CN102676675A - Trichoderma reesei木聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的木聚糖酶(称之为XYL-IV)并且涉及编码那些木聚糖酶的核酸分子。本发明还涉及鉴定与XYL-IV编码核酸同源的核酸的方法、分离的核酸及其用途。

Description

Trichoderma reesei木聚糖酶
政府赞助的研究和发展
不适用。
发明背景
木材的复杂结构包括纤维素，半纤维素和木质素，以及其它次要成分。木质素和纤维素与半纤维素相结合，并且可能部分共价键合纤维素与半纤维素两者。在造纸工艺中，通常从木浆中去除木质素，因为其带来褐色，降低了强度并且给最终产品带来其它不期望的特征。能够用很多方法实现木质素的去除。
通过化学制浆(例如Kraft方法)最初从木浆中去除大部分木质素。在接下来的漂白过程中，化学纸浆常常与氯和其它去木质化学品反应进一步去除木质素，并且然后与漂白剂反应来修饰来自纸浆的木质素，给出稳定的变白的纸浆。但是，从环境角度出发不期望用氯处理，因为产生的排放物含有大量有毒化合物(例如氯化酚类)。考虑到用含氯化学品漂白的纸浆引起的环境有害作用，驱使工业寻求可替代的漂白方法。
文献中描述过利用木聚糖酶和来自真菌和细菌来源的其它酶来增强去木质作用和增白(brightening)，同时减少或消除氯化合物的使用的尝试。但是，现有酶体系通常不容易实现半纤维素的降解或去木质作用达到充分的程度。通过应用另外的木聚糖酶可以提高半纤维素的降解和去木质作用的程度，所述另外的木聚糖酶以不同的方式裂解木聚糖或者与其它木聚糖酶，半纤维素酶，其它酶，或者甚至化学品协同作用。
已经鉴定和表征了多种来自真菌和细菌微生物的木聚糖酶(参见，例如，美国专利5,437,992；Coughlin，M.P.上文；Biely，P.等，Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reeseiCellulases and Other Hydrolases，Espoo 1993，P.Souminen和T.Reinikainen编著，Foundation for Biotech nical and IndustrialFermentation Research 8：125-135(1993))。特别地，已经在T.reesei中鉴定了三种具体的木聚糖酶(XYL-I，XYL-II，和XYL-III)(Tenkanen，等，Enzyme Microb.Technol.14：566(1992)；
Figure BDA00001628052400021
等，Bio/Technology 10：1461(1992)；和Xu，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：718(1998))。
尽管文献中描述过很多种木聚糖酶，但是依然存在鉴定在与动物饲料，谷物加工，生物燃料，洗涤，织物护理，化学品，植物加工，和对纸浆和纸去木质和增白相关的应用中更有效的新的木聚糖酶的需要。
发明概述
申请人鉴定了cDNA克隆，其编码这里指定为XYL-IV的新的木聚糖酶并且与前面描述的木聚糖酶具有一定序列同一性。
在一个实施方案中，本发明提供了包括编码XYL-IV的DNA的分离的核酸分子。在某些方面，所述分离的核酸包括编码具有图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的XYL-IV的DNA，或者与这样的编码核酸序列互补。优选地，编码XYL-IV蛋白质的DNA来自微生物，优选来自真菌或细菌。优选地，所述DNA来自丝状真菌例如木霉属(Trichodermaspp.)，腐质霉属(Humicola spp.)，链孢霉属(Neurospora spp.)，曲霉属(Aspergillus spp.)，镰孢属(Fusarium spp.)，青霉属(Penicillium spp.)，或者胶霉属(Gliocladium spp.)，更优选来自木霉属(Trichoderma spp)。还优选所述DNA包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。或者，所述DNA与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少50％，60％，或70％，优选至少85％或90％的序列同一性，或者包括SEQID NO：1核苷酸序列的衍生物，其中所述DNA编码裂解木聚糖，支化木聚糖或木寡糖(xylooligosaccharides)的XYL-IV蛋白质。包括这样的DNA的载体，转化有这样的载体的宿主细胞，以及这样的转化的宿主细胞产生的发酵肉汤也在本发明的范围内。
本发明的另一个实施方案提供了部分或全部分离的XYL-IV蛋白质。优选地，所述XYL-IV来自微生物，优选来自真菌或细菌。优选地，所述XYL-IV来自丝状真菌，更优选来自丝状真菌例如木霉属(Trichoderma spp.)，腐质霉属(Humicola spp.)，链孢霉属(Neurospora spp.)，曲霉属(Aspergillus spp.)，镰孢属(Fusariumspp.)，青霉属(Penicillium spp.)，或者胶霉属(Gliocladium spp.)，最优选来自木霉属(Trichoderma spp)。特别地，本发明提供了分离的天然序列XYL-IV，其在一个实施方案中，包括包含图2的第1-465位残基(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。在本发明的优选实施方案中，所述XYL-IV包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少50％或70％，优选至少85％或90％序列同一性，或者包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的衍生物，其中XYL-IV裂解木聚糖。
本发明的另一个实施方案提供了制备XYL-IV蛋白质的方法，包括步骤(a)获得用包括编码XYL-IV蛋白质的DNA的载体转化的宿主细胞；(b)在适合表达并且任选地适合XYL-IV蛋白质分泌的条件下培养宿主细胞；和(c)从含有XYL-IV蛋白质的发酵肉汤回收。
在另一个实施方案中，本发明提供了与XYL-IV蛋白质或者其结构域特异性结合的抗体。任选地，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了使用XYL-IV蛋白质或者编码XYL-IV蛋白质的DNA的方法。
附图的简要描述
图1说明在混合碳源上培养之后从Trichoderma reesei RNA获得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2说明来自Trichoderma reese的新XYL-IV的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3说明沿着图1的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)限制酶切位点的位置。
图4说明HexA3Xyl3的有效水解。数值来自表5。
图5说明通过XYL-IV自木聚糖，MeGIcA-木聚糖和黑麦的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)产生还原糖。每一种木聚糖以5g/L存在，并且反应在40℃和pH 4下进行。
图6a和6b说明XYL-IV和XYL-I及-II每一种的协同作用。
作为还原糖(图6a)和游离的木糖(图6b)测定产物。数值来自表6。
图7a-d说明XYL-I和XYL-IV逐步作用中的协同作用。在图7a和7b中，底物是MeGIcA-木聚糖。在图7c和7d中，底物是黑麦阿拉伯木聚糖。数值来自表7。
本发明的详细描述
定义
应该注意，如在该说明书和附加的权利要求书中使用的，除非另有明确说明，单数形式“一个”，“一”和“这个”包括复数指示物。因此，例如，关于含有“化合物”的组合物包括两种或多种化合物的混合物。还应该注意，除非另有明确说明，术语“或者”一般以其包括“和/或”的意义被使用。
“木聚糖酶”指来自微生物例如真菌，细菌，或者来自植物或动物的蛋白质或多肽的蛋白质或多肽结构域，并且其具有在木聚糖碳水化合物骨架(包括支化的木聚糖和木寡糖)的一个或多个不同的位点催化裂解木聚糖的能力。在一定条件下，木聚糖酶也可以催化从较小的单元合成糖例如木聚糖或木寡糖。文献中已知来自T.Reesei的三种具体的木聚糖酶。
如这里所使用的，“XYL-IV”指具有木聚糖酶活性的酶，并且其一般在其天然或野生形式没有纤维素结合域。本发明的XYL-IV包括包含图2的第1-465位残基(SEQ ID NO：2)的蛋白质，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少50％或70％，优选至少85％或90％序列同一性的蛋白质，或者SEQ ID NO：2的氨基酸序列的衍生物，其中XYL-IV裂解木聚糖。本发明提供的XYL-IV具体排除三种已知的T.Reesei木聚糖酶，它们被称为XYL-I，XYL-II(属于糖基水解酶家族11)，和XYL-III(属于糖基水解酶家族10)，并且描述于
Figure BDA00001628052400041
等和Xu，等，上文。相信XYL-IV以和三种已知的T.Reesei木聚糖酶不同的方式作用于木聚糖，但是也可以裂解某些相同的位置。
