JP2003516749A

JP2003516749A - ハロゲン化反応のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2003516749A
Application number: JP2001545525A
Authority: JP
Inventors: ジョン・ステフェンズ; クリス・ベイティー; ジョン・マーキス・ディーツ; ジャン・ドン; キム・プロマ・カムダー; スティーブ・ヒル
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2003-05-20
Also published as: WO2001044447A1; CA2393910A1; IL150084A0; AR026939A1; AU772124B2; EP1238062A1; HUP0203807A3; HUP0203807A2; AU1707801A; BR0017024A; EA004942B1; EA200200634A1; MXPA02005868A; CN1409759A

Abstract

(57)【要約】本発明はハロゲン化天然産物の生合成のための方法、トランスジェニック植物およびトランスジェニック微生物を記載し、ここでハロゲン化は基質および位置特異的である。特に本発明は、病原体に対する宿主生物の保護のための、本発明の方法によって生産されたハロゲン化メタボライトの使用、より特に植物病原体に対する植物の保護に関連する。この視点では本発明は、トランスジェニック植物に植物病原体への高い抵抗性を、および生物制御生物に高い生物制御特性を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、全般にハロゲン化天然産物の生合成のための方法、トランスジェニ
ック植物およびトランスジェニック微生物に関し、ここで、ハロゲン化は基質お
よび位置特異的（regiospecific）である。ある視点では、本発明は、病原体に
対する宿主生物の保護のための、本発明の方法によって生産された、ハロゲン化
メタボライトの使用に、より特に、植物病原体に対する植物の保護に関する。こ
の視点では、本発明は、トランスジェニック植物に植物病原体への高い抵抗性を
、および生物制御生物（biocontrol organisms）に高い生物制御特性を提供する
。

【０００２】２０００を超える既知の天然存在のハロゲン化メタボライトの生合成が、なが
く２のクラスの酵素：ハロペルオキシダーゼおよび非ヘモハロペルオキシダーゼ
の機能としてみなされてきた（Gribble GW 1994, The natural production of c
hlorinated compunds. Environ Sci technol 28:310-319;van Pee K-H[1996]Bio
synthesis of halogenated metabolites by bacteria. Annu Rev Microbiol 50:
375-99）。第１の群の、ブロモペルオキシダーゼおよびクロロペルオキシダーゼ
はすべて、ヘム含有補欠分子族としてプロトポルフィリンＩＸを保有する。この
群は、水素ペルオキシドと反応することによって触媒的に作用し、酵素のヒドロ
ペルオキシドを形成し（化合物Ｉ）、これは次いでハライド（Ｘ；Ｘ＝Ｂｒ^―、
Ｃｌ⁻、またはＩ⁻）と反応し、酵素（Ｅ）−結合中間体ＥＯＸを生じる。ＥＯ
Ｘがハロゲン化剤であるか否か、またはＥＯＸの分解が活性化、短い半減期ハロ
ゲン化剤Ｘ^＋またはその誘導体（ＨＯＸ、Ｘ_２またはＸ_３ ⁻）につながるか否か
未知である。しかし、ハロゲナーゼのこのクラスによって示される基質特異性の
欠如および位置特異性の欠如は、ハロゲン化が活性部位の外部で起こり、そして
ＥＯＸの分解産物の1つによって触媒されることを強く証拠付けている（Fransse
n MCR[1994]Halogenation and oxidation reactions with haloperoxidases. Bi
ocatalysis 10:87-111）。

【０００３】２つの型の非ヘムハロペルオキシダーゼは、バナジウムを保有し、そしてこれ
らはセリンプロテイナーゼのＳｅｒ／Ａｓｐ／Ｈｉｓ触媒三つ組み特性を保有す
る。前者の群はバナジウムおよび水素ぺルオキシド依存性のＨＯＸの形成を触媒
し、これは再び活性部位の外部でのハロゲン化および著しい基質特性の欠如とい
う結果である（Franssen MCR[1994]Halogenation and oxidation reactions wit
h haloperoxidases. Biocatalysis 10:87-111）。非バナジウム含有非ヘムハロ
ペルオキシダーゼは、活性部位Ｓｅｒ残基で酢酸エステルを形成し、これは次い
で水素ペルオキシドの存在下で過酢酸に変換され；過酢酸はハライドイオンを活
性化ハロゲン化種に酸化すると、仮説をたてられている（Pelletier I, Altenbu
cher J, Mattes R[1995]. A catalytic triad is required by the non-heme ha
loperoxidase to perform halogenation. Bionchim Biophys Acta 1250:149-157
）。また、結果は基質特性も位置特異性をも有して進行しない反応であるvan Pe
e K-H[1996]Biosynthesis of halogenated metabolites by bacteria. Annu Rev
Microbiol 50:375-99）。

【０００４】最近さらなるクラスの、産物が広範囲の天然産物の位置特異的ハロゲン化を実
行する能力を示すハロゲナーゼ遺伝子が記載された（Hammer PE, Hill DS, Lam
ST, Van Pee KH, Ligon JM[1997]Four genes from Pseudmonas fluorescens tha
t encode the biosynthesis of pyrrolnitrin. Appl Environ Microbiol 63:214
7-2154）。

【０００５】本発明は、ハロゲンを基質に、位置特異的な態様で転移させる方法を記載し、
該方法は、基質を位置特異的ハロゲナーゼと、酸化剤、ハロゲン供与体、電子ト
ランスフェラーゼ、および還元剤の存在下で接触させることを含み、ここで、該
転移がインビボで起こるならば、電子トランスフェラーゼはヘテロロガス核酸分
子によってコードされる。

【０００６】特に方法を記載し、・ここで本発明の方法はＦＡＤまたはＦＭＮ構成要素、特にＦＡＤをさらに含み
、・ここで電子トランスフェラーゼが、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはフェレド
キシンからＦＡＤへの電子転移を触媒することのできる酵素であり、・ここで電子トランスフェラーゼはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはフェレドキ
シンから位置特異的ハロゲナーゼへの電子転移を触媒することのできる酵素であ
り、・ここで電子トランスフェラーゼがフラビンレダクターゼ、フェロドキシンＮＡ
ＤＰレダクターゼ、フェレドキシン、ジアフォラーゼ−スルフヒドリルレダクタ
ーゼまたはＮＡＤＨ−ｃｙｔ−Ｂ５レダクターゼ、ＮＡＤＯＨ−ＦＭＮレダクタ
ーゼ、ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−ｐ４５０レダクターゼまたはニトレートレダクター
ゼであり、

【０００７】・ここで電子トランスフェラーゼが配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２
９または３１のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも３０％同一性を有するアミ
ノ酸配列を含み、・ここで電子トランスフェラーゼが配列番号１９、２１、２３、２５、２９また
は３１のいずれかのアミノ酸配列を含み、・ここで位置特異的ハロゲナーゼがｐｒｎＡ、ｏｒｎＣ、ピオルテオリン（pyol
uteorin）ハロゲナーゼｐｌｔＡ、ｐｌｔＤ、およびｐｌｔＭ、テトラサイクリ
ンハロゲナーゼｃｔｓ４、ヒドロラーゼａ、またはハルヒミシンハロゲナーゼｂ
ｈａＡであり、・ここで位置特異的ハロゲナーゼが配列番号１を含み、・ここで位置特異的ハロゲナーゼが配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５
または１７のいずれかのアミノ酸ドメインを含んでいるポリペプチドである。

【０００８】さらに配列番号１８、１０、２２、２４、２６、２８、または３０のいずれか
に実質的に類似であるヘテロロガス核酸、および少なくとも１のヘテロロガス核
酸は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６のいずれかに実質的
に類似であるヘテロロガス核酸を発現している宿主細胞を提供し、特にここで、
・宿主細胞は細菌、真菌または植物細胞であり、・宿主細胞は微生物細胞であり、・宿主細胞はｐｒｎＢおよびｐｒｎＤをコードしている核酸配列をさらに発現し
、さらに、・前記の宿主細胞を成長させることを含むピロールニトリンを生産する方法、・植物を当該宿主細胞で処理し、それによって病原体を阻害する量で、宿主によ
ってピロールニトリンを生産させることを含む、病原体に対して植物を保護する
方法、を提供し、前記の方法はさらに宿主からピロールニトリンを収集することをさら
に含む。

【０００９】さらに、・本発明の宿主細胞を含んでいる植物、・病原体に対して植物を保護する方法であって、前記の植物を成長させ、それに
よってピロールニトリンを、病原体を阻害する量で、該植物で生産させる方法、
・前記の植物の種子、・作物での真菌成長を予防する方法であって、ここで植物が作物植物である、本
発明の植物を成長させることを含む方法、・宿主によるハロゲン化基質の生産を向上させる方法であって、電子トランスフ
ェラーゼをコードしているヘテロロガス核酸分子を宿主で発現させ、ここで該宿
主が位置特異的ハロゲナーゼ活性を有する少なくとも１の内因性ペプチドを発現
することを含む方法、を提供する。

【００１０】本発明は、驚くべきことに位置特異的ハロゲナーゼが、ハロゲンを基質にイン
ビトロで転移させるが、そうさせるために、それらはさらなるタンパク質ファク
ター、電子トランスフェラーゼを必要とすることを見出した。これらの酵素によ
ってインビトロでハロゲン化を実行するためにさらなるタンパク質ファクターが
要求されるという発見は、Pseudmonas fluorescensによって、ピロールニトリン
、ジ塩素化ニトロフェニルピロール抗生物質の生合成において機能するｐｒｎＡ
、Ｄ−トリプトファンハロゲナーゼの精製によって作成された。ＮＡＤＨ−およ
びフラビンアデニンジヌクレオチド（以後「ＦＡＤ」）依存性ハロゲナーゼの精
製は、ハロゲン化活性の進行性減少を伴った。ＰｒｎＡを過剰発現しているP. f
luorescensからのエキストラクトのイオン交換クロマトグラフィーの間、部分的
に精製され、不活性のＰｒｎＡはＰｒｎＡが不存在であるクロマトグラフィーフ
ラクションのアリコートの添加によって再活性化され得る。ここでP. fluoresce
ns P2と命名された再活性化に不可欠のファクターは、その熱およびプロテアー
ゼ感受性に基づきタンパク質であるとその後に示された。ＰｒｎＡの均質ヘの精
製は活性の完全な喪失につながり、これは本発明の電子トランスフェラーゼの添
加によって再生され得る。

【００１１】ピロールニトリン経路の第２のハロゲナーゼである、ＰｒｎＣは、ハロゲン化
天然産物の生合成に関係すると知られている以下の位置特異的ハロゲナーゼに対
してよりも、ＰｒｎＡに対してより小さい配列類似性にもかかわらず、ｐｒｎＡ
と配列類似性を示す：ピオルテオリン（Nowak-Thompson B, Chaney N, Wing JS,
Gould SJ, Loper JE, [1999]Characterization of the pyoluteorin biosynthe
tic gene cluster of Pseudmonas fluorescens Pf-5. J Bacteriol 181:2166-21
74参照）；クロロエレモマイシン（van Wageniongen AM, Kirkpatrick PN, Will
iams DH, Harris BR, Kershaw JK, Lennard NJ, Jones M, Jones SJ, Solenberg
PJ[1998]Sequencing and analysis of genes involved in the biosynthesis o
f vancomysin group antibiotic. Chem Biol 5:155-162参照）；バルヒマイシン
(balhimycin)（Pelzer S,Sussmuth R, Heckmann D,Recktenwald J, Huber P,Jun
g G, Wohlleben W[1999]Identification and analysis of the balhimycin bios
ynthetic gene cluster and its use for manipulating glycopeptide biosynth
esis in Amycolatopsis mediterranei DSM5908. Antimicrob Agents Chemother
43:1565-73 and Pelzer S, Reichert W, Hupper M, Heckmann D, Wohlleben W[1
997] Cloning and analysis of a peptide synthetase gene of the halhimysin
producer Amycolatopsis mediterranei DSM 5908 and development of a gene
disruption/replacement system. J Biotechnol56:115-128参照); およびクロロ
テトラサイクリン(Dairi T, Nakano T, Mizukami T, Aisaka K, Hasegawa M, Ka
tsumata R[1995]Conserved organization of genes for biosynthesis of chlor
tetracycline in Streptomyces strains. Biosci Biotechnol Biochem 59: 1360
-1361,and Dairi T, Nakano T, Aisaka K, Katsumata, R, Hasegawa M[1995]Clo
ning and nucleotide sequence of the gene responsible for chlorination of
tetracycline. Biosci Biotechnol Biochem 59:1099-106参照)。ＰｒｎＡと同
様に、ＰｒｎＣの精製は、ハロゲン化活性の喪失を伴い、これは本発明の電子ト
ランスフェラーゼの添加によって再生され得る。

【００１２】ピロールニトリン経路は、ＰｒｎＡ、ＰｒｎＢ、ＰｒｎＣおよびＰｒｎＤ（ピ
ロールニトリンオペロンの核酸配列は、5.8 X/N, cited in US patent No. 5723
759であってここで引用により全部を含ませるもの参照）をコードしているピロ
ールニトリンオペロンが発現されたときに、E. coliにおいて機能すると以前示
された。ＰｒｎＡおよびＰｒｎＣはハロゲナーゼとして機能し；ＰｒｎＢはトリ
プトファンのインドリル部分のアミノフェニルピロールヘの再配列を触媒し、そ
してＰｒｎＤはアミノフェニル部分をニトロフェニル置換基に酸化する。驚くべ
きことに、本発明において、本発明の電子トランスフェラーゼ、この場合にE. c
oliフラビンレダクターゼ（以後「Ｆｒｅ」）が過剰発現されるとき、ピロール
にトリルのインビボの生産が有意に増強されることが見出された。

【００１３】この「Ｐ２様活性」は、E.coli抽出物の精製不活性ＰｒｎＡへの添加によって
E. coliにおいて確立された。E. coliＰ２様活性は、イオン交換、ヒドロキシア
パタイト、およびゲル浸透カラムクロマトグラフィーによって次いで部分的に精
製された。活性を含むカラムフラクション、およびフランキング不活性フラクシ
ョンをトリプリシン化し、そしてマススペクトロメトリーによって配列決定し；
不活性フラクションで同定されたペプチドを、活性の、E. coliＰ２様活性含有
フラクション、およびE. coliゲノムデータベースに言及された残りのペプチド
に存在するものからサブトラクト化した。これから、１の核酸配列であるＮＡＤ
Ｈ−依存性フラビンレダクターゼを独特に同定した（以後「ｆｒｅ」Genbank ac
cession 23486）。

【００１４】より特異的により詳細に以下に記載されるように、E. coliｆｒｅを次いでク
ローン化し、そして過剰発現させ、過剰発現している細胞は、フラビンレダクタ
ーゼ活性の増加に直接的に比例的である、E. coliＰ２様活性の増加を保有する
と示される。ｆｒｅはまた別のプラスミド上のピロールニトリンオペロンと一緒
にE. coliに共発現させた。ピロールニトリンオペロンのみを有するものよりも
両方のプラスミドを有する細胞が、顕著により高いピロールニトリンまたはピロ
ールニトリンメタボライトを生産し、このことは、ＦｒｅのＰｒｎＡおよびＰｒ
ｎＣのアクセサリーファクターとの同一性を確認しており、並びにE.coliにおい
てフラビンレダクターゼ活性はピロールニトリン生産を制限する主要なファクタ
ーであることを指摘している。

【００１５】本発明のある実施態様では、ハロゲンを位置特異的な態様で基質に転移させる
方法であって、基質を酸化剤、ハロゲン供与体、電子トランスフェラーゼ、およ
び還元剤の存在下で位置特異的ハロゲナーゼと接触させることを含む方法を提供
し、ここで該転移がインビボで起こるならば、電子トランスフェラーゼは宿主に
対してヘテロロガスである。

【００１６】本発明のさらなる実施態様では、ハロゲンを位置特異的な態様で基質にハロゲ
ンを転移させる方法であって、基質を酸化剤、ハロゲン供与体、電子トランスフ
ェラーゼ、還元剤およびＦＡＤまたはＦＭＮの存在下で位置特異的ハロゲナーゼ
と接触させること含む方法を提供し、ここで該転移がインビボで起こるならば、
電子トランスフェラーゼは宿主に対してヘテロロガスである。特に好ましい実施
態様では、反応はピロールニトリンの生産をもたらす。

