Muy pequeños, cristales muy densos. ++++ Pequeños, no densos; o pequeños, casi densos con algunos cristales de tamaño medio . +++ Pequeños, no densos con cristales grandes medianos; o pequeños- medianos, no densos. ++ Cristales medios o grandes con algunos cristales pequeños Cristales discretos redondos, grandes (por ejemplo, 30% de control de sacarosa) .

[Un registro de +++ o superior se requiere para un aislado por tener cualquier utilidad práctica] . Los resultados a partir del ensayo laminar se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Los resultados en la Tabla 1 muestran que fuera de los 19 aislados de la bacteria .Antartica que fueron investigaron, solamente el aislado 196 y el aislado 20 producen proteínas con cantidades significantes de AFP. El aislado 196 es Marinomonas protea, como se describe además abajo.

Ejemplo 2 Colección del Aislado 196 Las bacterias se aislaron de la interfase hielo/agua del Lago Ace, Antartica (68°28'S, 78°11'E). Las muestras se colectaron taladrando un agujero a través del hielo (1600 mm de espesor) en el punto más profundo del lago. Las secciones de la parte inferior del centro de la interfase hielo/agua se fundieron en agar. El material se designó Aislado 196.

Características de crecimiento del Aislado 196 Las colonias del aislado 196 que formaron en agar de agua de mar de fuerza media después de 3 a 5 días de incubación a 10°C, fueron no pigmentadas (color cremoso) , suaves, convexas, circulares con bordes completos y variadas en tamaño de menos de 0.5 mm hasta 1.5 mm de diámetro. En agar de soya tríptico las colonias fueron beiges en color, mucoides y esparcidas, y variadas de 2-5 mm de diámetro. El aislado fue psicotrófico, que crece a temperaturas entre <0 hasta ~25°C (crecimiento óptimo entre 15-22°C), sin crecimiento a 30°C. La bacteria crece aeróbicamente y bajo condiciones microaerofílicas, pero podría no crecer ; |j|j|g^ - *& $>" n anaeróbicamente. No requiere agua de mar para el crecimiento, pero podría tolerar hasta 70% de NaCl. Las células se hicieron crecer en 60-70% de NaCl que consiste de bastoncillos rectos y células cocoides, los cuales parecen más retorcidos y propuestos que las células en medio de salinidad inferior. Las curvas de crecimiento típico en diferentes tipos de medios se muestran en las Figuras 1 y 2.

Clasificación de Organismos Análisis de .ARNr 16S Filogenético a partir de Aislado 96 La identificación del aislado se basó en el análisis de ARNr 16S. Una secuencia casi completa (1,485 pb) del gen ARNr 16S, se obtuvo del alargamiento de las posiciones de nucleótidos 18 a 1503 (numeración equivalente a Escherichia coli ) , y se muestra en la Figura 3. Los análisis de .ARNr 16S contra las especies en el banco de datos públicamente disponible, mostraron que representan nuevas especies del género Marinomonas (en la subclase gama-3 de la Proteobacteria phylum) , con 74.7% de identidad a Marinomonas communis (el tipo de especie del género) . La igualación entre las dos secuencias se muestra en la Figura 4. El nombre fue propuesto Marinomonas protea sp. Nov. (pro'te. a. Gr. n . Proteos, nombre del dios Griego mitológico del mar quien podría aparecer en muchas formas, M.L. fem. adj . protea, polimorfos) (Prof. Hans G. Truper, pers . comm . ) . La bacteria se ha depositado en las Colecciones Nacionales Británicas de Bacterias Industriales y Marinas .Aberdeen (NCIMB) bajo el número 41006 el 9 de Febrero de 1999. Las secuencias ARNr 16S generadas en este estudio fueron depositadas en el GenBank. Las similitudes del porcentaje para las secuencias se dan en la Tabla I. Los tres filogenéticos determinados usando PHYLIP (versión 3.57c) se muestra en la Figura 5. Usa secuencias casi completas de ARNr 16S, que comparan Marinomonas protea con sus relativos filogenéticos más cercanos y con otros tres aislados de hielo marino identificados como Marinomonas sp . (M. Brown, pers . Comm) . Los tres se construyeron usando el método de probabilidades máximas (Felsentein, 1981) .

.Análisis Filogenético de .ARNr 16S del Aislado 20 Un análisis del Aislado 20 se encontró por ser una especie de Pseudomonas . Más precisamente, el aislado 20 se encontró por tener un valor de similitud de 99.4% con Pseudomonas synxantha . Esta cepa se depositó ba o el Tratado de Budapest con la autoridad depositaría internacional NCIMB Aberdeen, Escocia bajo el número NCIMB 41076.

