MXPA02005834A - Xilanasa de trichoderma reesei. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a nuevas xilanasas (referidas como XYL-IV) y a moleculas de acido nucleico que codifican para estas xilanasas. Tambien se proporcionan vectores y celulas huesped que incluyen estas secuencias de acido nucleico, anticuerpos que se unen a las xilanasas de la presente invencion, metodos para producir las xilanasas de la presente invencion y metodos para el empleo de las xilanasas de la presente invencion.

Description

XILANASA DE TRICHODERMA REESEI ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La compleja estructura de la madera incluye la celulosa, hemicelulosa y lignina, junto con otros componentes menores. La lignina está asociada con la celulosa y hemicelulosa y probablemente está enlazada, parcialmente, de manera covalente tanto a la celulosa como a la hemicelulosa. En el proceso de fabricación del papel, la lignina generalmente es removida de la pulpa de madera porque tiene un color cafezusco, reduce la resistencia e imparte otras características indeseables al producto terminado. La remoción de la lignina se puede llevar a cabo de numerosas maneras. Gran parte de la lignina inicialmente es removida de la pulpa de madera mediante la pulpación química (e.g., el proceso de Kraft) . En el subsecuente proceso de blanqueado, la pulpa química rutinariamente se hace reaccionar con cloro y otros productos químicos deslignificantes, para remover adicionalmente la lignina y después se hace reaccionar con agentes blanqueadores para modificar la lignina de la pulpa, obteniéndose una pulpa aclarada estable. Sin embargo, el tratamiento con cloro es indeseable desde el punto de vista ambiental, debido a que los flujos de salida resultantes contienen un gran número REF: 139553 de compuestos tóxicos (e.g., compuestos fenólicos clorados) . La preocupación acerca de los efectos ambientalmente peligrosos causados por el blanqueado de la pulpa con cloro que contiene productos químicos, ha llevado a la industria a buscar métodos de blanqueamiento alternativos . En la literatura científica se han descrito intentos de utilizar xilanasas y otras enzimas derivadas de hongos y bacterias, para la deslignificación y el aclarado, mientras se disminuye o elimina el uso de . compuestos químicos de cloro. Sin embargo, los sistemas enzimáticos existentes por lo general no logran fácilmente la degradación de la hemicelulosa o la deslignificación en un grado suficiente. El grado de deslignificación y degradación de la hemicelulosa se podrían mejorar empleando xilanasas adicionales que rompan el xilano de diferente manera o que actúen ' sinérgicamente con otras xilanasas, hemicelulasas y otras enzimas, o incluso compuestos químicos . Se han identificado y caracterizado numerosas xilanasas provenientes de microorganismos micóticos y bacterianos (véase e.g., la Patente Norteamericana US No. 5,437,992; Coughlin, M.P. supra; Biely, P. et al., Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Espoo 1993, P.