【００１７】１つの好ましい実施態様では、電子トランスフェラーゼがＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨまたはフェレドキシンからＦＡＤの電子転移を触媒することのできる酵素
であり、または電子トランスフェラーゼがＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはフェ
レドキシンから位置特異的ハロゲナーゼへの電子転移を触媒することのできる酵
素である。

【００１８】１つの好ましい実施態様では、該電子トランスフェラーゼアミノ酸配列は、Ｎ
ＡＤＰＨ−ＦＭＮレダクターゼ、ラット肝臓ＮＡＤＰＨチトクロームＰ−４５０
レダクターゼ、ホウレンソウフェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、チトクロー
ムｂ５レダクターゼ、またはニトライトレダクターゼに、少なくとも３０％同一
、好ましくは４０％同一、より好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％同
一、より好ましくは７０％同一、より好ましくは８０％同一、またはより好まし
くは９０％同一である。

【００１９】本発明のある好ましい実施態様では、位置特異的ハロゲナーゼアミノ酸配列は
、Pseudomonas fluorescensからのＰｒｎＡ、ＰｒｎＣ、ピオルテオリン（pyolu
teorin）ハロゲナーゼＰｌｔＡ、ＰｌｔＤ、およびｐｌｔＭ、Streptmyces auro
faciensからのテトラサイクリンハロゲナーゼｃｔｓ４、Amycolatopsis orienta
lisからのヒドラーゼ、またはAmycolatopsis mediterraneiからのバルヒマイシ
ンハロゲナーゼｂｈａＡに、少なくとも３０％同一、好ましくは４０％同一、よ
り好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％同一、より好ましくは７０％同
一、より好ましくは８０％同一、またはより好ましくは９０％同一である。

【００２０】ある好ましい実施態様では、本発明の電子トランスフェラーゼのそれに実質的
に類似であるヘテロロガス核酸を発現している、および本発明の位置特異的ハロ
ゲナーゼをコードしているヘテロロガス核酸を発現している宿主細胞を提供する
。ある好ましい実施態様では宿主細胞は、細菌、真菌または植物細胞である。

【００２１】ある好ましい実施態様では、ｐｒｎＡ、ＰｒｎＢ、ＰｒｎＣ、ＰｒｎＤおよび
ｆｒｅをコードしているヘテロロガス核酸分子を発現している宿主細胞を提供す
る。ある好ましい実施態様では、ピロールニトリンを生産する方法を提供し、該方
法は、ＰｒｎＡ、ＰｒｎＢ、ＰｒｎＣ、ＰｒｎＤおよびｆｒｅをコードしている
ヘテロロガス核酸分子を発現している、植物細胞を含み得る、宿主細胞を成長さ
せることによる。

【００２２】ある好ましい実施態様では、本発明の電子トランスフェラーゼのそれに実質的
に類似であるヘテロロガス核酸を発現している、および本発明の位置特異的ハロ
ゲナーゼをコードしているヘテロロガス核酸を発現している宿主細胞を含む植物
を提供する。ある好ましい実施態様では、ｐｒｎＡ、ｐｒｎＢ、ｐｒｎＣ、ｐｒｎＤおよび
本発明の電子トランスフェラーゼをコードしているヘテロロガス核酸分子を発現
している植物を提供する。

【００２３】配列表の簡単な説明配列番号１は、本発明の位置特異的ハロゲナーゼに存在する保存アミノ酸モチー
フである。配列番号２は、P. fluorescensからのＰｒｎＡをコードしている核酸配列である
。配列番号３は、P. fluorescensからのＰｒｎＡのアミノ酸配列である。配列番号４は、P. fluorescensからのＰｒｎＣをコードしている核酸配列である
。配列番号５は、P. fluorescensからのＰｒｎＣのアミノ酸配列である。配列番号６は、P. fluorescensからのＰｌｔＡをコードしている核酸配列である
。配列番号７は、P. fluorescensからのＰｌｔＡのアミノ酸配列である。配列番号８は、P. fluorescensからのＰｌｔＤをコードしている核酸配列である
。配列番号９は、P. fluorescensからのＰｌｔＤのアミノ酸配列である。配列番号１０は、P. fluorescensからのＰｌｔＭをコードしている核酸配列であ
る。

【００２４】配列番号１１は、P. fluorescensからのＰｌｔＭのアミノ酸配列である。配列番号１２は、A. orientalisからのヒドロラーゼＡをコードしている核酸配
列である。配列番号１３は、A. orientalisからのヒドロラーゼＡのアミノ酸配列である。配列番号１４は、S. aureofaciensからのｃｔｓ４をコードしている核酸配列で
ある。配列番号１５は、S. aureofaciensからのｃｔｓ４のアミノ酸配列である。配列番号１６は、A. mediterraneiからのｂｈａＡをコードしている核酸配列で
ある。配列番号１７は、A. mediterraneiからのｂｈａＡのアミノ酸配列である。配列番号１８は、E. coliからのＦｒｅをコードしている核酸配列である。配列番号１９は、E. coliからのＦｒｅのアミノ酸配列である。配列番号２０は、ラットからのＮＡＤＨチトクロームｂ５レダクターゼをコード
している核酸配列である。

【００２５】配列番号２１は、ラットからのＮＡＤＨチトクロームｂ５レダクターゼのアミノ
酸配列である。配列番号２２は、ウサギからのＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−ｐ４５０−レダクターゼを
コードしている核酸配列である。配列番号２３は、ウサギからのＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−ｐ４５０−レダクターゼの
アミノ酸配列である。配列番号２４は、S. oleraceaからのフェロドキシンをコードしている核酸配列
である。配列番号２５は、S. oleraceaからのフェロドキシンのアミノ酸配列である。配列番号２６は、V. FischeriからのＮＡＤＰＨ−ＦＭＮレダクターゼをコード
している核酸配列である。配列番号２７は、V. FischeriからのＮＡＤＰＨ−ＦＭＮレダクターゼのアミノ
酸配列である。配列番号２８は、S. oleraceaからのフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼを
コードしている核酸配列である。配列番号２９は、S. oleraceaからのフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼの
アミノ酸配列である。配列番号３０は、A. parasiticusからのニトレートレダクターゼをコードしてい
る核酸配列である。配列番号３１は、A. parasiticusからのニトレートレダクターゼのアミノ酸配列
である。配列番号３２は、E. coliフラビンレダクターゼのためのプライマーである。配列番号３３は、E. coliフラビンレダクターゼのためのプライマーである。配列番号３４は、プラスミドｐＮＯＶ５２３である。配列番号３５は、プラスミドｐＮＯＶ５２４である。

【００２６】インビトロのハロゲン化天然産物の生産本発明にしたがって、ハロゲン化天然産物を、ハロゲン供与体、酸化剤、還元
剤、および本発明の電子トランスフェラーゼの存在下で位置特異的ハロゲナーゼ
を基質と反応させることによってインビトロで生産し得る。本発明の位置特異的ハロゲナーゼはハライド、酸化剤、および生物学的ハロゲ
ン化反応中に１または２以上の炭素−水素結合の１または２以上の炭素−ハロゲ
ン結合による置換を触媒する還元系と相互作用することのできるハロゲナーゼで
あり、そして基質および／または位置特異的である。位置特異的とは、炭素−ハ
ロゲン結合が基質中の特異的な位置でのみ形成されることを意味する。

【００２７】本発明の好ましい位置特異的ハロゲナーゼは、以下の保存モチーフを含み、そ
して少なくとも１の炭素−水素結合の特異的な位置での炭素−ハロゲン結合によ
る置換を触媒するものを含む。ｘ１−Ｗ−ｘ２−Ｗ−ｘ３−Ｉ−Ｐ−ｘ４（配列番号１）ここで、Ｘ１はＧまたはＴであり、Ｘ２はＶ、Ｌ、Ｔ、ＦまたはＭであり、Ｘ３は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４はＩ、Ｆ、ＭまたはＬである。

【００２８】好ましい実施態様では、本発明のハロゲナーゼはトリプトファンハロゲナーゼ
を含む。本発明のトリプトファンハロゲナーゼは、ＰｒｎＡ（配列番号３）（タ
ンパク質アクセッション＃ＡＡＢ９７５０４；Hammer PE, Burd W, Hill DS, Li
gon JM, van Pee K, ''Conservation of the pyrrolnitrin biosynthetic gene
cluster among six pirrolnitrin-producing strains''FEMS Microbiol Lett 19
99 Nov 1; 180(1):39-44参照）および配列番号３への９０％同一性、８０％同一
性、７０％同一性、６０％同一性、５０％同一性、または４０％同一性を好まし
くは有する位置特異的ハロゲナーゼを含む。本出願全体で使用されるようなアミ
ノ酸配列の間のパーセント同一性は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.h
tmlで利用可能であるＢＡＬＳＴ２．０９プログラムによて決定され、ここでパ
ラメーターセッティングは：７のギャップオープニングペナルティーおよび２の
ギャップエクステンションペナルティーでのｂｌｏｓｕｍ６２スコアリングマト
リックスおよび５０のｘドロップオフで１０．００の予測および３のワードサ
イズである。

【００２９】好ましい実施態様では、本発明の位置特異的ハロゲナーゼはモノクロロアミノ
ピロールニトリン（monochchloroaminopyrrolnitrin）ハロゲナーゼを含む。モ
ノクロロアミノピロールニトリンハロゲナーゼは、タンパク質アクセッションナ
ンバーＡＡＢ９７５０６を有するＰｒｎＣ（配列番号５）および好ましくはその
９０％同一性、その８０％同一性、その７０％同一性、その６０％同一性、５０
％または４０％同一性を有する位置特異的ハロゲナーゼを含む。

【００３０】本発明の特に好ましい実施態様では、Pseudomonas fluorescensからのｐｒｎ
Ａ（配列番号３）、ｐｒｎＣ（配列番号５）、ピオルテオリンハロゲナーゼｐｌ
ｔＡ（配列番号７）、ｐｌｔＤ（配列番号９）、およびｐｌｔＭ（配列番号１１
）、Streptmyces aurofaciensからのテトラサイクリンハロゲナーゼｃｔｓ４（
配列番号１５）、Amycolatopsis orientalisからのヒドロラーゼａ（配列番号１
３）、Amycolatopsis mediterraneiからのバルヒマイシンハロゲナーゼｂｈａＡ
（配列番号１７）であって以下のように同定されるものを含むもののいずれかに
、３０％同一、好ましくは４０％同一、より好ましくは５０％同一、より好まし
くは６０％同一、より好ましくは７０％同一、より好ましくは８０％同一、より
好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一、より好ましくは９９％同一
であるいずれかを含む。

【００３１】

【表１】

【００３２】本発明の電子トランスフェラーゼは電子をＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはフ
ェレドキシンまたは他の還元剤からＦＡＤまたはＦＭＮに転移させることのでき
る電子トランスフェラーゼ、またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはフェレドキ
シンまたは他の還元剤からハロゲナーゼに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性オキシドレ
ダクターゼまたは他の電子供与体によるオキシドレダクターゼ、例えばクロロプ
ラスト光化学系、ラクテート、キサンチンなどによって転移することのできる電
子トランスフェラーゼを含み得る。

【００３３】本発明の電子トランスフェラーゼは、電子転移が、還元剤の酸化に関係する吸
光度の特徴的変化によってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまたはフェレドキシンの酸
化をモニタリングすることによって検出することができる、電子トランスフェラ
ーゼを選択することによって決定し得る。この変化（または変化の率の増加）は
ＦＡＤまたはＦＭＮの存在に依存性である。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの酸化を
３４０ｎｍの吸光度をモニタリングすることによって検出し得、酸化は吸光度の
減少と言う結果となる。フェレドキシンの酸化を４２０ｎｍの吸光度をモニタリ
ングすることによって検出し得；酸化は吸光度の増加という結果となる。電子転
移はまた３４０ｎｍでの励起および＞３８０ｎｍの放射による蛍光の特徴的減少
によってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの酸化をモニタリングすることによって検出
することができる。蛍光の減少はＦＡＤまたはＦＭＮの存在に依存性である。

【００３４】本発明の電子トランスフェラーゼはまた、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨからの本
発明の位置特異的ハロゲナーゼへの電子転移が、５０マイクロモルのハロゲナー
ゼとともにまたはそれなしで、５０マイクロモルＮＡＤＨまたは５０マイクロモ
ルＮＡＤＰＨと電子トランスフェラーゼを混合し（ハロゲナーゼはハロゲンザイ
ム状態、すなわちすべての必要なコファクター、例えば、すでに結合した、ＦＡ
Ｄを伴うものであるべきことが必要である）、そしてハロゲナーゼに依存性であ
るＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの酸化の率の増加を観察することによって同定する
ことができる、電子トランスフェラーゼを選択することによって決定し得る；酸
化は前記の様に３４０ｎｍの吸光度の減少または蛍光の減少によって測定する。

【００３５】本発明の電子トランスフェラーゼは、フェレドキシンからハロゲナーゼへの電
子転移が、５０マイクロモルのハロゲナーゼとともにまたはそれなしで、５０マ
イクロモル還元性フェレドキシンと電子トランスフェラーゼを混合し（ハロゲナ
ーゼはハロゲンザイム状態、すなわちすべての必要なコファクター、例えば、す
でに結合した、ＦＡＤを伴うものであるべきことが必要である）、そしてハロゲ
ナーゼに依存性である酸化の率の増加を観察することによって同定することがで
きる、電子トランスフェラーゼを選択することによって決定し得る；フェレドキ
シンの酸化は３４０ｎｍの吸光度の増加によって測定する。

【００３６】本発明の好ましい実施態様では、電子トランスフェラーゼは、以下の：配列番
号１９のアミノ酸配列を含むE.coliフラビンレダクターゼ（Fieschi F, Niviere
V, Frier C, Decout JL, Fontecave M. ''The mechanism and substrate sprci
ficity of the NADPH;flavin oxidoreductase from Escherichia coli.''J Biol
Chem 1995 Dec 22; 270(51):30392-400に記載される）；Richarme, G.''Purifi
caion of a new dihydrolipoamide dehydrogenase from Escherichia coli'',J
Baxteriol (1989 Dec.)171(12):680-5にしたがって精製されるジアフォラーゼ−
スルフヒドリルレダクターゼ；ＮＡＤＨチトクローム−ｂ５−レダクターゼ（配
列番号２１）（Barber MJ, Quinn GB ''High-level expression in Escherichia
coli of the soluble,catalytic domain of rat hepatic cytochrome b5 reduc
tase'',Protein Expr Purif 1996 Aug;8(1);41-7によって記載される）；ウサギ
からのＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−Ｐ４５０レダクターゼ（配列番号２３）、S. olera
ceaからのフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（配列番号２９）、S.olerace
aからのフェレドキシン（配列番号２５）、A. parasiticusからのニトレートレ
ダクターゼ（配列番号３１）、およびV.fisheriからのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＦＭＮ
レダクターゼ（配列番号２７）（Zenno S, Saigo K ''Identification of the g
enes encoding NAD(P)H-flavin oxidoreductases that are similar in sequenc
e to Escherichia coli Fre in four species of luminous bacteria; Photorha
bdus luminescens, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi,and Vibrio orientalis.
''J Bacteriol 1994 Jun;176(12):3544-51によって記載される）のいずれかに
少なくとも３０％同一、好ましくは４０％同一、より好ましくは５０％同一、よ
り好ましくは６０％同一、より好ましくは７０％同一、より好ましくは８０％同
一、より好ましくは９０％同一または同一である。本発明の電子トランスフェラ
ーゼはエキストラクトの形態または精製形態で使用し得る。

【００３７】特に好ましい実施態様では、本発明の電子トランスフェラーゼは、配列番号２
１、２３、２７、２９、または３１のいずれかおよび前記の試験のいずれかで電
子転移についてポジティブであるテスト品に、少なくとも３０％同一、好ましく
は４０％同一、より好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％同一、より好
ましくは７０％同一、より好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同一で
ある。