M • i k -Ejemplo 3 Extracción de Proteína Celular Total Un cultivo bacteriano (2 L) del Aislado 196 se hizo crecer en medio líquido (Caldo de Soya Tríptico) a 15°C hasta turbidez. El cultivo fue asépticamente pipeteado en universales estériles de Nalgene™. Las células se cosecharon por centrifugación 4,200 x g por 12 minutos a 5°C (Sorvall Dupont Econospin) . Las pelotillas se resuspendieron en 1 ml de amortiguador Tris 10 mM enfriado en hielo (Tris [hidroxímetil]amino-metano) /HCl (pH 7.0). Las células fueron formadas en pelotillas por 10 minutos. Las pelotillas fueron entonces ya sea almacenadas a -20°C durante la noche, o las extracciones de proteína se llevaron a cabo inmediatamente. La pelotilla se resuspendió en 1 ml de amortiguador de extracción nativo enfriado en hielo (NEB, el cual consiste de 25 mM Tris/HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 Mra PMSF y 0.1 itiM Pepstatina A) . El amortiguador Tris actúa como un -amortiguador bioquímico, el EDTA es un agente quelante y es activo contra las metaloproteasas, PMSF es un inhibidor de las proteasas de serina y la Pepstatina A inhibe la proteasa. A cada pelotilla resuspendida, se agregaron dos volúmenes de perlillas de vidrio lavadas en ácido (HCl 70%) (1.5 ml de perlillas de 425-600 µm de diámetro y 0.5 ml de perlillas de 3 mm de diámetro, ambas de Sigma) , o suficientes para crear una cubierta adherente viscosa de la suspensión celular sobre las perlillas. Las perlillas fueron lavadas en ácido para prevenir el álcali ser liberado de los vidrios cuando se someten a vórtices, como esto podrían dañarse potencialmente los componentes sensibles al álcali de la célula. La mezcla entonces se sometió a vórtices por sesiones de 1 minuto, con intervalos de 1 minuto en hielo. Esto se repitió 8 veces para cada muestra, después de lo cual se agregó 1 ml de NEB enfriado en hielo a las perlillas, las cuales fueron sometidas a vórtices nuevamente para permitir a la suspensión celular entrar en la solución. Las células se dejaron en hielo por 5 minutos para permitir a las perlillas de vidrio fijarse y los usados transferirse a tubos Eppendor enfriados en hielo, estériles y centrifugados (Beckman MSE, 12,000 x g, 5°C, 5 minutos) para separar las paredes celulares y células no disueltas, así como también cualquiera de las perlillas de vidrio las cuales se transfirieron accidentalmente. El sobrenadante se transfirió a Eppendorfs enfriados en hielo, estériles y centrifugados una vez más para remover cualquiera de los desechos celulares adicionales que pueden interferir con el ensayo Rl . El sobrenadante se pipeteó en 2 Eppendorfs il *pdfflA^j?^.^ j fafj etiquetados enfriados en hielo, y almacenados a -20°C hasta que se llevó a cabo el ensayo.

Ejemplo 4 Efecto de las Proteínas .Anticongelantes Bacterianas en Morfología de Cristales de Hielo El efecto de la proteína anticongelante a partir del aislado 196 (obtenida como en el Ejemplo 32) en la 10 morfología de cristal de hielo, se sometió a ensayo examinando el extracto de proteína celular total a -6°C bajo el microscopio. Los cristales de hielo hexagonales, algunos alargados, fueron claramente visibles. 15 Ejemplo 5 Purificación de Proteina e Información de Secuencia Purificación de Proteina Activa La proteína anticongelante bacteriana, la cual se 20 llamó marinomonina, se aisló del extracto crudo producido en el Ejemplo 3 usando cromatografía de fase inversa (RPC) en un sistema de purificación de proteína .AKTAT, seguido por cromatografía de exclusión en gel (Sephadex® 75, ó S75) en un afeaí sistema SMART™ ( bos de Pharmacia Biotech) . Las fracciones activas de cada método de separación se corrieron en gel SDS de bis-acpla ida al 10%: la banda obtenida corre a un peso molecular de ~38 kDa.

Información de Secuencia La banda de proteína de 38 kDa se electro anchó en una membrana PVDF y se secuenció N-terminal. La siguiente secuencia de 16 aminoácidos se obtuvo con el 6to. aminoácido que produce un resultado ambiguo de ya sea Glicina o Valina (la región obscurecida indica la región de la secuencia que la sonda de oligonucleótido designó a partir de) : Búsquedas de Homología de Base de Datos Las búsquedas de homología de secuencia se llevaron a cabo usando la secuencia N-termmal de la nueva proteína AFP usando búsquedas FASTA contra la base de datos SWISS- PROT, la cual incluye todas las secuencias AFP publicadas. Las igualaciones de secuencia fueron aleatorias, en tales similitudes fueron igualadas a un amplio rango de organismos, tanto bacterianos como eucarióticos, y las similitudes no fueron particularmente altas. También, las regiones de homología entre las secuencias de proteína no fueron localizadas en el N-término de las proteínas en la base de datos, pero la secuencia media: esto reduce la probabilidad de cualquiera de las homologías reales entre las secuencias de proteína y la secuencia N-terminal de esta nueva proteína.