Souminen and T. Reinikainen eds., Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135 (1993)). En particular, se han identificado tres xilanasas especificas (XYL-I, XYL-II y XYL-III) en G. reesei (Tenkanen et al., Enzyme Microb. Technol 14:566 (1992); Tórronen, et al., Bio/Technology 10:1461 (1992); y Xu, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718 (1998)). Aunque se han descrito numerosas xilanasas en la literatura científica, todavía existe la necesidad de identificar nuevas xilanasas que sean más efectivas en aplicaciones relacionadas con los alimentos animales, el procesamiento de granos, los bioco bustibles, la limpieza, el cuidado de telas, productos químicos, procesamiento de plantas y deslignificación y aclaramiento de pulpa y papel. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los Solicitantes han identificado clonas de ADNc que codifican para una nueva xilanasa, referida en la presente como XYL-IV y tienen cierta identidad de secuencia con xilanasas previamente descritas. En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que incluye ADN que codifica para una XYL-IV. En ciertos aspectos, el ácido nucleico aislado incluye ADN que codifica para una XYL-IV que tiene la secuencia de' aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o es complementaria a tales secuencias codificadoras de ácido nucleico. De preferencia, el ADN que codifica para una proteína XYL-IV se deriva de un microorganismo/ de preferencia un hongo o una bacteria. Preferiblemente, el ADN se deriva de un hongo filamentoso tal como Trichoderma spp. , Humicola spp. , Neurospora spp. , Aspergillus spp. , Fusarium spp., Penicillium spp., o Cliocladium spp., más preferiblemente de Trichoderma spp. También de preferencia, el ADN incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. Alternativamente, el ADN tiene cuando menos 50, 60 ó 70%, de preferencia cuando menos 85% ó 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, o incluye un derivado de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en donde el ADN codifica para una proteina XYL-IV que rompe al xilano, al xilano ramificado o xilooligosacáridos . Los vectores que incluyen tal ADN, células huésped que han sido transformadas con tales vectores y los caldos de fermentación producidos por tales células huésped transformadas, también están dentro de los alcances de la presente invención. Otra modalidad de la presente invención proporciona una proteína XYL-IV parcial o totalmente aislada. De preferencia, la proteína XYL-IV se deriva de un microorganismo, preferiblemente un hongo o una bacteria. De preferencia, la proteína XYL-IV se deriva de un hongo filamentoso, más preferiblemente de un hongo filamentoso tal como Trichoderma spp. , Humicola spp. , Neurospora spp. , Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., o Gliocladium spp. y más preferiblemente de Trichoderma spp. En particular, la presente invención proporciona una secuencia nativa aislada de XYL-IV, la cual en una modalidad, incluye una secuencia de aminoácidos que abarca los residuos del 1 al 465 de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . En una modalidad preferida de la presente invención, la XYL-IV que incluye una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 tiene cuando menos 50 ó 70%, de preferencia cuando menos 85 ó 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó incluye un derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 en donde la XYL-IV derivada rompe enlaces del xilano. Todavía otra modalidad de la presente invención proporciona un método para producir la proteina XYL-IV, que incluye los pasos de (a) obtener una célula huésped que ha sido transformada con un vector que incluye ADN que codifica para una proteína XYL-IV; (b) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión y, opcionalmente, la secreción de la proteína XYL-IV; y (c) recuperar el caldo de fermentación que contiene la proteína XYL-IV. En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a la proteína XYL-IV o a un dominio de la misma. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para utilizar la proteína XYL-IV o el ADN que codifica para la proteína XYL-IV. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) de una clona de ADNc obtenida de ARN de Trichoderma reesei después de hacerlo crecer en una fuente mixta de carbono. La Figura 2 ilustra la secuencia de aminoácidos previamente citada (SEQ ID NO: 2) para una nueva XYL-IV de Trichoderma reesei. La Figura 3 ilustra ubicaciones de sitios de rompimiento de enzimas de restricción a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) . La Figura 4 ilustra la hidrólisis eficiente de HexA3Xil3. Los valores se tomaron de la Tabla 5. La Figura 5 ilustra la producción de azúcares reductores por la XYL-IV a partir de xilano, MeGlcA-xilano y arabinoxilano del centeno. Cada xilano estaba presente a 5 g/L y la reacción se llevó a cabo a 40°C y pH 4. Las Figuras 6a y 6b ilustran el sinergismo de la XYL-IV con las XYL-I y II. El producto se midió en forma de azúcar reductor (Figura 6a) y xilosa libre (Figura 6b) . Los valores se tomaron de la Tabla 6. Las Figuras 7a-d ilustran el sinergismo, en una acción por pasos, de las XYL-I y XYL-IV. En las Figuras 7a y 7b el sustrato fue MeGlcA-xilano. En las Figuras 7c y 7d el sustrato fue arabinoxilano del centeno. Los valores se tomaron de la Tabla 7. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Debe observarse que, tal como se utiliza en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el o la" incluyen referentes plurales, a menos que el contenido claramente lo especifique de otra manera. Asi pues, por ejemplo, la referencia a una composición que contiene "un compuesto" indica una mezcla de dos o más compuestos. También debe observarse que el término "o" generalmente se emplea en su sentido incluyente "y/o", a menos que el contenido lo especifique claramente de otra manera. El término "xilanasa" significa una proteina o polipéptido, el dominio de una proteina o polipéptido derivado de un microorganismo, e.g., un hongo, una bacteria o proveniente de una planta o animal y que tiene la capacidad de catalizar la degradación (rompimiento de enlaces) del xilano en una o más de varias posiciones de la estructura de carbono del xilano, incluyendo xilanos ramificados o xilooligosacáridos . Bajo ciertas condiciones, una xilanasa también puede catalizar la síntesis de un azúcar tal como un xilano o un xilooligosacárido, a partir de unidades menores. En la literatura científica se conocen tres xilanasas especificas derivadas de T. reesei . Tal como se utiliza en la presente, el término "XYL-IV" se refiere a una" enzima que tiene actividad de xilanasa y que, típicamente, en su forma nativa o tipo' silvestre, carece de un dominio de unión a la celulosa. La XYL-IV de la presente invención incluye la proteína que abarca los residuos del 1 al 465 de la Figura 2 (SEQ ID NO:2), proteínas que tienen cuando menos 50 ó 70%, de preferencia cuando menos 85 ó 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o un derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 en donde la XYL-IV degrade al xilano. La XYL-IV proporcionada por la presente invención, específicamente excluye las tres xilanasas conocidas de T. reesei, las cuales son referidas como XYL-I, XYL-II (pertenecientes a la familia de la glucosilhidrolasa 11) y XYL-III (perteneciente a la familia de glucosilhidrolasa 10) y las cuales se describen en Torrónen et al. y Xu, et al., supra) . Se piensa que la XYL-IV actúa sobre el xilano de diferente manera que las tres xilanasas conocidas de T. reesei, pero también puede realizar rompimientos de enlace (degradación) en las mismas posiciones. Se contempla en la presente que la XYL-IV se puede derivar de cualquiera de una variedad de fuentes, incluyendo un microorganismo, e.g. un hongo o una bacteria, una planta o un animal. Específicamente, se contempla que los microorganismos que poseen capacidades celulóticas serán excelentes fuentes de la proteína XYL-IV. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la XYL-IV se deriva de Trichoderma spp., particularmente Trichoderma reesei. Sin embargo, también preferiblemente, la XYL-IV y/o el ADN que codifica para XYL-IV de conformidad con la presente invención, se deriva de un hongo tal como Absidia spp. ; Acremonium spp. ; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., incluyendo A. aculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus, A. fumigatus , A. nidulans , A. niger, A. oryzae, A. terreus y A. versicolor; Aerobasidium spp.; Cephalosporum spp.; Chaetomium spp.; Coprinus spp. ; Dactylium spp.; Fusarium spp. , incluyendo F. conglomerans , F. decemcellulare, F. javanicum, F. lini, F. oxysporum y F. solani; Gliocladium spp.; Humicola spp., incluyendo H. insolens y H. lanuginosa; Mucor spp.; Neurospora spp. ; incluyendo N. crassa y N. sitophila; Neocalli astix spp. ; Orpinomyces spp. ; Penicillium spp. ; Fhanerochaete spp. ; Phlebia spp. ; Piromyces spp. ; Rhizopus spp. ; Schizophyllum spp. ; Trametes spp. ; Trichoderma spp. , incluyendo G. reesei, T. reesei (longibrachiatum) y G. viridae; y Zygorhynchus spp. De preferencia, las proteínas XYL-IV de conformidad con la presente invención se aislan o purifican. El término "purificación" o "aislamiento" significa que la proteína XYL-IV es alterada de su estado natural en virtud de separarla de algunos o todos los componentes de origen natural con los cuales está asociada en la naturaleza. Tal aislamiento o purificación se pueden llevar a cabo por técnicas de separación reconocidas en este campo, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, la separación hidrofóbica, diálisis, tratamiento con proteasa, precipitación con sulfato de amonio u otras precipitaciones de proteínas con sales, centrifugación, cromatografía de exclusión de tamaño, filtración, microfiltración, electroforesis en gel o separación en un gradiente para remover células completas, restos celulares, impurezas, proteínas extrañas o enzimas no deseadas en la composición final . Además es posible agregar componentes a la composición que contiene XYL-IV, que proporcionen beneficios adicionales, por ejemplo agentes activadores, agentes antiinhibición, iones deseables, compuestos para controlar el pH u otras enzimas. De preferencia, las proteínas XYL-IV de conformidad con la presente invención se producen por métodos récombinantes . Tal como se utiliza en la presente, el término "microorganismo" se refiere a una bacteria, un hongo, virus, protozoario y otros microbios u organismos microscópicos. Tal como se utiliza en la presente, el término "planta" se refiere a cualquier miembro del reino Plantae. Tal como se utiliza en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino Animalia. Los animales pueden ser unicelulares o pluricelulares. Tal como se utiliza en la presente, el término "derivado" significa una proteína que se deriva de .una proteína precursora (e.g., la proteína nativa) mediante la adición de uno o más aminoácidos al extremo C-terminal o N-terminal, por sustitución de uno o más aminoácidos en uno o un número de diferentes sitios en la secuencia de aminoácidos, por la deleción de uno o más aminoácidos en cualquiera de los extremos de la proteína o en uno o más -sitios de la secuencia de aminoácidos, o la inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la secuencia de aminoácidos. La preparación de un derivado de XYL-IV de preferencia se lleva a cabo modificando una secuencia de ADN que codifica para la proteína nativa, la transformación de esa secuencia de ADN en un huésped apropiado y la expresión de la secuencia de ADN modificada para formar el derivado de XYL-IV. Los "derivados" de la presente invención incluyen péptidos que contienen secuencias de aminoácidos alteradas en comparación con una secuencia de aminoácidos precursora (e.g., una XYL-IV de tipo silvestre o en estado nativo), en donde los péptidos retienen una naturaleza de XYL-IV característica del precursor, pero tienen propiedades alteradas en algún aspecto específico. Por ejemplo, un derivado de XYL-IV puede tener un pH óptimo más elevado o una mayor estabilidad a la temperatura o estabilidad oxidativa, pero retiene su característica actividad de modificación del xilano. De manera similar, los derivados de conformidad con la presente invención incluyen un dominio de unión a la celulosa, el cual ya sea fue agregado, removido, o bien, modificado de tal manera que impida o mejore significativamente su capacidad de unión a la celulosa. Un derivado de conformidad con la presente invención incluye un xilano u otro sustrato, un dominio de unión, el cual ha sido agregado o modificado para alterar su capacidad de unión al sustrato. Se contempla que los derivados de conformidad con la presente invención se derivan de un fragmento de ADN que codifica para un derivado de XYL-IV en donde la actividad funcional del derivado XYL-IV expresado sea retenida. Los derivados además incluyen modificaciones quimicas que cambian las caracteristicas de la XYL-IV. Normalmente, un derivado de XYL-IV tendrá cuando menos aproximadamente 50, 70 u 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, de preferencia cuando menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, incluso más preferiblemente cuando menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos y todavía más preferiblemente 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . Preferiblemente, cualquier sustitución de aminoácidos es (sustitución de aminoácidos conservadora) utilizando L-aminoácidos, en donde un aminoácido es reemplazado por otro biológicamente similar. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas que preservan la carga general, hidrofobicidad/hidrofi-lia, y/o volumen estérico del aminoácido que está siendo sustituido. Ejemplos de sustituciones conservadoras son aquellos entre los siguientes grupos: Gly/ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr y Phe/Trp/Tyr. Un derivado podría, por ejemplo, diferir en una cantidad tan pequeña como 1 a 10 residuos de aminoácido, tal como 6-10, una cantidad tan pequeña como 5, tan pequeña como 4, 3, 2 ó incluso 1 residuo de aminoácido. Tal como se utiliza en la presente, una "XYL-IV de secuencia nativa", incluye un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la XYL-IV derivada de la naturaleza. Tal XYL-IV de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o puede ser producida por medios recombinantes o sintéticos. El término "XYL-IV" de secuencia nativa" específicamente abarca las formas de origen natural, truncadas o secretadas de una XYL-IV y formas variantes de origen natural (e.g., formas alternativamente empalmadas) de una XYL-IV. En una modalidad de la presente invención, la XYL-IV de secuencia nativa incluye los aminoácidos del 1 al 465 de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . Tal como se utiliza en la presente, la frase Mpor ciento (%) de identidad de secuencia" con respecto a las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos identificados en la presente, se define como el porcentaje de residuos de aminoácido o de nucleótidos, en una secuencia candidata, que son idénticos a los residuos de aminoácido o nucleótidos de una secuencia de XYL-IV, después de alinear la secuencia y hacer huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no tomando en cuenta ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Los métodos para realizar el alineamiento de secuencia y la determinación de la identidad de secuencia, son conocidos por los técnicos en la materia y pueden ser realizados sin ninguna experimentación excesiva, y los cálculos de los valores de identidad se pueden obtener con exactitud. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York) ; y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure 5:suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Se dispone de un número de algoritmos para alinear secuencias y determinar la identidad de secuencia, los cuales incluyen, por ejemplo, el algoritmo de alineación de homología de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el método de búsqueda de similitud de Pearson et al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA Nati. Acad. Sci. 85:2444; el algoritmo de Smith-Waterman {Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997); y los algoritmos BLASTP, BLASTN y BLASTX (véase Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Los programas de computadora que utilizan estos algoritmos también están disponibles en el comercio e incluyen, pero no se limitan a: ALIGN o Megalign (DNASTAR) software, o WU-BLAST-2 (Altschul et al . , Meth. Enzym., 266; 60-480 (1996)); o GAP, BESTFIT, BLAST, Altschul et al., supra, FASTA, y TFASTA, paquetes que están disponibles en Genetics Computing Group (GCG) , Versión 8, Madison, Wisconsin, EUA; y el programa CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California. Los técnicos en la materia podrán determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud de las secuencias que están siendo comparadas. De preferencia, la identidad de secuencia se determina utilizando los parámetros por definición determinados por el programa. Específicamente, la identidad de secuencia se puede determinar por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997))· tal como fue implantado en el programa MSPRCH (Oxford Molecular) , utilizando una búsqueda de huecos afines con los siguientes parámetros de búsqueda: hueco abierto, penalidad de 12; y extensión de hueco, penalidad de 1. De preferencia, las comparaciones de aminoácidos apareados se pueden llevar a cabo utilizando el programa GAP del paquete de software de análisis de secuencias GCG de Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, empleando la matriz de sustitución de aminoácidos blosum62, con un peso de los huecos de 12 y un peso de la longitud de los huecos de 2. Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos/ el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácido adicionales o residuos de aminoácido eliminados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para comparar con la secuencia de aminoácidos de referencia, incluirá cuando menos 20 residuos de aminoácido contiguos y podría tener 30, 40, 50 ó más residuos de aminoácido. Las correcciones para la identidad de secuencia incrementada asociada con la inclusión de huecos en la secuencia de aminoácidos del derivado, se puede realizar asignando penalidades a los huecos. Tal como se utiliza en la presente, el término "vector de expresión" significa una construcción de ADN que incluye una secuencia de ADN que está operablemente ligada con una secuencia de control adecuada capaz de afectar la expresión del ADN en un huésped apropiado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para afectar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia codificadora de sitios de unión a ribosoma adecuados en el ARNm y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. De preferencia se utilizan diferentes tipos de células con diferentes vectores de expresión. Un promotor preferido para los vectores utilizados en Bacillus subtilis es el promotor AprE; un promotor preferido utilizado en E. coli es el promotor Lac; un promotor preferido utilizado en Saccharomyces cerevisiae es PGKl; un promotor preferido en Aspergillus niger es glaA y un promotor preferido para Trichoderma reesei es cbhl. El vector puede ser un plásmido, un fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en una célula huésped apropiada, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma huésped; o podría, bajo condiciones adecuadas, integrarse al genoma mismo. En la presente descripción, los términos "plásmido" y "vector" a veces se utilizan de manera intercambiable. Sin embargo, la presente invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que son o pueden ser conocidas en la técnica. Así pues, se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión en la expresión de las secuencias de ADN de la presente invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, tales como varios derivados conocidos de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, e.g. plásmidos de E. coli, incluyendo col El, pCRl, pBR322, pMb9, pUC 19 y sus derivados, plásrtiidos de rango de huéspedes más amplio, RP4, ADNs de fagos, e.g. los numerosos derivados del fago ?, e.g. NM989 y otros fagos ADN, e.g. MI3 y fagos filamentosos de una sola cadena de ADN; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2µ o derivados de los mismos, vectores útiles en células eucarióticas, tales como vectores útiles en células animales y vectores derivados de combinaciones de ADN de plásmidos y de fagos, tales como plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de un fago u otras secuencias de control de expresión. Las técnicas de expresión que utilizan los vectores de expresión de la presente invención, son conocidas en esta manera y se describen generalmente en, por ejemplo, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATOY MANUAL, SECOND EDITION, Cold Spring Harbor Press (1989) . A menudo, tales vectores de expresión que incluyen las secuencias de ADN de la presente invención, son transformados en un huésped unicelular mediante la inserción directa al genoma de una especie particular, a través de un evento de integración (véase e.g. Bennett & Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego, pp. 70-76 (1991) y los artículos citados en ese documento que describen la inserción genómica dirigida al blanco en células de hongos) . Tal como se utiliza en la presente, el término "cepa huésped" o "célula huésped" significa un huésped apropiado para un vector de expresión, que incluye ADN de conformidad con la presente invención. Las células huésped útiles en la presente invención generalmente son huésped procarióticos u eucarióticos, incluyendo cualquier microorganismo transformable en el cual se pueda lograr la expresión. Específicamente, las cepas huésped pueden ser Bacillus subtilis, Eschexichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae o Aspergillus niger. Las células huésped se transforman o transfectan con vectores construidos utilizando las técnicas de ADN recombinante . Tales células huésped transformadas son capaces de replicar vectores que codifican para XYL-IV y sus derivados o variantes (mutantes) o expresar el producto peptídico deseado. En una modalidad preferida de conformidad con la presente invención, el término "célula huésped" significa tanto células como protoplastos creados a partir de células de Trichoderma sp. Tal como se utiliza en la presente, el término "secuencia de señal" significa una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteína, que facilita la secreción de la forma madura de la proteína fuera de la célula. Esta definición de secuencia de señal es funcional. La forma madura de la proteína extracelular' carece de la secuencia de señal, la cual es degradada durante el proceso de secreción. Tal como se utiliza en la presente, los términos "unido funcionalmente" o "operablemente ligado" significan que una región reguladora, tal como un promotor, un terminador, una señal de secreción o una región intensificadora está unida a un gen estructural y controla la expresión de ese gen. Las condiciones "estrictas" de las reacciones de hibridación, son determinadas fácilmente por un técnico en la materia y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado y de la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para su apareamiento apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para volverse a aparear cuando están presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Mientras más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, más alta será la temperatura relativa que se puede utilizar. Como resultado, se tiene que temperaturas relativas más altas tenderían a producir condiciones de reacción más estrictas, mientras que temperaturas más bajas serían menos estrictas. Para detalles adicionales y explicaciones acerca de las condiciones estrictas de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers, 1995) . Tal como se utilizan en la presente, los términos "condiciones estrictas" o "condiciones altamente estrictas" pueden ser identificadas por lo siguiente: (1) que emplean una fuerza iónica baja y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0.015M/citrato de sodio 0.0015M/dodecilsulfato de sodio al 0.1%, a 50°C; (2) que emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina sérica bovina al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, a pH'6.5, con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) que emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75M, citrato de sodio 0.075M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x solución de Den ardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 ug/ml) , SDS, al 0.1% y sulfato de dextrán al 10%, a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50%, a 55°C, seguido por un lavado altamente estricto que consiste de 0.1 x SSC que contiene AEDT, a 55°C. Tal como se utiliza en la presente, la frase "condiciones moderadamente estrictas" se puede identificar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989) e incluye el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (e.g., temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos estrictas que aquellas anteriormente descritas. Un ejemplo de condiciones moderadamente estrictas es una incubación durante una noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrán al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por un lavado de los filtros con 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. Un técnico en la materia reconocerá cómo a ustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., conforme sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares. Tal como se utiliza en la presente, el término una sustancia (e.g. un polinucleótido o proteina) "derivado de" un microorganismo, significa que la sustancia es nativa del microorganismo. Especificidad de la XYL-IV En general, la XYL-IV exhibe una especificidad diferente a la de la familia 11 ó a la de la familia 10 de la glucosilhidrolasa. En particular, la XYL-IV exhibe una especificidad por sustancias diferente a la de una <x-arabinofuranosidasa, una a-galactosidasa, una ß-xilosidasa, una ß-manosidasa. Más particularmente, la XYL-IV degrada sustratos con una especificidad diferente de la XYL-I ó II ó III; es decir, la XYL-IV puede degradar el xilano en algunas de las mismas posiciones que estas otras xilanasas, pero también lo rompe en diferentes posiciones. En una modalidad, bajo condiciones de reacción típicas, la XYL-IV puede exhibir una mayor actividad hacia un xilano no sustituido o un MeGlcA-xilano acetilado, que la XYL-I ó la XYL-II. Tanto la XYL-IV como la II pueden hidrolizar al MeGlcA-xilano desacetilado. La XYL-II típicamente exhibe una mayor actividad que la XYL-IV sobre un arabinoxilano. En la degradación del xilano no sustituido o un MeGlcA-xilano acetilado, la XYL-IV produjo xilosa como producto principal, con cantidades menores de xilobiosa y xilo-oligosacáridos sustituidos. Las otras dos xilanasas produjeron diferentes productos. La XYL-IV generalmente romperá más cerca de una unidad de xilosa sustituida que la XYL-I ó la II. La diferencia en especificidad entre la XYL-IV y las XYL-I y II puede producir una sinergia en la degradación de un producto mediante la combinación o mezclas de estas enzimas. Por ejemplo, la degradación de un sustrato por una mezcla de XYL-IV con XYL-I y/o XYL-II, puede dar como resultado un incremento más que aditivo en la velocidad y/o grado de degradación del sustrato, en comparación con la degradación de cualquiera de estas enzimas- De manera similar, la degradación de un sustrato por una o más XYL-I, II y/o IV, seguido por una degradación por una XYL diferente o una combinación de XYL-I, II y/o IV, puede dar como resultado un incremento más que aditivo en la velocidad y/o grado de degradación del sustrato, en comparación con la degradación realizada por cualquiera de estas enzimas. En una modalidad, la XYL-IV puede degradar varios xilanos poliméricos del centeno, el xilano no sustituido, MeGlcA-xilano y arabinoxilano . Típicamente, la XYL-IV degrada el arabinoxilano más lentamente que los otros dos xilanos, los cuales pueden ser degradados a velocidades aproximadamente iguales. La XYL-IV puede hidrolizar tanto oligosacáridos lineales como sustituidos. La XYL-IV bajo condiciones de reacción típicas, no degrada o degrada sólo débilmente un glucomanano, un galactomanano, un ß-glucano, una carboximetilcelulosa, una laminarina o una xilobiosa. En otra modalidad, la XYL-IV se puede utilizar bajo ciertas condiciones de reacción, para catalizar el acoplamiento de azúcares para formar azúcares más grandes. Por ejemplo, la XYL-IV se puede emplear para la síntesis de una xilobiosa o un xilooligosacárido, a partir de unidades menores. Alternativamente, la XYL-IV puede catalizar la formación de derivados de azúcar a partir de unidades menores . Preparación de la XYL-IV La presente invención se refiere a la expresión, aislamiento y uso de la XYL-IV y derivados de la XYL-IV. La XYL-IV o derivados de la misma, de preferencia se preparan mediante métodos recombinantes . Sin embargo, las proteínas XYL-IV para utilizarse en la presente invención, se pueden obtener por otros medios reconocidos en la técnica, tales como purificación a partir de . fuentes naturales o síntesis química. Purificación a Partir de Fuentes Naturales La XYL-IV se puede purificar a partir de fuentes naturales mediante métodos conocidos y comúnmente empleados. Por ejemplo, las células que contienen XYL-IV se pueden romper por varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisis celular. La XYL-IV se puede recuperar del medio por las técnicas convencionales, incluyendo separación de las células del medio por centrifugación, filtración y precipitación de las proteínas del sobrenadante o filtración con una sal, por ejemplo, sulfato de amonio. Después, la XYL-IV se puede purificar a partir de las células destruidas por procedimientos tales como: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; CLAR de fase reversa; cromatografía en materiales basados en sílice o una resina de intercambio iónico, tal como DEAE; cromatoenfoque; EGPA-DSS (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) ; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y cromatografía de afinidad. Se pueden emplear varios métodos de purificación de proteínas y tales métodos son conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag, New York (1982) . Los pasos de purificación seleccionados dependerán, por ejemplo, de la XYL-IV particular producida o de la fuente de donde se obtuvo esta enzima. Síntesis Química Alternativamente, la secuencia de ¦ la XYL-IV o porciones de la misma, se puede producir por síntesis peptídica directa, empleando técnicas en fase sólida (véase e.g., Stewart, et al., SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, W.H. Feeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). Se puede realizar una síntesis de proteína in vitro utilizando técnicas manuales o automáticas. La síntesis automatizada se puede llevar a cabo, por ejemplo, empleando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) , según las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias porciones de la XYL-IV por separado y después combinarlas utilizando métodos químicos o enzimáticos, para producir una XYL-IV de longitud completa. Métodos Recambinantes Aislamiento de ADN que Codifica para la XYL-IV Se puede obtener ADN que codifica para una XYL-IV a partir de una biblioteca de ADNc preparada de un microorganismo que se piense que posea AR m de XYL-IV y que lo exprese a un nivel detectable. El gen que codifica para la XYL-IV también se puede obtener a partir de una biblioteca genómica o por síntesis de oligonucleótidos.- Las bibliotecas se pueden seleccionar con sondas (tales como anticuerpos contra una XYL-IV u oligonucleótidos de cuando menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. La selección de una biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada, se puede llevar a cabo mediante procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., supra. Un mecanismo alternativo para aislar el gen que codifica para la XYL-IV, es utilizar la metodología de Reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) (Sambrook, et al., supra; Dieffenbach, et al., PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ) . En técnicas conocidas para la selección de una biblioteca de ADNc, las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberán tener una longitud suficiente y deben ser suficientemente poco ambiguas para que se disminuyan al mínimo los falsos positivos. El oligonucleótido de preferencia se marca de tal manera que pueda ser detectado mediante la hibridación con ADN proveniente de la biblioteca que se está seleccionando. Los métodos de marcado son conocidos en la técnica e incluyen el uso de marcas radioactivas como ATP marcado con 32P, biotinación o marcado enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo condiciones moderadamente estrictas y altamente estrictas, se proporcionan en Sambrook, et al., supra . Las secuencias identificadas mediante estos métodos de selección de biblioteca se pueden comparar o alinear con otras secuencias conocidas, depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a cualquier nivel de aminoácidos o nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa, se pueden - determinar mediante la alineación de secuencia utilizando programas de software de computadora tales como ALIGN, DNAstar e INHERIT, los cuales emplean varios algoritmos para medir la homología. Se pueden obtener ácidos nucleicos que tengan una secuencia codificadora de proteina mediante la selección de bibliotecas de ADNc o genómicas, utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente para la primera vez y, si es necesario, utilizando procedimientos de extensión de cebadores convencionales, tales como los descritos en Sambrook et al. supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de ARNm que pudieran no haber sido transcritos inversamente en ADNc. Selección y Transformación de Células Huésped Se transfectan o transforman células huésped con vectores de expresión o de clonación descritos en la presente para la producción de XYL-IV. Las células huésped se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados como sea apropiado para incluir promotores, seleccionadores de transformantes o genes amplificadores que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como los medios, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por los técnicos en la materia sin realizar demasiado experimentación. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la - - productividad de los cultivos celulares, sé pueden encontrar en MAMMALIAN CELL BIOTECHNOLOGY : A PRACTICAL, APPROACH, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook, et al., supra. Los métodos de transfección son conocidos para los técnicos en la materia, por ejemplo, con CaP04 y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo empleando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, tal' como se describe en Sambrook et al. , supra, o la electroporación, generalmente se utilizan para células procarióticas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. La infección con Agrobacterium tumefaclens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, tal como se describe en Shaw, et al., Gene 23:315 (1983) y en la Solicitud Internacional de Patente WO 89/05959, publicada el 29 de junio de 1989. Las transformaciones en levaduras se pueden llevar a cabó de conformidad con el método de Van Solingen, et al., J. Bacteriol. 130:946 (1977) y Hsiao, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (USA) 76:3829 (1979). Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en células, tales como la microinyección nuclear, electroporación, microporación, bombardeo biolistico-, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, e.g., polibreno, poliornitina. Las células huésped apropiadas para la clonación o expresión del ÁDN en los vectores de la presente, incluyen células procarióticas, levaduras u hongos filamentosos. Los procariotes adecuados, incluyen, pero no se limitan a eubacterias, tales como microorganismos gram positivos o gram negativos, por ejemplo Enterobacteriaceae tal como E. coli. Están disponibles al público varias cepas de E. coli, tales como la cepa E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); la cepa E. COli W3110 (ATCC 27,325) y la cepa K5 772 (ATCC 53,635). Además de microorganismos procarióticos, los microorganismos eucarióticos, tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican para la XYL-IV. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior comúnmente utilizado. De preferencia, el microorganismo por ser transformado incluye una cepa que se deriva de Trichoderma spp. o Aspergillus spp. Más preferiblemente, la cepa incluye G. reesei, la cual es útil para obtener una expresión excesiva de la proteina; o Aspergillus niger var. awamori. Por ejemplo, la cepa de Trichoderma RL-P37, descrita por Sheir-Neiss, e.t al. en Appl. Microbiol.

