MXPA02004861A - Proteinas antigenicas de virus de sindrome de mancha blanca de camaron y uso de las mismas. - Google Patents
Proteinas antigenicas de virus de sindrome de mancha blanca de camaron y uso de las mismas.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a proteinas antigenicas derivadas del virus de Sindrome de Mancha Blanca que tienen un tamaño estimado de 19 kDa (VP 19) o 13 kDa (VP13), al uso de estas proteinas en vacunas y a vacunas en la base de estas proteinas. Ademas, la invencion se refiere a anticuerpos en contra de estas proteinas y al uso de anticuerpos en vacunas, a secuencias de acido nucleico que codifican estas proteinas y a su uso en vacunas. Tambien, la invencion se refiere al uso de dichas proteinas en la elaboracion de una vacuna para profilaxis y/o tratamiento de Sindrome de Mancha Blanca en crustaceos, a vacunas de vector y a equipos de diagnostico que comprenden dichos acidos nucleicos o anticuerpos.
Description
PROTEÍNAS ANTIGÉNICAS DE VIRUS DE SÍNDROME DE MANCHA BLANCA DE CAMARÓN Y USOS DE LAS MISMAS
La presente invención se refiere a proteínas antigénicas derivadas del virus de Síndrome de Mancha Blanca, el uso de estas proteínas en vacunas, a vacunas en la base de estas proteínas, a anticuerpos contra las proteínas, al uso de estos anticuerpos en vacunas, secuencias de ácidos nucleicos que las codifican y el uso de dichas proteínas en la elaboración de una vacuna para profilaxis y/o tratamiento e Síndrome de Mancha Blanca en crustáceos, a vacunas de vector y a equipos de diagnóstico. El Virus de Síndrome de Mancha Blanca (WSSV) es una enfermedad viral principal en camarones por todo el mundo. El virus tiene un amplio rango de huésped entre crustáceos (Flegel, 1997) y existe poca variación genética entre aislados (Lo et al., 1 999). Los estudios de microscopia de electrón (EM) mostraron que los viriones se envuelven y tienen una apariencia en forma de varilla a bala de aproximadamente 275 nm en longitud y 1200 mm de ancho con un apéndice similar a una cola en un extremo. Los nucleocápsidos, que han perdido su envoltura, tienen una apariencia sombreada y un tamaño de aproximadamente 300 nm x 70 nm (Wongteerasupaya er al., 1 995). La morfología de virión, su ubicación nuclear y su morfogénesis son evocativos de baculovirus en insectos (Durand et al., 1 997). Originalmente, WSSV se ha clasificado como un miembro sin asignar de la familia Baculoviridae (Francki et al., 1991 ), por lo tanto, el virus se ha referido como Baculovirus Mesodermal Ectodermal
Sistémico (SEMBV) o Baculovirus de Mancha Blanca (WSBV). En la actualidad, WSSV no se acepta más en esta familia (Murphy ef al., 1995) debido a la falta de información molecular. El ADN viral de doble filamento tiene un tamaño de cavidad sobre 200 kb como se deriva del análisis de endonucleasa de restricción (Yang er al., 1997). Un brote de WSSV en camarón cultivado causa mortalidad en masa entre camarones. La enfermedad se caracteriza por manchas blancas en la coraza, apéndices y cutícula y la coloración rojiza del hepatopáncreas del camarón. Los camarones infectados muestras señales de letargía y una rápida reducción en consumo de alimento y dentro de 3 a 5 días estos camarones mueren. Un brote de WSSV conduce a pérdidas pesadas en la industria de camarón cultivado y como una consecuencia existe una fuerte necesidad de vacunas que puedan proteger contra infecciones de WSSV. La identificación y caracterización de proteínas de WSSV principales que pueden utilizarse en tal vacuna proporcionarían los medios para desarrollar tales vacunas. Dos genes se han aislado e identificado como vp 19 y vp 13, que codifican las proteínas respectivas VP13 (1 3 kDa) y VP19 (1 9 kDa) debido a su peso molecular estimado de su movilidad en geles SDS-PAGE coloreados de Azul Brillante Coomassie. VP19 es una proteína de envoltura, mientras que VP13 es una proteína de nucleocápsido. La estructura de lectura abierta de vp19 comprende 366 nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 junto con la secuencia de aminoácido deducida que consiste de 121 aminoácidos (representados por separado como SEQ ID NO 2). La estructura de lectura abierta del gen vp13 comprende al
menos los 186 nucleótidos como se representan en la SEQ ID NO 3. Este ORF codifica una proteína de nucleocápsido VP13 d,ue comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 4. Dos variantes de proteína VP 13 se encuentran, una teniendo la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 4, y una variante más larga teniendo la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 5. La presente invención proporciona un medio para producir vacunas recombinantes para proteger a los crustáceos contra infección con WSSV. La proteína de envoltura VP19 y la proteína de nuóleocápsido VP1 3 de WSSV que se han identificado y caracterizado se encontró que son adecuadas para utilizarse en la elaboración de una vacuna de subunidad para proteger a los crustáceos contra infecciones con WSSV. La clonación y caracterización de las secuencias de nucleótidos de la presente invención proporciona la producción de estas proteínas de WSSV utilizando técnicas de tecnología recombinante. De esta manera, las proteínas de WSSV pueden obtenerse, las cuales se encuentran substancialmente libres de otras proteínas WSSV. Las proteínas WSSV aisladas pueden utilizarse para fabricar vacunas de subunidad para proteger a los crustáceos contra infección de WSSV. Las proteínas de la presente invención son especialmente útiles en vacunas marcadoras. Tales vacunas pueden comprender, por ejemplo, solamente VP1 3 y/o 19. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de WSSV pueden utilizarse para fabricar vacunas de vector para proteger a los crustáceos contra la infección con WSSV. Las
