MXPA02005868A

MXPA02005868A - Composiciones y metodos para reacciones de halogenacion.

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Publication number: MXPA02005868A
Application number: MXPA02005868A
Authority: MX
Inventors: Jian Dong
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2002-10-23
Also published as: EA004942B1; WO2001044447A1; HUP0203807A2; AR026939A1; AU1707801A; CA2393910A1; HUP0203807A3; CN1409759A; EA200200634A1; EP1238062A1; BR0017024A; IL150084A0; JP2003516749A; AU772124B2

Abstract

La presente invencion describe metodos, microorganismos transgenicos y plantas transgenicas para la biosintesis de productos naturales halogenados, donde la halogenacion es substrato y regioespecifica. En particular, esta invencion se refiere al uso de metabolitos halogenados, producidos por el metodo de la invencion, para la proteccion de organismos hospederos contra patogenos, mas particularmente, para la proteccion de plantas contra fitopatogenos. En este aspecto, la invencion proporciona plantas transgenicas con resistencia mejorada a fitopatogenos, y organismos de biocontrol con propiedades de biocontrol mejoradas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA REACCIONES DE HAOGENACION DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de manera general a métodos, plantas transgénicas y microorganismos transgénicos para la biosintesis de productos naturales halogenados, donde la halogenación es substrato y regioespecifica. En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de metabolitos halogenados, producidos por el método de la invención, para la protección de organismos hospederos contra patógenos, en forma más particular, a la protección de plantas contra fitopatógenos- En este aspecto, la invención proporciona plantas transgénicas con resistencia mejorada a fitopatógenos, y organismos de biocontrol con propiedades de biocontrol mejoradas. La biosintesis de por arriba de 2000 metabolitos halogenados que se originan en forma natural, conocidos, ha sido considerada como una función de dos clases de enzimas: las haloperoxidasas y las haloperoxidasas sin hemo (Gribble GW 1994, The natural production of chlorinated compounds. Environ Sci technol 28:310-319; van Pee K-H

[1996] Biosynthesis of halogenated metabolites by bacteria. Annu Rev Microbiol 50:375-99). Del primer grupo, todas las REF. :139518 bromoperoxidasas y cloroperoxidasas poseen protoporfirina IX como el grupo protético que contiene hemo. Este grupo actúa catalíticamente reaccionando con peróxido de hidrógeno para formar el hidroperóxido de la enzima (compuesto I), el cual reacciona entonces con el haluro (X; X=Br", Cl", o I") que resulta en la formación del intermediario EOX unido a la enzima (E) . Se desconoce si EOX es el agente de halogenación o si la descomposición de EOX conduce a un agente X+ de halogenación de vida corta, activado, o derivado del mismo (por ejemplo, HOX, X2 o X3) . Sin embargo, la falta de especificidad del substrato y falta de regioespecificidad exhibida por esta clase de halogenasas fuertemente argumenta que la halogenación se realiza fuera del sitio activo y es catalizada por uno de los productos de descomposición de EOX (Franssen MCR

[1994] Halogenation and oxidation reactions with haloperoxidases. Biocatalysis 10:87-111). Las haloperoxidasas sin hemo son de dos tipos, aquellas que poseen vanadio, y aquellas que poseen una caracteristica de triada catalítica de Ser/Asp/His de proteinasas de serina. El grupo formador cataliza la formación dependiente de vanadio y peróxido de hidrógeno de HOX el cual de nuevo resulta en la halogenación fuera del sitio activo y una falta pronunciada de especificidad de Érf^a^^^^^^? f ta^ substrato (Franssen MCR

[1994] Halogenation and oxidation reactions with haloperoxidases . Biocatalysis 10:87-111). Las haloperoxidasas sin hemo que no contienen vanadio son sometidas a hipótesis para formar un éster de acetato en el residuo Ser del sitio activo, el cual entonces se convierte a ácido peracético en la presencia de peróxido de hidrógeno; el ácido peracético oxida el ion haluro a una especie de halogenación activada (Pelletier I, Altenbucher J, Mattes R

[1995] . Una triada catalítica es requerida por la haloperoxidasa sin hemo para realizar la halogenación.

Biochim Biophys Acta 1250:149-157). Otra vez, el resultado es una reacción la cual falla para proceder con cualquier especificidad del substrato o regioespecificidad van Pee K-H

[1996] Biosynthesis of halogenated metabolites by bacteria. Annu Rev Microbiol 50:375-99). Últimamente se ha descrito una clase adicional de genes de halogenasa cuyos productos exhiben la capacidad de realizar la halogenación regioespecifica de un arreglo amplio de productos naturales (Ha mer PE, Hill DS, Lam ST, Van Pee KH, Ligón JM

[1997] Four genes from Pseudomonas fl uorescens that encode the biosynthesis of pyrrolnitrin. Appl Environ Microbiol 63:2147-2154.

^L t ¿~?£ti*.,~ .^J^^^á^a^ ^^ jg^^^^^^^ La presente invención describe métodos de transferencia de un halógeno a un substrato de una manera regioespecifica que comprende poner en contacto el substrato con una halogenasa regioespecifica en la presencia de un oxidante, un donador de halógeno, una electrón transferasa, y un reductor donde si la transferencia ocurre in vivo la electrón transferasa se codifica por una molécula de ácido nucleico heterólogo. En particular, se describen los métodos • en donde el método de acuerdo con la invención además comprende un componente FAD o FMN, particularmente FAD • en donde la electrón transferasa es una enzima capaz de catalizar la transferencia de electrones a partir de NADH o NADPH o ferredoxina a FAD • en donde la electrón transferasa es una enzima capaz de catalizar la transferencia de electrones a partir de NADH o NADPH o ferredoxina a la halogenasa regioespecifica • en donde la electrón transferasa es una flavina reductasa, ferrodoxina NADP reductasa, ferredoxina, diaforasa- sulfhidrilo reductasa o NADH-cyt-B5 reductasa, NADPH-FMN reductasa, NADPH-cyt-p450 reductasa o nitrato reductasa • en donde la electrón transferasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 30% de identidad a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs:19, 21, 23, 25, 27, 29 ó 31 • en donde la electrón transferasa comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NOs:19, 21, 23, 25, 29 ó 31 • en donde la halogenasa regioespecifica es prnA, prnC, pioluteorina halogenasas pltA, pltD, y pltM, tetraciclma halogenasa cts4, hidrolasa a, o balhimicina halogenasa bha A • en donde la halogenasa regioespecifica comprende la SEC ID N0:1 • en donde la halogenasa regioespecifica es un polipéptido que comprende un dominio de aminoácido de acuerdo con cualquiera de una de las SEC ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ó 17. Además se proporcionan células hospederas que expresan un ácido nucleico heterólogo substancialmente similar a cualquiera de una de las SEC ID Nos. 18, 10, 22, 24, 26, 28, ó 30 y al menos un ácido nucleico heterólogo substancialmente similar a cualquiera de las SEC ID N0s:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16, en particular en donde • la célula hospedera es una bacteria, hongo o célula vegetal • la célula hospedera es una célula microbiana • la célula hospedera además expresa secuencias de ácidos nucleicos que codifican prnB y prnD Se proveen además • métodos de producción de pirrolnitrina que comprende hacer crecer la célula hospedera como se menciona aqui posteriormente • métodos de protección de una planta contra un patógeno que comprende tratar la planta con la célula hospedera, por lo cual se produce la pirrolnitrina por el hospedero en cantidades que inhiben el patógeno los métodos como se mencionan aqui posteriormente, que además comprenden colectar pirrolnitrina a partir del hospedero. Adicionalmente se proporcionan • plantas que comprenden una célula hospedera de acuerdo con la invención • métodos de protección de una planta contra un patógeno, que comprende el crecimiento de la planta como se menciona posteriormente, por lo cual la pirrolnitrina es producida en la planta en cantidades que inhiben el patógeno • semillas de la planta como se mencionan en lo sucesivo • métodos para prevenir el crecimiento de hongos sobre un cultivo, que comprende hacer crecer la planta de acuerdo con la invención, en donde la planta es una planta de cultivo • métodos para mejorar la producción de substratos halogenados por un hospedero que comprende expresar una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica la electrón transferasa en un hospedero en donde el hospedero expresa al menos un polipéptido endógeno que tiene actividad de halogenasa regioespecifica. En la presente invención se encuentra de manera sorprendente que las halogenasas regioespecificas son capaces de transferir un halógeno a un substrato in vi tro pero con el fin de hacer que los mismos requieran un factor de proteina adicional, una electrón transferasa. El descubrimiento que un factor proteináceo adicional es requerido para efectuar la halogenación in vi tro por estas enzimas, se hace a través de la purificación de PrnA, una D-triptofano halogenasa que funciona en la biosintesis de pirrolnitrina, un antibiótico de nitrofenilpirrol diclorado, por Pseudomonas fl uorescens .

La purificación de esta halogenasa dependiente de NADH y dinucleótido de flavina adenina (posteriormente "FAD") se acompañó por una disminución progresiva en la actividad de halogenación. Durante la cromatografía de intercambio iónico de extractos a partir de P. fl uorescens que sobreexpresan la PrnA, la PrnA parcialmente purificada e inactiva podria ser reactivada por la adición de alícuotas de fracciones cromatográficas a partir de las cuales PrnA se ausenta. El factor responsable para la reactivación aqui designada P. fl uorescens P2, posteriormente muestra ser una proteina en la base de su sensibilidad al calor y a la proteasa. La purificación de PrnA a la homogeneidad conduce a una pérdida completa de actividad, la cual podria ser almacenada por la adición de una electrón transferasa de la invención. Una segunda halogenasa en la trayectoria de pirrolnitrina, PrnC, exhibe la similitud de secuencia con PrnA, aunque menos similitud de secuencia a PrnA que a las siguientes halogenasas regioespecificas conocidas por estar involucradas en la biosintesis de productos naturales halogenados: pioluteorina (véase, Nowak-Thompson B, Chaney N, Wing JS, Gould SJ, Loper JE,

[1999] Characterization of the pyoluteorin biosynthetic gene cluster of Pseudomonas fl uorescens Pf-5. J Bacteriol 181:2166-2174); cloroeremomicina (véase, van Wageningen AM, Kirkpatrick PN, Williams DH, Harris BR, Kershaw JK, Lennard NJ, Jones M, Jones SJ, Solenberg PJ

[1998] Sequencing and analysis of genes involved in the biosynthesis of a vancomycin group antibiotic. Chem Biol 5:155-162); balhi icina (véase, Pelzer S, Sussmuth R, Heckmann D, Recktenwald J, Huber P, Jung G, Wohlleben W

[1999] identification and analysis of the balhimycin biosynthetic gene cluster and its use for manipulating glycopeptide biosynthesis in ?mycolatopsis medi terranei DSM5908. Antimicrob Agents Chemother 43:1565-73 y Pelzer S. Reichert W, Huppert M, Heckmann D, Wohlleben W

[1997] Cloning and analysis of a peptide synthetase gene of the balhimycin producer Amycolatopsis medi terranei DSM5908 and development of a gene disruption/replacement system. J Biotechnol 56:115-128); y clorotetraciclina (véase, Dairi T, Nakano T, Mizukami T, Aisaka K, Hasegawa M, Katsumata R

[1995] Conserved organization of genes for biosynthesis of chlortetracycline in Streptomyces strains. Biosci Biotechnol Biochem 59:1360-1361, y Dairi T, Nakano T, Aisaka K, Katsumata R, Hasegawa M

[1995] Cloning and nucleotide sequence of the gene responsible for chlorination of tetracycline. Biosci Biotechnol Biochem 59:1099-106). Similar a PrnA, la purificación de PrnC se acompañó por una pérdida l^ j tt mm imÉtí^ M^ de actividad de halogenación, que podria ser restablecida por la adición de una electrón transferasa de la invención. La trayectoria de pirrolnitrina se ha mostrado previamente para la función en E. coli cuando se expresó el operón de pirrolnitrina que codifica PrnA, PrnB, PrnC y PrnD (para la secuencia de ácido nucleico del operón de pirrolnitrina véase 5.8 X/N, citado en la Patente Estadounidense No. 5,723,759 la cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) . La función de PrnA y PrnC como halogenasas; PrnB cataliza el rearreglo de la porción mdolilo de triptofano al aminofenilpirrol, y PrnD oxida la porción aminofenilo a un substituyente de nitrofenilo. De manera sorprendente en la presente invención se encuentra que cuando una electrón transferasa de la invención, flavina reductasa de E. coli (de aqui en adelante "Fre") en este caso, es sobreexpresada, la producción in vivo de pirrolnitrina es mejorada significativamente. La presencia de la "actividad semejante a P2" se estableció en E. coli por la adición de extracto de E. coli a la PrnA inactiva purificada. La actividad semejante a P2 de E. coli se purificó entonces parcialmente por el intercambio de iones, hidroxiapatita, y cromatografía de columna de permeación de gel. Las fracciones de columna que contienen la t*«m* ?+ ^~*-l** . actividad, y las fracciones inactivas de flanqueo se tripsinizaron y se secuenciaron por espectrometría de masa; los péptidos identificados en las fracciones inactivas se substrajeron de aquellos presentes en la fracción que contiene la actividad semejante a P2 de E. coli , activo, y los péptidos remanentes referidos en la base de datos del genoma de E. coli . A partir de esto, únicamente se identificó una secuencia de ácido nucleico, una flavina reductasa dependiente de NADH, (posteriormente "fre", Genbank acceso 23486) . Como se describirá en forma más especifica en la descripción detallada posteriormente, la fre de E. coli se clonó entonces y se sobreexpresó, y la células de sobreexpresión demuestran poseer incrementos en la actividad semejante a P2 de E. coli directamente proporcional a su incremento en la actividad de flavina reductasa. -fre también se co-transformó en E. coli junto con el operón de pirrolnitrina en plásmidos separados. Las células que albergan ambos plásmidos producen una pirrolnitrina significativamente superior o metabolitos de pirrolnitrina que aquellas que albergan el operón de pirrolnitrina solo, que confirma la identidad de Fre como el factor auxiliar para PrnA y PrnC, asi como también la indicación que, en E. coli , ^^tite^»^**^^^ ^ la actividad de flavina reductasa es un factor principal que limita la producción de pirrolnitrina. En una modalidad de la invención, se provee un método para la transferencia de un halógeno a un substrato en una manera regioespecifica que comprende poner en contacto el substrato con una halogenasa regioespecifica en la presencia de un oxidante, un donador de halógeno, una electrón transferasa, y un reductor donde si la transferencia ocurre in vivo la electrón transferasa es heteróloga al hospedero. En otra modalidad de la invención, se provee un método de transferencia de un halógeno a un substrato en una manera regioespecifica que comprende poner en contacto el substrato con una halogenasa regioespecifica en la presencia de un oxidante, un donador de halógeno, una electrón transferasa, un reductor y FAD o FMN, donde si la transferencia ocurre in vi vo, la electrón transferasa es heteróloga al hospedero. En una modalidad particularmente preferida, la reacción resulta en la producción de pirrolnitrina. En una modalidad preferida la electrón transferasa es una enzima capaz de catalizar la transferencia de electrones de NADH o NADPH o ferredoxina o FAD o la electrón transferasa es una enzima capaz de catalizar la transferencia de electrones desde NADH o NADPH o ferredoxina a la halogenasa regioespecifica. En una modalidad preferida de la invención, la secuencia de aminoácido de electrón transferasa es al menos 30% idéntica, preferiblemente 40% idéntica, en forma más preferida 50% idéntica, en forma más preferida 60% idéntica, en forma más preferida 70% idéntica, en forma más preferible 80% idéntica, o en forma más preferida 90% idéntica a NADPH-FMN reductasa, NADPH citocromo P-450 reductasa del higado de la rata, ferredoxina NADP reductasa de espinaca, citocromo b5 reductasa, o nitrito reductasa. En una modalidad preferida de la invención, la secuencia de aminoácido de halogenasa regioespecifica es al menos 30% idéntica, preferiblemente 40% idéntica, en forma más preferida 50% idéntica, en forma más preferida 60% idéntica, en forma más preferida 70% idéntica, más preferiblemente 80% idéntica, o en forma más preferida 90% idéntica a PrnA, PrnC, pioluteorina halogenasas Pl tA, pl tD, y pl tM de Pseudomonas fluorescens, tetraciclina halogenasa cts4 de Streptomyces aurofaciens, hidrolasa a partir de A ycolatopsis orientalis, o balhimicina halogenasa bha A de Amycolatopsis mediterranei . flÉfr- L.1i^i^.^f^^í^k.^ßt^^^^ ^?..é¡i á.

En una modalidad preferida se provee una célula hospedera que expresa un ácido nucleico heterólogo substancialmente similar a aquel de una electrón transferasa de la invención y que expresa un ácido nucleico heterólogo que codifica una halogenasa regioespecifica de la invención. En una modalidad preferida, la célula hospedera es una célula bacteriana, fúngica o vegetal. En una modalidad preferida, se provee una célula hospedera que expresa moléculas de ácido nucleico heterólogo que codifican prnA, prnB, prnC, prnD y -fre. En una modalidad preferida, se provee un método para producir pirrolnitrina haciendo crecer una célula hospedera, la cual puede incluir una célula vegetal, que expresa moléculas de ácido nucleico heterólogas que codifican prnA, prnB, prnC, prnD y fre . En una modalidad preferida, se provee una planta que comprende una célula hospedera que expresa un ácido nucleico heterólogo substancialmente similar a aquel de una electrón transferasa de la invención y que expresa un ácido nucleico heterólogo que codifica una halogenasa regioespecifica de la invención. En una modalidad preferida, se provee una planta que expresa moléculas de ácido nucleico heterólogas que codifican prnA, prnB, prnC, prnD y una electrón transferasa de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO:l es la porción de aminoácido conservado presente en las halogenasas regioespecificas de la invención. SEC ID NO: 2 es la secuencia de ácido nucleico que codifica PrnA de P. fl uorescens SEC ID NO: 3 es la secuencia de aminoácido de PrnA de P. fluorescens SEC ID NO.4 es la secuencia de ácido nucleico que codifica PrnC de P. fl uorescens SEC ID NO: 5 es la secuencia de aminoácido de PrnC de P. fluorescens SEC ID NO: 6 es la secuencia de ácido nucleico que codifica PltA de P. fl uorescens SEC ID NO: 7 es la secuencia de aminoácido de PltA de P. fluorescens SEC ID NO: 8 es la secuencia de ácido nucleico que codifica PltD de P. fl uorescens SEC ID NO: 9 es la secuencia de aminoácido de PltdD de P. fluorescens _4 i í i ití iá-í.

SEC ID NO: 10 es la secuencia de ácido nucleico que codifica PltM de P. fluorescens SEC ID NO: 11 es la secuencia de aminoácido de PltM de P. fluorescens SEC ID NO: 12 es la secuencia de ácido nucleico que codifica hidrolasa A de A. orientalis SEC ID NO: 13 es la secuencia de aminoácido de hidrolasa A de A. orientalis SEC ID NO: 14 es la secuencia de ácido nucleico que codifica cts4 de S. aureofaciens SEC ID NO: 15 es la secuencia de aminoácido de cts4 de 5. aureofaciens SEC ID NO: 16 es la secuencia de ácido nucleico que codifica bhaA a partir de A. medi terranei SEC ID NO: 17 es la secuencia de aminoácido de bhaA de A. medi terranei SEC ID NO: 18 es la secuencia de ácido nucleico que codifica Fre de E. coli SEC ID NO: 19 es la secuencia de aminoácido de Fre de E. coli SEC ID NO: 20 es la secuencia de ácido nucleico que codifica NADH citocromo b5 reductasa de rata. SEC ID NO: 21 es la secuencia de aminoácido de NADH citocromo b5 reductasa de rata.