这里考虑XYL-IV可以来自各种各样的任何来源，包括微生物，例如真菌或细菌，植物，或动物。具体地说，预计具有纤维素溶解能力的微生物将是极好的XYL-IV蛋白质的来源。在本发明特别优选的实施方案中，XYL-IV来自木霉属(Trichoderma spp.)，特别是Trichodermareesei。但是，还优选地，根据本发明的XYL-IV和/或编码XYL-IV的DNA来自真菌，例如，犁头霉属(Absidia spp.)；支顶孢属(Acremonium spp.)；蘑菇属(Agaricus spp.)；Anaeromyces spp.；曲霉属(Aspergillus spp.)，包括棘孢曲霉(A.aculeatus)，泡盛曲霉(A.awamori)，黄色曲霉(A.flavus)，臭曲霉(A.foetidus)，丁烯二酸曲霉(A.fumaricus)，烟曲霉(A.fumigatus)，构巢曲霉(A.nidulans)，黑色曲霉(A.niger)，米曲霉(A.oryzae)，土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidium spp.；头孢属(Cephalosporium spp.)；毛壳霉属(Chaetomiumspp.)；Coprinus spp.；Dactyllum spp.；镰孢属(Fusarium spp.)，包括F.conglomerans，多隔镰孢(F.decemcellulare)，爪哇镰孢(F.javanicum)，亚麻镰孢(F.lini)，尖孢镰孢(F.oxysporum)和茄病镰孢(F.solani)；胶霉属(Gliocladium spp.)；腐质霉属(Humicola spp.)，包括H.insolens和H.lanuginosa；毛霉属(Mucor spp.)；链孢霉属(Neurospora spp.)，包括粗糙链孢霉(N.crassa)和嗜食链孢霉(N.sitophila)；Neocallimastix spp.；Orpinomyces spp.；青霉属(Penicillium spp)；Phanerochaete spp.；射脉菌属(Phlebia spp.)；Piromyces spp.；根霉属(Rhizopus spp.)；裂褶菌属(Schizophyllum spp.)；栓菌属(Trametes spp.)；木霉属(Trichoderma spp.)，包括T.reesei，T.reesei(longibrachiatum)和绿色木霉(T.viride)；和接霉属(Zygorhynchus spp.)。
优选地，根据本发明的XYL-IV蛋白质是分离的或纯化的。所谓纯化或分离指通过将XYL-IV与其自然界相关的天然存在成分的一些或全部分开而从其自然状态改变XYL-IV蛋白质。这样的分离或纯化可以通过本领域公知的分离技术来实现，例如离子交换层析，亲和层析，疏水分离，透析，蛋白酶处理，硫酸铵沉淀或者其它蛋白质盐沉淀，离心，大小排阻层析，过滤，微过滤，凝胶电泳或者梯度分离来去除全部的细胞，细胞碎屑，杂质，外来蛋白质，或者最终组合物中不期望的酶。然后还可以向含有XYL-IV的组合物中加入提供另外的益处的成分，例如，活化剂，抗抑制剂，期望的离子，控制pH的化合物或者其它酶。优选地，通过重组方法制备根据本发明的XYL-IV蛋白质。
如这里所使用的，“微生物”指细菌，真菌，病毒，原生动物，和其它微生物或微生物体。如这里所使用的，“植物”指植物界的任何成员。如这里所使用的，“动物”指动物界的任何成员。动物可以是单细胞动物或多细胞动物。
如这里所使用的，“衍生物”指通过在C-末端和N-末端之一或两端加上一个或多个氨基酸，在氨基酸序列的一个或多个不同的位点替代一个或多个氨基酸，在蛋白质的一端或两端或者在氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，或者在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而从前体蛋白质(例如天然蛋白质)衍生的蛋白质。优选通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列，将该DNA序列转化到合适的宿主中，并且表达该经修饰的DNA序列，形成衍生的XYL-IV，实现XYL-IV衍生物的制备。
本发明的“衍生物”包括其中肽保留了前体XYL-IV的特征性XYL-IV特性但是在某些具体方面具有改变的性质的与前体氨基酸序列(例如，野生型或天然状态XYL-IV)相比包括改变的氨基酸序列的肽。例如，所述XYL-IV衍生物可以具有提高的最适pH值或提高的温度或氧化稳定性但是保留其特征性木聚糖修饰活性。类似地，根据本发明的衍生物包括纤维素结合域，其可以以这样的方式被加入，去除或修饰，使得显著削弱或增强其纤维素结合能力。根据本发明的衍生物包括木聚糖或者其它底物的结合域，其已经被加入或修饰来改变其底物结合能力。还考虑根据本发明的衍生物衍生自其中保留表达的XYL-IV衍生物的功能活性的编码XYL-IV衍生物的DNA片段。衍生物进一步包括改变XYL-IV特征的化学修饰。
通常，XYL-IV衍生物与图2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有至少大约50％，70％，或85％的氨基酸序列同一性，优选至少大约85％氨基酸序列同一性，更优选至少大约90％氨基酸序列同一性，甚至更优选至少大约95％氨基酸序列同一性，和更优选98％氨基酸序列同一性。优选地，所有的氨基酸替代是使用L-氨基酸的“保守型氨基酸替代”，其中一个氨基酸被另一个生物学类似氨基酸替代。保守型氨基酸替代是保持被替代的氨基酸的总电荷，疏水性/亲水性，和/或空间位阻的那些。保守型替代的例子是下面各组中的那些：Gly/Ala，Val/Ile/Leu，Lys/Arg，Asn/Gln，Glu/Asp，Ser/Cys/Thr，如Phe/Trp/Tyr。衍生物的不同可以在于，例如，1-10个这样少的氨基酸残基，例如6-10个，象5这样少，象4，3，2这样少，或者甚至1个氨基酸残基。
如这里使用的，“天然序列XYL-IV”包括具有和从自然得到的XYL-IV相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列XYL-IV可以从自然界分离或者可以通过重组或合成方法制备。术语″天然序列XYL-IV″具体包括天然存在的XYL-IV的截短或分泌形式和XYL-IV的天然存在的变体形式(例如，不同剪接形式)。在本发明的一个实施方案中，天然序列XYL-IV包括图2的第1-465位氨基酸(SEQ ID NO：2)。
如这里使用的，与这里鉴定的氨基酸或核苷酸序列的“百分(％)序列同一性”定义为为了实现最大百分比序列同一性将序列比对并且，如果需要，引入间隙之后，而且不考虑所有的保守型替代作为序列同一性一部分，在候选序列中与XYL-IV序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。
进行序列比对并且测定序列同一性的方法是本领域技术人员公知的，可以进行而不需要过多的实验，并且可以明确获得同一性值的计算。参见，例如，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，例如，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本领域那些熟练技术人员能够确定用于测定比对的合适的参数，包括需要在要比较的序列的长度上实现最大比对所需的算法。优选地，使用程序确定的默认参数测定序列同一性。具体地说，通过MSPRCH程序(Oxford Molecular)中实施的Smith-Waterman同源性搜索算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997))能够测定序列同一性，采用下面的搜索参数使用亲族间隙搜索(affine gap search)：间隙开放损失12，间隙扩展损失1。优选地，利用Genetics Computer Group，Inc.，Madison，Wisconsin的GCG序列分析软件包的GAP程序，应用blosum62氨基酸替代矩阵，间隙权重12并且长度权重2，可以进行成对氨基酸比较。
关于两个氨基酸序列的最佳比对，变体氨基酸序列的连续片段可以相对参照氨基酸序列具有另外的氨基酸残基或者缺失的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列相比较的连续区段包括至少20个连续的氨基酸残基，并且可以是30，40，50，或者更多的氨基酸残基。通过指定间隙损失可以对与包括衍生物氨基酸序列中间隙相关的提高的序列同一性进行校正。
如这里使用的，“表达载体”指包括与在合适的宿主中能实现DNA表达的合适的调控序列可操作地连接的DNA序列的DNA构建体。这样的调控序列可以包括实现转录的启动子，任选的调控转录的操纵基因序列，编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。针对不同的细胞类型优选使用不同的表达载体。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中使用的载体的优选的启动子是AprE启动子；大肠杆菌(E.coli)中使用的优选的启动子是Lac启动子，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用的优选的启动子是PGK1，黑曲霉(Aspergillus niger)中使用的优选的启动子是glaA，Trichoderma reesei中使用的优选的启动子是cbhI。所述载体可以是质粒，噬菌体粒，或者简单地是潜在的基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中，该载体可以独立于宿主基因组而复制和发挥功能，或者可以，在合适的条件下，整合到基因组本身中。在本申请说明书中，质粒和载体有时互换使用。但是，本发明意在包括本领域公知的或者变为公知的起着等价功能的其它形式表达载体。因此，在本发明表达DNA序列时可以使用多种宿主/表达载体组合。有用的表达载体，例如，可以由染色体，非染色体和合成的DNA序列组成，例如各种已知的SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如，来自大肠杆菌的质粒，包括col E1，pCRl，pBR322，pMb9，pUC 19和它们的衍生物，宽宿主范围质粒，例如，RP4，噬菌体DNAs，例如，噬菌体λ的多种衍生物，例如，NM989，和其它DNA噬菌体，例如，M13和丝状单链DNA噬菌体，酵母质粒，例如2μ质粒或者其衍生物，真核细胞中有用的载体，例如在动物细胞中使用的载体和从质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体，例如经修饰应用噬菌体DNA或其它表达调控序列的质粒。使用本发明的表达载体的表达技术是本领域公知的并且一般性描述于，例如，Sambrook，等，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，SECOND EDITION，冷泉港出版社(1989)。经常地，通过整合事件直接插入到特定物种的基因组中而将包括本发明DNA序列的这样的表达载体转化到单细胞宿主中(参见，例如，Bennett & Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego，pp.70-76(1991)和这里引用的描述真菌宿主定向基因组插入的文章)。