【００３８】還元剤、例えばピリジンヌクレオチド、例えば、還元性ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドまたは還元性ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ま
たは還元性フェレドキシンの選択は、本発明の電子トランスフェラーゼの選択に
依存する。本発明のすべての電子トランスフェラーゼは一般に、１または他のピ
リジンヌクレオチドでのより高い触媒性活性を有する；しかし一般に他のピリジ
ンヌクレオチドでのいくらかの活性を有する。こうして要すれば他の考察により
、好ましくないピリジンヌクレオチドを、特定の電子トランスフェラーゼとハロ
ゲン化反応において使用し得る。それぞれの電子トランスフェラーゼの好ましい
ピリジンヌクレオチドは以下の通りである：ＮＡＤＰＨはＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−
Ｐ４５０レダクターゼおよびフェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼのために好ま
しいピリジンクレオチドである。ＮＡＤＨはE.coliフラビンレダクターゼ、ＮＡ
ＤＨ−チトクローム−ｂ５−レダクターゼ、ニトレートレダクターゼおよびジア
フォラーゼスルフヒドリルレダクターゼのために好ましいピリジンヌクレオチド
である。

【００３９】フェレドキシンＮＡＤＰＨレダクターゼはまた、植物の、単離クロロプラスト
のまたはクロロプラストフラグメントを含んでいる光化学系Ｉの照明によって生
成し得る還元性フェレドキシンを使用することができる。フェレドキシンをまた
、フェレドキシン依存性デヒドロゲナーゼ例えば、ピルベート：フェレドキシン
オキシドレダクターゼによって還元し得る（Hormner DS, Hirt RP, Embley TM '
'A single eubacterial orgin of eukaryotic pyruvate: ferredoxin oxidoredu
ctase genes:implication for the evolution of anaerobic eukaryotes.''Mol
Biol Evol 1999 Sep; 16(9):1280-91）。

【００４０】好ましい実施態様では、ＦＡＤはインビトロ反応に含まれ、反応の効率を増加
させ得る。特に好ましい実施態様では、反応はＦＡＤを含み、そして選択される
位置特異的ハロゲナーゼはＰｒｎＡである。究極の実施態様では、本発明は、ハロゲナーゼを、ここでハロゲナーゼは本発
明の精製位置特異的ハロゲナーゼであり、基質、ハロゲンイオン、例えば、Ｃｌ
−および活性酸素供与体、例えば、Ｈ_２Ｏ_２、ＫｌＯ_４、ヨードソベンゼン、ヨ
ードソベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ベンゾイルペルオ
キシド、クメンヒドロペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ペルオキシ酢酸ま
たは近縁化合物と合わせることを含む。

【００４１】本発明の基質は、選択された本発明の位置特異的ハロゲナーゼに依存する。本
発明の基質は、トリプトファン、インドール、アミノフェニルピロールおよびそ
れらの誘導体およびテトラサイクリンｂｈａＡの基質であってバルヒマイシン基
質クラスＢ１−１、Ｂ１−２、Ｂ２−１、Ｂ２−２およびＢ３のすべての化合物
を含むものを含み得る（Pelzer S, Sussmuth R, Heckmann D, Recktenwald J, H
uber P, Jung G, Wohlleben W[1999]Identification and analysis of the balh
imycin biosynthetic gene cluster and its use for manipulating glycopepti
de biosynthesis in Amycolatopsis mediterranei DSM5908. Antimicrob Agents
Chemother 43:1565-73）。

【００４２】本発明に有用であるハロゲン供与体は、無機または有機カチオンの塩として、
またはそれらのそれぞれの酸として供給し得る。本発明のハロゲン供与体はＦ⁻ 、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻またはＩ⁻イオンを提供し得る。本発明の反応は、４ないし１０のｐＨのバッファー中で、０℃ないし６５℃の
温度で実施し得る。ハロゲン供与体を塩、例えば塩化物塩として添加し得、Ｌｉ
Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣｓＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２＆ＮＨ_４Ｃｌを含
み得る。反応時間は１分ないし４８時間で変化することができる。最適条件はｐ
Ｈ７．５、温度３０℃、反応時間１２時間である。

【００４３】インビトロハロゲン化の触媒の効率は、ハロゲナーゼへの電子トランスフェラ
ーゼの共有結合によって増加し得、こうして還元剤からハロゲナーゼへの電子転
移を二次過程よりむしろ一次過程とする（ハロゲナーゼの濃度について）。同じ
結果が、読み枠でコード領域を融合させることによって、電子トランスフェラー
ゼおよび本発明の位置特異的ハロゲナーゼの両方を含む融合タンパク質を遺伝的
に改変することによって得ることができる。融合物は電子トランスフェラーゼお
よびハロゲナーゼタンパク質ドメインを分離する短いペプチド配列をコードして
いる介在性配列とともに、またはそれなしで作成することができる。融合タンパ
ク質を２方向のいずれかで作成することができる：（１）Ｎ−末端−電子トラン
スフェラーゼ−（任意のリンカー）−ハロゲナーゼ−Ｃ−末端；（２）Ｎ−末端
−ハロゲナーゼ−（任意のリンカー）−電子トランスフェラーゼ−Ｃ−末端。

【００４４】本発明のさらなる実施態様では、位置特異的ハロゲナーゼおよび電子トランス
フェラーゼを含む系のタンパク質構成要素を以下にさらに記載のように固定し、
基質と反応させ、産物を生成させることができる。ハロゲナーゼおよび電子トラ
ンスフェラーゼを、共固定化される個々の酵素として、または２の構成要素のコ
ード配列が融合され、電子トランスフェラーゼおよびハロゲナーゼを有する単一
のタンパク質を生成している融合タンパク質として使用することができる。更な
る酵素および適当な二次還元剤は系に含まれ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生
させ得る：そのような酵素二次還元剤対の例は：アルコールデヒドロゲナーゼお
よびエタノール、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼおよびグル
コース−６−フォスフェート、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアセトアルデ
ヒド、リポアミドデヒドロゲナーゼおよび還元チオール、例えば、リポアミド、
ジチオスレイトールまたはメルカプトスルフォン酸を含む。

【００４５】本実施態様では、酵素（これはもしその系が使用されるなら、ＮＡＤＨまたは
ＮＡＤＰＨ再生系の酵素を含む）を任意の幾つかのプロセスによって固定し得る
。例は：（１）基質およびヌクレオチドの通過を許容するが酵素は通過しない半
透膜（透析膜）を有する容器の内部に酵素を置き；（２）酵素を不溶性マトリク
スに共有結合させ；（３）酵素をマトリクスに、酵素に対して指向される抗体ま
たは酵素に融合された抗原に対して指向される抗体を介して結合させ；（４）酵
素をマトリクスにビオチンおよびビオチン−結合ドメイン、例えばアビジンを介
して結合させ；（５）酵素の周辺でマトリクス（例えばメタクリレートポリマー
）を重合化させることを含む。

【００４６】固定化酵素を次いで還元剤、二次還元剤（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系が使用される
ならば）、基質およびハロゲン塩を含むバッファーに曝露させ得る。有機溶媒を
含ませ、基質の可溶化を容易化し得る。典型的な条件はｐＨ４ないし１０、０な
いし６５℃を含む。十分なハロゲン化産物が生成された後、ハロゲン化天然産物
を反応混合物か除去する。

【００４７】ヘテロロガス宿主におけるハロゲン化天然産物の生産本発明の電子トランスフェラーゼをコードしているヘテロロガス核酸分子を、
細菌または真菌宿主で発現させ、ネイティブ宿主から可能であり得るよりもより
大きい効率で天然産物のハロゲン化の生産を可能とし得る。例えば、天然産物生
産を増強するために、本発明の電子トランスフェラーゼをコードしているヘテロ
ロガス核酸分子をピロールニトリンプロデューサー、例えばPseudomonas fluore
scens、Burkholderia pyrrocinia、Myxococcus fulvus、Bukholderia cepacia、
Pseudmonas aureofaciens、ピオルテオリンプロデューサー例えばPseudomonas f
luorescens、バンコマイシンクラス抗生物質生産生物例えば種々のAmycolatopsi
s種、例えばA. orietalis&A.mediterraneiおよびクロロテトラサイクリンプロデ
ューサーStreptomyces aureofaciens、または他の抗生物質生産Streptomyces種
において発現させ得る。

【００４８】さらに、位置特異的ハロゲナーゼおよび電子トランスフェラーゼをコードして
いるヘテロロガス核酸分子を細菌または真菌宿主で共発現させ、ハロゲン化天然
産物の生産を可能とし、または増大させることができる。ある場合に、本発明の
ハロゲン化天然産物の合成は、１の生合成ステップ、ハロゲン化ステップのみを
必要とし、したがって発現されるヘテロロガス核酸分子のみが、本発明のハロゲ
ナーゼおよび電子トランスフェラーゼのコード配列を含むものである。別の場合
では、１または２以上のハロゲン化ステップがハロゲン化天然産物を生じる生合
成経路の一部である。この場合には多重（multiple）ヘテロロガス核酸分子が発
現される。

【００４９】本明細書を通じて使用される用語「ヘテロロガス核酸分子」は、それが導入さ
れる宿主細胞と天然には連関されない核酸分子を意味し、遺伝的構築物、非天然
に多重コピー存在する天然に存在する核酸分子；および非ネイティブ核酸分子に
作動可能に連結されたそれ以外のホモロガス核酸分子を含む。

【００５０】広い意味で、用語「実質的に類似」は、本明細書を通じて核酸分子について使
用されるとき、ここで、対応する核酸分子が引用ヌクレオチド配列によってコー
ドされるポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコ
ードする、例えばここで、ポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸の変化
のみが発生する、引用ヌクレオチド配列に対応する核酸分子を意味する。望まし
くは、実質的に類似の核酸分子は引用ヌクレオチド配列によってコードされるポ
リペプチドをコードする。用語「実質的に類似」は、ここで配列が特定の細胞で
の発現を最適化するように修飾されている、核酸分子を含むことを特に意図する
。実質的に類似の核酸分子と引用ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセントは
、望ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４５％、より望ましくは
少なくとも６５％、より望ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８
５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％
、なおもなおより好ましくは少なくとも９９％同一である。配列比較をSmith-Wa
terman配列アラインメントアルゴリズムを使用して実施する（例えばWaterman,
M.S.Introduction to Computational Biology:Maps, sequence and genomes. Ch
aprman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0,or at http://www-hto.usc
.edu/software/sequaln/index.html参照）。ローカルＳプログラム、バージョン
１．１６は以下のパラメーターで使用される：マッチ：１、ミスマッチペナルテ
ィー：０．３３、オープンーギャップペナルティー：２、エクステンディッド−
ギャップペナルティー：２．

【００５１】引用ヌクレオチド配列に「実質的に類似」の核酸分子は、引用ヌクレオチド配
列に、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中で、５０℃で２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、より
望ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａ
ＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡで中で、５０℃で１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗
浄、より望ましくはなお５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．
５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中で、５０℃で０．５ＸＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳで洗浄、好ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中で、５０℃で０．１ＸＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳで洗浄、より好ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中で、６５℃で０．１Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄によりハイブリダイズする。前記条件下でハイ
ブリダイズする本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも８０塩基対、より好ま
しくは少なくとも５０塩基対および特に少なくとも２１塩基対、およびより特に
１８塩基対を好ましくは含む。

【００５２】これらの遺伝的な操作の技術は種々の利用可能な宿主に特異的で当業界で知ら
れている。例えば発現ベクターｐＫＫ２２３を使用してヘテロロガス遺伝子をE.
coliにおいて、ｔａｃプロモーターの後方で、転写または翻訳融合のいずれか
で発現させることができる。多重オープンリーディングフレーム（以後「ＯＲＦ
」）をコードしているオペロンの発現のために、もっとも単純な手法は、ベクタ
ー例えばｐＫＫ２２３に該オペロンを転写融合において挿入し、使用されるべき
ヘテロロガス遺伝子のコグネイトリボゾーム結合部位をもたらすことである。グ
ラム陽性種、例えばBacillusでの過剰発現のための技術は、また当業界で既知で
あり、そして本発明の内容で使用することができる（Quax et al. In.: Industr
ial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et
al., American Society for Microbiology, Washington(1993)）。過剰発現のた
めの別の系は、酵母ベクターに依存し、そしてPechia、SaccharomycesおよびKlu
yveromycesの使用を含む（Sreekrishana, In: Industrial microorganisms: bas
ic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Slatrud eds., Ame
rican Society for Microbiology, Washington(1993); Dequin & Barre, Biotec
hnology 12: 173-177(1994);van den Berg et al., Biotechnology 8;135-139(1
990)）。

【００５３】これらのハロゲン化天然産物のあるものは、微生物、特に植物病原性微生物の
の成長の阻害に有効で有り得る。ハロゲン化天然産物を、ハロゲナーゼおよび／
または電子トランスフェラーゼが過剰発現される生物から生産することができ、
そしてこのために好適な生物は、グラム陰性およびグラム陽性細菌および酵母、
ならびに以下により詳細に記載される植物を含む。ハロゲン化天然産物生産の目
的のために、宿主生物の選択での顕著な基準は、そのそれぞれの操作、成長（す
なわち微生物の場合の発酵）の迅速性、およびその、過剰発現されるハロゲン化
天然産物への感受性の欠如である。ハロゲン化天然産物生産のこれらの方法は、
ハロゲン化天然産物の製造に通常使用される化学合成技術を上回る顕著な利点を
有する。記載の方法の適用は、発酵によるハロゲン化天然産物の生産における効
率および収率を増加させ、そして以前天然産物中に存在しなかったおよび合成的
に達成が困難である位置での新しいハロゲン原子の導入において有用である。

【００５４】化学合成を上回る利点のあるものは、生産のより低廉なコスト、およびハロゲ
ンの好ましい位置特異性の化合物を合成する可能性である。電子トランスフェラ
ーゼの取りこみは、ハロゲン化産物の効率および収率を増加させることができる
。加えて、新規ハロゲン化産物を望まれる基質および位置特異性を有する天然に
存在するハロゲナーゼの使用、または新規基質および位置特異性を有する改変ハ
ロゲナーゼの使用のいずれかによって、ハロゲンの既知の天然産物への付加によ
って生産することができる。多くの天然産物例えば、マクロライド、ポリケタイ
ドおよび非リボソーム性ペプチドを、位置特異性および鏡像異性的特異性を有し
て、ハロゲン化する化学的手段を使用することは非常に困難である。アリールま
たはアルキル部分のハロゲン化に要する条件は、一般に天然産物の構造の他の変
化を引き起こす。

【００５５】ハロゲナーゼはまた、有機合成によって一般に生成されるラセミ混合物に対し
て、鏡像異性的に純粋な産物を生産することができる（プロキラル炭素のハロゲ
ン化の場合に）。立体化学的に適当な化合物を生産する可能性は、多くのキラル
活性炭素原子を有する分子について特に重要である。ヘテロロガス宿主によって
生産されたハロゲン化天然産物を、医学的（すなわち病原体および／または感染
性疾患の制御）並びに農業的応用を含む多くの目的のために使用することができ
る。

【００５６】ハロゲン化産物の生産が１より多い酵素を要する場合、所望のハロゲン化産物
の生合成のための酵素をコードしている核酸分子を単一の生物で発現させ得る。
ある好ましい実施態様では、天然産物のための酵素をコードしているすべての望
まれる核酸配列を生物のクロモソームに単一オペロンとして組みこみ、そして好
適な調節エレメントによって制御する。別の好ましい実施態様では、該核酸配列
は選択可能マーカーを有するプラスミド上に有され得る。さらなる別の好ましい
実施態様は、２またはより多いコンパチブルプラスミド上で要される核酸配列を
発現させることを含み、または要される核酸配列がクロモソーム中および１また
は２以上のコンパチブルプラスミド中に分布し得る。核酸分子の発現は、天然産
物生合成核酸コード配列のネイティブ調節エレメントによって、または該経路の
核酸配列の発現のより正確な制御もたらすように選択されたプロモーターによっ
て制御され得る。所望により、電子トランスフェラーゼ核酸配列を本発明の位置
特異的ハロゲナーゼ（複数含む）をコードしているものとともにオペロンに含ま
せる。または、電子トランスフェラーゼ配列は、別個に発現し得る。

【００５７】ハロゲン化産物を創出する本発明のさらなる方法は、２またはより多い別個の
生物の間の生合成経路からの核酸分子を分割することを含む。該生物を、生合成
の経路の次のステップを発現している別のカルチャーに移されるべき１のカルチ
ャーによって生産された生合成中間体と別個に成長させ得る。または該生物を要
求されるように１から他方へ通過する中間体と共培養し得る。これらの適用のい
ずれかにおいて、それぞれのハロゲナーゼは同じ生物でおよび同じサブセルラー
位置で共発現される好適な電子トランスフェラーゼを要する。