secuencias de nucleótidos de la presente invención puede utilizarse además para propósitos de diagnóstico, por ejemplo para detectar la presencia de WSSV en ql campo. Adicronalmente, las proteínas WSSV de la presente invención pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos de WSSV. Estos anticuerpos pueden utilizarse para producir vacunas de WSSV para inmunización pasiva de crustáceos. Los anticuerpos también pueden utilizarse para propósitos de diagnóstico tale como la detección de WSSV en crustáceos o en el campo. De esta manera, una primer modalidad de la invención proporciona una proteína antigénica de WSSV que es adecuada para inmunizar crustáceos contra WSSV que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% homologa a la secuencia de aminoácido como se representa en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 y a fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. En una forma preferida, la modalidad se refiere a tales proteínas de WSSV que tiene una homología de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90%, más preferentemente 95% de homología a la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 y a fragmentos inmunogénicos de ta)es proteínas. Aún más preferido es el nivel de homología de 98% o aún
1 00%. El nivel de homología de proteína puede determinarse con el programa de computadora "BLAST 2 SEQUENCES" al seleccionar el subprograma: "BLASTP", que puede encontrarse en www.ncbi.nlm.bih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Una referencia para este
programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174:247-250 (1999). Matriz utilizada: "blosum62". Parámetros utilizados son los parámetros de falla: Espacio abierto: 1 1 . Espacio de Extensión: 1 . Espacio x_eliminación: 50 Se entenderá que, para las proteínas particulares incluidas en la presente, las variaciones naturales pueden existir entre cepas WSSV individuales. Estas variaciones pueden demostrarse por una(s) diferencia(s) de aminoácidos en la secuencia total o por eliminaciones, substituciones, inserciones, inversiones o adiciones de un aminoácido(s) en dicha secuencia. La substitución de aminoácido que no altera esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, se ha descrito, por ejemplo, por Neurath er al., en "The Proteins" Academic Press Nueva York (1 979). Los reemplazos de aminoácido entre aminoácidos relacionados o reemplazos que han ocurrido frecuentemente en evolución son, entre otras, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, He/Val (ver Dayhof, M. D. , Atlas of protein secuence and structure, Nat. Biomed. Res. Found. Washington D.C. , 1978, vol. 5 compl 3). Otras sustituciones de aminoácido incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Me, Leu/Val y Ala/Glu. En base a esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la comparación de proteína rápida y sensible (Science, 227, 1435-1441 , 1985) y determinar la similitud funcional entre las proteínas homologas. Tales sustituciones de aminoácido de las modalidades ejemplares de esta invención, así como también las variaciones que tienen supresiones e/o inserciones se encuentran dentro del alcance de la invención mientras que
las proteínas resultantes no se afectan necesariamente en sus propiedades antigénicas o inmunogénicas. Esto explica el porque las proteínas WSSV de acuerdo a la invención, cuando se aislan de aislamientos de campo diferentes, pueden tener niveles de homología de aproximadamente 70%, mientras que todavía representan la misma proteína con las mismas características inmunológicas. Aquellas variaciones en la secuencia de aminoácidos de una cierta proteína de acuerdo a la invención que todavía proporcionan una proteína capaz de inducir una respuesta inmune contra la infección con WSSV o al menos en contra de las manifestaciones clínicas de la infección se consideran como "que no se afectan esencialmente las propiedades antigénicas o inmunogénicas de dicha proteína". Sin embargo, cuando una proteína se utiliza por ejemplo para propósitos de vacunación o para elevar los anticuerpos, no es necesario utilizar la proteína total. También es posible utilizar un fragmento de aquella proteína que es capaz, como tal o acoplada a un vehículo tal como por ejemplo KLH, de inducir una respuesta inmune contra aquella proteína, un fragmento tan llamado inmunogénico. Un "fragmento inmunogénico" se entiende que es un fragmento de la proteína de longitud completa que todavía ha retenido su capacidad de inducir una respuesta inmune en un huésped vertebrado, es decir, comprende un epítopo de célula T o B. Los anticuerpos elevados en un huésped vertebrado son muy adecuados como medios pasivos de vacunación en camarones. En este momento, una variedad de técnicas se encuentra disponible para identificar fácilmente los
fragmentos de ADN que codifican los fragmentos antigénicos (determinantes). El método descrito por Geysen ef al. (Solicitud de Patente WO 84/03564, Solicitud de Patente WO 86/06487, la Patente de É.U. NR. 4,833,092, Proc. Nati Acad. Sci. 81 : 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), el método tan llamado PEPSCAN es un método bien establecido, rápido y fácil de realizar para la detección de epítopos; las regiones inmunológicamente importante de la proteína. El método se utiliza ampliamente y se conoce bien como tal por aquel experto en la materia. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la detección de epítopos de célula B. También, dada la secuencia del gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos de computadora son capaces de diseñar fragmentos de proteína específicos como los epítopos inmunológicamente importantes sobre la base de su arreglo estructural y/o secuencial con epítopos que ahora se conocen. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo a Hopp y Woods (Proc. Nati. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981 )), y los aspectos de estructura secundaria de acuerdo a Chou y Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987) y la Patente de E.U. 4,554, 101 ). Los epítopos de célula T pueden predecirse de igual forma de la secuencia por computadora con la ayuda del criterio de amfifiiicidad de Berzofsky (Science 235, 1050-1062 (1987) y la solicitud de Patente de E.U. NTIS US 07/005,885). Una vista condensada se encuentra en: Shan Lu en principios comunes: Tibtech 9: 238-242 (1991 ), Good ef al. en Epítopos de Malaria; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu por una revisión; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzowsky por epítopos HIV; The FASEB Journal