如这里使用的，“宿主菌株”或者“宿主细胞”指用于包括本发明DNA的表达载体的合适的宿主。本发明中有用的宿主细胞一般是原核宿主或真核宿主，包括其中能够实现表达的任何可转化微生物。具体地说，宿主菌株可以是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，Trichoderma reesei，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者黑曲霉(Aspergillus niger)。用应用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞能复制编码XYL-IV及其衍生物或变体(突变体)的载体或者表达期望的肽产物。在根据本发明的优选实施方案中，“宿主细胞”指从木霉属(Trichoderma sp.)细胞和其产生的原生质体。
如这里使用的，“信号序列”指有利于在细胞外分泌成熟形式蛋白质的、与蛋白质的N-末端部分键合的氨基酸序列。信号序列的该定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程之中被裂解。
如这里使用的，“功能性连接”或者“可操作地连接”指，调控区，例如启动子，终止子，分泌信号或增强子区附加或连接于结构基因并且控制该基因的表达。
本领域技术人员容易确定杂交反应的“严紧性”，并且一般是根据探针长度，洗涤温度，和盐浓度的经验计算值。一般情况下，越长的探针要求适当退火的温度越高，而越短的探针需要越低的温度。当互补链存在于低于它们的熔解温度的环境中时，杂交作用一般取决于变性的DNA重新退火的能力。探针和杂交序列之间的预期同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。作为结果，得出较高的相对温度趋向于使反应条件更严紧，而较低温度严紧性较低。有关杂交反应严紧性的进一步详细描述和解释参见Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Wiley Interscience Publishers，1995)。
如这里使用的，“严紧条件”或者“高严紧条件”可以鉴定为：(1)对于洗涤使用低离子强度和高温度，例如，50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间使用变性剂，例如甲酰胺，例如，42℃下，含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)和750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50％(v/v)甲酰胺；或者(3)42℃下，使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt’s溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡聚糖，在42℃下用0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和在55℃下用50％甲酰胺洗涤，接着55℃下用含有EDTA的0.1x SSC组成的洗液高严紧性洗涤。
如这里使用的，“中等严紧条件”可以根据Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(纽约：冷泉港出版社，1989)定义，并且包括使用比上面描述的那些严紧性低的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度，离子强度，和％SDS)。中等严紧条件的一个例子是37℃下在下面的溶液中过夜温育，所述溶液包括：20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20mg/mL变性剪切鲑精DNA，接着在大约37-50℃下用1x SSC洗涤滤膜。本领域技术人员明白怎样根据需要调节温度，离子强度，等适应象探针长度等这样的因素。
如这里使用的，从微生物“来源的”物质(例如多核苷酸或蛋白质)指对微生物是天然产生的物质。
XYL-IV特异性
一般来说，XYL-IV表现出不同于11家族或10家族糖基水解酶的特异性。特别地，XYL-IV表现出的底物特异性不同于α-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-半乳糖苷酶，β-木糖苷酶，β-甘露糖苷酶的底物特异性。更特别地，XYL-IV以不同于XYL-1或-II或-III的特异性裂解底物。即，XYL-IV可以在和这些其它的木聚糖酶相同位置中的一些处裂解木聚糖，但是它也在不同的位置处裂解。
在一个实施方案中，在典型反应条件下，与XYL-I或XYL-II相比，XYL-IV表现出更大的对没有取代的木聚糖或者乙酰化MeGIcA-木聚糖的活性。XYLs-IV和-II两者都能水解脱乙酰MeGIcA-木聚糖。XYL-II一般表现出比XYL-IV更大的对阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)的活性。在裂解没有取代的木聚糖或乙酰化MeGIcA-木聚糖中，XYL-IV产生木糖作为其主要产物，有较少量的木二糖和取代的木寡糖。其它两种木聚糖酶产生不同的产物。与XYL-I或-II相比，XYL-IV一般在更接近于取代的木糖单元处裂解。
XYL-IV和XYLs-I和-II之间的特异性中的差异能够在这些酶的组合物或混合物对产物的裂解中产生协同作用。例如，XYL-IV与XYL-I和/或XYL-II的混合物对底物的裂解能够导致与更少的这些酶的裂解相比底物裂解速度和/或程度的大于加和性相加的提高的结果。类似地，不同的XYL或者XYL-I，-II和/或-IV的组合裂解之前一种或多种XYLs-I，-II和/或-IV对底物的裂解能导致与更少的这些酶的裂解相比底物裂解速度和/或程度的大于加和性相加的提高。
在一个实施方案中，XYL-IV能够裂解来自黑麦的几种聚合木聚糖，没有取代的木聚糖，MeGIcA-木聚糖，和阿拉伯木聚糖。一般情况下，与另两种木聚糖(以大约相等的速度被裂解)相比，XYL-IV更缓慢地裂解阿拉伯木聚糖。XYL-IV能够水解线性和取代的寡糖。XYL-IV，在典型反应条件下，不裂解，或者仅很少地裂解葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，β-葡聚糖，羧甲基纤维素，昆布多糖，或木二糖。
在另一个实施方案中，在某些反应条件下可以使用XYL-IV来催化糖的偶联，形成更大的糖。例如，对于从较小单元合成木二糖或木寡糖可以使用XYL-IV。或者，XYL-IV能够催化从较小单元形成糖衍生物。
XYL-IV的制备
本发明涉及XYL-IV和XYL-IV的衍生物的表达，分离和应用。优选通过重组方法制备XYL-IV或衍生物。但是，用于本发明的XYL-IV蛋白质可以通过其它本领域公知的方法获得，例如从自然界分离物中纯化或者化学合成。
从自然界分离物中纯化
通过公知公用方法能够从自然界分离物中纯化XYL-IV。例如，通过各种物理或化学方法破碎含有XYL-IV的细胞，例如冷冻解冻循环，超声，机械破碎，或者细胞溶解试剂。通过常规技术可以从介质中回收XYL-IV，包括通过离心，过滤，和用盐例如硫酸铵沉淀上清夜或滤液中的蛋白质而从介质中分离细胞。然后通过下面的方法可以从破碎的细胞纯化XYL-IV，例如：在离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅基材料或离子交换树脂例如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；和亲和色谱。可以使用各种蛋白质纯化方法，这样的方法是本领域公知的并且描述于例如Deutscher，酶学方法(Methods in Enzymology)182(1990)；Scopes，PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE，Springer-Verlag，纽约(1982)。将根据产生的特定XYL-IV或者根据该酶的来源选择纯化步骤。
化学合成
或者，可以通过应用固相技术直接肽合成产生XYL-IV序列，或者其部分(参见例如，Stewart，等，SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHES IS，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。利用人工技术或者自动化可以进行体外蛋白质合成。例如利用应用生物系统肽合成仪(Foster City，CA)根据厂商说明可以实现自动合成。可以分别化学合成XYL-IV的各部分并且利用化学或酶方法组合来制备全长XYL-IV。
重组方法
编码XYL-TV的DNA的分离
可以从由确信具有XYL-IV mRNA并且以可检测水平表达的微生物制备的cDNA文库获得编码XYL-IV的DNA。也可以从基因组文库或者通过寡核苷酸合成获得XYL-IV编码基因。
用设计来鉴定感兴趣的基因或者其编码的蛋白质的探针(例如XYL-IV的抗体或者至少大约20-80个碱基的寡核苷酸)能够筛选文库。可以应用标准程序进行使用选择的探针对cDNA或基因组文库的筛选，例如描述于Sambrook，等，上文。另一种分离编码XYL-IV的基因的方法是应用PCR方法(Sambrook，等，上文；Dieffenbach，等，PCRPRIMER：A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1995))。