【００５８】新規ハロゲン化産物を、所望の非ハロゲン化構造を生産することが要求される
遺伝子をすでに発現する生物に、ハロゲナーゼを導入することによって生産し得
る。該ハロゲナーゼを完全構造で特異的部位について特異性を有するように改変
し、またはそれは、ネイティブ生物の最終的構造にその後に取りこまれる構造の
構成要素について特異性を有し得る。例えば、ハロゲナーゼを改変し、ペプチド
含有抗生物質にその後取りこまれるアミノ酸を特異的にハロゲン化し得る。次い
で得られる産物は天然産物で見出されない位置の新規ハロゲン修飾を保有する。

【００５９】前記のいずれかの系で、ハロゲン化の効率における顕著な利点が、電子トラン
スフェラーゼおよび位置特異的ハロゲナーゼをコードしている核酸配列の融合に
よってもたらされ、その結果、融合タンパク質は両方の機能性を有して生成され
；そのような融合物は、還元剤からハロゲナーゼへの電子転移のより高い効率を
もたらし得る。電子トランスフェラーゼ核酸配列をハロゲナーゼの５’または３
’末端のいずれかに融合し得る。短いリンキングペプチド（リンカー）のための
コード配列を、該融合に組みこみ、電子トランスフェラーゼおよびハロゲナーゼ
タンパク質ドメインをコードしている配列を分離し得；リンカーの長さは１ない
し３０アミノ酸残基長で変化することができる。

【００６０】本発明のハロゲンナーゼおよび／または電子トランスフェラーゼをまたヘテロ
ロガス細菌および真菌宿主で発現させ、そのような細菌および真菌宿主の生物制
御株の効率を増加させる目的で、ハロゲン化天然産物を生産することができる。
抗−病原性ハロゲン化天然産物のヘテロロガス過剰発現のために好適である微生
物は、植物または根圏でコロニー化できるすべての微生物である。そういうもの
として、それらは植物病原性真菌、細菌およびネマトーダと接触し、病原体成長
を阻害することができる。これらは、グラム陰性微生物例えば、Bacillusおよび
真菌TrichodermaおよびGliocladiumを含む。特に好ましいヘテロロガス宿主はPs
eudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas cepacia、Pseudomo
nas aureofaciens、Pseudomonas aurantiaca、Enterbacter cloacae、Serratia
marscesens、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Trichoderma viride、Tric
hoderma harzianumおよびGliocladium virensである。

【００６１】ヘテロロガス生物制御株の発現は、選択された宿主の複製に適当なベクターの
選択およびプロモーターの好適な選択を要する。グラム陰性およびグラム陽性細
菌および真菌における発現のための技術は当業界で周知であり、そして本明細書
の任意の場所に記載される。

【００６２】トランスジェニック植物におけるハロゲン化産物の生産本発明のハロゲナーゼおよび／または電子トランスフェラーゼをトランスジェ
ニック植物で発現させ、こうしてトランスジェニック植物で選択されたハロゲン
化天然産物の生合成を可能とする。ある場合では、本発明のハロゲン化天然産物
は、１の生合成ステップである、ハロゲン化ステップのみを要求し、およびした
がって発現されるヘテロロガス核酸分子のみが、本発明の位置特異的ハロゲナー
ゼおよび電子トランスフェラーゼのためのコード配列を含むものである。他の場
合では、１または２以上のハロゲン化ステップはハロゲン化天然産物を生じる生
合成経路の一部である。この場合では、多重ヘテロロガス核酸分子が発現される
。

【００６３】本明細書で使用されるように、「植物」は任意の発育のステージの任意の植物
または植物の一部を意味する。ここに、挿し木、細胞または組織培養物および種
子がまた含まれる。本発明と結びつけて使用されるように、用語「植物組織」は
全植物、植物細胞、植物器官、植物種子、プロプラスト、カルス、細胞培養物、
および構造的および／または機能的単位に組織化された植物細胞の任意の群を含
むがこれらに限定されない。ハロゲン化天然産物が抗病原性特性を有する場合、
植物病原性真菌および細菌に対する高い抵抗性を有するトランスジェニック植物
を作出することができる。トランスジェニック植物におけるこれらの発現のため
に、本発明のハロゲナーゼおよび／または電子トランスフェラーゼをコードして
いる核酸分子および隣接配列は修飾および最適化を要し得る。

【００６４】多くの場合に他の生物からの核酸分子は、修飾なしで高レベルで植物で発現さ
せることができるが、トランスジェニック植物での低レベル発現は、植物に好ま
しくないコドンを有する核酸分子のためで有り得る。すべての生物はコドン利用
のために特異的な優先性を有し、そして植物の優先性を確保するために、コード
されたアミノ酸を維持しつつ、他の生物からのコドンを変化させることができる
ことが当業界で知られている。さらに、植物での高レベル発現は、少なくとも３
５％ＧＣ含量、そして好ましくは４５％より多いＧＣ含量を有するコード配列か
ら最良に達成される。低ＧＣ含量を有する微生物遺伝子は、伝令を脱安定化し得
るＡＴＴＴＡモチーフおよび不適当なポリアデニル化を生じ得るＡＡＴＡＡＡモ
チーフの存在のために植物で低レベルに発現され得る。加えて、本発明のハロゲ
ナーゼまたは電子トランスフェラーゼをコードしている核酸分子を、ｍＲＮＡト
ランケーションを引き起こし得る異常なスプライシング部位の存在についてスク
リーニングすることができる。コード配列、例えば前記のもの内で作成されるべ
きことが要求されるすべての変化は、周知の技術である部位特異的突然変異誘発
、ＰＣＲ、および公開された特許出願ＥＰ０３８５９６２、ＥＰ０３５９４７２
、およびＷＯ９３／０７２７８に記載された方法を使用する合成遺伝子構築を使
用して作成することができる。

【００６５】本発明の好ましい核酸は修飾されなくてもよく、これらはトランスジェニック
植物種で高レベルで発現されるべきであり、またはあるいは脱安定化および不適
当なポリアデニル化モチーフおよび異常なスプライシング部位の除去、そしてさ
らに植物に好ましいコドンの取りこみによって修飾され、そしてさらに植物での
発現に好ましいＧＣ含量を有する修飾された核酸分子であり得る。好ましい核酸
配列は単子葉植物および双子葉植物種の両方で十分に発現され得るが、配列を修
飾して特定の好ましいコドンおよびこれらの好ましさが異なると示された（Murr
ay et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498(1989)）単子葉植物または双子葉植物
の好ましいＧＣ含量を考慮に入れることができる。

【００６６】翻訳の効率的な開始のために、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を要求し
得る。選択された核酸分子にコグネイトな配列は、植物で効率的に翻訳を開始し
、またはあるいはあまり効率的でなく開始し得る。あまり効率的ではなく開始し
得る場合、それらは植物で効果的であると知られる配列の包含によって修飾する
事ができる。Joshiは、植物のための適当なコンセンサス翻訳インヒビターを（N
AR 15: 6643-6653(1987);配列番号１５）、そしてClontechは、さらなるコンセ
ンサス翻訳インヒビターを（1993/1994カタログ、２１０ページ、配列番号１６
）示唆している。これらのコンセンサス配列は、本発明の核酸分子での使用のた
めに好適である。これらの配列を、ＡＴＧを含むＡＴＧまで（ここで選択された
核酸分子の第２のアミノ酸は非修飾のままである）、またはあるいはＡＴＧの次
のＧＴＣを含むＧＴＣまで（トランスジーンの第２のアミノ酸を修飾する可能性
を有して）、核酸分子構築物に取りこませる。

【００６７】トランスジェニック植物における本発明のハロゲナーゼまたは電子トランスフ
ェラーゼをコードしている核酸分子の発現は、植物で機能性であると示されたプ
ロモーターの後方である。プロモーターの選択は、発現のための時間的および位
置的な要求に依存して、およびまた標的種に依存して変化する。ハロゲン化天然
産物が抗病原性であり、そして茎葉の病原体に対する植物の保護が望まれる場合
、葉における発現が好ましく；穂の病原体に対する植物の保護のために、花序（
例えば下穂、円錐花序、巻絹等）における発現が好ましく；根の病原体に対する
植物保護のために、根における発現が好ましく；土壌病原体に対する実生の保護
のために、根および／または実生における発現が好ましい。多くの場合、しかし
、１より多い型の病原体に対する発現が求められ、こうして多重組織における発
現が望ましい。双子葉植物からの多くのプロモーターが単子葉植物で作動可能で
あり、逆もまた同じであることが示されたが、理想的には双子葉植物プロモータ
ーは双子葉植物での発現のために選択され、そして単子葉植物プロモーターは単
子葉植物での発現のために選択される。しかし、選択されるプロモーターの由来
に限定はない；本発明の核酸分子の発現を駆動するときに作動可能であることが
十分である。構成的に発現される好ましいプロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓお
よび１９Ｓプロモーター、およびアクチンまたはユビキチンをコードしている遺
伝子からのプロモーターである。

【００６８】本発明の核酸分子はまた、化学的に調節されるプロモーターの調節の下で発現
させることができる。このことは、合成されるべきハロゲン化天然産物が、作物
植物が誘導化学物質で処理されるときにのみに合成され、そしてハロゲン化天然
産物生合成がその後に減衰することを可能とする。遺伝子発現の化学的誘導に好
ましい技術は、公開された出願ＥＰ０３３２１０４およびＵＳ５６１４３９５（
引用によりここに含ませる）に詳説されている。化学的誘導に好ましいプロモー
ターはタバコＰＲ−１ａプロモーターである。

【００６９】プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導性であるものである。多くのプ
ロモーターが傷部位で、およびまた植物病原体感染の部位で局所的に発現される
ことが記載されている。理想的には、そのようなプロモーターは感染の部位での
み局所的に活性であるべきであり、このように、抗病原性ハロゲン化天然産物が
、侵入しつつある病原体の成長を阻止するためにそれを合成することが必要であ
る細胞において蓄積する。この種類の好ましいプロモーターは、Stanford et al
. Mol.Gen. Genet. 215: 200-208(1989). Xu et al. Plant Molecu. Biol. 22:
573-588(1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158(1989), Rohrmeier &
Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792(1993), Firek et al. Plant Molec. B
iol. 22: 129-142(1993), and Warner et al.Plant J. 3: 191-201(1993)によっ
て記載されるものを含む。

【００７０】好ましい組織特異的発現パターンは、緑色組織特異的、根組織特異的、茎特異
的、および花特異的を含む。緑色組織での発現のための好適なプロモーターは、
光合成に関係する遺伝子を調節する多くのものを含み、そしてそれらの多くは単
子葉植物および双子葉植物の両方からクローン化された。好ましいプロモーター
は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子からのトウモロコシＰＥ
ＰＣプロモーター（Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589(1989)
）である。根特異的発現のために好ましいプロモーターは、Framond(FEBS 290:
103-106(1991); EP0452269[1479])によって記載されたものであり、そしてさら
に好ましい根特異的プロモーターは特許出願ＷＯ９３／０７２７８に記載された
ものであり、それはトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動する。

【００７１】本発明の好ましい実施態様は、根特異的な様式でハロゲン化天然産物、ピロー
ルニトリンを生産するトランスジェニック植物である。本発明の特に好ましい実
施態様では、ピロールニトリンのための生合成遺伝子を根特異的プロモーターの
後方で発現させ、トランスジェニック植物を植物病原体Rhizoctoniaに対して保
護する。さらなる好ましい実施態様は、傷誘導可能または病原体感染誘導可能な
態様で抗病原性ハロゲン化天然産物を生産するトランスジェニック植物である。

【００７２】好適なプロモーターの選択に加えて、植物でのハロゲン化天然産物生産のため
の構築物は、ヘテロロガスハロゲナーゼおよび／または電子トランスフェラーゼ
核酸分子の下流に付着されるべき適当な転写ターミネーターを要する。幾つかの
そのようなターミネーターは当業界で利用可能であり、既知である（例えばＣあ
ＭＶからのｔｍ１、ｒｂｃＳからのＥ９）。植物で機能すると知られる任意の利
用可能なターミネーターは、本発明の内容で使用することができる。

【００７３】多くの他の配列をハロゲナーゼおよび／または電子トランスフェラーゼ核酸分
子のための発現カセットに取りこむことができる。これらはイントロン配列（例
えばＡｄｈ１およびｂｒｏｎｚｅ１から）およびウイルスリーダー配列（例えば
ＴＭＶ、ＭＣＭＶおよびＡＭＶから）のような発現を増強すると示された配列を
含む。

【００７４】植物でのハロゲン化天然産物の生産は、その経路の第一のステップをコードし
ているハロゲン化天然産物生合成核酸分子を、その経路基質に接近させることを
要する。それぞれの個々のハロゲン化天然産物および関係する経路のために、こ
の基質はことなるようであり、そして植物のその細胞性局在化もまた同様であり
得る。多くの場合では基質はサイトソル内で局在化し、一方他の場合ではそれは
ある種の亜細胞性オルガネラで局在化し得る。植物の多くの生合成活性がクロロ
プラストに存在し、しばしば基質はクロロプラストに局在化し、そして結果的に
本発明のハロゲナーゼおよび電子トランスフェラーゼは適当なオルガネラ（例え
ばクロロプラスト）に最もよくターゲティングされる。酵素がコードされている
導入遺伝子の亜細胞性局在化は、当業界で周知の技術を使用して実施化すること
ができる。典型的には、既知のオルガネラ−ターゲティング性遺伝子産物からの
標的ペプチドをコードしているＤＮＡを操作し、そして要求されたハロゲナーゼ
および電子トランスフェラーゼ核酸分子の上流に融合する。多くのそのようなタ
ーゲット配列はクロロプラストについて既知であり、そしてヘテロロガス構築物
におけるそれらの機能化は示されている。本発明の好ましい実施態様では、ピロ
ールニトリン生合成のために要求される核酸分子はクロロプラストにターゲティ
ングされ、なぜならその経路基質のトリプトファンはクロロプラストで合成され
るからである。

【００７５】ある種の場面では、ハロゲン化天然産物生産のために要求される核酸の過剰発
現は、特定の経路のための基質の細胞内利用可能性を奪い得、そしてこれは細胞
における有害な影響を有し得る。このような場面では、基質の生合成のための酵
素をコードする核酸分子の過剰発現によって利用可能な基質の量を増加させるこ
とが望ましい。トリプトファン（ピロールニトリン生合成のための基質）の場合
には、これはｔｒｐＡおよびｔｒｐＢコード核酸分子の過剰発現によって達成す
ることができる。より多くの基質を利用可能とさせるさらなる方法は、特異的基
質を利用する既知の経路を停止させることによる（ただしこれは有害な副作用な
く実施することができる場合は）。この態様では、合成される基質はハロゲン化
天然産物の生合成に向けてチャンネリングされ、そして他の化合物に向けてされ
ない。

【００７６】植物形質転換に好適なベクターは、本明細書の他の場所で記載される。アグロ
バクテリウム仲介性形質転換のために、バイナリベクターまたは少なくとも１の
Ｔ−ＤＮＡボーダー配列を有するベクターが好適であり、一方直接的移入のため
に、任意のベクターが好適であり、そして所望の構築物のみを含んでいる直鎖上
ＤＮＡが好ましくあり得る。直接的移入の場合に、単一ＤＮＡ種による形質転換
または共形質転換を使用することができる（Schocher et al Biotechnology 4:
1093-1096(1986)）。直接的移入およびアグロバクテリウム仲介性移入の両方の
ために、形質転換を抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレ
キセート）または除草剤（バスタ）に対する抵抗性を提供し得る選択可能マーカ
ーとともに通常は企て得る。しかし、選択可能マーカーの選択は本発明について
は重要でない。