- Biotechnol. 20:46 (1984) se sabe que secreta cantidades elevadas de enzimas celulasas. Equivalentes funcionales de la cepa RL-P37 incluyen Trichoderma reesei (longibrachiatum) . cepa RUT-C30 (ATCC No. 56765) y la cepa QM9414 (ATCC No. 26921). Otro ejemplo incluye mutantes sobreproductoras como las descritas en ard et al. en Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738 (1993). Se contempla que estas cepas podrían ser útiles en la sobreexpresión de XYL-IV de Trichoderma spp. La selección de la célula huésped apropiada se considera dentro de la práctica normal de esta' técnica. Selección y Transformación de Células Huésped de Trichoderma sp. Una modalidad preferida para preparar XYL-IV. de conformidad con la presente invención, incluye' la transformación de una célula huésped Trichoderma sp. con una construcción de ADN que incluye cuando menos un fragmento de ADN que codifica para una porción o para la totalidad de la XYL-IV, en donde dicha porción está funcionalmente unida a un promotor. La célula huésped transformada, entonces, se hace crecer en condiciones tales que exprese la proteína deseada. Subsecuentemente, el producto proteico deseado se puede aislar o purificar hasta una sustancial homogeneidad. De preferencia, el microorganismo por ser transformado incluye una cepa derivada de Trichoderma spp. Más preferiblemente, la cepa incluye T. reesei, la cual es útil para obtener una sobreexpresión de la proteina, la cepa Trichoderma RL-P37, equivalentes funcionales a la cepa RL-P37, tales como Trichoderma reesei (longibrachiatum) cepa RUT-C30 (ATCC No. 56765) o la cepa QM9414 (ATCC No. 26921) . Se puede elegir un marcador seleccionable para hacer posible la detección de los hongos transformados. Será adecuado cualquier gen marcador seleccionable que sea expresado en el microorganismo seleccionado. Por ejemplo, con Trichoderma sp., el marcador seleccionable se elige de tal manera que la presencia del marcador seleccionable en las transformantes no afecte significativamente las propiedades de las mismas. Tal marcador seleccionable puede ser un gen que codifica para un producto que pueda ser evaluable. Por ejemplo, se puede usar una copia funcional de un gen de Trichoderma sp. el cual, si hace falta en la cepa huésped, da como resultado que la cepa huésped muestre un fenotipo auxotrófico. En una modalidad preferida, una cepa de Trichoderma sp. pyr4~ es transformada con un gen pyr4, el cual, entonces, proporciona un marcador seleccionable para la transformación. Una cepa derivada pyr4~ se puede obtener mediante la selección de cepas de Trichoderma sp. que son resistentes al ácido fluoroorótico (FOA) . El gen pyr4 codifica para la enzima orotidina-5' -monofosfato descarboxilasa, una enzima que es requerida para la biosíntesis de la uridina. Las cepas con un gen pyr4 intacto, crecerán en un medio que carece de uridina, pero serán sensibles al ácido fluoroorótico . Es posible seleccionar cepas pyr4~ que carecen de una enzima orotidina monofosfato descarboxilasa funcional y que requieren de uridina para crecer, mediante la selección de resistencia al FOA. Utilizando la técnica de selección con FOA,' también es posible obtener cepas que requieren uridina y que carecen de una enzima orotato pirrofosforibosil transferasa funcional. Es posible transformar estas células con una copia funcional del gen que codifica para esta enzima (Berges y Barreu, Curr. Genet. 19:359 (1991)). La selección de cepas derivadas se realiza fácilmente utilizando la técnica de resistencia al FOA anteriormente referida y, de esta manera, de preferencia se emplea el gen pyr4 como marcador seleccionable. Para transformar una cepa de Trichoderma sp. pyr4~ para que tenga la capacidad de expresar uno o más genes xyl4, se aisla un solo fragmento de ADN que incluye un gen xyl4 a partir del plásmido por deleción y dicho fragmento se utiliza para transformar una célula huésped de Trichoderma pyr~ apropiada. Después, las transformantes se identifican y se seleccionan con base en su capacidad de expresar el gen pyr4 y de esta manera el cumplimiento de la auxotrofia por uridina de la cepa huésped. Después se lleva a cabo un análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Southern (Southern blot) con las transformantes resultantes, para identificar y confirmar un evento de integración cruzada doble que reemplace una parte o la totalidad de la región codificadora de la copia genómica del gen por ser eliminado, con el marcador seleccionable pyr4. Aunque los vectores plasmídicos . específicos anteriormente descritos se refieren a la preparación de transformantes pyr", la presente invención no se limita a estos vectores. Se pueden eliminar y reemplazar varios genes en la cepa de Trichoderma sp. utilizando las técnicas anteriores. Además, se puede emplear cualquier marcador seleccionable disponible tal como se describió anteriormente. De hecho, cualquier gen de Trichoderma sp. que haya sido clonado y por lo tanto identificado, se puede eliminar de, o puede ser reemplazado del genoma, empleando la estrategia anteriormente descrita. Como se estableció anteriormente, las células huésped preferidas incluyen derivados de Trichoderma sp. que carecen o que tienen un gen o genes no funcionales que corresponden al marcador seleccionable elegido. Por ejemplo, si se elige el marcador seleccionable pyr4, entonces se utiliza una cepa derivada pyr4~ especifica como receptora en el procedimiento de transformación. De manera similar, se pueden emplear marcadores seleccionables que incluyen genes de Tríchoderma sp. equivalentes a los genes de Aspergillus nidulans amdS, argB, trpC y niaD. Por lo tanto, la cepa receptora correspondiente es una cepa derivada tal como argET, trpC, niaD', respectivamente. En las técnicas de transformación preferidas, debe tomarse en cuenta que la permeabilidad de la pared-celular al ADN en Trichoderma sp. es muy baja. De conformidad con lo anterior, la incorporación de la secuencia de ADN deseada, del gen o del fragmento génico, es cuando mucho mínima. Existe un número de métodos para incrementar la permeabilidad de la pared celular de Trichoderma sp. en la cepa derivada (i.e., carente de un gen funcional que corresponda al marcador seleccionable utilizado), antes del proceso de transformación. El método preferido en la presente invención para preparar cepas de Trichoderma sp. para la transformación, incluye la preparación de protoplastos a partir del micelio del hongo. El micelio se puede obtener a partir de esporas vegetativas germinadas. El micelio se trata con una enzima que digiere la pared celular, obteniéndose protoplastos. Los protoplastos, posteriormente, se protegen mediante la presencia de un agente estabilizante osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Normalmente, la concentración de estos estabilizantes varía entre 0.8M y 1.2M. Es preferible utilizar aproximadamente una solución 1.2M de sorbitol en el medio de suspensión. La incorporación de ADN en la cepa de Trichoderma sp. huésped, depende de la concentración de iones calcio. Generalmente se utiliza CaCl2 10 mM y CaCl2 50 mM en una-solución de incorporación. Además de la necesidad del ión calcio en la solución de incorporación, otros compuestos generalmente incluidos son un sistema regulador de pH, tal como la solución reguladora TE (Tris 10 mM, pH 7.4; AEDT 1 mM) o solución reguladora MOPS (ácido morfolinopropansulfónico) , pH 6.0 y polietilenglicol (PEG) . Se piensa que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares, permitiendo de esta manera que el contenido del medio se introduzca al citoplasma de la cepa Trichoderma sp. y que el ADN plasmídico sea transferido al núcleo. Esta fusión a menudo produce múltiples copias del ADN plasmídico integrado en el cromosoma huésped. Normalmente se utiliza en la transformación una suspensión que contiene protoplastos de Trichoderma sp. ó células que hayan sido sometidas a un tratamiento de permeabilidad, a una densidad de 108 a 109 células/ml, de preferencia 2 x loVml. Se mezcla un volumen de 100 microlitros de estos protoplastos o células, en uña solución apropiada (e.g., sorbitol 1.2M CaCl2 50 mM) con el ADN deseado. Generalmente se agrega una alta concentración de PEG a la solución de incorporación. Se pueden añadir de 0.1 a 1 volúmenes de PEG 4000 al 25%, a la suspensión de protoplastos. Sin embargo, es preferible agregar aproximadamente 0.25 volúmenes a la solución de protoplastos. También se pueden añadir aditivos tales como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloruro de potasio y similares, a la solución de incorporación y éstos pueden ayudar en la transformación. Generalmente, la mezcla después se incuba a aproximadamente 0°C durante un periodo de entre 10 y 30 minutos. Después se añade PEG adicional a la mezcla para incrementar la incorporación del gen deseado o de la secuencia de ADN deseada. El PEG 4000 al 25% normalmente se agrega en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, pueden ser adecuados volúmenes mayores y menores. El PEG 4000 al 25% de preferencia constituye aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de añadir el PEG, la mezcla de transformación se incuba a temperatura ambiente antes de añadir una solución de sorbitol y CaCl2.