筛选cDNA文库的已知技术中，选择作为探针的寡核苷酸应该具有足够长度和足够的明确性，使假阳性最小化。优选标记寡核苷酸使得其在与要筛选的文库中的DNA杂交时可以被检测。标记方法是本领域公知的，并且包括使用放射性标记物，象32P-标记的ATP，生物素化作用或酶标记。Sambrook，等，上文中提供了杂交条件，包括中等严紧性和高度严紧性。
可以将在这样的文库筛选方法中鉴定的序列与公共数据库例如GenBank或者其它私人序列数据库中保存和可获得的其它已知序列进行比较并且比对。通过使用计算机软件程序例如应用不同的算法测定同源性的ALIGN，DNAstar，和INHERIT进行序列比对可以确定分子确定的区域内或者全长序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。
通过使用这里第一次公开的推导的氨基酸序列筛选选择的cDNA或者基因组文库可以获得具有蛋白质编码序列的核酸，并且，如果需要，使用Sambrook，等，上文中描述的常规引物延长方法，来检测前体和没有逆转录为cDNA的mRNA加工中间体。
宿主细胞的筛选和转化
用这里描述的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞来产生XYL-IV。在适当修饰以诱导启动子，筛选转化体，或者扩增编码期望的序列的基因的常规营养培养基中培养宿主细胞。不用过多实验，本领域技术人员能够选择培养条件，例如培养基，温度，pH等。一般情况下，在MAMMALIAN CELL BIOTECHNOLOGY：A PRACTICAL APPROACH，M.Butler，编著(IRL Press，1991)和Sambrook，等，上文中可以找到将细胞培养物的产率最大化的原理，方法，和实用技术。
转染方法对于本领域技术人员是公知的，例如，CaPO4和电穿孔。根据使用的宿主细胞，利用适合这样的细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等人所述，利用氯化钙进行钙处理，或者对于原核生物或者包含大量细胞壁屏障的其它细胞一般应用电穿孔。如Shaw，等，Gene23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述，对于某些植物细胞的转化使用用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转染。根据Van Solingen，等，J.Bacteriol.130：946(1977)和Hsiao，等，Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)的方法可以进行酵母转化。但是，也可以使用将DNA导入细胞的其它方法，例如通过核显微注射，电穿孔，微穿孔，生物轰击，细菌与完整细胞的原生质体融合，或者聚阳离子，例如，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)，聚鸟氨酸。
这里用于在载体中克隆或表达DNA的合适的宿主细胞包括原核细胞，酵母，或者丝状真菌细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌(Enterobacteriaceae)例如大肠杆菌(E.coli.)。各种大肠杆菌(E.coli)菌株公众是可以得到的，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC 53,635)株。除了原核生物外，原核微生物例如丝状真菌或酵母对于编码XYL-IV的载体是合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是普遍使用的低级真核宿主微生物。
优选地，待转化的微生物包括来自木霉属(Trichoderma spp.)或者曲霉属(Aspergillus spp.)的菌株，或者更优选地，所述菌株包括T.reesei，其用于获得超量表达蛋白质，或者黑曲霉awamori变种(Aspergillus niger var.awamori)。例如，Sheir-Neiss，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46(1984)中描述的木霉属菌株RL-P37，已知分泌提高量的纤维素酶。RL-P37的功能等价物包括Trichodermareesei(longibrachiatum)菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。另一个实例包括过量生产的突变体，如Ward，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738(1993)中所述。认为这些菌株在超量表达木霉属XYL-IV中也是有用的。认为合适的宿主细胞的筛选在本领域技术人员能力内。
木霉属(Trichoderma sp.)宿主细胞的筛选和转化
根据本发明制备XYL-IV的优选方法包括用至少包括与启动子功能性连接的编码XYL-IV的部分或全部的DNA片段的DNA构建体转化木霉属(Trichoderma sp.)宿主细胞。然后在表达期望的蛋白质的条件下培养转化细胞。接着，分离或者纯化期望的蛋白质产物至基本上同质化。
优选地，要转化的微生物包括来自木霉属(Trichoderma spp.)的菌株。更优选地，所述菌株包括用于获得超量表达的蛋白质的T.reesei，木霉属菌株RL-P37，RL-P37的功能等价物，例如Trichoderma reesei(longibrachiatum)菌株RUT-C30(ATCC No.56765)，或者菌株QM9414(ATCC No.26921)。
一定要选择选择标记以使能够检测转化的真菌。在选择的微生物中表达的任何选择标记基因都是合适的。例如，使用木霉属(Trichoderma spp.)，选择可选择标记使得转化体中可选择标记的存在不明显影响其性质。这样一种可选择标记可以是编码可测试产物的基因。例如，可以使用木霉属(Trichoderma spp.)基因的功能拷贝，宿主菌株中如果缺少该基因则导致宿主菌株显示营养缺陷表型。
在优选的实施方案中，用提供用于转化的可选择标记的功能性pyr4基因转化木霉属(Trichoderma spp.)的pyr4-衍生菌株。通过筛选对氟乳清酸(FOA)有抗性的木霉属(Trichoderma spp.)可以获得pyr4-衍生菌株。pyr4基因编码乳清酸核苷-5’-一磷酸脱羧酶，一种尿苷生物合成需要的酶。携带完整pyr4基因的菌株能在没有尿苷的培养基中生长但是对氟乳清酸敏感。通过筛选FOA抗性有可能筛选没有功能性乳清酸核苷一磷酸脱羧酶但是生长需要尿苷的pyr4-衍生菌株。利用FOA筛选技术也可能获得没有功能性乳清酸焦磷酸核糖转移酶的需要尿苷的菌株。有可能用编码该酶的基因的功能拷贝转化这些细胞(Berges和Barreau，Curr.Genet.19：359(1991))。参照上文，利用FOA抗性技术容易进行衍生菌株的筛选，这样，优选使用pyr4基因作为选择标记。
为了转化pyr4-木霉属以使其具有表达一个和多个xyl4基因的能力，然后从缺失质粒分离包括xyl4基因的单一DNA片段，并且用来转化合适的pyr-木霉属宿主。然后以其表达pyr4基因产物因而弥补宿主菌株尿苷营养缺陷的能力为基础鉴定并且筛选转化体。然后对得到的转化体进行Southern印迹分析，鉴定并且证实双交叉整合事件，其中pyr4选择标记替代部分或全部的要缺失的基因的基因组拷贝的部分或全部。
尽管上述具体的质粒载体涉及pyr-转化体的制备，但是本发明不局限于这些载体。应用上述技术在木霉属(Trichoderma sp.)菌株中可以缺失和替代各种基因。另外，如上所述，可以使用任何可获得的可选择标记。事实上，应用上述策略可以从基因组中缺失或替代已经克隆和鉴定的任何木霉属(Trichoderma sp.)基因。
如上所述，优选的宿主菌株包括没有或者具有相应于所选可选择标记的非功能性的基因的木霉属(Trichoderma sp.)的衍生物。例如，如果选择pyr4的选择标记，则在转化过程中使用特定pyr4-衍生菌株作为受体。类似地，可以使用包括等价于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)基因amd3，argB，trpC，niaD的木霉属(Trichoderma sp.)基因的选择标记。因此，相应的受体菌株必须是衍生菌株，例如分别是argB-，trpC-，niaD-。
在优选的转化技术中，一定要考虑到木霉属(Trichoderma sp.)中细胞壁对DNA的渗透性非常低。因此，摄入期望的DNA序列，基因或基因片段是很少的。在转化过程之前有很多方法来提高衍生菌株(即缺少相应于使用的可选择标记的功能基因)中木霉属(Trichodermasp.)细胞壁的透性。
制备用于转化的木霉属(Trichoderma sp.)的本发明优选方法涉及从真菌菌丝体制备原生质体。可以从萌芽营养孢子获得菌丝体。用消化细胞壁产生原生质体的酶处理菌丝体。然后通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨糖醇，甘露糖醇，氯化钾，硫酸镁等等。通常这些稳定剂的浓度在0.8M至1.2M之间。优选使用含大约1.2M的山梨糖醇的悬浮培养基溶液。
DNA摄取到宿主木霉属(Trichoderma sp.)菌株中取决于钙离子浓度。一般在摄取溶液中使用大约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了摄取溶液中需要钙离子之外，一般包括的其它物质是缓冲体系例如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或者10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。相信聚乙二醇起作用融合细胞膜从而允许培养基内含物输送到木霉属(Trichoderma sp.)菌株的细胞质中并且将质粒DNA转移给核。这种融合常常得到串联整合到宿主染色体中的质粒DNA的多个拷贝。
