MXPA01010646A - Receptor de p2x3, metodos para alterar la actividad del receptor p2x3 y sus usos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al receptor de P2X3, metodos para modular la actividad del receptor P2X3 y a los usos de estos metodos. En particular, tales metodos pueden ser usados, por ejemplo, para acelerar la velocidad de re-sensibilizacion de un receptor desensibilizado.

Description

RECEPTOR DE P2X3, MÉTODOS PARA ALTERAR LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR PD2X3, Y SUS USOS La presente solicitud es una Continuación en Parte de la 5 solicitud de patente de E.U. pendiente No. de Ser. 09/191 , 136, presentada el 13 de Noviembre de 1 998, que es una Continuación en Parte de la solicitud de patente de E. U. No. de Ser. 09/008,526, presentada el 16 de Enero de 1 998, ahora abandonada, y la solicitud de patente de E.U. No. de Ser. 09/008, 1 85, presentada el 16 de Enero de 1998, ahora 10 abandonada. La presente solicitud también reivindica prioridad de la solicitud provisional de E. U. No. de Ser. 60/1 30,339, presentada el 21 de Abril de 1999.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 15 Campo Técnico La invención sujeto se refiere al receptor de P2X3, métodos para modular la actividad del receptor de P2X3, y a los usos de estos métodos. En particular, tales métodos pueden utilizarse, por ejemplo, • para acelerar la velocidad de la resensibilización del receptor, cuando se 20 receptor se ha desensibiiizado. Además, la presente invención también comprende el uso de antagonistas de receptor, en particular un antagonista del receptor de P2X3, para minimizar la sensación de dolor en un mamífero. Información Antecedente 25 Los receptores de P2X funcionan como canales de ion * permeables al catión, en algunos casos, como canales heteroméricos que consisten de dos diferentes subtipos de receptor P2X diferentes (Lewis et al., Nature 377:432-435 (1995); Le et al., J. Neurosci. 18:7152-7159 (1998); Torres ef al., Mol. Pharmacol. 54:989-993 (1998)). Al menos un • 5 par de subtipos de receptor P2X, P2X2 y P2X3, funciona como un canal heteromérico en las neuronas de ganglio nudoso de rata, en donde muestra propiedades electrofisiológicas y farmacológicas distintas (Lewis ef al., s?pra (1995)). Con respecto a receptores individuales, el receptor de P2X2 de 10 rata se expresa en la médula espinal, y en los ganglios de raíz dorsal y afc nudosa (Brake ef al., Nature, 371 :519-523 (1994)), aunque la expresión del receptor de P2X3 se encuentra principalmente en un subgrupo de neuronas en los ganglios sensoriales (Chen et al., Nature 377:428-430 (1 995); Vulchanova ef al., Neuropharmacol 36: 1229-1242 (1997). La 15 distribución de ambos receptores es consistente con un papel en la transmisión de dolor. Las subunidades del receptor de P2X2 y P2X3 forman canales funcionales cuando se expresan solas, y también pueden formar un canal heteromultimérico funcional que tiene propiedades • similares a las corrientes observadas en los canales sensoriales nativos 20 cuando se co-expresan (Lewis ef al., Nature 377:432-435 (1995)). La evidencia de estudios de ganglios nudosos de rata indica que tanto los canales heteroméricos de P2X2/ P2X3 y canales homoméricos de P2X2 contribuyen a las corrientes inducidas por ATP (Virginio ef al., J. Physiol (Lond) 510:27-35 (1998); Thomas ef al., J. Phusiol (Lond) 509 (Pt 2):41 1 - 25 417 (1998)); Vulchanova ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8063-8067 *»»••«->» ' - <- »-- * ?.*.-. ' (1996); Simo i et al., Mol. Pharmacol. 52:237-248 (1997)). ATP, que activa los receptores de P2X2, P2X3, y P2X2/P2X3, funciona como un neurotransmisor excitador en el cuerno dorsal de la médula espinal y en los aferentes primarios de ganglios sensoriales • 5 (Holton ef al , J. Phvsiol (Lond) 126: 124-140 (1954)). La activación inducida por ATP de receptores de P2X en las terminales del nervio de ganglio de ra íz dorsal en la médula espinal estimula la liberación de glutamato, un neurotransmisor clave incluido en la señalización nociceptiva (Gu et al., Nature 389:749-753 (1997)). De esta manera, ATP 10 liberado de células dañadas puede evocar el dolor al activar los receptores i de P2X2, P2X; o P2X2/P2X3 en los finales del nervio nociceptivo de nervios sensoriales. Esto es consistente con la inducción de dolor por ATP intradérmicamente aplicado en el modelo base de vejiga humana (Bieehen, Br. J. Pharma col. 62:573-577 (1 978)), la identificación de los receptores 15 de P2X2 en neuronas nociceptivas en la pulpa del diente (Cook ef al., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 350:61 8-625 (1994)). Esta evidencia sug iere que P2X2 y P2X3 funciona en la nocicepción, y que los modulares de estos receptores de P2X2 humanos pueden ser útiles como • analgésicos. 20 Lé utilidad de cibacron azul [es decir, Azul Reactivo-2; ácido 2-antracenosulfónico, 1 -amino-4-[[4-[[4-cloro-6-[(2-sulfofenil)amino]-1 ,3,5- triazin-2-il]am?no]-3-sulfofenil]amino-9, 1 0-dihidro-9, 10-dioxo-], un derivado de ácido sulf ónico de antraquinona, como un inhibidor de señalización mediada por ATP y la activación del receptor de P2X y P2Y, se ha 25 documentado bien (Ralevic et al. , Pharmacological Reviews 50:41 3-492 . LJ . AM^ü?^?*> * (1998)). Cibacron azul funciona como un antagonista del varias respuestas fisiológicas mediadas por ATP, diversas, incluyendo contracción del músculo suave de la vejiga urinaria de rata (Hashimoto ef al., Br. J. Pharmacol. 1 15:636-640 (1995)), potenciales de unión inhibidora del intestino ciego de rata (Manzini ef al., Eur. J. Pharmacol. 127: 197-204 (1986)), secreción de fosfolípido de células Tipo II alveolares de rata (Rice ef al., Br. J. Pharmacol. 97: 1258-162 (1989)), e influjo de calcio en células acinares de parótida de rata (Soltoff ef al., Biochem. Biophys. Res. Común. 165: 1279-1285 (1989)). El cibacron azul también funciona tanto como antagonista del corrientes interiores operadas por el receptor P2 e flujo de calcio en células PC12 (Nakazawa ef al., Pflugers Arch 418:214-219 (1991 ); Michel ef al., Scmiedebergs Arch. Pharmacol. 354:562-571 (1 996); Surprenant, A. , Ciba Found. Svmp. 1 98:208-219 (1 996)), y como un inhibidor de actividad de nucleotidaza en oocitos de Xenopus (Ziganshin ef al., Biochem. Pharmacol. 51 :897-901 (1996)). Los receptores de P2X? y P2X2 de rata, recombinantes también son sensibles a la inhibición por cibacron azul (Surprenant, A. , Ciba Found. Svmp. 1 98:208-21 9 (1 996)). Aunque los efectos de cibacron azul en la función del receptor de P2X parecen ser principalmente inhibidores, un reporta ha descrito su actividad potencial en el receptor de P2X4 (Miller ef al., Neuropharmacology 37: 1 579-1 586 (1998)). En las células HEK293 que expresan el receptor de P2X4 de rata, el pre-tratamiento con cibacron azul medio un incremento de 4 veces en la potencia de ATP sin afectar la respuesta máxima (Miller eí al., supra (1 998)). ' * e±-* Los efectos nociceptivos de ATN exógenamente administrado y agonistas del receptor de P2X también se han demostrado en animales de laboratorio (Bland-Ward ef al., Br. J. Pharmacol. 122:366-371 (1997); Hamilton ef al., Br. J. Pharmacol. 126:326-332 (1999)). Un incremento • 5 mediado por el receptor P2 selectivo en excitabilidad neuoral ectópica que se ubica en aferentes sensoriales dañados se ha reportado recientemente en ratas después de la lesión del nervio de constricción crónico (Chen ef al., NeuroReport 10:2779-2782 (1999)). Además de las acciones nociceptivas periféricas de ta activación del receptor de P2X, la 10 estimulación de los receptores de P2X espinales también pueden contribuir a la nocicepción como se indica por la habilidad de los agonistas del receptor P2 administrados intratecalmente (i.t.) para incrementar la sensibilidad a los estímulos nocivos persistentes y agudos en roedores (Driessen eí al. , Brain Res. 666: 182-1 88 (1994); Tsuda ef al., Br. J. 15 Pharmacol.127:449-456 (1999); Tsuda ef al., ., Br. J. Pharmacol.128: 1497- 1 504 (1999)). La utilidad de los ligandos purinérgicos disponibles para evaluar el papel de los subtipos del receptor P2 individuales en fisiología • mamífera se ha complicado por la susceptibilidad de los agonistas del 20 receptor P2 para experimentar la degradación enzimática, y por la falta de antagonistas y agonistas selectivos del subtipo de receptor P2 (King ef al., Pharmacol Rev. 50:41 3-492 (1998)). Sin embargo, la disponibilidad reciente de los subtipos de receptor P2 mamíferos recombinantes ha permitido la caracterización sistemática de la farmacología de subtipos de 25 receptor P2 específicos (King et al., supra (1 998); Bianchi eí al., Europ. J.

' Phartnacol. 376: 127-138 (1999) y conduce a la clarificación adicional de la selectividad farmacológica de ligandos que actúan como receptores de P2X. Por ejemplo, 2',3,-O-(2,4,6-trinitrofenil)-ATP (TNP-ATP), un análogo de ATP fluorescente con las acciones antinociceptivas después de la administración i.t. en ratones (Tsuda ef al., ., Br. J. Pharmacol. 127:449-456 (1999); Tsuda ef al., ., Br. J. Pharmacol. 128: 1497-1 504 (1 999), se ha encontrado que es un antagonista nanomolar potente en los receptores de P2X? , P2X3 l y P2X2/3 (Lewis ef al., ., Br. J. Pharmacol. 124: 1463-1466 (1998); Thomas ef al., J. Phvsiol. 5092:41 1 -417 (1 998)). Ya que los ligandos selectivos de subtipo para los receptores P2 individuales aún no se han identificado, los esfuerzos para producir los subtipos del receptor de P2X específicos incluidos en la transmisión de señales nociceptivas se han basado grandemente en la ubicación del receptor y los estudios funcionales que utilizan técnicas inumunohistoquímicas. Estos estudios han mostrado que tanto los subtipos del receptor de P2X2 3 heteromérico y P2X3 homomérico se ubican selectivamente en ias terminales, central y periférica de las neuronas sensoriales de diámetro pequeño (Chen ef al., Nature 377:428-431 (1 995); Lewis et al. , Nature 377:432-435 (1995); Vulchanova ef al., Neuropharmacol 36: 1229-1242 (1997); Vulchanova ef al., Euro. J. Neurosci. 10: 3470-3478 (1 998)). Además, los datos recientes han mostrado que la inmunoreactividad específica de P2X3 se incrementa significativamente tanto en el ganglio de raíz dorsal lesionado como en el cuerno de la médula espinal ipsalateral después de la lesión de constricción crónica del nervio ciático de la rata (Novakovic ef al., Pain J &&L.* '80:27*3-282 (1999). Tomados juntos, la ubicación inmunohistoquímica o funcional de los receptores que contienen P2X3 (P2X3 y P2X2 3) en nervios sensoriales indica que estos receptores de P2X pueden tener un papel 5 principal para mediar los efectos nociceptivos de ATP exógeno. De esta manera, los compuestos que bloquean o inhiben la activación de los receptores de P2X3 sirven para bloquear los estímulos de dolor. Los antagonistas del receptor a los compuestos que activan normalmente los canales heteroméricos del receptor de P2X3 y/o P2X2/ P2X3, tal como ATP, 10 podrían bloquear exitosamente la transmisión de dolor. k En vista de lo anterior, los métodos se necesitan ciertamente, los cuales proporcionan la habilidad para regular o controlar los receptores de P2X, por ejemplo, P2X3. El control de tales receptores proporciona la habilidad para minimizar el dolor en pacientes en necesidad de tal 15 tratamiento. Todas las patentes de E. U. , solicitudes de patente y publicaciones citadas en la presente, ya sea supra o infra, se incorporan en la presente para referencia en su totalidad . • 20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de receptor de P2X3 o un receptor que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica a dicha secuencia de polinucleótidos que codifica el receptor de P2X3 humano. El 25 polinucleótido puede ser un polideoxiribonucleótido (ADN) o un &2^¡^&^?$íi 'poliribonucleótido (ARN). Más específicamente, el ADN puede comprender la secuencia representada por SEQ ID NO: 1 5. La invención también incluye una célula huésped que comprende el polinucleótido. Esta célula huésped puede ser, por ejemplo, una célula bacterial, una célula mamífera, una célula de levadura o una célula anfibia. Adicional, la presente invención comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido, como se describe arriba, operablemente enlazado a al menos una secuencia de control que dirige la transcripción dei polinucleótido. El polipéptido codificado por el polinucleótido puede ser el P2X3 humano que puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. La presente invención también incluye una célula huésped que comprende este vector de expresión. Además, la presente invención incluye un método para producir un polipéptido de receptor de P2X3 humano, el método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula huésped, descrita arriba, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de dicho polipéptido y (b) recuperar dicho polipéptido. La invención también incluye un polipéptido de receptor de P2X3 humano, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Adicionalmente, la presente invención comprende un método para identificar compuestos que modulan la actividad del receptor de P2X, el método comprendiendo las etapas de: (a) proporcionar una célula -• ' ^ — -— A? jatiÜBrtü n -huésp*ed que expresa un receptor de P2X que comprende un polipéptido de P2X3 humano; (b) mezclar un compuesto con el receptor de P2X; y (c) medir ya sea: (i) el efecto del compuesto de prueba en la activación del receptor de P2X o la célula que expresa el receptor de P2X, o (ii) la unión • 5 del compuesto de prueba a la célula o el receptor de P2X. La célula puede ser como se describe arriba. La medición de la etapa (c) (ii) puede realizarse al medir una señal generada por una porción detectable. La porción detectable puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste de una marca fluorescente, una radiomarca, una marca 10 quimiolµminiscente y una enzima. La medición de la etapa (c) (i) puede realizarse al medir una señal generada por un ion radiomarcado, un reactivo cromogénico, una sonda fluorescente o una corriente eléctrica. En el método, el polipéptido de receptor de P2X3 humano puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. 15 Además, la presente invención también incluye un método para detectar un polinucleótido objetivo de un receptor de P2X3 en una muestra de prueba, el método comprendiendo las etapas de: (a) contactar el polinucleótido objetivo con al menos una sonda de polinucleótido ^ específica del receptor de P2X3 humano o un complemento de la misma 20 para formar un complejo de objetivo-sonda; y (b) detectar la presencia del complejo de objetivo-sonda en la muestra de prueba. En este método, la etapa de detección (c) comprende utilizar una porción detectable capaz de generar una señal medible. La invención también incluye un polinucleótido aislado que 25 codifica un receptor de P2X3 humano o una porción del mismo y capaz de •hibridlzar selectivamente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de receptor de P2X3 humano, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15 o una porción de la misma. El polinucleótido puede producirse por técnicas sintéticas o recombinantes. La presente • 5 invención también incluye un polipéptido purificado codificado por un polinucleótido del receptor de P2X3 humano en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 o una porción de la misma. El polipéptido puede producirse por técnicas sintéticas o recombinantes. 10 También, la presente invención incluye un anticuerpo { monoclonal que se une específicamente a un receptor de P2X3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o un fragmento inmunoreactivo de la misma. Debe observarse que la invención comprende un método para 15 detectar el receptor de P2X3 humano en una muestra de prueba, el método comprendiendo las etapas de: (a) contactar la muestra de prueba con un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente al receptor de P2X3 humano, por un tiempo y bajo condiciones suficientes • para la formación de un complejo resultante; y (b) detectar el complejo 20 resultante que contiene el anticuerpo, en donde el anticuerpo se une específicamente ai aminoácido del receptor de P2X3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma. Adicionalmente, la presente invención incluye un 25 polinucleótido aislado que codifica un polipéptido del receptor de P2X 'huma'no o una variante del mismo, en donde el receptor es P2X3. La invención también incluye un método terapéutico para liberar el dolor que comprende: (a) presentar un individuo afligido con dolor; y (b) administrar al individuo una cantidad eficaz de un compuesto antagonístico de P2X3. El compuesto antagonístico puede ser efectivo contra los canales heteromultiméricos de P2X3. Además, la presente invención también incluye un método para potenciar los efectos de un agonista que activa un receptor de P2X3 que comprende las etapas de: (a) incubar las células que comprende dicho receptor de P2X3 con un tinte de triaceno; y (b) exponer las células incubadas al agonista por un tiempo y bajo condiciones suficientes para que el agonista se une al receptor de P2X3, en donde el tinte de triaceno de la etapa (a) potencia el efecto del agonista de la etapa (b). El receptor puede derivarse de un mamífero tal como un humano o un roedor. El tinte de triaceno puede seleccionarse del grupo que consiste de, por ejemplo, cibacron azul, basilen azul, reactivo azul 5 y reactivo rojo 2. El agonista puede ser, por ejemplo, adenosina 5 -trifosfato disodio (ATP). La presente invención también incluye un método para bloquear la actividad inhibidora de un antagonista del receptor P2 no selectivo en un receptor de P2X3 que comprende las etapas de: (a) incubar las células que expresan P2X3 con un tinte de triaceno; y (b) exponer las células incubadas a un antagonista del receptor de P2 no selectivo, en donde el tinte de triaceno de la etapa (a) bloquea la actividad inhibidora del antagonista. El receptor de P2X puede derivarse de un mamífero tal como un roedor o un humano. El antagonista puede ser ácido piridoxal-5- ,i *fosfato-6-azofenil-2',4'-disufónico (PPADS). El tinte de triaceno puede ser cibacron azul o uno de los otros tintes de triaceno arriba descritos. Adicionalmente, la presente invención comprende un método para acelerar la velocidad de resensibilización del receptor de P2X3 de las • 5 células que expresan el receptor de P2X3 desensibilizado que comprende las etapas de exponer las células que expresan el receptor de P2X3 desensibilizado a un tinte de triaceno, en donde el tinte de triaceno acelera dicha velocidad de resensibilización de los receptores de P2X3 de dichas células que expresan el receptor de P2X3 desensibilizado. De 10 nuevo, el receptor de P2X3 puede derivarse de un mamífero, tal como un áfc humano o un roedor. El tinte de triaceno puede ser cibacron azul o uno de los otros tintes de triaceno arriba descritos. Un método para inducir los efectos antinociceptivos en un mamífero que comprende la etapa de administrar un antagonista del 15 receptor de P2X a un paciente en necesidad de tales efectos antinociceptivos en una cantidad suficiente para realizar los efectos antinociceptivos. De nuevo, el mamífero puede ser un humano o una rata. El antagonista del receptor de P2X3 induce los efectos antinociceptivos en un receptor que contiene P2X3. El receptor puede ser, por ejemplo, P2X3. 20 El antagonista puede ser, por ejemplo, 2',3'-O-(2,4,6-trinitrofenil)-ATP (TNP-ATP).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa la secuencia del producto 5'RACE de 25 P2X3 del Ejemplo 2 (SEQ ID NO: 13), en el cual las secuencias de las <. * -*• -*-* . j-gj. * j^ng m - cargas de inicio se subrayan y el codón de inicio predicho (ATG) se muestra en negritas. La Figura 2 representa la secuencia del producto 3'RACE de A P2X3 del Ejemplo 3 (SEQ ID NO: 14), en el cual las secuencias de las 5 cargas de inicio se subrayan y el codón de terminación predicho (TAG) se muestra en negritas. La Figura 3 representa la secuencia de la estructura de lectura abierta completa de cADN que codifica el polipéptido del receptor P2X3 humano (SEQ ID NO: 1 5). Los codones de inicio (ATG) y de terminación 10 (TAG) se muestran en negritas; las secuencias de flanqueo 5' y 3' A introducidas durante la construcción de plásmido, incluyendo los sitios de restricción EcoRI (GAATTC) y Not I (GCGGCCGC), se subrayan. La Figura 4 representa las secuencias de aminoácidos predichas, alineadas de los polipéptidos del receptor de rata (r P2X3) (SEQ 15 ID NO: 1 7) y de humano (hP2X3). Los residuos idénticos se identifican al encerrarlos en un cuadro. La Figura 5 ilustra el efecto de potenciación de cibacron azul en influjo de calcio mediado por receptores de P2X3 humanos estimulados por STP. A, las células 1 321 -P2X3, cargadas con el indicador de Ca2+ 20 Fluo-4 se trataron con ATP en la presencia (linea sólida) o ausencia (línea rayada) de cibacron azul. La fluorescencia relativa como el por ciento de la respuesta máxima obtenida en la ausencia de cibacron azul. B, los receptores de hP2X3 que expresan oocito de Xenopus se estimularon con ATP en la ausencia (corriente pequeña) y presencia (corriente grande) de 25 cibacron azul. La aplicación de ATP se denota por la barra horizontal.