SEC ID NO: 22 es la secuencia de ácido nucleico que codifica NADPH-cyt-p450-reductasa de conejo. SEC ID NO: 23 es la secuencia de aminoácido de NADPH-cyt-p450-reductasa de conejo SEC ID NO: 24 es la secuencia de ácido nucleico que codifica ferodoxina de S. olerácea . SEC ID NO: 25 es la secuencia de aminoácido de ferodoxina de S. olerácea SEC ID NO: 26 es la secuencia de ácido nucleico que codifica NADPH-FMN reductasa de V. Fischeri . SEC ID NO: 27 la secuencia de aminoácido de NADPH-FMN reductasa de V. Fischeri . SEC ID NO: 28 es la secuencia de ácido nucleico que codifica ferredoxina-NADP reductasa de S. olerácea SEC ID NO: 29 es la secuencia de aminoácido de ferredoxina-NADP reductasa de 5. olerácea SEC ID NO: 30 es la secuencia de ácido nucleico que codifica nitrato reductasa de A. parasi ticus SEC ID NO: 31 es la secuencia de aminoácido que codifica nitrato reductasa de A. parasi ticus SEC ID NO: 32 es el cebador de flavina reductasa de E. coli SEC ID NO: 33 es el cebador para flavina reductasa de E. coli SEC ID NO: 34 es el plásmido pNOV523 ^^¡á^.^.-^^^ . --*..-~ SEC ID NO: 35 es el plásmido pNOV524 Producción de Productos Naturales Halogenados In Vi tro . De acuerdo con la presente invención, los productos naturales halogenados se pueden producir in ví tro haciendo reaccionar una halogenasa regioespecifica con un substrato en la presencia de un donador de halógeno, un oxidante, un reductor, y una electrón transferasa de la invención. Un halogenasa regioespecifica de la invención es una halogenasa que es capaz de interactuar con un haluro, un oxidante, y un sistema de reducción para catalizar el reemplazo de uno o más enlaces de carbono-hidrógeno por uno o más enlaces de carbono-halógeno durante una reacción de halogenación biológica y es substrato y/o regioespecifica. Regioespecifica significa que los enlaces carbono-halógeno están formados sólo en locaciones especificas en un substrato. Las halogenasas regioespecificas preferidas de la invención comprenden aquellas que incluyen la siguiente porción conservada y cataliza el reemplazo de al menos un enlace carbono-hidrógeno por un enlace carbono-halógeno a una locación especifica. xl-W-x2-W-x3-I-P-x4 (SEC ID N0:1) donde XI es G o T; X2 es V, L, T, F o M; X3 es cualquier residuo de aminoácido 5 X4 es I, F, M o L En una modalidad preferida, las halogenasas de la presente invención comprende Triptofano halogenasas. Las triptofano halogenasas de la invención incluyen PrnA (SEC ID 0 NO: 3 (véase, acceso de proteina # AAB97504; Hammer PE, Burd W. Hill DS, Ligón JM, van Pee K, "Conservation of the pyrrolnitrin biosynthetic gene cluster among six pyrrolnitrin-producing strains." FEMS Microbiol Lett 1999 Nov 1; 180 (1) : 39-44) y halogenasas regioespecificas que 5 preferiblemente tienen 90% de identidad, 80% de identidad, 70% de identidad, 60% de identidad, 50% de identidad o 40% de identidad a SEC ID NO: 3. El porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos como se usa en toda esta solicitud se determina por el programa BASTP 2.09 disponible en 0 ' - : . " - . , - -- donde los ajustes de parámetros son: matriz de marcación blosum62 con una penalización de apertura de separación de 7 y una -_s_ 3 penalización de extensión de separación de 2 y x_reducción de 50 y esperado de 10.00 y tamaño de palabra de 3. En otra modalidad preferida las halogenasas regioespecificas de la invención comprenden monocloroaminopirrolnitrina halogenasas. Las monocloroaminopirrolnitrina halogenasas comprenden PrnC (SEC ID NO: 5) que tienen el número de acceso de proteina AAB97506 y halogenasa regioespecifica que preferiblemente tiene 90% de identidad a ésta, 80% de identidad con ésta, 70% de identidad a ésta, 60% de identidad, 50% ó 40% de identidad a ésta. En una modalidad particularmente preferida de la invención, las halogenasas regioespecificas de la invención comprenden cualquiera que sea 30% idéntica, preferiblemente 40% idéntica, en forma más preferiblemente 50% idéntica, en forma más preferida 60% idéntica, en forma más preferida 70% idéntica, más preferiblemente 80% idéntica, en forma más preferida 90% idéntica, más preferiblemente 95% idéntica, o en forma más preferida 99% idéntica a cualquiera de prnA (SEC ID NO: 3), prnC (SEC ID NO: 5), pioluteorina halogenasas pltA (SEC ID NO: 7), pltD (SEC ID NO: 9), y pltM (SEC ID NO: 11) de Pseudomonas fl uorescens, tetraciclina halogenasa cts4 (SEC ID NO: 15) de Streptomyces aurofaciens, hidrolasa a (SEC ID O: 13) de Amycolatopsis orientalis , balhimicina halogenasa bha A (SEC ID NO: 17) de Amycola topsis medi terranei que incluye aquellos identificados en la siguiente tabla: Una electrón transferasa de la invención puede comprender una electrón transferasa capaz de transferir electrones de NADH o NADPH o ferredoxina u otro reductor a FAD o FMN, o una electrón transferasa capaz de transferir electrones de NADH o NADPH o ferredoxina u otro reductor a la halogenasa por una oxidoreductasa dependiente de NAD(P)H o una oxidoreductasa con otros donadores de electrones, tal como el fotosistema de cloroplastos, lactato, xantina, etc. Las electrón transferasas de la invención pueden ser determinadas seleccionando electrón transferasas en las cuales la transferencia del electrón puede ser detectada monitoreando la oxidación de NADH o NADPH o ferredoxina por el cambio característico en la absorbencia asociada con la oxidación del reductor. Este cambio (o incremento en la velocidad de cambio) es dependiente de la presencia de FAD o FMN. La oxidación de NADH y NADPH puede ser detectada monitoreando la absorbancia a 340 nm; la oxidación resulta en una disminución en la absorbancia. La oxidación de ferredoxina puede ser detectada monitoreando la absorbancia a 420 nm; la oxidación resulta en un incremento en la absorbancia. La transferencia del electrón puede también ser detectada monitoreando la oxidación de NADH o NADPH por la disminución caracteristica en la fluorescencia con excitación a 340 nm y emisión a >380 nm. Este decremento en la fluorescencia es dependiente de la presencia de FAD o FMN. Las electrón transferasas de la invención pueden también ser determinadas seleccionando las electrón transferasas en las cuales la transferencia del electrón a la halogenasa regioespecifica de la invención a partir de NADH o NADPH puede ser identificada mezclando la electrón transferasa con 50 micromolares de NADH o 50 micromolares de NADPH con o sin 50 micromolares de halogenasa (la halogenasa necesita estar en el estado haloenzima, que es con todos los cofactores necesarios, tal como FAD, ya unidos) y observando un incremento en la velocidad de oxidación de NADH o NADPH que es dependiente de la halogenasa; la oxidación es medida por un incremento en la absorbancia a 340 nm o una disminución en la fluorescencia como se describe anteriormente . Las electrón transferasas de la invención pueden ser determinadas seleccionando las electrón transferasas en las cuales la transferencia del electrón a la halogenasa a partir de ferredoxina puede ser identificada mezclando la electrón transferasa con 50 micromolar de ferredoxina reducida con o sin 50 micromolares de halogenasa (la halogenasa necesita estar en el estado holoenzima, que es con todos los cofactores necesarios, tal como FAD, ya unidos) , y observando un incremento en la velocidad de oxidación de que es dependiente de la halogenasa; la oxidación de la ferredoxina es medida por una absorbancia incrementada a 340 nm. En una modalidad preferida de la invención, la electrón transferasa es al menos 30% idéntica, preferiblemente 40% idéntica, más preferiblemente 50% idéntica, más preferiblemente 60% idéntica, más preferiblemente 70% idéntica, más preferiblemente 80% idéntica, más preferiblemente 90% idéntica o idéntica a cualquiera de las siguientes: una flavina reductasa de E. coli que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 19 (descrita por Fieschi F, Niviere V, Frier C, Decout JL, Fontecave M. "The mechanism and substrate specificity of the NADPH: flavin oxidoreductase from Escherichia coli". J Biol Chem 1995 Dic 22; 279 (51) : 30392-400) ; la diaforasa-sulfhidrilo reductasa purificada de conformidad con Richarme, G. "Purification of a new dihydrolipoamide dehydrogenase from Escherichia coli," J Bacteriol (1989 Dic.) 171(12): 680-5; NADH citocromo-b5- reductasa (SEC ID NO: 21) (descrita por Barber MJ, Quinn GB "High-level expression in Escherichia coli of the soluble, catalytic domain of rat hepatic cytochrome b5 reducíase". Protein Expr Purif 1996 Ago; 8(l):41-7); NADPH-cyt-P450 reductasa (SEC ID NO:23) a partir de conejo, ferredoxina-NADP reductasa (SEC ID NO: 29) a partir de S. olerácea, ferredoxina (SEC ID NO: 25) a partir de S. olerácea, nitrato reductasa (SEC ID NO: 27) a partir de A. parasi ticus, y NAD(P)H-FMN reductasa (SEC ID NO: 27) a partir de V. fischeri (descrita por Zenno S, Saigo K "identification of the genes encoding NAD (P) H-flavin oxidoreductases that are similar in sequence to Escherichia coli Fre in four species of luminous bacteria: Photorhabdus luminiscens, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, and Vibrio orientallis". J Bacteriol 1994 Jun; 176 (12) : 3544-51) ; Las electrón transferasas de la invención pueden ser usadas en la forma de extracto o purificada. En una modalidad particularmente preferida, la electrón transferasa de la invención es al menos 30% idéntica, preferiblemente 40% idéntica, más preferiblemente 50% idéntica, más preferiblemente 60% idéntica, más preferiblemente 70% idéntica, más preferiblemente 80% idéntica, o más preferiblemente 90% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOs:21, 23, 25, 27, 29 ó 31 y pruebas positivas para la transferencia del electrón en cualquiera de las pruebas descritas anteriormente. gj^^j^?áHjy La selección del reductor tal como un nucleótido de piridina, por ejemplo, dinucleótido de adenina nicotinamida reducida o fosfato dinucleótido de adenina nicotinamida reducida o ferrodoxina reducida, depende de la selección de la electrón transferasa de la invención. En general todas las electrón transferasas de la invención tienen actividad catalítica superior con uno u el otro nucleótido de piridina; pero generalmente tienen alguna actividad con el otro nucleótido de piridina. Asi, si es deseable debido a otras consideraciones, pueden ser usados los nucleótidos de piridina no preferidos en las reacciones de halogenación con electrón transferasas particulares. Los nucleótidos de piridina preferidos de cada electrón transferasa son como sigue: NADPH es el nucleótido de piridina preferido para la NADPH-cyt-P450 reductasa y ferredoxina NADP reductasa. El NADH es el nucleótido de piridina preferido para flavina reductasa de E. coli , NADH-citocromo-b5-reductasa, nitrato reductasa y diaforasa sulfhidrilo reductasa. La ferredoxina NADP reductasa puede también usar ferredoxina reducida la cual puede ser generada por iluminación de plantas, de cloroplastos aislados o de fragmentos de cloroplastos que contienen fotosistema I. La ferredoxina puede también ser usada por deshidrogenasas dependientes de la ferredoxina tal como piruvato: ferredoxina oxidoreductasa. (Horner DS, Hirt RP, Embley TM "A single eubacterial origin of eukaryotic pyruvate : ferredoxm oxidoreductase genes: implications for the evolution of anaerobic eukaryotes." Mol Biol Evol 1999 Sep; 16(9):1280-91) . En una modalidad preferida, FAD puede ser incluido en la reacción in vi tro para incrementar la eficiencia de la reacción. En una modalidad particularmente preferida la reacción incluye FAD y la halogenasa regioespecifica seleccionada es PrnA. En una modalidad alterna, la invención comprende combinar la halogenasa, en donde la halogenasa es una halogenasa regioespecifica purificada de la presente invención con el substrato, un ion halógeno tal como Cl- y con un donador activo de oxigeno tal como H202, K104, yodosobenceno, yodosobenzoato, hidroperóxido de ter-butilo, peróxido de benzoilo, hidroperóxido de cumeno, peróxido de dicumilo, ácido peroxi acético o compuestos aliados. Los donadores activos de oxigeno se distribuyen con la necesidad de suministrar 02 y reductor. Un substrato de la invención dependerá de la halogenasa regioespecifica seleccionada de la invención. Los substratos de la invención pueden incluir triptofano, indol, aminofenilpirrol y derivados allí de y tetraciclina, substratos para bhaA que incluyen todos los compuestos del substrato de balhimicina clases Bl-1, Bl-2, B2-1, B2-2, y B3 (descritos por Pelzer S, Sussmuth R, Heckmann D, Recktenwald J, Huber P, Jung G, Wohlleben W

[1999] Identificación y análisis del agrupamiento de gen biosintético balhimicina y su uso para manipular la biosíntesis de glicopéptidos en Amycolatopsis medi terranei DSM5908. Antimicrob Agents Chemother 43:1565-73) . Un donador de halógeno empleado en la presente invención, puede ser suministrado a la reacción como una sal de un catión inorgánico u orgánico o como sus respectivos ácidos. El donador de halógeno de la invención puede proporcionar un ion F~, Cl", Br", o I". Las reacciones de la invención pueden ser conducidas en amortiguador con pH entre 4 y 10, temperatura entre 0°C y 65°C. El donador de halógeno puede ser agregado como una sal, por ejemplo, las sales de cloruro pueden incluir LiCl, NaCl, KC1, CsCl, MgCl2 CaCl2 y NH4C1. Los tiempos de reacción pueden variar desde 1 minuto a 48 horas. Las condiciones óptimas son pH 7.5, temperatura 30°C, tiempo de reacción de 12 h. -t-MÉ ^g!Íg^^^¡ La eficiencia de catalizadores en halogenaciones in ví tro puede ser incrementada acoplando covalentemente la electrón transferasa a la halogenasa, haciendo así la transferencia del electrón a partir del reductor a la haogenasa un primer proceso de orden en lugar de un segundo proceso de orden (con respecto a la concentración de halogenasa) . El mismo resultado puede obtenerse diseñando genéticamente una proteina de fusión que contiene tanto una electrón transferasa como una halogenasa regioespecífica de la invención fusionando sus regiones de codificación en estructura. Las fusiones pueden elaborarse con o sin una secuencia de intervención que codifica para una secuencia peptídica corta que separa las electrón transferasas y los dominios de proteínas halogenasas. Las proteínas de fusión pueden elaborarse en cualquiera de las dos orientaciones: (1) N-término-electrón transferasa- (enlazador opcional) -halogenasa-C-término; (2) N-término-halogenasa- (enlazador opcional) -electrón transferasa-C-término . En otra modalidad de la invención, los componentes de proteína del sistema que comprenden una halogenasa regioespecífica y electrón transferasa pueden ser inmovilizados, como se describe además abajo y se dejan reaccionar con substratos para generar productos. La halogenasa y electrón transferasa pueden ser usados como enzimas individuales que son co-inmovilizadas o como una proteína de fusión en la cual las secuencias que codifican para los dos componentes están fusionadas para generar una proteína única con la electrón transferasa y las actividades de la halogenasa. Una enzima adicional y reductor secundario apropiado pueden ser incluidos en el sistema para generar NADH ó NADPH: ejemplos de tales pares reductores secundarios de enzima incluyen: alcohol deshidrogenasa y etanol, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y glucosa-6-fosfato, aldehido deshidrogenasa y acetaldehido, lipoamida deshidrogenasa y tiol reducido tal como lipoamida, ditiotreitol o ácido mercaptosulfónico . En esta modalidad las enzimas (las cuales podrían incluir enzimas del NADH o NADPH que regeneran el sistema si tal sistema es usado) , pueden ser inmovilizadas por cualquiera de los varios procesos. Los ejemplos incluyen: (1) colocación de las enzimas dentro de un contenedor con una membrana semipermeable (membrana de diálisis) que permitirá el paso de substratos y nucleótidos pero no enzimas; (2) covalentemente uniendo las enzimas a una matriz insoluble; (3) enlazando las enzimas a una matriz vía anticuerpos dirigidos contra las enzimas o anticuerpos dirigidos contra antígenos fusionados a las enzimas; (4) enlazando las enzimas a una matriz vía un dominio de enlace a la biotina tal como avidina. (5) Polimerizando una matriz (tal como un polímero de metacrilato) alrededor de la enzima. Las enzimas inmovilizadas pueden entonces estar expuestas a un amortiguador que contiene el reductor, reductor secundario (si NAD(P)H que regenera el sistema es usado), substrato y sal de haluro. Los solventes orgánicos pueden incluirse para facilitar la solubilización de substratos. Las condiciones típicas comprenden pH 4 a 10, 0 a 65°C. Después que suficiente producto halogenado se ha generado, los productos naturales halogenados son removidos de la mezcla de reacción.