【００７７】トランスジェニック植物でのハロゲン化天然産物の合成は、ハロゲン化天然産
物生合成酵素をコードしている多重核酸分子の同時的な過剰発現をしばしば要す
る。これは個々のハロゲン化天然産物生合成核酸分子を、異なる植物系統に個々
に形質転換し、それから得られた系統を交雑することによって達成することがで
きる。多重核酸配列を有する系統の選択および維持を、それぞれの種々の形質転
換構築物が種々の選択可能マーカーを利用するならば、容易化することができる
。すべての要求されるハロゲン化天然産物生合成核酸分子をピラミッド化した系
統は、ハロゲン化天然産物を合成することができ、一方他の系統はできない。

【００７８】このアプローチは、最終的ハイブリッドが、必然的に２の親の交雑系であるハ
イブリッド作物、例えばトウモロコシについて好適であり得る。種々のヘテロロ
ガス核酸分子を有する種々の近交系の維持がまた、ここで特定のハロゲン化天然
産物経路が多重ハロゲン化天然産物であって、それぞれが有用性を有するものに
つながり得る、場面で有利で有り得る。すべての残りの要求される核酸分子を有
する系統とハイブリッド交雑させるために、その経路の後のステップのための種
々の別の核酸配列を有する種々の系統を利用することによって、種々の利用性を
有し得る種々の選択されたハロゲン化天然産物を有する種々のハイブリッドを作
出することが可能である。

【００７９】多重核酸配列を有する植物系統を生産する別の方法は、ハロゲン化天然産物生
合成核酸分子（複数含む）ですでに形質転換された存在する系統の形質転換（お
よび種々のマーカーによる選択）、およびまた多重生合成核酸分子であって、そ
れぞれが適当な調節制御（すなわちプロモーター、ターミネーター等）下である
ものを有する単一の形質転換ベクターの使用を含む。ＤＮＡ構築の容易性を与え
るならば、多重生合成核酸分子を有するためのクローニングベクターの操作が好
ましい方法である。

【００８０】さらなる好ましい方法は、前記のように本発明のハロゲナーゼの、本発明の電
子トランスフェラーゼとの融合タンパク質を構築し、そして本発明のトランスジ
ェニック植物でそのような融合タンパク質をコードしている核酸分子を発現させ
ることである。電子トランスフェラーゼをコードしている核酸分子を、ハロゲナ
ーゼコード核酸分子の５’または３’末端のいずれかに融合し得る。所望により
、その融合にリンカーを取りこませ、電子トランスフェラーゼおよびハロゲナー
ゼタンパク質ドメインを分離し得る。好ましい実施態様では、融合タンパク質は
（Ｇｌｙ）_６からなるリンカーを含む。しかし、当業者は、他の適当な長さおよ
び／または組成のリンカーをまた選択し得ることを認識する。

【００８１】さらなる好ましい実施態様では、植物でのハロゲン化天然産物の生産を、直接
的プラスチド形質転換によって達成し得る。遺伝子がそれぞれの植物細胞に存在
する環状プラスミドゲノムの数千コピーに相同的組換えによって挿入される、プ
ラスチド発現は、核内発現される遺伝子を上回る莫大なコピー数の有利性を利用
し、総可溶性植物タンパク質の１０％を容易に超えることのできる発現レベルを
可能とする。好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列を、プラスチドをターゲ
ティングするベクターに挿入し、所望の植物宿主のプラスチドゲノムに形質転換
する。そのヌクレオチド配列を含むプラスチドゲノムについてホモプラスミック
な植物を得て、そしてそのヌクレオチド配列の高発現が優先的に可能である。

【００８２】プラスチドの形質転換技術は、例えば米国特許番号５４５１５１３、５５４５
８１７、５５４５８１８および５８７７４６２に、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６７
８３およびＷＯ９７／３２９７７に、およびMcBride et al.(1994)Proc. Natl.A
cad. Sci USA 91, 7301-7305に詳細に記載され、すべて引用によりここに全体を
含ませる。プラスチド形質転換のための基本的技術は、選択可能マーカーにフラ
ンキングであるクローン化プラスチドＤＮＡの領域を、そのヌクレオチド配列と
ともに好適な組織に、例えばバイオリスチックまたはプロトプラスト形質転換（
例えば塩化カルシウムまたはＰＥＧ介在性形質転換）を使用して、導入すること
に関係する。ターゲティング配列と呼ばれる、１ないし１．５ｋｂのフランキン
グ領域は、プラスチドゲノムとの相同的組換えを容易化し、そしてこうしてプラ
ストームの特異的領域の置換または修飾を許容する。

【００８３】最初に、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する抵抗
性を付与するクロロプラスト１６ＳｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子における
点突然変異を、形質転換のための選択可能マーカーとして利用する（Svab, Z.,
Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci/ USA 87, 85
26-8530; Staub J. M., and Maliga, P. (1992)Plant Cell 4, 39-45）。これら
のマーカーの間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラス
チドターゲティングベクターの創出を可能とする（Staub, J. M., and Maliga,
P. (1993)EMBO J. 12,601-606）。形質転換頻度の実質的な増加を、劣性ｒＲＮ
Ａまたはｒ−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子の、優性選択可能マーカー、スペ
クチノマイシン−解毒酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラー
ゼをコードしている細菌ａａａＡ遺伝子での置換によって得る（Svab, Z., and
Maliga, P. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917）。プラスチド形
質転換に有用である他の選択可能マーカーは、当業界で既知であり、本発明の範
囲に含まれる。

【００８４】本発明の特に好ましい実施態様では、ピロールニトリンの誘導可能なプラスチ
ド生産を、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下のオペロンとしてｆｒ
ｅ、ｐｒｎＡ、ｐｒｎＢ、ｐｒｎＣ、およびｐｒｎＤの直接的クロロプラスト形
質転換によって達成する。誘導可能発現を、クロロプラスト移行ペプチドを保有
するように改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている核内構築物で
あってＰＲ１プロモーターの制御下であるものを保有する植物と交雑することに
よって達成し、ＢＴＨ−誘導可能発現を可能とする。

【００８５】本発明の方法によるハロゲン化天然産物の生産は、裸子植物、単子葉植物、お
よび双子葉植物を含む、広範囲の植物細胞で存在し得る。遺伝子はこれらの広い
クラス内に入る任意の植物細胞に挿入することができるが、作物植物細胞、例え
ば限定されないがイネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、ジャガイ
モ、ニンジン、カンショ、テンサイ、インゲンマメ、エンドウ、チコリー、レタ
ス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソ
ウ、アウパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、ペッパー、セルリー、ニンジン
、スカッシュ、パンプキン、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、
メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラ
ズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴ、バナ
ナ、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガムおよびサトウキビで特に有用である。

【００８６】本発明の位置特異的ハロゲナーゼおよび/または電子トランスフェラーゼにつ
いての対立遺伝子（複数含む）を、作物植物または再生することのできる植物細
胞カルチャーで直接選択によって取得する場合、対立遺伝子を遺伝的に改変する
ことおよび植物にそれを形質転換することの必要のない伝統的育種技術を使用し
て商業的な品種（varieties）に移す。

【００８７】実施例以下の実施例を本発明のさらなる説明および本発明を実施化するための方法と
して供する。これらは限定としてではなく、本発明の以下に実施化し得るかにつ
いてのガイドラインの提供として意図する。

【００８８】実施例１：ＰｒｎＡでのインビトロのハロゲン化反応Ａ．E.coliフラビンレダクターゼＰ２、Aspergillusニトレートレダクターゼ、
およびチトクロームｂ５レダクターゼでのＰｒｎＡの活性化ＰｒｎＡを、Kirner et al(Kirner, S. et al J Bacteriol 1998 Apr; 180(7)
:1939-43)に記載されたプラスミドｐＰＥＨ１４（ｐｒｎＡ）で、Pseudomonas f
luorescens BL915deltaORF1-4から、イオン交換クロマトグラフィーによって精
製する。精製酵素は、前記本発明の背景で記載のように調製したＰ２の添加なく
して無視できる活性を有する。タンパク質濃度または調製物は０．３６ｍｇ／ｍ
ｌである。

【００８９】ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．５（５０ｍＭ）、グルコース−６−フォスフェ
ート（１４．３ｍＭ）、Ｄ−Ｔｒｐ（７ｍＭ）、ＮａＣｌ（７ｍＭ）を含む、ア
ッセイ混合物を調製する。Aspergillus nigerカタラーゼをSigma Chemical Co.
から購入する。（１３Ｕ／ｍｌ）、ウシ赤血球スーパーオキシドジムスターゼ（
以下ＳＯＤ）をSigma Chemical Co.から購入する。（５Ｕ／ｍｌ）、Leuconosto
c mesenteroidesグルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼをSigmaから
購入し、（５Ｕ／ｍｌ）、ＦＡＤ（７マイクロモル）。ＮＡＤＨ依存性混合物ま
たはＮＡＤＰＨ混合物を以下に示すように使用する。ＮＡＤＨ−依存性アッセイ
混合物を、１２ｍｇのＮＡＤＨを４．５ｍｌの前記アッセイ混合物に添加するこ
とによって調製する。ＮＡＤＰＨ−依存性アッセイ混合物を、３ｍｇのＮＡＤＰ
Ｈを１ｍｌの前記のアッセイ混合物に添加することによって調製する。

【００９０】以下に記載の反応１−７を３反復のポリプロピレン管に準備する。ＰｒｎＡ、
示したアッセイ混合物および電子トランスフェラーゼを混合の後、サンプルを撹
拌し、次いで室温で反転によって混合する。反応を反応の開始２０．５時間後に
２分間のボイリングによって停止させ、次いでサンプルをMicrocon10膜により限
外濾過によってHPLC分析のために調製する（30分間１４０００ｘｇ）。HPLC分析
をMethod Set PrnA1により（以下に記載）、インジェクション体積は５０マイク
ロリッターであり、およびデーターを最初６分間収集する。

【００９１】標準を５または１０マイクロリッター７−Ｃｌ−Ｔｒｐ（１ｍＭ）を十分な５
０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５と混合することによって調製し、最終体積２０
０マイクロリッターとする。Ｄ−Ｔｒｐは〜２分で、そして７−Ｃｌ−Ｔｒｐは
４．３分に溶出し、確かなＤ−Ｔｒｐおよび７−ＣｌＴｒｐの溶出によって示さ
れるとおりである。７−Ｃｌ−Ｔｒｐの量を、標準曲線と比較することによって
決定する。報告された活性は、電子トランスフェラーゼの添加後７−Ｃｌ−Ｔｒ
ｐの正味の増加である。

【００９２】ＨＰＬＣ分析法ＰｒｎＡ１７−Ｃｌ−Ｔｒｐの決定フォトダイオードアレイディテクターを有するWaters Alliance HPLCシステム
を使用する。Waters Alliance HPLCは粒子サイズ３マイクロメーターのＣ１８シ
リカで充填された４．６ｘ５０ｍｍカラムを備えている。ここでＰｒｎＡ１とし
て命名される勾配溶出法を使用する。流速はずっと１ｍｌ／分であり、そして吸
光度データーを２１０ないし４００ｎｍで収集し１．２ｎｍの分解能でありサン
プリング速度は１／ｓである。系を８５：１５の水：メタノール混合物で予め平
衡させる。サンプルのインジェクション後、カラムを開始条件から４０：６０水
：メタノール混合物への６分間勾配で展開する。次いで６．０ないし７．０分に
メタノールの濃度は線形勾配で１００％に増加する。カラムを１００％メタノー
ルで１分間洗浄し、次いで再平衡させる。〜２分でＤ−Ｔｒｐが溶出し、４．３
分に７−Ｃｌ−ｔｒｐが溶出し、確かなＤ−Ｔｒｐおよび７−Ｃｌ−Ｔｒｐの溶
出によって指摘されるとおりである。

【００９３】１．E.coliフラビンレダクターゼによるＰｒｎＡの活性化 E.coliフラビンレダクターゼ、（以後Ｆｒｅと略称）を、引用により全体をこ
こに含ませる、Fieschi et al(1995)J. Biol. Chem 270 30392-30400のプロトコ
ルに基づく方法において、硫酸アンモニウムによって、次いで親水性クロマトグ
ラフィーによって精製する。フラビンレダクターゼ精製は、細菌ホモゲニゼーシ
ョンおよび硫酸アンモニウムフラクショネーションによるFieschiの手法に従う
。この時点でフラビンレダクターゼ活性が沈殿する。沈殿物を遠心分離によって
収集し、２５ｍＭトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．５０．５ＭＫＣｌ１０％グリ
セロール中に再懸濁する。引用によりによりここにその全体を含ませるFontcave
et al J Biol Chem 1987 Sep 5; 262(25):12325-31の方法は、次いで完了する
。収集した精製Ｆｒｅサンプルのタンパク質濃度は、２１マイクログラム／ｍｌ
である。それぞれの反応物は２０マイクロリッターＰｒｎＡ、１６０マイクロリ
ッターの前記ＮＡＤＨ混合物および２０マイクロリッターのＦｒｅを含む。得ら
れる正味の産物形成は２１．４６＋／−１．０２ｎモル７−Ｃｌ−Ｔｒｐであっ
た。

【００９４】２．Ｐ２によるＰｒｎＡの活性化Ｐ２は、イオン交換クロマトグラフィーによって精製されるPseudomonas fluo
rescensからの電子トランスフェラーゼタンパク質調製物であり、そして本発明
の背景に前記している。それはＰｒｎＡ活性を有しない。Ｐ２サンプルのタンパ
ク質濃度は４．８ｍｇ／ｍｌである。それぞれの反応物は、２０マイクロリッタ
ーＰｒｎＡ、１６０マイクロリッターのＮＡＤＨ混合物および２０マイクロリッ
ターのＰ２を含む。得られる正味の産物形成は１２．５０＋／−２．０２ｎモル
７−Ｃｌ−Ｔｒｐである。

【００９５】３．ホウレンソウニトレートレダクターゼによるＰｒｎＡの活性化ホウレンソウニトレートレダクターゼの組換えＦＡＤ−ドメイン（以後「ＳＮ
ＩＲ）（１８．６マイクロモル）。それぞれの反応物は、２０マイクロリッター
ＰｒｎＡ、１６０マイクロリッターのＮＡＤＨ混合物および２０マイクロリッタ
ーのＳＮＩＲを含む。得られる正味の産物形成は０．０４８＋／−０．７３ｎモ
ル７−Ｃｌ−Ｔｒｐである。

【００９６】４．AspergillusニトレートレダクターゼによるＰｒｎＡの活性化 Aspergillus sp.からのニトレートレダクターゼ、（１０Ｕ／ｍｌ）を、ＩＣ
Ｎから購入した。それぞれの反応物は２０マイクロリッターＰｒｎＡ、１６０マ
イクロリッターのＮＡＤＨ混合物および２０マイクロリッターのニトレートレダ
クターゼを含む。得られる正味の産物形成は１．４９＋／−０．１８ｎモル７
−Ｃｌ−Ｔｒｐであった。

【００９７】５．ラットＮＡＤＨ−チトクローム−ｂ５−レダクターゼによるＰｒｎＡの活性
化ラット肝臓チトクロームｂ５レダクターゼの組変え可溶性ドメイン（１１．７マ
イクロモル）を取得する。それぞれの反応物は、２０マイクロリッターＰｒｎＡ
、１６０マイクロリッターのＮＡＤＨ混合物および２０マイクロリッターのチト
クロームｂ５レダクターゼを含む。正味の産物形成は０．３１＋／−０．１１ｎ
モル７−Ｃｌ−Ｔｒｐであった。

【００９８】６．ジアフォラーゼスルフヒドリルレダクターゼによるＰｒｎＡの活性化ジアフォラーゼスルフヒドリルレダクターゼ（２００Ｕ／ｍｌ）をUnited Sta
tes Biochemicalsより購入する。それぞれの反応物は、２０マイクロリッターＰ
ｒｎＡ、１６０マイクロリッターのＮＡＤＨ混合物および２０マイクロリッター
のジアフォラーゼを含む。正味の産物形成は２．２４＋／−０．０４ｎモル７−Ｃｌ−Ｔｒｐであった。

【００９９】７．ウサギＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−Ｐ４５０レダクターゼによるＰｒｎＡの活性化ウサギ肝臓ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−Ｐ４５０レダクターゼ（０．０６９ｍｇ／ｍ
ｌ）をSigma Chemical Co.より購入する。それぞれの反応物は、２０マイクロリ
ッターＰｒｎＡ、１６０マイクロリッターのＮＡＤＰＨ混合物および２０マイク
ロリッターのチトクロームＰ４５０レダクターゼを含む。得られる正味の産物形
成は３．３５＋／−０．２３ｎモル７−Ｃｌ−Ｔｒｐであった。