Ejemplo 6 Dos requerimientos importantes para un microorganismo que produce AFP por ser de utilidad práctica es que su cultivo puede ser fácilmente escalonado y que la actividad AFP es estable. Por ejemplo, la susceptibilidad a la desnaturalización por calor hace difícil usar el AFP en productos alimenticios tales como helados, que son pasteurizados durante la manufactura.

Cultivo de Marinomonas protea en "matraces agitados" (escala de 9 litros) El aislado 196 (Marinomonas protea ) se cultivó en 18 matraces Erlenmeyer de ÍL individuales que contienen 500 ml de Caldo de Sales de Mar Estéril (sales de mar (Sigma) 40 g/L; peptona (Fisher) 5 g/L; extracto de levadura (Difeo) 2 g/L) . Los matraces se inocularon asépticamente con 100 µl de un cultivo existente de M. protea . Los cultivos se hicieron crecer estáticamente a 15°C por 7 días en un incubador Sanyo. Los cultivos mostraron señales de turbidez siguiendo 2 días a 15°C. Al día 7 la temperatura dei incubador se ajustó a 4°C y se mantuvo a esta temperatura por unos 7 días adicionales para inducir la producción de proteína anticongelante (AFP) . Después de 7 días de inducción en frío a 4°C, las células de los 9 L del cultivo se colectaron en 6 contenedores de 300 ml por centrifugación repetida. La centrifugación se llevó a cabo a 700 rpm por 20 minutos y a 4eC usando un rotor de ángulo fijo F-15/250 Sorvall en un centrífugo RC5C Sorvall Instruments. Después de cada paso de centrifugación, el sobrenadante se descargó y se agregó cultivo adicional y la centrifugación se repitió. En esta forma, las pelotillas se acumularon en 6 contenedores hasta que se cosecharon los 9 L de cultivo. Los seis contenedores y pelotillas asociadas se almacenaron a -80°C hasta que se requiere para la extracción de proteína y toma de pruebas laminares.

Extracción de proteína a partir de 9 litros de cultivo y pruebas laminares para actividad AFP Las pelotillas se lavaron por resuspensión moderada en 10 ml de Tris/HCl 10 mM enfriado en hielo (pH 7.0). Una alícuota de 1 ml de las células resuspendidas se centrifugó en un tubo Eppendorf por 5 minutos a 13,000 rpm en un microcentrífugo (MSE Micro Centaur) . El "sobrenadante lavado" se retuvo para someterlo a prueba por actividad AFP por el ensayo LAMINAR. Las células de pelotillas (~ 0.2 g) se resuspendieron en 800 µl de amortiguador de extracción enfriado en hielo (50 mM Tris/HCl, pH 7.0) y 200 µl de cóctel inhibidor de proteasa Bacteriana suministrado por Sigma. [Este cóctel contiene una mezcla de inhibidores de proteasa con amplia especificidad para la inhibición de serina, cisteína, aspártico y metalo-proteasas y a inopeptidasas. Comprende fluoruro de 4- (2- aminoetil) bencensulfonilo (AEBSF) , pepstatina-A, trans- epoxisuccinil-L-leucil-amido (4-guanidino) butano (E-64) , bestatina, y EDTA sódico] . Las muestras se sometieron a vórtices y después se colocaron en hielo, y este proceso se repitió un total de 8 veces. Las muestras entonces se centrifugaron y el "sobrenadante de extracción" se retuvo por someter a prueba AFP por el ensayo LAMINAR. Actividad LAMINAR Ejemplo 7 Inducción de AFP por sacudimiento en frío un cultivo a 8°C Para la producción de AFP para ser fácilmente escalonada, es importante que el sacudimiento en frío pueda ser efectivo a un rango de temperaturas diferentes. Por ejemplo, es difícil operar fermentadores a temperaturas por debajo de 8°C. Por lo tanto, para ser capaz de una producción a escala en fermentadores, podría ser posible inducir la expresión de AFP por sacudimiento en frío a temperaturas de 8°C o superiores. Este ejemplo muestra que los cultivos de Marinomonas protea pueden ser inducidos por expresar AFP a 8°C. El aislado 196 (Marinomonas protea ) se cultivó en un matraz Erlen eyer de 1 L que contiene 500 ml de Caldo de Sales de Mar estéril (sales de mar (Sigma) 40 g/L; peptona (Fisher) 5 g/L; extracto de levadura (Difco) 2 g/L) . El matraz se inoculó asépticamente con 100 µl de un cultivo existente de M. protea . El cultivo se hizo crecer estáticamente a 15°C por 7 días en un incubador Sanyo a 15°C. EL cultivo mostró signos de turbidez después de 2 días a 15°C. Al día 7, el cultivo se transfirió a un incubador Conviron fijo a 8°C y esta temperatura se mantuvo por unos 7 días adicionales para inducir la producción de proteína anticongelante (AFP) . Después de 7 días de inducción en frío a 8°C, el cultivo de M. protea se cosechó y sometió a prueba por su actividad AFP por el ensayo LAMINAR. Los 500 ml de cultivo se colectaron en un contenedor de 50 ml por centrifugación repetida. La centrifugación se llevó a cabo a 9000 rpm por 5 minutos a 4°C usando un rotor Sorvall SS34 en un centrífugo Sorvall Instrument RC5C. Después de cada paso de centrifugación, el sobrenadante se descargó y se agregó cultivo adicional y se repitió la centrifugación. En esta forma una pelotilla acumulada en el contendedor hasta los 500 ml del cultivo se cosechó. La pelotilla celular resultante pesó 0.9 g. Los 0.9 g de las células en forma de pelotillas fueron resuspendidas moderadamente en 1 ml de amortiguador de extracción enfriado en hielo (25 mM Tris/HCl, pH 7.0) y 0.5 ml de cóctel de inhibidor de proteasa Bacteriana suministrado por Sigma (véase Ejemplo 6) . La muestra se sometió a vórtices y después se colocó en hielo, y este proceso se repitió un total de 8 veces. La muestra entonces se centrifugó por 10 minutos a ldOOOrpm usando un rotor Sorvall SS34 en un centrífugo Sorvall Instrument RC5C y el "sobrenadante de extracción" se filtró usando un filtro de 0.2 µm y retuvo por determinación de la actividad (véase tabla) .