Producción de Productos Naturales Halogenados en Hospederos Heterólogos Las moléculas de ácido nucleico heterólogo que codifican una electrón transferasa de la invención pueden ser expresadas en hospederos bacterianos o fúngicos para permitir la producción de la halogenación de productos naturales con eficiencia mayor que podría ser posible a partir de los hospederos nativos. Por ejemplo, para mejorar la producción de productos naturales, una molécula de ácido nucleico ..^^^r^?A^I^^?^flfui heterólogo que codifica una electrón transferasa de la invención, puede ser expresada en productores de pirrolnitrina tal como Pseudomonas fl uorescens, Burkholdepa pyrrocinia , Myxococcus fulvus, Burkholderia cepacia , Pseudomonas aureofaciens, productores de pioluteorina tal como Pseudomonas fluorescens, organismos que producen antibióticos de la clase de vancomicina tal como varias especies de Amycolatopsis tal como A. orientalis y A. medi terranei y el productor de clorotetraciclina Streptomyces aureofaciens, u otras especies de Streptomyces que producen antibióticos. Además, las moléculas de ácido nucleico heterólogo que codifican halogenasas regioespecíficas y electrón transferasas, pueden ser co-expresadas en hospederos bacterianos o fúngicos para permitir o incrementar la producción de productos naturales halogenados. En algunos casos la síntesis de los productos naturales halogenados de la invención, solamente requerirá un paso biosintético, el paso de halogenación y, por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico solamente heterólogos que serán expresadas serán aquellas que comprenden secuencias codificantes para la halogenasa y electrón transferasa de la invención. En otros casos, uno o más pasos de halogenación serán parte de una trayectoria biosintética que resulta en el producto natural halogenado. En este caso se expresarán moléculas de ácido nucleico heterólogo múltiples. El término "molécula de ácido nucleico heterólogo" como se usa a través de la presente especificación, se refiere a una molécula de ácido nucleico no asociada naturalmente con una célula hospedera en la cual es introducida, incluyendo constructos genéticos, copias múltiples que no se originan naturalmente de una molécula de ácido nucleico que se origina naturalmente; y por otra parte una molécula de ácido nucleico homólogo operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico no nativa. En su sentido más amplio, el término "substancialmente similar", cuando se usa en toda la presente especificación con respecto a una molécula de ácido nucleico, significa una molécula de ácido nucleico que corresponde a una secuencia de nucleótido de referencia, en donde la molécula de ácido correspondiente codifica un polipéptido que tiene substancialmente la misma estructura y función como el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótido de referencia, por ejemplo, en donde solamente cambia en aminoácidos que no afectan que ocurra la función del polipéptido. Deseablemente la molécula de ácido nucleico substancialmente similar codifica el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótido de referencia. El término "substancialmente similar" está específicamente propuesto para incluir moléculas de ácido nucleico en donde la secuencia se ha modificado para optimizar la expresión en células particulares. El porcentaje de identidad entre la molécula de ácido nucleico substancialmente similar y la secuencia de nucleótido de referencia deseablemente es al menos 30%, preferiblemente al menos 45%, más deseablemente al menos 65%, más deseablemente al menos 75%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, todavía más preferiblemente al menos 95%, aún todavía más preferiblemente al menos 99% idéntica. Las comparaciones de secuencia se llevaron a cabo usando un algoritmo de alineación de secuencia Smith-Waterman (véase por ejemplo, Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology:Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. Londres: 1995. ISBN 0-412-99391-0, o en http : //www-hto .use . edu/software/seqaln/index .html) . El programa local S, versión 1.16 es usado con los siguientes parámetros: igualación: 1, penalización por desigualdad: 0.33, penalización de extensión de separación: 2, penalización de extensión ampliada: 2. Una molécula de ácido nucleico "substancialmente I . í similar" a una secuencia de nucleótido de referencia hibridiza a la secuencia de nucleótido de referencia en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavados en SSC 2X, SDS al 0.1% a 50°C, más deseablemente en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavados en SSC IX, SDS a 0.1% a 50°C, más deseablemente todavía en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 raM a 50°C con lavado en SSC 0.5X, SDS al 0.1% a 50°C, preferiblemente en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), NaP04 al 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavados en SSC 0.1X, SDS al 0.1% a 50°C, más preferiblemente en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavados en SSC 0.1X, SDS al 0.1% a 65°C. El polinucleótido de la invención que hibridiza bajo las condiciones anteriores preferiblemente comprende al menos 80 pares base, más preferiblemente al menos 50 pares base y particularmente al menos 21, y más particularmente 18 pares base. Las técnicas para estas manipulaciones genéticas son específicas para los hospederos diferentes disponibles y se conocen en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión pKK223 puede ser usado para expresar genes heterólogos en E. coli, ya sea en la fusión transcripcional o traduccional, detrás del promotor tac. Para la expresión de operones que codifican estructuras lectoras abiertas múltiples (aquí posteriormente "ORFs") , el procedimiento más simple es insertar el operon en un vector tal como pKK223 en la fusión transcripcional, permitiendo el sitio de enlace del ribosoma cognato de los genes heterólogos ser usados. Las técnicas para la sobre expresión en las especies gram-positivas tales como Bacill us son también conocidas en la técnica y pueden ser usadas en el contexto de esta invención (Quax et al . En: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds . Baltz et al . , American Society for Microbiology, Washington (1993) ) . Los sistemas alternos para la sobre expresión confían en vectores de levaduras e incluyen el uso de Pichia , Saccharomyces y Kl uyveromyces (Sreekrishna, En: Industrial microorganisms :basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Biotechnology 12:173-177 (1994); van den Berg et al . , Biotechnology 8:135-139 (1990)). Algunos de estos productos naturales halogenados pueden ser efectivos en la inhibición del crecimiento de microbios, particularmente microbios fitopatogénicos . Los productos naturales halogenados pueden ser producidos a partir de organismos en los cuales la halogenasa y/o electrón transferasa han sido sobre expresados, y organismos adecuados para estos incluyen bacterias y levaduras gram-negativa y gram-positiva, así como también plantas las cuales serán descritas en más detalle abajo. Para los propósitos de producción del producto natural halogenado, el criterio significante en la selección del organismo hospedero es su facilidad de manipulación, rapidez de crecimiento ( es decir, fermentación en el caso de microorganismos) , y su carencia de susceptibilidad al producto natural halogenado siendo sobre producido. Estos métodos de producción de producto natural halogenado tienen ventajas significantes sobre la tecnología de síntesis química usualmente usada en la preparación de productos naturales halogenados. La aplicación de los métodos descritos aquí podría incrementar la eficiencia y rendimiento en la producción de productos naturales halogenados por fermentación y podría ser usado en la introducción de nuevos átomos de halógeno en posiciones que previamente no están presentes en el producto natural y que podría ser difícil lograr sintéticamente. Algunas de las ventajas sobre la síntesis química son costos más baratos de producción, y la habilidad para sintetizar compuestos de una regioespecificidad preferida de halogenación. La incorporación de un electrón transferasa puede incrementar la eficiencia y rendimiento de los productos halogenados. Además, los nuevos productos halogenados pueden ser producidos por adición de halógeno a productos naturales conocidos ya sea por uso de halogenasas que se originan naturalmente con substrato deseado y regioespecificidad o por uso de halogenasas diseñadas genéticamente con nuevo substrato y regioespecificidad. Podrá ser muy difícil usar medios químicos para halogenar muchos productos naturales por ejemplo, macrólidos, policétidos y péptidos no ribosomales, con regioespecificidad y especificidad enantiomérica. Las condiciones requeridas para halogenación de porciones arilo o alquilo podrán de manera general, causar otros cambios en la estructura del producto natural. Las halogenasas pueden también producir productos enantioméricamente puros (en el caso de halogenación de un carbón pro-quiral), opuestos a las mezclas racémicas comúnmente generadas por síntesis orgánicas. La habilidad para producir compuestos estereoquimicamente apropiados es particularmente importante para moléculas con muchos átomos de carbono quiralmente activos. Los productos naturales halogenados producidos por hospederos heterólogos pueden ser usados por numerosos propósitos incluyendo médicos ( es decir, control de patógenos y/o padecimientos infecciosos) así como también aplicaciones agrícolas. En donde una producción de un producto halogenado requiere más de una enzima, las moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas para la biosíntesis del producto halogenado de interés pueden ser expresadas en un organismo individual. En una modalidad preferida, todas las secuencias de ácido nucleico que codifican las enzimas para el producto natural, podrán ser integradas en el cromosoma del organismo como un operon sencillo y controlado por un elemento regulatorio adecuado. En una modalidad preferida alterna, las secuencias de ácido nucleico pueden ser llevadas en un plásmido con un marcador seleccionable. Otra modalidad preferida alterna comprende expresar las secuencias de ácido nucleico requeridas en dos o más plásmidos compatibles o las secuencias de ácido nucleico requeridas podrán ser distribuidas entre el cromosoma y uno o más plásmidos compatibles. La expresión de las moléculas de ácido nucleico podrá ser controlada por los elementos regulatorios nativos de las secuencias codificantes de ácido biosintético del producto natural o por promotores seleccionados para permitir el control más preciso de la expresión de las secuencias de ácido nucleico de la trayectoria. Óptimamente, las secuencias de ácido nucleico de la electrón transferasa podrán estar incluidas en el operón junto con aquellas que codifican la halogenasa regioespecífica (o halogenasas) de la invención. Alternativamente, las secuencias de la electrón transferasas pueden ser expresadas de manera separada. Otro método de la invención para crear productos halogenados comprende dividir moléculas de ácido nucleico a partir de la trayectoria biosintética entre dos o más organismos separados. Los organismos puede hacerse crecer separadamente con intermediarios biosintéticos producidos por un cultivo a ser transferido a otros cultivos que expresan pasos subsecuentes en la trayectoria de biosíntesis. Alternativamente, los organismos pueden ser co-cultivados con intermedios que pasan de uno a otro como se requiere. En cualquiera de estas aplicaciones, cada halogenasa requiere una electrón transferasa adecuada co-expresada en el mismo organismo y en la misma ubicación sub-celular. Los nuevos productos halogenados pueden ser producidos introduciendo una halogenasa en un organismo que ya expresa genes requeridos para producir la estructura no halogenada de interés. La halogenasa puede ser diseñada genéticamente por tener especificidad para el sitio e *, ÍÍ. .?-B--específico en la estructura completa o puede tener especificidad para un componente de la estructura que es subsecuentemente incorporado en la estructura final en el organismo nativo. Por ejemplo, una halogenasa puede ser diseñada genéticamente para específicamente halogenar un aminoácido que es subsecuentemente incorporado en un antibiótico que contiene péptido. El producto resultante puede entonces poseer nuevas modificaciones de halógeno en posiciones no encontradas en el producto natural. En cualquiera de los sistemas descritos anteriormente, las ventajas significantes en la eficiencia de halogenación puede ser afectadas por fusión de las secuencias de ácido nucleico que codifican para la electrón transferasa y la halogenasa regioespecífica, de manera tal que una proteína de fusión es generada sin ambas funcionalidades; tal fusión puede resultar en eficiencia superior de la transferencia del electrón a partir del reductor a la halogenasa. Las secuencias de ácido nucleico de la electrón transferasa pueden ser fusionadas a cualquiera de los extremos 5' o el 3' de la halogenasa. Una secuencia de codificación para un péptido de enlace corto (enlazador) puede ser incorporada en la fusión, separando la secuencia codificante para la electrón transferasa y dominios de proteína de halogenasa; la longitud del enlazador puede variar de 1 hasta 30 residuos de aminoácidos en longitud. Las halogenasas y/o electrón transferasas de la invención puede también ser expresadas en hospederos bacterianos heterólogos y fúngicos para producir productos naturales halogenados con el objetivo de incrementar la eficiencia de cepas de biocontrol de tales hospederos bacterianos y fúngicos. Los microorganismos los cuales son adecuados para la sobre expresión heteróloga de productos naturales halogenados anti-patogénicos son todos microorganismos los cuales son capaces de colonizar plantas o la rizosfera. Como tales, serán llevados en contacto con el hongo fitopatogénico, bacterias y nemátodos que causan una inhibición del crecimiento del patógeno. Estos incluyen microorganismos gram-negativa tal como Pseudomonas , Enterobacter y Serra tia , los microorganismos gram-positivas Bacill us y el hongo Trichoderma y Gliocladi um. Los hospederos heterólogos particularmente preferidos son Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aurantiaca , Enterobacter cloacae, Serratia marscesens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum y Gliocladi um virens. ±^fH»^.^---^«EJ---M-Kf*—********* La expresión en cepas heterólogas de biocontrol requiere la selección de vectores apropiados para la replicación en el hospedero seleccionado y una selección adecuada de promotor. Las técnicas son bien conocidas en el arte para la expresión en la bacteria y hongos gram-negativa y gram-positiva, y son descritas en alguna parte en esta especificación.

Producción de Productos Halogenados en Plantas Transgénicas Las halogenasas y/o electrón transferasas de la invención son expresadas en plantas transgénicas así causando la biosintesis de los productos naturales halogenados seleccionados en las plantas transgénicas. En algunos casos, los productos naturales halogenados de la invención, solamente requerirán un paso biosintético, el paso de halogenación y por lo tanto, las únicas moléculas de ácido nucleico heterólogo que serán expresadas serán aquellas que comprenden secuencias codificantes para la halogenasa regioespecífica y electrón transferasa de la invención. En otros casos, uno o más pasos de halogenación serán parte de una trayectoria biosintética que resulta en el producto natural halogenado. En este caso múltiples moléculas de ácido nucleico heterólogo serán expresadas.

Como se usa en esta especificación, una "planta" se refiere a cualquier planta o parte de una planta en cualquier etapa de desarrollo. En eso están también incluidos cortes, células o cultivos de tejidos y semillas. Como se usa en conjunto con la presente invención, el término "tejido de planta" incluye, pero no se limita a, plantas completas, células vegetales, órganos vegetales, semillas vegetales, protoplastos, callos, cultivos celulares y cualquier grupo de células vegetales organizados en unidades estructurales y/o funcionales. En donde el producto natural halogenado tiene propiedades anti-patogénicas, las plantas transgénicas con resistencia mejorada a hongos fitopatogénicos y bacterias son generadas. Para su expresión en plantas transgénicas, las moléculas de ácido nucleico que codifica las halogenasas y/o electrón transferasas de la invención y secuencias adyacentes pueden requerir modificación y optimización. Aunque en muchos casos la molécula de ácido nucleico a partir de otros organismos puede ser expresada en plantas a niveles superiores sin modificación, puede resultar baja expresión en plantas transgénicas a partir de moléculas de ácido nucleico que tienen codones los cuales no son preferidos en las plantas. Se sabe en la técnica que todos los organismos tienen preferencias específicas para el empleo ,,^^,^^-*^-^-^^ 2Mili de codón, y los codones a partir de otros organismos, pueden ser cambiados para conformarse con las preferencias de plantas, mientras se mantienen los aminoácidos codificados. Además, la expresión alta en plantas es mejor lograda a partir de secuencias codificantes las cuales tienen al menos 35% de contenidos GC, pueden expresarse pobremente en plantas debido a la existencia de porciones ATTTA las cuales pueden desestabilizar mensajes, y porciones AATAAA las cuales pueden causar poliadenilación inapropiada. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican las halogenasas o electrón transferasas de la invención pueden ser seleccionadas por la existencia de sitios de empalme ilegítimos los cuales pueden causar truncación de ARNm. Todos los cambios requeridos para ser elaborados dentro de la secuencia codificante tal como aquellos descritos anteriormente, pueden ser elaborados usando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, PCR y construcción sintética del gen usando los métodos descritos en las solicitudes de patentes publicadas EP 0 385 962, EP 0 359 472 y WO 93/07278. Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención, pueden no ser modificadas, deberán ser estas expresadas en niveles altos en especies de plantas transgénicas objetivo, o alternativamente pueden ser moléculas de ácido nucleico modificadas por la remoción de desestabilización y porciones inapropiadas de poliadenilación y sitios de empalme ilegítimos y además modificados por la incorporación de codones preferidos de plantas, y además con un contenido GC preferido para la expresión en plantas. Aunque las secuencias preferidas de ácido nucleico pueden ser adecuadamente expresadas en especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden ser modificadas para contar las preferencias de codón específicas y preferencias de contenido GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas como estas preferencias han mostrado diferir (Murray et al . Nucí. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Para iniciación eficiente de traducción, las secuencias adyacentes a la metionina de iniciación pueden requerir modificación. Las secuencias cognadas a las moléculas de ácido nucleico seleccionadas pueden iniciar la traducción eficientemente en plantas, o alternativamente, pueden así ser ineficientes. En el caso en que sean ineficientemente, pueden ser modificadas por la inclusión de secuencias conocidas por ser efectivas en las plantas. Joshi ha sugerido un iniciador de traducción consenso apropiado para plantas (NAR 15:6643-6653 (1987); SEC ID NO: 15) y Clontech sugiere un iniciador de la traducción consenso adicional (catálogo 1993/1994, página 210; SEC ID NO: 16). Estos consensos son adecuados para uso con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las secuencias están incorporadas en la construcción de la molécula de ácido nucleico, hasta e incluyendo el ATG (mientras se deja el segundo aminoácido de la molécula de ácido nucleico seleccionada sin modificar) , o alternativamente hasta e incluyendo el substituyente GTC en el ATG (con la posibilidad de modificar el segundo aminoácido del transgen) . La expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican las halogenasas o electrón transferasas de la invención en plantas transgénicas es detrás de un promotor mostrado por ser funcional en las plantas. La selección del promotor variará dependiendo de los requerimientos temporales y espaciales para la expresión, y también dependiendo de las especies objetivo. En donde los productos naturales halogenados son anti-patogénicos y la protección de plantas contra los patógenos foliares se desea, la expresión en hojas es preferida; para la protección de plantas contra patógenos de maíz, se prefiere la expresión en inflorescencias (por ejemplo, espigas, panículas, mazorcas, etc.); para la protección de plantas contra patógenos de la raíz, se prefiere la expresión en raíces; para la protección de i ^ i i á plántulas contra patógenos que nacen del suelo, se prefiere la expresión en raíces y/o plántulas. En muchos casos, sin embargo, la expresión contra más de un tipo de fitopatógenos se sugerirá, y así la expresión en múltiples tejidos será deseable. Aunque muchos promotores a partir de dicotiledóneas han mostrado ser operacionales en monocotiledóneas y vise versa, idealmente, los promotores de dicotiledóneas se seleccionan por su expresión en dicotiledóneas y los promotores de monocotiledóneas para la expresión en monocotiledones. Sin embargo, no hay restricción en la procedencia de los promotores seleccionados; es suficiente que sean operacionales accionando la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los promotores preferidos los cuales son expresados constitutivamente incluyen los promotores CaMV 35S y 19S, y promotores a partir de genes que codifican la actina o ubiquitina. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden también ser expresadas bajo la regulación de promotores los cuales son químicamente regulados. Esto permite al producto natural halogenado, ser sintetizado solamente cuando las plantas de cultivos son tratadas con la inducción de químicos, y la biosíntesis del producto natural halogenado subsecuentemente declina. La tecnología preferida ff*faa-'^'1fflttf'<1'1tHfiff'a para la inducción química de la expresión del gen, se detalla en la solicitud publicada EP 0 332 104 y patente Estadounidense 5,614,395 (incorporada aquí por referencia). Un promotor preferido para la inducción química es el promotor PR-la del tabaco. Una categoría preferida de promotores es aquella la cual es inducible a las lesiones. Se han descrito numerosos promotores los cuales son expresados en sitios de lesiones y también en sitios de la infección del fitopatógeno. Idealmente, tal promotor beberá solamente ser localmente activo en los sitios de infección, y en esta forma, el producto natural halogenado anti-patogénico solamente se acumula en las células en las cuales necesita ser sintetizado para interrumpir el crecimiento del patógeno invasor. Los promotores preferidos de esta clase incluyen aquellos descritos por Standford et al . , Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al . , Plant Mol. Biol., 22:783-792 (1993), Logemann et al . Plant Cell 1 : 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al . , Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), y Warner et al . , Plant J. 3:191-201 (1993) . Los patrones de expresión específicos del tejido preferidos, incluyen específicos del tejido verde, MÉMÜiü^-i ÉU específicos de la raíz, específicos del tallo y específicos de la flor. Los promotores adecuados para la expresión en tejido verde incluyen muchos los cuales regulan genes involucrados en la fotosíntesis y muchos de estos han sido clonados de tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Un promotor preferido es el promotor PEPC de maíz a partir del gen de fosfoenol piruvato carboxilasa (Hudspeth & Gruía, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). Un promotor preferido para la expresión específica de la raíz es aquél descrito por de Framond (FEBS 290:103-106 (1991); EP 0 452 269

[1974]) y un promotor específico de la raíz preferido adicional es aquél del gen T-l proporcionado por esta invención. Un promotor específico del tallo preferido, es aquel descrito en la solicitud de patente WO 93/07278 y el cual acciona la expresión del gen trpA de maíz. Las modalidades preferidas de la invención son las plantas transgénicas que se producen del producto natural halogenado, pirrolnitrina en una forma específica de la raíz. En una modalidad especialmente preferida de la invención, los genes biosintéticos para la pirrolnitrina son expresados detrás de un promotor específico de la raíz para proteger plantas transgénicas contra el fitopatógeno Rhizoctonia . Las modalidades preferidas adicionales son plantas transgénicas que producen productos naturales halogenados anti-patogénicos en una manera inducible de infección del patógeno o inducible de lesiones. Además de la selección de un promotor adecuado, las construcciones para la producción de productos naturales halogenados en las plantas requiere un terminador de la transcripción apropiado que esté unido corriente abajo de las moléculas de ácidos nucleicos de halogenasas heterólogos y/o electrón transferasas. Varios de tales terminadores son disponibles y conocidos en la técnica (por ejemplo, tml a partir de CaMV, E9 de rbcS) . Cualquier terminador disponible conocido por funcionar en las plantas puede ser usado en el contexto de esta invención. Otras numerosas secuencias pueden ser incorporadas en los casetes de expresión para las moléculas de ácido nucleico de halogenasa y/o electrón transferasas. Estas secuencias incluyen aquellas que han mostrado mejorar la expresión tal como secuencias intrones (por ejemplo, de Adhl y bronzel ) y secuencias líderes virales (por ejemplo, de TMV, MCMV y AMV) . La producción de productos naturales halogenados en las plantas, requiere que la molécula de ácido nucleico biosintética de producto natural halogenado que codifica el primer paso en la trayectoria, tendería acceso al substrato de la trayectoria. Para cada producto natural halogenado individual y trayectoria involucrada, este substrato posiblemente diferirá, y para su localización en la planta. En muchos casos el substrato puede ser localizado en el citosol, mientras en otros casos, puede ser localizado en algunos organelos subcelulares. Tanta actividad biosintética en la planta ocurra en el cloroplasto, a menudo el substrato puede ser localizado en el cloroplasto y consecuentemente las halogenasas y electrón transferasas de la invención son mejor dirigidas al organelo apropiado (por ejemplo, el cloroplasto) . La localización subcelular de las enzimas que codifican el transgen puede ser intentada usando técnicas bien conocidas en el arte. Tipicamente, el ADN que codifica el péptido objetivo de un producto del gen dirigido al organelo conocido, es manipulado y fusionado corriente arriba de las moléculas de ácido nucleico de halogenasa y electrón transferasa requeridas. Muchas secuencias objetivo son conocidas por el cloroplasto y se ha mostrado su funcionamiento en las construcciones heterólogas. En una modalidad preferida de esta invención, las moléculas de ácido nucleico requeridas para la biosíntesis de pirrolnitrina son dirigidas al cloroplasto debido a que la trayectoria del **^ ±??M ? *ii¿?gto substrato triptofano es sintetizada en el cloroplasto. En algunas situaciones, la sobre expresión de ácidos nucleicos requeridos para la producción de productos naturales halogenados puede disminuir la disponibilidad celular del substrato por una trayectoria particular y este puede tener efectos perjudiciales en la célula. En situaciones tales como esta es deseable incrementar la cantidad de substrato disponible por la sobre expresión de las moléculas de ácido nucleico las cuales codifican las enzimas por la biosíntesis del substrato. En el caso del triptofano (el substrato para la biosíntesis de pirrolnitrina) , este puede ser logrado por la sobre expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican trpA y trpB. Una trayectoria adicional de elaboración de más substrato disponible es por el cambio de las trayectorias conocidas las cuales utilizan substratos específicos (siempre que se hacen sin efectos colaterales perjudiciales) . En esta manera, el substrato sintetizado es encauzado hacia la biosíntesis del producto natural halogenado y no hacia otros compuestos. Los vectores adecuados para la transformación de plantas se describen en alguna parte en esta especificación. Para la transformación mediada por Agrobacteri um, los vectores binarios o vectores que portan al menos una secuencia límite de ADN-T son adecuados, mientras para la transferencia directa, cualquier vector es adecuado y el ADN lineal que contiene solamente la construcción de interés puede ser preferido. En el caso de transferencia directa, puede ser usada la transformación con unas especies de ADN sencillas o co-transformación (Schocher et al . Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Para la transferencia directa y transferencia mediada por Agrobacterium, la transformación es usualmente (pero no necesariamente) intentada con un marcador seleccionable el cual puede proporcionar resistencia a un antibiótico (kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (basta) . La selección del marcador seleccionable no es sin embargo, crítica a la invención. La síntesis de un producto natural halogenado en una planta transgénica, frecuentemente requerirá la sobre expresión simultánea de moléculas de ácido nucleico múltiples que codifican las enzimas biosintéticas del producto natural halogenado. Esto puede lograrse transformando las moléculas de ácido nucleico biosintético del producto natural halogenado individual en diferentes líneas de plantas individualmente, y después cruzando las líneas resultantes. La selección y mantenimiento de las líneas que llevan múltiples secuencias de ácido nucleico se facilita si cada ! » una de las varias construcciones de transformación utilizan diferentes marcadores seleccionables. Una línea en la cual todos las moléculas de ácido nucleico biosintéticas de producto natural halogenado que han sido amontonadas sintetizará el producto natural halogenado, mientras otras líneas no lo serán. Este procedimiento puede ser adecuado para los cultivos híbridos tales como maiz en los cuales el híbrido final es necesariamente una cruza entre dos padres. El mantenimiento de líneas producidas diferentes con moléculas de ácido nucleico heterólogo diferentes, puede también ser ventajoso en situaciones en donde una trayectoria de producto natural halogenado particular puede conducir a múltiples productos naturales halogenados, cada uno de los cuales tiene una utilidad. Utilizando diferentes líneas que llevan diferentes secuencias de ácido nucleico alternativas por pasos posteriores en la trayectoria para hacer una cruza híbrida con lineas que llevan todas las moléculas de ácido nucleico requeridas restantes, es posible generar diferentes híbridos que llevan diferentes productos naturales halogenados seleccionados los cuales pueden tener diferentes utilidades. Los métodos alternos para producir líneas de plantas que llevan múltiples secuencias de ácido nucleico, incluyen la retransformación de líneas existentes ya transformadas con una molécula o moléculas de ácido nucleico biosintético de producto natural halogenado (y selección con un marcador diferente) , y también el uso de vectores de transformación individuales los cuales llevan múltiples moléculas de ácido nucleico biosintéticas, cada una bajo control regulatorio apropiado (es decir, promotor, terminador, etc.). Dada la facilidad de construcción de ADN, la manipulación de los vectores de clonación para llevar múltiples moléculas de ácido nucleico biosintéticas es un método preferido. Otro método preferido es construir una proteína de fusión como se describe anteriormente de la halogenasa de la invención con la electrón transferasa de la invención y expresar un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en una planta transgénica de la invención. La molécula de ácido nucleico que codifica la electrón transferasa puede ser fusionada a ya sea el extremo 5' ó 3' de la molécula de ácido nucleico que codifica la halogenasa. Un enlazador, puede opcionalmente, ser incorporado en la fusión, separando la electrón transferasa y los dominios de la proteína halogenasa. En una modalidad preferida la proteína de fusión comprende un enlazador compuesto de (Gly) 6. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que un enlazador de otras longitudes adecuadas y/o composición pueden también ser seleccionado. En otra modalidad preferida, la producción de productos naturales halogenados en las plantas puede lograrse por transformación de plástido directa. La expresión del plástido en el cual los genes son insertados por recombinación homologa en los varios cientos de copias del genoma del plástido circular presente en cada célula vegetal, toma ventaja de la enorme ventaja de número de copias sobre los genes nucleares expresados para permitir los niveles de expresión que pueden fácilmente exceder el 10% de la proteína de planta soluble total. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótido es insertada en un vector de objetivo plástido y transformada en el genoma plástido de un hospedero de planta deseado. Se obtienen las plantas homoplásmicas para los genomas plástidos que contienen la secuencia de nucleótido, y son preferiblemente capaces de expresión alta de la secuencia de nucleótidos. La tecnología de transformación de plástidos es por ejemplo, extensivamente descrita en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,451,513, 5,545,817, 5,545,818 y 5,877,462 en la solicitud PCT No. WO 95/16783 y WO 97/32977, J-----»-?----^-^A¿-?L>^ SílÁÁ y en McBride et al . (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305, todas incorporadas aquí por referencia en su totalidad. La técnica básica para la transformación de plástidos involucra introducir regiones de ADN de plástido clonado que flanquean un marcador seleccionable junto con la secuencia de nucleótidos en un tejido objetivo adecuado, por ejemplo, usando transformación de protoplastos o biolística (por ejemplo, cloruro de calcio, o transformación mediada por PEG). Las regiones de flanqueo 1 hasta 1.5 kb, llamadas secuencias de objetivo, facilitan la recombinación homologa con el genoma plástido y así permiten el reemplazo o modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, las mutaciones en punto en los genes 16S ARNr y rpsl2 del cloroplasto, que confieren resistencia a la espectinomicina y/o estreptomicina son utilizados como marcadores seleccionables para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., y Maliaga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45) . La presencia de sitios de clonación entre estos marcadores permite la creación de un vector de objetivo plástido para la introducción de genes extraños (Staub, J. M., y Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). El incremento substancial en la frecuencia de transformación se obtiene por el reemplazo del ARNr recesivo o genes de resistencia al antibiótico de la proteína-r con un marcador seleccionable dominante, el gen aadA bacteriano que codifica a la enzima espectinomicina-detoxificante aminoglicosido-3' -adeniltransferasa (Svab, Z., y Maliga, P. (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90, 913-917) . Otros marcadores seleccionables empleados para la transformación de plástidos se conocen en la técnica y están abarcados dentro del ámbito de la invención. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la producción inducible de plástido de pirrolnitrina se logra por transformación de cloroplasto directa de fre, prnA, prnB, prnC, y prnD como un operon bajo control del promotor T7 bacteriófago. La expresión inducible es lograda mediante cruzas con plantas que poseen un constructo nuclear que codifica la polimerasa de ARN T7 diseñada genéticamente por poseer un péptido de tránsito de cloroplasto y bajo el control del promotor PRI, permitiendo la expresión inducible de BTH. La producción de productos naturales halogenados por el método de la invención puede ocurrir en una amplia variedad de células de plantas, que incluyen aquellas de gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Aunque el gen puede ser insertado en cualquier célula vegetal que cae dentro de estas clases amplias, es particularmente útil en, pero no limitado a las células vegetales de cultivos, tales como arroz, trigo, cebada, centeno, maíz, papa, zanahoria, papa dulce, remolacha, frijol, guisantes, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, berenjena, pimienta, apio, zanahoria, chayóte, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, albaricoque, fresa, uvas, frambuesa, mora, pina, aguacate, papaya, mango, plátano, soya, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. En donde un alelo (s) para una halogenasa reigoespecífica y/o electrón transferasa de la invención se obtiene por selección directa en una planta de cultivo o cultivo de célula vegetal a partir de la cual una planta de cultivo puede ser generada, se mueve en variedades comerciales usando técnicas de reproducción tradicionales sin la necesidad de diseñar genéticamente el alelo y transformarlo en la planta.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven como descripción adicional de la invención y métodos para practicar la invención. No están propuestos por ser limitantes, preferentemente proporcionan líneas guías en como la invención puede ser practicada.