:2412-2418 (1991 ). Otra modalidad de la invención se relaciona a las vacunas capaces de proteger al camarón contra la infección WSSV, que comprenden un reactivo de anticuerpo con una proteína o fragmento inmunogénico de acuerdo a la invención según se describe anteriormente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona a vacunas capaces de proteger al camarón contra la infección WSSV, que comprenden una proteína o fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo a la invención según se describe anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de acuerdo a la invención, o un fragmento inmunogénico de la misma. Más particularmente, ésta modalidad de la invención se relaciona a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína antigénica o un fragmento inmunogéníco de la misma comprendiendo una secuencia de aminoácidos según se representa en SEQ ID Nos. 2, 4 o 5. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico tiene o comprende la secuencia según se representa en SEQ ID NO 1 o 3. Las secuencias de nucleótido respectivas comienzan con el codón ATG que codifica el primer residuo M de la secuencia de aminoácidos deducida hasta el códón que codifica el residuo de aminoácido de terminal Ó. Debe entenderse que para el propósito de esta invención las secuencias de ácido nucleico que tienen homología de secuencia con las secuencias
representadas en SEQ. ID NO 1 o SEQ ID NO 3 también se encuentran dentro del alcance de la invención. La homología de secuencia para el propósito de esta invención se considera que es al menos de 70%, preferentemente 75%, más preferentemente 80%, aún más preferentemente 85%. Las secuencias de ácido nucleico altamente preferidas son aquellas que tienen homología de secuencia con las secuencias representadas en SEQ ID NO 1 o 3 de al menos 90%, más preferentemente 95%. Las homologías de 98% o aún 1 00% son aún más preferidas. Para el propósito de esta invención, la homología de secuencia se determina al comparar la secuencia de nucleótido de interés con la parte correspondiente de la secuencia representada en SEQ ID NO 1 o 3. Para el propósito de esta invención , la homología de secuencia de porcentaje se define como el porcentaje de nucleótidos idénticos entre las secuencias comparadas. El nivel de homología de nucleótido puede determinarse con el programa de computadora "SECUENCIAS BLAST 2" al seleccionar el subprograma: "BLASTN" que puede encontrarse en www. ncbi.nim.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova,
Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Los parámetros utilizados son los parámetros de omisión: Retribución para una pareja: +1. Penalidad para una dispareja: -2. Abertura abierta: %. Abertura de extensión: 2. Abertura x_bajada: 50. Las secuencias de ácido nucleico que tienen homología de
secuencia de acuerdo a la invención pueden aislarse fácilmente con una de las secuencias representadas en SEQ ID NO 1 o 3 o con los fragmentos de esta secuencia de las cepas de WSSV exactamente relacionadas utilizando la clonación de rutina y las técnicas de hibridización. Para este propósito, la hibridización se lleva a cabo bajo condiciones rigurosas, preferentemente, altamente rigurosas. Las condiciones de hibridización rigurosas se entiende que son condiciones de lavado de 1 x SSC, 0.1 % SDS a una temperatura de 65°C; las condiciones altamente rigurosas se refieren a condiciones de lavado en donde la concentración de SSC se va disminuyendo hacia 0.3 x SSC. La información específica precisamente no debería interpretarse a fin de requerir la exclusión de bases erróneamente identificadas. Las secuencias específicas descritas en la presente pueden utilizarse fácilmente para aislar las secuencias de nucleótido homologas de otras cepas. Una secuencia de ácido nucleico que tiene homología de secuencia con una de las secuencias representadas en SEQ ID NO 1 o 3 codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácido, la cual comprende alteraciones comparadas a una de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NOs. 2, 4 o 5, mediante lo cual dichas alteraciones no afectan esencialmente las propiedades antigénicas o inmunogénicas de dicha proteína. Las proteínas WSSV de acuerdo a la invención pueden obtenerse por medio de los métodos de purificación y aislamiento bioquímicos estándares o pueden prepararse por medio de la tecnología recombinante general. Las secuencias de nucleótido de acuerdo a la
invención son particularmente adecuadas para utilizarse para la producción recombinante de proteínas WSSV, sustancialmente libres de otras proteínas WSSV. Las secuencias de nucleótido se incorporan en un vector de expresión adecuado capaz de expresar las proteínas, transformar una célula huésped adecuada con dicho vector de expresión y cultivar la célula huésped en un medio adecuado. Las proteínas expresadas pueden aislarse y purificarse de las células o el medio. Los vectores de expresión , entre otros, son plásmidos, cósmidos, virus y YAC's (Cromosomas Artificiales de Levadura) que comprenden las regiones de control necesario para la replicación y expresión. El vector de expresión puede llevarse a la expresión en una célula huésped. Las células huésped adecuadas, por ejemplo, son bacterias, células de levadura, células de insecto y células de mamífero. Tales técnicas de expresión se conocen bien en la materia (Sambrook et al. , Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1 989; King and Posee, 1 992). Además, las secuencias de ácido nucleico de acuerdo a la invención pueden utilizarse para elaborar una vacuna de vector para vacunar crustáceos contra las infecciones de WSSV. Una vacuna vector se entiende que es una vacuna en donde una bacteria o virus atenuado (a), vivo (a), se ha modificado de tal forma que contiene una o más secuencias de nucleótido heterólogas insertadas en su material genético. Estas (os) tan llamadas (os) bacterias o virus vector son capaces de coexpresar las proteínas heterólogas codificadas por los nucleótidos insertados. De esta manera, en un cuarto aspecto, la invención se