Ejemplo 8 Estabilidad al calor de AFP extraído de Marinomonas protea Un extracto que contiene AFP se preparó a partir de un cultivo de Marinomonas protea, esencialmente como se describe en el Ejemplo 6. 25 µl de alícuotas (5 en total), se colocaron en tubos Eppendorf de 500 µl y se sometieron a prueba por su estabilidad al calor. Cuatro de los tubos se ^colocaron en un baño de agua hirviente. Cada tubo se expuso al tratamiento al calor por una longitud diferente de tiempo: ya sea 1, 2, 4 ó 15 minutos. El quinto tubo fue usado como control y no se expuso al tratamiento de calor. Después del tratamiento en calor, todos los tubos se colocaron n¡¡¡ inmediatamente en hielo y después se sometieron a ensayo por su actividad AFP usando el ensayo laminar.

Actividad LAMINAR después de la ebullición Como el AFP extraído de Marinomonas protea puede sobrevivir la ebullición, es adecuable para usarse en productos alimenticios que son pasteurizados durante su manufactura. Por ejemplo, una "mezcla" de helado podría * típicamente ser pasteurizada manteniendo a una temperatura de 82 °C por 25 segundos antes del enfriamiento y congelamiento.

Este ejemplo muestra que el AFP extraído de Marinomonas protea podría someter tal proceso de pasteurización sin ai ai, aÉi , > ..., * ¥h»^^^ tm^í^i 7^^ 2s^^„í ^^ MÁ? pérdida de actividad AFP.

Ejemplo 9 Un proceso preferido se describe abajo para el aislamiento de AFP de Marinomonas protea . a) Cul tivo Celulares 10 litros de cultivo se produjeron como se describe previamente en el ejemplo 6 (crecimiento a 15°C e inducción a 4°C) . Las células se cosecharon por centrifugación y mantuvieron a -80°C hasta que se requiere. b) Extracción de Proteína Las células se resuspendieron en amortiguador de extracción (20 M tris, 10 mM EDTA, pH 7.1) y después sometidas a somcación 10 veces por 15 segundos a intervalos de 45 segundos usando una sonda Sanyo Soniprepl50 a Amplitud de 12 µl . Los extractos se colocaron en un baño de hielo/etanol durante el procedimiento de sonicación para evitar el sobrecalentamiento de los extractos. c) Tratamiento de calor para inactivar las proteasas ^^^^^^^ El extracto se colocó en un baño de agua hirviente por 4.5 minutos. La temperatura de las muestras se midió y encontró por alcanzar 73°C. Hemos encontrado que esta es una forma muy efectiva de inactivación de las proteasas en la muestra, y al mismo tiempo mata a la mayoría o todas las bacterias (Marinomonas protea) en la muestra. d) Separación de AFP a partir de desechos celulares Los extractos se centrifugaron por 1 hora a 4°C a 16,000 rpm en un Centrifugo Sorval (rotor SS-34) para remover los desechos celulares. El AFP se encontró por estar presente en el sobrenadante. e) Remoción de la bacteria viable restante Para muchos alimentos congelados, tales como helados, es importante asegurar la remoción de todas las bacterias viables. Esto asegura que los productos y equipos pueden mantenerse a estándares altos de higiene. Para las preparaciones de AFP en la invención, hemos encontrado que esto puede lograrse por microfiltración. En este ejemplo, el sobrenadante descrito en (d) se filtró con una unidad de esterilización de 0.2 µm de Nalgene. Lo filtrado se colectó en tubos estériles y se almacenó a -80°C hasta que se requiere . f) Garantía de calidad - medición de actividad AFP y células viables a través del proceso En cada paso del proceso, los extractos se sometieron a ensayo con el ensayo laminar. Los extractos también se sometieron a prueba por la presencia de células bacterianas. Las cajas de Petri que contienen agar de Soya Tripton de Sigma se usaron (40g diluido en 1 L) . Las muestras se estriaron con un lazo en una caja de Petri o colocaron en placas con un esparcidor (50 µl) e incubaron por 7 días a 15°C.