La suspensión de protoplastos, posteriormente, es agregada a alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Este medio de cultivo permite el crecimiento únicamente de las transformantes. Se puede usar cualquier medio de cultivo en la presente invención que sea adecuado para hacer crecer las transformantes deseadas. Sin embargo, si se van a seleccionar transformantes pyr es preferible utilizar un medio de cultivo que no contenga uridina. Subsecuentemente, las colonias son transferidas y purificadas en un medio de cultivo agotado de uridina. En esta etapa, las transformantes estables pueden ser distinguidas de las transformantes no estables por su velocidad de crecimiento más rápida y por la formación de colonias circulares con un contorno liso, más que rugoso, en un medio de cultivo sólido carente de uridina. Adicionalmente, en algunos casos se puede realizar una prueba de estabilidad adicional haciendo crecer las transformantes en un medio sólido no selectivo (i.e., que contenga uridina) , se cosechan las esporas de este medio de cultivo y se determina el porcentaje de estas esporas que subsecuentemente germinará y crecerá en un medio de cultivo selectivo carente de uridina. Preparación y Uso de un Vector Replicable El ADN que codifica para la proteína XYL-IV se prepara para su inserción en un microorganismo apropiado.

De conformidad con la presente invención, el ADN que codifica para una enzima XYL-IV incluye la totalidad del ADN necesario para codificar una proteina que tenga una actividad funcional de XYL-IV. De conformidad con ello, el ADN se puede derivar de cualquier fuente microbiana que produzca XYL-IV, siempre y cuando el gen pueda ser identificado y aislado conforme a los métodos descritos en la presente. En una modalidad preferida, el ADN que codifica para una proteina XYL-IV se deriva de Trichoderma sp. y más preferiblemente de Trichoderma reesei. El ADN que codifica para la proteina XYL-IV se puede preparar mediante la construcción de un vector de expresión portador del ADN que codifica para XYL-IV. El vector de expresión portador del fragmento de ADN insertado que codifica para XYL-IV, puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse autónomamente en un organismo huésped dado o capaz de integrarse al ADN del huésped, típicamente un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. Varios vectores están disponible para el público. También se contempla que más de una copia del ADN que codifica para una proteína XYL-IV se puede recombinar en la cepa, para facilitar la sobreexpresión. En modalidades preferidas, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de genes. El primero contiene secuencias de ADN en las cuales el promotor, la región codificadora del gen y la secuencia terminadora provienen del gen por ser expresado. Se puede obtener una truncación del gen al eliminar secuencias de ADN indeseables (e.g., que codifican para dominios no deseados), para dejar el dominio que va a ser expresado bajo el control de sus propias secuencias reguladoras de transcripción y de traducción. También está contenido un marcador seleccionable en el vector, lo cual permite la selección para la integración, en el huésped, de múltiples copias de las nuevas secuencias del gen xyl4. El segundo tipo de vector de expresión es preensamblado y contiene secuencias requeridas para un alto nivel de transcripción y un marcador seleccionable. Se contempla que la región codificadora para un gen o parte del mismo, se puede insertar en este vector de expresión de propósito general, de tal modo que quede bajo el control transcripcional de las secuencias promotora y terminadora del cartucho. Por ejemplo, el plásmido pTEX es uno de tales vectores de expresión de propósitos generales. Véase la Patente Norteamericana US 5,650,322 para una descripción de este vector. pTEX es un plásmido que ha sido diseñado como un vector de expresión de propósitos múltiples, para utilizarse en el hongo filamentoso G. reesei. El cartucho de expresión dentro del vector tiene varias características únicas que lo hacen útil para esta función. La transcripción es regulada utilizando las potentes secuencias promotora y terminadora del gen cJ l para T. reesei . En el vector, la secuencia de ADN que codifica para la proteina XYL-IV de la presente invención, deben estar operablemente ligadas a secuencias transcripcionales y traduccionaíes; es decir, una secuencia promotora adecuada y una secuencia de señal en el marco de lectura del gen estructural. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped y se puede derivar de genes que codifican para proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. El péptido de señal proporciona la producción extracelular de la XYL-IV o derivados de la misma. El ADN que codifica para la secuencia de señal, de preferencia es aquel que está asociado naturalmente con el gen por ser expresado; sin embargo, está contemplada en la presente invención la secuencia de señal de cualquier fuente adecuada, por ejemplo una exocelobiohidrolasa o endoglucanasa de Trichoderma. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados, empleando técnicas conocidas en este campo. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, una o más secuencias de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes, emplea las técnicas de unión estándar que son conocidas para los técnicos en la materia. La XYL-IV deseada se puede producir de manera recombinante no sólo directamente, sino que también en forma de un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de rompimiento especifico en el extremo N-terminal de la proteina madura o polipéptido. 'En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN codificador de XYL-IV que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica que se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp ó enterotoxina II termoestable. Para secreción en levaduras, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de la invertasa de levadura, el líder factor alfa (incluyendo líderes factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la Patente Norteamericana US No. 5,010,182) o una secuencia lider de fosfatasa ácida, la secuencia lider de glucd'amilasa de C. albicans (Patente Europea EP 362,179, publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en la Solicitud Internacional de Patente WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322, es adecuado para gran parte de las bacterias gram negativas y el origen del plásmido 2µ es adecuado para levaduras. Los vectores de expresión y clonación tipicamente contendrán un gen de selección, también denominado marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, e.g., el gen que codifica para la enzima D-alanina racemasa para Bacilli. Un gen de selección adecuado para utilizarse en levaduras, es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb, et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman, et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper, et al., Gene 10:157 (1980)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, la cepa ATCC No. 44076 ó PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). Un gen de selección preferido para utilizarse en Trichoderma sp. es el gen pyr4. Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor operablemente ligado a la secuencia de ácido nucleico codificadora de XYL-IV. El promotor dirige la síntesis de ARm. Se conocen promotores que son reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. . Los promotores preferidos incluyen una secuencia promotora de hongos, por ejemplo, el promotor de los genes cbhl ó egli. Los promotores adecuados para utilizarse en huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores ß-lactamasa y lactosa (Chang, et al. Nature 275:615 (1978); Goeddel, et al., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Nucí. Acids Res. 8:4057 (1980); y la Solicitud de Patente Europea 36,776) y promotore híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:21 (1983)). Los promotores para utilizarse en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN codificador de XYL-IV. Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizarse en huéspedes de levadura, incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. , 255:2073 (1980)) u otras enzimas glucoliticas (Hess, et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland, Biochem. 17:4900 (1978)), tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa-3-fosfoglicerato mutasa, pivurato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para las enzimas alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizarse en la expresión en levaduras, se describen adicionalmente en la Patente Europea EP 73,657. Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas, e.g. levaduras, hongos, células de insecto, de plantas) también "contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles en el extremo 5' y ocasionalmente en el 3' de regiones no traducidas de ADNs o ADNc eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos en forma de fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para XYL-IV. Detección de la Amplificación/Expresión Génica La amplificación y/o expresión génica se puede medir directamente en una muestra, por ejemplo, por el método de inmunoelectrotransferencia tipo Southern (Southern blot) convencional, inmunoelectrotransferencia tipo Northern (Northern blot) para cuantificar . la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5201 (1980)), inmunoelectrotransferencia de punto (dot blot) (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una . sonda marcada apropiadamente, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer duplas, incluyendo duplas de ADN, duplas de ARN y duplas híbridas de ADN-ÁRN o duplas de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden estar marcados y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la dupla se une a una superficie, de tal manera que al formarse la dupla en la superficie, se pueda detectar la presencia del anticuerpo unido a la dupla. La expresión génica, alternativamente, se puede medir por métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquimica de células y ensayo de fluidos de cultivo celular, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquimica y/o el ensayo de fluidos de muestras, pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden preparar en cualquier mamífero. De manera-conveniente, se pueden preparar anticuerpos contra una secuencia nativa de XYL-IV,. contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente o contra una secuencia exógena fusionada a ADN ,que codifica para XYL-IV y que codifica para un epitopo -de anticuerpo específico. Purificación de Polipéptidos Se pueden recuperar formas de XYL-IV a partir del medio de cultivo o de lisados de la célula huésped, por los métodos, anteriormente descritos, para el aislamiento y purificación de aislamientos naturales. Se pueden emplear técnicas adicionales, dependiendo de la célula huésped empleada y cualquier estructura variante en la enzima recombinante . Por ejemplo, ..si la enzima recombinante esté unida a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una- solución detergente adecuada (e.g.. Triton-X 100) o por degradación enzimática. La purificación de la enzima recom inante también puede emplear columnas de proteína A y Sepharosa para remover los contaminantes tales como IgG y columnas de metales quelantes para fijarse a formas de la XYL-IV con epítopos marcados. Los pasos de purificación seleccionados dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción empleado, de la XYL-IV particular producida y de cualquier estructura variante para la enzima recombinante. Derivados de XYL-IV Además de la secuencia nativa de XYL-IV descrita en la presente, se contempla que se pueden preparar derivados de XYL-IV con secuencias de aminoácidos alteradas. Los derivados de XYL-IV se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN -que codifica para XYL-IV o por síntesis de la XYL-IV deseada. Los técnicos en la materia observarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar procesos postraduccionales de la XYL-IV, tales como el cambio del número o posición de sitios de glucosilación. Los derivados de la secuencia nativa de XYL-IV o de varios dominios de la XYL-IV descrita en la presente, se pueden preparar, por ejemplo, empleando cualquiera de las técnicas y lineamientos de mutaciones conservadoras y no conservadoras que se presentan, por ejemplo, en la Patente Norteamericana US No. 5,364,934. Las variaciones de secuencia pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican para la XYL-IV, que dé como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos de la XYL-IV en comparación con la secuencia nativa de XYL-IV. Opcionalmente, la variación de secuencia se realiza por sustitución de cuando menos un aminoácido por otro aminoácido, en uno o más de los dominios de la XYL-IV. Los lineamientos para determinar qué residuo de aminoácido se puede insertar , sustituir o eliminar sin afectar de manera adversa la actividad deseada de la XYL-IV, se pueden encontrar comparando la secuencia del polipéptido con la de moléculas de proteina homólogas conocidas y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoácido por otro que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina por una serina; es decir, reemplazos de aminoácidos conservadores.. Las inserciones o deleciones, opcionalmente, pueden estar en el rango de 1 a 5 aminoácidos . La variación permitida se puede determinar mediante inserciones sistemáticas, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando los derivados resultantes con respecto a su actividad funcional, empleando las técnicas conocidas en este campo. Las variaciones de secuencia se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica/ tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida a sitio), barrido de alanina y mutagénesis por RCP. La mutagénesis dirigda a sitio (Cárter, et al., Nucí. Acids Res. 13:4331 (1986); Zoller, et al., Nucle. Acids Res. 10:6487 (1987)), la mutagénesis de cartucho (Wells, et al., Gene 34:315 (1985)), la mutagénesis de selección de restricción (Wells, et al., Philos. Trans. R. Soc. London serA 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas, se pueden aplicar al ADN clonado para producir el ADN que codifica para XYL-IV con una secuencia variante. El análisis de aminoácidos por barrido también se puede emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen la alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido en este grupo, debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal del derivado. La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común.

- Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones enterradas como en posiciones expuestas Creighton, THE PROTEINS, (W.H. Feeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no rinde cantidades adecuadas del derivado, se puede usar un aminoácido isoestérico. Anticuerpos Anti-XYL-IV La presente invención además proporciona anticuerpos anti-XYL-IV. Algunos anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos anti-XYL-IV de la presente invención pueden incluir anticuerpos policlonales. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para los técnicos en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden inducir en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante serán inyectados en el mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales . Para anticuerpos anti-XYL-IV, el agente inmunizante puede incluir la proteína XYL-IV o una proteína de fusión de la misma. Podría ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina - - de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soya. Ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lipido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un técnico en la materia sin realizar demasiada experimentación. Los anticuerpos anti-XYL-IV, alternativamente, pueden ser anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando los métodos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, típicamente es inmunizado con un agente inmunizante para inducir la formación de linfocitos' que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Para anticuerpos anti-XYL-IV, el agente inmunizante típicamente incluirá la proteína XYL-IV o una proteína de fusión de la misma. Generalmente, se utilizan ya sea linfocitos de sangre periférica ("LSPs") si se desean células de origen humano, o bien, células de bazo o de ganglio linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos, entonces, se fusionan con una línea celular inmortalizada, empleando un agente de fusión tal como polietilenglicol, . para formar una célula de hibridoma (Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press, (1986) pp. 59-103) . Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovino y de origen humano. Normalmente se emplean líneas de células de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células progenitores carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT ó HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente contendrá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT") , en donde estas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan de manera estable un alto nivel de expresión de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas de células inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, las cuales se pueden obtener, por ejemplo, en el Centro de Distribución de Células del Instituto Salk (Salk Institute Cell Distribution Center) , San Diego, California y en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) , Manassas, Virginia. También se han descrito lineas de células de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Iinmunol. 133:3001 (1984); Brodeur, et al., MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, MarceL Dekker, Inc., Nueva York (1987) pp. 51-63). El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma, posteriormente, se puede ensayar con respecto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra una XYL-IV. De preferencia,- la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente de enzima ligada (ELISA) . Tales técnicas y ensayos son conocidos en esta materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, se puede determinar, por ejemplo, por el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anai. Biochem. 107:220 (1980). Después de que se identifican las células de hibridoma deseadas, las clonas pueden ser subclonadas por procedimientos de dilución limitante y se pueden hacer crecer por los métodos estándar (Goding, supra) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Los anticuerpos monoclonales secretados por las subclonas se pueden aislar o purificar a partir del medio de cultivo por los procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como por ejemplo proteina A-Sepharosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales también se pueden preparar por métodos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en la Patente Norteamericana US No. 4,816,567. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la presente invención, se puede aislar y secuenciar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., mediante el uso de sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma de la presente invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, los cuales posteriormente son transíectados a células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de alguna otra manera no produzcan la proteina inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora para los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente Norteamericana US NO. 4, 816,567; Morrsion et al., supra) o uniendo covalentemente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina, la totalidad o una parte de la secuencia codificadora para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Tal polipéptido que no es inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación con antigeno de un anticuerpo de la presente invención, para crear un anticuerpo quimérico bivalente. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada generalmente es truncada en cualquier punto de la región Fe, para prevenir el entrecruzamiento de cadenas pesadas. Alternativamente, los residuos de cisteina relevantes son sustituidos por otros residuos de aminoácido o son eliminados, para prevenir la reticulación. También se dispone de métodos in vitro para la preparación de anticuerpos monovalentes . La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, se puede llevar a cabo mediante técnicas de rutina conocidas en esta materia. Métodos de Empleo de XYL-IV En otra modalidad, las xilanasas de la presente-invención tienen aplicaciones en mejorar la deslignificación y/o el blanqueamiento de la pulpa de conformidad con técnicas reconocidas en esta materia. El proceso incluye poner en contacto la pulpa con la XYL-IV y dicho proceso depende de factores tales como el pH, la temperatura, el tiempo de tratamiento, la dosis de enzima y la cantidad y tipo de pulpa. Se prefiere que el proceso anterior sea llevado a cabo a una temperatura y pH que intensifiquen la actividad enzimática de la XYL-IV. El periodo de tratamiento preferido para aplicar la XYL-IV de la presente invención, es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 4 horas, dependiendo de factores tales como los resultados deseados, la cantidad y calidad de pulpa tratada y la concentración de enzima, por ejemplo.

- - Una dosis de enzima adecuada es de aproximadamente 0.10 a 200 unidades/g de pulpa seca, de preferencia de 0.50 a 50 unidades/g. La actividad de xilanasa de las preparaciones enzimáticas se determina de la siguiente manera: A 1.8 mL de una solución de xilano (al 0.6%, Sigma No. X-0627, preparada en solución reguladora de acetato de sodio 0.05M y ajustada a pH 5.3 con ácido acético), se le añaden 0.200 mL de la enzima adecuadamente diluida en la misma solución reguladora. La mezcla de reacción se incuba a 40°C durante exactamente 30 minutos. Después la reacción es detenida agregando 3 L de reactivo DNS (3, 5-dinitrosalicilato 10 g/L; tartrato de sodio y potasio, 300 g/L) , y se desarrolla un color hirviendo la muestra durante 5 minutos. Después se mide la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Una unidad enzimática libera una micromol de azúcares reductores calculada como xilosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo. Se calcula la actividad de una dilución de enzima que libera 4 micromoles de azúcar reductor bajo las condiciones de ensayo. La actividad de la XYL-IV también se puede establecer en unidades de masa, por ejemplo, una unidad preferida de XYL-IV puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 100,000 ppm en un ensayo o mezcla de reacción. El presente método se puede aplicar para mejorar o ayudar al mejoramiento de cualquiera de una variedad de pulpas procesadas; es decir, pulpas que ya han sido previamente tratadas de cualquiera de una variedad de maneras para reducir su contenido de lignina y son tratadas en el proceso para mejorar adicionalmente la remoción de lignina por métodos quimicos. El presente método se puede aplicar al tratamiento de pulpas kraft de madera dura y madera blanda, para mejorar la remoción de lignina y el aclarado de las pulpas. El método es particularmente aplicable a pulpas químicas; es decir, aquellas en las que el componente de lignina ha sido químicamente modificado por varios tratamientos químicos, tales como los procesos del sulfato (kraft) y la deslignificación con oxígeno, y de preferencia se aplica a pulpas kraft. En un método preferido, la XYL-IV se aplica a la pulpa después de la digestión de kraft o la deslignificación con oxígeno, pero antes del blanqueamiento. En casos en donde la digestión kraft y la deslignificación con oxígeno se realizan en la misma pulpa, la enzima se aplica después de la digestión de kraft, antes de la deslignificación con oxígeno o después de la deslignificación con oxigeno. La presente invención también es aplicable a pulpas blanqueadas con ozono. La pulpa resultante se trata para remover el componente de lignina liberable utilizando un extractor apropiado. En otra modalidad, la pulpa tratada con XYL-IV subsecuentemente se puede tratar con productos químicos que degradan la lignina tales como cloro, dióxido de cloro y peróxido, y además se puede extraer con un extractor apropiado. En todavía otra modalidad, la pulpa tratada con la enzima se puede tratar con un extractor apropiado, seguido por la degradación de la lignina y un tratamiento final con un extractor apropiado. Tales extractores esencialmente solubilizan el componente de lignina afectado y los extractores adecuados incluyen, pero no se limitan a bases tales como hidróxidos de metales alcalinos (E) , dimetilformamida (DMF) , dioxano, acetona y alcohol. Las extracciones con hidróxido se pueden combinar con peróxido de hidrógeno (Ep) u oxigeno (Ep) . La pulpa resultante, entonces, se puede blanquear adicionalmente con una secuencia de blanqueadores químicos tal como dióxido de cloro (DED) o peróxido (P-P) hasta la claridad deseada, mediante lo cual se observa un sustancial ahorro de productos químicos cuando se compara con la pulpa blanqueada hasta la misma claridad mediante la misma secuencia, pero sin el uso del tratamiento enzimático. La reducción de compuestos que contienen cloro o peróxido se lleva a cabo de tal manera. Además, al realizar la presente invención con las enzimas anteriormente presentadas, se puede aplicar la misma cantidad dé compuestos químicos blanqueadores a la pulpa y todavía lograr un aclarado mayor en la pulpa tratada. En otra modalidad, la presente invención proporciona aplicaciones adicionales de la XYL-IV anteriormente descrita, en una variedad de escenarios industriales. Por ejemplo, la XY1-IV se puede utilizar para la degradación enzimática de desechos de agricultura, para la producción de combustibles de alcohol y otros compuestos quimicos industriales importantes, para la producción de productos alimenticios para animales o seres humanos o como componente en una composición detergente. Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar los alcances de la presente invención, de ninguna manera. Todas las referencias de patente y literatura científica citadas en la presente descripción, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. EJEMPLOS Ejemplo 1- Clona de ADNc de Trichoderma reesei Codificadora de una Nueva Xilanasa La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 2) de una clona de ADNc obtenida de una biblioteca de ADNc preparada a partir de ARN de Trichoderma reesei después de haber crecido en una fuente de carbono mixta, por medio de los métodos comunes en la técnica. Se identificó un marco de lectura abierta de 1518 nucleótidos y la proteína codificada fue deducida. Se predijo que la proteína madura tendría 465 aminoácidos de longitud. La XYL-IV anteriormente identificada carece del dominio de unión a la celulosa (DUC) de algunas de las celulasas producidas por Trichoderma y otras celulasas micóticas. Los DUCs también están asociados con algunas enzimas micóticas extracelulares no celulolíticas, tales como la acetilxilano esterasa y la mananasa de Trichoderma reesei (longibrachiatum) . La XYL-IV anteriormente identificada también carece de una secuencia que tiene identidad con las regiones ligadoras o de bisagra presentes en las celulasas de Trichoderma y otras celulasas micóticas y que conectan al DUC con el dominio catalítico. Se observan regiones con identidad de secuencia y similitud de secuencia entre la secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 2) de la xilanasa de Trichoderma de la Figura 2 y secuencias conocidas de glucosidasas microbianas y ciertas secuencias de función desconocida. La identidad y similitud se detectaron en una búsqueda de bancos de datos de secuencias de proteínas llevada a cabo con el programa BLAST (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) u otro programa similar conocido en la técnica. La similitud de secuencia se determinó por los métodos estándar. En particular, se llevaron a cabo comparaciones de aminoácidos apareados empleando el programa GAP del paquete de software de análisis de secuencias GCG de Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, EUA. La similitud de secuencia se determinó por métodos estándar. Este análisis de secuencia de aminoácidos de la XYL-IV de T. reesei se reporta en la Tabla 1, utilizando el programa GAP con la matriz de sustitución de aminoácidos blosum62, con un peso de los huecos de 12 y un peso de longitud de 2. Este análisis de la secuencia de aminoácidos de la XYL-IV de G. reesei, se reporta en la Tabla 1.