La Figura 6 ilustra que el cibacron azul (CB) incrementa significativamente la potencia de la activación del receptor de hP2X3 inducido por ATP en una manera dependiente de la concentración. Las curvas de concentración-efecto de ATO se determinaron en la ausencia o presencia de cibacron azul al medir el influjo de CA2+, como se determina por fluorescencia Fluo-4, en células 1321 -hP2X3: m, sin cibacron azul (ATP EC50 = 356 ± 47 nM, Emax = 102 ± 3%); A , 1 µM de cibacron azul (ATP EC50 = 64 ± 7 nM*, Emax = 267 ± 6%*); w, 3 µM de cibacron azul (ATP EC50 = 46 ± 8 nM*, Emax = 330 ± 5%*); , 10 µM de cibacron azul (ATP EC50 = 60 ± 12 nM*, Ema = 345 ± 6%*). Los datos se muestran como un por ciento de la respuesta máxima a 10 µM de ATP y son los promedios (± sem) de tres experimentos (análisis estadísticos en base a los valores de pEC50; *P < 0.05 en comparación con el control). La Figura 7 ilustra que la potencia del cibacron azul para potenciar la activación del receptor de hP2X3 es similar para los agonistas de P2X3 prototípicos. Las curvas de concentración-efecto de cibacron azul se determinaron para cada uno de los cuatro agonistas dei recptor de P2X3 prototípico al medir el influjo de Ca2+, como se determina por fluorescencia Fluo-4, en células 1 321 -hP2X3. Las concentraciones máximas medias de cibacron azul requeridas para mediar la potenciación completa fueron como sigue: ?, 10 µM de ATP (cibacron azul EC50 = 1 .4 ± 0.5 µM, ECma = 504 ± 15%); A , 10 µM de 2-meSATP (cibacron azul EC50 = 1 .4 ± 0.2 µM, ECmax = 555 ± 18%); m, 10 µM de BzATP (cibacron azul EC50 = 0.9 ± 0.1 µM, ECmax = 562 ± 12%); * , 10 µM de aß-meATP (cibacron azul EC50 = 1 .4 ± 0.2 µM, ECmax = 537 ± 14%). Los datos se muestran como un ^rf& ^^^^ . ?.Ú* . í ,? í|g¡l¡lffT * por ciento de la respuesta máxima a 10 µM de ATP y son los promedios (± sem) de tres experimentos. Las curvas de concentración-efecto se ajustan utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros en Prisma GraphPad. 5 La Figura 8 ilustra la potenciación de actividad del receptor de hP2X3 con varios tintes de triaceno. Las curvas de concentración-efecto de para cuatro tintes de triaceno estructuralmente relacionados se determinaron al medir el influjo de Ca2+ activado por ATP en células 1321 N 1 -hP2X3: m, reactivo rojo 2 (EC50 = 55 ± 10 µM, Ema? = 600%, 10 parámetro fijo); *, basilen azul (EC50 = 1 .2 ± 0.6 µM, Ema? = 373 ± 1 7%*); • A , reactivo azul 5 (EC5o = 1 .4 ± 0.5 µM, Ema? = 534 + 14%); w, cibacron azul (EC50 = 1 .2 ± 0.2 µM, Ema? = 566 ± 17%). Los datos se muestran como un por ciento de la respuesta máxima a 1 0 µM de ATP y son los promedios (± sem) de tres experimentos (análisis estadísticos en base a 15 los valores de pEC50; *P < 0.05 en comparación con el control). La Figura 9 ilustra que el cibacron azul bloquea la actividad inhibidora de PPADS. A, las curvas de concentración-efecto para la inhibición de la actividad del receptor de hP2X3 activado por ATP por PPADS se determinaron en la presencia y ausencia de cibacron azul. 20 PPADS y cibacron azul se co-aplicaron 3 minutos antes de la adición de 3 µM de ATP: m , sin cibacron azul (PPADS IC50 = 8.6 ± 3 µM, Ema? = 101 ± 4%); •, 1 µM de cibacron azul (PPADS IC50 = 14 ± 3 µM, Emax = 280 ± 6%*); * , 10 µM de cibacron azul (PPADS IC50 = 51 ± 4 µM, Ema? = 437 ± 6%*); A , 25 100 µM de cibacron azul (PPADS IC50 = 220 ± 1 86 µM*, Emax = 488 ± 9%*). 1 ' I -*-^- "" 'Inset * los datos se normalizan a la señal máxima observada en cada concentración de cibacron azul. B, las curvas de concentración-efecto para la potenciación de cibacron azul de respuestas de hP2X3, activada por 3 µM de ATP, se determinaron en la presencia y ausencia de PPADS: 5 u, sin PPADS (cibacron azul EC50 = 3.8 ± 0.4 µM, Emax = 738 ± 22%); A , 5 µM de PPADS (cibacron azul EC50 = 4.5 ± 0.3 µM, Emax = 682 ± 15%); Y, 10 µM de PPADS (cibacron azul EC50 = 7.5 ± 0.2 µM*, Emax = 730 ± 7%); * , 50 µM de PPADS (cibacron azul EC 0 = 15 ± 1 .4 µM*, Ema? = 653 ± 10%). Los datos se muestran como un por ciento de la respuesta máxima a 3 µM de 10 ATP y son los promedios (± sem) de tres experimentos (análisis • estadísticos en base los valores de pEC50; *P < 0.05 en comparación con el control). La Figura 10 ilustra que el cibacron azul incrementa significativamente la velocidad de recuperación del receptor hP2X3 de 15 desensibilización. Las curvas de concentración-efecto de cibacron azul se determinaron en células 1 321 -hP2X3 agudamente desensibilizadas y no desensibilizadas: m, no desensibilizadas (cibacron azul EC50 = 1 .1 ± 0.1 µM, Ema? = 288 ± 5%); •, desensibilizadas (cibacron azul EC50 = 6.4 ± 0.4 • µM*, Emax = 302 ± 5%). Los datos se muestran como un por ciento de la 20 respuesta máxima a 3 µM de ATP y son los promedios (± sem) de tres experimentos (análisis estadísticos en base los valores de pEC50; *P < 0.05 en comparación con el control). La Figura 1 1 ilustra que el cibacron azul acelera la recuperación de receptores de hP2X3 de desensibilización. A, las células 25 1321 -hP2X3 se pre-trataron con ATP o D-PBS (curva de control), ^ü^, .¿^¿í^lt^akaiM ^enjuagaron dos veces para remover el exceso de ATP extracelular, e incubaron por los periodos de tiempo mostrados antes de la re- estimulación con varias concentraciones de ATP. La curva de control (línea rayada) muestra la concentración-efecto de ATP en células mock- • 5 desensibilizadas (D-PBS-tratadas). B, las células 1321 -hP2X3 se pre- trataron con ATP, enjuagaron dos veces para remover el exceso de ATP extracelular, e incubaron por los periodos de tiempo mostrados en la presencia de cibacron azul antes de la re-estimulación con varias concentración de ATP. La curva de control (línea rayada) muestra la 10 concentración-efecto en ATP en células mock-desensibilizadas (D-PBS-fp tratadas) pre-tratadas con 50 µM de cibacron azul. C, las velocidades de recuperación del receptor se muestran como una función de % de la respuesta no desensibilizada con el tiempo. Las curvas son soluciones de %control = max (1 -exp(-kt*tiempo)), en donde %control es el porcentaje de 15 la actividad del receptor en comparación con los receptores no desensibilizados, max es la actividad de %control observada en 61 .5 min, tiempo es el tiempo en minutos y Kt es el tiempo constante. t?/2 (tiempo medio de la resensibilización del receptor) se calcula como 1 n(0.5)/-K. ^ La Figura 12 ilustra el curso del tiempo para los efectos 20 nociceptivos agudos de BzATP intradérmico en la rata. La Figura 13 ilustra las determinaciones de dosis-respuesta para los efectos nociceptivos agudos de los agonistas del receptor de P2X después de la administración intradérmica en la pata oculta de la rata (n=6 por grupo de dosis). Los valores representan +/- S. E. M para las 25 respuestas que contraen la pata, nociceptivas acumulativas que ocurren ,t.J . . . **. * *,. . - - . . * . . ^aa^A^Jaa *15 minutos después de la inyección. *P < 0.05 en comparación con las ratas tratadas con el vehículo. La Figura 15 representa determinaciones de concentración- efecto para TNP-ATP (diamantes, IC50 = 40 nM), TNP-ADP (cuadrados, • 5 IC50 = 120 Nm) y TNP-AMP (triángulos, IC50 > 3,000 nM) para inhibir 100 µM de flujo de calcio estimulado por BzATP en células 1321 N1 que expresan receptores de rP2X3 . RFU = unidades de fluorescencias relativas. Los valores representan promedio ± S.E.M. de tres experimentos separados. 10 La Figura 15 ilustra los efectos de co-administración f intradérmica de TNP-ATP (F(3,20) = 8.20, P < 0.05), pero no TNP-AMP (F(3,20) = 0.30, P > 0.05), con BzATP (1 000 nmol/pata), la dosis dependiente atenúa la contracción de la pata nociceptiva en la rata (n = 6 por grupo de dosis). Los valores representan promedio ± S. E. M, . para las 15 respuestas que contraen la pata nociceptiva, acumulativas que ocurren 15 minutos después de la inyección. * P < 0.05 en comparación con ratas tratadas con el vehículo. La Figura 16 representa los efectos de la co-administración intradérmica de TNP-ATP (barras negras), pero no TNP-AMP (barras 20 grises), con 5% de formalina atenuaron la contracción de la pata nociceptiva aguda en la rata (n = 6 por grupo de dosis). La Fase I representa las respuestas nociceptivas agudas, acumulativas que ocurren 1 5 minutos inmediatamente después de la administración intradérmica (F(2,27) = 5. 1 5, P < 0.05). La Fase II representa respuestas nociceptivas 25 acumulativas registradas por un periodo de 20 minutos que comienzan 30 •minutos después de la inyección formalina (F(2,27) = 6.97, P < 0.05). Los valores representan promedio ± S.E.M., * P < 0.05 en comparación con las ratas tratadas con el vehículo. La Figura 17 representa las determinaciones de 5 concentración-efecto para los efectos de cibacron azul en activación de agonista de receptores de P2X3 y de P2X2/3. (Panel izquierdo) curvas de concentración-efecto representativas para cibacron azul (EC50 = 2 µM) para aumentar BzATP (1 µM) y la activación por a, ß-meATP (10 µM) de receptores de P2X3 de rata. (Paneles derechos) las curvas de 10 concentración-efecto para cibacron azul para aumentar BzATP (1 µM) y la • activación por a,ß-meATP (10 µM) de los receptores P2X2/3 de rata. RFU = unidades de fluorescencia relativas. La Figura 18 ilustra los efectos nociceptivos de la coadministración intradérmica de BzATP y cibacron azul en el ocultamiento 15 de la pata de la rata (F(16,352) = 7.30, P < 0.05). Las respuestas del vehículo indican los efectos de salina (cuadrado abierto) o la coadministración de salina y BzATP (círculos llenos) en la conducta aguda que contrae la pata (respuestas acumulativas para los primeros 1 5 minutos después de la inyección) Los efectos nociceptivos de cibacron azul solo 20 se indican por los cuadrados abiertos y líneas punteadas. Los efectos de la co-administración de cibacron azul y BzATP se indican por los círculos llenos y líneas sólidas. Los valores representan promedio ± S. E.M. de tres experimentos separados (n = 6 por grupo de dosis), * P < 0.05 en comparación con los efectos nociceptivos de BzATP solo, + P < 0.05 en 25 comparación con los efectos nociceptivos de cibacron azul solo.

La Figura 19ilustra que el cibacron azul incrementa la contracción de la pata nociceptiva tanto en Fase I como Fase II de la prueba de formalina de rata. Cibacron azul (30 y 100 nmol/pata) se coadministraron con formalina intradérmica (1 -5%) en el ocultamiento de la • 5 pata de la rata. Las respuestas nociceptivas de la Fase I se registran por los primeros 15 minutos después de la administración. Las respuestas nociceptivas de Fase II se registran por un periodo de tiempo de 20 minutos que comienza 30 minutos después de la administración . La administración intradérmica de las dosis crecientes de formalina sola 10 produjeron incrementos significativos en respuestas nociceptivas (*P < 0.05) en comparación con las inyecciones del vehículo. Las barras negras indican las respuestas nociceptivas de formalina o vehículo solo. Las barras grises indican las respuestas nociceptivas de cibacron azul (30 nmol/pata) en la presencia de formalina o vehículo. Las barras de rayada 15 sencillo indican respuestas nociceptivas de cibacron azul (100 nmol/pata) en la presencia de formalina o vehículo. Los valores representan promedio ± S. E.M. (n = 6 por grupo de dosis), * P < 0.05 en comparación con formalina sola (respuestas del vehículo en cada dosis de formulación), + P < 0.05 en comparación con el vehículo solo. 20 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención sujeto se refiere al receptor de P2X3, la secuencia de ácidos nucleicos de este receptor, la secuencia de aminoácidos del receptor, métodos para producir este receptor, y métodos 25 para alterar la actividad del receptor de P2X3 por el uso de varios químicos (por ejemplo, cibacron azul y/o TNP-ATP). La habilidad para regular externamente el receptor puede permitir a uno, por ejemplo, controlar las sensaciones tales como dolor, después de un accidente traumático, durante el curso de una enfermedad terminal, durante cirugía, después de • 5 la cirugía o durante cualquier situación durante la cual un dolor de paciente debe administrarse por un proveedor médico. En particular, la presente invención proporciona un métodos para seleccionar una pluralidad de compuestos para la unión específica a un purinoreceptor para identificar un compuesto que modula la actividad 10 del receptor. El método comprende (a) proporcionar una célula que expresa la secuencia de codificación del polipéptido purinoreceptor humano (u otro mamífero), (b) mezclar un compuesto con la célula, y (c) medir el efecto del compuesto de prueba en la activación del purinoreceptor o la célula que expresa el receptor purinoreceptor. 15 Además, la invención proporciona un método para determinar la cantidad de un antagonista o agonista de receptor en una muestra de prueba. El método comprende (a) proporcionar una célula que expresa la secuencia de codificación del polipéptido purinoreceptor humano (u otro mamífero) y (c) medir el efecto del compuesto de prueba en la activación 20 del purinoreceptor o la célula que expresa el receptor purinoreceptor. La invención también comprende una célula huésped que codifica el purinoreceptor de interés. La célula huésped se forma genéticamente con un vector, también comprendido por la presente invención , que puede ser un vector de clonación o un vector de expresión . 25 El vector comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un ^ ^*"****«*^*Mfc . . . .. . . . «purinóreceptor operablemente enlazado a las secuencias de control que controlan su expresión. Preferentemente, la célula huésped se transfecta establemente para expresar el purinoreceptor. Más preferentemente, la célula huésped es una célula nula de purinoreceptor, la cual, si no carece • 5 ya de expresión de purinoreceptor endógeno, se ha formado así. La práctica de la presente invención empleará, al menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante, electrofisiología, y farmacología que se encuentran dentro de la experiencia de la materia. 10 Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por f ejemplo, Sambrook, Frtisch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Vols. I y II (D.N. Glover Ed . 1 985); Perbal, B. , A. Practical Guide to Molecular Cloning (1 984); las series, Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds. , Academic 15 Pres, Ine); Transcription and Translation (Hames ef al., eds. 1 984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller ef al., eds. (1 987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (2da ed. , Springer-Verlag); y PCR: A Practical Approach (McPherson eí al., eds. (1991 ), IRL Press). 20 Como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares, "uno", " una" y " el", "la" incluyen referencias plurales al menos que el contenido dicte claramente otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una carga de inicio" incluye dos o más de tales cargas de inicio, la referencia a " un 25 aminoácido " incluye más de un aminoácido, y lo similar. "«"-* - - ' • - - _^¡á^t Oefini'ciones: Para describir la presente invención, los siguientes términos se emplearán y se definen como se indica abajo: El término "receptor de P2" intenta un receptor purinérgico • 5 para el ligando ATP y/o otros nucleótidos de pirimidina o purina, ya sea naturales o sintéticos. Los receptores de P2 se subclasifican ampliamente como receptores de "P2X" o "P2Y". Estos tipos difieren en su farmacología, estructura y mecanismos de transducción de señal. Los receptores de P2X son generalmente canales de ion abiertos a ligando, 10 mientras que los receptores de P2Y operan generalmente a través de un fe sistema acoplado a la proteína G. Además, y sin intentar limitarse por teoría, se cree que los receptores de P2X comprenden multímeros de polipéptidos de receptor, tales multímeros puede ser ya sea el mismo o diferentes subtipos. Consecuentemente, el término "receptor de P2X" se 15 refiere, como sea apropiado, a la subunidad del receptor individual o subunidades, así como también a los receptores heteroméricos y homomérieos comprendidos por el mismo. El término "subunidad" cuando se utiliza en referencia a los • purinoreceptores propone un polipéptido que, ya sea solo o en 20 combinación con uno o más de otros polipéptidos, forma un purinoreceptor funcional. Cuando un purinoreceptor comprende más de una subunidad de polipéptido, las subunidades pueden ser ya sea idénticas (formando un multímero homomérico) o diferentes (formando un multímero heteromérico). 25 El término "P2Xn" propone un subtipo de receptor de P2X en donde' n es un entero de al menos 1 . En el momento de la invención, al menos 7 subtipos de receptores de P2X„ se han aislado y/o caracterizado. Un "agonista del receptor de P2X3" es un compuesto que se une a y activa un receptor de P2X3. Por "activa" se propone la producción 5 de una o más respuestas farmacológicas, fisiológicas o electrofisiológicas. Tales respuestas pueden incluir, pero no se limitan a, un incremento de despolarización celular específica del receptor. Un "antagonista del receptor de P2X3" es una substancia que se une a un receptor de P2X3 y evita que los agonistas activen el receptor. 10 Los antagonistas puros no activan el receptor, pero algunas substancias pueden haber mezclado las propiedades agonistas y antagonistas. El término "polinucleótido" como se utiliza en la presente significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonueleótidos. Este término se refiere 15 solamente a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, el término incluye ADN de doble filamento o de un solo filamento, así como también ATR de doble filamento o de un solo filamento. También incluye modificaciones, tales como por metilación y/o por vendaje, y las formas no modificadas del polinucleótido. 20 El término "variante" se utiliza para referirse a una secuencia de oligonucleótidos que difieren de la secuencia de tipo silvestre relacionada en la inserción, eliminación o substitución de uno o más nucleótidos. Cuando no se causa por una mutación estructuralmente conservativa (ver abajo), tal oligonucleótido variante se expresa como una 25 "variante de proteína" la cual, como se utiliza en la presente, indica una .^^««.«É^ ,. , .. *-.* ..,„, .,.., Li. - ._^ . , ... 1 , » t , ,„,„ . -. . ,.^,-n ßecue'ncia de polipéptidos que difiere del polipéptido de tipo silvestre en la inserción, eliminación o substitución de uno o más aminoácidos. La variante de proteína difiere en estructura primaria (secuencia de aminoácido), pero puede o no diferir significativamente en estructura • 5 terciaria o secundaria o en función relativa al tipo silvestre. El término "mutante" generalmente se refiere a un organismo o una célula que despliega un nuevo carácter genético o fenotipo como el resulta de cambio en su gen o cromosoma. Sin embargo, en algunos casos, "mutante" puede utilizarse en referencia a una proteína variante u 10 oligonucleótido y "mutación" puede referirse al cambio subyacente a la variante. "Identidad " se define como un nucleótido exacto a la correspondencia de nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, 15 respectivamente. Dos o más secuencias de nucleótidos pueden compararse al determinar su "identidad porcentual ". Dos o más secuencias de aminoácidos también pueden compararse al determinar su "identidad porcentual". Los programas disponibles en el Paquete de • Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 (disponible de Genetics 20 Computer Group, Madison, Wl), por ejemplo, el programa GAP, son capaces de calcular tanto la identidad entre dos polinucleótidos y la identidad entre dos secuencias de polipéptidos, respectivamente. Otros programas para calcular la identidad porcentual se conocen en la materia. "Similitud" se refiere al aminoácido exacto para la comparación 25 de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, en donde los *.Í? aminoácidos son idénticos o poseen propiedades químicas y/o físicas similares tales como carga o hidrofobicidad. De esta manera, una "similitud porcentual" puede entonces determinarse entre las secuencias de polipéptidos comparadas. Las técnicas para determinar la identidad de • 5 secuencia de aminoácidos, así como también la identidad de la secuencia de ácidos nucleicos, se conocen bien en la materia e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos de mARN para el gel (usualmente a través de un compuesto intermedio de cADN) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y comparar esto con una segunda 10 secuencia de aminoácidos (ver la descripción de identidad porcentual arriba) "Polipéptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente e indican una cadena molecular de aminoácidos enlazados a través de los enlaces de péptido. Los términos no se refieren a una 15 longitud específica del producto. De esta manera, los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones post-translacionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y lo • similar. Además, los fragmentos de proteína, análogos, proteínas 20 variantes o mutadas, proteínas de fusión y lo similar se incluyen dentro del significado de polipéptido, siempre que tales fragmentos, etc, retengan la unión y otras características necesarias para su uso propuesto. Una "mutación funcionalmente conservativa" como se utiliza en la presente propone un cambio en un polinucleótido que codifica un 25 polipéptido derivado en el cual la actividad no se altera substancialmente Ia •-* >* <* * en comparación con aquella del polipéptido del cual se hace el derivado. Tales derivados pueden tener, por ejemplo, inserciones de aminoácidos, eliminaciones o substituciones en la molécula relevante que no afectan substancialmente sus propiedades. Por ejemplo, los derivados pueden 5 incluir substituciones de aminoácidos conservativas, tales como substituciones que conservan la carga general, hidrofobicidad/hidrofilicidad, porción de cadena lateral, y/o volumen estérico del aminoácido substituido, por ejemplo, Gly/Ala, Val/lle/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Thr/Ser y Phe/Trp/Tyr. 10 Por el término "mutante estructuralmente conservativo" se i propone un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácidos nucleicos pero que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del cual se deriva la variante degenerada. Esto puede ocurrir debido a que un 15 aminoácido específico puede codificarse por más de un "codón", o secuencia de tres nucleótidos, es decir, debido a la degeneración del código genético. "Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" , y otros términos que denotan 20 microorganismos o líneas celulares eucarióticas más elevadas cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden, o se han, utilizado como recipientes para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, inmaterial del método mediante el cual el ADN se introduce en la célula o la disposición subsecuente de la célula. Los términos 25 incluyen la progenie de la célula original que se ha transfectado. Las ?t ?l*?~~''?u* ' • • ' ' célula's en el cultivo primario así como también las células tales como oocitos también pueden utilizarse como recipientes. Un "vector" es una replicación en la cual otro segmento de polinucleótido se une, tal como para atraer la replicación y/o expresión del 5 segmento unido. El término incluye vectores de expresión, vectores de clonación y lo similar. Una "secuencia de codificación" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe en mARN y/o se traduce en un polipéptido. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por 10 un codón de inicio de traducción en el término 5' y un codón de detención É de traducción en el término 3'. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, mARN, cADN y secuencias de polinucleótidos recombinantes. Las variantes o análogos pueden prepararse por la eliminación de una porción de la secuencia de codificación, por la 15 inserción de una secuencia, y/o por la substitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis dirigida de sitio, se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook ef al., supra. ; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid 20 Hibridization, supra . " Operablemente enlazada" se refiere a una situación en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. De esta manera, por ejemplo, una secuencia de control " operablemente enlazada" a una secuencia de 25 codificación se liga en tal manera que la expresión de la secuencia de i . - , ..„ .1 * * ..- ....... • --^^•^ codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Una secuencia de codificación puede enlazarse operablemente a las secuencias de control que dirigen la transcripción de los polinucleótidos, mediante la cual dicho polinucleótido se expresa en una 5 célula huésped. El término "transfección" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, irrespectiva del método utilizado para la inserción, o la forma molecular del polinucleótido que se inserta. La inserción de un polinucleótido per se y la inserción de un 0 plásmido o vector comprendido del polinucleótido exógeno se incluyen. El polinucleótido exógeno puede transcribirse directamente y traducirse por la célula, mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, puede integrarse establemente en el genoma huésped. "Transfección" generalmente se utiliza en referencia a 5 una célula eucariótica mientras que el término "transformación" se utiliza para referirse a la inserción de un polinucleótido en una célula procariótica. "Transformación" de una célula eucariótica también se refiere a la formación de un estado canceroso o tumorigénico. El término "aislado", cuando se refiere a polinucleótido o un 0 polipéptido, propone que la molécula indicada se encuentra presente en una ausencia substancial u otras macromoléculas biológicas similares. El término "aislado" como se utiliza en la presente significa que al menos 75% en peso, más preferentemente al menos 85% en peso, más preferentemente aún al menos 95% en peso, y más preferentemente al 5 menos 98% en peso de una composición es el polipéptido o polinucleótido aislado. Un "polinucleótido aislado" que codifica un polipéptido particular se refiere a un polinucleótido que se encuentra substancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido sujeto; sin embargo, la molécula puede incluir • mutaciones funcional y/o estructuralmente conservativas como se define en la presente. Una "muestra de prueba" como se utiliza en la presente propone un componente de un cuerpo del individuo que es una fuente de uno de los receptores de P2X, incluyendo P2X3. Estas muestras de 10 prueba incluyen muestras biológicas que pueden evaluarse por los métodos de la presente invención descritos en la presente e incluyen • fluidos corporales tales como sangre completa, tejidos y preparaciones celulares. Las siguientes abreviaciones de aminoácidos de una sola letra 15 se utilizan por todo el texto: Alanina A Arginina R Asparagina N Ácido aspártico D Cisteína C Glutamina Q • Ácido glutámico E Glicina G 20 Histidina H Isoleucina I Leucina L Lisina K Metionina M Fenilalanina F Prolina P Serina S Treonina T Triptofan W 25 Tirosina Y Valina V . » . » ? fc , ^J¡^¡¡^ Como se observa arriba, los receptores de P2X3 mamíferos, polinucleótidos que codifican las subunidades de polipéptido o receptores variantes de los mismos, y métodos para hacer estos receptores se proporcionan en la presente. La invención no solamente incluye el • 5 receptor de P2X anterior sino que también los métodos para seleccionar los compuestos utilizando el receptor y las células que expresan el receptor. Además, los polinucleótidos y los anticuerpos que pueden utilizarse en los métodos para la detección del receptor, así como también, los reactivos útiles en estos métodos, se proporcionan. Los compuestos y 10 polinucleótidos útiles para regular el receptor y su expresión también se proporcionan como se describe más abajo. En una modalidad preferida, el polinucleótido codifica el polipéptido del receptor de P2X humano o variantes de proteína del mismo que contienen los substituyer.tes de aminoácido. 15 El ADN que codifica el receptor de P2X humano arriba mencionado, y las variantes del mismo, puede derivarse de cADN o genómico, preparado por síntesis, o por una combinación de técnicas. El ADN puede entonces utilizarse para expresar el receptor de P2X humano o f como un templado para la preparación de ARN utilizando métodos bien 20 conocidos en la materia (ver, Sambrook eí al., supra), o como una sonda molecular capaz de hibridizarse selectivamente, y por lo tanto detectar la presencia de, otras secuencias de nucleótidos que codifican P2X. cADN que codifica el receptor de P2X3 puede obtenerse de una biblioteca de ADN apropiada. Las bibliotecas de cADN pueden 25 probarse utilizando el procedimiento descrito por Grunstein ef al. (1975) ^ m i máßí * Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 73:3961 . El cADN así obtenido puede modificarse entonces y amplificarse utilizando la reacción de cadena de polimerasa ("PCR") y secuencias de carga de inicio para obtener el ADN específico que codifica el receptor de P2X humano. • 5 Más particularmente, PCR emplea cargas de inicio de oligonucleótidos cortas (generalmente 1 0-20 nucleótidos en longitud) que igualan los extremos opuestos de una secuencia deseada dentro de la molécula de ADN. La secuencia entre las cargas de inicio no necesita conocerse. El templado inicial puede ser ya sea ARN o ADN. Si se utiliza 10 ARN, primero se transcribe inverso a cADN. El cADN se desnaturaliza entonces, utilizando técnicas bien conocidas tales como calor, y las cargas de inicio de oligonucleótidos apropiadas se agregan en exceso molar. La extensión de la carga de inicio se efectúa al utilizar polimerasa de ADN en la presencia de trifosfatos de deoxinucleótido o 15 análogos de nucleótido. El producto resultante incluye las cargas de inicio respectivas en sus términos 5', enlazadas covalentemente a los complementos recientemente sintetizados de los filamentos originales. La molécula replicada se desnaturaliza de nuevo, hibridiza con cargas de • inicio, y así sucesivamente, hasta que el producto se amplifica 20 suficientemente. Tales métodos de PCR se describen en por ejemplo, las Patentes de E. U. Nos. 4, 965, 1 88; 4,800, 1 59; 4,863,202; 4,683, 195; incorporadas en la presente para referencia en sus totalidades. El producto del PCR se clona y los clones que contienen el ADN del receptor de P2X, derivado de la segregación del filamento extendido de la carga de 25 inicio, seleccionado. La selección puede realizarse utilizando una carga ¡hi rüfr - • • • • - ' ?? *. de inicio como una sonda de hibridización. Todavía alternativamente, el ADN del receptor de P2X podría generarse utilizando un planteamiento de RT-PCR (transcriptasa inversa- reacción en cadena de polimerasa) que inicia con ARNA humano. El ARN 5 humano pueden obtenerse de células o tejido en los cuales el receptor de P2X específico se expresa, por ejemplo, cerebro, médula espinal, útero o pulmón, utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, el cADN de un solo filamento se sintetiza de ARN humano como el templado utilizando ios procedimientos de transcriptasa inversa estándar y el cADN se amplifica 10 utilizando PCR. Esto es un ejemplo de la generación de las variantes del receptor de P2X de un templado de ARN de tejido humano. La transcripción inversa de ARNs humanos también puede realizarse utilizando reactivos del Sistema de Preamplificación Superscirpt (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) y el siguiente método: Poli A + ARN (1 15 microgramo) derivado de tejido de la glándula pituitaria (Clontech, Inc. , Palo Alto, CA) y 30 µM (50 nangogramos) de cargas de inicio de hexámero alaeatorias se combinan en un volumen final de 12 µl de dH2O. Esta mezcla se calienta a 70°C por 10 minutos y se enfría en hielo por 1 minuto. Los siguientes componentes se agregan: 2 µl 1 0X regulador PCR 20 (200 mM decTris-HCI pH 8.4, 500 mM de KCl), 2 µl 25 mM de MgCI2, 1 µl 1 0 mM mezcla de dNTP, y 2 µl 0.1 M de ditiotreitol. La reacción se equilibra por 5 minutos a 25°C después de lo cual 1 µl (200 unidades) de transcriptasa inversa Superscript II se agrega y la incubación continúa a 25°C por 10 minutos, seguidos por 50 minutos a 42°C. Alternativamente, 25 10 picomoles de carga de inicio dT Oligo pueden substituirse por las ^m^mnn^ --1 <, cargas de inicio de hexámero aleatorio en la mezcla de reacción anterior. En este caso, el equilibrio se lleva a cabo a 42 °C por 2 minutos después de los cuales la transcriptasa inversa se agrega y la incubación se continúa a 42°C por 50 minutos. La reacción de transcripción inversa se 5 termina por la incubación a 70°C por 15 minutos y se enfría en hielo. Rnasa H (1 µl; 2 unidades) se agrega y la mezcla se incuba por 20 minutos a 37° C, después se almacena en hielo. Los oligonucleótidos sintéticos pueden prepararse utilizando un sintetizaclor de oligonucleótido automático tal como aquel descrito por 10 Warner (1 984) ADN 3:401 . Si se desea, los filamentos sintéticos pueden fl marcarse con 32P por el tratamiento con quinasa de polinucleótido en la presencia de 32P-ATP, utilizando condiciones estándar para la reacción. Las secuencias de ADN, incluyendo aquellas aisladas de bibliotecas de cADN o genómicas, pueden modificarse por métodos conocidos que 15 incluyen mutagénesis dirigida de sitio como se describe por Zoller (1982) Nucleic Acids Res. 1 0:6487. Brevemente, el ADN a modificarse se empaca en fago como una secuencia de un solo filamento. Se convierte entonces en un ADN de doble filamento con polimerasa de ADN utilizando, como una carga de inicio, un oligonucleótido sintético complementario a la 20 porción del ADN a modificarse, y que tiene la modificación deseada incluida en su propia secuencia . El cultivo de bacterias transformadas, que contiene replicaciones de cada filamento del fago, se pone en placas de agrá para obtener placas. Teóricamente, 50% de las nuevas placas contienen fago que tiene la secuencia mutada, y el 50% restante tiene la 25 secuencia original. Las réplicas de las placas se hibridizan a sonda sintétfca marcada con el filamento correcto, pero no con la secuencia no modificada. Las secuencias que se han identificado por hibridización se recuperan y clonan. Alternativamente, es necesario identificar los clones por análisis de secuencia si existe dificultad para distinguir la variante del • 5 tipo silvestre por hibridización. En cualquier caso, el ADN se confirmaría por secuencia. Una vez producido, el ADN que codifica el receptor de P2X específico, o ADN aproximadamente 60-80% idéntico a la secuencia de nucleótidos que codifica el receptor de P2X específico, y más 10 preferentemente, ADN aproximadamente 90% idéntico a la secuencia de lA nucleótidos que codifica el receptor de P2X específico, puede entonces incorporarse en un vector de clonación o un vector de expresión para su replicación e n una célula huésped adecuada. La construcción de vector emplea métodos conocidos en la materia, generalmente, la división de 15 ADN específico de sitio se realiza al tratar con enzimas de restricción adecuada bajo condiciones que generalmente se especifican por el fabricante de estas enzimas comercialmente disponibles. Después de la incubación con la enzima de restricción, la proteína se remueve por • extracción y el ADN se recupera por precipitación. Los fragmentos 20 divididos pueden separarse utilizando, por ejemplo, métodos de electrofóresis de gel de agarosa y poliacrilamida , de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos de experiencia en la materia. Los fragmentos de separación y pegajosos pueden terminarse obtusos utilizando una polimerasa 1 de ADN de E. coli (Klenow) en la 25 presencia de los trifosfatos de deoxinucleótido apropiados (dNTPs) •presentes en la mezcla. El tratamiento con nucleasa S 1 también puede utilizarse, dando como resultado la hidrólisis de cualquier porción de ADN de un solo filamento. Las ligaciones se realizan utilizando reguladores estándar y 5 condiciones de temperatura utilizando ligasa de ADN 4 y ATP. Alternativamente, la digestión de la enzima de restricción de los fragmentos no deseados pueden utilizarse para evitar la ligación. Las construcciones de vector estándar generalmente incluyen elementos de resistencia antibióticos específicos. Las mezclas de ligación 10 se transforman en un huésped adecuado, y los transformantes exitosos seleccionados por resistencia antibiótica u otros marcadores. Los plásmidos de los transformantes pueden prepararse entonces de acuerdo con los métodos conocidos por aquellos en la materia usualmente siguiendo una amplificación de cloranfenicol como se reporta por Clewell 15 ef al. , J. Bacteriol. 1 1 0:667 (1 972). El ADN se aisla y analiza usualmente por el análisis de enzima de restricción y/o secuenciación. La secuenciación puede ser por el método desoí bien conocido de Sanger ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977) como se describe además por Messing et al. , Nucleic Acid Res 9:309 (1 981 ), o por el método 20 reportado por Maxam ef al. , Meth Enzvmol. 65:499 (1 980). Los problemas con la compresión de banda, que algunas veces se observa en regiones ricas en GC, se superan por el uso de, por ejemplo, T-deazoguanosina o inosina, de acuerdo con el método reportado por Barr ef al., Biotechnigues 4:428 (1 986). 25 Las células huésped se forman genéticamente con los - ¡mm¡MMmlÍ¡¡ítiU&¡¡ ? i É Ui ima ^ fi -Hhl n iim vectores de esta invención, que pueden ser un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar en la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped formadas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados como apropiados para activar los promotores, seleccionando transformantes/transfectantes o amplificar el polinucleótido que codifica la subunidad. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y lo similar, generalmente son similares a aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán aparentes para aquellos de experiencia en la materia. Tanto las células huésped eucarióticas o procarióticas pueden utilizarse para la expresión de secuencias de codificación deseadas cuando las secuencias de control apropiadas que son compatibles con el huésped designado se utilizan. Por ejemplo, entre los huéspedes procarióticos, Escherichia coli se utiliza frecuentemente. También, por ejemplo, las secuencias de control de expresión para procariotas incluyen pero no se limitan a promotores, opciopalmente conteniendo porciones operadoras, y sitios de unión de ribosoma. Los vectores de transferencia compatibles con huésped procarióticos pueden derivarse de, por ejemplo, el plásmido pBR322 que contiene operones que confieren resistencia a la tetracilina y ampicilina, y los diversos vectores de pUC, que también contienen las secuencias que confieren marcadores de resistencia al antibiótico. Estos marcadores pueden utilizarse para obtener transformantes exitosos por selección. Las secuencias de control procarióticas comúnmente utilizadas incluyen pero no se limitan al sistema de operon de lactosa (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)), el sistema de operon de triptofan (reportado por Goeddel ef al., Nucleic Acid Rres. 8:4057 (1980)) y el promotor P1 derivado de lambda y sitio de unión de ribosoma de gen N (Shimatake ef al., Nature 292: 128 (1981 )), el promotor 5 Tac híbrido (De Boer ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 292: 128 (1983) derivado de secuencias de los promotores UV5 lac y trp. Los sistemas anteriores son particularmente compatibles con E. coli, sin embargo, otros huéspedes procarióticos tales como cepa de Bacillus o Pseudomonas pueden utilizarse si se desea. 10 Los huéspedes eucarióticos incluyen levadura y células mamíferas en sistemas de cultivo. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. carlsbergensis se utilizan comúnmente como huéspedes de levadura. Los vectores compatibles con levadura llevan marcadores que permiten la selección de transformantes exitosos al conferir protrofia a los 15 mutantes auxotróficos o resistencia a metales pesados en cepas de tipo silvestre. Los vectores compatibles con levadura pueden emplear el origen 2-µ de replicación (Broach ef al., Meth Enzymol. 101 :307 (1 983)), la combinación de CEN3 o ARS 1 u otros medios para aplicar la replicación, tales como las secuencias que darán como resultado la incorporación de 20 un fragmento apropiado en el genoma de la célula huésped. Las secuencias e control para vectores de levadura se conocen en la materia e incluyen pero no se limitan a promotores para la síntesis de enzimas glicolíticas, incluyendo el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa. Ver, por ejemplo, Hess ef al., J. Adv. Enzvme Reo. 7: 149 (1968); Holland eí al., 25 Biochemistrv 17:4900 (1978) y Hitzeman, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)).

I llalli II Mili I ?¡ í - - Por jemplo, algunos sistemas de control útiles son aquellos que comprenden el promotor de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) o promotor regulable de deshidrogenasa de alcohol (ADH), o el promotor de levadura híbrido ADH2/GAPHD descrito en Cousens ef al., • 5 Gene 61 :265-275 (1987), las terminaciones también se derivan de GAPDH, y, si la secreción se desea, de secuencias guía del factor alfa de levadura, además, la región reguladora transcripcional y la región de inicio transcripcional que se enlazan operablemente pueden ser tales que no se asocian naturalmente en el organismo de tipo silvestre. 10 Las líneas celulares mamíferas disponibles como huéspedes para la expresión son conocidos en la materia y se encuentran disponibles de depositarios tales como la Colección de Cultivo de Tipo Americano. Estas incluyen pero no se limitan a células HeLa, células de riñon embriónico humano (HEK), ovario de hámster chino (CHO), células de 15 riñon de hámster bebe 8BHK) y otras. Los promotores adecuados para las células mamíferas también se conocen en la materia e incluyen los promotores virales tales como aquellos del Virus de Simio 40 (SV40), virus de sarcoma Rous (RSV), adenovirus (ADV), virus de papiloma de bovino • (BPV) y citomegalovirus (CMV). Las células mamíferas también pueden 20 requerir secuencias de terminación y secuencias de adición de poli A, secuencias intensificadoras que aumentan la expresión también pueden incluirse, y las secuencias que causan la amplificación del gen también pueden ser deseables. Estas secuencias se conocen en la materia. Los vectores adecuados para la replicación en células mamíferas pueden 25 incluir replicaciones virales, o secuencias que aseguran la integración de -.^^^AJaaiaa^ ate». tas secuencias apropiadas que codifican los receptores de P2X en el genoma huésped. Un ejemplo de tal sistema de expresión de mamífero se describe en Gopalakrishnan eí al., Eur. J. Pharmacol, Mol, Pharmacol. 290:237-246 (1 995). • 5 Otros sistemas eucarióticos también se conocen, como son los métodos para introducir los polinucleótidos en tales sistemas, tales como células anfibias, utilizando métodos estándar tales como aquellos descritos en Briggs et al., Neuropharmacol 34:583-590 (1995) o Stühmer, Meth Enzymol. 207:319-345 (1992); células de insecto que utilizan los 10 métodos descritos en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment f Station Bulletin No: 1 555 (1987), y lo similar. Los sistemas de expresión de baculovirUs pueden utilizarse para generar niveles elevados de proteínas recombinantes en células huésped de insecto. Este sistema permite el nivel elevado de la expresión 15 de proteína , aunque el procesamiento post-translacional de la proteína es en una manera similar a las células mamíferas. Estos sistemas de expresión utilizan promotores virales que se activan después de la infección de baculovirus para accionar la expresión de genes clonados en las células de insecto (O'Reilly eí al. , (1992) Baculovirus Expression 20 Vectors: A Laboratory Manual, IRL/Oxford University Press). La transfección puede ser cualquier método conocido para introducr polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo el empacar el polinucleótido en un virus y transducir una célula huésped con el virus, por toma directa del polinucleótido por la célula huésped, y lo similar, tales 25 métodos se conocen por aquellos expertos en la materia. Los «** ^^g ^ g|^tfMaM^^ÉMl«l*^MMftM^— •->«»* _«••>' procedimientos de transfección seleccionados dependen de la célula a transfectarse y se determinan por el programador. La expresión del receptor puede detectarse por el uso de un radioligando selectivo para el receptor. Sin embargo, cualquier técnica de 5 unión de radioligando conocida en la materia puede utilizarse para detectar el receptor (ver, por ejemplo, Winzor ef al., (1995) Quantitative Characterization of Ligand Binding, Wiley-Liss, Inc. , NY ; Michel ef al., Mol. Pharmacol. 51 :524-532 (1997)). Alternativamente, la expresión puede detectarse al utilizar anticuerpos o mediciones funcionakles, es decir, 10 despolarización celular estimulada por ATP utilizando métodos que se É conocen bien por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, el influjo de Ca2* estimulado por el agonista o la inhibición por antagonistas de influjo de Ca2+ estimulado por el agonista, puede medirse en células mamíferas transfectadas con el cADN del receptor de P2X2 recombinante, 15 tales como células COS, CHO o HEK. Alternativamente, el influjo de Ca + puede medirse en las células que no expresan de manera natural los receptores de P2, por ejemplo, la línea celular de astrocitoma humano 1321 N1 , se ha preparado utilizando tecnología recombinante para expresar transitoria o fijamente el receptor y P2X3 . 20 El polipéptido de P2X se recupera y purifica de cultivos de célula huésped recombinantes que expresan lo mismo por métodos conocidos incluyendo sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, 25 cromatografía de hidroxiapatita o cromatografía de lectina. Las etapas de J doblado de la proteína pueden utilizarse, según se necesario, para completar la configuración de la proteína. Finalmente, la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) puede emplearse para las etapas de purificación final. • 5 Estos polipéptidos comprendidos por la presente invención son preferentemente aproximadamente 40-60% similares a la secuencia de aminoácidos que corresponde al receptor de P2X3, más preferentemente aproximadamente 70-85% similar a la secuencia de aminoácidos del receptor de P2X3, y aún más preferentemente al menos aproximadamente 10 90% similar a la secuencia de aminoácidos del receptor de P2X3. El polipéptido del receptor de P2X humano, o fragmentos del mismo de la presente invención, también pueden sintetizarse por las técnicas convencionales conocidas en la materia, por ejemplo, por síntesis química tal como síntesis de péptido de fase sólida. En general, estos 15 métodos emplean ya sea métodos de síntesis de fase en solución o sólida. Ver, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2da Ed, Pierce Chemical Co: , Rockford, IL (1 984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Análisis, Synthesis, Biology, edotres E.

^ Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1980), pp. 3- 20 254, para las técnicas de síntesis de péptido de fase sólida; y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds. , The Peptides: Análisis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1 , para la síntesis de solución clásica. En un sistema preferido, ya sea el ARN o ADN derivado del 25 mismo, cada uno de los cuales codifica el receptor de P2X humano Al* específico, puede expresarse por la inyección directa en la célula, tal como un oocito Xenopus laevis. Utilizando este método, la funcionalidad del receptor de P2X3 humano codificado por el ADN o el mARN puede ^ evaluarse como sigue. Un polinucleótido que codifica un receptor se 5 inyecta en un oocito para su traducción en una subunidad receptora funcional. La función del receptor de P2X3 humano variante expresado puede valorarse en el oocito por una variedad de técnicas que incluyen técnicas electrofisiológicas tales como fijación de voltaje, y lo similar. Los receptores expresados en una célula huésped 10 recombinante pueden utilizarse para identificar los compuestos que k modulan P2X3. En este aspecto, la especificad de la unión de un compuesto que muestra la afinidad para el receptor se demuestra al medir la afinidad del compuesto para células que expresan el receptor o membranas de estas células. Esto puede hacerse al medir la unión 15 específica del compuesto marcado (por ejemplo, radioactivo) a las células, membranas celulares o receptor aislado, o al medir la habilidad del compuesto para desplazar la unión específica de un ligando marcado estándar. Ver, Michel eí al., supra. La expresión de los receptores ^ variantes y la selección de los compuestos que se unen a, o inhiben la 20 unión de ligando marcado a estas células o membranas, proporcionan un método para la selección rápida de compuestos con una alta afinidad para el receptor. Estos compuestos pueden ser agonistas, antagonistas o modulares del receptor. Los receptores expresados también pueden utilizarse para 25 seleccionar los compuestos que modulan la actividad del receptor de P2X. " -"-a""-— - ' -* -*- .- * . . ..,. * * . fr*mj- ?^áa? Un método para identificar compuestos que modulan la actividad de P2X, comprende proporciona una célula que expresa un receptor de P2X humano específico que proporciona una célula que expresa un polipéptido del receptor de P2X humano específico, combinar un compuesto de prueba • 5 en esa actividad del receptor de P2X. La célula puede ser una célula bacterial, una célula mamífera, una célula de levadura, una célula anfibia, un insecto y otra célula que expresa el receptor. Preferentemente, la célula es una célula mamífera o una célula anfibia. De esta manera, por ejemplo, un compuesto de prueba se evalúa por su habilidad para producir 10 una respuesta apropiada, por ejemplo, la estimulación de despolarización celular o incrementar en niveles de calcio intracelulares debido al influjo de ion de calcio si un purinoreceptor de P2X se expresa en la célula huésped, la estimulación de un incremento en los niveles de ion de calcio intracelular y/o hidrólisis de inositolfosfolípido y la formación de fosfato de 15 inositol si un purinoreceptor de P2Y se expresa, o por la habilidad del compuesto para modular la respuesta a un antagonista o agonista de purinoreceptor P2X o P2Y. El nivel de calcio intracelular puede analizarse utilizando un • indicador fluorescente sensible al ion de calcio. La fluorescencia celular 20 puede monitorearse utilizando un fluorómetro. Los ejemplos de tintes fluorescentes sensibles al ion de calcio incluyen, por ejemplo, quin-2 (ver, por ejemplo, Tsien eí al., J. Cell. Biol. 94:325 (1982)), fura-2 (ver, por ejemplo, Grynkiewicz ef al., J . Biol. Chem . 260: 3440 (1 985)), calcio verde- 1 , indo-1 (ver, por ejemplo, Grynkiewicz ef al., supra), fluo-3 (ver, por 25 ejemplo, Kao eí al. , J. Biol. Chem. 264:81 79 (1 989)) y rod-2 (ver, por ••--*- >--**>*»*• ^^^^y^a ejemplo, Tsien ef al., J. Biol. Chem. Resumen 89a (1987)), y los esteres de acetoximetil hidrolizable de esterasa no específico de los mismos, de los cuales todos se encuentran comercialmente (Molecular Probes. Eugene, OR; Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO). • 5 La despolarización de membrana de células formadas genéticamente para expresar un purinoreceptor de P2Xn puede monitorearse utilizando un tinte fluorescente que es sensible a cambios en potencial de membrana. Por ejemplo, el tinte fluorescente sensible- potencial se divide en una membrana en la despolarización y da como 10 resultado un incremento detectable en fluorescencia celular. Ejemplos de f tales tintes fluorescentes sensibles-potencial de membrana incluyen carbocianinas, tales como yoduro de 3,3'-dipentiloxacarbocianina (DiOC5) y yoduro de 3,3'-dipropiltiadiacarbocianuro (DiSC3), oxonoles, tales como bis-(1 ,3-ácido dibutilbarbitúrico) pentametina oxonol (DiBAC (5)) o bis- 15 (1 ,3-ácido dibutilbarbitúrico) pentamina oxonol (DiBAC4 (5)), o lo similar. Con objeto de calibrar la emisión de fluorescencia de estos tintes in situ, un agente que enfría la emisión de fluorescencia puede utilizarse. De esta manera, por ejemplo, anti-fluoresceina (Molecular • Probes) enfría aproximadamente 87% de la fluorescencia de una solución 20 de 5 nM de fluo-3 en pH 7,0, y puede utilizarse para calibrar la emisión de fluorescencia de este tinte. Cuando los derivados del tinte de éster de acetoximetil se utiliza, la hidrólisis incompleta del éster puede dar como resultado un indicador fluorescente que es fluorescente pero insensible a iones de calcio. Los controles par tal situación incluyen transportar 25 cantidades saturadas de iones de calcio en la célula por un inóforo para lograr la respuesta de fluorescencia máxima y transportar los iones de magnesio en la célula para enfriar la fluorescencia del indicar si todos los esteres de acetoximetilo se han hidrolizado. Un medio mediante el cual á^ tales iones pueden transportarse en células es con el uso de un inóforo, 5 tal como A231 87 (ver, por ejemplo, Pressman ef al., (1976), Ann, . Rev. Biochem 45:504) (Sigma Chemical Co.), el derivado brominado del mismo (ver, por ejemplo, Deber ef al., (1985) Anal. Biochem. 146:349 (Molecular Probes), u otros ionóforos bien conocidos en la materia. Además, puede ser deseable cuantificar la cantidad de ion de 10 calcio intracelular de la emisión de fluorescencia de una célula al ft comparar los datos de fluorescencia obtenidos de los compuestos de prueba a una curva de calibración que se generó por una serie de calibradores cada uno teniendo una concentración de ion de calcio conocida. De esta manera, los estándares de ion de calcio se hacen 15 teniendo un rango de concentraciones pero preparando una solución madre de, por ejemplo, CaCI , de las cuales las diluciones pueden hacerse para lograr la(s) concentración(es) estándar(es) deseada(s). La emisión de fluorescencia de los estándares en la presencia del tinte indicador • fluorescente sensible al ion de calcio se utiliza para construir una curva 20 estándar y la concentración de ion de calcio intracelular de la célula genéticamente formada en el análisis se determina de la curva estándar. alternativamente, las células previamente tratadas con un inóforo de calcio pueden incubarse con la tinta indicadora y los estándares de ion de calcio utilizados para generar la curva estándar. 25 El análisis puede conducirse manualmente o utilizar un 1 * « •*- - . < :- "tí iíirtíítf^t sistema automático. Para un análisis de selección funcional de alta capacidad que identifica los lígandos de purinoreceptor humano, un sistema automático se prefiere. Un ejemplo de tal sistema automático comprende proporcionar una placa de cultivo de 96 cavidades en cada • 5 cavidad de la cual se cultiva una célula genéticamente formada para codificar y expresar un polipéptido de purinoreceptor humano. La placa se carga e un lector de placa de formación de imágenes de fluorescencia ("FLIPR"), que mide simultáneamente las cinéticas de flujo de calcio intraceiular en cada una de las 96 cavidades). Tal FLIPR se encuentra 10 comercialmente disponible de Molecular Devices Corp. (Sunnyvale, CA). p FLIPR es capaz de transferir cuantitativamente los fluidos hacia y desde cada cavidad de la placa de 96 cavidades y de esta manera puede utilizarse para agregar tinte indicador fluorescente sensible a ion de calcio, un compuesto candidato, un agonista de purinoreceptor, por 15 ejemplo, ATP, UTP, 2-metiltioATP, o lo similar y/o un antagonista del purinoreceptor, por ejemplo, suramin, cibacron azul, PPADS o lo similar. FLIPR recolecta los datos de fluorescencia por toda la duración del análisis.

• En una manera similar, la presencia de un antagonista o un 20 agonista de purinoreceptor en una muestra de prueba puede determinarse utilizando un sistema automático o manual. Un sistema automático para practicar el método comprende proporcionar una palca de cultivo de 96 cavidades en cada cavidad de la cual una célula formada genéticamente que expresa un purinoreceptor se cultiva. El tinte indicador fluorescente, 25 muestra de prueba, y/o agonista de purinoreceptor se agregan a cada * * . cavidad y la emisión de fluorescencia de cada cavidad se monitorea simultáneamente por FLIPR. Los medicamentos del purinoreceptor de P2X se consideran g agentes terapéuticos potenciales en varios desordenes incluyendo, sin 5 limitación, sistema nervioso central o condiciones del sistema nervioso periférico, por ejemplo, epilepsia, dolor, depresión, enfermedades neurodegenerativas, y lo similar, y en desordenes del sistema reproductivo, asma, enfermedad vascular periférica, hipertensión, desordenes del sistema inmune, desorden del intestino irritable o 10 eyaculación prematura. Además, el ADN o ARN derivado del mismo, puede utilizarse para designar sondas de oligonucleótidos para ADNs que expresan receptores de P2X específicos. Como se utiliza en ia presente, el término "sonda" se refiere a una estructura comprendida de un polinucleótido, 15 como se define arriba, que contiene una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos presente en un polinucleótido objetivo. Las regiones de polinucleótido de sondas pueden componerse de ADN, y/o ARN, y/o análogos nucleótidos sintéticos. Tales sondas podrían ser útiles en análisis de hibridización in vitro para 20 distinguir las variantes de P2X2 y P2X4 de mensaje de tipo silvestre, con la condición de que puede ser difícil diseñar un método capaz de hacer tal distinción dadas las pequeñas diferencias que pueden existir entre las secuencias que codifican el receptor de P2X variante y de tipo silvestre. Alternativamente, un análisis en base a PCR podría utilizarse para 25 amplificar el ADN o ARN muestra para análisis de secuencia. jg^^j ^í ^a£|&^| ' - -- .- -*** »--« Además, cada polipéptido de P2X específico o fragmento(s) del mismo pueden utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales utilizando técnicas que se conocen bien en la materia. El receptor de P2X específico o fragmentos relevantes pueden obtenerse utilizando la • 5 tecnología recombinante subrayada arriba, es decir, una célula recombinante que expresa el receptor o fragmentos pueden cultivarse para producir cantidades del receptor o fragmento que pueden recuperarse y aislarse. Alternativamente, el polipéptido de P2X específico o fragmento(s) del mismo pueden sintetizarse utilizando técnicas sintéticas 10 de polipéptido convencionales como se sabe en la materia. Los anticuerpos monoclonales que despliegan la especificidad y selectividad • para un polipéptido de P2X particular puede marcarse con una porción detectable o medible, por ejemplo, una porción fluorescente, radiomarcas, enzimas, marcas quimioluminiscentes y lo similar, y utilizarse en análisis in 15 vitro. Se teoriza que tales anticuerpos podrían utilizarse para identificar polipéptidos del receptor de P2X variante o de tipo silvestre para propósitos de inmuno-diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos se han generado para detectar amiloide b1 -40 v. 1 -42 en tejido cerebral (Wisniewski ef al., (1 996) Biochem. J. 31 3:575-580; ver también, Suzuki ef 20 al., (1 994) Science 264: 1 336-1 340; Gravina ef al., (1 995) J. Biol. Chem. 270:701 3-7016; y Turnet ef al., (1 996) J. Biol. Chem. 271 :8966-8970). Modulación Alostérica de Actividad del Receptor: La activación de los receptores de P2X por ATP y otros agonistas del receptor de P2X regula los gradientes de ion a través de la 25 membrana celular, modula las concentraciones citosólicas de cationes, incluyendo Ca2+, Na+ y K+, y tiene un papel en la regulación de potencial de membrana celular. Los moduladores alostéricos de la actividad del receptor generalmente aumentan la activación del receptor inducida por agonista al unir a los sitios secundarios en el receptor. Con respecto a cibacron azul, la presente invención se refiere al descubrimiento de que este antagonista del receptor de P2X tiene la habilidad para modular alostéricamente los efectos de un receptor de P2X3 presente en un mamífero tal como un humano o una rata. Más específicamente, en células que expresan el receptor de P2X3, cibacron azul tiene la habilidad de mediar aproximadamente un incremento de 3-7 veces en la magnitud y potencia de influjo de CA2+ activado por ATP y corrientes de transmembrana. La concentración máxima media de cibacron azul requerida par mediar la potenciación máxima es independiente del agonista utilizado para activar el receptor de hP2X3. Ya que el cibacron azul aumenta tanto la potencia del agonista como la magnitud absoluta de la activación del receptor de P2X3, estas acciones alostéricas son significativamente distintas de los efectos previamente reportados de cibacron azul en la actividad del receptor de P2X4 (Miller eí al., Naunvn Schmiedebergs Arch Pharmacol 354:562-571 (1 998)). De esta manera , consistente con las propiedades de otros canales de ion abiertos a ligando, actividad del receptor de P2X3 pueden modularse alostéricamente por un ligando distinto del agonista endógeno. Con respecto al efecto de cibacron azul en antagonistas, el antagonista del receptor de P2 no selectivo, PPADS, por ejemplo, causa L un cambio hacia la derecha de la curva de concentración-efecto de cibacron azul, mientras que las concentraciones crecientes de cibacron azul atenúan el antagonismo de PPADS. A El homólogo de rata del receptor de P2X3 produce resultados 5 similares a aquellos presentados arriba y en los ejemplos, en la exposición a cibacron azul, sugiriendo que la actividad moduladora de cibacron azul no es dependiente de especie. Debe observarse que el mecanismo de potenciación del receptor de P2X3 mediado por cibacron azul no es un resultado secundario 10 de su efecto inhibidor previamente descrito en ectonucleotidasa (Stout eí f al., Biochem. Mol. Biol. Int. 36:927-934 (1995)). Su la actividad de ecto- ATPasa mediada por cibacron azul fue un factor contribuyente, se esperaría que el cibacron azul solo mediaría la actividad similar al agonista, al incrementar el nivel de ATP endógeno en el medio. Sin 15 embargo, como se evidencia por los datos que corresponde a los ejemplos de abajo, no son efectos intrínsecos de cibacron azul en la actividad del receptor de hP2X3. Además, la acumulación del agonista endógeno como un resultado de inhibición de ecto-ATPase se esperaría que afectará los V subtipos del receptor de P2, en lugar del receptor de P2X3 solo. 20 Además de ATP, de acuerdo con la presente invención, el cibacron azul puede utilizarse para potenciar la activación del receptor de hP2X3 por otros agonistas del receptor de P2X incluyendo, por ejemplo, 2- meASTP, BzATP y aß-meATP. En cada caso, la concentración máxima media de cibacron azul requerida para medir la potenciación completa es 25 similar, sugiriendo que el efecto de cibacron azul en el receptor es .* t . u *. . hta » •- -ri- ivux* ,.««„... .. . . ... ... ., ,... . * ^. independiente del agonista. De esta manera, cualquier agonista, según parece ser apropiado por un practicante médico, puede utilizarse en combinación con cibacron azul. g^ Además de mediar un incremento en la magnitud de la señal 5 del receptor de P2X3 máximo, el cibacron azul aumenta la potencia del agonista al causar un cambio hacia la izquierda de la curva de concentración-respuesta de ATP. En particular, en la presencia de 3 µM de cibacron azul, ATP es 7 veces más potente que en su ausencia, sugiriendo que el cibacron azul puede tener un efecto en la afinidad y/o la 10 eficacia de ATP para el receptor de hP2X3 o sirve para aumentar la f cooperación de ATP que se une al receptor multimérico. La actividad moduladora de cibacron azul puede corroborarse por la observación de que la potencia inhibidora de un antagonista del P2X3 no competitivo, PPADS, se relaciona de manera inversa a la 15 concentración de cibacron azul. Cibacron azul, aunque aumenta la magnitud de la activación del receptor de P2X3, causa un cambio hacia la derecha de la curva de concentración-efecto de PPADS que demuestra que este modular holostérico reduce la actividad antagonista. Este efecto *PP de cibacron azul es independiente de la concentración de ATP y de esta 20 manera no es una consecuencia de un incremento aparente en ocupación del receptor. El cambio hacia al izquierda mediado por cibacron azul de las curvas de concentración-efecto de agonista y el cambio hacia la derecha de las curvas de concentración-efecto de antagonista, soportan la 25 conclusión de que el cibacron azul funciona como un modular holostérico de la actividad del receptor de P2X3. Además, la exclusividad mutua de la inhibición mediada por PPADS y potenciación mediada por cibacron azul sugiere una interacción compleja entre los ligandos reguladores que modulan la función del receptor de P2X3. • 5 El efecto modulador de cibacron azul arriba descrito puede observarse tanto en receptores de P2X3 humano y de rata, y es al menos 1000 veces más potente que las acciones de Ca2+, sugiriendo que los receptores de P2X3 endógenamente expresados pueden someterse a la regulación funcional por una multiplicidad de interacciones de baja y alta 10 afinidad. • Aceleración de la Recuperación del Receptor Subsecuente a la Desensibilización: Además de potenciar los efectos de ATP en el receptor de hP2X3, cibacron azul también tiene la habilidad para producir 15 aproximadamente un incremento de 6 veces en la velocidad de recuperación del receptor de hP2X3 de desensibilización, como se evidencia por su habilidad para restaurar la respuesta de ATP a receptores agudamente desensibilizados. Por lo tanto, de acuerdo con la presente jj invención, el cibacron azul puede administrarse a un paciente con objeto 20 de incrementar la velocidad de representación del receptor de P2X3 después de una fase de desensibilización. Además, debe observarse que la potenciación tanto de los receptores de P2X3 humano como de rata por cibacron azul ocurre concomitantemente con la resensibilización del receptor acelerado. De 25 esta manera, de acuerdo con la presente invención, uno puede potenciar aBJMflÉitodÉ- -r — i ni — i l ' - -Hit n -r -rlMifrr el receptor mientras se resensibiliza simultáneamente el receptor. La velocidad aparente de recuperación de desensibilización se incremente seis veces en la presencia de 50 µM de cibacron azul. La reducción en la vida media del periodo refractario después de la 5 desensibilización sugiere que los receptores de P2X3 endógenamente expresados pueden someterse a mecanismos moduladores que facilitan su recuperación funcional. Se cree que la unión de cibacron azul al receptor de P2X3 conduce a un cambio conformacional rápido, dando como resultado la 10 potenciación de la activación del receptor de P2X3 mediada por ATP. Este 4fc cambio de conformación también media un efecto a largo plazo, más lento en estado de desenzibilización del receptor, de manera que la rensensibilización funcional y la modulación haioestérica ocurre secuencialmente y puede compartir un mecanismo común de acción. 15 En vista de lo anterior, la presente invención se refiere a un nuevo descubrimiento que el cibacron azul modula selectivamente los receptores de P2X3 de rata y humano al aumentar la potencia agonista y eficacia, así como también facilitar la resensibilización del receptor después de la desensibilización inducida por el agonista. De esta manera, 20 uno puede administrar cibacron azul a un paciente con objeto de tanto modular el receptor, si se desea, por ejemplo, en estudios de déficit sensorial, así como también facilitar la resensibilización, o para lograr ya sea uno de estos dos efectos. Implicaciones Terapéuticas 25 De acuerdo con la presente invención , uno puede también **u*ili? uc*Uß»* n.~ ?...»?~ ? . Li . . . . - .. . „ . . __ , f . +±mf¿ administrar periféricamente los antagonistas del receptor de P2 a un paciente con objeto de, por ejemplo, reducir la nocicepción (es decir, la sensación de dolor). Por ejemplo, TNP-ATP (es decir, un agonista de A receptor de P2X potente) puede utilizarse para reducir la nocicepción 5 persistente o aguda en un paciente. TNP-ATP periféricamente administrado atenúa tanto la nocicepción persistente como aguda en la prueba de formalina (es decir, estímulo inflamatorio) que proporciona evidencia para una contribución tanto de receptores P2X3 y/o P2X2/3 a neurotransmisión nociceptivo 10 periférico. Esta vista se soporta además por la habilidad de cibacron azul (ß para aumentar específicamente la activación del receptor de P2X3 y P2X2 3 in vitro y para aumentar tanto la nocicepción aguda y persistente in vivo. Los efectos pronociceptivos de cibacron azul in vivo parecen ser farmacológicamente específicos ya que otro derivado de ácido 15 sulfónico de antraquinona, naranja reactiva, que no altera la función del receptor de P2X3, no aumenta los efectos nociceptivos de formalina intradérmica. En resumen, en vista de lo anterior y como se evidencia por ^P los ejemplos presentados abajo, la activación de los receptores de P2X3 y 20 P2X2/3 abiertos a ATP que se ubican altamente en neuronas sensoriales primarias sensibles a capsaicina (Vulchanova ef al., Neuropharmacol 36: 1229-1242 (1 997), contribuyen a la neurotransmisión nociceptiva. La administración periférica de los agonistas del receptor de P2X inicia las respuestas nociceptivas agudas en los animales de laboratorio y aumentan 25 los efectos nociceptivos de otros estímulos nocivos incluyendo (^^^ '"* * ** *- carrageenan, formalina y capsacína como se ilustra en la presente (ver también, Bland-Ward ef al, Br. J. Pharmacol. 122:366-3721 (1997); Hamilton ef al., Br. J. Pharmacol. 126:326-332 (1999); Sawynok ef al., Eur. J. Pharmacol. 330: 1 15-121 (1997); Tsuda ef al., Br. J. Pharmacol. • 5 127:449-456 (1 999); Tsuda ef al., Br. J. Pharmacol. 128: 1497-1504 (1999)). La demostración de que el TNP-ATP periféricamente administrado atenúa tanto la nocicepción persistente y aguda en la prueba de formalina de rata proporciona evidencia para una contribución tanto de receptores de P2X3 y/o P2X2/3 a la neurotransmisión nociceptiva periférica. 10 Este concepto se soporta además por la habilidad de cibacron azul para aumentar selectivamente la activación del receptor de P2X3 y/o P2X2 3 in vitro y para aumentar el dolor persistente y agudo in vivo. De esta manera, la modulación farmacológica por TNP-ATP y cibacron azul de respuestas nociceptivas producidas por un agonista del receptor de P2 15 (BzATP) o por un estímulo inflamatorio (formalina) proporcionan evidencia para un papel específico de la activación del receptor de P2X3 y/o P2X2 3 en neurotransmisión nociceptiva. Los ejemplos presentados abajo se relacionan con las • modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los 20 ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen para limitar el alcance de ia presente invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc), pero algún error experimental desviación debe, por supuesto, 25 permitirse.