Las muestras fueron NI: Células resuspendidas en Amortiguador de Extracción (registro Laminar ++++) . N2: Células en amortiguador de Extracción y después de la sonicación (registro Laminar +++++) . N3: Células en amortiguador de Extracción, después de la sonicación y ebullición por 4 minutos 30 segundos (registro Laminar +++++) . N4: N3 centrifugado por 1 hora y filtrado en unidad de esterilización 0.2 µ (registro Laminar +++++) .

** Presencia de colonias en la Caja de Petri X Ausencia de colonias Conclusión El AFP producido por este proceso es : a) activo, b) libre de células viables, y c) libre de químicos tóxicos .

Ej emplo 10 En este ejemplo se demuestra como determinar cuánta solución que contiene AFP se agrega al producto alimenticio usando el "ensayo de inhibición de Re-cristalización (Rl)". El ensayo Rl es cuantitativo pero es también consumidor de tiempo y requiere equipo especial. Un ensayo para medir la inhibición de recristalización en hielo ha sido previamente descrito por Jarretan et al. (WO 99/37782). En este ejemplo, el protocolo dado abajo se usó.

Protocolo de Ensayo Rl Una solución que contiene AFP de Marinomonas protea se ajustó a un nivel de 30% de sacarosa con cristales de sacarosa. Una gota de 3 µl de la muestra se colocó en una cubierta de laminilla de 22 mm. Una cubierta de laminilla de 16 mm entonces se colocó en la parte superior y se colocaron 200 g de peso en la muestra para asegurar un espesor de laminilla uniforme. Los bordes de las cubiertas de laminillas se sellaron con barniz de uñas claro. La laminilla se colocó en un portaobjetos de microscopio controlado por temperatura Linkman THM 600. La etapa se enfrió rápidamente (50°C por minuto) a -40°C para producir una gran población de cristales pequeños. La temperatura del portaobjetos entonces se elevó rápidamente (50°C por minuto) a -6.0°C y se mantuvo a esta temperatura. La fase de hielo se observó a -6.0°C usando un microscopio Leitz Ortholux II. Las condiciones de luz polarizadas en conjunto con una placa lambda se usaron para mejorar el contraste de los cristales de hielo. Las imágenes se registraron a T=0 y T=60 minutos y analizaron usando conjunto de programas de análisis de imágenes (Analysis, Software Soft-Imaging GmbH, D48153, Munster, Ha merstrasse, 89 Alemania) . El crecimiento del cristal se calculó como sigue. El tamaño medio de una población de cristales de hielo a un tiempo particular se determinó capturando una imagen de la población (usando el equipo mencionado anteriormente) y después seleccionado una región de la imagen que contiene al menos 200 cristales de hielo. El diámetro más largo de cada cristal se determinó retirándolo alrededor de éste y calculando el diámetro más largo usando el conjunto de programas de análisis de imagen. Cada experimento Rl se llevó a cabo 3 veces (por lo tanto, las imágenes de al menos 600 cristales de hielo se analizaron) . Los datos en la tabla registran la media del crecimiento de cristales de hielo (es decir, la diferencia en el diámetro medio de cristales de hielo al tiempo cero y después de 60 minutos) . Los límites de confianza se calcularon por un nivel de confianza en la media de 95%. Varias diluciones de una preparación de Marinomonas AFP se hicieron con el fin de averiguar cuan lejana la muestra podría diluirse y todavía lograr una inhibición efectiva de la re-cristalización del hielo. En términos prácticos, consideramos una preparación de AFP o una dilución de una preparación AFP para lograr una inhibición efectiva de la re-cristalización del hielo si una muestra de dilución o preparación resulta en crecimiento de cristales de hielo en el ensayo Rl de 3 µm o menos.