通常在转化中使用含有108-109/ml，优选2x 108/ml密度的进行过渗透性处理的木霉属(Trichoderma sp.)原生质体或细胞的悬浮液。将100微升体积的这些原生质体或细胞的合适的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)与期望的DNA混合。一般向摄取溶液加入高浓度的PEG。向原生质悬浮液中可以加入0.1-1体积的25％PEG 4000。但是，优选向原生质悬浮液中加入大约0.25体积。也可以向摄取溶液加入添加剂例如二甲亚砜，肝素，亚精胺，氯化钾等有助于转化。
一般情况下，然后将该混合物在大约0℃下温育10-30分钟的时间。然后向该混合物中加入另外的PEG进一步加强期望的基因或DNA序列的摄入。一般以转化混合物体积的5-15倍的体积加入25％PEG4000；但是，更大和更小体积可以是合适的。25％PEG 4000优选是转化混合物体积的大约10倍。加入PEG之后，在加入山梨糖醇和CaCl2溶液之前在室温下温育转化混合物。然后向熔化的等分生长培养基加入原生质体悬浮液。该生长培养基只允许转化体生长。本发明中可以使用适合期望的转化体生长的任何生长培养基。但是，如果筛选Pyr+转化体，则优选使用不含有尿苷的生长培养基。转移随后的菌落并且在排除尿苷的生长培养基上纯化。
在该阶段，通过在没有尿苷的固体培养基上更快的生长速度和平滑圆形菌落的形成而不是参差不齐形状可以将稳定转化体与不稳定转化体区分出来。另外，在某些情况下通过在固体非选择性培养基(即含有尿苷)上培养转化体，从其培养基中收获孢子并且测定这些后面将在没有尿苷的选择性培养基上发育生长的孢子的百分比，可以进行稳定性的进一步试验。
可复制载体的制备和使用
制备编码XYL-IV蛋白质的DNA用于插入合适的微生物中。根据本发明，编码XYL-IV酶的DNA包括编码具有功能性XYL-IV活性的蛋白质所需的全部DNA。因此，可以从产生XYL-IV的任何微生物来源产生DNA，前提是所述基因可以根据这里描述的方法鉴定和分离。在优选的实施方案中，DNA编码来自木霉属(Trichoderma sp.)并且更优选来自Trichoderma reesei的XYL-IV蛋白质。
通过构建携带编码XYL-IV的基因的表达载体可以制备编码XYL-IV的基因。携带插入的编码XYL-IV的DNA片段的表达载体可以是能够在给定宿主生物体内自主复制的或者能够整合到宿主的DNA中的任何载体，一般是质粒，粘粒，病毒颗粒，或者噬菌体。各种载体是公众可以获得的。也涉及编码XYL-IV的DNA的一个以上的拷贝可以被重组到菌株中以有利于超量表达。
在优选的实施方案中，涉及两种类型的获得基因表达的表达载体。第一种类型包含其中启动子，基因编码区和中止子序列都源自要表达的基因的DNA序列。通过缺失不期望的DNA序列(例如编码不期望的结构域)留下在其自身转录和翻译调控序列的控制下表达的结构域可以获得基因截短。载体上也包含可选择标记来筛选整合到宿主中新的xyl4基因序列多个拷贝的整合。
第二类型的表达载体是预装配的并且包含高水平转录所需的序列和可选择标记。涉及到基因或者其部分的编码区可以被插入到该一般目的的表达载体中使其处于表达盒启动子和终止子序列的转录调控之下。例如，pTEX是这样一种普通目的表达载体。参见美国专利5,650,322，其描述了该载体。pTEX是丝状真菌T.reesei中使用的多用途表达载体。载体内的表达盒具有使其对该功能有用的几种独特特征。对于T.reesei使用强cbhl基因启动子和终止子序列。
在载体中，本发明的编码XYL-IV的DNA序列应该可操作连接转录和翻译序列，即，合适的启动子序列和信号序列在读框内可操作地连接结构基因。启动子可以是在宿主细胞内表现出转录活性的任何DNA序列并且可以来自与宿主细胞同源或异源的蛋白质编码基因。对于胞外产生XYL-IV或者其衍生物可提供信号肽。编码信号肽的DNA优选其与要表达的基因自然相结合，但是本发明涉及来自任何合适的来源例如来自木霉属的外切纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶的信号序列。
可以通过多种方法将合适的核酸序列插入到载体中。一般情况下，利用本领域公知的技术将DNA插入到合适的限制性酶切位点中。载体成分一般包括但不限于一个或多个信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。包含这些成分的一个或多个的合适的载体的构建可利用技术人员公知的标准连接技术。
可以直接地，也可以作为与异源多肽的融合多肽，重组产生期望的XYL-IV，所述异源多肽可以是信号序列或者在成熟蛋白质或多肽的N-末端有特异性酶切位点的其它多肽。一般情况下，信号序列可以是载体的成分或者其可以是插入到载体中的XYL-IV编码DNA的一部分。信号序列可以是例如选自碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或者热稳定肠毒素I I前导区的原核细胞信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导区，α-因子前导区(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导区，后者描述于美国专利No.5,010,182)，或者酸性磷酸酶前导区，C.albicans葡糖淀粉酶前导区(1990年4月4日公开的EP 362,179)，或者1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号序列。
表达和克隆载体都包含使载体能在一个或多个选择的宿主细胞中复制的核酸序列。这样的序列对于各种各样的细菌，酵母和病毒是公知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合酵母。
表达和克隆载体一般包含选择基因，也称为选择标记。一般选择基因编码蛋白质使得(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如，氨苄青霉素，新霉素，氨甲喋呤，或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷不足，或者(c)补充从复合培养基得不到的关键营养，例如，编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。酵母中使用的合适的选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trpl基因(Stinchcomb，等，Nature 282：39(1979)；Kingsman，等，Gene 7：141(1979)；Tschemper，等，Gene 10：157(1980))。trpl基因为没有在色氨酸中生长能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics 85：12(1977))提供选择标记。对于木霉属优选使用的选择基因是pyr4基因。
表达和克隆载体通常包含可操作地连接XYL-IV编码核酸序列的启动子。该启动子指导mRNA合成。各种潜在的宿主细胞识别的启动子是公知的。优选的启动子包括真菌启动子序列，例如，cbhl或egl1基因的启动子。
适合于原核宿主使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子体系(Chang，等，Nature 275：615(1978)；Goeddel，等，Nature，281：544(1979))，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子体系(Goeddel，Nucl.Acids Res.8：4057(1980)；和欧洲专利申请36,776)，和杂合启动子例如tac启动子(deBoer，等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 80：21(1983))。细菌系统中使用的启动子也包含可操作地连接编码XYL-IV的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
对酵母宿主使用的合适的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman，等，J.Biol.Chem.255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess，等，J.Adv.Enzyme Reg.7：149(1968)；Holland，Biochem.17：4900(1978))，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。属于具有另外的生长条件调控转录优点的可诱导启动子的其它酵母启动子，是醇脱氢酶2，异细胞色素C(isocytochrome C)，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。EP 73,657中也描述了酵母表达中使用的合适的载体和启动子。
真核宿主细胞(例如酵母，真菌，昆虫，植物)中使用的表达载体也包含转录终止和稳定mRNA所需的序列。一般从真核细胞或病毒DNAs或cDNAs的5’和，有时3’，非翻译区获得这样的序列。这些区包含在编码XYL-IV的mRNA的非翻译部分作为多腺苷酸化片段转录的核苷酸片段。
检测基因扩增/表达
以这里提供的序列为基础，利用合适的标记探针，通过例如常规Southern印迹，定量测定mRNA转录的Northern印迹(Thomas，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77：5201(1980))，点印迹(DNA分析)，或者原位杂交，可以直接测定样品基因扩增和/或表达。或者，可以应用能够识别特异性双链体(duplex)，包括DNA双链体，RNA双链体，和DNA-RNA杂合双链体，或者DNA-蛋白质双链体的抗体。反过来可以标记所述抗体，并且在双链体结合表面的情况下可以进行测试，这样一旦在表面上形成双链体，就能够检测与该双链体结合的抗体的存在。