proporciona para una vacuna vector para utilizarse en profilaxis o tratamiento de Síndrome de Mancha Blanca en crustáceos que comprenden una bacteria o virus atenuado (a) vivo (a) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicha bacteria o virus se ha modificado para comprender en su material genético una o más de ias secuencias de nucleótido de la presente invención. El camarón infectado con tales LRCs producirá una respuesta inmunológica no solamente contra los inmunógenos del vehículo, sino también contra las partes inmunogénicas de la (s) proteína (s) para las cuales ei código genético se clona en el LRC. Como un ejemplo de LRCs bacteriales, la bacteria tal como Vibrio anguillarum conocida en la materia puede utilizarse atractivamente. (Singer, J.T. ef al. , New Developments in Marine Biotechnology, p. 303-306, Eds. Le Gal and Halvorson, Plenum Press, New York, 1998). También, los virus LRC pueden utilizarse como una matera de transportar la secuencia de ácido nucleico en una célula objetivo. Los virus adecuados para esta prueba son, por ejemplo, virus de Cabeza Amarilla y virus Asociado por Branquia, ambos pertenecientes a la familia coronaviridae (ver, por ejemplo, Spann, K.M. ef al. , Dis. Aquat. Org. 42: 221 -225, (2000), y Cowley, J.A. ef al. , Dis. Aquat. Org. 36: 153-157 (1999) para el virus, o Enjuanes, L. et al. , p. 28-31 de Proceedings of the ESW, Brescia, Italia, 27-30 de Agosto del 2000 para virus de corona de vehículo recombinante vivo). La técnica de recombinación homologa in vivo, bien conocida en la materia, puede utilizarse para introducir una secuencia de ácido
nucleico recombinante en el genoma de una bacteria o virus de elección, capaz de inducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico insertado de acuerdo a la invención en el animal huésped. Una manera eficaz y alternativa de vacunación es la vacunación directa con ADN que codifica el antígeno relevante. La vacunación directa con ADN que codifica las proteínas ha sido exitosa para diversas proteínas diferentes. (Como se observa por ejemplo en
Donnelly ef al. The immunologist 2: 20-26 (1993)). Esta manera de vacunación es atractiva para la vacunación de camarón contra la infección de WSSV. Por lo tanto, todavía otra modalidad de la invención se refiere a vacunas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de acuerdo a la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma, o fragmentos de ADN, por ejemplo, plásmidos, que comprenden tales secuencias de ácido nucleico. Todavía otra mpdalidad de lá presente invención se refiere a una proteína de acuerdo a la invención para utilizarse en una vacuna. Nuevamente otra modalidad de la invención se refiere al uso de una proteína de acuerdo a la invención para la elaboración de una vacuna para combatir las infecciones de WSSV. Una vacuna de acuerdo a la invención puede utilizarse para proteger los crustáceos tales como los camarones incluyendo pero no limitándose a miembros de ia familia Penaeidae tal como por ejemplo, P. monodon, P. chinesis, P. merguensis, o Metapeaeus spp. ; esquilas incluyendo pero no limitándose a miembros de la familia Palaemonidae tal
como por ejemplo, Macrobrachium spp. o Palaemon spp. ; cangrejos incluyendo pero no limitándose a miembros de la familia Palinuridae y Nephropidae tal como por ejemplo, Calinectes spp. , Palinurus spp. , Panuliris spp. u Homarus spp. ; langostinos incluyendo pero no limitándose a miembros de la familia Astacidae ejemplos de los cuales están Astacus spp. , Procambarus spp. , y Oronectes spp. ; y jaiba incluyendo pero no limitándose a los miembros de la familia Cancridae y Portuidae, ejemplos de las cuales están Cáncer spp. , Callinectes spp. , Carcinus spp. y Portunus spp. Una vacuna de acuerdo a la invención puede prepararse de acuerdo a las técnicas .bien conocidas por el experto y descritas por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1 8a edición (1 990), eds. A.R. Gennaro et al. , capítulo 72, pp. 1 389-1404, Colegio de Filadelfia de Farmacia y Ciencia. Las vacunas de acuerdo a la invención comprenden una cantidad eficaz de una o más proteínas, bacteria o virus vector de acuerdo a la invención, y un vehículo farmacéutico aceptable. El término "eficaz" según se utiliza en la presente se define como la cantidad suficiente para inducir una respuesta protectora en los crustáceos. La cantidad de vector o proteína dependerá del tipo de vector o proteína, la vía de administración, el tiempo de administración, las especies a vacunar así como también la edad, salud en general, temperatura y dieta. En general, una dosis de 0.01 a 1 000 µg de proteína por animal, preferentemente 0.5 a 500 µg, más preferentemente 1 a 100 µg por animal puede utilizarse. En caso de vacunas de vector viral, puede