Resultados de ensayo Rl El crecimiento de cristales medios se determinó analizando las imágenes de 1200 cristales.

Las figuras 6A y 6B ilustran típicamente imágenes de cristal de hielo simplemente para mostrar el tipo de imagen que fue capturada y analizada.

Los resultados muestran que la preparación de AFP puede ser diluida 10 veces y todavía se logra una inhibición efectiva de la re-cristalización de hielo. Por lo tanto, una dilución de 1 en 10 (= 10%) de esta preparación se usó en prototipos de alimentos congelados como muestra el ejemplo 11.

Ejemplo 11 Preparación de muestras de hielo de agua Se hicieron tres pre-mezclados líquidos para la preparación de hielo de agua: (A) 20% de sacarosa en agua (control negativo; no de conformidad a la invención) (B) 20% de sacarosa en agua que contiene AFP de Marinomonas . El AFP ha sido diluido en la pre-me2cla a una concentración que podrá dar un valor Rl de aproximadamente 1-9 µm. En este ejemplo esta fue una dilución de 1 en 10 o 10% - véase el ejemplo 10 para los datos de Rl .

Por lo tanto, la pre-mezcla B tiene la siguiente composición: Ingrediente % por peso Sacarosa 20.00 Preparación AFP (en amortiguador acuoso) 10.00 Agua 70.00 C) 20% de sacarosa en agua que contiene AFP de pescado tipo III, CLAR 12 como se describe en WO-A-97/02343. El AFP ha sido diluido en la pre-mezcla a una concentración que podrá dar un valor Rl de aproximadamente 2.9 µm.

Determinación de dureza Barras cuboides de hielo de agua (lOmm x 55mm x 95mm) se prepararon para cada composición (A, B, C) como sigue. Cada composición fue congelada a -3.5°C en una máquina de helados Gelato Chef 2000 (Magimix UK Ltd) . La mezcla fue transferida a moldes de goma de silicona con dimensiones internas de lOmm x 55mm x95mm, previamente enfriados a -30°C. La preparación fue entonces enfriada a -30°C por 1 hora antes del desmolde y almacenamiento a -25°C antes de la prueba de dureza, usando la prueba de dureza Vickers.

La prueba de dureza Vickers es una prueba de penetración o indentación que involucra empujar un penetrador en forma piramidal en la superficie del material y registrar la fuerza aplicada como una función del desplazamiento de la punta. La fuerza y el desplazamiento son medidos durante el ciclo de cargado de indentación y el ciclo de descarga. La prueba se describe en "Handbook of Plastics Test materials" Ed. R.P. Brown, Pub. George Godwin Limited, The Builder Group, 1-3 Pemberton Row, Fleet Street, Londres, 1981. La geometría piramidal Vickers es un estándar de ingeniería industrial (BSi 427, 1990) . Se tiene un ángulo ápex en la punta de 136°. La dureza se determinó como: A donde Hv es la dureza Vickers, Fma. es la máxima fuerza aplicada (véase la figura 7) y A es el área proyectada de la indentación dejada en la superficie del material. El área A es determinada asumiendo que la indentación tiene la misma geometría como el penetrador que lo forma, es decir, una pirámide Vickers, y por lo tanto el área proyectada puede ser determinada de la profundidad de indentación dada por d? en la figura 8.

A" 24.5 ^ Determinación de fuerza y módulo Varias tiras delgadas (10 o más) de hielo de agua (50mm x lOmm x 2 mm) se prepararon para cada composición (A, B, C) como sigue. Un molde de goma de silicona fue cortado exactamente para dar dimensiones internas de 50mm x lOmm x 2mm. El molde fue colocado en una hoja de acetato y firmemente presionado para dar un sello hermético de agua. Cada composición fue pipeteada en un molde usando una icropipeta de alta precisión, y se removió cualquier burbuja de aire. Una segunda ho a de acetato fue desenrollada sobre la punta de molde completo y nuevamente se removió cualquier burbuja de aire. La composición fue congelada colocando el ensamble completo entre dos bloques enfriados con nitrógeno a -30°C por 2 minutos. Después de este tiempo, el molde se removió y se equilibro a -20°C. Las tiras fueron desmoldeadas removiendo la hoja superior de acetato, seguido por el molde de goma de silicona antes de que la base de la hoja se invierta y nuevamente se desprende para revelar la tira de hielo de agua. Estas tiras se almacenaron a -25°C antes de someter a prueba la fuerza y módulos, usando una prueba de curva de tres puntos.