Ejemplo 1: Reacciones de halogenación in vitro con PrnA A. Activación de PrnA con flavina reductasa de E. coli , P2, nitrato reductasa de Aspergill us, y citocromo b5 reductasa. El PrnA es purificado por cromatografía de intercambio de iones a partir de Pseudomonas fl uorescens BL915deltaORFl-4 con el plásmido pPEH14 (prnA) descrito en Kirner et al (Kirner, S. et al J Bacteriol 1998 Apr; 180 (7) : 1939-43) . La enzima purificada tiene actividad despreciable si adición del P2 preparado como se describe en el Antecedente de la invención anterior. La concentración de la proteina o la preparación es de 0.36 mg/ml. La mezcla de ensayo se prepara conteniendo amortiguador HEPES a pH 7.5 (50 mM) , glucosa-6-Fosfato (14.3 mM) , D-Trp (7 mM) , NaCl (7 mM) . La catalasa de Aspergill us niger es adquirida de Sigma Chemical Co. (13 U/ml), la dismutasa de superóxido de eritrocito bovino (posteriormente "SOD") es adquirido de Sigma Chemical Co. (5 U/ml) . deshidrogenasa glucosa-6-Fosfato de Leuconostoc mesenteroides adquirido de Sigma (5 U/ml), FaD (7 micromolar). Cualquier mezcla dependiente NADH o mezcla NADPH es usada como se indica abajo. Una mezcla de ensayo dependiente de NADH es preparada agregando 12 mg de NADH a 4.5 ml de la mezcla de ensayo descrita anteriormente. Una mezcla de ensayo dependiente de NADPH es preparada agregando 3 mg de NADPH a 1 ml de la mezcla de ensayo descrita anteriormente. Las reacciones 1-7 descritas abajo, son colocadas en tubos de polipropileno por triplicado. Después de mezclar el PrnA, la mezcla de ensayo indicada y la electrón transferasa, las muestras son sometidas a vórtices, después mezcladas por inversión a temperatura ambiente. Las reacciones son detenidas 20.5 horas después de la iniciación de las reacciones a ebullición por 2 minutos después, las muestras son preparadas por análisis de CLAR por ultrafiltración a través de 10 membranas Microcon (14000 x g por minuto) . El análisis de CIAR es por el Método Set PrnAl (descrito abajo), el volumen de inyección es de 50 microlitro, y los datos se colectan por los primeros 6 minutos . Los estándares se preparan mezclando 5 o 10 microlitros de 7-Cl-Trp (1 mM) con suficiente HEPES 50 mM, pH 7.5 para llevar el volumen final a 200 microlitros. El D-Trp es eluido a ~2 minutos y el 7-Cl-trp es eluido a 4.3 minutos, Ul^ ^l¿ i^J-í?e4£íí¿£d^ii*^4^^^¡fc&i^^?|¿Ji^tÍ^í^gÍji.i I como se indica por la elución del D-Trp auténtico y 7-Cl-Trp. La cantidad de 7-Cl-trp es determinada por comparación a una curva estándar. Las actividades reportadas son el incremento puro en 7-Cl-Trp después de la adición de la electrón transferasa.

Método Analítico PrnAl por CLAR. Determinación de 7-Cl-Trp Se usó un sistema de CLAR Waters Alliance con un detector de arreglo de fotoyodo. El CLAR Waters Alliance se equipó con una columna 4.6 x 50 mm envasada con C18-Sílice, tamaño de partícula de 3 micrómetros. Se usó un método de gradiente de elución designado aquí como PrnAl. Las velocidades de flujo son de 1 ml/mín completo y los datos de absorbancia se colectaron a partir de 210 hasta 400 nm con una resolución de 1.2 nm y una velocidad de muestreo de 1/s. El sistema como el pre-equilibrado con una mezcla 85:15 de agua:metanol. Después de la inyección de la muestra la columna se desarrolló con un gradiente de 6 minutos a partir de las condiciones iniciadoras a una mezcla de 40:60 agua:metanol . Después de 6.0 a 7.0 minutos la concentración de metanol se incrementó a 100% en un gradiente lineal. La columna se lavó por 1 minuto con 100% de metanol, después de equilibró nuevamente. El D-Trp eluyó a ~2 min y el 7-Cl-trp eluyó a 4.3 minutos, como se indica por la elución del D-Trp auténtico y 7-Cl-Trp. 1. Activación de PrnA por Flavina reductasa de E. coli La Flavina reductasa de E. coli (abreviada aquí después como Fre) , se purificó por precipitación de sulfato de amonio seguida por cromatografía hidrofóbica, es un método a base del protocolo de Fieschi et al (1995) J. Biol. Chem 270 30392-30400 la cual está aquí incorporado por referencia en su totalidad. La purificación de flavina reductasa después del procedimiento de Fieschi a través de la homogenización bacteriana y división de sulfato de amonio. En tal punto se precipita la actividad de flavina reductasa. Lo precipitado se colecta por centrifugación, se resuspende en 25 mM de Tris/Cl pH 7.5 0.5M KC1, glicerol al 10%. El método de Fontcabe et al J Biol Chem 1987 Sep 5; 262 (25) : 12325-31 el cual está aquí incorporado por referencia en su totalidad es después seguido para terminación. La concentración de proteína de la muestra Fre purificada colectada es de 21 microgramos/ml. Cada reacción contiene PrnA 20 microlitros, 160 microlitros de la mezcla de NADH descrita anteriormente y 20 microlitros de Fre. La formación del producto puro resultante fue de 21.46 +/- 1.02 nmol 7-Cl-Trp. 2. Activación de PrnA por P2 El P2 es una preparación de proteína de electrón transferasa a partir de Pseudomonas fl uorescens purificada por cromatografía de intercambio de iones y descrita anteriormente en el Antecedente de la invención. No tiene actividad PrnA. La concentración de proteína de la muestra P2 es de 4.8 mg/ml. Cada reacción contiene 20 microlitros de PrnA, 160 microlitros de mezcla de NADH y 20 microlitros de p2. La formación del producto neto resultante fue de 12.50 +/- 2.02 nmol 7-Cl-Trp. 3. Activación de PrnA por nitrato reductasa de espinaca El dominio FAD recombinante de nitrato reductasa de espinaca (aquí posteriormente "SNIR) (18.6 micromolar). Cada reacción contiene 20 microlitros de PrnA, 160 microlitros de mezcla NADH y 20 microlitros de SNIR. La formación del producto neto resultante fue de 0.048 +/- 0.73 nmol 7-Cl-Trp. 4. Activación de PrnA por nitrato reductasa de Aspergill us Nitrato reductasa de Aspergill us sp (10 U/ml) se adquirió de ICN. Cada reacción contiene 20 microlitros de PrnA, 160 microlitros de mezcla NADH y 20 microlitros de nitrato reductasa. La formación del producto neto resultante ,U Ü fue de 1.49 +/- 0.18 nmol 7-Cl-Trp. 5. Activación de PrnA por NADH-citocromo-b5-reductasa de rata El dominio soluble recombinante de citocromo b5 reductasa hepática de rata (Se obtiene 11.7 micromolar). Cada reacción contiene 20 microlitros de PrnA, 160 microlitros de mezcla NADH y 20 microlitros de citocromo b5 reductasa. La formación del producto neto fue de 0.31 +/- 0.11 nmol 7-Cl-Trp. 6. Activación de PrnA por diaforasa sulfihidrilo reductasa La diaforasa sulfhidrilo reductasa (200 U/ml) es adquirida de los Bioquímicos Estadounidenses. Cada reacción contiene 20 microlitros de PrnA, 160 microlitros de mezcla NADH y 20 microlitros de diaforosa. La formación del producto fue de 2.24 +/- 0.04 nmol 7-Cl-Trp. 7. Activación de PrnA por NADHP-cyt-P450 reductasa de conejo La NADPH-cyt-P450 reductasa de hígado de conejo (0.069 mg/ml) es adquirida de Sigma Chemical Co. Cada reacción contiene 20 microlitros de PrnA, 160 microlitros de mezcla NADPH y 20 microlitros de citocromo P450 reductasa. La formación del producto neto resultante fue de 3.35 +/- 0.23 nmol 7-Cl-Trp.

Ejemplo 2: Activación de PrnA por flavina reductasa de E. coli ; ferredoxina NADP reductasa de espinaca, ferredoxina NADP reductasa de espinaca + ferredoxina de espinaca; y reductasa NAD(P)H:FMN de PhotoJacterium fischeri Se usaron los siguientes componentes en los ejemplos 1-4 abajo: PrnA (descrito por el Ejemplo 1 anterior) a 0.36 mg/ml, Mezcla de Ensayo que contiene HEPES (100 mM) , glucosa-6-fosfato, sal disódica (50 mM) , D-Trp (5 mM) , NaCl (5 mM) . La catalasa de Aspergill us niger (39 U/ml) , superóxido de dismutasa de eritrocito bovino (15 U/ml), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides (10 U/ml). NADH- (3 mg/ml) NADPH (3 mg/ml). Cada ensayo contiene la mezcla de ensayo, ya sea NADH (para muestras que contienen Fre y la reductasa NAD(P)H:FMN) o NADPH (para muestras que contienen FNR o FNR y Fd) , PrNA y la electrón transferasa indicada. Las muestras de control negativo incubaron en paralelo; este amortiguador se substituye por PrnA. Los estándares de cuantificación se prepararon diluyendo 0, 1, 2 ó 5 microlitros de 7-Cl-Trp estándar (1 mM) en 100 microlitros de Mezcla de Ensayo, 50 microlitos de NADH, 20 microlitros de PrnA y 50 microlitros t'* |J¿l»tjA'fafc.^^Mi^i-.-A i de amortiguador; los tubos se calentaron a 100 C previo a la adición de PrnA, después se calentaron unos 2 minutos adicionales. El procesamiento adicional está en paralelo con las reacciones enzimáticas. Todas las muestras de mezclaron por 2 horas a temperatura ambiente. Las reacciones se detuvieron y las muestras se procesaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, incluyendo el uso del método analítico por CLAR PrnAl como se describe en el Ejemplo 1. 1. Actividad de PrnA con Fe: 100 microlitros de Mezcla de ensayo, 50 microlitros de NADH, 20 microlitros de PrnA y 50 microlitros de Fre (0.84 microgramos/ml) se mezclan como se describe anteriormente. El 7-Cl-Tpr puro producido fue de 8.44 nmol. 2. Actividad de PrnA con reductasa NADP de ferrodoxina: 100 microlitros de Mezcla de ensayo, 50 microlitros de NADH, 20 microlitros de PrnA y 50 microlitros de FRN (4.1 micromolar) se mezclan como se describe anteriormente. El 7-Cl-Tpr puro producido fue de 4.22 nmol. 3. Actividad de PrnA con reductasa NADP ferrodoxina y ferrodoxina: 100 microlitros de Mezcla de ensayo, 50 microlitros de NADH, 20 microlitros de PrnA y 50 microlitros de FNR (4.1 micromolar) y Fd (7 micromolar) se mezclan como se describe anteriormente. El 7-Cl-Tpr puro producido fue de 9.15 nmol. 4. Actividad de PrnA con NAD (P)H: FMN: reductasa de Photobacteri um fischeri : 100 microlitros de Mezcla de ensayo, 50 microlitros de NADH, 20 microlitros de PrnA y 50 microlitros de NAD(P)H:FMN reductasa adquirida de Roche (4 U/ml) se mezclan como se describe anteriormente. El 7-Cl-Tpr puro producido fue de 0.11 nmol.

Ejemplo 3: reacciones de halogenación ip vitro con PrnC Fre, ferrodoxina NADP reductasa, ferrodoxina y NADPH-FMN reductasa son sometidas a prueba por su habilidad para activar P. fl uorescens PrnC que se suprimió de la electrón transferasa endógena (P2) como se describe abajo. PrnC cataliza la cloración de monodecloroaminopirrolitrina (MDA) para proporcionar aminopirrolnitrina (APRN) . Los siguientes materiales se prepararon para uso en los ensayos descritos abajo. Amortiguador 100 mM Tris/Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5. Monodecloroaminopirrolnitrina (MDA) 74.2 M es preparado por cultivo de Pseudomonas fluorescens que expresan PrnA y PrnB como se describe en (Kirner et al, 1998) el cual está aqui incorporado por referencia en su totalidad. La mezcla de ensayo comprende FAD (5 µM) y MDA (742 µM) en amortiguador. El NADH es disuelto en amortiguador a una ft 'f*• » ^fe¿-«.-A-«a-concentración de 6 mg/ml. o el N7ADPH es disuelto en amortiguador a una concentración de 6 mg/ml. El Extracto #1 es un extracto crudo en amortiguador que contiene PrnC y la electrón transferasa endógena P2 descrita anteriormente en el ejemplo 1. El PrnC es expresado en la bacteria P. fl uorescens (pPEH/prnC/134 ?prn) que tiene el operon prn cromosomal suprimido pero comprende una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO:4), que codifica el PrnC detrás de un promotor tac en plásmido pPEH-PrnC (Kirner et al, 1998) . En este sistema, el promotor tac resulta en la expresión constitutiva de PrnC. El Extracto #2, PrnC en Extracto #1 se purifica mezclando el Extracto #1 con una resina de intercambio aniónico después removiendo la resina por centrifugación, para suprimir el PrnC de la actividad de P. fl uorescens P2 usando 100 mM de amortiguador Tris/Cl. Los ensayos descritos abajo se corren como sigue: El Extracto #2 es mezclado con la electrón transferasa indicada, la mezcla de ensayo y ya sea NADH o NADPH como se indica. La actividad nativa de PrnC previo a la remoción de la actividad P2 se determina por una muestra paralela en la cual el extracto #1 se mezcla con la mezcla de ensayo y NADH. Todas las muestras son mezcladas por inversión durante la noche, después las reacciones son detenidas por la adición de * i f i i^í^'OÉ-S-10 microlitros de KOH (6 M) , seguido por extracción con acetato de etilo (1 ml) . 0.6 ml de la capa soluble orgánica se remueve a un tubo separado y el solvente se remueve por centrifugación a vacío. El residuo es redisuelto en 200 microlitros de 60/40 H20/CH3CN + 100 microlitros de CH3CN. Las muestras son filtradas a través de filtros de nylon de 0.2 µm para remover la materia particulada. Las muestras son analizadas por el método PrnC_Iso descrito abajo. El cromatograma de absorbancia de 220 nm es analizado e integrado. La actividad PrnC se expresa como 100 veces la velocidad del área del pico APRN a la suma de las áreas de pico de APRN y MDA. Asumiendo los coeficientes de extinción iguales a 220 nm, la velocidad calculada es equivalente al % de conversión puro de MDA a APRN por halogenación.