eficazmente utilizarse una dosis de 1 0?3 a 10?8 pfu (unidades formadoras de placa) por animal. Las vacunas de vector bacteriales pueden darse muy eficazmente en dosis de 10?3 a 10?8 bacterias. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para utilizarse en una vacuna de acuerdo a la invención son estériles y fisiológicamente compatibles tales como por ejemplo, agua estéril, salina, reguladores acuosos tales como fosfatos de metal de álcali (por ejemplo, PBS), alcoholes, polioles y lo similar. Además, una vacuna de acuerdo a la invención, puede comprender otros aditivos tales como adyuvantes, estabilizadores, anti-oxidantes, conservadores y otros. Los adyuvantes adecuados incluyen pero no se limitan a, sales o geles de aluminio, carbomeros, copolímeros de bloque no iónico, tocoferoles, monofosforilípido A, muramildipéptido, emulsiones de aceite, glucanos, citoquinas, saponinas tales como Quil A, y lo similar. La cantidad de adyuvante agregado depende de la naturaleza del adyuvante por sí mismo. Los estabilizadores adecuados para utilizarse en una vacuna de acuerdo a la invención incluyen pero no se limitan a, carbohidratos tales como sorbitol, manitol, almidón, sucrosa, dextrina, y glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, y reguladores como fosfatos de alcalina. Los conservadores adecuados incluyen, entre otros, timerosal y mertiolato. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden administrarse por medio de la inyección , inmersión , inmersión, rocío o aerosol, o por oral. Preferentemente, la vacuna se administra en los crustáceos mediante la inmersión o por oral, especialmente en el caso de granjas de
cultivo de agua comercial. Para la administración oral, la vacuna se mezcla preferentemente con un vehículo adecuado para la administración oral, es decir, celulosa, alimento o una sustancia metabolizable tal como alfa-celulosa o aceites diferentes de origen animal o vegetal. Los vehículos alimenticios particularmente preferidos para el suministro oral de la vacuna de acuerdo a la invención, son organismos de alimentación vivos que son capaces de encapsular la vacuna. Una manera muy adecuada para obtenerse esto es alimentar, por ejemplo, las células de insecto en donde se ha expresado una proteína de acuerdo a la invención, a organismo de alimentación vivos. Los organismos de alimentación vivos incluyen pero no se limitan a, alimentadores de filtro no-selectivo similar al plancton preferentemente miembros de Rotifera, Artemia, y lo similar. El altamente preferido es el camarón de agua salada Artemia sp. Las proteínas de acuerdo a la invención, pueden utilizarse para la producción de anticuerpos, utilizando las técnicas generales disponibles al experto en la materia. Preferentemente, las proteínas se utilizan para producir anticuerpos monoclonales específicos. Los anticuerpos de acuerdo a la invención, pueden prepararse de acuerdo a las técnicas estándares. Los procedimientos para inmunizar animales, por ejemplo, ratones con proteínas y los procedimientos para la selección de hibridomas que produce anticuerpos monoclonales específicos de proteína, se conocen bien en la materia (ver por ejemplo Cligan ef al. (eds), Current protocols in Immunology 1992; Kohier y Milsterin, Nature 256, pp. 495-497. 1975: Steenbakkers ef al. , Mol. Biol. Rep. 19, pp 125-134, 1994). Los
anticuerpos obtenidos pueden utilizarse en diagnósticos para detectar WSSV en el campo o para detectar la presencia de WSSV en los crustáceos. Las secuencias de nucleótido de acuerdo a la invención también son adecuadas para utilizarse en diagnósticos. Dichas secuencias o fragmentos de las mismas pueden utilizar, por ejemplo, en tecnología de PCR para detectar la presencia de WSSV en el campo, o en los crustáceos. Una prueba de diagnóstico para la detección de WSSV, por ejemplo, se basa en la reacción de ADN aisl do del animal a probarse, con exámenes específicos o por ejemplo, es una prueba PCR en base a las secuencias de codificación para las proteínas de acuerdo a la invención o en base a las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a aquellas secuencias de codificación. Si las moléculas de ácido nucleico específico para las proteínas WSSV de acuerdo a la invención, se presentan en el animal, estas, por ejemplo, se unirán específicamente a cargas de inicio de PCR específicos y llegaran a amplificarse posteriormente en la reacción de PCR. El producto de reacción de PCR puede detectarse fácilmente en electroforesis de gel de ADN. Las reacciones de PCR se conocen bien en la materia (ver referencia de abajo). Las moléculas de ácido nucleico pueden fácilmente aislarse del hepatopáncreas del animal a probarse. Los libros de texto de PCR estándares dan métodos para determinar la longitud de las cargas de inicio para las reacciones de PCR selectivas con moléculas de ácido nucleico específicas para las proteínas de acuerdo a la invención. Las cargas de inicio con una secuencia de ácido nucleótido de al menos 12 nucleótidos,
se utilizan frecuentemente, pero las cargas de inicio de más de 15, más preferentemente 18 nucleótidos son de cierta forma más selectivos. Los primeros especialmente con una longitud de al menos 20, preferentemente al menos 30 nucleótidos muy generalmente son aplicables. Las técnicas de PCR se describen ampliamente en (Dieffenbach & Dreksler, PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1 995)). Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de WSSV de acuerdo a la invención o partes de aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen una longitud de al menos 12, preferentemente 1 5, más preferentemente 18, aún más preferentemente 20, 22, 25, 30, 35, o 40 nucleótidos en ese orden de preferencia, en donde las moléculas de ácido nucleido o partes de las mimas tienen al menos 70% de homología con la secuencia de ácido nucleico según se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 o una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico según se representa en SEQ ID NO: 1 o 3, por lo tanto, también son parte de la invención. Tales moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, pueden utilizarse como cargas de inicio en las reacciones de PCR a fin de mejorar la cantidad de ácido nucleico que codifica las proteínas de acuerdo a la invención. Esto permite la amplificación rápida de las secuencias de nucleótido específico para utilizarse como una herramienta de diagnóstico, por ejemplo, para la detección de WSSV en el tejido según se indica anteriormente. Otra prueba en base a ácido nucleico se basa en la hibridización clásica con fragmentos de cADN específico de proteína marcada de color o radioactivamente. Tanto las reacciones de POR como