Prueba de curva de tres puntos Una prueba de curva puede ser usada para determinar un número de propiedades mecánicas de materiales de confituras de hielo, tal como módulos Young (aparente) y firmeza de flexión. En una prueba de curva, una pieza de la muestra es deformada mientras se mide la fuerza aplicada y somete a prueba la desviación de la pieza. Un dato esquemático expuesto para una confitura de hielo se muestra en la figura 8. El módulo elástico se determina por el gradiente de la parte lineal inicial de esta curva. La prueba general aplica a todos los tipos de sólidos descritos en "Biomechanics Materials. A practical Approach" Ed. J.F.V. Vincent, Pub. IRL Press, Oxford University Press, Walton Street, Oxford, 1992 y "Handbook of Plastics Test materials" Ed. R.P. Brown, Pub. George Godwin Limited, The Builder Group, l-3Pemberton Row, Fleet Street, Londres, 1981. En esta solicitud particular, una prueba de cuerva de tres puntos fue adaptada para evaluar las tiras delgadas de hielo agua (50mm x lOmm x 2mm; preparado como arriba) mientras en un gabinete se controla la temperatura fija a -20°C. Someter a prueba involucra colocar cada una de las tiras en 2 soportes separados por 30mm y aplicar una presión de un soporte superior centralmente en la superficie de las tiras (figura 9) . La fuerza aplicada en flexión y desplazamiento del contacto móvil se registra a través de la prueba. La velocidad de descenso del soporte móvil fue lOmm por minutó. Los módulos elásticos aparentes del material se dan por la ecuación; E - gradiente . S3 4BD3 donde el gradiente es el que se muestra en la figura 8, S es el trayecto (distancia) entre los contactos de soporte por debajo de la tira de prueba, B es el ancho de la tira y D es la profundidad de la tira. Para estas pruebas el trayecto (S) fue de 30mm. Con referencia a la Figura 8, la firmeza del material bajo las condiciones de curva de tres puntos, se da "como; 2BJX donde du es la firmeza de flexión y Fma? es la fuerza máxima registrada.

Resultados de las propiedades mecánicas sometidas a prueba Los resultados para 3 diferentes composiciones de hielo de agua se dan abajo. Los datos fueron registrados como la media, derivada de 10 mediciones elaboradas. En el caso de la prueba de dureza, 10 medidas se hicieron en una barra de hielo de agua (lOmm x 55mm x 95mm) . En el caso de la firmeza y módulos, una medida se hizo en cada una de las 10 tiras de hielo de agua individuales (50mm x lOmm x 2ram) .

De manera sorprendente, los resultados muestran que las muestras que contienen AFP de Marinomonas no fueron duras o quebradizas, debido al hecho de que el AFP de pescado y AFP de Marinomonas fueron cada uno agregados en niveles similares en términos de su actividad Rl .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante, para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