Tabla 1 - Comparaciones de Identidad y Similitud de Secuencia de XYL-IV Ejemplo 2 - Caracterización de la XYL-IV La XYL-IV se caracterizó por varios métodos comunes para la caracterización de proteínas y enzimas. Se aisló la XYL-IV de Trichoderma reesei.

Después de una electroforesis en gel de poliacrilamida, esta XYL-IV muestra un peso molecular de aproximadamente 43.0 kDa. Esta XYL-IV tiene varias isoformas, cada una con un punto isoeléctrico (pl) de aproximadamente 7, determinado por el sistema PHAST® (Pharmacia) . La ligera tinción con el reactivo de Schiff, indica sólo un bajo nivel de glucosilación. El gen XYL-IV fue expresado cuando Trichoderma reesei se hizo crecer en celulosa como única fuente de carbono, pero no cuando se hizo crecer en glucosa como única fuente de carbono. Lo que se piensa que es una secuencia de aminoácidos N-terminal de la XYL-IV madura, se determinó por degradación de Edman después de un rompimiento con tripsina de la proteina y el aislamiento de los péptidos por CLAR de fase reversa en C18. ' La secuencia N-terminal se determinó que era: Xaa-Ser-Tyr-Ala-Thr-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Xaa-Ala-Asn-Ile-Xaa-Ile-en donde Xaa indica un aminoácido que no £ue identificado debido a una señal insuficiente. La XYL-IV es homologa a las xilanasas que son clasificadas como pertenecientes a la familia 5 de las glucosil hidrolasas. Empleando un sustrato de xilano, el cual podría no ser el sustrato óptimo para la XYL-IV, el pH óptimo de actividad de la XYl-IV se observó entre pH 3.5 y 4. Esto difiere del pH óptimo para la XYL-II, pH 5-5.5 y de la XYL-I, pH 3.5,-4.5. A pH 4, la XYL-IV mostró los niveles más altos de actividad, a temperaturas entre 40 y 50°C. Esta enzima retuvo la actividad en solución a temperatura ambiente durante varias horas, pero lentamente perdió actividad a temperaturas elevadas. La especificidad de sustrato de la XYL-IV se determinó para sustratos macromoleculares y p-nitrofenil-glucósidos. Las siguientes sustancias macromoleculares no fueron degradadas significativamente por la XYL-IV, después de 24 horas a 40°C, a pH 4 en una solución reguladora de citrato de sodio: glucomanano (goma konjac, Megazyme) , galactomanano (algarroba, Sigma) , ß-glucano (cebada, Megazyme) , carboximetilcelulosa (Fluka) , laminarina (Sigma) o xilobiosa. Empleando sustratos de p-nitrofenilglucósido conocidos, la XYL-IV no mostró la actividad esperada para una a-arabinofuranosidasa, una a-galactosidasa, una ß-xilosidasa o una ß-manosidasa. La XYL-IV fue evaluada adicionalmente con respecto a la hidrólisis de varios sustratos, en presencia y ausencia de XYL-I y XYL-II. La Tabla 2 describe los sustratos empleados en estos estudios. La composición de monosacáridos de cada sustrato fue analizada por CIAR después de concluir la hidrólisis enzimática hasta obtener monosacáridos . Tabla 2 - Sustratos para los Experimentos de Hidrólisis * Casi cada segunda unidad de xilosa es portadora de un sustituyente acetilo. ** Todavía estaba presente una pequeña cantidad de oligosacáridos desconocidos después de concluir la hidrólisis enzimática. nd = no determinado. La XYL-IV se comparó con la XYL-I y la XYL-II en un experimento en el cual se empleó una pequeña cantidad de enzima y sólo una pequeña porción (típicamente <10%) de cada sustrato fue hidrolizada. Los azúcares reductores formados por las enzimas fueron ensayados por el método DNS, el cual es conocido en la técnica. Los xilo-oligosacáridos (1-meros a 5-meros, Xili a Xils) se determinaron por CLAR utilizando oligosacáridos comerciales como estándares. La hidrólisis se estudió bajo condiciones de: 24 h, 40°C, pH 4.0 (XYL I y XYL IV) y pH 5.0 (XYL II). Los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 - Hidrólisis de Xilanos (5 g/L) por XYLs-I, -II y - IV de Trichoderma reesel.

* Los oligosacáridos fueron desacetilados durante el análisis de CLAR, por lo tanto, los valores representan xilo-oligosacáridos tanto acetilados como no acetilados después de la hidrólisis.

+ Suma total de Xil + Xil2 + Xil3 + X1I4 + Xils En estos experimentos, la XYL-IV exhibió una mayor actividad frente a xilano no sustituido y MeGlcA-xilano acetilado, en comparación con la XYLs-I y -II. Tanto la XYL-IV como la -II hidrolizaron al MeGlcA-xilano desacetilado. La XYL-II exhibió una mayor actividad que la XYL-IV sobre los arabinoxilanos. La XYL-IV produjo xilosa como producto principal, con menos cantidades de xilobiosa y xilo-oligosacáridos sustituidos. Las otras dos xilanasas produjeron una mezcla de productos muy diferente (Tabla 3) . Los productos y la actividad de la XYL-IV fueron diferentes de aquellos de la familia 11 y la familia 10 de las glucosilhidrolasas . La especificidad de sustrato de la XYL-IV se caracterizó adicionalmente empleando varios sustratos de oligosacáridos aislados (Tabla 4) . La hidrólisis se estudió bajo condiciones de: pH 4.0, 40°C, 1 hora. Tabla 4 - Hidrólisis de Oligosacáridos Sustituidos (0.5-0.7 g/L) por la XYL-IV de T. reesei (500 nkat/g) * Estructuras publicadas en Tenkanen et al. 1996.

** Más probablemente Ara2Xil3 + Ara2Xil4 En estos experimentos, la XYL-IV rompió el enlace entre las dos unidades de xilosa no sustituidas, pero no el enlace entre una unidad de xilosa sustituida y una unidad de xilosa no sustituida. Sin embargo, la XYL-IV rompió más cerca a la unidad sustituida que las XYL-I ó -II. La XYL-IV dejó sólo una unidad no sustituida en el extremo reductor del oligosacárido. La cantidad de XYL-IV necesaria para una hidrólisis eficiente de HexA3Xil3 fue evaluada incubando una mezcla de Hex2Xil2 + Hex3Xil3 durante 1 hora a 40°C. Se obtuvo una hidrólisis casi completa del HexA3Xil3 utilizando 30 mg (500 nkat) de XYL-IV por gramo de HexAXil3 (Tabla 5, Figura 4) . Tabla 5 - Hidrólisis de He A^ila mediante la XYL-IV Dosis Dosis HexAXil3 HexAXil2 Xil Xil2 (mg/g) (nkat/g) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) 0 0 270 115 < 4 7 0.65 10 260 130 6 9 3.2 51 220 160 18 7 6.5 104 150 190 30 8 32 512 13 270 30 8 65 1040 < 4 290 66 9 324 5200 < 4 290 67 8 648 10400 < 4 290 65 8 - - La XYL-IV fue efectiva para la hidrólisis de varios xilanos poliméricos del centeno, el xilano no sustituido, MeGlcA-xilano y arabinoxilano. El arabinoxilano fue degradado más lentamente que los otros dos xilanos, los cuales fueron degradados a velocidades aproximadamente iguales (Figura 5) . Ejemplo 3 - Hidrólisis de Sustrato por Combinaciones o Mezclas de XYLs-I, -II y -IV La hidrólisis de varios sustratos, ya sea simultánea o secuencial con XYLs-I, -II y -IV, demostró que la XYL-IV exhibe una sinergia con las otras xilanasas. La Tabla 6 y la Figura 6 muestran los resultados de un estudio en el cual se incubó un sustrato individualmente con una de las XYLs-I, -II ó -IV, o con.una combinación de estas xilanasas. El efecto de agregar XYL-IV fue más que aditivo. Es decir, se observó sinergia. Aunque no limitante para la presente invención, se piensa que esta sinergia principalmente se debe a la capacidad de la XYL-IV de hidrolizar oligosacáridos lineales y sustituidos producidos por las XYL I y II.

Tabla 6 - Sinergia de la XYL-IV con las XYLs-I y -II - Condiciones: pH 40°C, 24 horas, concentración del sustrato 5 g/L. * Suma total de XÍI+XÍI2+XÜ3+XÍI4+XÍI5. ** Suma total calculada como xilosa. +** No analizado por CIAR. **** El grado de hidrólisis de este sustrato normalmente fue bajo en estos experimentos. ***** Los oligosacáridos fueron desacetilados durante el análisis de CIAR, asi que los valores representan xilo-oligosacáridos tanto acetilados como no acetilados después de la hidrólisis. La Tabla 7 y la Figura 7 muestran los resultados de un estudio en el cual se incubó un sustrato con XYL-I, esta enzima se inactivó por calor y después el sustrato fue incubado con XYL-IV. Esto dio como resultado el rompimiento secuencial del sustrato por la XYL-I seguida por la XYL-IV. Una vez más, se observó sinergia entre las XYL-I y XYL-IV.

Tabla 7 - Hidrólisis por Pasos realizada por XYL-I Seguida por XYL-IV Condiciones: pH 4, 40°C, 24 horas + 24 horas, concentración del sustrato 5 g/L; XYL I (100 nkat/g ó 5000 nkat/g) y XYL IV (20 nkat/g) . * Suma total de Xil+Xil2+Xil3+Xil4+Xil5. ** Suma total calculada como xilosa.