或者，可以通过免疫学方法，例如细胞的组织化学染色和细胞培养液的分析，直接定量测定基因产物的表达，来测定基因表达。用于组织化学染色和/或样品液体的测试的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以用任何哺乳动物制备。方便地，可以制备抗天然XYL-IV序列，抗以这里提供的DNA序列为基础的合成肽，或者抗与XYL-IV编码DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列的抗体。
多肽纯化
通过上述从自然分离物分离和纯化的方法可以从培养物或者从细胞裂解产物回收XYL-IV各种形式。根据使用的宿主细胞和重组酶中任何变体结构，可以使用另外的技术。例如，如果重组酶是膜结合的，则使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或者通过酶裂解，其可以从膜上释放。重组酶的纯化也可以使用蛋白质A琼脂糖凝胶柱来去除污染物例如IgG，和金属螯合柱来结合表位标记形式的XYL-IV。选择的纯化步骤将取决于例如使用的制备方法的性质，产生的特定XYL-IV，和重组酶的任何变体结构。
XYL-IV的衍生物
除了这里描述的天然序列XYL-IV外，涉及制备具有改变的氨基酸序列的XYL-IV衍生物。通过向XYL-IV编码DNA引入合适的核苷酸变化，或者通过合成期望的XYL-IV，能够制备XYL-IV衍生物。本领域技术人员明白氨基酸的改变可以改变XYL-IV的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
例如，使用例如美国专利No.5,364,934中提出的保守型和非保守型突变的技术和指南，能够制备这里描述的天然序列XYL-IV或者XYL-IV的各种结构域的衍生物。序列变异可以是导致与天然序列XYL-IV相比XYL-IV的氨基酸序列变化的编码XYL-IV的一个或多个密码子的替代，缺失或插入。任意地，序列变异通过在XYL-IV的一个或多个结构域中用任何其它氨基酸替代至少一个氨基酸。
通过将多肽序列与已知同源蛋白质分子相比较并且将高同源性区中变化的氨基酸序列数最小化可以找到确定哪一个氨基酸残基可以被插入，替代或缺失而且不会不利地影响期望的XYL-IV活性的指导。氨基酸替代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸置换一个氨基酸，例如用丝氨酸置换亮氨酸，即，保守氨基酸置换。任选地插入或缺失可以是1-5个氨基酸范围。通过在序列中系统地进行氨基酸的插入，缺失或替代，并且使用本领域公知的技术测定得到的衍生物的功能活性，可以确定允许的变化。
利用本领域公知的方法可以进行序列变异，可以对克隆的DNA进行例如寡核苷酸介导的(定点)诱变，丙氨酸扫描，和PCR诱变。可使用定点诱变(Carter，等，Nucl.Acids Res.13：4331(1986)；Zoller，等，Nucl.Acids Res.10：6487(1987))，盒式诱变(Wells，等，Gene34：315(1985))，限制选择诱变(Wells，等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317：415(1986))或者其它已知的技术来产生具有改变的序列的XYL-IV编码DNA。
可以利用扫描氨基酸分析来鉴定连续序列中的一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对小的中性氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸，和半胱氨酸。该组中丙氨酸典型地是优选的扫描氨基酸，因为它除去了β-碳那一边的侧链，并且不太可能改变衍生物的主链构象。典型地优选丙氨酸，也因为它是最常见的氨基酸。此外，常常在隐藏和暴露位置都发现丙氨酸(Creighton，THEPROTEINS，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976))。如果丙氨酸替代不得到适当量的衍生物，则可以使用同型空间配位的氨基酸。
抗-XYL-IV抗体
本发明进一步提供抗XYL-IV抗体。示例的抗体包括多克隆和单克隆抗体。
本发明的抗XYL-IV抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员公知的。例如通过一次或多次注射免疫剂和，如果需要，佐剂，能够在哺乳动物中产生多克隆抗体。典型地，通过多次皮下或腹膜内注射对哺乳动物注射免疫剂和/或佐剂。对于抗XYL-IV抗体，免疫剂可以包括XYL-IV或者其融合蛋白。将免疫剂与已知在接受免疫的哺乳动物中是免疫原性的蛋白质偶合可能是有用的。这样的免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的例子可以包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成的海藻糖dicorynomycolate)。本领域技术人员不用进行过多实验就可以选择免疫方法。
或者，抗XYL-IV抗体可以是单克隆抗体。利用杂交瘤方法，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)中描述的那些，可以制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，典型地，用免疫剂免疫小鼠，仓鼠，或者其它合适的宿主动物，激发产生或者能产生特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。
对于抗XYL-IV抗体，免疫剂一般包括XYL-IV或者其融合蛋白。一般情况下，如果期望人源细胞，则使用外周血淋巴细胞(″PBLs″)，或者如果期望非人哺乳动物源，则使用脾细胞或者淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂例如聚乙二醇使淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合，生成杂交瘤细胞(Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES ANDPRACTICE，Academic Press，(1986)pp.59-103)。无限增殖化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类，牛和人源的骨髓瘤细胞。通常情况下，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以在优选含有一种或多种抑制没有融合的无限增殖化细胞的生长或存活的物质的合适培养基中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲本细胞没有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基一般包括次黄嘌呤，氨基喋呤，和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质阻止HGPRT-缺陷细胞生长。
优选的无限增殖化细胞系是有效融合，支持选择的产生抗体的细胞稳定高水平表达抗体，并且对培养基例如HAT培养基敏感的那些。更优选的无限增殖化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如从SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)获得。关于产生人单克隆抗体也描述过人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur，等，MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUESAND APPLICATIONS，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63)。
然后可以对其中培养杂交瘤细胞的培养基测定抗XYL-IV的单克隆抗体的存在。优选地，通过免疫沉淀或者通过体外结合测试例如放射免疫测试(RIA)或者酶联免疫吸附测试(ELISA)测定杂交瘤产生的单克隆抗体的结合特异性。这样的技术和测试是本领域公知的。例如通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析可以测定单克隆抗体的结合亲和性。
鉴定预期的杂交瘤细胞之后，通过有限稀释程序可以将克隆亚克隆并且通过标准方法(Goding，上文)培养。用于该目的的合适的培养基包括例如Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium和RPMI-1640培养基。
通过常规免疫球蛋白纯化方法可以从培养基中分离和纯化亚克隆分泌的单克隆抗体，例如，蛋白质A-Sepharose，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或者亲和色谱。
通过重组DNA方法例如美国专利4,816,567描述的那些方法也可以制备单克隆抗体。利用常规方法可以容易地分离编码本发明地单克隆抗体的DNA并且测序(例如，通过使用能特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞用作这样的DNA的优选的来源。一旦分离出，可以将该DNA置于表达载体中，其然后被转染到宿主细胞例如猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或者不另外产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞之中，实现在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。也可以例如通过用人重链和轻链恒定区编码序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison，等，上文)，或者通过共价结合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列，也可以修饰DNA。这样的非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的抗体的恒定区，或者可以取代本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变区，产生嵌合二价抗体。