I ir i ni iimiMf II r i r EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN DE UNA SECUENCIA DE cADN HUMANA PROBABLEMENTE PARA CODIFICAR POLIPÉPTIDO DE P2X3 La secuencia de aminoácidos predicha del receptor de P2X3 • 5 de rata (secuencia NBCI número de I. D. 1 103623) se utilizó para buscar las secuencias de ADN humanas que podrían codificar los polipéptidos similares. La herramienta de búsqueda de la base de datos TBLASTN (Alschul (1 993) J. Mol. Evol. 36:390-200) se utilizó, lo que permite consultar las bases de datos de nucleótidos con una secuencia de 10 proteínas al traducir dinámicamente las secuencias de ADN en todas las 6 • estructuras de lectura posibles. Una búsqueda de los sitios objetivo de secuencia del Banco Genético (STS) revelaron un fragmento genómico humano, 229 pares bases en longitud, que contienen una estructura de lectura abierta que ser predeciría para codificar un polipéptido que tiene 15 un grado elevado de homología a una región del receptor de P2X3 de rata. La secuencia depositada para este fragmento (número de acceso del Banco Genético G03901 ) fue como sigue: CCCGAATCGG TGGACTGCTT CTCCACTGTG GTCTGGTCGC TGGGGTACAC • TGGGTTGGTC AAAGCCGCGA TTTTCAGTGT AGTCTCATTC ACNTGNAGGC 20 GAAAGAGCTG CTGTTGTCAA GTTCTGACTA TGGGCATGT CCTCTTTTGT GACCCCATTT GACAGACTCA GCAGTGGGCG CCATGACCT AGTCATGAGG GGAGCCAGGA CATCTGTGTG ATCCCAAGG (SEQ ID NO.1) En donde "N" representa cualquiera de las bases A, T, G y C, EJEMPLO 2 25 IDENTIFICACIÓN DEL EXTREMO 5' DEL cADN lil Illipliii lillllíllliií' iiTiílíii I l i l i il I En base a la secuencia de G03901 , las cargas de inicio se diseñaron para utilizarse en procedimientos de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) en un esfuerzo por aislar la estructura de lectura abierta intacta para este receptor. Las cargas de 5 inicio utilizadas en las reacciones descritas abajo son como siguen: Carga de Inicio 1 s (SEQ ID NO:2): 5'-TTTACCAACCCAGTGTACCC-3' Carga de Inicio 2s (SEQ ID NO:3): 5'-ACCACAGTGGAGAAGCAGTC-3' 10 Carga de Inicio 3as (SEQ ID NO:4): F 5'-GAATCGGTGGACTGCTTCTC-3' Carga de Inicio 4as (SEQ ID NO:5): 5'CGATTTTCAGTGTAGTCTCATTC-3' Carga de Inicio 5as (SEQ ID NO:6): 15 5'GGGGTACACTGGGTTGGTAA-3' Carga de Inicio Amplia 5'RACE (SEQ ID NO:7): d'-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-S' Carga de Inicio Adaptadora Universal (SEQ ID NO:8): • Carga de Inicio Adaptadora (SEQ ID NO:9): 20 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' Carga de Inicio Adaptadora Universal Abreviada (SEQ ID NO: 10): 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' Carga de Inicio 5'hPX3 (SEQ ID NO: 1 1 ): 5'-CACCATGAACTGCATATCCGACTTC-3' 25 Carga de Inicio 3hPX3 (SEQ ID NO.12: -^^gjjgg^SI l 5'-CTAGTGGCCTATGGAGAAGGC-3' Para identificar el extremo 5' del cADN que se deriva de la región genómica de la cual la secuencia G03901 es parte de, la técnica A RACE (Amplificación Rápida de Extremos de cADN) (Forman ef al. (1998), 5 Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. 85:8998-9002) se empleó. La extensión del cADN identificado a través de la etapa de RT-PCR se llevó a cabo utilizando el sistema reactivo 5'RACE™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Un microorganismo de poli A +ARN derivado de tejido de glándula pituitaria de humano (Cat. # 65894-1 , Lote # 6080167; Clontech 10 Laboratories, Palo Alto, CA) se utilizó en una reacción utilizando reactivos f| proporcionados en el equipo como se describe; 1 µl (1 µg) de ARN se combinó con 3 µl (3 pmol) de Carga de Inicio 3as y 1 1 µl de agua libre de Rnasa (agua tratada con dietilpirocarbonato, o DEPC) y se calentó a 70°C por 10 minutos después por 1 minuto en hielo. 2.5 µl de 10x de regulador 15 de reacción (200 mM de Tris-HCl pH 8.4, 500 mM de KCl), 3 µl de 25 mM de MgCI2, 1 µl de 10 mM de mezcla dNTP, y 2.5 µl de 0.1 M de DTT se agregaron. La mezcla se incubó a 42°C por 2 minutos después de los cuales 1 µl de transcriptasa de inversa de Superscript II™ (Life • Technologies). La reacción se incubó por un adicional de 30 minutos a 20 42°C, 1 5 minutos a 70°C, y en hielo por 1 minuto. Un microlitro de RNasa H (2 unidades) se agregó e incubó a 55°C por 20 minutos. El cADN se purificó utilizando las columnas de GlassMax™ incluidas en el equipo. El cADN se eluyó de la columna en 50 µl de agua destilada (dH2O), liofilizada, y resuspendida en 21 µl de H2O. El residuo del cADN se realizó 25 en la siguiente reacción: 7.5 µl de dH2O, 2.5 µl de regulador de reacción (200 mM de Tris-HCl pH 8.4, 500 mM de KCl), 1 .5 µl de 25 mM de MgCI2, 2.5 µl de 2 mM de dCTP, y 1 0 µl del cADN se incubaron a 94°C por 3 minutos, después 1 minuto en hielo, seguido por 10 minutos a 37°C. Finalmente, la mezcla se incubó a 70°C por 10 minutos y después se • 5 colocó en hielo. La amplificación de PCR del cADN se realizó en las siguientes etapas: 5 µl del cADN se incluyeron en una reacción que también contuvo 5 µl de 10x de regulador PCR GeneAmp™ (Perkin, Elmer, Foster City, CA), (500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl pH 8.3, 15 mM de MgCI2, y 0.01 % 10 (p/v) de gelatina), 1 µl de 1 0 mM de mezcla dNTP, 1 µl (1 0 pmol) de Carga • de Inicio Amplia, 1 µl (10 pmol) de Carga de Inicio 5as, y 35 µl de dH2O. La reacción se calentó a 95°C durante 1 minuto, después se mantuvo a 80°C por 2 minutos durantes los cuales 0.5 µl (2.5 unidades) de polimerasa Amplitaq™ (Perkin Elmer) se agregaron. La reacción se giró 15 35 veces bajo estas condiciones:94°C por 1 5 segundos, 52°C por 20 segundos, y 72°C por 1 minuto. Después de que la amplificación, los productos de reacción se purificaron utilizando el sistema de producción del producto de PCR QiaQuick™ (Qiagen, Inc. , Chatworth CA) como por las instrucciones del 20 fabricante. Los productos se eluyeron de las columnas con 50 µl de regulador de TE (1 0 mM de Tris, 1 mM de EDTA pH 8.0), y un microlitro del eluyente se utilizó como ADN templado en una reacción de PCR para incrementar los niveles de producto específico para aislamiento subsecuente. La reamplificación también incluyó: 5 µl de 10 x de 25 regulador PCR de GeneAmp™, 1 µl de 1 0 mM de mezcla dNTP, 1 µl (1 0 pmol) de Carga de Amplificación Universal, 1 µl (10 pmol) de Carga de Inicio 4as, y 40.5 µl de dH2O. La reacción se calentó a 95°C durante 1 minuto, después se mantuvo a 80°C durante los cuales 0.5 µl (2.5 unidades) de polimerasa de Amplitaq™ se agregaron. La reacción se giró 5 35 veces bajo estas condiciones: 94°C por 15 segundos, 50°C por 20 segundos, y 72°C por 1 minuto. Los productos de amplificación se analizaron a través de 0.8% de electroforesis de gel de agarosa y un producto predominante de aproximadamente 1 .3 pares de kilobase en longitud se detectó. El producto se extirpó del gel y se purificó a través 10 del sistema de purificación QiaQuick™. El producto se eluyó de la f columna con 50 µl de dH2O y liofilizó a 10 µl de volumen. Tres microlitros del ADN resultante se utilizaron en una reacción de ligación con vector pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se incubó a 14°C durante la noche. Los productos de ligación se utilizaron 15 para transformar E. coli del equipo de clonación utilizando los procedimientos del fabricante estándar. Los tamaños de inserción de los clones resultantes se determinaron utilizando reactivos terminadores de tinte (Prism™, Perkin Elmer Applied Biosystems División, Foster City, CA) F^ y un secuenciador de ADN de Biosystemas Applied Modelo 373. La 20 secuencia del producto 5'RACE incluyendo los sitios EcoRI del vector pCR2.1 se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1 3). Las secuencias de los amplímeros (Carga de Inicio de Amplificación Universal y el complemento para la Carga de Inicio 4as) se subrayan. EJEMPLO 3 25 IDENTIFICACIÓN DEL EXTREMO 3' DEL cADN de P2X3 ^^»MMM^^a^.M^. ^^^ Para identificar la secuencia que rodea el codón de terminación de la estructura de lectura abierta que codifica el receptor de P2X3 humano, se empleó el Sistema 3'RACE™ de Life Technologies con ^ las cargas de inicio diseñados para STS G03901 . Poli A + ARN (500 5 nanogramos) derivados del tejido de glándula pituitaria (ver Ejemplo 2, arriba) se utilizó en la reacción como sigue: El ARN y 10 picomoles de la Carga de Inicio Adaptadora se combinaron en un volumen final de 12 µl de dH2O. Esta mezcla se calentó a 70°C por 10 minutos y se enfrió en hielo por 1 minuto. Los siguientes componentes se agregaron: 2 µl de 10x de 10 regulador de PCR (200 mM de Tris-HCl pH 8.4, 500 mM de KCl), 2 µl de 25 f mM de MgCI2, 1 µl de 10 mM de mezcla dNTP, y 2 µl de 0.1 M de ditiotreitol. La reacción se equilibró a 42°C por 2 minutos después de los cuales 1 µl (200 unidades) de transcriptasa inversa de Superscriptll™ se agregaron y la incubación continuó a 42°C por 50 minutos. La reacción se 15 terminó por incubación a 70°C por 1 5 minutos y se enfrió en hielo. Rnasa H (1 µl; 2 unidades) se agregaron y la mezcla se incubó por 20 minutos a 37°C, después se almacenó en hielo. La amplificación del extremo 3' del cADN de P2X3 se realizó en las siguientes reacciones: 2 µl del primer filamento de cADN sintetizado 20 arriba se utilizó en una mezcla de PCR que también incluye 5 µl de 10x de regulador PCR de GeneAmp™, 1 µl de 10 mM de dNTPs, 1 µl (10 picomoles, Carga de Inicio 1 s, 1 µl (1 0 picomoles) de Carga de Inicio de Amplificación Universal Abreviada (AUAP) y 39.5 µl de dH2O. La reacción se calentó a 95°C durante 1 minuto, después se mantuvo a 80°C por 2 25 minutos, durantes los cuales 0.5 µl (2.5 unidades) de polimerasa - *" "- ' • ' *• ' -•- •" - Amplitaq™ se agregaron. La reacción se giró 35 veces bajo estas condiciones: 94°C por 1 5 segundos; 54°C por 20 segundos, y 72°C por 2 minutos. Después del giro, la reacción se incubó por 10 minutos a 70°C y ^ almacenó a 4°C. 5 Después de la amplificación, los productos de reacción se purificaron utilizando el sistema de purificación del producto de PCR QiaQuick™. Los productos se eluyeron de las columnas con 50 µl de regulador TE (10 mM de Tris, 0.1 mM de EDTA pH 8.0) y un microlitro del eluyente se utilizó como ADN templado en una reacción de PCR para 10 incrementar los niveles del producto específico para el aislamiento subsecuente. La reamplificación también incluyó: 5 µl de 10x de regulador de PCR GeneAmp™, 1 µl de 1 0 mM de mezcla dNTP, 1 µl (1 0 pmol) AUAP, 1 µl (10 pmol) de Carga de Inicio 2s, y 40.5 µl de dH2O. La reacción se calentó a 95°C por 1 minuto, después se mantuvo a 80°C durante los 15 cuales 5 µl (2.5 unidades) de polimerasa Amplitaq™ se agregaron. La reacción se giró 35 veces bajo estas condiciones: 94°C por 1 5 segundos; 54°C por 20 segundos, y 72°C por 2 minutos. Los productos de amplificación se analizaron a través de 0.8% de electroforesis de gel de • agarosa y se detectó un producto predominante de aproximadamente 700 20 pares base en longitud. Este producto se extrajo del gel y se purificó a través del sistema de purificación Qiaquick™ . El producto se eluyó de la columna con 50 µl de dH2O y liofilizó a un volumen de 1 0 µl. Tres microlitros del ADN anterior se utilizaron en una reacción de ligación con vector pCR 2.1 (Invitrogen) incubada a 1 5°C por 3.5 horas. 25 Los productos de ligación se utilizaron para transformar E. coli del equipo ¿¿f^^^^^^^^^^^=&^^^^^^^s^ de clonación. Los tamaños de inserción de los clones resultantes se determinaron utilizando digestiones EcoRI de los plásmidos y los clones que contienen inserciones del tamaño aproximado del producto de PCR se secuenciaron utilizando reactivos de terminador de tinte fluorescente (Prism, Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373. La secuencia del producto 3'RACE que incluye los sitios EcoRI del vector pCR 2.1 se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 14), en la cual las secuencias de los amplímeros (AUAP y el complemento de la Carga de Inicio 2s) se subrayan. EJEMPLO 4 AISLAMIENTO DE cADN QUE CONTIENE LA ESTRUCTURA DE LECTURA ABIERTA INTACTA DE P2X3 HUMANO Utilizando la información en la secuencia que rodea los codones de inicio y terminación del mensaje de P2X3 humano, las cargas de inicio de oligonucleótidos se diseñaron y sintetizaron para permitir RT-PCR de la estructura de lectura abierta intacta del mARN. Las secuencias de estas cargas de inicio, diseñaron 5'hP2X3 y 3'hP2X3, se muestran arriba. La amplificación de PCR se realizó en una porción (2 ul) del cADN de glándula pituitaria descrito en el Ejemplo 3. Una polimerasa termoestbie de lectura (Polimerasa ADN Pfu Clonado, Stratagene, La Joya, CA) se utilizó en la amplificación para asegurar la amplificación de alta fidelidad. La mezcla de reacción consistió de 2 µl de cADN, 5 µl de 10x de regulador de reacción de polimerasa Pfu clonado (200 mM de Tris-HCl (pH 8.8), 1 00 mM de KCl, 1 00 mM de (NH4)2SO4, 1 % Tritón X-1 00, 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino libre de nucleasa), 1 µl de mezcla dNTP, 1 µl (10 picomoles) de carga de inicio 5'hP2X3, 1 µl (10 picomoles) carga de inicio 3'hP2X3 y 39.5 µl de dH O. La reacción se calentó a 95°C por 1 minuto, después se mantuvo a 80°C por 2 minutos, durante los cuales 0.5 ^ µl (1 .25 unidades) de polimerasa Pfu clonada se agregaron. La reacción 5 se giró bajo las siguientes condiciones: 94°C por 20 segundos, 52°C por 20 segundos, y 72°C por 3.5 minutos. Después del giro, la reacción se incuba por 10 minutos a 70°C. Los productos de reacción se separaron en un gel de agarosa de 0.8% y un producto de aproximadamente 1 .2 kilobases se extirpo y 10 purificó a través del sistema de purificación de gel QiaQuick™. El ADN se ( eluyó con 50 µl de dH2O, liofilizó y resuspendió en 1 0 µl de dH2O. Un microlitro de este ADN se utiliza en la reacción de reamplificación que también incluyeron 5 µl de 10x de regulador de reacción de Pfu , 1 µl de mezcla dNTP, 1 µl (1 0 picomoles) de la Carga de Inicio 5'hP2X3, 1 µl (10 15 picomoles) de Carga de Inicio 3'hP2X3, y 40.5 µl de dH2O. La reacción se calentó a 95°C durante 1 minuto, después se mantuvo a 80°C por 2 minutos, durante los cuales 0.5 µl (1 .25 unidades) de polimerasa clonada ^^ Pfu se agregaron. La reacción se giró 1 5 veces bajo las siguientes condiciones: 94°C por 20 segundos; 52°C por 20 segundos, y 72°C por 3.5 20 minutos. Después del giro, la reacción se incubó por 1 0 minutos a 70°C y almacenó a 70°C. Los productos de reacción se separaron en un gel de agarosa de 0.8% y un producto de 1 .2 kilobases se extirpo y purificó a través del sistema de purificación de gel QiaQuick™. El ADN se eluyó con 50 µl de 25 dH2O, liofilizó y resuspendió en 15 µl de dH2O. Tres microlitros del producto de PCR purificado se utilizaron en una reacción de ligación utilizando el sistema de clonación pCRscript™ (Stratagene) que también incluyeron 0.5 µl (5 ng) del vector Amp SK (+) pCRScript™, 1 µl de 1 0 x de Regulador de Reacción pCRScript™, 0.5 µl de 10 mM de ATP, 1 µl (5 • 5 unidades de enzima de restricción Srf I, 1 µl de (4 unidades) de ligasa de ADN T4, y 3 µl de dH2O. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente por una hora, después a 65°C por 15 minutos. Un microlitro de este producto de reacción se utilizó para transformar las células ultracompetentes de XL-2 azul de transformación 10 (Stratagene) como por los procedimientos del fabricante estándar. Los f clones resultantes se seleccionaron por el análisis de restricción y se secuenciaron utilizando reactivos de terminador de tinte fluorescente (Prism, Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN de Applied Biosystems 310.- la secuencia de la estructura de lectura abierta se 15 muestra en la Figura 3 (SEQ ID NO: 15). Una comparación de la secuencia de proteína predicha del P2X3 humano de la presente invención (SEQ ID NO: 16) con aquella del polipéptido de rata correspondiente (SEQ ID NO: 17) se representa en la Figura 4. • EJEMPLO 5 20 ANÁLISIS ELECTROFISIOLÓGICO Y EXPRESIÓN DE RECEPTORES P2X3 RECOMBINANTES EN OOCITOS XENOPUS Los oocitos de Xenopus lavéis se prepararon e inyectaron con ADN receptor de la presente invención, y las respuestas del receptor se midieron utilizando fijación de voltaje de dos electrodos, de acuerdo a los 25 procedimientos previamente descritos (Briggs ef al., (1 995), supra). Los oocitos se mantuvieron a 17-18°C en solución de Barth normal (90 mM de NaCI, 1 mM de KCl, 0.6 mM de NaNO3, 0.74 mM de CaCI2, 0.82 mM de MgCI2, 2.4 mM de NaHCO3, 2.5 mM de piruvato de sodio, y 10 mM de regulador Na de N-(2-hidroxi-etil)-piperacin-N'-(2-ácido etanosulfónico) ("HEPES"), pH final 7.55). Las respuestas se midieron en un potencial de sujeción de -60 mV en solución de Barth modificada que contiene 10 mM de BaCI2 y que carece de CaCI2 y MgCI2 (pH final 7.4). Sin embargo, en algunos experimentos, el potencial celular varió intencionalmente con objeto de determinar la relación de corriente-voltaje de respuesta. El agonista se aplicó brevemente utilizando una válvula solenoide controlada por computadora y un aplicador empuje/jale colocado dentro de 200-400 µm del oocito. Las respuestas se registraron por computadora en sincronía con aplicación de agonista. Los antagonistas se incluyeron con agonistas en el aplicador de empuje/jale y se aplicaron al baño por superfusión por al menos 3 minutos antes de la aplicación del agonista. Las respuestas se cuantificaron al medir la amplitud máxima. ADN para la inyección en oocitos fue la inserción de P2X3 de pCADN3.1 preparado como se describe en el Ejemplo 2. El clon creció y preparó a gran escala utilizando el sistema de preparación de ADN maxiprep QIAgen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN se precipitó por etanol y se resuspendió en el regulador TE. Cuatro análisis funcionales de receptores P2X3 humanos, 1 0 ng de ADN de P2X3 humano preparado como se describe arriba se inyectaron en el núcleo de los oocitos Xenopus. Los oocitos se incubaron en solución de baño de Barth normal que contiene 1 00 µg/ml de ,^^ ¡a. a *~ - - i**Au^?