las reacciones de hibridización se conocen bien en la materia y, entre otras, se describen en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. ef al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). De está manera, otra modalidad de la invención se refiere a un equipo de diagnóstico para la detección de WSSV en donde la prueba comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos de 70% homólogo a la secuencia de ácido nucleico según se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 o una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a aquella secuencia de ácido nucleico, o ún fragmento de la misma, que tiene una longitud de al menos 12, preferentemente 1 5, más preferentemente 18 nucleótidos. Una prueba de diagnóstico se basa en la detección de material antigénico de proteínas de WSSV y por lo tanto, adecuada para la detección de la infección de WSSV por ejemplo, también puede ser una prueba ELISA de inserción estándar. En un ejemplo de tal prueba, las paredes de las cavidades de una lámina ELISA se revisten con anticuerpo dirigidos en contra de la proteína de acuerdo a la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma. Después de la incubación con el material a utilizarse, los anticuerpos anti-WSSV marcados se agregan a las cavidades. Una reacción de color revela así la presencia de material antigénico de WSSV. Por lo tanto, todavía otra modalidad de la presente invención se refiere a Una prueba de diagnóstico para la detección de WSSV, caracterizada porque dicha prueba comprende anticuerpos en contra de una proteína o una fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo a la
invención . De esta manera, en otro aspecto, la presente invención se proporciona para un equipo de diagnóstico que comprende una o más secuencias de nucleótido o anticuerpos de acuerdo a la invención. Los anticuerpos elevados en contra de las proteínas de acuerdo a la invención pueden además utilizarse para elaborar vacunas de anticuerpo para la inmunización pasiva de los crustáceos. De esta manera, en un cuarto aspecto, la presente invención se proporciona para una vacuna para la inmunización pasiva en contra de WSSV en donde la vacuna comprende anticuerpos elevados en contra de una proteína que comprende una secuencia de aminoácido según se muestra en SEQ ID NO2, SEQ ID NO 4, o SEQ ID NO5. Tal vacuna puede prepararse utilizando técnicas estándares, según se menciona anteriormente. Preferentemente, una vacuna para la administración oral de los anticuerpos se prepara, en donde los anticuerpos se mezclan con un vehículo comestible tal como alimento de pescado. Más preferentemente, la vacuna se prepara de anticuerpos preparados en huevos de gallina (anticuerpos IgY). Los métodos para la produccióp a gran escala de anticuerpos de acuerdo a la invención, también se conocen en la materia. Tales métodos recaen en la clonación de (fragmentos) la información genética que codifica la proteína de acuerdo a la invención en un fago filamentoso para la muestra de fago. Tales técnicas se describen, entre otras, en la "Página de Elaboración de Anticuerpos" bajo "muestra de fago filamentoso" en http://aximt.1 . imt. uni-marburg.de/-rek/aepphage. html. , y en papeles de revisión por Córtese, R. ef al. (1 994) en Trends Biotechn . 12: 262-267 , por
Claxon, T. & Wells, J.A. (1994) en Trends Biotechn. 12: 173-183, por Marks, J.D. ef al., (1992) en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010, por Winter, G. ef al., (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, M. ef al., (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Los fagos se utilizan posteriormente para explorar las bibliotecas de expresión de camelido que expresan anticuerpos de cadena pesada de camelido. (Muyldermans, S. y Lauwereys, J., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140 (1999) y Ghahroudi, M.A. ef al., FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la librería que expresan los anticuerpos deseados pueden replicarse y posteriormente utilizarse para la expresión a gran escala de anticuerpos. REFERENCIAS Durand, S., Lightner, D. V., Redman, R. M., y Bonami, J. R. (1997). Ultrastructuré and morphogenesis of Whité Spot Síndrome Baculovirus (WSSV). Diseases Aquat. Organisms 29, 205-211. Flegel, T. W. (1997). Major viral diseases of the black tigre prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World J. Microbiol. Biotechnol. 13, 433-442. Francki, R.I.B., Fauquet, C. M., Knudson, D. L., y Brown, F. (1991). "Classification and Nomenclature of Viruses: Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses". Springer-Verlag, New York. Lo, C.F., Hsu, H. C, Tsai, M. F., Ho, C. H., Peng, S.E., Kou, G. H., y Lightner, D. V. (1999). Specific genomic fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp white spot síndrome virus. Diseases Aquat. Organisms.
Murphy, F.A., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Ghabrial, S. A.,
Jarvis, A. W., Martelli, G. P., Mayo, M. A., y Summers, M. D. (1995).
"Classification and Nomenclature of Viruses: Sixth Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses". Virus Taxonomy Springer-Verlag, New York. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). "Molecular Cloning: A laboratory Manual". 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Wonteerasupaya, C. Vickers, J. E., Sriurairatana, S., Nash, G. L., Akarajamorn, A., Boonsaeng, V., Panyim, S., Tasanakajon, A., Withyachumnarnkul, B., y Flegel, T. W. (1995). A non-occluded, system baculovirus that occurrs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tigre prawn Penaeus monodon. Diseases Aquat. Organisms 21, 69-77. Yang, F., Wang, W., Chen, R. Z., y Xu, X. (1997). A simple and efficient method for purification of prawn baculovirus DNA. J. Virol. Meth.67, 1-4.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Vacunación de Penaeús monodon con proteína de WSSV VP19