抗体可以是一价抗体。制备一价抗体的方法是本领域公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。重链通常在Fc区内的任何一点被截短以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基被另一个氨基酸残基取代或者缺失以防止交联。
体外方法也适合制备一价抗体。利用本领域公知的常规技术能够实现抗体的消化，产生其片段特别是Fab片段。
应用XYL-IV的方法
另一个实施方案中，本发明的木聚糖酶用于增强根据本领域公知技术的纸浆去木质作用和/或漂白。该方法包括使纸浆接触XYL-IV并且取决于例如pH，温度，处理时间，酶的剂量和纸浆的量和类型这样的因素。
优选的是在提高XYL-IV的酶活性的温度和pH下进行上述方法。对应用本发明的XYL-IV的优选的处理时间是大约10分钟至大约4小时，取决于例如预期的结果，处理的纸浆的量和质量和酶的浓度等这样的因素。
合适的酶的剂量是大约0.10-200单位/克干纸浆，更优选0.50-50单位/克。如下测定酶制剂的木聚糖酶活性：向1.8ml木聚糖溶液(0.6％Sigma No.X-0627，在0.05M乙酸钠缓冲液中制备并且用乙酸调节到pH 5.3)，加入相同缓冲液中的0.200ml适当稀释的酶。该溶液在40℃下温育正好30分钟。然后通过加入3ml DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸盐10f/l；Na，K酒石酸盐300g/l)终止反应，并且通过将样品煮沸5分钟显出颜色。然后在540nm波长处测定吸光度。一个酶单位在测试条件下每分钟释放一微摩尔还原糖，还原糖计算为木糖。从测试条件下释放4微摩尔还原糖的酶稀释物计算活性。可以以质量单位表示XYL-IV的活性，例如，测试或者反应混合物中XYL-IV的优选的量可以是大约1ppm至大约100,000ppm。
本发明方法可以用来对各种处理过的纸浆提高等级或者有助于提高等级，所谓处理过的纸浆即预先已经各种方法中的任何方法处理过以减小它们的木质素含量并且在该过程中通过化学方法处理进一步提高木质素去除的程度的木浆。本发明方法可以用来处理硬木和软木牛皮纸浆来增强木质素去除和使木浆增白。
该方法特别适用于化学纸浆，即其中已经通过各种化学处理例如硫酸钠(牛皮纸)方法和氧去木质作用化学修饰过木质素成分的那些纸浆，并且优选用于牛皮纸浆。优选的方法中，在牛皮纸浆消化或氧去木质作用之后但是漂白之前对纸浆施用XYL-IV。在对相同纸浆进行牛皮纸浆消化和氧去木质作用的情况下，在牛皮纸浆消化之后，氧去木质作用之前或氧去木质作用之后使用酶。本发明还用于臭氧漂白的纸浆。
使用合适的提取剂处理得到的纸浆去除可释放的木质素成分。在另一个实施方案中，接着可以用木质素降解化学品例如氯气，二氧化氯和过氧化氯处理用XYL-IV处理过的纸浆，并且进一步用合适的提取剂提取。在另一个实施方案中，可以用合适的提取剂处理酶处理过的纸浆，接着是木质素降解，并且最后用合适的提取剂处理。这样的提取剂基本上溶解受影响的木质素成分，并且合适的提取剂包括但不限于碱，例如碱金属氢氧化物(E)，DMF，二恶烷，丙酮，和醇。氢氧化物提取剂可以与过氧化氢(Ep)或者氧(Ep)混合。然后通过化学漂白顺序(chemical bleaching sequence)例如二氧化氯(DED)或过氧化氯(P-P)可以将得到的纸浆进一步漂白至期望的白度(brightness)，与通过相同顺序但是不利用酶处理的漂白到相同的白度的纸浆相比时发现大量节省化学品。用这样一种方法实现含有氯的化学品或过氧化物的减少。另外，通过用上述酶实施本发明，人们可以对纸浆应用相同量的漂白化学品，而实现处理过的纸浆的更大的白度。
在另一个实施方案中，本发明提供上述XYL-IV在各种工业环境中的另外的应用。例如，XYL-IV可以用来酶解农业垃圾来产生醇类燃料和其它的重要的工业化学品，用来产生动物饲料或人用食品，或者作为洗涤剂组合物中的成分。
只是为了详细说明的目的提供下面的实施例，而不是为了在任何方面限制本发明的范围。本发明说明书中引用的所有的专利和参考文献在这里完整地引作参考。
实施例
实施例1-编码新的木聚糖酶的Trichoderma reesei cDNA克隆
图1显示从通过本领域公知的方法自在混合碳源上生长之后的Trichoderma reesei的RNA制备的cDNA文库获得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ.ID NO：1)和推出的相应的氨基酸序列(SEQ.ID NO：2)。鉴定了可读框的1518个核苷酸并且推导出编码的蛋白质。预计成熟蛋白质全长465个氨基酸。
上面鉴定的XYL-IV没有木霉属产生的一些纤维素酶和其它真菌纤维素酶中的纤维素结合域(CBD)。CBDs也与一些非分解纤维素的胞外真菌酶有关，例如来自Trichoderma reesei(longibrachiatum)的乙酰基木聚糖酯酶和甘露聚糖酶。上面鉴定的XYL-IV也没有与木霉属和其它真菌纤维素酶中存在的连接CBD和催化域的接头或绞合区具有同一性的序列。
在图2的木霉属木聚糖酶预测氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和微生物糖苷酶的已知序列及未知功能的一些序列之间发现具有序列同一性和序列相似性的区。在利用BLAST程序(Altschul，等，J.Mol.Biol.215：403(1990))或者本领域公知的其它类似程序进行的蛋白质序列数据库检索中检测同一性和相似性。通过标准方法测定序列相似性。
特别地，利用Genetics Computer Group，Inc.，Madison，Wisconsin的GCG序列分析软件包的GAP程序进行配对氨基酸比较。通过标准方法测定序列相似性。表1中给出了T.reesei XYL-IV的氨基酸序列分析，使用GAP程序，blosum62氨基酸替代矩阵，间隙权重为12并且长度权重为2。
表1中给出了T.reesei XYL-IV的此氨基酸序列分析。
表1-XYL-IV的序列同一性和相似性比较
Figure BDA00001628052400291
实施例2--XYL-IV的特征
通过表征蛋白质和酶的几种常用方法表征XYL-IV，或XYL IV。
分离来自Trichoderma reesei的XYL-IV。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，该XYL-IV表现出大约43.0kDa的分子量。该XYL-IV具有几种异构体，根据
Figure BDA00001628052400301
系统(Pharmacia)测定都具有大约7的pI。Schiffs试剂的轻微染色表明只有低水平的糖基化作用。当Trichoderma reesei在作为唯一碳源的纤维素上生长时XYL-IV基因表达，而在作为唯一碳源的葡萄糖上生长时则不表达XYL-IV基因。
胰蛋白酶裂解蛋白质并且通过C18反相HPLC分离肽之后通过埃德曼降解测定成熟XYL-IV的N-末端氨基酸序列。测定的N-末端序列是：
Xaa-Ser-Tyr-Ala-Thr-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Xaa-Ala-Asn-Ile-Xaa-Ile-
其中Xaa表示由于信号不足而没有鉴定的氨基酸。
XYL IV与分类属于糖基水解酶家族5的木聚糖酶同源。
使用木聚糖底物(其可能不是XYL-IV的最佳底物)，发现XYL-IV活性的pH最适值在pH 3.5和4之间。这不同于XYL-II的最适pH，pH5-5.5，和XYL 1的最适pH，pH 3.5-4.5。pH 4时，XYL-IV在40℃和50℃温度之间表现出最高活性水平。该酶在室温下在溶液中活性保持几小时，但是在升高的温度下缓慢丧失活性。
对于大分子底物和对硝基苯基-糖苷测定XYL-IV的底物特异性。在pH 4柠檬酸钠缓冲液中在40℃下24小时之后XYL-IV不明显裂解下面的大分子物质：葡甘露聚糖(魔芋(konjac)，Megazyme)，半乳甘露聚糖(角豆，Sigma)，β-葡聚糖(大麦，Megazyme)，羧甲基纤维素(Fluka)，昆布糖(Sigma)或者木二糖。使用已知的对硝基苯基-糖苷底物，XYL-IV没有表现出α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-木糖苷酶或者β-甘露糖苷酶所预期的活性。
对XYL-IV进一步评价在XYL-1和XYL-11存在和不存在下几种底物的水解作用。表2描述这些研究中使用的底物。完全酶解为单糖之后通过HPLC分析各底物的单糖成分。
表2.用于水解实验的底物
*几乎每一个第二木糖单元带有乙酰基取代基.**少量未知的寡糖在完全酶解之后仍然存在.nd＝没有测定.
在实验中XYL-IV与XYL-I和XYL-II相比较，其中使用少量各种酶并且只有一小部分(一般＜10％)的各种底物被水解。用本领域公知的DNS方法测定使用酶生成的还原糖。使用商售寡糖作为标准物通过HPLC测定线性木寡糖(1聚物至5聚物，Xyl1至Xyl5)。在下面的条件下研究水解：24hr，40℃，pH 4.0(XYL I和XYL IV)和pH 5.0(XYLII)。表3给出这些研究的结果。
表3.Trichoderma reesei的XYLs-I，-II，和-IV对木聚糖(5g/l)的水解
*在HPLC中寡糖被去乙酰化，因此数值代表水解之后乙酰化和没有乙酰化的木寡糖。+是Xyl+Xyl2+Xyl3+Xyl4+Xyl5的总和。
在这些实验中，与XYLs-I和-II相比，XYL-IV表现出更大的对没有取代的木聚糖和乙酰化MeGIcA-木聚糖的活性。XYL-IV和-II都水解去乙酰化MeGIcA-木聚糖。XYL-II表现出比XYL-IV更大的对阿拉伯木聚糖的活性。XYL-IV产生木糖作为其主要产物，有较少量的木二糖和取代的木寡糖。另外两种木聚糖酶产生非常不同的产物混合物(表3)。XYL-IV的产物和活性不同于糖基水解酶家族11和家族10的那些。