Método Analítico de CLAR PrnC Iso: El instrumento de C AR usado es el sistema de CLAR Waters Alliance con un detector de arreglo de fotoyodo y está equipado con una columna 4.6 x 50 mm envasada con Cld-Sílice, tamaño de partícula 3 micrómetros. El método CLAR es un método de elución ísocrática en el cual la velocidad de flujo es de 1.5 ml/min y el solvente es una relación 58:42 de agua: acetonitrilo. Los datos de absorbancia de colectaron de 210 hasta 400 nm con una resolución de 2.4 nm y una velocidad de muestreo de 5/s. El sistema es pre-equilibrado por un mínimo de 6 minutos previo a la inyección. El volumen de inyección es de 50 microlitros, el tiempo de colección de datos de 6 minutos seguido por unos 6 minutos adicionales de elución isocrática antes de la inyección de la siguiente muestra. El MDA es eluido a 2.16 minutos en este método y la aminopirrolnitrina (APRN) se eluye a 3.05 min. Las concentraciones de proteína se determinan por el método BCA usando los procedimientos estándares descritos por el vendedor (Pierce) . 1. La actividad PrnC con Fre de E. coli : 50 microlitros de Extracto #2 se mezclan con 20 microlitros de flavina reductasa de E. coli , (21 microgramo/ml), 100 microlitros de mezcla de ensayo, y 50 microlitros de NADH; el mezclado continua durante la noche seguido por el análisis del producto como se describe anteriormente. Actividad observada de 51.8% de conversión de MDA a APRN. 2. Actividad de PrnC con ferrodoxina NADP reductasa de espinaca: 50 microlitros del Extracto #2 se mezclan con 20 microlitros de ferredoxina:NADP reductasa de espinaca (20.7 micromolares), 100 microlitros de mezcla de ensayo, y 50 microlitros de NADH; el mezclado continua durante la noche seguido por el análisis del producto como se describe anteriormente. Actividad observada de 1.8% de conversión de MDA a APRN. 3. Actividad PrnC con ferrodoxina NADP reductasa de espinaca y ferrodoxina de espinaca: 50 microlitros del Extracto #2 se mezclan con 20 microlitros de ferrodoxina de espinaca :NADP reductasa de espinaca (20.7 micromolar) y ferredoxina de espinaca (Fd) (35 micromolar), 100 microlitros de mezcla de ensayo, y 50 microlitros de NADH; el mezclado continua durante la noche seguido por análisis del producto como se describe anteriormente. Actividad observada de 2.5% de conversión de MDA a APRN. 4. Actividad PrnC con NADPH FMN reductasa: 50 microlitros del Extracto #2 se mezclan con 20 microlitros de NAD(P)H:FMN reductasa (10 U/ml) de Photobacteri um fischeri , 100 microlitros de mezcla de ensayo y 50 microlitros de NADH; el mezclado continua durante la noche seguido por el análisis del producto como se describe anteriormente. Actividad observada de 4.0% de conversión de MDA a APRN. 5. Actividad nativa de PrnC previo a la remoción de la actividad P2 se determina por una muestra en paralelo en la cual el Extracto #1 (50 microlitros) es mezclado con la mezcla de ensayo (100 microlitros) y NADH (50 microlitros) ; el mezclado continua durante la noche seguido por el análisis del producto como se describe anteriormente. Actividad observada de 7.8% de conversión de MDA a APRN.

Ejemplo 4 : Halogenación en E. coli Clonación del ácido nucleico que codifica a la flavina reductasa de E. coli La secuencia de ácido nucleico que codifica la flavina reductasa de E. coli (posteriormente "fre" ) es PCR replicada de la cepa E. coli XL-1 Blue (Stratagene) usando los cebadores 5' GCGCGAATTCATGACAACCTTAAGCTGTAAAGTGACC (SEC ID NO: 32) y 3' GCGCCTGCAGTCAGATAAATGCAAACGCATCGCC (SEC ID NO: 33). La molécula de ácido nucleico es entonces clonada Topo (Invitrogen), transformada en XL-1 Blue de E. coli (Stratagene) y los transformantes son seleccionados plaqueados sobre medio sólido de caldo Luria (LB) suplementado con ampicilina. Varias colonias son seleccionadas y analizadas por el secuenciamiento de ADN para confirmar su identidad. De estos, una se encontró por poseer una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia idéntica de aquella de la fre reportada (Acceso Genbank 23486) . Una segunda posee una secuencia de ácido nucleico que comprende una mutación en el nucleótido 247 que resulta en una substitución de aminoácido cargado de Lys83 a Glu83 (mutante posteriormente referido como -freE8°) .

B. Sobre expresión inducible del mutante fre y freE83 La sobre expresión mducible del mutante fre y -freE83 está acompañada por la clonación del fre de tipo silvestre y el mutante de substitución -reE83 en los sitios EcoRl/Pstl de pKK223-3 (Pharmacia) bajo el control del promotor tac . Después las células de transformación que comprenden el fre-pKK223-3, íreE83-pKK223-3, y el vector vacío pKK223-3 se hacen crecer en 6 mL de LB + amp a 37C durante la noche, después diluido en 30 Ml LB+amp, 5 mM IPTG (Fisher) por 5 horas y cosechado por centrifugación. Las pelotillas bacterianas se suspendieron en 4.5 mL de HEPES 50 mM pH 7.5, 1 mM EDTA más 0.5 mL de 5 mg/mL lisozíma por 15 minutos a 25C, sometido a dos ciclos de cebado por congelamiento. Después de la sonicación por 1 minuto en hielo, lo homogenizado se centrifuga a 16K x g por 20 minutos. Los sobrenadantes son entonces diluidos serialmente con HEPES 50 mM pH 7.5, EDTA 1 mM para generar 8 muestras con concentración relativa que varía de 1 a 1/10000. Cada extracto bacteriano y extracto bacteriano diluido se sometió a ensayo para complementación de la actividad PrnA por adición de 20 microlitros de extracto a 180 microlitros de una solución compuesta de 7.2 microgramos PrnA (0.36 microgramos/microlitros) , 3.3 micromolar de FAD, NaCl 3.3 mM, D-Trp 1.67 mM, 0.67 mg/ml NADH y HEPES 50 mM, pH 7.5. Las reacciones se incuban a 30C por 2 horas. Las reacciones son detenidas por calentamiento a 100°C por 2 minutos seguido por centrifugación a 21000 x g por minuto. Las soluciones del sobrenadante son entonces filtradas a través de membranas de ultrafiltración centrífuga de corte de 10 kDa. Lo filtrado es entonces sometido a ensayo por CLAR de fase inversa para cuantificar la conversión de D-Trp a D-7-clorotriptofano usando el método analítico descrito solo en el Ejemplo 1 para PrnAl. La adición del extracto de E. coli que contiene el vector vacío ?KK223-3 resulta en 0.34 pmol de 7-Cl-Trp por minuto por microgramo de proteína en la Adición del extracto agregado del extracto de E. coli que contiene xreE83 - pKK223-3 resultó en 1.14 pmol 7-Cl-Trp por minuto por microgramo de proteína en el extracto agregado. La adición del extracto a partir de E. coli que contiene fre-pKK223-3 resultó en 301 pmol en 7-Cl-Trp por minuto por microgramo de proteína en el extracto agregado. Los análisis de flavina reductasa se llevaron a il? iÍd? *i*»¿???t?ia* jáu ^ cabo por adición de 10 microlitros de extracto bacteriano a 990 microlitros de Hepes 50 mM pH 75. que contiene 0.1 mg/ml de NADPH y 9.5 micromolares de riboflavina. Si la actividad es también alta para permitir la observación del primer 20% de la reacción, el extracto bacteriano es diluido 1/10 en amortiguador HEPES 50 mM después sometido a ensayo como anteriormente. La conversión de NADH a NADP es después monitoreada espectrofotométricamente a 340 nm. La adición de extracto a partir de E. coli que contiene el vector vacío pKK223-3 tiene una actividad de flavina reductasa de 0.055 nmol por minuto por microgramo de proteína en el extracto agregado. La adición del extracto de E. coli que contiene fre 83- pKK223-3 tiene una actividad flavina reductasa de 0.157 nmol por minuto por microgramo de proteína en el extracto agregado. La adición del extracto a partir de E. coli que contiene fre-pKK223-3 tiene una actividad flavina reductasa de 25.4 nmol por minuto por microgramo de proteína en el extracto agregado. Esto demuestra que los cambios en la actividad de la flavina reductasa son proporcionales a los cambios en la actividad de halogenación.

C. Co-expresión de fre y el operon prn en E. coli El operon de pirrolnitrina de Pseudomonas ^Hüj y^ge»^j|Mjj|| fl uorescens completo (5.8 X/N, citado en la Patente Estadounidense No. 5,723,759 el cual está aquí incorporado por referencia anterior) en pKK223-3 (Pharmacia) se transformó en E. coli . La secuencia -fre, que incluye el promotor Taq, es transferida de pKK223-3 en el marcador de tetraciclina de pACYC184 (NEB) , el cual contiene el origen compatible de replicación pl5A. Este plásmido es después co-transformado con 5.8X/N y presencia de ambos vectores se selecciona por ampicilina y cloranfenicol. La cepa hospedera que contiene fre solo son también generadas como controles negativos. Un cultivo de 60 mL de cada línea, se hizo crecer a 37 °C con sacudimiento a 200 rpm por 48 horas. De cada cultivo, 5 mL se extrajeron para el análisis de plásmido para confirmar la presencia de uno o ambos plásmidos. Una alícuota de 15 ml se usó para el análisis de la proteina y actividad. Los restantes 40 mL del cultivo se extraen 2 veces con 2 volúmenes de acetato de etilo. Las fracciones de acetato de etilo son concentradas a sequedad in vacuo y después llevadas hasta 50 microlitros de 6:4 H20/CH3CN y 60 microlitros de MeOH. Veinte microlitros de las soluciones resultantes son entonces analizados por el método de CLAR Prn_BCD para aminopirrolnitrina, y pirrolnitrina descrito abajo.

Método Analítico por CLAR Prn BCD. Determinación de MDA, APRN y PRN. El instrumento de CLAR es un sistema CLAR de Water Alliance con detector de arreglo de fotoyodo y está equipado con una columna 4.6 x 50 mm envasada con C18-Sílice, tamaño de partícula de 3 micromolares. El método CLAR es un método de elución por gradiente. Las velocidades de flujo son 1-2 ml/min completamente y los datos de absorbancia se colectaron de 210 a 400 nm con una resolución de 2.4 nm y una velocidad de muestreo de 5/s. El sistema es pre-equilibrado con una velocidad de agua: acetonitrilo 65:35. Siguiendo la inyección de muestreo, la columna es desarrollada en un gradiente lineal a partir de las condiciones iniciadoras a una velocidad de agua: acetonitrilo 40:60. La aminopirrolnitrina es eluida a 5.0 min y la pirrolnitrina a 6.6 minutos. Tanto la aminopirrolnitrina como la pirrolnitrina son medidas por integración de áreas de pico en cromatogramas medidas a longitudes de ondas de diagnóstico. Para aminopirrolnitrina se usan 300 nm de absorbancia. Para pirrolnitrina, se usan 250 nm de absorbancia. Los resultados muestran que la acumulación de aminopirrolnitrina se incrementa mayor de 10 veces, y la acumulación de pirrolnitrina se incrementó mayor de 4 veces en células de E. coli que co-expresan plásmidos que contienen -fre y el operon de pirrolnitrina comparado con las células que expresan solamente el operon pirrolnitrina.

Ejemplo 5: Halogenación por PrnA expresado en plantas transgénicas después purificadas y sometidas a ensayos in vitro El ecotipo Columbia de Arabidopsis thaliana , es transformado (por el método de transformación mediado por Agrobacterium) con las cuatro moléculas de ácido nucleico del operon de pirrolnitrina, que codifica PrnA, PrnB, PrnC y PrnD, cada uno detrás del promotor de ubiquitina como se describe abajo en el Ejemplo 6. Las moléculas de ácido nucleico de pirrolnitrina individuales son PCR replicadas con los sitios de restricción apropiados a partir de pCIB169 (Patente Estadounidense No. 5,723,759), el cual contiene un clon cósmido de P. fluorescens BL915, número de acceso a GeneBank es U74493. Las moléculas de ácido nucleico son subclonadas y secuenciadas. El promotor ubiquitina3 y el primer intrón (J: Callis et al (1990). Journal of Biological Chemistry 265:12486-12493. y S.

R. Norris et al (1993) Plant Molecular Biology. 21:895-906), son replicados por PCR a partir del genoma de Arabidopsis por [^ .-U j-. -1- -a----^..^^^^- ^.^^^-^é^^n i g^^ ?rrl t ? jrf~ &* ¡ -üij a *®?a~y contener un sitio 5' Kpnl y 3'BamHI. El promotor ubiquitina, terminador nos (Depicker et al (19829 Journal of Molecular and Applied Genetics 1:561-573) y cada molécula de ácido nucleico de pirrolnitrina individual (véase Patentes Estadounidenses Nos. 5,723,759 y 5,955,348 cada una de las cuales está aquí incorporada por referencia en su totalidad) , son clonadas en un vector pSportl modificado. Un triplete de nucleótido -3ACC consenso Kozak es agregado a cada uno de PrnA, B y D justo al 5' del ATG inicial. La molécula de ácido nucleico PrnC no es modificada. El codón GTC inicial en PrnB es cambiado a un codón ATG. Estas modificaciones resultan en la serie de vector pPE7826, 27, 28 y 29 (Prn A, B, C, D respectivamente) . Todas las otras secuencias son consenso a la secuencia de tipo silvestre. El PrnAC doblete es construido insertando el fragmento Kpnl de pCIB7826 en el sitio Kpnl de pCIB7828 (PrnC) produciendo pCIB7830. El doblete PrnBD es producido insertando el fragmento Kpnl de PCIB787 (PrnB) en el sitio Kpnl de pCIB7829 (PrnD) produciendo pCIB7831. Los cuatro operones de la molécula de ácido nucleico se crean insertando el fragmento Notl de pCIB7830 en el fragmento Notl de pCIB7831 produciendo PCIB7832. El fragmento Xbal de pCIB7832 se inserta en el vector binario pCIB200 produciendo el vector de í í ! i transformación pCIB7819. El vector final es sometido a electroporación en agrobacterium y usado para la transformación de Arabidopsis. Arabidopsis thaliana es transformada por el método de N. Bechtold et al (N. Bechtold et al (1993) . C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199). Dos líneas transformadas (3 y 12) y una línea de control no transformada se hacen crecer y las hojas se cosechan (lg) . Las hojas son congeladas en N2 líquido, en polvo en un mortero y extraídas con 6 ml de amortiguador LS (HEPES 50 mM, pH 7.5, NaCl 5 mM) . Después de la centrifugación a 5000 x g por 15 minutos para desechos de pelotillas, el sobrenadante es filtrado suavemente a través de un cristal hilado para remover las partículas residuales. El PrnA es inmunopurificado mezclando el extracto (3 ml) con una matriz de afinidad. La matriz de afinidad se prepara mezclando por 30 minutos, a temperatura ambiente, 100 microlitros de anticabra-IgG-agarosa de conejo (adquirida de Sigma) con 50 microlitros de suero anti-PrnA de cabra. Después las perlillas de agarosa se lavan tres veces con 1 ml de amortiguador LS. Después de mezclar los 3 ml de la muestra con la matriz de afinidad, el material no absorbido es removido de las perlillas por lavado con amortiguador LS. Una .¿i-?-t- Í&-4 • ^mm muestra de control positivo es preparada mezclando 5 microlitros de PrnA (0.36 microgramos/microlitros) purificado de Pseudomonas fl uorescens como se describe en el Ejemplo 1 con 3 ml de LS, después tratando en paralelo con las muestras del extracto de planta. 200 microlitros de amortiguador de ensayo (HEPES 50 M pH 7.5, D-Trp 5 mM, 5 mM NaCl 5 µM FAD, 5 mM glucosa-e-fosfato + 2 mg/ml NADH + 6.25 U/ml glucosa-6-fosfato deshidrogenasa + 44 U/ml catalasa + 30 U/ml SOD) y 20 microlitros de Fre (21 microgramo/ml) purificado de E. coli como se describe en el ejemplo 1 se agregan a las perlillas de agarosa que contienen PrnA inmunopurificado, excepto por una muestra de cada linea de 3 y 12. Las muestras son entonces mezcladas durante la noche por inversión, filtradas a través de filtros Microcon-10, después el producto se somete a ensayo por el método CLAR PrnAl (descrito anteriormente en el Ejemplo 1) . El volumen de inyección de la muestra fue de 50 microlitros. Los siguientes niveles de 7-Cl-Trp se encontraron: control positivo (PrnA exógeno agregado al extracto de planta no transformado) 185 pmol, Línea 3 + Fre (dos muestras separadas) 83 pmol y 113 pmol, Línea 3 sin Fre 0 pmol, Línea 12 con Fre (dos muestras separadas) 120 pmol y 64 pmol, Línea 12 sin Fre 0 pmol, _ÉÉi ül control no transformado 0 pmol. Estos datos demuestran que las plantas transformadas expresan PrnA en una forma activa cuya actividad fue dependiente de la adición de Fre.

Ejemplo 6: Halogenación en plantas transgénicas A. Producción citoplásmica de compuestos halogenados en plantas transgénicas por transformación de ácido nucleico que codifica la flavina reductasa de E. coli en plantas que comprenden ácido nucleico que codifica a PrnA, PrnB, PrnC y PrnD. La secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 6, que codifica la flavina reductasa a partir de E. colí, es clonada en el vector pN0V019, para colocar la molécula de ácido nucleico bajo el control del promotor ubiquitma 10 de Arabidopsis (UB10) (J. Callis et al (1990) . Journal of Biological Chemistry 265:12486-12493, y S. R. Norris et al (1993) Plant Molecular Biology, 21:895-906), y terminado con el terminador de nopalina sintasa de Agrobacterium (Depicker et al (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1:561-573) . El sistema vector binario que consiste de pNOV507 (KanR), 508 (ChlorR) y 509, (AmpR) se completa. Los tres ^-^* ^ vectores usados para construir el operon de pirrolnitrina con la molécula de ácido nucleico fre y un marcador seleccionable resistente al herbicida son como siguen. Nov507 (Kan) es el vector binario con el polienlazador entre los límites derecho e izquierdo reemplazados con una selección de sitios de restricción únicos que no se encuentran en cualquiera de los promotores, terminadores, pirrolnitrina, fre o las moléculas de ácido nucleico del marcador seleccionable. Los otros dos vectores pNOV508 (ChlorR) y pNOV509 (AmpR) , son vectores los cuales contienen una porción del polienlazador pNOV507 con sitios de restricción adicionales agregados para clonar los casetes de moléculas de ácido nucleico separadas para el operon de pirrolnitrina. Estos dos vectores son vectores de construcción o ensambles. El cásete fre junto con el cásete del marcador seleccionable UB3 de pNOVll son ligados en conjunto en pNOV509. Este cásete doble es después transferido en el vector binario, pNOV507, proporcionando el vector final pNOV510. Este vector es sometido a electroporación en Agrobacteri um. Las líneas de Arabidopsi s thaliana que son transformadas con moléculas de ácido nucleico PrnA, PrnB, PrnC y PrnD como se describe en el Ejemplo 5, son transformadas por el método de N. Bechtold et al (N. Bechtold et al (1993). C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194- m^^^¡ iü&^^y 1199) . Todas las moléculas de ácido nucleico de la trayectoria de pirrolnitrina en plantas y varias construcciones son accionadas por el promotor de ubiquitina3 de Arabidopsis (UB3) (J. Callis et al (1990) Journal of Biological Chemistry 265:12486-12493. y S. R. Norros et al (1993) Plant Molecular Biology. 21:895-906), y terminado con el terminador nos a partir de Agrobacteri um. Las líneas homocigotas de Arabidopsis que alojan prnA, prnB, prnC y prnD, y el tipo silvestre Columbia, son transformadas con pNOV510 por infiltración de Agrobacteri um por el método de N- Bechtold et al como se describe anteriormente. Las semillas son colectadas, secadas abajo y plantadas en el suelo. Las plantas transformadas son identificadas atomizando las plántulas con el agente selectivo a 0.025% tres veces durante ocho días. Las plantas son después confirmadas por presencia y nivel de pirrolnitrina por CLAR o espectrometría de masas- cromatografía de gas. Los extractos de plantas pueden también o alternativamente, ser confirmados por actividad prnA y/o prnC como se describe anteriormente.

B. Producción citoplásmica de compuestos halogenados en plantas transgénicas por co-transformación de flavina reductasa de E. coli y el operon de pirrolnitpna. Las secuencias de ácido nucleico que codifican PrnA, PrnB, PrnC y PrnD de la trayectoria de pirrolnitrina expuestas en la Patente Estadounidense No. 5,723,759 e incorporadas por referencia anterior y la SEC ID NO: 7 que codifica la flavina reductasa de E. coli son introducidas en plantas en un constructo de ADN-t único. La expresión de cada una de las moléculas de ácido nucleico biosintéticas de pirrolnitrina es accionada por el promotor UB3, mientras la SEC ID NO: 7 de fre es accionada por UB10. Todas las cinco moléculas de ácido nucleico han sido ya sea conformadas o alteradas para conformarse estrechamente a una secuencia de iniciación traduccional Kozak por posesión de A en -3. Todas las moléculas de ácido nucleico son terminadas por el terminador nos. En una modalidad preferida, el vector final es construido ensamblando los genes promotores UB3-biosintéticos de pirrolnitrina de objetivos citosólicos y el cásete UBIO-fre en un vector binario que comprende los siguientes: límite derecho UB3-prnA-nos-UB3-prnC-nos-UB3-prnB-nos-UB3-prnD-nos-UB10-fre-nos-UB3-marcador seleccionable-nos-Límite izquierdo. Este vector se nombra pNOV523 (SEC ID NO:34). En otra modalidad, el operon de pirrolnitrina de objetivo citosólico es creado por el enlace del fragmento de doblete Notl A/B de pCIB7830 en el vector de doblete C/D pCIB7831. El operón es transferido en pNOV507 como un cásete de Xbal. El doblete Notl A/B de pCIB10253 está ligado en el vector de doblete C/D pCIB10254. Esta construcción también es transferida a pNOV507 como un cásete de Xbal . El vector final contiene lo siguiente: Límite derecho-UB3-prnA-nos-UB3-prnB-nos-UB3-prnC-nos-UB3-prnD-nos-UB10-fre-nos-UB3-marcados seleccionable-nos-Límite izquierdo. Este vector es entonces electroporado en Agrobacteri um y usado para transformar Arabidopsis (Columbia) , por infiltración de Agrobacteri um (N. Bechtold et al (1993). C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199.) Las semillas son colectadas, secadas y plantadas en la tierra. Las plantas transformadas se identifican por aspersión de las plántulas con el agente selectivo a 0.025% tres veces por ocho días. Las plantas se confirmaron entonces por la presencia y nivel de pirrolnitrina por CLAR o cromatografía de gas-espectrometría de masa.