^a gentamicina por 2-7 días después de la inyección. La respuesta a 10 µM de ATP se registró entonces. Los resultados de la expresión anterior y el análisis muestran que los receptores de la presente invención son funcionales. Los oocitos • 5 inyectados con ADN de P2X3 humano respondieron a la aplicación extracelular de ATP al mostrar una corriente de catión de conductancia mezclada (100-6000 nA). Los oocitos inyectados con una cantidad apropiada de agua no respondieron a ATP. Un EC50 ATP aproximado de 0.7 µM se obtuvo de relaciones de concentración-respuesta (0.01 -1 000 10 µM) de estos oocitos. Las relaciones de corriente-voltaje inducidas por {f ATP también se registraron de estos oocitos. Estos revelaron un potencial inverso de aproximadamente cero mv, con rectificación interior pronunciada registrada en los potenciales de membrana negativa. Otros agonistas de receptor de P2X, a, ß-metileno-ATP, 15 produjeron corrientes máximas similares a aquellos evocados por ATP, aunque es ligeramente menos potente (EC50= 2.1 µM). La aplicación de un tercer agonista del receptor de P2X, 2-metiltio-ATP, fue ligeramente menos potente (EC5o= 0.4 µM) que ya sea ATP o a, ß-metileno-ATP. El antagonismo funcional de las respuestas se determinaron por la aplicación 20 de los agonistas del receptor de P2X no específicos o ácido piridoxal- fosfato-6-azofenil-2'-4'-disulfónico. Ambos antagonistas produjeron un bloque completo de corrientes inducidas por ATP (0.3 µm), con suramin que despliega potencia incrementada (IC50= 0.3 µM relativa a PPADS (IC50= 1 µM). 25 En resumen, la inyección del ADN del receptor de P2X3 humano en oocitos Xenopus resultó en expresión de receptores de P2X3 funcionales de la superficie celular, y estos receptores funcionan como canales de catión no específicos abiertos de ligando. Estos receptores respondieron al agonista del receptor de P2 extracelular con una potencia 5 de orden de 2-metiltio-ATP > ATP > a,ß-metileno-ATP. También muestra rectificación interior y se bloquea tanto por PPADS de antagonistas de receptor de P2 como suramina. EJEMPLO 6 MEDICIÓN DE LOS NIVELES DE CALCIO INTRACELULAR 10 SUBSECUENTES A EXPOSICIÓN DE CIBACRON AZUL f Los siguientes materiales, líneas celulares y cultivos aplican a este ejemplo y todos los ejemplos que siguen, en donde se observa. Materiales Adenosina 5'-trifosfato disodio (ATP), tetrasodio de 2-metiltio- 15 ATP (2-meSATP), y dilitio de aß-metileno-ATP (aß-ATP) se obtuvieron de Research Biochemicals International (Natick, MA), 2' & 3'-O-(4- benzoilbenzoil)-ATP sal de tetraetilamonio (isómeros mezclados) (BzATP) y cibacron azul se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Luois, • MO). Sulfato G41 8 se obtuvo de Calbiochem-Novabiochem Corpl. (La 20 Joya, CA). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) (con 4.5 mg mi"1 de glucosa y 4 mM de L-glutamina) y el suero de bovino feltal se obtuvieron de Hyclone Laboratories, Inc. (Logan, UTA). Salina regulada de fosfato de Dulbecco (D-PBS) (con 1 mg de ml'1 de glucosa y 3.6 mg de 1 de Na piruvato, sin fenol rojo), higromicina y Lipofectamina se 25 obtuvieron de Life Technologies (Gran Island, NY). Fluo-4 AM se compró tJa lüj i iin iiiriiiiir i i -- "— — '- - - - - - - -i*"*" de Molecular Probes (Eugene, OR). Cultivo celular y líneas celulares estables El cADN del receptor de P2X3 de rata fue 100% idéntico a la ^^ secuencia previamente publicada (Garcia-Guzman ef al., Brain Res. Mol. 5 Brain. Res. 47:59-66 (1997)). El receptor de P2X3 humano fue esencialmente idéntico a aquel reportado por Garcia-Guzman ef al., supra (1997) (# de acceso del Banco Genético Y07683). Una excepción única fue un residuo de aminoácido 126, en donde una arginina se codifica, la secuencia publicada codifica una prolínea en esta posición. Las múltiples 10 replicaciones de clonación del receptor de P2X3 humano produjeron la misma secuencia, sugiriendo que la diferencia observada no es el • resultado de un artefacto de clonación o un error de secuenciación. Las células de astrocitoma humana 1321 N 1 que expresan establemente receptores de hP2X3 o rP2X3 (1321 rX3-3, y 1321 hX3-1 1 , respectivamente) 15 se construyeron utilizando métodos de transfección mediadas por lípido estándar. Todas las líneas celulares se mantuvieron en D-MEM que contiene 10% de FBS y antibióticos como sigue: células 1321 rX3-3, y 1 321 hX3-1 1 , 300 µg ml" 1 G418; y células 1321 rX2-1 , 100 µg ml" 1 higromicina. Las células se desarrollaron a 37°C en un atmósfera húmeda 20 que contiene 5% de CO2. Medición de los niveles de Ca2+ intracelulares La función del receptor de P2X se determinó en la base de incrementos mediados por agonista en concentración de Ca2+ citosólica. Un tinte de quelación de Ca2+ fluorescente (Fluo-4) se utilizó como un 25 indicador de los niveles relativos de Ca2+ intracelular en un formato de 96 cavidades utilizando un Lector de Placa de Formación de Imágenes de Fluorescencia (LIPR, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las células se desarrollaron a confluencia en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades negras y cargaron con la forma de acetoximetiléster (AM) de Fluo-4 (1 µM) en D-PBS por 1 -2 horas a 23°C. Cibacron azul (50 µl de 4x concentración) se agregó 3 min antes de la adición de agonistas (50 µl de 4x concentración) (volumen final = 200 µl). Los datos de fluorescencia se recolectaron en intervalos de 1 a 5 segundos a través de cada paso del experimento. Los datos mostrados en la Figura 5a se basan en el incremento máximo en unidades de fluorescencia relativas en comparación con la fluorescencia base. Las curvas de concentración-efecto para todos los tipos celulares se muestran como un porcentaje de la señal mediada por ATP máxima medida en la ausencia de cibacron azul. Los datos de respuesta de concentración se analizaron utilizando una ecuación Hill logística de cuatro parámetros en Prisma GraphPad (San Diego, CA). Todos los datos se expresan como promedio + sem. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t del Student (P < 0.05) en la base de ios valores plC50 Como se evidencia por los datos, la activación de ATP causó un incremento rápido y transitorio en los niveles de Ca2+ citoplásmico. Las formas de las curvas de influjo de Ca2+ fueron cuantitativamente similares a los datos electrofisiológicos (ver Ejemplo 9 de abajo) medidos en oocitos Xenopus (Bianchi ef al., 1 999). La pre-incubación de las células por 3 min con cibacron azul (10 µM) condujo a un incremento de 3-7 veces en la ká-*^. . . -^ - .. -. *. *. . * » -^£^¡tíl?^?^ß magnitud de la respuesta activada de ATP máxima (Emax), como se mide tanto por influjo CA2+ (Fig. 5a) y comentes de transmembrana (Fig. 5b). El cibacron azul medió una potenciación de 307 veces similar de la respuesta máxima de ATO utilizando células que expresan el homólogo del receptor 5 P2X3 (datos no mostrados). Los experimentos piloto mostraron que el conjunto del efecto de cibacron azul ocurrió en menos de 1 min, de esta manera un tiempo de pre-aplicación de 3 min se selección para asegurar la actividad completa.

El cibacron azul solo mostró efecto no intrínseco en influjo de Ca2+ en 10 concentraciones de hasta 200 µM y no afecta de manera medible el pH del fc regulador de análisis (pH 7.2) en concentraciones de hasta 1 mM. El efecto de potenciación de cibacron azul fue específico para el receptor de P2X3, ya que las concentraciones de cibacron azul hasta 1 mM no alteran la activación del agonista de los receptores de hP2X? , hP2X2, y hP2X7 15 expresados en células 1321 N1 (datos no mostrados). Cibacron azul (10 µM no aumenta la potencia de la activación de ATP del influjo de Ca2+ mediado por el receptor hP2X4 en la presencia de concentraciones sub- máximas de agonista , como se ha descrito previamente (Miller ef al., 1998). Sin embargo, ningún incremento en la respuesta de hP2X4 activada 20 por ATP se observó. EJEMPLO 7 CARACTERIZACIÓN DE LA ELECTROFISIOLOGÍA DEL RECEPTOR DESPUÉS DE LA EXPOSICIÓN A CIBACRON AZUL Electrofisiología: 25 El subtipo del receptor hP2X3 expresado en oocitos Xenopus Hm^ se caracterizó utilizando técnicas de fijación de voltaje de dos electrodos. Brevemente, los oocitos se desnudaron de células foliculares sobrepuestas y las inyecciones intranuclear de 12 ni de Cadn (1 µg/µl) se realizaron en cada oocito. Los oocitos se utilizaron para los registros de 5 1 -5 días después de la inyección y se perforaron (35 ml/min) con una solución de registro estándar que contiene (mM): 96 NaCI, 2.0 KCl, 1 .8 CaCI2, 1 .0 MgCI2, 5.0 Na-piruvato y 5.0 Na-Hepes (pH 7.4). Los electrodos (1 .5-2.0 MO) se llenaron con 120 mM de KCl. ATP se aplicó utilizando una pipeta de aplicación de medicamento activado por solenoide colocada 10 cerca del oocito en la cámara de perfusión. AGTP se aplicó cada 3.5 min, ^b y la duración de aplicación típicamente duró 5 seg. Al Cibacron azul se aplicó un baño por al menos 3 min antes de que se co-aplique con ATP a través de la pipeta de medicamento. Las células se fijaron por voltaje a - 60 mV. Los datos se adquirieron y analizaron utilizando software pClamp 15 (Axon Instruments, Foster City, CA). Como evidencia por los datos de la Figura 5b, cibacron azul (1 µM) produjeron una potenciación de la amplitud máxima de 1 µM de corrientes activadas por ATP a 213 + 49% de control (Fig. 5b). El efecto ^ de cibacron azul en Emax de la corriente de transmembrana mediada por el 20 receptor hP2X3 duró más, de manera que la potenciación completa se observó hasta 9 min después de una breve exposición (1 min) a cibacron azul. El inicio del efecto de potenciación por cibacron azul fue rápido (<1 min; datos no mostrados). La co-aplicación de cibacron azul y ATP resultó en la potenciación de la señal de influjo de Ca2+, aunque con una potencia 25 aparente inferior y Emax que las observadas después de un periodo de pre- ^^?^^.*^^. ^ •-t--i-— ¿ -"- - — incubación de 3 min. Cibacron azul (10 µm) no tuvo efecto aparente en las cinéticas de la respuesta de flujo de Ca2+ activada por ATP (Fig. 5a) o en las cinéticas de densibilización aguda del receptor hP2X3 (Fig. 5b). g La potenciación de los receptores de P2X3 humanos activados 5 por ATP por cibacron azul fue dependiente de la concentración (Fig. 6), con una respuesta máxima media observada (EC5o) de 1.4 + 0.5 µM (Fig. 6). Además de aumentar el Ema? de la respuesta del receptor de hP2X3 activado por ATP, el cibacron azul también causo un cambio hacia la izquierda dependiente de la concentración de la curva de concentración- 10 efecto de ATP (Fig 6). En la presencia de 3 µM de cibacron azul, la magnitud de la señalización del receptor de hP2X3 activado por ATP se incrementó más de 3 veces (Emax = 330 + 5%) mientras que el EC50 de ATP se redujo de 356 + 1 00 nM a 46 + 8 nM (Fig 6). El ECso de cibacron azul requerido para mediar la potenciación 15 fue similar irrespectivo del agonista utilizado para activar los receptores de hP2X3. El Emax de la activación del receptor de hP2X3 por concentraciones máximas (1 0 µM) de ya sea ATP, BzATP, 2-meASTP o a,ß-meATP, todas de las cuales son agonistas conocidos para el receptor • de P2X3, fueron similares en todas las concentraciones de cibacron azul 20 (Fig . 7). El cibacron azul no confiere actividad agonista a nucleótidos previamente mostrados inactivos en el receptor de P2X3 (García-Guzman ef al., supra (1997); Bianchi ef al., Eur. J. Pharmacol. 376: 127-1 38 (1 999), incluyendo ADP, UTO y UDP (1 00 µM, datos no mostrados). El efecto de potenciación de cibacron azul no se afectó por la eliminación de los 25 almacenamientos de Ca2+ intracelular utilizando tapsigargina pero se abrogó completamente en la presencia de EGTA extracelular, sugiriendo que la magnitud incrementada de la respuesta activada por ATP se debe a flujo de Ca2+ incrementado a través de la membrana de plasma (datos no ^^ mostrados). 5 EJEMPLO 8 HABILIDAD DE LOS TINTES DE TRIACENO PARA POTENCIAR LA ACTIVACIÓN DEL RECEPTOR POR ATP Los tintes de triaceno se relacionan estructuralmente con cibacron azul, incluyendo basilen azul, reactivo azul 5, reactivo rojo 2, 10 reactivo naranja 14 y reactivo amarillo 2, se probaron por su habilidad para potenciar la activación del receptor hP2X3 por ATP (Fig. 8). Mientras • que el reactivo naranja 14 y el reactivo amarillo 2 mostraron poca o nada de actividad de potenciación, basilen azul, reactivo azul 5 y reactivo rojo mediaron la potenciación del receptor de hP2X3 significativo. Los 15 derivados de ácido sulfónico de antraquinona, basilen azul y reactivo azul 5, mostraron que las concentraciones máximas medias de la potenciación del recepto de hP2X3 similar a cibacron azul (valores EC50 de 1 .2 + 0.5 µM, respectivamente). El reactivo rojo 2 fue significativamente potente f como un potenciador de activación del receptor de hP2X3 por ATP (EC50 = 20 55 + 10 µM) (Fig. 8). Ninguno de los tintes de triaceno probados fueron intrínsecamente fluorescentes, ni afectaron el pH del regulador de análisis en concentraciones de hasta 1 mM. EJEMPLO 9 EFECTO DE CIBACRON AZUL EN LA ACTIVIDAD INHIBIDORA DE PPADS 25 Y EFECTO DE PPADS EN ACTIVIDAD DE POTENCIACIÓN DE CIBACRON - rt' ft **' -' - - ^ - .. . ^ i^ . • - . _^- AZUL La inhibición de los receptores de hP2X3 por PPADS, un antagonista del receptor de P2 selectivo, se ha demostrado previamente ^. Garcia-Guzmán et al.. Brain Res. Mol. Brain. Res. 47:59-66 (1997)). En la F 5 ausencia de cibacron azul, la activación de hP2X3 mediada por ATP inhibido con una concentración máxima media (IC50) de 8.6 + 3 µM (Fig. 9a). El pre-tratamiento de las células que expresan hP2X3 con 10 µM de cibacron azul incrementaron tanto la señal activada por ATP (Ema?=437 + 6%) y el IC50 aparente (51 ± 3 µM) de PPADS. Para determinar si cibacron 10 azul media este efecto al incrementar la potencia efectiva de ATP, el -f experimento se realizo utilizando 1 , 3, 10 o 30 µM de ATP. Para todas las concentraciones de ATP, cibacron azul produjo un cambio hacia la derecha dependiente de la concentración similar de las curvas de concentración- efecto de PPADS. Por ejemplo, en la ausencia de cibacron azul, los 15 valores de IC50 aparentes para PPADS en cada concentración de ATP fueron 3.64 ± 1 . 1 µM (1 µM de ATP), 3.1 1 ± 1 .0 µM (3 µM de ATP), 4.81 ± 1 .1 µM (10 µM de ATP), 2.67 ± 0.7 µM (30 µM de ATP), que confirman que PPADS es un antagonista no competitivo en el receptor de P2X3. De • manera similar, PPADS se encontró que no es competitivo con ATP en 20 concentraciones de cibacron azul hasta 100 µM (datos no mostrados). El efecto de cibacron azul en la potencia inhibidora de PPADS se encontró entonces que es independiente de concentración de ATP, sugiriendo que el cibacron azul y PPADS muestra efectos mutuamente exclusivos en el receptor de hP2X3. 25 Por el contrario de este experimento, el efecto de PPADS en | K ^ l± ^^sj^^ ^ la concentración de cibacron azul del receptor de hP2X3 se determinó (Fig. 9b). PPADS causó un cambio hacia la derecha dependiente de la concentración de la curva de concentración-efecto de cibacron azul, mientras que reduce simultáneamente la magnitud inicial de la activación 5 de ATP (Fig. 9b). Aunque 50 µM de PPADS fue suficiente para inhibir completamente los receptores de hP2X3 activados por ATP, cibacron azul supera la actividad inhibidora de PPADS en una manera dependiente de la concentración. EJEMPLO 10 10 EFECTO EN CIBACRON AZUL COMO MODULADOR DE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR EN RECEPTORES DESENSIBILIZADOS AGUDAMENTE Y • NO DESENSIBILIZADOS La potencia de cibacron azul como un modulador de la actividad del receptor de hP2X3 se determinó en receptores no 15 desensibilizados y desensibilizados agudamente (Fig, 1 0). Las células 1321 N 1 -hP2X3 se expusieron a 10 µM de ATP por 1 min para desensibilizar agudamente los receptores de hP2X3. Como se describe en la Fig. 1 0, el EC5o de cibacron azul requerido para potenciar completamente receptores de hP2X3 no desensibilizados fue 1 .1 ± 0.2 µM 20 (Fig. 10). Sin embargo, los receptores de hP2X3 agudamente desensibilizados parecieron ser menos sensibles a la potenciación mediada por cibacron azul (EC50 = 6.4 ± 0.5 µM), de manera que 100 µM de cibacron azul se requirió para lograr una señal máxima. Sin considerar el estado inicial de los receptores de hP2X3 (agudamente desensibilizado 25 o no desensibilizado), el pre-tratamiento de cibacron azul últimamente condujo a una actividad máxima activada por el agonista, sugiriendo que el tamaño del grupo de receptores fue comparable bajo ambas condiciones (Fig. 10): ^ EJEMPLO 1 1 5 HABILIDAD DE CIBACRON AZUL PARA RESTAURAR LA ACTIVACIÓN FUNCIONAL A RECEPTORES AGUDAMENTE DESENSIBILIZADOS DESPUÉS DE LA EXPOSICIÓN A ATP Las células que expresan hP2X3 se desensibilizaron por el pretratamiento con ATP (1 0 µM) por 1 min, enjuagaron para remover el 10 ATP extracelular y, después de varios periodos de tiempo de incubación con o sin cibacron azul, los receptores desensibilizados se recambiaron • con ATP. La Figura 1 1 a demuestra la falta de respuesta de hP2X3 a un segundo cambio con ATP inmediatamente después de la desensibilización (tiempo 1 .5 min). La extensión del tiempo de incubación entre el cambio 15 subsecuente y la desensibilización con ATP revelaron la recuperación progresiva de la activad del receptor de hP2X3, acercándose a la señal de control (no desensibilizado) por 61 .5 min. La adición de 50 µM de cibacron azul durante el periodo de } incubación después de que la desensibilización inducida por ATL parece 20 incrementar tanto la potencia aparente de ATP y la velocidad de recuperación de desensibilización (Fig 1 1 b). Después de una incubación de 1 5 min con cibacron azul, las células desensibilizadas mostraron casi actividad completa en comparación con las células de control (no desensibilizadas), indicando un periodo refractario considerablemente más 25 corto después de la desensibilización. Observe que la inclusión de ggg^gj ¡H^^^^ >^*^¡* i m. *^ ~-^ ,a cibacron azul en el regulador de incubación conduce i) velocidad aumentada de recuperación de receptores hP2X3 de desensibilización, ii) ECma final incrementado, y iii) potencia incrementada del agonista (Fig. 1 1 b). • 5 La Figura 1 1 c muestra la señal del receptor máxima en varios puntos de tiempo después de la desensibilización aguda como un porcentaje de la señal de control (no desensibilizada) en la presencia y ausencia de 50 µM de cibacron azul (ver líneas rayadas en las Figuras 1 1 a y b). Las vidas medias calculadas (t1 2) del periodo refractario (definido 10 como el tiempo requerido para restaurar 50% de la actividad observada en 60 min) fueron 15.9 min (Kt = 0.0436 min"1) en la ausencia, y 2.6 min (Kt = • 0.2626 min" )en la presencia, de cibacron azul. De esta manea, el cibacron azul incrementa la velocidad de recuperación del receptor de hP2X3 de la desensibilización de 6 veces. 