Producción de cepa de virus Una cepa de virus WSSV se produjo en el langostino Procambarus clarkii mediante la inyección intramuscular de WSSV
purificado. A fin de determinar la dilución resultante en 90-100% de mortalidad en el camarón tigre negro P. monodon, se realizó una concentración de virus in vivo utilizando animales de aproximadamente 1 gramo en peso. La cepa de virus se diluyó en etapas de 1 x 105 a 5 x 101 1 veces en 330 mM de NaCI y para cada dilución se inyectó 10 µl intramuscularmente en 1 0 camarones. Los camarones que se inyectaron con 330 mM de NaCI, sirvieron como control negativo para la infección . Todos los camarones sirviendo como control negativo (no mostrado) y aquéllos habiendo recibido la dilución de virus 5 x 101 1 sobreviviente, mientras que la mortalidad debido a la infección de virus ocurrió en todos los grupos con una dilución de virus inferior. La administración de diluciones de virus de 1 x 105 y 1 x 107 dieron como resultado casi 100% de mortalidad en un período de 20 días. Una supresión en mortalidad se observó cuando las diluciones de virus de 1 x 108 y 5 x 109 se utilizaron. La dilución 1 x 108 dio como resultado un 90% de mortalidad final, pero el tiempo de mortalidad se suprimió y cubrió un período de 40 días. El experimento se repitió con la dilución 1 x 1 07, la 1 x 106, y la 1 x 105 produciendo esencialmente los mismos resultados. La dilución de 1 x 105 se eligió como la dosis de virus para más experimentos a medida que esta condición se esperó que diera la respuesta óptima a la neutralización en términos de reducción de mortalidad. Expresión de proteínas de WSSV VP19 v VP13 en células de insecto Las ORFs VP1 9 y VP1 3 se expresaron en células de insecto utilizando un vector baculovirus. El sistema Bac-a-Bac (GIBCO BRL) se
utilizó para generar baculovirus recombinantes (AcMNPV) que expresan las proteínas de virión de WSSV putativo VP19 y VP13 del promotor de poliherina de baculovirus en células de insecto. Los virus recombinantes se generaron expresando la Proteína Fluorescente Verde (GFP) del promotor p1 0 y cada una de las proteínas de WSSV del promotor de polihedrina de vaculovirus. Las células de insecto Sf21 se infectaron con AcMNPV-WSSVvp19, y AcMNPV-WSSVvp13 con una MOI de 5 y se colectaron en 72 h, posteriores a la infección. Los extractos de células Sf21 infectadas se analizaron en un 1 5% de gel de SDS-PAGE (Fig. 1 ). Los productos de expresión clara pueden observarse por VP1 3 (Fig. 1 , paso 5, e indicada aquí como VP1 5), la cual tiene la misma movilidad electroforética como su contraparte auténtica en el virión de WSSV (Fig. 1 , paso 2). Un producto de expresión (menos claro, pero claramente visible) pudo observarse por VP19 (Fig. 1 , paso 3). Por lo tanto, un análisis western se llevo a cabo utilizando un antisuero policlonal elevado contra el WSSV purificado. Este análisis mostró que VP1 9 se expresó en la posición esperada (Fig. 1 , paso 4), y de aquí en adelante que el ORF vp19 codificó una proteína de virión de WSSV. Vacunación v cambio El experimento se estableció de acuerdo al plan en la Tabla 1 . Se utilizaron cuatro grupos experimentales; dos grupos de control, el control positivo y negativo, un grupo recibiendo VP19 y un grupo recibiendo GFP. En el grupo de GFP, los camarones recibieron la misma mezcla que se dio en el grupo VP1 9, con la excepción de VP19.
Tabla 1. Grupo establecido de experimento de vacunación
Todos los grupos se inyectaron con 20 µl de sus soluciones respetivas. Para el grupo VP19 y el grupo de GFP, se administró una cantidad total de 15 µg de proteína tanto para la vacunación como el impulsador. Para la dilución de las soluciones de prúteína, así como también los controles de virus, se utilizó una solución de 330 mM de NaCl. GFP es Proteína Verde Fluorescente. En el grupo de GFP, los camarones recibieron la misma mezcla que se dio al grupo VP1 9, con la excepción de VP 19. Cinco días después de la vacunación, el camarón dio una inyección de refuerzo, dos días después seguido por la inyección de WSSV. Después del cambio, los camarones se monitorearon por una semana y los camarones muertos se examinaron para la presencia de WSSV mediante ensayos ELISA y microscopía electrónica. Ninguno de los camarones en el grupo 1 , el control negativo, murió de WSSV. Los
camarones de grupo 2 comenzaron a morir de la infección de WSSV después de un día y medio, y se alcanzó una mortalidad de 100% después de 5 días. Los primeros animales en los grupos de vacunación 3 murieron después de un día y medio, pero continuaron más lento en comparación al grupo 2. El grupo 3 alcanzó 100% de mortalidad después de seis días posteriores al cambio y muestra una supresión clara en mortalidad en comparación al control positivo. Esto demuestra que la vacunación de camarón P. monodon con la proteína de WSSV VP19 tiene un efecto positivo en la escala de supervivencia de los camarones después del cambio con WSSV.
Leyenda para las fiquras Figura 1. Marcador LMW Paso 1 (Amersham pharmaci biotech), 2 gel SDS-PAGE de WSSV Purificado, 3 gel SDS-PAGE de VP19 sobre -expresada, 4 una mancha Western con anti-WSSV de VP19 sobre-expresada. 5 gel SDS-PAGE de VP13 sobre-expresada (indicada aquí como VP15). Figura 2. Esta figura muestra el nivel de efecto de vacunación en mortalidad de camarones después del cambio con WSSV: -*-= vacuna
VP19, -*-= control negativo, -D-= control positivo, -*-= control de GFP.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Al zo Nobel N . V.
<120> Proteínas Antigénicas de Virus de Síndrome de Mancha Blanca de Camarón y usos de las mismas.