S-^^- l-^-----* C. Producción de compuestos halogenados en plástidos de plantas transgénicas. Los constructos de ácido nucleico que codifican prnA y B son tratados por ingeniería genética para expresar péptidos de tránsito de cloroplastos (Wong, E.Y. et al (1992) Plant Molecular Biology vol. 20:81-93.), y colocados conjuntamente en un vector que permite la selección en kanamicina. Los protocolos de transformación son como se detalla en los ejemplos previos (N. Bechtold et al (1993) . C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199).

Construcción de los vectores de moléculas de ácido nucleico de pirrolnitrina de objetivo plástido. Las moléculas de ácido nucleico de trayectoria de pirrolnitrina, individuales, son PCR replicadas de PCIB10230, 31, 32, 33 (Prn A, B, C, D respectivamente), para contener un sitio de restricción 5'Nhel y 3'BamHI. Las moléculas de ácido nucleico son Topo clonado en pCR2.1 (Invitrogen, US Office Carlsbad, CA 92008, número de catálogo K2030-01) para la confirmación de secuencia. La secuencia de tránsito del péptido de subunidad pequeña RuBPcasa, es PCR replicada de la librería de ADNc de Arabidopsis en pFL61 (Wong et al., 1992, Plant Mol Biol 20: 81-93). Esta secuencia de ácido nucleico k éáü? t+?t *****.^.. ^ jjH es ligada en el extremo 5' de cada molécula de ácido nucleico de pirrolnitrina en pPEH31, 30, 29, y 28 (Prn A, B, C, D respectivamente) . Este conjunto de vectores de pPEH contienen el cásete de UB3-intron-nos. El péptido maduro adicional se sintetiza como oligos complementarios, se templa y se liga en la porción 5' de la construcción de la molécula de ácido nucleico de pirrolnitrina del péptido de tránsito. Esto produce los vectores de la molécula del ácido nucleico de pirrolnitrina de objetivo plástido pCIB10249, 50, 51 y 52 (Prn A, B, C, D, respectivamente) . El pCIB10253 del doblete PrnAB se creó ligando PrnA que contiene el cásete de la molécula de ácido nucleico de Kpnl de pCIB10249 en pCibl0250. El doblete PrnCD, pCIB10254 se creó ligando el PrnC que contiene el cásete de la molécula de ácido nucleico Xhol a partir de pCIB10251 en pCIB10252. Cada doblete se transfirió como un cásete Xbal en el vector Binario pCIB200 (KanR) . El esquema del marcador seleccionable para vectores de objetivo plástido fue: para el vector fre-Límite Derecho-UBlO-clp-fre-nos-UB3-marcador seleccionable-nos-Lí ite izquierdo, para los vectores PrnA/B Límite derecho-UB3-prnA-nos-UB3-prnB-nos-UB3-marcador seleccionable-nos-Límite izquierdo y para los vectores PrnC/D Límite derecho-UB3-prnC-nos-UB3-prnD-nas-UB3-marcador seleccionable-nos-Izquierda.

El vector prnAB-fre de objetivo plástido es entonces electroporado en Agrobacteri um y se usa para transformar Arabadopsis col umbia vía el método de N-Bechtold et al., como se describió anteriormente. Las semillas son colectadas, secadas y plantadas en la tierra. Las plantas transformadas son identificadas por aspersión de las plántulas con el agente selectivo y automáticamente adquieren la característica de homocigosidad. De manera similar, el vector de prnCD/marcador seleccionable de objetivo plástido se introduce en Arabadopsis como se describió anteriormente y los transformadores resultantes automáticamente adquieren características de homocigosidad. Las plantas homocigotas transformadas que comprenden el constructo prnAB-fre/marcador seleccionable de objetivo plástido, son cruzadas entonces con las plantas de prnCD/marcador seleccionable de objetivo plástido, homocigotos. En otra modalidad, el cásete de prnCD de objetivo plástido se transfiere en el vector binario que comprende el cásete de fre de objetivo UBIO-plástido. Este vector es conocido como pNOV524 (SEC ID NO:35). El vector pNOV524 es entonces electroporado en Agrobacteri um y se usa para transformar Arabidopsis col umbia vía el método de N. .^^^ u^^ft^f^n^ft^^tt^ tA Bechtold et al, como se describió anteriormente. Tanto la Arabidopsis de tipo silvestre como la Arabidopsis previamente transformada con pCIB10253 (que comprende prnA/B de objetivo plástido) son transformadas con pNOV524. Las semillas son colectadas, secadas y plantadas en tierra. Las plantas transformadas se identifican rociando las plántulas con el agente selectivo y automáticamente adquieren la característica de homocigosidad. La progenie resultante se somete al agente selectivo apropiado. Las plantas resistentes a este régimen de agente selectivo poseen fre y prnA, B, C, y D en el estado semicigoto. Un experto en la técnica reconocerá las diversas posibles variaciones en este enfoque. En todos los casos, la expresión de pirrolnitrina es cuantificada por CLAR o cromatografía de gas.

Ejemplo 7: Halogenación por PrnC expresado en hojas de plantas transgénicas suministradas con MDA Los análisis de manchado Western de líneas de Columbia transformadas con el constructo pNOV524 (que comprende el prnC de objetivo plástido, prnD y fre) se realizan seguido de la selección basta. Adicionalmente, los análisis de manchado western de líneas de Arabidopsis ÍAÍÁ.¿¿l±?¿* *.—>M?. i--A" tj&g transformadas con pCIB10253 (que comprende prnA y prnB de objetivo de plástido) y posteriormente transformadas con pNOV 524, se realizan seguido de la selección basta. Las hojas solas de cada una de las líneas son homogenizadas en IX amortiguador de muestra de proteína, se hierve y se separa por 10% de SDS-PAGE. Posteriormente, la membrana se sondea para la presencia de proteínas prnC y prnD con anticuerpos elevados contra prnC y prnD, respectivamente. Las líneas de arabidopsis positivas para la expresión de prnC y prnD son idénticas. Los mismos extractos de proteína se vuelven a examinar para la presencia de la proteína flavina reductasa (fre) usando un gel de gradiente a 10-20% y posteriormente sondeando la membrana con anticuerpos elevados contra fre. Se identifican las lineas positivas para la expresión de fre. Las hojas son tomadas de una línea positiva de Arabidopsis para la expresión de prnC de objetivo plástido, prnD y fre y adicionalmente de una línea de Arabidopsis que es negativa para prnC y prnD por manchado western. Las hojas son infiltradas a vacío con MDA mientras que se sumergen en un MES de 5 mM (pH 5.7); 400 mM de amortiguador de Mannitol, y se deja durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Posteriormente, el amortiguador se extrae con acetato de etilo, se concentra a sequedad y se analiza en CLAR (como se describe en el Ejemplo 4 precedente) .

Las hojas de las plantas positivas para prnC, prnD y fre convierten MDA a APRN (aproximadamente 5%) . La conversión se detecta dentro de 3 horas de periodo de incubación. Además, aproximadamente 30% de la APRN se convierte a pirrolnitrina. Además, las hojas, de control negativo, de las plantas que no expresan prnC o prnD, no muestran conversión de MDA a ya sea APRN o pirrolnitrina. Las publicaciones de referencia, citadas anteriormente, se incorporan aquí como referencia en su totalidad. -y~ ISTADO DE SECUENCIA <110> Novartis AG <120> Composiciones y Métodos para Reacciones de Halogenación <130> Caso S-31082A <140> <141> <150> US 60/228801 <151> 1999-12-15 <150> US 60/219343 <151> 2000-01-03 <160> 35 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: amino ácido dominio consenso <400> 1 Xaa Ala Ala Trp Xaa Ala Ala Trp Xaa Ala Ala lie Pro Xaa Ala Ala 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1617 <212> ADN <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> CDS <222> (1) .. (1617) <400> 2 atg aac aag ccg atc aag aat atc gtc atc gtg ggc ggc ggt act gcg 48 Met Asn Lys Pro He Lys Asn He Val He Val Gly Gly Gly Thr Ala 1 5 10 15 ggc tgg atg gcc gcc tcg tac etc gtc cgg gcc etc caá cag cag gcg 96 Gly Trp Met Ala Ala Ser Tyr Leu Val Arg Ala Leu Gln Gln Gln Ala 20 25 30 aac att acg etc atc gaa tet gcg gcg atc cct cgg atc ggc gtg ggc 144 Asn He Thr Leu He Glu Ser Ala Ala He Pro Arg He Gly Val Gly 35 40 45 gaa gcg acc atc cea agt ttg cag aag gtg ttc ttc gat ttc etc ggg 192 Glu Ala Thr He Pro Ser Leu Gln Lys Val Phe Phe Asp Phe Leu Gly 50 55 60 ata ccg gag cgg gaa tgg atg ccc caá gtg aac ggc gcg ttc aag gcc 240 He Pro Glu Arg Glu Trp Met Pro Gln Val Asn Gly Ala Phe Lys Ala 65 70 75 80 gcg atc aag ttc gtg aat tgg aga aag tet ccc gac ccc tcg cgc gac 28Í Ala He Lys Phe Val Asn Trp Arg Lys Ser Pro Asp Pro Ser Arg Asp 85 90 95 .--.- j^-^j-fc»------*-----*-,^^ gat cae ttc tac cat ttg ttc ggc aac gtg ccg aac tgc gac ggc gtg 336 Asp His Phe Tyr His Leu Phe Gly Asn Val Pro Asn Cys Asp Gly Val 100 105 110 ccg ctt acc cae tac tgg ctg cgc aag cgc gaa cag ggc ttc cag cag 384 Pro Leu Thr His Tyr Trp Leu Arg Lys Arg Glu Gln Gly Phe Gln Gln 115 120 125 ccg atg gag tac gcg tgc tac ccg cag ccc ggg gca etc gac ggc aag 432 Pro Met Glu Tyr Ala Cys Tyr Pro Gln Pro Gly Ala Leu Asp Gly Lys 130 135 140 ctg gca ccg tgc ctg tec gac ggc acc cgc cag atg tec cae gcg tgg 480 Leu Ala Pro Cys Leu Ser Asp Gly Thr Arg Gln Met Ser His Ala Trp 145 150 155 160 cae ttc gac gcg cae ctg gtg gcc gac ttc ttg aag cgc tgg gcc gtc 528 His Phe Asp Ala His Leu Val Ala Asp Phe Leu Lys Arg Trp Ala Val 165 170 175 gag cgc ggg gtg aac cgc gtg gtc gat gag gtg gtg gac gtt cgc ctg 576 Glu Arg Gly Val Asn Arg Val Val Asp Glu Val Val Asp Val Arg Leu 180 185 190 aac aac cgc ggc tac atc tec aac ctg etc acc aag gag ggg cgg acg 624 Asn Asn Arg Gly Tyr He Ser Asn Leu Leu Thr Lys Glu Gly Arg Thr 195 200 205 ctg gag gcg gac ctg ttc atc gac tgc tec ggc atg cgg ggg etc ctg 672 Leu Glu Ala Asp Leu Phe He Asp Cys Ser Gly Met Arg Gly Leu Leu 210 215 220 atc aat cag gcg ctg aag gaa ccc ttc atc gac atg tec gac tac ctg 720 He Asn Gln Ala Leu Lys Glu Pro Phe He Asp Met Ser Asp Tyr Leu 225 230 235 240 ctg tgc gac age gcg gtc gcc age gcc gtg ccc aac gac gac gcg cgc 768 Leu Cys Asp Ser Ala Val Ala Ser Ala Val Pro Asn Asp Asp Ala Arg 245 250 255 gat ggg gtc gag ccg tac acc tec tcg atc gcc atg aac tcg gga tgg 816 Asp Gly Val Glu Pro Tyr Thr Ser Ser He Ala Met Asn Ser Gly Trp 260 265 270 acc tgg aag att ccg atg ctg ggc cgg ttc ggc age ggc tac gtc ttc 864 Thr Trp Lys He Pro Met Leu Gly Arg Phe Gly Ser Gly Tyr Val Phe 275 280 285 tcg age cat ttc acc tcg cgc gac cag gcc acc gcc gac ttc etc aaa 912 Ser Ser His Phe Thr Ser Arg Asp Gln Ala Thr Ala Asp Phe Leu Lys 290 295 300 etc tgg ggc etc tcg gac aat cag ccg etc aac cag atc aag ttc cgg 960 Leu Trp Gly Leu Ser Asp Asn Gln Pro Leu Asn Gln He Lys Phe Arg 305 310 315 320 gtc ggg cgc aac aag cgg gcg tgg gtc aac aac tgc gtc tcg atc ggg 100Í Val Gly Arg Asn Lys Arg Ala Trp Val Asn Asn Cys Val Ser He Gly 325 330 335 ^----^i.--»»-------»...- -iA- >-?.-..- --fe-, li í . ctg tcg tcg tgc ttt ctg gag ccc ctg gaa tcg acg ggg atc tac ttc 1056 Leu Ser Ser Cys Phe Leu Glu Pro Leu Glu Ser Thr Gly He Tyr Phe 340 345 350 atc tac gcg gcg ctt tac cag etc gtg aag cae ttc ccc gac acc tcg 1104 He Tyr Ala Ala Leu Tyr Gln Leu Val Lys His Phe Pro Asp Thr Ser 355 360 365 ttc gac ccg cgg ctg age gac gct ttc aac gcc gag atc gtc cae atg 1152 Phe Asp Pro Arg Leu Ser Asp Ala Phe Asn Ala Glu He Val His Met 370 375 380 ttc gac gac tgc cgg gat ttc gtc caá gcg cae tat ttc acc acg tcg 1200 Phe Asp Asp Cys Arg Asp Phe Val Gln Ala His Tyr Phe Thr Thr Ser 385 390 395 400 cgc gat gac acg ccg ttc tgg etc gcg aac cgg cae gac ctg cgg etc 1248 Arg Asp Asp Thr Pro Phe Trp Leu Ala Asn Arg His Asp Leu Arg Leu 405 410 415 tcg gac gcc atc aaa gag aag gtt cag cgc tac aag gcg ggg ctg ccg 1296 Ser Asp Ala He Lys Glu Lys Val Gln Arg Tyr Lys Ala Gly Leu Pro 420 425 430 ctg acc acc acg tcg ttc gac gat tec acg tac tac gag acc ttc gac 1344 Leu Thr Thr Thr Ser Phe Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Glu Thr Phe Asp 435 440 445 tac gaa ttc aag aat ttc tgg ttg aac ggc aac tac tac tgc atc ttt 1392 *A~-^--.-A,--u--M^-(aMJaAifc Tyr Glu Phe Lys Asn Phe Trp Leu Asn Gly Asn Tyr Tyr Cys He Phe 450 455 460 gcc ggc ttg ggc atg ctg ccc gac cgg tcg ctg ccg ctg ttg cag cae 1440 Ala Gly Leu Gly Met Leu Pro Asp Arg Ser Leu Pro Leu Leu Gln His 465 470 475 480 cga ccg gag tcg atc gag aaa gcc gag gcg atg ttc gcc age atc cgg 14. Arg Pro Glu Ser He Glu Lys Ala Glu Ala Met Phe Ala Ser He Arg 485 490 495 cgc gag gcc gag cgt ctg cgc acc age ctg ccg acá aac tac gac tac 1536 Arg Glu Ala Glu Arg Leu Arg Thr Ser Leu Pro Thr Asn Tyr Asp Tyr 500 505 510 ctg cgg tcg ctg cgt gac ggc gac gcg ggg ctg tcg cgc ggc cag cgt 1584 Leu Arg Ser Leu Arg Asp Gly Asp Ala Gly Leu Ser Arg Gly Gln Arg 515 520 525 999 cc aa °tc gca gcg cag gaa age ctg tag 1617 Gly Pro Lys Leu Ala Ala Gln Glu Ser Leu 530 535 <210> 3 <211> 538 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 3 Met Asn Lys Pro He Lys Asn He Val He Val Gly Gly Gly Thr Ala 1 5 10 15 Gly Trp Met Ala Ala Ser Tyr Leu Val Arg Ala Leu Gln Gln Gln Ala 20 25 30 Asn He Thr Leu He Glu Ser Ala Ala He Pro Arg He Gly Val Gly 35 40 45 Glu Ala Thr He Pro Ser Leu Gln Lys Val Phe Phe Asp Phe Leu Gly 50 55 60 He Pro Glu Arg Glu Trp Met Pro Gln Val Asn Gly Ala Phe Lys Ala 65 70 75 80 Ala He Lys Phe Val Asn Trp Arg Lys Ser Pro Asp Pro Ser Arg Asp 85 90 95 Asp His Phe Tyr His Leu Phe Gly Asn Val Pro Asn Cys Asp Gly Val 100 105 110 Pro Leu Thr His Tyr Trp Leu Arg Lys Arg Glu Gln Gly Phe Gln Gln 115 120 125 Pro Met Glu Tyr Ala Cys Tyr Pro Gln Pro Gly Ala Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Leu Ser Asp Gly Thr Arg Gln Met Ser His Ala Trp 145 150 155 160 His Phe Asp Ala His Leu Val Ala Asp Phe Leu Lys Arg Trp Ala Val 165 170 175 Glu Arg Gly Val Asn Arg Val Val Asp Glu Val Val Asp Val Arg Leu 180 185 190 5 Asn Asn Arg Gly Tyr He Ser Asn Leu Leu Thr Lys Glu Gly Arg Thr 195 200 205 Leu Glu Ala Asp Leu Phe He Asp Cys Ser Gly Met Arg Gly Leu Leu 210 215 220 10 He Asn Gln Ala Leu Lys Glu Pro Phe He Asp Met Ser Asp Tyr Leu 225 230 235 240 Leu Cys Asp Ser Ala Val Ala Ser Ala Val Pro Asn Asp Asp Ala Arg 245 250 255 Asp Gly Val Glu Pro Tyr Thr Ser Ser He Ala Met Asn Ser Gly Trp 15 260 265 270 Thr Trp Lys He Pro Met Leu Gly Arg Phe Gly Ser Gly Tyr Val Phe 275 280 285 Ser Ser His Phe Thr Ser Arg Asp Gln Ala Thr Ala Asp Phe Leu Lys 20 290 295 300 Leu Trp Gly Leu Ser Asp Asn Gln Pro Leu Asn Gln He Lys Phe Arg 305 310 315 320 -,,-s-s . * a . y^?< Val Gly Arg Asn Lys Arg Ala Trp Val Asn Asn Cys Val Ser He Gly 325 330 335 Leu Ser Ser Cys Phe Leu Glu Pro Leu Glu Ser Thr Gly He Tyr Phe 340 345 350 5 He Tyr Ala Ala Leu Tyr Gln Leu Val Lys His Phe Pro Asp Thr Ser 355 360 365 Phe Asp Pro Arg Leu Ser Asp Ala Phe Asn Ala Glu He Val His Met 370 375 380 ]_Q Phe Asp Asp Cys Arg Asp Phe Val Gln Ala His Tyr Phe Thr Thr Ser 385 390 395 400 Arg Asp Asp Thr Pro Phe Trp Leu Ala Asn Arg His Asp Leu Arg Leu 405 410 415 Ser Asp Ala He Lys Glu Lys Val Gln Arg Tyr Lys Ala Gly Leu Pro 15 420 425 430 Leu Thr Thr Thr Ser Phe Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Glu Thr Phe Asp 435 440 445 Tyr Glu Phe Lys Asn Phe Trp Leu Asn Gly Asn Tyr Tyr Cys He Phe 20 450 455 460 Ala Gly Leu Gly Met Leu Pro Asp Arg Ser Leu Pro Leu Leu Gln His 465 470 475 480 ^^-¿^-^.¿^^^^^¿^^^.-,^-^^^1^^^^-^-^^ ^?tJ?k?^jt^?t. -A-t-AA.