GGtAACAGGGGAGCTtGCTCCTGCTGACOAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGC GTAGGAATCTGCCTAGTAGAGGGGGACAACATGTGGAAACGCAtGCtAATAC CGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGGAGGGGACTCTTCGGAGCCTTCCGCTATT AGATGAGCCTGCGTGAGATTAGCTAGTTGGtAGGGTAAAGGCCTACCAAGGC GACGATCTCTAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACA CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGC AAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAGGGTRGTAAAG (^CTTTCAGGGGTGAGGAAGGGTGATAGGTTAATACGTTATCATC?RGACOTT AGCCCCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAG AGGGTGCAACK GTTAATCGGAATRACTGGC?:GTAAAGCGCGCGTAGGTGGT? TGTTAAGTCGGATGTGAAATCCCAC^ GCTCAACCTTGGAATGGCACCCGATA CTGGCTAGC?AGAGTATGGTAGAGGGGTGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTOA AATGCGTAGATATAGGAAGGAACATCAGTGGCGAAGGOJACACCCTGGACG AATACTGACACTGAGGTGCGAAACK:GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCX3TAAACGATG CTACTAGCCGTRGGGTTGTAATGACTT AGTGGCGCAGCrAACX?^ATAAGTAGAC ?xrrGGGGAGTACGGCCGCAAG GTrAAAACr?\AATGAATTGACGGGGGCCCGCA^ titAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCp-ACCTACTCTTGAC^TCCA ^GAA ATTTOAGAGAT ^GATGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAsGTGClGCATGG ratCGTCAGCTCCpGTrGtGAAATGTTGGGTrAAGT<XX:GtAACGAGCGCAA CCCTTGTCX?TATTGGCCAGCACGTAATGGTGGGAACGGGAAGGAGACTGCCG GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTGACG AGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAGAGGGCTGCAAGCTAGC GATAGTGAGCGAAtCCCACAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAA CTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGG TGAATACGTTCCCGGGCCTGGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGAT TGCGCCAGAAGTAGCTAGCTTAACCCTTCGGGATG< CGGTGACCACGGAGTG GTCAATGACTGGGGT?GAAGTCTACGCG-'3 1 S 'GCCCTTGCTC AGATTQJUCO CraGCGGCAS GCCTAACAC? TGC?AQTCOA SX ßOBJXlUStf». GRAGCXTGCT TCTCTTOACA. COOGCQQACG OCTGAGT?AT xox accCTCOAAT creoepssiA GGGGG8GAIA A8TTCOOM. ACCGACOCTA 1SX XXA8GC?X? OOTCCIACGG GAG?AftGCAG QOG?CCT 8 QOCCTTOCOC 20X T?TC?GATGA OCCX?OSTCG OATTAOCTAO TTSSTOAGCT AATOOCTCAC 25X CMOßCGftCQ ATCOGl?AaCT OOICIßAOMS GAIGATCAOT CMACXQSA? 301 CT0AOAC?CG GICC?GACTC CX?Oß8AOQ CAQCAGT8G GAMATTSOA. 351 CftATOQOCGÁ. AftGCCIG8C OUSCCAXßCC GO ECGFSTO? AG?AOeiCTT 401 oQSKiTßr?? AGCACT??X sitoaaMßn «KCGTOTM JOXMXACT 51 QCÍAAITGGG ?csraccßA. CM?AXMCC ACOQGCTAAC Tcreiecaß SOX CAQCCGCGOT AA33VCMWW OIQCAACCGT TAATCGOAAT TftCXO8OGT ssx ???soscocß taat3tssttt GTTAJUTPGCSS AisraAAAic CCOQGGCGCA. COX AOCZ8QAAC TOC?TXCftAA ACTOACTOAC TMSup?XGG TAGAOGOTGQ CSX TOSAATTTCC TGTGTAGCOG TGW?OTCßT ?ß?XKX?QG? AOß??CftCC? 701 GS8OS?Aßß CSRCC?CCT3 «CHUU?CT G?OkCIG?8 TCCQAAMSCG 7s? TQ8GAßc?? AOßGaaxKi Auwxxrroat jtßzcao?cc ßov??oa?sß 801 TCAACTAGCC (A'lUUA?GCC TTQAflCTTTT AßXGQCGC?Q CTAACGCATT CSX AAGTTGACCß CCIGGQS?ßT ACQGCCOCAA GGT AAAAC CM? ßMXT 9QX GACGOOaOCC OIC?CMGCG GTGGAßCATß TTSTTT?A T CO?AGC?ACO 951 CQAASAACCT T?CCAGGCCT 0ACATCCAA. TGAACTTT T AOMWIftSAT xoox TQGTaccrrc GGGAACR?TO AGACAOCGGC TGC? QGCTG TCGTCAQCGC XOSX GTGTTGTGAA ATOTA?GQGC-3 '

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 5 1. Un proceso para producir péptidos anticongelantes, caracterizado porque comprende colectar una o más muestras de bacterias de un medio ambiente de baja temperatura acuoso, cultivar la bacteria y extraer las 10 proteínas de las muestras, someter a prueba las proteínas por propiedades anticongelantes, seleccionar la proteína que tiene propiedades anticongelantes, y producir la proteína seleccionada en cantidades suficientes para usar como un aditivo alimenticio AFP. 15 2. Cultivos bacterianos puros de especies de
2. Marinomonas que generan proteínas anticongelantes, caracterizados porque los cultivos bacterianos muestran al menos 90% y preferiblemente 95% de homología en la secuencia del gen ARNr 16S con la secuencia correspondiente en el 20 organismo Marinomonas protea (SEC ID no 1) .
3. 3. Cultivos bacterianos puros de especies de Pseudomonas que generan proteínas anticongelantes, caracterizados porque los cultivos bacterianos muestran al menos 90% y preferiblemente 95% de homología de secuencia en la secuencia ARNr 16S con la secuencia del gen de conformidad a la SEC ID no 2.
4. 4. Proteína que muestra propiedades anticongelantes, caracterizada porque es obtenida por los procesos de conformidad con la reivindicación 1 o aislada de un cultivo de conformidad con la reivindicación 2 ó 3.
5. 5. Proteína de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es estable al calor.
6. 6. Proteína caracterizada porque muestra actividad anticongelante y que tienen una homología de secuencia en la secuencia de ammo ácido N terminal de al menos 75% a la secuencia de amino ácido de la SEC ID No 3.
7. 7. Isoformas y derivados de la secuencia de amino ácido de la SEC ID no 3, caracterizados porque tienen propiedades anticongelantes.
8. 8. Secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica la secuencia de amino ácido de la secuencia ID no 3.
9. 9. Producto alimenticio, caracterizado porque comprende una proteína que muestra propiedades anticongelantes de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 4-7.
10. 10. Un prod Qto alimenticio de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el producto alimenticio se selecciona del grupo que comprende vegetales congelados y confituras congeladas tal como helados. 10 15 20