Ejemplo 4 - Preparación de una Molécula de ADN Clonada que Codifica para XYL-IV de Trichodezma Se proporciona el siguiente como un método para preparar una clona que incluye un gen completo xyl4 descrito en el Ejemplo 1. En este ejemplo, se prepararon clonas de ADN genómico de ADNc derivadas de Trichoderma, empleando el siguiente procedimiento. Se sintetizó un par de oligonucleótidos adecuados para utilizarse como cebadores de RCP y basados en la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 1. Se realizó una reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) utilizando estos cebadores y, como plantilla, ADN genómico total aislado de Trichoderma reesei, por ejemplo, de la cepa QM6a (ATCC 13631). La enzima ADN polimerasa (eg., Pwo polimerasa), la solución reguladora y la mezcla de desoxinucleótidos utilizadas, fueron suministradas por Boehringer Mannheim. Se utilizaron las condiciones tipicas para una RCP, tales como: paso 1, 1 min a 94°C; paso 2, 40 seg. a 92°C; paso 3, 1 min a 50°C; paso 4, 2 min a 72°C, los pasos 2, 3 y 4 se repitieron 29 veces; paso 5, 5 min a 72°C. El principal producto de ADN de la RCP fue digerido con enzimas de restricción, e.g., GglII y Xbal, que reconocieron los sitios agregados por los dos cebadores y el fragmento resultante se purificó en un gel de electroforesis en agarosa. Este fragmento de ADN fue ligado a un vector apropiado, el cual fue digerido con las mismas enzimas de restricción, por ejemplo, pSL1180 (Pharmacia), el cual había sido digerido con, e.g., BglII y Xbal. El plásmido resultante típicamente es secuenciado para confirmar que el inserto corresponda al fragmento esperado del gen xyl4 de Trichoderma. La secuencia de ADN revela la presencia de cualquier intrón y exón en el gen. El plásmido o el inserto que contiene, ahora se puede utilizar como sonda de hibridación para permitir que el gen xyl4 completo sea clonado a partir de cualquier biblioteca de ADN genómico o de ADNc de interés. Debido a que no existen regiones DUC o ligadoras (de bisagra) , el ADN codificador de xyl4 dentro del plásmido no incluye estas regiones. Por lo tanto, por diseño, se esperaría que se hibridizara con otras secuencias de ADN de xyl4, pero no con las secuencias codificadoras de DUC, las cuales podrían ser parte de otros genes de xilanasa o glucosidasa. Se sometió a una digestión separadamente ADN genómico total de T. reesei, por ejemplo, de la cepa QM6a, con una variedad de diferentes endonucleasas de restricción y después a una electroforesis en gel de agarosa. El ADN subsecuentemente se sometió a una inmunoelectro-transferencia con un filtro de membrana Nytran (S&S) y se sondeó con un fragmento de ADN de xyl4 aislado del plásmido y marcado con P, aplicando el sistema de- marcado aleatorio Megaprime, suministrado por Amersham. La hibridación con la sonda se realizó en condiciones moderadamente estrictas en una solución reguladora típica, por ejemplo, que contenía 30% de formamida, 5X SSPE, 0.5% de SDS, a 38°C. El filtro de membrana, posteriormente, se lavó en condiciones moderadamente estrictas, por ejemplo, en 2X SSC, 0.1% de SDS a 55°C, antes de ser expuesto a una película de rayos X. Los resultados indican que la copia genórtiica del gen xyl4 de T. reesei reside en un fragmento de restricción apropiado. Dado el gen xyl4 ejemplificado tal como se muestra en los párrafos anteriores, sería rutinario para un técnico en la materia clonar el gen xyl4 de Trichoder a reesei a partir de bibliotecas de ADN o ADNc mediante una hibridación de colonias, empleando como sonda un fragmento de RCP insertado en un plásmido, de la manera anteriormente descrita. Ejemplo 5 - Método para Aislar Secuencias de ADN que Codifican para XYL-IVs en Microorganismos La técnica general de los Ejemplos 1 y 4 se puede adaptar en conjunto con técnicas conocidas, para obtener clonas que incluyan genes de XYL-IV provenientes de otros hongos y bacterias. Se puede marcar n plásmido adecuado o un inserto de ADN aislado que codifica para una parte del gen xyl4, al igual que se puede marcar la molécula completa de xyl4. Entonces, esta sonda de ADN, se puede utilizar para hibridizarse con ADN genómico o ADNc proveniente de otros hongos o bacterias. Una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la XYL-IV de Trichoderma, con las secuencias de aminoácidos conocidas de otras xilanasas, identifica ciertas regiones de aminoácidos que son conservadas entre la XYL-IV y otras xilanasas. Estas regiones conservadas proporcionan la base para el diseño de cebadores degenerados, para ser utilizados en una amplificación por RCP del ADN codificador de XYL-IV proveniente de otros microorganismos . Tales métodos - son generalmente conocidos en la técnica y se consideran rutinarios (véase e.g., McPherson et al., PCR A PRACTICAL APPROACH PP. 171-186 (1991)). Los oligonucleótidos derivados de una o más de estas secuencias de aminoácidos, se podrían utilizar como cebadores para realizar experimentos rutinarios de RCP, empleando ADN genómico. Después, podrían obtenerse fácilmente ADN genómico o ADNc proveniente de cualquier microorganismo y se podrían utilizar como plantillas en tales experimentos de RCP. De esta manera, sería posible clonar genes que codifican para una XYL-IV a partir de una variedad de microorganismos.

Ejemplo 6 - Método de Hibridación Heteróloga para el Aislamiento de Secuencias Codificadoras de XYL-IV a Partir de Otros Microorganismos Se puede digerir ADN genómico de diferentes microorganismos con una enzima de restricción apropiada, tal como HindlII, y se puede analizar en un gel de agarosa al 1.0%. El gel es despurinado, desnaturalizado y sometido a inmunoelectrotransferencia, y la membrana se retícula por UV mediante procedimientos conocidos. La prehibridación, hibridación, mareaje de la zona y detección, se realizan utilizando métodos conocidos, tales como el Sistema DIG/Genius™ de Boehringer Mannheim. Una sonda corresponde a la secuencia de nucleótidos codificadora de la molécula completa de XYL-IV de T. reesei. La subclona de ADNc original (Ejemplo 1) se somete a una digestión con un par apropiado de enzimas de restricción y el fragmento resultante se marca con DIG-dUTP (digoxigenina-dUTP) , a través de un marcado con cebador aleatorio, de conformidad con las instrucciones · del fabricante (Boehringer Mannheim) . La membrana es prehibridizada y después hibridizada en un reactivo de bloqueo apropiado, tal como 5 x SSC -0.1% de N-laurosilcarcosina - 0.02% de SDS - 1% de reactivo de bloqueo Genius'"*, a una temperatura adecuada, tal como 45°C. La hibridación (típicamente durante una noche) es seguida por varios lavados. Después, se realiza la detección y visualización con un conjugado apropiado, tal como un sustrato quimioluminiscente CSPD®, de conformidad con las instrucciones del fabricante. Este método y variaciones del mismo (diferentes condiciones de hibridación y lavado) se puede utilizar para detectar genes que codifican para XYL-IV en cualquier organismo . La presente invención ha sido descrita con referencia a varias modalidades y técnicas especificas y preferidas. Sin embargo, debe entenderse que es posible realizar numerosas variaciones y modificaciones sin apartarse del espíritu y los alcances de la presente invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un ácido nucleico aislado que comprende ADN que tiene cuando menos 60% de identidad de secuencia (a) una molécula de ADN que codifica para el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la SEQ ID NO: 1, o (b) el complemento de la molécula de ADN del inciso (a) . 2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una molécula de ADN que codifica para el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la SEQ ID NO: 1. 3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. 4 ? El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ADN tiene cuando menos 70% de identidad de secuencia, cuando menos 80% de identidad de secuencia o cuando menos 90% de identidad de secuencia. 5. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. 6. Una proteina XYL-IV ' parcial o totalmente aislada, caracterizada porque se deriva de un microorganismo . 7. La proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteina XYL-IV se deriva de un hongo o una bacteria. 8. La proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el hongo comprende un hongo filamentoso. 9. La proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma spp.; Humicola spp.; Neurospora spp., Aspergillus spp., F sarium spp., Penicillium spp. ó Gliocadium spp. 10. La proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma reesei. 11. La proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó (b) un derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en donde la XYL-IV de los incisos (a) o (b) degrada el xilano. 12. La proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia, cuando menos 90% de identidad de secuencia o cuando menos 951 de identidad de secuencia . 13. La proteína XYL-IV de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. 14. Un ADN aislado caracterizado porque codifica para la proteina XYL-IV de conformidad con la reivindicación 6. 15. El ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque se deriva de un hongo o una bacteria . 16. El ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el hongo comprende un hongo filamentoso . 17. El ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma spp.; Humicola spp.; Neurospora spp. , Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp. ó Gliocadium spp. 18. El ADN de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma reesei. 19. el ADN de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende (a) una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó (b) un derivado de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en donde el ADN de los incisos (a) o (b) codifica para una proteina XYL-IV que degrada el xilano. 20. Un ADN aislado caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. 21. Un vector caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 20. 22. El vector de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque está operablemente ligado a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 23. Una célula huésped transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 22. 24. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende un hongo filamentoso . 25. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma spp. ; Humicola spp. ; Neurospora spp., Aspergillus spp. ó Fusarium spp. 26. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma reesei. 27. Un método para producir una proteína XYL-IV, caracterizado porque comprende: (a) obtener una célula huésped que ha sido transformada con un vector que comprende ADN que codifica para una proteína XYL-IV; (b) cultivar la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión y, opcionalmente, la. secreción de la proteína XYL-IV; (c) recuperar la proteína XYL-IV. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el ADN se deriva de un hongo filamentoso. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma spp.; Humicola spp.; Neurospora spp., Aspergillus spp., Fusarium spp. o Gliocladium spp. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el hongo filamentoso comprende Trichoderma reesei. 31. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el ADN comprende (a) una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 ó (b) un derivado de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en donde el ADN codifica para una proteina XYL-IV que degrada el xilano. 32. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el ADN comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. 33. Un método para alterar las propiedades de un sustrato que contiene xilano, caracterizado porque comprende poner en contacto el sustrato que contiene xilano con una composición que comprende la proteína XYL-IV producida por el método de conformidad con la reivindicación 27. 3 . El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende alterar las propiedades de manejo de alimento de animales y productos alimenticios y materiales de plantas. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende alterar las propiedades de pulpa de madera o derivados de la misma durante la manufactura del papel. 36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende alterar las propiedades de biomasa que contiene xilano durante su reducción a glucosa. 37. Un anticuerpo caracterizado porque se une específicamente a una XYL-IV. 38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende un" anticuerpo monoclonal . 39. Un método para identificar un ácido nucleico con homología a un ácido nucleico que codifica para XYL-IV, caracterizado porque comprende: hibridizar un ácido nucleico de prueba bajo condiciones al menos moderadamente estrictas con un ácido nucleico de xyl4 de cuando menos aproximadamente 14 nucleótidos contiguos de ADN, que tiene cuando menos 60% de identidad con (a) una molécula de ADN que codifica para el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc. de la SEQ ID NO: 1, o (b) el complemento de la molécula de ADN del inciso (a) ; seleccionar un ácido nucleico de prueba que se hibridice con el ácido nucleico de xyl4; aislar el ácido nucleico de prueba hibridizado. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ácido nucleico de prueba hibridizado codifica para una XYL-IV. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ácido nucleico de prueba hibridizado codifica para una xilanasa todavía no categorizada. 42. El método de . conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ácido nucleico de prueba hibridizado codifica para una xilanasa. 43. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones altamente estrictas. 44.. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene cuando menos aproximadamente 10 nucleotidos y comprende ADN que tiene cuando menos 60% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica para el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la SEQ ID NO: 1, o (b) el complemento de la molécula de ADN del inciso (a) .