Arg Pro Glu Ser He Glu Lys Ala Glu Ala Met Phe Ala Ser He Arg 485 490 495 Arg Glu Ala Glu Arg Leu Arg Thr Ser Leu Pro Thr Asn Tyr Asp Tyr 500 505 510 Leu Arg Ser Leu Arg Asp Gly Asp Ala Gly Leu Ser Arg Gly Gln Arg 515 520 525 Gly Pro Lys Leu Ala Ala Gln Glu Ser Leu 530 535 <210> 4 <211> 1704 <212> ADN <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> CDS <222> (1) .. (1704) <400> 4 atg act cag aag age ccc gcg aac gaa cae gat age aat cae ttc gac Met Thr Gln Lys Ser Pro Ala Asn Glu His Asp Ser Asn His Phe Asp 1 5 10 15 gta atc atc etc ggc tcg ggc atg tec ggc acc cag atg ggg gcc atc 96 Val He He Leu Gly Ser Gly Met Ser Gly Thr Gln Met Gly Ala He 20 25 30 ? _-< --a------.--L .---?--^,_----»¡-iL ttg gcc aaa caá cag ttt cgc gtg ctg atc atc gag gag tcg tcg cae 144 Leu Ala Lys Gln Gln Phe Arg Val Leu He He Glu Glu Ser Ser His 35 40 45 ccg cgg ttc acg atc ggc gaa tcg tcg atc ccc gag acg tet ctt atg 192 Pro Arg Phe Thr He Gly Glu Ser Ser He Pro Glu Thr Ser Leu Met 50 55 60 aac cgc atc atc gct gat cgc tac ggc att ccg gag etc gac cae atc 240 Asn Arg He He Ala Asp Arg Tyr Gly He Pro Glu Leu Asp His He 65 70 75 80 acg tcg ttt tat tcg acg caá cgt tac gtc gcg tcg age acg ggc att 288 Thr Ser Phe Tyr Ser Thr Gln Arg Tyr Val Ala Ser Ser Thr Gly He 85 90 95 aag cgc aac ttc ggc ttc gtg ttc cae aag ccc ggc cag gag cae gac 336 Lys Arg Asn Phe Gly Phe Val Phe His Lys Pro Gly Gln Glu His Asp 100 105 110 ccg aag gag ttc acc cag tgc gtc att ccc gag ctg ccg tgg ggg ccg 384 Pro Lys Glu Phe Thr Gln Cys Val He Pro Glu Leu Pro Trp Gly Pro 115 120 125 gag age cat tat tac cgg caá gac gtc gac gcc tac ttg ttg caá gcc 432 Glu Ser His Tyr Tyr Arg Gln Asp Val Asp Ala Tyr Leu Leu Gln Ala 130 135 140 gcc att aaa tac ggc tgc aag gtc cae cag aaa act acc gtg acc gaa 480 ^toJluattiMtthhitht. M AM ?toei?J??Átm**. J-.---- --Í- ! Ala He Lys Tyr Gly Cys Lys Val His Gln Lys Thr Thr Val Thr Glu 145 150 155 160 tac cae gcc gat aaa gac ggc gtc gcg gtg acc acc gcc cag ggc gaa 528 Tyr His Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Val Thr Thr Ala Gln Gly Glu 165 170 175 cgg ttc acc ggc cgg tac atg atc gac tgc gga gga cct cgc gcg ccg 576 Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Met He Asp Cys Gly Gly Pro Arg Ala Pro 180 185 190 etc gcg acc aag ttc aag etc cgc gaa gaa ccg tgt cgc ttc aag acg 624 Leu Ala Thr Lys Phe Lys Leu Arg Glu Glu Pro Cys Arg Phe Lys Thr 195 200 205 cae tcg cgc age etc tac acg cae atg etc ggg gtc aag ccg ttc gac 672 His Ser Arg Ser Leu Tyr Thr His Met Leu Gly Val Lys Pro Phe Asp 210 215 220 gac atc ttc aag gtc aag ggg cag cgc tgg cgc tgg cae gag ggg acc 720 Asp He Phe Lys Val Lys Gly Gln Arg Trp Arg Trp His Glu Gly Thr 225 230 235 240 ttg cae cae atg ttc gag ggc ggc tgg etc tgg gtg att ccg ttc aac 768 Leu His His Met Phe Glu Gly Gly Trp Leu Trp Val He Pro Phe Asn 245 250 255 aac cae ccg cgg tcg acc aac aac ctg gtg age gtc ggc ctg cag etc 816 Asn His Pro Arg Ser Thr Asn Asn Leu Val Ser Val Gly Leu Gln Leu 260 265 270 -**lf "*fr*f- ••^-'%^"^*'¿j"kaf^ ' gac ccg cgt gtc tac ccg aaa acc gac atc tec gca cag cag gaa ttc 864 Asp Pro Arg Val Tyr Pro Lys Thr Asp He Ser Ala Gln Gln Glu Phe 275 280 285 gat gag ttc etc gcg cgg ttc ccg age atc ggg gct cag ttc cgg gac 912 Asp Glu Phe Leu Ala Arg Phe Pro Ser He Gly Ala Gln Phe Arg Asp 290 295 300 gcc gtg ccg gtg cgc gac tgg gtc aag acc gac cgc ctg caá ttc tcg 960 Ala Val Pro Val Arg Asp Trp Val Lys Thr Asp Arg Leu Gln Phe Ser 305 310 315 320 tcg aac gcc tgc gtc ggc gac cgc tac tgc ctg atg ctg cae gcg aac 1008 Ser Asn Ala Cys Val Gly Asp Arg Tyr Cys Leu Met Leu His Ala Asn 325 330 335 ggc ttc atc gac ccg etc ttc tec cgg ggg ctg gaa aac acc gcg gtg 1056 Gly Phe He Asp Pro Leu Phe Ser Arg Gly Leu Glu Asn Thr Ala Val 340 345 350 acc atc cae gcg etc gcg gcg cgc etc atc aag gcg ctg cgc gac gac 1104 Thr He His Ala Leu Ala Ala Arg Leu He Lys Ala Leu Arg Asp Asp 355 360 365 gac ttc tec ccc gag cgc ttc gag tac atc gag cgc ctg cag caá aag 1152 Asp Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Tyr He Glu Arg Leu Gln Gln Lys 370 375 380 ctt ttg gac cae aac gac gac ttc gtc age tgc tgc tac acg gcg ttc 1200 Leu Leu Asp His Asn Asp Asp Phe Val Ser Cys Cys Tyr Thr Ala Phe 385 390 395 400 tcg gac ttc cgc cta tgg gac gcg ttc cae agg ctg tgg gcg gtc ggc 1248 Ser Asp Phe Arg Leu Trp Asp Ala Phe His Arg Leu Trp Ala Val Gly 405 410 415 acc atc etc ggg cag ttc cgg etc gtg cag gcc cae gcg agg ttc cgc 1296 Thr He Leu Gly Gln Phe Arg Leu Val Gln Ala His Ala Arg Phe Arg 420 425 430 gcg tcg cgc aac gag ggc gac etc gat cae etc gac aac gac cct ccg 1344 Ala Ser Arg Asn Glu Gly Asp Leu Asp His Leu Asp Asn Asp Pro Pro 435 440 445 tat etc gga tac ctg tgc gcg gac atg gag gag tac tac cag ttg ttc 1392 Tyr Leu Gly Tyr Leu Cys Ala Asp Met Glu Glu Tyr Tyr Gln Leu Phe 450 455 460 aac gac gcc aaa gcc gag gtc gag gcc gtg agt gcc ggg cgc aag ccg 1440 Asn Asp Ala Lys Ala Glu Val Glu Ala Val Ser Ala Gly Arg Lys Pro 465 470 475 480 gcc gat gag gcc gcg gcg cgg att cae gcc etc att gac gaa cga gac 1488 Ala Asp Glu Ala Ala Ala Arg He His Ala Leu He Asp Glu Arg Asp 485 490 495 ttc gcc aag ccg atg ttc ggc ttc ggg tac tgc atc acc ggg gac aag 1536 Phe Ala Lys Pro Met Phe Gly Phe Gly Tyr Cys He Thr Gly Asp Lys 500 505 510 -}¿¿-µja-- i.lt .aff?f- --.^-.-.-A -...^ .M- .«<MhÉj -É^-¿-----?--^.- -^-^ - 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(1350) <400> 6 atg age gat cat gat tat gat gta gtg att atc ggt ggc ggg ccg gcg Met Ser Asp His Asp Tyr Asp Val Val He He Gly Gly Gly Pro Ala 1 5 10 15 ggt tcg acc atg gcc tec tac ctg gca aaa gcc ggt gtc aaa tgc gcg 96 Gly Ser Thr Met Ala Ser Tyr Leu Ala Lys Ala Gly Val Lys Cys Ala 20 25 30 gtg ttc gaa aaa gaa ctg ttc gag cgc gag cat gtt ggc gag tcg ctg 144 Val Phe Glu Lys Glu Leu Phe Glu Arg Glu His Val Gly Glu Ser Leu 35 40 45 gta ccg gcc acc act ccg gtg ctg ctg gaa atc ggg gtg atg gaa aag 192 Val Pro Ala Thr Thr Pro Val Leu Leu Glu He Gly Val Met Glu Lys 50 55 60 atc gag aaa gcc aac ttc ccg aag aag ttc ggc gct gcc tgg acc tcg 240 He Glu Lys Ala Asn Phe Pro Lys Lys Phe Gly Ala Ala Trp Thr Ser 65 70 75 80 gca gat tec ggc ccc gaa gac aag atg ggc ttc cag ggg ctg gac cae 288 Ala Asp Ser Gly Pro Glu Asp Lys Met Gly Phe Gln Gly Leu Asp His 85 90 95 gat ttc cgt tcg gcg gaa atc etc ttc aac gag cgc aag cag gaa ggg 336 Asp Phe Arg Ser Ala Glu He Leu Phe Asn Glu Arg Lys Gln Glu Gly 100 105 110 gtc gat cgc gac ttc acg ttc cae gtc gac cgc ggc aag ttc gac cgc 384 Val Asp Arg Asp Phe Thr Phe His Val Asp Arg Gly Lys Phe Asp Arg 115 120 125 att ctt ctg gag cae gca ggt tcg ctg ggg gcc aag gtc ttc cag ggc 432 He Leu Leu Glu His Ala Gly Ser Leu Gly Ala Lys Val Phe Gln Gly 130 135 140 gtg gag atc gct gac gtc gag ttt etc age ccg ggc aat gtc att gtc 480 -jj=á-^-fl--¡»-^.-.¿.p;-.^^ Val Glu He Ala Asp Val Glu Phe Leu Ser Pro Gly Asn Val He Val 145 150 155 160 aat gcc aag ctg ggc aag cgc age gtg gag atc aag gcc aag atg gtg 52. Asn Ala Lys Leu Gly Lys Arg Ser Val Glu He Lys Ala Lys Met Val 165 170 175 gtg gat gcc age ggt cgc aac gtg ctg ctg ggc cgc cgg ctg ggc ttg 576 Val Asp Ala Ser Gly Arg Asn Val Leu Leu Gly Arg Arg Leu Gly Leu 180 185 190 cga gaa aag gac ccg gtc ttc aac cag ttc gcg att cae tec tgg ttc 624 Arg Glu Lys Asp Pro Val Phe Asn Gln Phe Ala He His Ser Trp Phe 195 200 205 gac aac ttc gac cgc aag tcg gcg acg caá age ccg gac aag gtc gac 672 Asp Asn Phe Asp Arg Lys Ser Ala Thr Gln Ser Pro Asp Lys Val Asp 210 215 220 tac atc ttc att cae ttc ctg ccg atg acc aat acc tgg gtc tgg cag 720 Tyr He Phe He His Phe Leu Pro Met Thr Asn Thr Trp Val Trp Gln 225 230 235 240 atc ccg atc acc gaa acc att acc age gtg ggc gtg gtt acg cag aag 768 He Pro He Thr Glu Thr He Thr Ser Val Gly Val Val Thr Gln Lys 245 250 255 cag aac tac acc aac tec gac etc acc tat gaa gag ttc ttc tgg gaa 816 Gln Asn Tyr Thr Asn Ser Asp Leu Thr Tyr Glu Glu Phe Phe Trp Glu 260 265 270 ..¿i--i-ik.d-Aa--.s--A--- --. ^y°im ^i¡mi ?wm¿ ? gcg gtg aag acc cgg gaa aac ctg cat gac gcg ctg aag gca tcg gag 864 Ala Val Lys Thr Arg Glu Asn Leu His Asp Ala Leu Lys Ala Ser Glu 275 280 285 cag gtc cgc ccg ttc aag aaa gag gcg gac tac age tac ggc atg aaa 912 Gln Val Arg Pro Phe Lys Lys Glu Ala Asp Tyr Ser Tyr Gly Met Lys 290 295 300 gaa gtc tgt ggc gac age ttc gtg ctg atc ggc gat gcc gca cgg ttc 960 Glu Val Cys Gly Asp Ser Phe Val Leu He Gly Asp Ala Ala Arg Phe 305 310 315 320 gtc gac ccg atc ttc tec age ggc gtc age gtt gca etc aac agt gcg 100. 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Ala Val Leu Lys Asp Pro Asn Asp His Thr Val Cys Tyr Leu Leu Phe 195 200 205 Ala Asn Gln Ser Glu Lys Asp He Leu Leu Arg Pro Glu Leu Glu Glu 210 215 220 Leu Arg Asn Glu His Ser Ser Arg Phe Lys Leu Trp Tyr Thr Val Asp 225 230 235 240 Lys Ala Pro Asp Ala Trp Asp Tyr Ser Gln Gly Phe Val Asn Glu Glu 245 250 255 Met He Arg Asp His Leu Pro Pro Pro Gly Glu Glu Thr Leu He Leu 260 265 270 Met Cys Gly Pro Pro Pro Met He Gln Phe Ala Cys Leu Pro Asn Leu 275 280 285 Glu Arg Val Gly His Pro Lys Glu Arg Cys Phe Thr Phe 290 295 300 <210> 22 <211> 2049 <212> ADN <213> Conejo <220> <221> CDS ^.-^ ^^ -te^^^^ü ^ ^ <222> (1¡ (2049) <400> 22 ctg atc aac atg gcg gac tec cae ggg gac acc ggc gcc acc atg cct 48 Leu He Asn Met Ala Asp Ser His Gly Asp Thr Gly Ala Thr Met Pro 1 5 10 15 gaa gcg gcg gcc cag gag gcg tcg gtc ttc age atg acg gac gtg gtt 96 Glu Ala Ala Ala Gln Glu Ala Ser Val Phe Ser Met Thr Asp Val Val 20 25 30 ctg ttc tcg etc atc gtg ggg ctg atc acc tac tgg ttc etc ttc aga 144 Leu Phe Ser Leu He Val Gly Leu He Thr Tyr Trp Phe Leu Phe Arg 35 40 45 aag aaa aag gag gaa gtg ccc gag ttc acc aag atc cag gcc ccg acg 192 Lys Lys Lys Glu Glu Val Pro Glu Phe Thr Lys He Gln Ala Pro Thr 50 55 60 tcg tcg tca gtg aag gag age age ttc gtg gag aag atg aag aag acg 240 Ser Ser Ser Val Lys Glu Ser Ser Phe Val Glu Lys Met Lys Lys Thr 65 70 75 80 ggc cgg aac atc gtg gtc ttc tac ggc tec cag acg ggc acc gcc gag 28 Gly Arg Asn He Val Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu 85 90 95 gag ttt gcc aac cgc ctg tec aag gat gcc cae cgc tac ggg atg cgg 336 Glu Phe Ala Asn Arg Leu Ser Lys Asp Ala His Arg Tyr Gly Met Arg 100 105 110 ggc atg gcc gcc gac ccc gag gag tac gac ctg gcc gac ctg age age 384 Gly Met Ala Ala Asp Pro Glu Glu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Ser Ser 115 120 125 ctg ccc gag atc aac aac gcc ctg gcc gtc ttc tgc atg gcc acc tac 432 Leu Pro Glu He Asn Asn Ala Leu Ala Val Phe Cys Met Ala Thr Tyr 130 135 140 ggt gag ggg gac ccc acc gac aac gcc cag gac ttc tac gac tgg ctg 480 Gly Glu Gly Asp Pro Thr Asp Asn Ala Gln Asp Phe Tyr Asp Trp Leu 145 150 155 160 cag gag acc gac gtg gac etc tcg ggg gtc aag tac gcg gtg ttt ggc 528 Gln Glu Thr Asp Val Asp Leu Ser Gly Val Lys Tyr Ala Val Phe Gly 165 170 175 etc ggg aac aag acc tac gag cae ttc aac gcc atg ggc aag tac gtg 576 Leu Gly Asn Lys Thr Tyr Glu His Phe Asn Ala Met Gly Lys Tyr Val 180 185 190 gac cag cgg ctg gag cag ctt ggc gcc cag cgc atc ttc gag ctg ggc 624 Asp Gln Arg Leu Glu Gln Leu Gly Ala Gln Arg He Phe Glu Leu Gly 195 200 205 a g ggc gac gat gat gca aac ctg gag gag gac ttc atc acg tgg cgg 672 Met Gly Asp Asp Asp Ala Asn Leu Glu Glu Asp Phe He Thr Trp Arg 210 215 220 gag cag ttc tgg ccg gcg gtg tgc gag cae ttc ggt gtg gag gcc acá 720 ,^j?^?. ^JítÉí,rí^á .*,. ^ ¿é^. 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Lys Glu Leu Tyr Leu Ser Trp Val Val Glu Ala Arg Arg His He Leu 420 425 430 gcc atc etc caá gac tac ccg tec ctg cgg ccg ccc atc gac cae ctg 1344 Ala He Leu Gln Asp Tyr Pro Ser Leu Arg Pro Pro He Asp His Leu 435 440 445 tgt gag ctg ctg ccc cgg ctg cag gcg cgc tac tac tec atc gcc tec 1392 Cys Glu Leu Leu Pro Arg Leu Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser He Ala Ser 450 455 460 tec tec aag gtc cae ccc aac tec gtg cae atc tgc gcc gtg gcc gtg 1440 Ser Ser Lys Val His Pro Asn Ser Val His He Cys Ala Val Ala Val 465 470 475 480 gag tac gag acc aag gcc ggc cgc etc aac aaa ggc gtg gcc acc age 1488 Glu Tyr Glu Thr Lys Ala Gly Arg Leu Asn Lys Gly Val Ala Thr Ser 485 490 495 tgg ctg cgg gcc aag gag ccg gcc ggg gag aat ggc ggc cgt gcc ctg 1536 Trp Leu Arg Ala Lys Glu Pro Ala Gly Glu Asn Gly Gly Arg Ala Leu 500 505 510 gtg ccc atg ttc gtg cgc aag tec cag ttc cgc ctg ccc ttc aag gcc 1584 Val Pro Met Phe Val Arg Lys Ser Gln Phe Arg Leu Pro Phe Lys Ala 515 520 525 acc acg ccg gtc atc atg gtg ggc ccc ggc acc ggc gtg gcc 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He Gly Phe He Gln Glu Arg Ala Trp Leu Arg Gln Gln Gly Lys Glu 545 550 555 560 Val Gly Glu Thr Leu Leu Tyr Tyr Gly Cys Arg Arg Ala Ala Glu Asp 565 570 575 Tyr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala Gly Phe Gln Lys Asp Gly Thr Leu 580 585 590 Ser Gln Leu Asn Val Ala Phe Ser Arg Glu Gln Ala Gln Lys Val Tyr 595 600 605 Val Gln His Leu Leu Arg Arg Asp Lys Glu His Leu Trp Arg Leu He 610 615 620 His Glu Gly Gly Ala His He Tyr Val Cys Gly Asp Ala Arg Asn Met 625 630 635 640 Ala Arg Asp Val Gln Asn Thr Phe Tyr Asp He Val Ala Glu Leu Gly 645 650 655 Ala Met Glu His Ala Gln Ala Val Asp Tyr Val Lys Lys Leu Met Thr 660 665 670 Lys Gly Arg Tyr Ser Leu Asp Val Trp Ser 675 680 <210> 24 <211> 444 <212> ADN <213> Spinacia olerácea <220> <221> CDS <222> (1) .. (444) <400> 24 atg gca gca acc acc acá acá atg atg ggc atg gcc acc acc ttt gtc 48 Met Ala Ala Thr Thr Thr Thr Met Met Gly Met Ala Thr Thr Phe Val 1 5 10 15 cea aaa ccc caá gca cea cea atg atg gcg gcg ctt cea tec aac acc 96 Pro Lys Pro Gln Ala Pro Pro Met Met Ala Ala Leu Pro Ser Asn Thr 20 25 30 ggc cgc tet ttg ttc gga etc aag acc ggt age cgt ggc gga agg atg 144 Gly Arg Ser Leu Phe Gly Leu Lys Thr Gly Ser Arg Gly Gly Arg Met 35 40 45 acá atg gct gcc tac aag gta acc ttg gta acá ccc acc ggt aac gta 192 Thr Met Ala Ala Tyr Lys Val Thr Leu Val Thr Pro Thr Gly Asn Val 50 55 60 gag ttt caá tgc cea gac gat gtt tac atc ttg gat gct gct gaa gaa 240 Glu Phe Gln Cys Pro Asp Asp Val Tyr He Leu Asp Ala Ala Glu Glu 65 70 75 80 gaa ggc att gac ttg cct tac tca tgc aga gct ggg tcg tgc tet tca 288 Glu Gly He Asp Leu Pro Tyr Ser Cys Arg Ala Gly Ser Cys Ser Ser tgc gcc gga aag ctt aag acá ggt agt ctt aac caá gat gat cag agt 336 Cys Ala Gly Lys Leu Lys Thr Gly Ser Leu Asn Gln Asp Asp Gln Ser 100 105 110 ttt ttg gat gac gat cag atc gat gaa gga tgg gtt ctt acc tgt gct 384 Phe Leu Asp Asp Asp Gln He Asp Glu Gly Trp Val Leu Thr Cys Ala 115 120 125 gct tac cct gtt agt gat gtt act att gag acc cae aag gaa gag gag 432 Ala Tyr Pro Val Ser Asp Val Thr He Glu Thr His Lys Glu Glu Glu 130 135 140 ctt act gcc taa 444 Leu Thr Ala 145 <210> 25 <211> 147 <212> PRT <213> Spmacia olerácea <400> 25 Met Ala Ala Thr Thr Thr Thr Met Met Gly Met Ala Thr Thr Phe Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Gln Ala Pro Pro Met Met Ala Ala Leu Pro Ser Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Ser Leu Phe Gly Leu Lys Thr Gly Ser Arg Gly Gly Arg Met 35 40 45 Thr Met Ala Ala Tyr Lys Val Thr Leu Val Thr Pro Thr Gly Asn Val 50 55 60 Glu Phe Gln Cys Pro Asp Asp Val Tyr He Leu Asp Ala Ala Glu Glu 65 70 75 80 Glu Gly He Asp Leu Pro Tyr Ser Cys Arg Ala Gly Ser Cys Ser Ser 85 90 95 Cys Ala Gly Lys Leu Lys Thr Gly Ser Leu Asn Gln Asp Asp Gln Ser 100 105 110 t-- -µ.U'4-i-- < ¿>i«-<211> 711 Phe Leu Asp Asp Asp Gln He Asp Glu Gly Trp Val Leu Thr Cys Ala 115 120 125 Ala Tyr Pro Val Ser Asp Val Thr He Glu Thr His Lys Glu Glu Glu 130 135 140 Leu Thr Ala 145 <210> 26 <212> ADN <213> Vibrio fischeri <220> <221> CDS <222> (1) .. (711) <400> 26 atg cea atc aat tgc aaa gta aag tet atc gag cea ttg gct tgt aat 48 Met Pro He Asn Cys Lys Val Lys Ser He Glu Pro Leu Ala Cys Asn 1 5 10 15 act ttt cga att tta ctt cae cea gaa cag cct gtt gct ttt aaa gca 96 Tnr Phe Arg He Leu Leu His Pro Glu Gln Pro Val Ala Phe Lys Ala 20 25 30 ggc caá tac cta acg gtt gtt atg ggt gaa aaa gac aaa cgc cea ttc 144 Gly Gln Tyr Leu Thr Val Val Met Gly Glu Lys Asp Lys Arg Pro Phe .^..-^--^^-^¿.. -^^, -^-,; 35 40 45 tca atc gca agt agt cct tgt cgc cae gaa ggt gaa att gag tta cat 192 Ser He Ala Ser Ser Pro Cys Arg His Glu Gly Glu He Glu Leu His 50 55 60 att ggt gcc gca gag cae aat gct tat gcc gga gaa gtg gtt gaa tca 240 He Gly Ala Ala Glu His Asn Ala Tyr Ala Gly Glu Val Val Glu Ser 65 70 75 80 atg aaa tcg gca cta gaa acg ggt ggt gat att tta att gat gcg cct 288 Met Lys Ser Ala Leu Glu Thr Gly Gly Asp He Leu He Asp Ala Pro 85 90 95 cat ggt gaa gcg tgg atc cgt gaa gac age gat cgt tca atg tta ttg 336 His Gly Glu Ala Trp He Arg Glu Asp Ser Asp Arg Ser Met Leu Leu 100 105 110 att gct ggc ggt acá ggt ttt agt tac gta cgt tca att ctt gat cae 384 He Ala Gly Gly Thr Gly Phe Ser Tyr Val Arg Ser He Leu Asp His 115 120 125 tgt att age caá cag att caá aaa cea att tac cta tac tgg ggt ggt 432 Cys He Ser Gln Gln He Gln Lys Pro He Tyr Leu Tyr Trp Gly Gly 130 135 140 cgt gat gaa tgc caá ctg tat gca aaa gca gaa tta gag age att gct 480 Arg Asp Glu Cys Gln Leu Tyr Ala Lys Ala Glu Leu Glu Ser He Ala 145 150 155 160 ¡ÉiliA-É-lliiiitirift^^ caá gcg cat age cat att acg ttt gtg cea gtg gtt gag aaa agt gaa 528 Gln Ala His Ser His He Thr Phe Val Pro Val Val Glu Lys Ser Glu 165 170 175 ggc tgg acá ggt aaa acg ggt aat gtg tta gaa gcg gta aaa gcc gat 576 Gly Trp Thr Gly Lys Thr Gly Asn Val Leu Glu Ala Val Lys Ala Asp 180 185 190 ttt aac tca cta gca gat atg gat att tac atc gca ggt cgc ttt gaa 624 Phe Asn Ser Leu Ala Asp Met Asp He Tyr He Ala Gly Arg Phe Glu 195 200 205 atg gct ggt gca gca cgt gag cag ttc acc act gaa aaa caá gcg aag 672 Met Ala Gly Ala Ala Arg Glu Gln Phe Thr Thr Glu Lys Gln Ala Lys 210 215 220 aaa gag cag ctg ttt ggt gat gca ttc gca ttt atc taa 711 Lys Glu Gln Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ala Phe He 225 230 235 <210> 27 <211> 236 <212> PRT <213> Vibrio fischep <400> 27 Met Pro He Asn Cys Lys Val Lys Ser He Glu Pro Leu Ala Cys Asn 1 5 10 15 ¿M tküiMbimt i l áir**^ *r 4rtt?tf ? 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(1110) <400> 28 atg acc acc gct gtc acc gcc gct gtt tet ttc ccc tet acc aaa acc 48 Met Thr Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Ser Phe Pro Ser Thr Lys Thr 1 5 10 15 acc tet etc tec gcc cga age tec tec gtc att tec cct gac aaa atc 96 Thr Ser Leu Ser Ala Arg Ser Ser Ser Val He Ser Pro Asp Lys He 20 25 30 ni mu i t?üiiin Tii - ri íiÉifti age tac aaa aag gtt cct ttg tac tac agg aat gta tet gca act ggg 144 Ser Tyr Lys Lys Val Pro Leu Tyr Tyr Arg Asn Val Ser Ala Thr Gly 35 40 45 aaa atg gga ccc atc agg gcc cag atc gcc tet gat gtg gag gca cct 192 Lys Met Gly Pro He Arg Ala Gln He Ala Ser Asp Val Glu Ala Pro 50 55 60 cea cct gct cct gct aag gta gag aaa cat tca aag aaa atg gag gaa 240 Pro Pro Ala Pro Ala Lys Val Glu Lys His Ser Lys Lys Met Glu Glu 65 70 75 80 ggc att acá gtg aac aag ttt aag cct aag acc cct tac gtt gga aga 288 Gly He Thr Val Asn Lys Phe Lys Pro Lys Thr Pro Tyr Val Gly Arg 85 90 95 tgt ctt ctt aac acc aaa att act ggg gat gat gca ccc gga gag acc 336 Cys Leu Leu Asn Thr Lys He Thr Gly Asp 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Met Glu Lys Gly He 325 330 335 Asp Asp He Met Val Ser Leu Ala Ala Ala Glu Gly He Asp Trp He 340 345 350 Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Lys Lys Ala Glu Gln Trp Asn Val Glu Val 355 360 365 Tyr <210> 30 <211> 2580 <212> ADN <213> Aspergillus parasiticus <220> <221> CDS <222> (1) .. (2580) <400> 30 atg gca acc atc acg gag gtt cgg acg gat gcg etc gtc cea act gac 4. Met Ala Thr He Thr Glu Val Arg Thr Asp Ala Leu Val Pro Thr Asp 10 15 etc gtc ctt aag acá ggt cag atc aaa att caá age gaa gag atc tcg 96 Leu Val Leu Lys Thr Gly Gln He Lys He Gln Ser Glu Glu He Ser 20 25 30 acg aaa gac ctg tec gat atc cct ctg cea cea cea tca aaa cgg ccg 144 Thr Lys Asp Leu Ser Asp He Pro Leu Pro Pro Pro Ser Lys Arg Pro 35 40 45 acá gaa gtg ctg age gta gat aaa gga acc cea gat age cat gtt ccg 192 Thr Glu Val Leu Ser Val Asp Lys Gly Thr Pro Asp Ser His Val Pro 50 55 60 cgt gat cct cga etc atc aga tta acg ggt gtt cat ccg ttt aac gtt 240 Arg Asp Pro Arg Leu He Arg Leu Thr Gly Val His Pro Phe Asn Val 65 70 75 80 gag cea cct ctt acá gat ctg tat aaa gaa ggg ttt tta acá tcg ccg 288 Glu Pro Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Lys Glu Gly Phe Leu Thr Ser Pro 85 90 95 gag etc ttc tat gtt cga aat cat ggc cea gtc cct cat gtc aag gat 336 Glu Leu Phe Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro His Val Lys Asp 100 105 110 gaa gat atc cct cae tgg gaa att act atc gaa gga ctg gta gag aag 384 Glu Asp He Pro 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Asn Arg Gly He Met Leu Ala His Lys Met Asn Gly Glu 225 230 235 240 tet ctt cgc cea gat cat ggt cgt ccg ctg agg gcc gtc gtg ccc ggt 768 Ser Leu Arg Pro Asp His Gly Arg Pro Leu Arg Ala Val Val Pro Gly . ?rMb ^i?J^?e^?UtttS?^^?? aikKi :. ------.?--g--l--í 245 250 255 caá ata gga gga cga agt gtc aag tgg ctg aag agg ctg atc ttg acc 816 Gln He Gly Gly Arg Ser Val Lys Trp Leu Lys Arg Leu He Leu Thr 260 265 270 gat gca cea age gat aac tgg tac cat atc aat gac aac cgc gtc tta 864 Asp Ala Pro Ser Asp Asn Trp Tyr His He Asn Asp Asn Arg Val Leu 275 280 285 cea acá atg gtc tcg ccc gat atg gca tca aat aac cga aat tgg tgg 912 Pro Thr Met Val Ser Pro Asp Met Ala Ser Asn Asn Arg Asn Trp Trp 290 295 300 cae gat gag cgg gat gcg att tat gac cta aac acc aac tec gcc gtt 960 His Asp Glu Arg Asp Ala He Tyr Asp Leu Asn Thr Asn Ser Ala Val 305 310 315 320 gga tat cct caá aac aat gag gtc tta aat atc ctg gag gcc agg gcc 1008 Gly Tyr Pro Gln Asn Asn Glu Val Leu Asn He Leu Glu Ala Arg Ala 325 330 335 gtc ata tac tgt cag agg ata gct tac gct ggt ggg ggc cgt agg gtt 1056 Val He Tyr Cys Gln Arg He Ala Tyr Ala Gly Gly Gly Arg Arg Val 340 345 350 acc agg gta gaa ata tec cta gac aaa ggc aaa tet tgg aga ttg gcg 1104 Thr Arg Val Glu He Ser Leu Asp Lys Gly Lys Ser Trp Arg Leu Ala 355 360 365 fa^feÉ-^^--S^*^^ >...«--fe*---gat atc gaa tat gcc gaa gac aag tat cgt gat ttc gaa ggc gag ctt 1152 Asp He Glu Tyr Ala Glu Asp Lys Tyr Arg Asp Phe Glu Gly Glu Leu 370 375 380 ttt gga ggc aaa gta gat atg tac tgg cgc gaa act tgc ttc tgc tgg 1200 Phe Gly Gly Lys Val Asp Met Tyr Trp Arg Glu Thr Cys Phe Cys Trp 385 390 395 400 tgt ttt tgg tet cta age atc gcc atc cea gag ctt gag aac agt gat 1248 Cys Phe Trp Ser Leu Ser He Ala He Pro Glu Leu Glu Asn Ser Asp 405 410 415 gcc atc ctt gta aga gcc atg gat gaa gca ttg ggc gtg cag cct cgc 1296 Ala He Leu Val Arg Ala Met Asp Glu Ala Leu Gly Val Gln Pro Arg 420 425 430 gat atg tac tgg tec gtt etc gga atg atg aac aac cct tgg ttc cgg 1344 Asp Met Tyr Trp Ser Val Leu Gly Met Met Asn Asn Pro Trp Phe Arg 435 440 445 gtt acá att acg aag gaa aac ggg aac ttg aga ttc gag cae cct acc 1392 Val Thr He Thr Lys Glu Asn Gly Asn Leu Arg Phe Glu His Pro Thr 450 455 460 cae cct agt atg cct acá gga tgg atg gaa cgc gtc aaa aaa gct ggg 1440 His Pro Ser Met Pro Thr Gly Trp Met Glu Arg Val Lys Lys Ala Gly 465 470 475 480 ggt gac ccg acg aat ggt aac tgg gga gaa aga cae gaa gga gag gag 1488 Gly Asp Pro Thr Asn Gly Asn Trp Gly Glu Arg His Glu Gly Glu Glu 485 490 495 ccg acg gag ccg gag ccc gtg caá gac att aat atg aag aaa gac ggg 1536 Pro Thr Glu Pro Glu Pro Val Gln Asp He Asn Met Lys Lys Asp Gly 500 505 510 cea age cga acg att agt ttt gaa gaa ttc aag gag aat tec tgt gat 1584 Pro Ser Arg Thr He Ser Phe Glu Glu Phe Lys Glu Asn Ser Cys Asp 515 520 525 gag aag cea tgg ttc atc gtg aat gga gaa gtg tat gat ggt caá gca 1632 Glu Lys Pro Trp Phe He Val Asn Gly Glu Val Tyr Asp Gly Gln Ala 530 535 540 ttt ctt gaa ggc cae cct ggc gga cgg cag agt att atc tec tet gcc 1680 Phe Leu Glu Gly His Pro Gly Gly 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2352 Gly Asn Arg Gln Glu Glu Asp He Leu Arg Arg Ala Glu Leu Asp Gly 770 775 780 ttc atg gcg tec gac age aga agg tgt aat ata ata cae act cta tec 2400 Phe Met Ala Ser Asp Ser Arg Arg Cys Asn He He His Thr Leu Ser 785 790 795 800 aaa gcg ccg gac tca tgg act ggc cgc cga gga cgc ata tec gaa gag 2448 Lys Ala Pro Asp Ser Trp Thr Gly Arg Arg Gly Arg He Ser Glu Glu 805 810 815 etc cta aag gag tac gcg gct cea gaa gat gag agt atg gta ctg att 2496 Leu Leu Lys Glu Tyr Ala Ala Pro Glu Asp Glu Ser Met Val Leu He 820 825 830 tgt ggt ccg cea gcc atg gaa gaa tcg gct cgg agg ata ctg ttg gcg 2544 Cys Gly Pro Pro Ala Met Glu Glu Ser Ala Arg Arg He Leu Leu Ala 835 840 845 gaa gga tgg aaa gaa tca gac ctt cae ttt ttc tga 2580 Glu Gly Trp Lys Glu Ser Asp Leu His Phe Phe 850 855 860 <210> 31 <211> 859 <212> PRT <213> Aspergillus parasiticus <400> 31 Met Ala Thr He Thr Glu Val Arg Thr Asp Ala Leu Val Pro Thr Asp 1 5 10 15 Leu Val Leu Lys Thr Gly Gln He Lys He Gln Ser Glu Glu He Ser 20 25 30 Thr Lys Asp Leu Ser Asp He Pro Leu Pro Pro Pro Ser Lys Arg Pro 35 40 45 Thr Glu Val Leu Ser Val Asp Lys Gly Thr Pro Asp Ser His Val Pro 50 55 60 Arg Asp Pro Arg Leu He Arg Leu Thr Gly Val His Pro Phe Asn Val 65 70 75 80 Glu Pro Pro Leu Thr Asp Leu Tyr Lys Glu Gly Phe Leu Thr Ser Pro 85 90 95 Glu Leu Phe Tyr Val Arg Asn His Gly Pro Val Pro His Val Lys Asp ^?.^^i^^ÁA?^^?l&? ??^ ^ ^^^^.^á^^ ^!? i- 100 105 110 Glu Asp He Pro His Trp Glu He Thr He Glu Gly Leu Val Glu Lys 115 120 125 Pro Leu Val Leu Asn Phe Arg Gln Val Leu Gln Gln Tyr Asp Gln He 130 135 140 Thr Ala Pro He Thr Leu Val Cys Ala Gly Asn Arg Arg Lys Glu Gln 145 150 155 160 Asn He Val Arg Lys Thr Lys Gly Phe Ser Trp Gly Ser Ala Gly Leu 165 170 175 Ser Thr Ala Leu Phe Thr Gly Pro Leu Leu Ala Asp He Leu Arg Ser 180 185 190 Gly Lys Pro Leu Arg Gln Ala Lys Tyr Val Cys Met Glu Gly Ala Asp 195 200 205 Lys Leu Pro Asn Gly His Tyr Gly Thr Leu He Lys Leu Asn Trp Ala 210 215 220 Leu Asp Pro Asn Arg Gly He Met Leu Ala His Lys Met Asn Gly Glu 225 230 235 240 Ser 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gacgctgtcg gcatcggcct 19933 gattatgccg gtgctgccgg gcctcctgcg cgatctggtt cactcgaacg acgtcaccgc 19993 ccactatggc attctgctgg cgctgtatgc gttggtgcaa tttgcctgcg cacctgtgct 20053 gggcgcgctg tcggatcgtt tcgggcggcg gccaatcttg ctcgtctcgc tggccggcgc 20113 cágate 20119 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante, para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVI8D?«^CIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. ün método para transferir un halógeno a un sustrato en una manera regioespecifica, caracterizado porque comprende poner en contacto el sustrato con una halogenasa regioespecifica en la presencia de un oxidante, un donador de halógeno, una electrón transferasa, y un reductor donde si ocurre la transferencia in vivo la electrón transferasa es codificada por una molécula de ácido nucleico heterólogo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un componente FAD o FMN .