【０１００】実施例２： E.coliフラビンレダクターゼによるＰｒｎＡの活性化；ホウレンソ
ウフェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、ホウレンソウフェレドキシンＮＡＤＰ
レダクターゼ＋ホウレンソウフェレドキシン；およびPhotobacterium fischeri
NAD(P)H:FMNレダクターゼ以下の構成要素を以下の実施例１−４で使用する：０．３６ｍｇ／ｍｌのＰｒ
ｎＡ（前記実施例１で記載）、ＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ）、グルコース−６−フ
ォスフェート、ジナトリウム塩（５０ｍＭ）、Ｄ−Ｔｒｐ（５ｍＭ）、ＮａＣｌ
（５ｍＭ）を含むアッセイ混合物。Aspergillus nigerカタラーゼ（３９Ｕ／ｍ
ｌ）、ウシ赤血球スーパーオキシドジムスターゼ（１５Ｕ／ｍｌ）、Leuconosto
c mesenteroidesグルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（１０Ｕ／
ｍｌ）。ＮＡＤＨ−（３ｍｇ／ｍｌ）ＮＡＤＰＨ（３ｍｇ／ｍｌ）。

【０１０１】それぞれのアッセイは、アッセイ混合物、ＮＡＤＨ（ＦｒｅおよびＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ：ＦＭＮレダクターゼを含んでいるサンプルについて）またはＮＡＤＰＨ（
ＦＮＲまたはＦＮＲおよびＦｄを含んでいるサンプルについて）のいずれか、Ｐ
ｒｎＡおよび指摘される電子トランスフェラーゼを含む。ネガティブコントロー
ルサンプルをパラレルでインキュベーションする；これらはバッファーをＰｒｎ
Ａで置換した。定量標準を１００マイクロリッターアッセイ混合物中の０、１、
２または５マイクロリッターの７−Ｃｌ−Ｔｒｐ標準（１ｍＭ）、５０マイクロ
リッターＮＡＤＨ、２０マクロリッターＰｒｎＡおよび５０マイクロリッターバ
ッファーの希釈によって調製する；管を１００℃に加熱し、次いでＰｒｎＡを添
加し、次いでさらに２分間熱した。さらなる修飾を酵素的反応とパラレルでおこ
なう。すべてのサンプルを室温で２時間混合する。反応を停止させ、そしてサン
プルを前記実施例１に記載のように修飾し、実施例１に記載のようなＨＰＬＣ分
析法ＰｒｎＡ１を使用することを含む。

【０１０２】１．ＦｒｅによるＰｒｎＡの活性：１００マイクロリッターアッセイ混合物、５
０マイクロリッターのＮＡＤＨ、２０マイクロリッターＰｒｎＡおよび５０マイ
クロリッターＦｒｅ（０．８４マイクログラム／ｍｌ）を前記のように混合する
。生産された正味の７−Ｃｌ−Ｔｒｐは８．４４ｎモルであった。２．フェロドキシンＮＡＤＰレダクターゼによるＰｒｎＡの活性：１００マイク
ロリッターアッセイ混合物、５０マイクロリッターのＮＡＤＨ、２０マイクロリ
ッターＰｒｎＡおよび５０マイクロリッターのＦＮＲ（４．１マイクロリッター
）を前記のように混合する。生産された正味の７−Ｃｌ−Ｔｒｐは４．２２ｎモ
ルであった。３．フェロドキシンＮＡＤＰレダクターゼおよびフェロドキシンによるＰｒｎＡ
の活性：１００マイクロリッターアッセイ混合物、５０マイクロリッターのＮＡ
ＤＨ、２０マイクロリッターＰｒｎＡおよび５０マイクロリッターのＦＮＲ（４
．１マイクロリッター）およびＦｄ（７マイクロモル）を前記のように混合する
。生産された正味の７−Ｃｌ−Ｔｒｐは９．１５ｎモルであった。４．Photobacterium fischeri NAD(P)H:FMNレダクターゼによるＰｒｎＡの活性
：１００マイクロリッターアッセイ混合物、５０マイクロリッターのＮＡＤＨ、
２０マイクロリッターＰｒｎＡおよび５０マイクロリッターのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：
ＦＭＮレダクターゼであってRocheから購入したもの（４U／ｍｌ）を前記のよう
に混合する。生産された正味の７−Ｃｌ−Ｔｒｐは０．１１ｎモルであった。

【０１０３】実施例３：ＰｒｎＣによるインビトロハロゲン化反応Ｆｒｅ、フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、フェロドキシンおよびＮＡＤ
ＰＨＦＭＮ−レダクターゼを以下に記載のように内因性電子トランスフェラー
ゼ（Ｐ２）を奪うP.fluorescens PrnCを活性化する能力について試験する。Ｐｒ
ｎＣはモノデクロロアミノピロールニトリン（ＭＤＡ）の塩素化を触媒し所望の
ピロールニトリン（ＡＰＲＮ）を得る。

【０１０４】以下に記載のアッセイでの使用のために、以下の材料を調製する。バッファー
１００ｍＭトリス／Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５。モノデクロロアミ
ノピロールニトリン（ＭＤＡ）７４．２ｍＭを、引用によりその全体をここに
含ませる（Kirner et al, 1998）に記載されたようにＰｒｎＡおよびＰｒｎＢを
発現しているPseudomonas fluorescensの培養によって調製する。アッセイ混合
物は、バッファー中のＦＡＤ（５μＭ）およびＭＤＡ（７４２μＭ）を含む。Ｎ
ＡＤＨを６ｍｇ／ｍｌの濃度でバッファー中に溶解する。またはＮＡＤＰＨをバ
ッファー中に６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。エキストラクト＃１は前記実施例
１に記載のＰｒｎＣおよび電子トランスフェラーゼＰ２を含んでいるバッファー
中の粗エキストラクトである。ＰｒｎＣを、クロモソームｐｒｎＣオペロンが削
除されたがプラスミドｐＰＥＨ−ＰｒｎＣ（Kirner et al, 1998）上でｔａｃプ
ロモーターの後方でＰｒｎＣをコードしている核酸配列（配列番号４）を含むP.
fluorescens細菌（pPEH/prnC/134Δprn）で発現させる。この系ではｔａｃプロ
モーターは、ＰｒｎＣの構成的発現をもたらす。エキストラクト＃２、エキスト
ラクト＃１中のＰｒｎＣを、エキストラクト＃１をアニオン交換樹脂と混合し、
次いで遠心分離によって樹脂を除去することによって精製する。P.fluorescens
P2活性を奪うために、１００ｍＭトリスＣｌバッファーを使用する。

【０１０５】以下に記載のアッセイを、以下のようにおこなう：エキストラクト＃２を指摘
される電子トランスフェラーゼ、アッセイ混合物およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈのいずれかであって指摘されるものと混合する。Ｐ２活性の除去の前のＰｒｎ
Ｃのネイティブ活性を、エキストラクト＃１をアッセイ混合物およびＮＡＤＨと
混合するパラレルサンプルによって決定する。すべてのサンプルを終夜転回によ
って混合し、ついで反応を１０マイクロリッターＫＯＨ（６Ｍ）の添加によって
停止させ、次いで酢酸エチル（１ｍｌ）で抽出する。０．６ｍｌの有機溶液層を
別の管に除去し、そして溶媒を真空遠心分離によって除去する。残渣を２００マ
イクロリッターの６０／４０Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_３ＣＮ＋１００マイクロリッターＣ
Ｈ_３ＣＮ中に再溶解する。サンプルを０．２μｍナイロンフィルターを経由して
濾過し、粒子性材料を除去する。サンプルを以下に記載のＰｒｎＣＩｓｏ法に
よって分析する。ＰｒｎＣ活性をＡＰＲＮおよびＭＤＡのピーク面積の合計に対
するＡＰＲＮピーク面積の１００倍の比率で発現させる。２２０ｎｍで等しい吸
光係数を仮定するならば、算出された比率はハロゲン化によるＭＡＤのＡＰＲＮ
への正味％変換と均等である。

【０１０６】ＨＰＬＣ分析方法ＰｒｎＣＩｓｏ使用するＨＰＬＣ装置はフォトダイオードアレイディテクターを有するWaters
Alliance HPLCシステムであり、そしてC-18-Sillica、粒子サイズ３マイクロメ
ーターで充填された４．６ｘ５０ｍｍカラムを備えている。ＨＰＬＣ方法はアイ
ソクラチック（isotratic）溶出方法であって流速が１．５ｍｌ／分でありそし
て溶媒が５８：４２比率の水：アセトニトリルであるものである。吸光度データ
を２１０ないし４００ｎｍで収集し２．４ｎｍの分解能および５／ｓのサンプリ
ング速度である。系をインジェクションの前に最低６分間予め平衡させる。イン
ジェクション体積は５０マイクロリッターでありデータ収集時間６分、次いで次
のサンプルのインジェクション前のアイソクラチック（isocratic）溶出の付加
的な６分である。ＭＤＡはこの方法では２．１６分で溶出し、そしてアミノピロ
ールニトリン（ＡＰＲＮ）は３．０５分で溶出する。タンパク質濃度をvendor(Pierce)によって記載された標準手法を使用するＢＣ
Ａ法によって決定する。

【０１０７】１．E.coli FreでのＰｒｎＣ活性：５０マイクロリッターのエキストラクト＃
２を２０マイクロリッターのE.coliフラビンレダクターゼ、（２１マイクログラ
ム／ｍｌ）、１００マイクロリッターアッセイ混合物、および５０マイクロリッ
ターＮＡＤＨと混合する；終夜連続混合、次いで前記の様な産物分析。ＭＤＡの
ＡＰＲＮへの５１．８％変換の観察された活性。２．ホレンソウフェロドキシンＮＡＤＰレダクターゼでのＰｒｎＣ活性：５０
マイクロリッターのエキストラクト＃２を２０マイクロリッターのホウレンソウ
フェレドキシン：ＮＡＤＰレダクターゼ（２０．７マイクロモル）、１００マイ
クロリッターアッセイ混合物、および５０マイクロリッターＮＡＤＨと混合する
；終夜連続混合、次いで前記のような産物分析。ＭＤＡのＡＰＲＮへの１．８％
変換の観察された活性。

【０１０８】３．ホウレンソウフェロドキシンＮＡＤＰレダクターゼおよびホウレンソウフェ
ロドキシンでのＰｒｎＣ活性：５０マイクロリッターのエキストラクト＃２を
２０マイクロリッターのホウレンソウフェロドキシン：ＮＡＤＰレダクターゼ（
２０．７マイクロモル）およびホウレンソウフェレドキシン（Ｆｄ）（３５マイ
クロモル）、１００マイクロリッターアッセイ混合物、および５０マイクロリッ
ターＮＡＤＨと混合する；終夜連続混合、次いで前記のような産物分析。ＭＤＡ
のＡＰＲＮへの２．５％変換の観察された活性。４．ＮＡＤＰＨＦＭＮレダクターゼでのＰｒｎＣ：５０マイクロリッターの
エキストラクト＃２を、Photobacterium fischeriからの２０マイクロリッター
のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮレダクターゼ（１０Ｕ／ｍｌ）、１００マイクロリッ
ターアッセイ混合物、および５０マイクロリッターＮＡＤＨと混合する。終夜連
続混合、次いで前記のような産物分析。ＭＤＡのＡＰＲＮへの４．０％変換の観
察された活性。５．Ｐ２活性の除去の前のＰｒｎＣのネイティブ活性を、エキストラクト＃１（
５０マイクロリッター）をアッセイ混合物（１００マイクロリッター）およびＮ
ＡＤＨ（５０マイクロリッター）と混合するパラレルサンプルによって決定する
；終夜連続混合、次いで前記のような産物分析。ＭＤＡのＡＰＲＮへの７．８％
変換の観察された活性。

【０１０９】実施例４：E.coliにおけるハロゲン化 E.coliフラビンレダクターゼをコードしている核酸のクローニング E.coliフラビンレクダクターゼ（以後「ｆｒｅ」）をコードしている核酸配列
をE. coli株ＫＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene）から、プライマー５’−GCGCGAATT
C ATGACAACCT TAAGCTGTAA AGTGACC（配列番号３２）および３’−GCGCCTGCAG TC
AGATAAAT GCAAACGCAT CGCC（配列番号３３）を使用してＰＣＲ複製する。次いで
核酸分子をＴｏｐｏクローン化し（Invitrogen）、E. coliＸＬ−１Blue（Strat
agene）に形質転換し、そして形質転換体をアンプリコンで補足されたLuria bro
th(LB)固形培地上に置くことによって選択する。いくつかのコロニーを選択し、
ＤＮＡシーケンシングによって分析し、それらの同一性を確認する。これらのう
ちのひとつは報告されたｆｒｅ（Genbank accession23486）のものに同一な配列
を含んでいる核酸分子を保有すると見出された。第２のものは、Ｌｙｓ８３のＧ
ｌｕ８３への負荷されたアミノ酸置換を生じたヌクレオチド２４７の突然変異を
含んでいる核酸配列を保有する（以後ｆｒｅ^Ｅ８３と称する突然変異体）。

【０１１０】Ｂ．ｆｒｅおよびｆｒｅ^Ｅ８３突然変異体の誘導可能過剰発現ｆｒｅおよびｆｒｅ^Ｅ８３突然変異体の誘導可能過剰発現を、野生型ｆｒｅお
よび置換突然変異体ｆｒｅ^Ｅ８３の、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）のEcoR1/P
st１部位に、ｔａｃプロモーターの制御下でのクローニングによって達成する。
形質転換後、ｆｒｅ−ｐＫＫ２２３−３、ｆｒｅ^Ｅ８３−ｐＫＫ２２３−３、お
よびエンプティーベクターｐＫＫ２２３−３を含んでいる細胞を、３７Ｃ終夜６
ｍＬＬＢ＋ａｍｐで成長させ、次いで３０ｍＬＬＢ＋ａｍｐに希釈し、５ｍ
ＭＩＰＴＧ（Fisher）５時間、そして遠心分離によって収集する。細菌ペレッ
トを４．５ｍＬ５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡプラス
０．５ｍＬ５ｍｇ／ｍＬリゾチームに２５Ｃ１５分間懸濁し、２サイクル凍
結融解に付す。氷上で１分間超音波処理後、ホモジネートを２０分間１６Ｋｘｇ
で遠心分離する。上清を次いで５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１ｍＭＥ
ＤＴＡで連続的に希釈し、１ないし１／１００００の範囲の相対濃度で８サンプ
ルを作成する。

【０１１１】それぞれの細菌エキストラクトおよび希釈した細菌エキストラクトを、２０マ
イクロリッターのエキストラクトの、１８０マイクロリッターの溶液であって７
．２マイクログラムＰｒｎＡ（０．３６マイクログラム／マイクロリッター）
、３．３マイクロモルＦＡＤ、３．３ｍＭＮａＣｌ、１．６７ｍＭＤ−Ｔ
ｒｐ、０．６７ｍｇ／ｍｌＮＡＤＨおよび５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５
からなるものへの添加によってｐｒｎＡ活性の補足についてアッセイする。反応
物を２時間３０Ｃでインキュベートする。反応を１００℃２分間加熱することに
よって停止させ、ついで２１０００ｘｇで５分間遠心分離する。上清溶液を次い
で、１０ｋＤａカットオフ遠心分離限外濾過膜を経由して濾過する。濾液を次い
で逆相ＨＰＬＣによってアッセイし、Ｄ−ＴｒｐのＤ−７−クロロトリプトファ
ンへの変換を、ＰｒｎＡ１について実施例１で前記した分析方法を使用して定量
する。エンプティーベクターｐＫＫ２２３−３を含んでいるE.Coliからのエキス
トラクトの添加は、添加エキストラクト中のマイクログラムタンパク質当たり０
．３４ｐモル７−Ｃｌ−Ｔｒｐをもたらし、ｆｒｅ^Ｅ８３−ｐＫＫ２２３−３
を含んでいるE. coliからのエキストラクトの添加は、添加エキストラクト中の
マイクログラムタンパク質当たり１．１４ｐモル７−Ｃｌ−Ｔｒｐをもたらし
た。ｆｒｅ−ｐＫＫ２２３−３を含んでいるE.coliからのエキストラクトの添加
は、添加エキストラクト中のマイクログラムタンパク質あたり３０１ｐモル７
−Ｃｌ−Ｔｒｐという結果であった。