15 EJEMPLO 12 EFECTOS NOCICEPTIVOS DE BzATP Sujetos. Ratas Sprague-Dawley macho adultas, 230-350 g, (Charles River, Wilmington, MA) se alojaron en grupos de cinco por caja y f se les dio acceso da agua y alimento. Los animales estuvieron en un ciclo 20 de 12 hr de luz obscura de 6:00 - 18:00 hr. Los animales se utilizaron solamente una vez en cada experimento. Todos los procedimientos experimentales y los procedimientos que manejan animales se aprobaron por un comité de uso y cuidado animal institucional (IACUC). Medicamentos: Se obtuvo sulfato de morfina de Mallinckrodt, 25 Inc. (St. Louis, MO) y se disolvió en una solución salina al 0.9%. i W Bf^-^ Adenosina 5'-trifosfato disodio (ATP), 2-metiltio-ATP tetrasodio (2- meASTP), y aß-metileno ATP dilitio (aß-meATP ) se obtuvieron de Research Biochemicals International (Natick, MA); 2' & 3'-O-(4- benzoilbenzoil)-ATP sal de tetraetilamonio (isómeros mezclados) (BzATP) • 5 y cibacron azul se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Luois, MO). TNP-ATP y Fluo-4AM se compararon de Molecular Probes (Eugene, OR). Todos los compuestos se disolvieron recientemente y diluyeron en 0.9% de salina. Sulfato G418 se obtiene de Calbiochem-Novabiochem Corp (La Joya, CA). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) 10 (con 4.5 mg mi" 1 de glucosa y 4 mM de L-glutamina) y suero de bovino fetal se obtuvieron de Hyclone Laboratories, Inc. (Logan, UTA). La salina • regulada de fosfato de Dulbecco (D-PBS) (con 1 mg mi"1 de glucosa y 3.6 mg l 1 de piruvato de Na, sin fenol rojo), higromicina y Lipofectamina se obtuvieron de Life Technologies (Grand Island, NY). 15 Prueba nociceptiva: Las respuestas nociceptivas se valoraron utilizando procedimientos previamente descritos para la prueba de formalina de dolor persistente inducido químicamente (Abbot ef al. , Pain . 60:91 -1 02 (1 995); Tjosen ef al., Pain 51 :5-17 (1992)). Los animales experimentalmente inocentes se colocaron en cajas de plexividrio 20 individuales y se dejaron 30 minutos para aclimatarse al ambiente de prueba. Después de este periodo, los animales recibieron inyecciones subcutáneas de ya sea solución de formalina (1 ,2.5,5%), dosis diferentes de BzATP solo, o en combinación con TNP-ATP o cibacron azul, en la superficie dorsal de la pata oculta derecha utilizando un aguja calibradora 25 de insulina (29G 1 /2). El volumen de inyección fue 50 µl para todos los tratamientos. Para valorar la nocicepción aguda, fos animales se observaron inmediatamente después de las inyecciones del medicamento y el número de conductas de contracción (extracciones de la pata) se registraron por un periodo de 1 minuto. Las observaciones adicionales se • 5 condujeron en intervalos secuenciales de 5 minuto durante los primeros 15-20 minutos después de las inyecciones del medicamento (Fase I, fase aguda de la prueba de formalina). Para algunos experimentos, las observaciones comenzaron 30 minutos después de la inyección de formalina y continuaron por 20 minutos después (Fase II, fase persistente 10 de la prueba de formulación). Para cada experimento individual, 6 ratas se utilizaron en grupos de control y experimental separados. Las • respuestas de contracción acumulativas promedio se analizaron por análisis de vapanza y comparación post-hoc se condujeron utilizando pruebas de diferencia menos significativas (GB-STAT, Dynamics 15 Microsystems, Inc. , Silver Sprinh, MD). El significado estadístico se determinó en P < 0.05. La administración intradérmica de BzATP (1 00-1000 nmol/pata) en la superficie dorsal en la pata oculta de rata produjo una respuesta de contracción de la pata dependiente de la dosis (Figura 12). • 20 La magnitud de la contracción de la pata nociceptiva después de 1 000 nmol/pata de BzATP fue equivalente a aquella observada después de la administración intradérmica aguda de 5% de formalina (Fase I de la prueba de formalina). La duración de este efecto duró poco con la mayoría de las respuestas de contracción de la pata ocurriendo en primer intervalo de 5 25 minutos después de la inyección del medicamento. Después de 20 ^^^^^^^jjj ¡ g ¿gjjg^ minutos de la administración del medicamento el número respuestas de contracción de pata inducido por BzATP no fue significativamente diferente (P > 0.05) de los animales inyectados con el vehículo. BzATP no ^ produce una segunda fase de conducta de contracción de la pata 5 nocifensiva prolongada (datos no mostrados) como aquella que se observa característicamente después de la administración de formalina intradérmica (Fase II de la prueba de formalina) (Tsojen ef al., Pain, 51 :5- 1 7 (1 992). Sawynok e tal., Eur. J, Pharmacol. 330: 1 15-121 (1 997). La habilidad de la BzATP intradérmica para producir conducta nocifensiva en 10 la rata se soporta por la habilidad de la morfina sistemáticamente administrada dependiente de la dosis (ED5u = 4 mg/kg, s.c.) reducen • BzATP (1000 nmol/pata) inducida por la contracción de la pata oculta (datos no mostrados). Los efectos nociceptivos de BzATP fueron similares a aquellos 15 de otros agonistas de receptor P2 incluyendo a, ß-meATP (Figura 13) que es menos susceptible a la degradación metabólica que los otros agonista del receptor de P2 (Ralevic eí al., Pharmacol. Rev. 50:413-492 (1 999)). Otros agonistas de nucleótido que incluyen ATP y 2meSATP también fl produjeron la contracción de la pata nociceptiva aguda (Figura 1 3) pero 20 las respuestas máximas en las dosis probadas fueron significativamente menores a aquellas observadas para BzATP. ADP se ha mostrado previamente que no activa los receptores P2X3 (Bianchi eí al., Eur. J. Pharmacol. 376: 127-1 38 (1 999)) y la administración intradérmica de ADP no produce ninguna respuesta nociceptiva (P > 0.05). Este patrón de 25 actividad in vivo es consistente con las evaluaciones farmacológicas ^ ^^^S ^m^^^ . i v. t « ^^ ( - .. ^ — > . ~~—u» previas de los agonistas del receptor de P2 prototípico para activar el receptor de P2X3 de rata recombínate in vitro. (Bianci et al. supra (1999)). El orden de potencia para estos agonistas del receptor de P2 in vitro fue BzATP (EC50 = 32 nM) > 2meSATP (EC50 = 220 Nm) > ATP (EC50 • 5 = 340 nM) > a,ß-meATP (EC50 = 510 nM) » ADP (EC50 =>100,000 Nm) (Bianchi ef al., supra (1 999). Un perfil farmacológico similar también se observo para el receptor P2X3 humano (Bianchi ef al., supra (1999)). EJEMPLO 1 3 EFECTOS ANTINOCICEPTIVOS DE TNP-ATP 10 El ejemplo 12 anterior presenta el procedimiento utilizado para administrar TNP-ATO a las ratas. • En términos de resultados, el nuevo antagonista del receptor P2X, TNP-ATP inhibió potencialmente el flujo de calcio estimulado por BzATP (ver Ejemplo 1 ) en células 1 321 N 1 que expresan el receptor de 15 P2X3 de rata (Figura 14). Como se ha mostrado para el receptor de P2X3 humano (Lewis et al., Br. J. Pharmacol. 124: 1463-1466 (1 998)), el retiro secuencial de los grupos de fosfato terminales reduce significativamente la potencia en el receptor oe P2X3 de rata con TNP-AMP mostraron poca • actividad inhibidora en concentraciones de hasta 30 µM. Un orden similar 20 de potencia para estos antagonistas de receptor de P2X se observó en el receptor de P2X2 3 de rata (datos no mostrados). La co-administración de TNP-ATP intradérmico (30-300 nmol/pata) con BzATP (1000 nmol/pata) en la superficie dorsal de la pata oculta de la rata, produjo una reducción dependiente de dosis y 25 significativa (P < 0.05) en la conducta de contracción de la pata nociceptiva (Figura 15). Los efectos antinociceptivos de TNP-ATP parecen ser farmacológicamente específicos ya que la co-administración de TNP-AMP con BzATP no reducen la conducta de contracción de la pata inducida por BzATP. 5 De manera similar, la co-administración de TNP-ATP con 5% de formalina en la superficie dorsal de la pata oculta de la rata también dependiente de la dosis reduce las conductas nocifensivas en la porción aguda (Fase I) de la prueba de formalina (Figura 16). Además, los efectos antinociceptivos de TNP-ATL también fueron evidentes en la fase 10 persistente (Fase II) de la prueba de formalina en donde una reducción significativa del 30% en la contracción de la pata inducida por formalina se • observa en ambas dosis (30 y 1 00 nmol/pata) de TNP-ATP. Consistente con su actividad anticonceptiva contra BzATP, TNP-ATP, pero no TNP- AMP, atenuó las respuestas nociceptivas tanto en los componentes agudo 15 (Fase I) como persistente (Fase II) de la prueba de formalina.

EJEMPLO 14 AUMENTO DE LA ACTIVACIÓN DEL RECEPTOR DE P2X,/3 Y P2X3 POR CIBACRON AZUL • 20 El ejemplo 6 ilustra el procedimiento utilizado para evaluar los efectos de cibacron azul en los receptores de P2X3 y P2X2 3. Con respecto a los resultados observados, consistentes con sus acciones alostéricas en el receptor de P2X3 humano (ver Ejemplos I y 25 II, anteriores), el cibacron azul produjo un incremento dependiente de la concentración tanto en flujo calcio mediado por BzATP (1 µM) como a,ß- meATP (10 µM) (valores EC 0 = 580 y 720 nM, respectivamente) en células 1321 N que expresan el receptor P2X3 de rata (Figura 17). Aunque • los efectos de aumento máximo de cibacron azul se observaron en 5 concentraciones hasta 1 00 µM, las concentraciones más elevadas generalmente fueron menos eficaces para aumentar la activación del agonista del receptor de P2X3 de rata (datos no mostrados). Este último fenómeno puede ser atribuible a la actividad antagonística intrínseca de cibacron azul (Ralevic ef al., Pharmacol. Rev. 50:41 3-492 (1998)). 10 Cibacron azul sobre el rango de concentración de 0.3 -10 µM l también aumentó la activación del receptor de P2X2 3 de rata por BzATP (1 M) y a, ß-meATP (10 µM) (Figura 17). Sin embargo, estos efectos fueron bifásicos con concentraciones de cibacron azul mayores a 10 µM que producen menos aumento de la activación mediada por el agonista del 15 receptor de P2X2/3 Adicionalmente, las concentraciones de cibacron azul mayores a 30 µM antagonizaron la activación del receptor de P2X2 3 por a, ß-meATP. Una contribución de los receptores de P2X2 homoméricos para estos efectos similares tanto en la activación mediada por BzATP F como a, ß-meATP de los receptores de P2X2 3 y a, ß-meATP no activa los 20 receptores de P2X3 J, Pharmacol 376: 127-138 (1 999). Consistente con estas observaciones, cibacron azul se encontró que solamente muestra la activación inducida por ATP del receptor de P2X3 de rata (IC50 = 8 µM) (datos no mostrados). Adicionalmente, se ha mostrado previamente que el cibacron 25 azul no aumenta la activación del agonista de los receptores de P2XL P2X2, y P2X7 (Alexander ef al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 291 : 1 135-1 142 (1999)). Aunque el cibacron azul produjo un aumento de 10 veces de la activación del receptor de P2X3, solamente un incremento de 2.5-4.5 veces • 5 en la activación del receptor de P2X2 3, se observó. Aunque las razones exactas para estos efectos diferenciales permanecen dudosas, la actividad del antagonista intrínseco de cibacron azul (Ralevic ef al., Pharmacol. Rev. 50:413-492 (1998)) puede contribuir a las diferencias observadas en la magnitud del aumento holostérico aparente de los receptores P2X2 3 10 P2X3. EJEMPLO 1 5 • EFECTOS PRONOCICEPTIVOS DE CIBACRON AZUL Ya que las concentraciones específicas de cibacron azul pueden aumentar selectivamente la activación de los receptores de P2X3 y 15 P2X2 3 in vitro, como se evidencia por los resultados arriba presentados, los estudios adicionales se condujeron para investigar el potencial de cibacron azul para aumentar los efectos nociceptivos de BzATP en la rata.

Consistente con los datos mostrados en la Figura 12, ia administración intradérmica de BzATP solo (1 0-300 nmol/pata) en la pata oculta de la rata 20 produjo un incremento dependiente de la dosis en conducta nanociceptiva (Figura 17a-d). La administración intradérmica de cibacron azul solo (1 0- 300 nmol/pata) produjo solamente una respuesta nociceptiva estadísticamente significativa, suave en una dosis de 1 00 nmol/pata (Figura 1 8a-d). 25 La co-administración intradérmica de cibacron azul con BzATP en la pata oculta de la rata produjo efectos bifásicos y significativos en la conducta de contracción de la pata nociceptiva a los efectos nociceptivos de BzATP solo (Figura 18a-d). A una dosis baja de BzATP (1 0 nmol/pata), ^* cibacron azul produjo un aumento pequeño, pero estadísticamente 5 significativo (P < 0.05) en la respuesta nociceptiva en comparación con los efectos de BzATP solo (Figura 18a). Los efectos pronociceptivos de cibacron azul fueron significativamente mayores cuando se combinaron con una dosis mínimamente nociceptiva de BzATP (30 nmol/pata) (Figura 17b). En una dosis más elevada de BzATP (100 nmol/pata), la habilidad 10 de cibacron azul para aumentar la nocicepción se observó solamente en la g^ dosis de 30 nmol/pata (Figura 17c). En contraste, la co-administración intradérmica de cibacron azul con una dosis elevada de BzATP (300 nmol/pata) produjo una inhibición dependiente de la dosis de las respuestas de contracción de la 15 pata en comparación con los efectos nociceptivos de BzATP solo (Figura 18d). EJEMPLO 16 AUMENTO DE NOCICEPCIÓN DE FORMALINA POR CIBACRON AZUL j Ya que las dosis intermedias de cibacron azul (30 y 100 20 nmol/pata) se encontraron que son más efectivas para aumentar los efectos nociceptivos de BzATP intradérmico, estas dosis de cibacron azul también se examinaron por su habilidad para aumentar la nocicepción en la prueba de formalina. En la fase aguda (Fase I) una respuesta nociceptiva dependiente de dosis y significativa (Figura 16a). La co- 25 administración del cibacron azul intradérmico (30 y 100 nmol/pata) con varias concentraciones de formalina (1 ,2.5 y 5%) también produjeron mayor nocicepción en la fase aguda (Fase I) de la prueba de formalina en comparación con los efectos de formalina sola (Figura 19a). Sin embargo, estos efectos parecen ser aditivos con la formalina ya que una interacción • 5 significativa entre los efectos nociceptivos de la formalina y cibacron azul no se observó (P > 0.05 (Figura 19a). Durante el componente nociceptivo persistente (Fase II) de la prueba de formalina, el cibacron azul intradérmico solo no produce una respuesta nociceptiva significativa (P < 0.05) (Figura 19b). Sin embargo, 10 la co-administración de cibacron azul (30 y 100 nmol/pata) con formalina (1 y 2.5%) produjo conducta de contracción de la pata significativamente mayor relativa a los efectos nociceptivos de ya sea formalina o cibacron azul administrado solo (Figura 19b). En esta porción persistente de la prueba de formalina, cibacron azul significativamente potenció los efectos 15 nociceptivos de 1 % y 2.5% de formalina como se indica por una interacción significativamente (P < 0.05) mayor que la interacción aditiva entre los efectos nociceptivos de formaiina y cibacron azul. A una dosis mínimamente nociceptiva de formalina (1 %), los efectos pronociceptivos de cibacron azul fueron bifásicos con 30 nmol/pata de cibacron azul que 20 produce un aumento significativamente mayor de nocicepción persistente en comparación con la dosis elevada de cibacron azul (100 nmol/pata) (Figura 19b). La administración intradérmica de las dosis inferiores de formalina, sin embargo, la co-administración de cibacron azul con esta dosis de formalina no produjo un aumento adicional de conducta de 25 contracción de la pata.