通过使用几种分离的寡糖底物进一步表征XYL-IV的底物特异性(表4)。在pH 4.0，40℃，1小时的条件下研究水解。
表4.T.reesei的XYL-IV(500nkat/g)对取代的寡糖(0.5-0.7g/l)的水解
  寡糖   产物
  HexA2Xyl2+HexA3Xyl3   HexA2Xyl2+Xyl
  Ara2Xyl3 *   没有作用
  Ara2Xyl4+Ara3Xyl4 *   AraXyl3+AraXyl4 **
*Tenkanen等1996公开的结构。**很可能是Ara2Xyl3+Ara2Xyl4
在这些实验中，XYL-IV裂解了两个未取代的木糖单元之间的连结，但是不裂解取代的和未取代的木糖单元之间的连结。但是与XYL-I或者-II相比，XYL-IV裂解确实靠取代单元更近。XYL-IV在寡糖的还原端只留下一个没有取代的单元。
通过在40℃下将Hex2Xyl2+Hex3Xyl3的混合物温育1小时来评价Hex3Xyl3充分水解需要的XYL-IV的量。对于每克HexA3Xyl3使用30mg(500nkat)的XYL-IV实现HexA3Xyl3几乎完全的水解(表5，图4)。
表5.XYL-IV对HexA3Xyl3的水解
Figure BDA00001628052400331
XYL-IV对于来自黑麦的几种聚合木聚糖，没有取代的木聚糖，MeGIcA-木聚糖和阿拉伯木聚糖的水解是有效的。与其它两种以大约相等的速度裂解的木聚糖相比，阿拉伯木聚糖裂解更缓慢(图5)。
实施例3--XYLs-I，-II，和-IV的组合或混合物对底物的水解
用XYLs-I，-II，和-IV同时或依次对几种底物水解证明XYL-IV表现出与其它木聚糖酶的协同作用。
表6和图6给出以下研究的结果，其中底物分别与XYLs-I，-II，或-IV之一，或者与这些木聚糖酶的组合温育。增加的XYL-IV的效果比简单加和更有效。就是说，发现有协同作用。尽管不限制本发明，相信该协同作用主要归因于XYL-IV水解XYL I和II产生的线性和取代的寡糖的能力。
表6.XYL-IV与XYLs-I及-II的协同作用
Figure BDA00001628052400341
条件：pH 4，40℃，24h，底物浓度5g/l。*Xyl+Xyl2+Xyl3+Xyl4+Xyl5的总和。**总和计算为木糖。***没有进行HPLC分析。****在这些实验中该底物的水解程度异常地低。*****在HPLC分析中寡糖被去乙酰化，因此数值代表水解之后乙酰化和没有乙酰化的木寡糖。
表7和图7给出以下研究的结果，其中底物与XYL-I一起温育，该酶被加热失活，然后该底物与XYL-IV温育。这显示XYL-I之后XYL-IV对底物依次裂解的结果。同样，在XYL-I和XYL-IV之间发现协同作用。
表7.XYL-I和之后XYL-IV的逐步水解
Figure BDA00001628052400351
条件：pH 4，40℃，24h+24h，底物浓度5g/l；XYL I(100nkat/g或者5000nkat/g)和XYL IV(20nkat/g)。*Xyl+XYL2+XYL3+XYL4+XYL5的总和。**总和计算为木糖。
实施例4-编码木霉属XYL-TV的克隆DNA分子的制备
下面提供制备包括实施例1描述的整个xyl4基因的克隆的方法。在该实施例中，通过使用下面方法制备来自木霉属的基因组DNA或cDNA克隆。
合成一对适合用作PCR引物并且以SEQ ID NO：1的cDNA序列为基础的寡核苷酸。使用这些引物和从Trichoderma reesei，例如，菌株QM6a(ATCC 13631)分离的总基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。Boehringer Mannheim提供使用的DNA聚合酶(例如，Pwo聚合酶)，缓冲液和脱氧核苷酸混合物。对PCR使用典型条件，例如：第一步，1分钟，94℃；第二步，40秒，92℃；第三步，1分钟，50℃；第四步，2分钟，72℃；第二，三和四步重复29次；第五步，5分钟72℃。
用限制性酶，例如，BglII和XbaI，两个引物带来的识别位点，消化PCR的主要DNA产物，并且从琼脂糖电泳凝胶纯化得到的片段。该DNA片段连接已经用相同的限制性酶消化的合适载体，例如已经用例如BglII和XhaI消化的pSL1180(Pharmacia)。一般对得到的质粒测序以证明插入物相应于木霉属xyl4基因的预期片段。该DNA序列表明基因中任何内含子和外显子的存在。
质粒，或者其包含的插入物，现在可以用作杂交探针，使得能从任何基因组DNA或者感兴趣的cDNA文库克隆整个xyl4基因。因为没有CBD或者接头(绞合)区，质粒中的XYL-IV编码DNA不包括这些区。因此，通过设计，预期其与其它xyl4 DNA序列杂交而不和CBD编码序列杂交，所述CBD编码序列可能是其它木聚糖酶和糖苷酶基因的一部分。
分别用各种不同的限制性内切酶消化来自T.reesei，例如，菌株QM6a的总基因组DNA并且进行琼脂糖凝胶电泳。接着将DNA印迹到Nytran(S & S)滤膜上并且用合适的xyl4 DNA片段探测，该片段从质粒分离并且通过Amersham提供的Megaprime随机标记系统用32p标记。在例如含有30％甲酰胺，5X SSPE，0.5％SDS的典型缓冲液中在38℃下以中等严紧性进行与探针的杂交。接着在用X-射线胶片曝光之前用中等严紧性洗涤滤膜，例如，在2X SSC，0.1％SDS中，在55℃下洗涤。结果表明T.reesei的基因组拷贝位于合适的限制性片段上。
如上所述给出例示的xyl4基因，通过如上所述插入质粒中的PCR片段作为探针进行菌落杂交从基因组DNA或cDNA文库克隆Trichoderma reesei xyl4基因对于本领域技术人员是常规的。
实施例5-分离在微生物中编码XYL-IV的DNA序列的方法
可以采用实施例1和4中的一般技术结合已知技术，获得包括来自其它真菌或细菌的XYL-IV基因的克隆。和对整个xyl4分子一样，可以标记合适的质粒或编码部分xyl4基因的分离的DNA插入物。然后该DNA探针可以用来与来自其它真菌或细菌的基因组DNA或cDNA杂交。木霉属XYL-IV的推导的氨基酸序列与已知的其它木聚糖酶的氨基酸序列相比较可鉴定在XYL-IV和其它木聚糖酶之间保守的氨基酸的某些区。这些保守区为设计在来自其它微生物的XYL-IV编码DNA的PCR扩增中使用的简并引物提供了基础。这样的方法一般是本领域公知的并且认为是常规的(参见例如，McPherson，等，PCR A PRACTICALAPPROACH pp.171-186(1991))。从这些氨基酸序列的一个或多个衍生的寡核苷酸用作使用基因组DNA的常规PCR实验的引物。容易从任何微生物获得基因组DNA或cDNA并且用作该PCR实验中的模板。用这种方法，有可能从各种微生物克隆编码XYL-IV的基因。
实施例6-从其它微生物分离XYL-IV编码序列的异源杂交方法
可以用合适的限制性酶例如HindIII消化来自不同微生物的基因组DNA并且在1.0％琼脂糖凝胶上分析。该凝胶被脱嘌呤，变性，和印迹，并且通过已知方法将膜进行UV-交联。利用已知方法，例如来自Boehringer Mannheim的DIG/GeniusTM System，进行预杂交，杂交，探针标记和检测。
探针相应于编码整个T.reesei XYL-IV分子的核苷酸序列。用一对合适的限制性酶消化初始cDNA亚克隆(实施例1)，并且通过随机引物标记根据厂商(Boehringer Mannheim)说明用DIG-dUTP(洋地黄毒苷-dUTP)标记得到的片段。
该膜预杂交之后在合适的封闭试剂例如5x SSC-0.1％N-月桂酰基肌氨酸-0.02％SDS-1％GeniusTM封闭试剂中，在合适的温度例如45℃下杂交。杂交(一般过夜)之后洗涤。然后用合适的偶合物检测并且例如使用化学发光底物
Figure BDA00001628052400381
根据厂商说明进行观察。
可利用该方法及其变化方法(不同杂交和洗涤条件)检测来自任何生物体的XYL-IV编码基因。
本发明参照各种具体的和优选的实施方案和技术进行了描述。但是，应该明白在本发明的精神和范围内可以进行很多变化和修饰。

Claims (10)

1.鉴定与XYL-IV编码核酸同源的核酸的方法，包括：
在至少中等严紧条件下将与(a)编码SEQ ID NO：1中的cDNA所编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)的DNA分子的互补分子有至少60％序列同一性的DNA的至少大约14个连续核苷酸的xyl4核酸与测试核酸杂交；
筛选与该xyl4核酸杂交的测试核酸；
分离杂交的测试核酸。
2.权利要求1的方法，其中所述杂交的测试核酸编码XYL-IV。
3.权利要求1的方法，其中所述杂交的测试核酸编码还没有归类的木聚糖酶。
4.权利要求1的方法，其中所述杂交的测试核酸编码木聚糖酶。
5.权利要求1的方法，其中所述杂交在高严紧条件下进行。
6.权利要求1或2的方法，其中所述XYL-IV是具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性的氨基酸序列、并具有木聚糖酶活性的蛋白质。
7.权利要求1的方法，其中所述序列同一性是至少70％、至少85％、至少90％或者100％。
8.至少大约10个核苷酸的分离的核酸，其包含与(a)编码SEQ IDNO：1中的cDNA所编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)的DNA分子的互补分子有至少60％序列同一性的DNA。
9.权利要求8的分离的核酸，其中所述序列同一性是至少70％、至少85％、至少90％或者100％。
10.权利要求8或9的分离的核酸用于鉴定与XYL-IV编码核酸同源的核酸的用途，其中所述XYL-IV是具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性的氨基酸序列、并具有木聚糖酶活性的蛋白质。
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