【０１１２】フラビンレダクターゼアッセイを１０マイクロリッター細菌エキストラクトの
９９０マイクロリッター５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．５であって０．１ｍｇ／
ｍｌＮＡＤＰＨおよび９．５マイクロモルリボフラビンを含んでいるものへ
の添加によって実施する。活性が非常に高く第１の２０％の反応の観察が許容さ
れないならば、細菌エキストラクトを５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで１／１
０希釈し、次いで前記のようにアッセイする。ＮＡＤＨのＮＡＤＰへの変換を次
いで分光光度計的に３４０ｎｍで監視する。エンプティーベクターｐＫＫ２２３
−３を含んでいるE. coliからのエキストラクトの添加は、添加エキストラクト
中のマイクログラムタンパク質当たりの０．０５５ｎモルのフラビンレダクター
ゼ活性を有した。ｆｒｅ^Ｅ８３−ｐＬＬ２２３−３を含んでいるE. coliからの
エキストラクトの添加は、添加エキストラクト中のマイクログラムタンパク質当
たり０．１５７ｎモルのフラビンレダクターゼ活性を有した。ｆｒｅ−ｐＫＫ２
２３−３を含んでいるE. coliからのエキストラクトの添加は、添加エキストラ
クト中のマイクログラムタンパク質当たりの２５．４ｎモルのフラビンレダクタ
ーゼ活性を有した。このことはフラビンレダクターゼ活性の変化がハロゲン化活
性の変化に比例的であることを実証している。

【０１１３】Ｃ．ｆｒｅおよびｐｒｎオペロンのe.coliにおける共発現ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）中の完全Pseudomonas fluorescensピロールニ
トリルオペロン（５．８Ｘ／Ｎ、米国特許番号５７２３７５９に記載され、前の
引用によりここにふくまれる）をE.coliに形質転換する。Ｔａｑプロモーターを
含んでいる、ｆｒｅ配列を、ｐＫＫ２２３−３から、コンパチブル複製開始点ｐ
１５Ａを含む、ｐＡＣＹＣ１８４（ＮＥＢ）のテトラサイクリンマーカーに移転
させる。このプラスミドを次いで、５．８Ｘ／Ｎで共発現させ、そして両方のベ
クターの存在をアンピシリンおよびクロラムフェニコールによって選択する。ｆ
ｒｅのみ含んでいる宿主株をまた、ネガティブコントロールのように作成する。
それぞれの株の６０ｍＬの培養物を、２００ｒｐｍで振とうしながら４８時間３
７℃で成長させた。それぞれの培養物から５ｍｌをプラスミド分析のためにエキ
ストラクトし、一方または両方のプラスミドの存在を確認する。１５ｍＬアリコ
ートをタンパク質および活性分析のために使用する。残りの４０ｍＬのカルチャ
ーを２体積の酢酸エチルで２回エキストラクトする。酢酸エチルフラクションを
減圧で濃縮乾燥し、それから５０マイクロリッターの６：４のＨ_２Ｏ／ＣＨ_３Ｃ
Ｎおよび６０マイクロリッターのＭｅＯＨに溶かす。２０マイクロリッターの得
られる溶液を次いで、アミノピロールニトリンについてＨＰＬＣ法ＰｒｎＢＣ
Ｄによって、および以下に記載のようにピロールニトリンについて分析する。

【０１１４】ＨＰＬＣ分析法ＰｒｎＢＣＤＭＤＡ、ＡＰＲＮおよびＰＲＮの決定ＨＰＬＣ装置は、フォトダイオードアレイを有するWaters Alliance HPLCシス
テムであり、そしてC18-Silica、粒子サイズ３マイクロモルで充填された４．６
ｘ５０ｍｍカラムを備えている。ＨＰＬＣ法は勾配溶出法である。流速はずっと
１．２ｍｌ／分であり、そして吸光度データを２１０ないし４００ｎｍで収集し
、２．４ｎｍの分解能であり、５／ｓのサンプリング速度である。系を６５：３
５の比率の水：アセトニトリルで予め平衡させる。サンプルインジュエクション
に続いて、カラムを開始条件から水：アセトニトリルの４０：６０比率への線形
勾配で展開させる。アミノピロールニトリンが５．０分で溶出し、そしてピロー
ルニトリンが６．６分で溶出する。アミノピロールニトリンおよびピロールニト
リンの両方を診断波長で測定したクロマトグラムのピーク面積を積算することに
よって測定する。アミノピロールニトリンについて、３００ｎｍ吸光度を使用す
る。ピロールニトリンについて２５０ｎｍ吸光度を使用する。

【０１１５】結果は、ピロールニトリンオペロンのみを発現している細胞と比較して、ｆｒ
ｅおよびピロールニトリンオペロンを含んでいるプラスミドを共発現しているE.
coli細胞において、アミノピロールニトリン蓄積が１０倍より大きく増加し、そ
してピロールニトリン蓄積は４倍より大きく増加したことを示す。

【０１１６】実施例５：トランスジェニック植物で発現されるＰｒｎＡによるハロゲン化、次
いで精製およびインビトロのアッセイ Arabidopsis thaliana、エコタイプColumbiaであるを（アグロバクテリウム仲
介形質転換法によって）ＰｒｎＡ、ＰｒｎＢ、ＰｒｎＣ＆ＰｒｎＤであって、そ
れぞれ以下の実施例６に記載のようなユビキチンプロモーターの後方にあるもの
をコードしている、ピロールニトリンオペロンの４の核酸分子で形質転換する。

【０１１７】個々のピロールニトリン核酸分子を、適当な制限部位でｐＣＩＢ１６９（米国
特許番号５７２３７５９）であってGenbak accession numberはU74493であるP.f
luorescens BL915からのコスミドクローンを含むものからＰＣＲ複製する。核酸
分子をサブクローン化しそして配列決定する。ユビキチン３プロモーターおよび
第１イントロン（J. Callis et al(1990). Journal of Biological Chemistry 2
65:12486-12493およびS.R.Norris et al(1993)Plant Molecular Biology. 21:89
5-906）をアラビドプシスゲノムから５’ＫｐｎＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位を
含むようにＰＣＲ複製する。ユビキチンプロモーター、ｎｏｓターミネーター（
Depicker et al (1982)Journal of Molecular and Applied Genetics 1:561-573
）およびそれぞれの個々のピロールニトリン核酸分子（米国特許番号５７２３７
５９および５９９５３４８であってそれぞれ引用によりその全体をここに含ませ
るもの参照）を、修飾ｐＳｐｏｒ１ベクターにクローン化する。

【０１１８】Ｋｐｚａｋコンセンサス−３ＡＣＣヌクレオチドトリプレットを、最初のＡＴ
Ｇのすぐ５’側のそれぞれのＰｒｎＡ、Ｂ、およびＤに付加する。ＰｒｎＣ核酸
分子は修飾されていない。ＰｒｎＢの最初のＧＴＧコドンはＡＴＧコドンに変え
られている。これらの修飾は、ベクターセットｐＰＥＨ７８２６、２７、２８お
よび２９（それぞれＰｒｎＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を生じる。すべてのその他の配列は
野生型配列と共通である。ＰｒｎＡＣダブレットをｐＣＩＢ７８２６からのＫｐ
ｎＩフラグメントを、ｐＣＩＢ７８３１を生産しているｐＣＩＢ７８２８（Ｐｒ
ｎＣ）のＫｐｎＩ部位に挿入することによって構築する。４の核酸分子オペロン
を、ｐＣＩＢ７８３０からのＮｏｔＩフラグメントをｐＣＩＢ７８３２を生産し
ているｐＣＩＢ７８３１のＮｏｔＩフラグメントに挿入することによって創出す
る。ｐＣＩＢ７８３２からのＸｂａＩフラグメントを、形質転換ベクターｐＣＩ
Ｂ７８１９を生産しているバイナリーベクターｐＣＩＢ２００に挿入した。最終
的なベクターをアグロバクテリウムにエレクトロポレーションし、そしてアラビ
ドプシス形質転換に使用する。

【０１１９】 Arabidopsis thalianaをN. Bechtold et al(N. Bechtold et al(1993). C. R.
Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199)の方法によって形質転換す
る。２の形質転換系統（３および１２）および非形質転換コントロール系統を成長
させ、そして葉（１ｇ）を収集する。葉を液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕し、そ
して６ｍｌのＬＳバッファー（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭＮ
ａＣｌ）でエキストラクトする。５０００ｘｇで１５分間ペレット片に遠心分離
後、上清をグラスウールを経由して濾過し、残渣粒子を除去する。

【０１２０】ＰｒｎＡを、エキストラクト（３ｍｌ）をアフィニティーマトリックスと混合
することによって免疫精製する。アフィニティーマトリックスを、１００マイク
ロリッターのウサギ抗ヤギ−ＩｇＧ−アガロース（Sigmaから購入した）を５０
マイクロリッターのヤギ抗−ＰｒｎＡ血清と、室温で３０分間混合することによ
って調製する。次いでアガロースビーズを３回、１ｍｌのＬＳバッファーで洗浄
する。３ｍｌのサンプルをアフィニティーマトリックスと混合の後、非吸収材料
をＬＳバッファーで洗浄することによってビーズから除去する。ポジティブコン
トロールサンプルを実施例１で記載のようにPseudmonas fluorescensから精製し
た５マイクロリッターのＰｒｎＡ（０．３６マイクログラム／マイクロリッター
）を３ｍｌのＬＳと混合し、次いで植物エキストラクトサンプルとパラレルで処
理することによって調製する。

【０１２１】２００マイクロリッターのアッセイバッファー（５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ
７．５、５ｍＭＤ−Ｔｒｐ、５ｍＭＮａＣｌ５μＭＦＡＤ、５ｍＭグル
コース６−フォスフェート＋２ｍｇ／ｍｌＮＡＤＨ＋６．２５Ｕ／ｍｌグル
コース６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ＋４４Ｕ／ｍｌカタラーゼ＋３０Ｕ
／ｍｌＳＯＤ）および２０マイクロリッターのＦｒｅ（２１マイクログラム／
ｍｌ）であってE.coliから実施例１に記載のように精製したものを、免疫精製し
たＰｒｎＡを含むビーズに添加し、ただしそれぞれの系統３および１２の１のサ
ンプルはこの限りでない。サンプルを次いで、終夜転回によって混合し、Microc
on-10フィルターを通して濾過し、次いで産物をＨＰＬＣ法ＰｒｎＡ１（実施例
１に前記）によってアッセイする。サンプルのインジェクション体積は５０マイ
クロリッターである。７−Ｃｌ−Ｔｒｉｓの以下のレベルを見出した：ポジティ
ブコントロール（外因性ＰｒｎＡを非形質転換植物エキストラクトに添加）１８
５ｐモル、系統３＋Ｆｒｅ（２の別個のサンプル）８３ｐモルおよび１１３ｐモ
ル、Ｆｒｅを欠く系統３は０ｐモル、Ｆｒｅを有する系統１２（２の別個のサン
プル）１２０ｐモルおよび６４ｐモル、Ｆｒｅを欠く系統１２は０ｐモル、非形
質転換コントロール０ｐモル。これらのデータは、形質転換植物が活性がＦｒｅの添加に依存した活性でＰｒ
ｎＡを発現することを実証している。

【０１２２】実施例６：トランスジェニック植物におけるハロゲン化Ａ．E.coliフラビンレダクターゼをコードしている核酸の、ＰｒｎＡ、ＰｒｎＢ
、ＰｒｎＣおよびＰｒｎＤをコードしている核酸を含んでいる植物ヘの形質転換
によるトランスジェニック植物におけるハロゲン化化合物のサイトプラスミック
生産 E. coliからのフラビンレダクターゼをコードしている、配列番号６の核酸配
列を、ベクターｐＮＯＶ０１９にクローン化し、アラビドプシスユビキチン１０
（ＵＢ１０）プロモーター(J. Callis et al (1990). Journal of Biological C
hemistru 265:12486-12493およびS. R. Norris et al (1993)Plant Molecular B
iology.21:895-906)の制御下で、そしてアグロバクテリウムからのノパリンシン
ターゼターミネーター（Depicker et al(1982)Journal of Molecular and Appli
ed Genetics 1:561-573）で終結される核酸分子におく。

【０１２３】ｐＮＯＶ５０７（Ｋａｎ^Ｒ）、５０８、（Ｃｈｌｏｒ^Ｒ）および５０９、（Ａ
ｍｐ^Ｒ）からなるバイナリーベクター系を完成する。３のベクターを使用しｆｒ
ｅ核酸分子を有するピロールニトリンオペロンを構築し、そして除草剤抵抗性選
択可能マーカーは以下の通りである。ｐＮｏｖ５０７（Ｋａｎ^Ｒ）は、いずれの
プロモーター、ターミネーター、ピロールニトリン、ｆｒｅ、または選択可能マ
ーカー核酸分子においても見出されない独特な制限部位の選択で置換されたレフ
トおよびライトボーダーの間のポリリンカーを有するバイナリーベクターである
。他の２のベクターｐＮＯＶ５０８（ＣｈｌｏｒＲ）およびｐＮＯＶ５０９（Ａ
ｍｐＲ）はピロールニトリンオペロンについての別個の核酸分子カセットをクロ
ーニングのために付加された付加的な制限部位とｐＮＯＶ５０７ポリリンカーの
一部を含むベクターである。これらの２のベクターは構築またはアセンブリベク
ターである。ｐＮＯＶ１１１からのＵＢ３−選択可能マーカーカセットとともに
ｆｒｅカセットを一緒にｐＮＯＶ５０９においてライゲートする。このダブルカ
セットを次いでバイナリーベクター、ｐＮＯＶ５０７に移転させ、最終的なベク
ターｐＮＯＶ５１０を得る。ベクターをアグロバクテリウムにエレクトロポレー
ションする。実施例５に記載のようなＰｒｎＡ、ＰｒｎＢ、ＰｒｎＣおよびＰｒ
ｎＤ核酸分子で形質転換されているArabidopsis theliana系統を、N. Bechtold
et al(N. Bechtold et al(1993)C. R. Acad. Sci. Paris Life Science 316:119
4-1199)の方法によって形質転換する。

【０１２４】植物のすべてのピロールニトリン経路核酸分子および種々の構築物は、アラビ
ドプシススユビキチン（ＵＢ３）プロモーター（J. Callis et al(1990)Journal
of Biological Chemistry 265:12486-12493.およびS. R.Norris et al(1993)Pl
ant Molecular Biology. 21:895-906）によって駆動され、そしてアグロバクテ
リウムからのｎｏｓターミネーターで終結される。ＰｒｎＡ、ＰｒｎＢ、Ｐｒｎ
ＣおよびＰｒｎＤを有するホモ接合性アラビドプシス系統、および野生型コロン
ビアを、前記のN. Bechtold et alの方法によるアグロバクテリウムインフィル
トレーションによってｐＮＯＶ５１０で形質転換する。種子を収集し、乾燥して
土壌に植える。形質転換植物は８日間に３回０．０２５％の選択剤で実生を噴霧
することによって同定する。植物を次いでＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィ
ー−質量分析によってピロールニトリンの存在およびレベルについて確認する。
植物エキストラクトをまた、またはあるいは、前記の様にｐｒｎＡおよび／また
はｐｒｎＣ活性について確認し得る。