Los efectos de aumento pro-nociceptivos de cibacron azul parecen ser farmacológicamente específicos ya que el análogo de cibacron azul estructuralmente similar, reactivo naranja, que no modula ^ alostéricamente la activación del receptor de P2X3 (Alexander ef al, ¡ 5 Pharmacol. Exp. Ther. 291:1135-1142 (1999), no producen la nocicepción sola después de la administración intradérmica (30 y 100 nmol/pat) y no tuvo efecto en la contracción de la pata nociceptiva persistente o agudo cuando se co-administra con formalina (datos no mostrados). • ?t»¿ M?*? lMti~M ,. .. . . *,.*. ... .. .. ?.I........ .-.... ., , . ... .. -. . .*3i®**-*, LISTADO DE SECUENCIAS <110> Abbott Laboratories Jarvis, Michael P. Lynch, Kevin J. Burgard, Edward C. Vanbießen, Timothy Kowaluk, Elizabeth A. <120 > RECEPTOR DE P2X3, MÉTODOS PARAALTERAR LAACTIVIDAD DEL RECEPTOR P2X3YSUS USOS <130? 6293.PC.02 <140> PCT/US00/10919 <141> 2000-04-21 <150> US 60/130,339 <151> 1999-04-21 <160> 17 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 229 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_característica <222> (103 ) . . . (103 ) <223> n = a o g o c o t/u, desconocido u otro <221> misc_caracteríetica <222> (106) . . . (106 ) <223> n - a o g o c o t/u, desconocido u otro <400> 1 cccgaatcgg tggactgctt ctccactgtg gtctggtcgc tggggtacac tgggttggtc 60 aaagccgcga ttttcagtgt agtctcattc acntgnaggc gaaagagctg gtgttgtcaa 120 gttctgacta tgggcaatgt cctcttttgt gaccccattt gacagactca gcagtgggcg 180 cccatgacct agtcatgagg ggagccagga catctgtgtg atcccaagg 229 <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213 > Secuencia Arricia I <220> <223> Carga de Inicio 1s <400> 2 tttaccaacc cagtgtaccc 20 ^^jjjji^^^^ <210> 3 <211> 20 <212> ADN < 13> Secuencia Arf icial <220> < 223 > Carga de Inicio 2s • <400> 3 accacagtgg agaagcagtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Arficial <220> <2 3 Carga de Inicio 3as <400> 4 gaatcggtgg actgcttctc 20 <210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Arficial <220> <223> Carga de Inicio 4as <400> 5 cgattttcag tgtagtctca ttc 23 <210> 6 <21Í> 20 <212> ADN <213> Secuencia Arficial <220> <223> Carga de Inicio das <400> 6 ggggtacact gggttggtaa 20 <210> 7 • <211> 48 <212> ADN <213 > Secuencia Arficial <220> <223> Carga de Inicio Amplia 5'RACE <221> misc-caracteristica <222> (36) ... (37) <223> n « a o g o c o t/u, desconocido, u otro <221> miec-caracteríetica .1J. aa <222> (41) . . . (42) <223> n - a o g o c o t/u, desconocido, u otro <221> misc_caracteristica <222> (46) . . . (47) <223> n » a o g o c o t/u, desconocido, u otro <400> 7 cuacuacuac uaggccacgc gtcgactagt acgggnnggg nngggnng 48 <210> 8 <211> 32 <212> ADN <213 > Secuencia Arficial <220> <223> Carga de Inicio Adaptadora Universal <400> 8 cuacuacuac uaggccacgc gtcgactagt ac 32 <210> 9 <211> 37 <212> ADN < 213 > Secuencia Arficial <220> < 223 > Carga de Inicio Adaptadora <400> 9 ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37 <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213 > Secuencia Arficial <220> «c223 > Carga de Inicio Adaptadora Universal Abreviada <400> 10 ggccacgcgt cgactagtac 20 <210> 11 • <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Arficial <220> <223 > Carga de Inicio 5'hP2X3 <400> 11 caccatgaac tgcatatccg acttc 25 <210> 12 <211> 21 <212> ADN '?~r*? ? I?IIÍGÉÉG *-¡ -..-.. , .. . . . - --..»-. - .-»- - --~ - - --»•>- - - ' «»«<rfa <213 > Secuencia Artificial -<220> <223> Carga de Inicio 3'hP2X3 <400> 12 ctagtggcct atggagaagg c 21 • <210> 13 <211> 1272 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <22 > producto 5'RACE que incluye los sitios EcoRI del vector PCR 2.1 <400> 13 ctactactac taggccacgc gtcgactagt aegggggggg gggggggacc ggggacgacc 60 accacctacc tcctcaggct gcggcctcgc gagggccccg gcgcgagagg acccccctct 120 cctgaggcca ccactgggcc cccttctgag tgtcccctga gcactctctc agcatgaact 180 gcatatccga cttcttcacc tatgagacca ccaagtcggt ggttgtgaaa agctggacca 240 tcgggatcat caaccgagta gttcagcttc tgatcatctc ctaetttgta gggtgggttt 300 tcttgcacga gaaggcttac caggtacggg acacagccat taagtcctcg gtggtaacca 360 aggtgaaggg ctccggactc tacaccaaca gagtcatgga tgtgtctgat tacgtgacgc 420 • cacctcaggg cacctcggtc tttgtcatca tcaccaagat gattgttact gaaaatcaga 480 tgcaaggatt ctgcccagag agtgaggaga aataccgctg tgtatcagac agccagtgcg 540 ggcctgagcg cttgccaggg atcctcactg gccgctgcgt gaactacagc tctgcgctcc 600 ggacctgtga gatccagggc tggtgcccca cggaggtgga cacagtggaa acgcccatca 660 tgatggaagc tgagaacttc actattttca tcaagaacag catccgtttc cccctcttca 720 actttgagaa gggaaacctc cttcccaacc tgacagccag ggacatgaag acctgccgct 780 tccacccgga caaggaccct ttctacccca tcttgcgggt aggggacgtg gtcaagtttg 840 cggggcagga ttttgccaaa ctggcgcgca cggggggagt tctgggcatt aagatcggct 900 gggtgtgcga cttggacaag gcctgggacc agtgcatccc caaatactcc ttcacccggc 960 tcgacagcgt ttctgagaaa agcagcgtgt ccccaggcta caacttcagg tttgccaagt 1020 actacaaaat ggaaaatggc agtgagtacc gcaccctcct gaaggctttt ggcatccgct 1080 tcgacgtgct ggtatacggg aatgctggca agttcaacat catccccacc atcatcagct 1140 ctgtggcggc ctttacttct gtgggagtgg gaactgttct ctgtgacatc atcctgctca 1200 acttcctcag gggggccgac cagtacaaag ccaagaagtt tgaggaggtg aatgagacta 1260 cactgaaaat cg 1272 <210> 14 <211> 706 <212> ADN <213 > Secuencia Artificial <220> <223> producto 3'RACE que incluye los sitios EcoRI del vector PCR 2.1 <400> 14 accacagtgg agaagcagtc caccgattcg 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Oye Val Asn Tyr Ser Ser Val Leu 130 135 140 Arg Thr Cys Glu He Qln Qly Trp Cys Pro Thr Glu Val Asp Thr Val 145 150 155 160 Glu Thr Pro He Met Met Glu Ala Glu Asn Phe Thr He Phe He Lys 165 170 175 Asn Ser He Arg Pbe Pro Leu Phe Asn Phe Glu Lys Gly Asn Leu Leu 180 185 190 • Pro Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Lys Thr Cys Arg Phe His Pro Asp 195 200 205 Lys Asp Pro Phe Cys Pro He Leu Arg Val Gly Asp Val Val Lye Phe 210 215 220 Ala Gly Gln Asp Phe Ala Lys Leu Ala Arg Thr Gly Gly Val Leu Gly 225 230 235 240 He Lys He Gly Trp Val Cys Asp Leu Asp Lys Ala Trp Asp Gln Cys 245 250 255 He Pro Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Leu Asp Ser Val Ser Glu Lys Ser 260 265 270 Ser Val Ser Pro Gly Tyr Asn Phe Arg Phe Ala Lys Tyr Tyr Lys Met 275 280 285 Glu Asn Gly Ser Glu Tyr Arg Thr Leu Leu Lys Ala Phe Gly He Arg 290 295 300 Phe Asp Val Leu Val Tyr Gly Asn Ala Gly Lys Phe Asn He He Pro 305 310 315 320 Thr He He Ser Ser Val Ala Ala Phe Thr Ser Val Gly Val Gly Thr 325 330 335 Val Leu Cys Asp He He Leu Leu Asn Phe Leu Lys Gly Ala Asp Gln 340 345 350 Tyr Lys Ala Lys Lys Phe Glu Glu Val Asn Glu Thr Thr Leu Lys He 355 360 365 Ala Ala Leu Thr Asn Pro Val Tyr Pro Ser Asp Gln Thr Thr Ala Glu 370 375 380 Lys Gln Ser Thr Asp Ser Gly Ala Phe Ser He Gly His 385 390 395 <210> 17 <211> 397 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 17 Met Asn Cys He Ser Asp Phe Ph= Thr Tyr Glu Thr Thr Lys Ser Val 1 5 10. 15 Val Val Lys Ser Trp Thr He Gly He He Asn Arg Ala Val Gln Leu • 20 25 30 Leu He He Ser Tyr Phe Val Gly Trp Val Phe Leu His Glu Lys Ala 35 40 45 Tyr Gln Val Arg Asp Thr Ala He Glu Ser Ser Val Val Thr Lys Val 50 55 60 Lys Gly Phe Gly Arg Tyr Ala Asn Arg Val Met Asp Val Ser Asp Tyr 65 70 75 80 Val Thr Pro Pro Gln Gly Thr Ser Val Phe Val He He Thr Lys He 85 90 95 He Val Thr Glu Asn Gln Met Gln Gly Phe Cys Pro Glu Asn Glu Glu 100 105 110 Lys Tyr Arg Cys Val Ser Asp Ser Gln Cys Gly Pro Glu Arg Phe Pro iMm^u 115 120 125 Gly Gly Gly He Leu Thr Gly Arg Cys Val Asn Tyr Ser Ser Val Leu 130 135 140 Arg Thr Cys Glu He Gln Gly Trp Cys Pro Thr Glu Val Asp Thr Val 145 150 155 160 Glu Met Pro He Met Met Glu Ala Glu Asn Phe Thr He Phe He Lys 165 170 - 175 Asn Ser He Arg Phe Pro Leu Phe Asn Pbe Glu Lys Gly Asn Leu Leu • 180 185 190 Pro Asn Leu Thr Asp Lys Asp He Lys Arg Cys Arg Phe His Pro Glu 195 200 205 Lys Ala Pro Phe Cys Pro He Leu Arg Val Gly Asp Val Val Lys Phe 210 215 220 Ala Gly Gln Asp Phe Ala Lys Leu Ala Arg Thr Gly Gly Val Leu Gly 225 230 235 240 He Lys He Gly Trp Val Cys Asp Leu Asp Lys Ala Trp Asp Gln Cys 245 250 255 He Pro Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Leu Asp Gly Val Ser Glu Lys Ser 260 265 270 Ser Val Ser Pro Gly Tyr Asn Phe Arg Phe Ala Lys Tyr Tyr Lys Met 275 280 285 Glu Asn Gly Ser Glu Tyr Arg Thr Leu Leu Lys Ala Phe Gly He Arg 290 295 300 Phe Asp Val Leu Val Tyr Gly Asn Ala Gly Lys Phe Asn He He Pro 305 310 315 320 • Tbr He He Ser Ser Val Ala Ala Phe Thr Ser Val Gly Val Gly Thr 325 330 335 Val Leu Cys Asp He He Leu Leu Asn Phe Leu Lys Gly Ala Asp Hie 340 345 350 Tyr Lys Ala Arg Lys Phe Glu Glu Val Thr Glu Thr Thr Leu Lys Gly 355 360 365 Thr Ala Ser Thr Asn Pro Val Phe Ala Ser Asp Gln Ala Thr Val Glu 370 375 380 Lys Gln Ser Thr Asp Ser Gly Ala Tyr Ser He Gly His 385" 390 395 • ,o¡.a?

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de receptor de P2X3 humano o un receptor que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica a dicha secuencia de polinucleótidos • que codifica dicho receptor de P2X3 humano. 2. Un polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizado porque el polinucleótido es un polideoxiribonucleótido (ADN). 3. Un polinucleótido según la reivindicación 1 , 10 caracterizado porque el polinucleótido es un poliribonucleótido (ARN). 4. Un polinucleótido según la reivindicación 2, • caracterizado porque ei ADN comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15. 5. Una célula huésped que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 o la reivindicación 4. 15 6. Una célula huésped según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha célula se selecciona del grupo que consiste de una célula bacterial, una célula mamífera, una célula de levadura y una célula anfibia. ^ - k 7. Una célula huésped según la reivindicación 6, 20 caracterizada porque la célula es una célula anfibia. 8. Una célula huésped según la reivindicación 6, caracterizada porque la célula es una célula mamífera. 9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 , enlazado operativamente a al menos una 25 secuencia de control que dirige la transcripción del polinucleótido. ¡ ta j 10. El vector de expresión según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho polinucleótido codifica un polipéptido de receptor P2X3, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. 5 1 1 . Una célula huésped que comprende un vector de expresión según la reivindicación 9. 12. Una célula huésped según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula bacterial, una célula mamífera, una célula de levadura y una 10 célula anfibia. 1 3. Una célula huésped según la reivindicación 12, • caracterizada porque la célula es una célula anfibia. 14. Una célula huésped según la reivindicación 12, caracterizada porque la célula es una célula mamífera. 15 1 5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 10. 16. Una célula huésped según la reivindicación 15, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula bacterial, una célula mamífera, una célula de levadura y una • 20 célula anfibia. 1 7. Una célula huésped según la reivindicación 1 6, caracterizada porque la célula es una célula anfibia. 1 8. Una célula huésped según la reivindicación 16, caracterizada porque la célula es una célula mamífera. 25 1 9. Un método para producir un polipéptido de receptor de P2X3 humano, el método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 1 1 por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de dicho polipéptido; y • 5 (b) recuperar dicho polipéptido. 20. Un método para producir un polipéptido de receptor de P2X3 humano, el método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 15 por un tiempo y bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho 10 polipéptido; y (b) recuperar dicho polipéptido. • 21 . Un polipéptido de receptor de P2X3 humano purificado, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. 15 22. Un método para identificar los compuestos que modulan la actividad del receptor de P2X, el método comprendiendo las etapas de: (a) proporcionar una célula que expresa un receptor de P2X que comprende un polipéptido de P2X3 humano; (b) mezclar un compuesto de prueba con el receptor de P2X; y 20 (c) medir ya sea (i) el efecto del compuesto de prueba en la activación del receptor de P2X o la célula que expresa el receptor de P2X, o (ii) la unión del compuesto de prueba a la célula o el receptor de P2X. 25 23. Un método según la reivindicación 22, caracterizado porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula bacterial, una célula mamífera, una célula de levadura y una célula anfibia. 24. Un método según la reivindicación 22, caracterizado 5 porque dicha medición de la etapa (c) (ii) se realiza al medir una señal generada por una porción detectable. 25. Un método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicha porción detectable se selecciona del grupo que consiste de una marca fluorescente, una radiomarca, una marca quimioluminescente y 10 una enzima. 26. Un método según la reivindicación 22, caracterizado • porque dicha medición de etapa (c) (i) se realiza al medir una señal generada por un ion radiomarcado, un reactivo cromogénico, una sonda fluorescente o una corriente eléctrica. 15 27. Un método según la reivindicación 23, caracterizado porque la célula huésped es una célula mamífera . 28. Un método según la reivindicación 23, caracterizado porque la célula huésped es una célula anfibia. 29. Un método según la reivindicación 22, caracterizado • 20 porque el polipéptido de receptor de P2X3 humano comprende la secuencia aminoácidos de SEQ ID NO: 16. 30. Un método para detectar un polinucleótido objetivo de un receptor de P2X3 en una muestra de prueba, el método comprendiendo las etapas de: 25 (a) contactar el polinucleótido objetivo con al menos una sonda de polinucleótido específico del receptor de P2X3 humano o un complemento del mismo para formar un complejo de objetivo-sonda; y (b) detectar la presencia del complejo de objetivo-sonda en la muestra de prueba. 5 31 . Un método para detectar cADN de mARN de receptor de P2X3 humano en una muestra de prueba, comprendiendo el método las etapas de: (a) realizar transcripción inversa con objeto de producir Cadn; (b) amplificar el cADN obtenido de la etapa (a); y 10 (c) detectar la presencia del receptor de P2X3 humano en la muestra de prueba. • 32. Un método según la reivindicación 31 , caracterizado porque dicha etapa de detección (c) comprende utilizar una porción detectable capaz de generar una señal medible. 15 33. Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de P2X3 o una porción del mismo y capaz de hibridizar selectivamente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de receptor de P2X3 humano, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15 o una porción de la misma. 20 34. Un polinucleótido asilado según la reivindicación 33, caracterizado porque el polinucleótido se produce por técnicas recombinantes. 35. Un polipéptido purificado codificado por un polinucleótido de receptor de P2X3 humano, en donde dicho polipéptido 25 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o una porción de la misma. 36. Un polipéptido purificado según la reivindicación 35, producido por técnicas recombinantes. 37. Un polipéptido purificado según la reivindicación 35, • 5 producido por técnicas sintéticas. 38. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al receptor de P2X3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o un fragmento inmunoreactivo de la misma. 39. Un método para detectar receptor de P2X3 humano en 10 una muestra de prueba, el método comprendiendo las etapas de: (a) contactar la muestra de prueba con un anticuerpo o un • fragmento del mismo que se une específicamente al receptor de P2X3 humano, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un complejo resultante; y 15 (b) detectar el complejo resultante que contiene el anticuerpo, en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un aminoácido del receptor de P2X3 humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma. 40. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de • 20 receptor de P2X humano o una variante del mismo en donde dicho receptor es P2X3. 41 . Un método terapéutico para liberar el dolor, que comprende: (a) presentar a un individuo afligido con dolor, y 25 (b) administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de un compuesto antagonístico de P2X3. 42. El método según la reivindicación 41 , caracterizado porque dicho compuesto antagonístico es eficaz contra canales heteromultiméricos de P2X3. 5 43. Un método para potenciar los efectos de un agonista que activa un receptor de P2X3 que comprende las etapas de: a) incubar las células que comprenden dicho receptor de P2X3 con un tinte de triaceno; b) exponer dichas células incubadas a dicho agonista por un 10 tiempo y bajo condiciones suficientes para que dicho agonista se una a dicho recepto de P2X3, en donde dicho tinte de triaceno de la etapa (a) • potencia dicho efecto de dicho agonista de la etapa (b). 44. El método según la reivindicación 43, caracterizado porque dicho receptor de P2X3 se deriva de un mamífero. 15 45. El método según la reivindicación 44, caracterizado porque dicho mamífero es un roedor o un humano. 46. El método según la reivindicación 43, caracterizado porque dicho tinte de triaceno se selecciona del grupo que consiste de cibacron azul, basilen azul, reactivo azul 5 y reactivo rojo 2. • 20 47. El método según la reivindicación 46, caracterizado porque dicho tinte de triaceno es cibacron azul. 48. El método según la reivindicación 43, caracterizado porque dicho agonista es adenosina d'-trifosfato disodio (ATP). 49. Un método para bloquear la actividad inhibidora de un 25 antagonista del receptor de P2 no selectivo en un receptor de P2X3 que , . .. ! -. * <•" - comprende las etapas de: a) incubar las células que expresan P2X3 con un tinte de triaceno; b) exponer dichas células expuestas a un antagonista del 5 receptor de P2, en donde dicho tinte de triaceno de la etapa (a) bloquea dicha actividad inhibidora de dicho antagonista. 50. El método según la reivindicación 49, caracterizado porque dicho receptor de P2X se deriva de un mamífero 51 . El método según la reivindicación 50, caracterizado 10 porque dicho mamífero es un roedor o un humano. 52. El método según la reivindicación 49, caracterizado • porque dicho antagonista es ácido piridoxal-5-fosfato-6-azofenil-2',4'- disulfónico (PPADS). 53. El método según la reivindicación 49, caracterizado 15 porque dicho tinte de triaceno es cibacron azul. 54. Un método para acelerar la velocidad de la resenzibilización del receptor de P2X3 de células que expresan el receptor de P2X3 que comprende las etapas de exponer dichas células que expresan el receptor de P2X3 desensibilizado a un tinte de triaceno, en • 20 donde dicho tinte de triaceno acelera dicha velocidad de resensibilización de receptores de P2X3 de dichas células que expresan el receptor de P2X3 desensibilizado. 55. El método según la reivindicación 54, caracterizado porque dicho receptor de P2X3 se deriva de un mamífero. 25 - ** *** * «. ., -., . . ., *--"* ' - " k. 56. El método según la reivindicación 55, caracterizado porque dicho mamífero es un roedor o un humano. 57. El método según la reivindicación 54, caracterizado porque dicho tinte de triaceno es cibacron azul. 58. Un método para inducir los efectos antinociceptivos en un mamífero que comprende la etapa de administrar un antagonista del receptor de P2X a un paciente en necesidad de tales efectos antinociceptivos en una cantidad suficiente para efectuar dichos efectos antinociceptivos. 59. El método según la reivindicación 58, caracterizado porque dicho mamífero es un humano o una rata. 60. El método según la reivindicación 58, caracterizado porque dicho antagonista del receptor de P2X induce los efectos antinociceptivos en un receptor que contiene P2X3. 61 . El método según la reivindicación 60, caracterizado porque dicho receptor que contiene P2X3 es P2X3. 62. El método según la reivindicación 58, caracterizado porque dicho antagonista es 2',3'-O-(2,4,6-trinitrofenil)-ATP (TNP-ATP),