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el componente adicional es FAD.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la electrón transferasa es una enzima capaz de catalizar la electrón transferasa a partir de NADH o NADPH o ferredoxina a FAD.

5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la electrón transferasa es una enzima tt^.--«a?[^^tM-l-i^^>*>^ 'fi capaz de catalizar la electrón jtransferasa a partir de NADH o NADPH o ferredoxina a la halogenasa regioespecifica.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la electrón transferasa es una flavina reductasa, ferredoxina NADP reductasa, ferredoxma, diaforasa-sufidrilo reductasa o NADH-cit-B5 reductasa, NADPH-FMN reductasa, NADPH-cit-p450 reductasa o nitrato reductasa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la electrón transferasa comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 30% de identidad para cualquiera de las secuencias de aminoácido de conformidad con las SEC ID Nos: 19, 21, 23, 25, 27, 29 o 31.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la electrón transferasa comprende una secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs: 19, 21, 23, 25, 29 o 31.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la halogenasa regioespecifica es prnA, prnC, pioluteorina halogenasas pltA, pltD, y pltM, tetraciclina halogenasas cts4, hidrolasa a, o balhimicina halogenasa bha A. ÉÉÉ^y ^-ÉÉMi^í

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la halogenasa regio especifica comprende la SEC ID NO: 1.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la halogenasa regio especifica es un polipéptido que comprende un dominio de aminoácido de conformidad con cualquiera de las SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 o 17.

12. Una célula hospedara caracterizada porque expresa un ácido nucleico heterólogo substancialmente similar a cualquiera de las SEC ID NOs: 18, 10, 22, 24, 26, 28 o 30 y al menos un ácido nucleico heterólogo substancialmente similar a cualquiera de las SEC ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16.

13. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula hospedera es una célula bacteriana, fúngica o vegetal.

14. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la célula hospedera es una célula microbiana.

15. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la célula hospedera Má,^^^-^^^- además expresa secuencias de ácido nucleico que codifican a prnB y prnD.

16. Un método de producción de pirrolnitrína, caracterizado porque comprende el crecimiento de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15.

17. Un método de protección a una planta contra un patógeno, caracterizado porque comprende tratamiento de la planta con la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, con la cual la pirrolnitrina es producida por el hospedero en cantidades que inhiben al patógeno.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque además comprende colectar la pirrolnitrina a partir del hospedero.

19. Una planta, caracterizada porque comprende una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14.

20. Una planta, caracterizada porque comprende una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15.

21. Un método de protección a una planta contra un patógeno, caracterizado porque comprende el crecimiento de la planta de conformidad con la reivindicación 20, con ello se produce pirrolnitrina en la planta en cantidades que inhiben al patógeno.

22. Una semilla vegetal de conformidad con la reivindicación 20.

23. Un método de prevención del crecimiento fúngico en un cultivo, caracterizado porque comprende el crecimiento de la planta de conformidad con la reivindicación 21, en donde la planta es una planta de cultivo.

24. Un método para mejorar la producción de sustratos halogenados por un hospedero, caracterizado porque comprende expresar una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a la electrón transferasa en un hospedero en donde el hospedero expresa al menos un polipéptido endógeno que tiene actividad halogenasa regioespecifica. -„-.--.--i^^ .^.-A.s--l-.it-^