<130> 2000558ep/pd
<140> <141>
<160> 5
<170> Patentln Ver . 2.1
<210> 1 <211> 366 <212> ADN <213> virus de síndrome de mancha blanca
<220> <221> CDS <222> (1).. (366)
<400> 1 atg gcc acc acg act aac act ctt cct tte ggc agg acc gga gcc cag 48 Met Ala Thr Thr Thr Asn Thr Leu Pro Phe Gly Arg Thr Gly Ala Gln. 1 5 10 15
gcc gct ggc cct tct tac acc atg gaa gat ctt gaa gge tec atg tct 96 Ala Ala Gly Pro Ser Tyr Thr Met Glu Asp Leu Glu Gly Ser Met Ser 20 25 30
atg gct ege atg ggt ctc ttt ttg ate gtt gct ate tea att ggt ate 144 Met Ala Arg Met Gly Leu Phe Leu He Val Ala He Ser He Gly He 35 40 45
cte gtc ctg gcc gtc atg aat gta tgg atg gga cea aag aag gac age 192 Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val Trp Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser 50 55 60
gat tct gac act gat aag gac acc gtt gat gat gac gac act gcc aac 240 Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp Thr Val Asp Asp A=p Asp Thr Ala Asn 65 70 75 80
gat aac gat gat gag gac aaa tat aag aac agg acc agg gat atg atg 288 Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Arg Asp Met Met 85 90 95
ctt ctg gct ggg tec gct ctt ctg tte ctc gtt tec gcc gco acc gtt 336 Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Thr Val 100 105 110
ttt atg tct tac ccc aag agg agg cag taa 366
Phe Met Ser Tyr Pro Lys Arg Arg Gln 115 120
<210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> virus de síndrome de mancha blanca
<400> 2 Met Ala Thr Thr Thr Asn Thr Leu Pro Phe Gly Arg Thr Gly Ala Gln 1 5 10 15
Ala Ala Gly Pro Ser Tyr Thr Met Glu Asp Leu Glu Gly Ser Met Ser 20 25 30
Met Ala Arg Met Gly Leu Phe Leu He Val Ala He Ser He Gly He 35 40 45
Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val Trp Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser 50 55 60
Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp Thr Val Asp Asp Asp Asp Thr Ala Asn 65 70 75 80
Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Arg Asp Met Met 85 90 95
Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Thr Val 100 105 110
Phe Met Ser Tyr Pro Lys Arg Arg Gln 115 120
<210> 3 <211> 186 <212> ADN <213> virus de síndrome de mancha blanca
<220> <221> CDS <222> (1).. (186)
<400> 3 atg gtt gcc cga age tec aag acc aaa tec cgc cgt gga age aag aag 48 Met Val Ala Arg Ser Ser Lys Thr Ly3 Ser Arg Arg Gly Ser Lys Lys 1 5 10 15
agg t^cc acc act gct gga cgc ate tce aag cgg agg age cea tea atg 96 Arg Ser Thr Thr Ala Gly Arg He Ser Lys Arg Arg Ser Pro Ser Met 20 25 30
aag aág cgt gca gga aag aag age tce act gtc cgt cgc cgt tec tea 144 Lys Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ser Ser Thr Val Arg Arg Arg Ser Ser 35 40 45
aag age gga aag aag tct gga gcc cgc aag tea agg cgt taa 186
Lys Ser Gly Lys Lys Ser Gly Ala Arg Lys Ser Arg Arg 50 55 60
<210> 4 <211> 61 <212> PRT <213> virus de síndrome de mancha blanca
<400> 4 Met Val Ala Arg Ser^ Ser Lys Thr Lys Ser Arg Arg Gly Ser Lys Lys 1 5 10 15
Arg Ser Thr Thr Ala Gly Arg He Ser Lys Arg Arg Ser Pro Ser Met 20 25 30
Lys Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ser Ser Thr Val Arg Arg Arg Ser Ser 35 40 45
Lys Ser Gly Lys Lys Ser Gly Ala Arg Lys Ser Arg Arg 50 55 60
<210> 5 <211> 80 <212> PRT <213> virus de síndrome de mancha blanca
<400> 5 Met Thr Lys Tyr Pro Glu Asn Lys Arg Leu Leu Ser Arg Asn Lys Glu 1 5 10 15
Thr Leu Lys Met Val Ala Arg Ser Ser Lys Thr Lys Ser Arg Arg Gly 20 25 30
Ser Lys Lys Arg Ser Thr Thr Ala Gly Arg He Ser Lys Arg Arg Ser 35 40 45
Pro Ser Met Lys Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ser Ser Thr Val Arg Arg 50 55 60
Arg Ser Ser Lys Ser Gly Lys Lys Ser Gly Ala Arg Lys Ser Arg Arg 65 70 75 80
Claims (9)
- REIVINDICACIONES 1. La proteína antigénica de WSSV adecuada para inmunizar crustáceos en contra de WSSV, caracterizada porque dicha proteína antigénica tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% homologa a la secuencia de aminoácidos según se representa en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína antigénica.
- 2. La proteína antigénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque tiene una homología de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90%, más preferentemente 95% de homología a la secuencia de aminoácidos según se representa en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína antigénica.
- 3. La vacuna capaz de proteger al camarón en contra de la infección de WSSV, caracterizada porque dicha vacuna comprende una proteína o un fragmento inmunogénico de la misma según ia reivindicación 1 o 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
- 4. La secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína antigénica según la reivindicación 1 o 2, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.
- 5. La secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 4, caracterizada porque dicha secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia según se representa en SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3.
- 6. La vacuna vector para utilizarse en profilaxis o tratamiento de Síndrome de Mancha Blanca en crustáceos, caracterizada porque dicha vacuna comprende una bacteria atenuada viva o virus atenuado vivo, comprendiendo dicha bacteria o virus en su genoma una secuencia de ácido nucleico heterólogo según la reivindicación 4 o 5.
- 7. La proteína antigénica según la reivindicación 1 o 2 para utilizarse una vacuna.
- 8. El u o de una proteína antigénica según la reivindicación 1 o 2, para ia elaboración de una vacuna para combatir las infecciones de WSSV. 9. Los anticuerpos elevados en contra de una proteína según la reivindicación 1 o 2. 10. La vacuna comprendiendo un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un anticuerpo según la reivindicación 9. 1 1 . La vacuna comprendiendo un vehículo farmacéuticamente aceptable y una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5. 12. El equipo de diagnóstico para la detección de WSSV, caracterizado porque dicho equipo comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70% homologa a la secuencia de ácido nucleico según se representa en SEQ ID NO: 1 o 3 o una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a aquella secuencia de ácido nucleico, o un fragmento de la misma que tiene una longitud de al menos 12, preferentemente 1 5, más preferentemente 18 nucleótidos, una proteína antigénica según la reivindicación 1 o 2 o un fragmento inmunogénico de la misma, o un anticuerpo según la reivindicación
- 9.
Applications Claiming Priority (2)
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