【０１２５】Ｂ．E.coliフラビンレダクターゼおよびピロールニトリンオペロンの共形質転換
によるトランスジェニック植物におけるハロゲン化化合物のサイトプラスミック
生産前に引用により含ませられている米国特許５７２３７５９に示されるピロール
ニトリン経路のＰｒｎＡ、ｐｒｎＢ、ＰｒｎＣ、およびＰｒｎＤをコードしてい
る核酸配列およびE. coliフラビンレダクターゼをコードしている配列番号７を
、単一ｔ−ＤＮＡ構築物において植物に導入する。それぞれのピロールニトリン
生合成核酸分子の発現は、ＵＢ３プロモーターによって駆動され、一方ｆｒｅ配
列番号７はＵＢ１０によって駆動される。すべての５の核酸分子を、−３のＡの
位置によるKozak翻訳開始配列に近いことを確認し、または確認するように変化
させた。すべての核酸分子をｎｏｓターミネーターによって終結させる。好まし
い実施態様では、最終的なベクターは、ＵＢ３プロモーター−サイトソルターゲ
ティング性ピロールニトリン生合成遺伝子およびＵＢ１０−ｆｒｅカセットを以
下のものを含むバイナリーベクターにおいてアセンブルすることによって構築す
る：ライトボーダー−ＵＢ３−ＰｒｎＡ−ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒｎＣ−ｎｏｓ−
ＵＢ３−ｐｒｎＢ−ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒｎＤ−ｎｏｓ−ＵＢ１０−ｆｒｅ−ｎ
ｏｓ−ＵＢ３−選択可能マーカー−ｎｏｓ−レフトボーダー。このベクターをｐ
ＮＯＶ５２３と命名する（配列番号３４）。

【０１２６】さらなる実施態様では、サイトソルターゲティング性ピロールニトリンオペロ
ンを、ｐＣＩＢ７８３０からのＮｏｔＩＡ／ＢダブレットフラグメントをＣ／Ｄ
ダブレットベクターｐＣＩＢ７８３１にライゲートすることによって創出する。
このオペロンをＸｂａＩカセットとしてｐＮＯＶ５０７に移転させる。ｐＣＩＢ
１０２５３からのＮｏｔＩＡ／Ｂダブレットを、Ｃ／ＤダブレットベクターｐＣ
ＩＢ１０２５４にライゲートする。この構築物をまた、ＸｂａＩカセットとして
ｐＮＯＶ５０７に移転させる。最終的なベクターは以下のものを含む：ライトボーダー−ＵＢ３−ｐｒｎＡ−
ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒｎＢ−ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒｎＣ−ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒ
ｎＤ−ｎｏｓ−ＵＢ１０−ｆｒｅ−ｎｏｓ−ＵＢ３−選択可能マーカー−ｎｏｓ
−レフトボーダー。

【０１２７】このベクターを次いで、アグロバクテリウムにエレクトロポレーションし、そ
してアグロバクテリウムインフィルトレーション（N. Bechtold et al (1993).C
.R.Acad.Sci.Paris, Life Sciences 316:1194-1199）によって、アラビドプシス
（コロンビア）に形質転換する。種子を収集し、乾燥しそして土壌に植える。形
質転換植物を８日間に３回０．０２５％の選択剤で実生を噴霧することによって
同定する。植物を次いで、ＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィー−質量分析に
よってピロールニトリンの存在またはレベルについて確認する。

【０１２８】Ｃ．トランスジェニック植物のプラスチドにおけるハロゲン化化合物の生産ｐｒｎＡおよびＢをコードしている核酸構築物を、クロロプラスト移行ペプチ
ド（Wong, E.Y. et al(1992)Plant Molecukar Biology vol.20:81-93.）を発現
し、そしてカナマイシンで選択の可能であるベクターとともに位置するように改
変する。形質転換プロトコールは先の実施例の詳細のとおりである（N. Bechtol
d et al (1993). C. R. Acad. Sci. Paris, life Sciences 316:1194-1199）。

【０１２９】プラスチドターゲティング性ピロールニトリン核酸分子ベクターの構築。個々のピロールニトリン経路核酸分子を、ｐＣＩＢ１０２３０、３１、３２、
３３（それぞれＰｒｎＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）から、５’ＮｈｅＩおよび３’ＢａｍＨ
Ｉ制限部位を含むように、ＰＣＲ複製する。これらの核酸分子を、配列確認のた
めに、ｐＣＲ２．１（Invitrogen,US Office Carlsbad, CA92008,カタログナン
バーK2030-01）にＴｏｐｏクローン化する。ＲｕＢＰカーゼ小サブユニットペプ
チド移行配列をｐＦＬ６１のアラビドプシスｃＤＮＡライブラリー（Wong et al
., 1992, Plant Mol Biol 20:81-93）からＰＣＲ複製する。この核酸配列を、ｐ
ＰＥＨ３１、３０、２９、２８（それぞれＰｒｎＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）のそれぞれの
ピロールニトリン核酸分子の５’末端にライゲートする。ｐＰＥＨベクターセッ
トはＵＢ３−イントロン−ｎｏｓカセットを含む。付加的な成熟ペプチドを相補
的オリゴとして合成し、アニーリングし、そして移行ペプチドピロールニトリン
核酸分子構築物の５’部分にライゲートする。これはプラスチドターゲティング
性ピロールニトリン核酸分子ベクターｐＣＩＢ１０２４９、５０、５１および５
２（それぞれＰｒｎＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を生産した。ＰｒｎＡＢダブレットｐＣＩ
Ｂ１０２５３をｐＣＩＢ１０２４９からのＫｐｎＩ核酸分子カセットを含んでい
るＰｒｎＡをｐＣｉｂ１０２５０にライゲートすることによって創出した。Ｐｒ
ｎＣＤダブレット、ｐＣＩＢ１０２５４をｐＣＩＢ１０２５１からのＸｈｏＩ核
酸分子カセットを含んでいるＰｒｎＣをｐＣＩＢ１０２５２にライゲートするこ
とによって創出した。それぞれのダブレットをＸｂａＩカセットとしてバイナリ
ーベクターｐＣＩＢ２００（ＫａｎＲ）に移転させた。プラスチドターゲティン
グ性ベクターのための選択可能マーカースキームは以下の通りであった：ｆｒｅ
ベクターのために、ライトボーダー−ＵＢ１０−ｃｌｐ−ｆｒｅ−ｎｏｓ−ＵＢ
３−選択可能マーカー−ｎｏｓ−レフトボーダー；ＰｒｎＡ／Ｂベクターのため
に、ライトボーダー−ＵＢ３−ｐｒｎＡ−ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒｎＢ−ｎｏｓ―
―ＵＢ３−選択可能マーカー−ｎｏｓ−レフトボーダーおよびＰｒｎＣ／Ｄのた
めにライトボーダー−ＵＢ３−ｐｒｎＣ−ｎｏｓ−ＵＢ３−ｐｒｎＤ−ｎｏｓＵ
Ｂ３−選択可能マーカー−ｎｏｓ−レフト。

【０１３０】プラスチドターゲティング性ｐｒｎＡＢ−ｆｒｅベクターを次いで、アグロバ
クテリウムにエレクトロポレーションし、そして前記の様にN.Bechtold et alの
方法を介してアラビドプシスコロンビアを形質転換する。種子を収集し、乾燥し
、そして土壌に植える。形質転換した植物を選択剤で実生を噴霧することによっ
て同定し、そしてホモ接合性とするために自殖する。同様に、プラスチドターゲ
ティング性ｐｒｎＣＤ／選択可能マーカーベクターを前記の様にアラビドプシス
に導入し、そして得られる形質転換体をホモ接合性のために自殖する。

【０１３１】プラスチドターゲティング性ｐｒｎＡＢ−ｆｒｅ／選択可能マーカー構築物を
含んでいるホモ接合性形質転換植物をついで、ホモ接合性プラスチドターゲティ
ング性ｐｒｎＣＤ／選択可能マーカー植物と交雑する。さらなる実施態様では、
プラスチドターゲティング性ｐｒｎＣＤカセットをＵｂ１０−プラスチドターゲ
ティング性ｆｒｅカセットを含んでいるバイナリーベクターに移転させる。この
ベクターはｐＮＯＶ５２４として知られる（配列番号３５）。ベクターｐＮＯＶ
５２４を次いで、アグロバクテリウムにエレクトロポレーションし、そして前記
のようなN. Bechtold et alの方法によりアラビドプシスコロンビアを形質転換
するために使用する。野生型アラビドプシスおよびｐＣＩＢ１０２５３で先に形
質転換したアラビドプシス（プラスチドターゲティング性ｐｒｎＡ／Ｂを含んで
いる）の両方をｐＮＯＶ５２４で形質転換する。種子を収集し、乾燥し、そして
土壌に植える。形質転換した植物を選択剤で実生を噴霧することによって同定し
、そしてホモ接合性とするために自殖する。得られる後代を適当な選択剤に付する。この選択剤レジームに抵抗性のある植
物はホモ接合性状態でｆｒｅおよびｐｒｎＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを保有する。当
業者はこのアプローチで多くの変形が可能であることを認識する。すべての場合
にピロールニトリン発現をＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィーによって定量
する。

【０１３２】実施例７：ＭＤＡを供給されたトランスジェニック植物葉において発現されたＰ
ｒｎＣによるハロゲン化バスタ選択に続いて、ｐＮＯＶ５２４構築物（プラスチドターゲティング性ｐ
ｒｎＣ、ｐｒｎＤおよびｆｒｅを含んでいる）で形質転換されたコロンビア系統
のウェスタンブロット分析を実施する。加えて、バスタ選択に続いて、ｐＣＩＢ
１０２５３（プラスチドターゲティング性ｐｒｎＡおよびｐｒｎＢを含んでいる
）で形質転換され、そして次いでｐＮＯＶ５２４で形質転換されたアラビドプシ
ス系統のウェスタンブロット分析を実施する。それぞれの系統からの単一の葉を
１Ｘタンパク質サンプルバッファーにおいてホモジネートし、煮沸し、そして１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離する。その後に、その膜は、それぞれｐｒｎ
ＣおよびｐｒｎＤに対してレイズされた抗体でｐｒｎＣおよびｐｒｎＤタンパク
質の存在について探査する。ｐｒｎＣおよびｐｒｎＤ発現についてポジティブで
あるアラビドプシス系統を同定する。同じタンパク質エキストラクトを、１０−
２０％勾配ゲルを使用してフラビンレダクターゼ（ｆｒｅ）タンパク質の存在に
ついて再試験し、そしてその後にｆｒｅに対してレイズされた抗体で膜を探査す
る。ｆｒｅ発現についてポジティブの系統を同定する。

【０１３３】ウェスタンブロットによってプラスチドターゲティング性ｐｒｎＣ、ｐｒｎＤ
およびｆｒｅ発現についてポジティブなアラビドプシス系統からおよびさらにｐ
ｒｎＣおよびｐｒｎＤについてネガティブであるアラビドプシス系統から葉を取
る。葉を５ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５．７）；４００ｍＭマンニトールバッファーに
沈めつつＭＤＡでバキュームインフィルトレーションし、そして暗黒で室温で終
夜放置する。その後、バッファーを酢酸エチルで抽出し、濃縮し乾燥しそしてＨ
ＰＬＣで分析する（先の実施例４で記載のように）。

【０１３４】ｐｒｎＣ、ｐｒｎＤおよびｆｒｅについてポジティブである植物からの葉はＭ
ＤＡをＡＰＲＮに変換する（およそ５％）。変換を３時間以内のインキュベーシ
ョン時間で検出する。さらに、およそ３０％のＡＰＲＮはピロールニトリンに変
換される。加えて、ネガティブコントロール、ｐｒｎＣまたはｐｒｎＤを発現し
ていない植物からの葉は、ＭＤＡのＡＰＲＮまたはピロールニトリンへの変換を
示さない。前に記載の引用刊行物はすべて引用によりそれらの全体をここに含める。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 17/10 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クリス・ベイティーアメリカ合衆国27701ノースカロライナ州ダーラム、モンマス・アベニュー303番 (72)発明者ジョン・マーキス・ディーツアメリカ合衆国27502ノースカロライナ州エイペックス、ジェンクス−カーペンター・ロード1411番 (72)発明者ジャン・ドンアメリカ合衆国50131アイオワ州ジョンストン、シャンベリー・ブールバード811番 (72)発明者キム・プロマ・カムダーアメリカ合衆国27514ノースカロライナ州チャペル・ヒル、イースト・チャーチ 10374番 (72)発明者スティーブ・ヒルアメリカ合衆国27511ノースカロライナ州ケリー、メラニー・レイン311番Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA08 BA11 CA03 DA06 EA04 GA11 4B064 AE49 CA02 CA07 CA11 CA19 CA21 CB30 CC24 DA11 4B065 AA26X AA26Y AA88X AA88Y AC14 BA02 CA18 CA29 CA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸化剤、ハロゲン供与体、電子トランスフェラーゼ、および
還元剤の存在下で、基質を位置特異的ハロゲナーゼと接触させることを含む、位
置特異的な態様でハロゲンを基質に転移させる方法であって、ここで該転移がイ
ンビボで起こるならば、電子トランスフェラーゼがヘテロロガス核酸分子によっ
てコードされる、方法。
【請求項２】ＦＡＤまたはＦＭＮ構成要素をさらに含む、請求項１の方法
。
【請求項３】さらなる構成要素がＦＡＤである、請求項２の方法。
【請求項４】電子トランスフェラーゼが、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまた
はフェレドキシンからＦＡＤへの電子転移を触媒することのできる酵素である、
請求項２の方法。
【請求項５】電子トランスフェラーゼが、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨまた
はフェレドキシンから部位特異的ハロゲナーゼへの電子転移を触媒することので
きる酵素である、請求項２の方法。
【請求項６】電子トランスフェラーゼが、フラビンレダクターゼ、フェロ
ドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、フェレドキシン、ジアフォラーゼ−スルフヒド
リルレダクターゼまたはＮＡＤＨ−ｃｙｔ−Ｂ５レダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−Ｆ
ＭＮレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔ−ｐ４５０レダクターゼまたはニトレー
トレダクターゼである、請求項２の方法。
【請求項７】電子トランスフェラーゼが、配列番号１９、２１、２３、２
５、２７、２９または３１に記載のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも３０％
同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６の方法。
【請求項８】電子トランスフェラーゼが、配列番号１９、１２、２３、２
５、２９または３１のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項７の方法。
【請求項９】位置特異的ハロゲナーゼが、ｐｒｎＡ、ｐｒｎＣ、ピロール
ニトリンハロゲナーゼｐｌｔＡ、ｐｌｔＤ、およびｐｌｔＭ、テトラサイクリン
ハロゲナーゼｃｔｓ４、ヒドロラーゼａ、またはバルヒマイシンハロゲナーゼｂ
ｈａＡである、請求項１の方法。
【請求項１０】位置特異的ハロゲナーゼが、配列番号１を含む、請求項９
の方法。
【請求項１１】位置特異的ハロゲナーゼが、配列番号３、５、７、９、１
１、１３、１５または１７のいずれかのアミノ酸ドメインを含んでいるポリペプ
チドである、請求項１０の方法。
【請求項１２】配列番号１８、１０、２２、２４、２６、２８、または３
０のいずれかに実質的に類似であるヘテロロガス核酸、および配列番号２、４、
６、８、１０、１２、１４または１６のいずれかに実質的に類似である少なくと
も１のヘトロロガス核酸を発現している宿主細胞。
【請求項１３】宿主細胞が細菌、真菌または植物細胞である、請求項１２
の宿主細胞。
【請求項１４】宿主細胞が微生物細胞である、請求項１３の方法。
【請求項１５】宿主細胞が、ｐｒｎＢおよびｐｒｎＤをコードしている核
酸配列をさらに発現する請求項１３の宿主細胞。
【請求項１６】請求項１５の宿主細胞を成長させることを含むピロールニ
トリンを生産する方法。
【請求項１７】植物を請求項１５の宿主細胞で処理し、それによって病原
体を阻害する量で、ピロールニトリンを宿主によって生産させることを含む、病
原体に対して植物を保護する方法。
【請求項１８】宿主からピロールニトリンを収集することをさらに含む、
請求項１６の方法。
【請求項１９】請求項１４の宿主細胞を含む植物。
【請求項２０】請求項１５の宿主細胞を含む植物。
【請求項２１】請求項２０の植物を成長させ、それによって病原体を阻害
する量で、植物でピロールニトリンを生産させることを含む、病原体に対して植
物を保護する方法。
【請求項２２】請求項２０に記載の植物の種子。
【請求項２３】植物が作物植物である、請求項２１の植物を成長させるこ
とを含む、作物における真菌の成長を防止する方法。
【請求項２４】宿主において電子トランスフェラーゼをコードしているヘ
テロロガス核酸分子を発現させることを含む、宿主によるハロゲン化基質の生産
を改良する方法であって、ここで該宿主が、位置特異的ハロゲナーゼ活性を有す
る少なくとも１の内因性ポリペプチドを発現する、方法。