MXPA01004683A - Metodos y composiciones para disminuir los niveles de colesterol en el plasma. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo, para determinar si un compuesto se enlaza a una-lipoproteina tal como LDL o VLDL de una, manera en la cual, disminuira el colesterol en el plasma, que incluye evaluar la capacidad del compuesto para formar un complejo con la lipoproteina, por ejemplo, LDL o VLDL, y luego determinar si, el complejo recientemente formado origina un cambio en la estructura de- la proteina apoB-100, que da como resultado el aumento de la afinidad de enlace al receptor LDL. Tambien se describe un metodo para disminuir el colesterol en un huesped que lo necesita, incluyendo un humano, el cual incluye la administracion de una cantidad efectiva del compuesto el cual se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol (por ejemplo, LDL o VLDL) de manera que altere la configuracion tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 al receptor LDL, incluyendo aquellas que se encuentran en la superficie de una celula hepatica.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA DISMINUIR LOS NIVELES DE COLESTEROL EN EL PLASMA Campo del Invento La presente invención, se encuentra en el área de los métodos y composiciones para disminuir los niveles de colesterol en el plasma, disminuyendo los niveles de lipoproteinas de baja densidad (LDL) y lipoproteinas de densidad muy baja (VLDL) en la circulación sanguínea.

Antecedentes del Invento La enfermedad de coronaria del corazón (CHD) continúa siendo la causa de muerte en los paises industrializados. La causa principal de la CHD es la aterosclerosis, una enfermedad que se caracteriza por la deposición de lipidos, incluyendo el colesterol en las paredes de los vasos arteriales, dando como resultado el estrechamiento de los pasajes de los vasos y finalmente el endurecimiento del sistema vascular . Ahora, es bien aceptado que la aterosclerosis puede comenzar con una lesión local al endotelio de la arteria, seguido por la proliferación de células arteriales del músculo suave provenientes de la capa media a la capa intima a lo largo de la deposición de lipido y la acumulación de células de espuma en la lesión. Conforme se desarrolla la capa de aterosclerosis, esta obstruye progresivamente más y más del vaso sanguíneo afectado, y puede finalmente conducir a la isquemia o el infarto. Como la deposición de lipidos en circulación tales como el colesterol juega un rol importante en el inicio y el progreso de la aterosclerosis, es importarte identificar métodos y composiciones para disminuir los niveles de colesterol en la circulación. Las lipoproteinas en la circulación, sirven como vehículos para el transporte de lipidos solubles como esteres de colesterol, triglicéridos, y los fosfolipidos más polares y el colesterol no esterificado en el ambiente acuoso del plasma -(Bradely, W.A. y Gotto, A.M.: American Physiological Society, Bethesda, MD, (1978) páginas 117 a 137) . La solubilidad de estos lipidos es lograda a través de la asociación fisica con las proteinas denominadas apolipoproteinas, y los complejos de lipido-proteina son llamados lipoproteinas (Dolphin, P.J. Biochem. Cell. Biol. (1985) 63,' páginas 850 a 869) . Se han aislado del plasma humano cinco clases diferentes del lipoproteinas, quilomicrones, lipoproteinas de muy baja densidad, (VLDL), lipoproteinas de baja densidad (LDL), lipoproteinas de alta densidad (HDL) y LP(a), (Alaupovic, P.: En el Manual de Electroforesis. In Handbook of Electróphoresis (1980) Vol. 1, páginas 27 a 46, la Publicación de Havel, R.J., Eder, H.A. y Bragdon, J.H.: En (1955) 34, páginas 1343 a 1353) . La LDL es el transportador principal del colesterol en el •plasma humano. Los triglicéridos y el colesterol dietéticos son ensamblados por los enterocitos (células intestinales) en partículas de quilomicrones, las cuales entran en la circulación a través del sistema linfático (Brown, M.S. y Goldstein, J.L Sci. American (1984) 251, páginas 58 a 66) . Las quilomicrones proporcionan ácidos grasos a las células periféricas y colesterol al higado. El higado a su vez, vuelve a empacar el colesterol junto con los triglicéridos en otra lipoproteina llamada VLDL. La función de la lipoproteina VLDL es similar a las quilomicrones, por ejemplo, abasteciendo ácidos grasos libres a los músculos y tejidos adiposos y colesterol a las células periféricas (Brown, M.S. y Goldstein, J.L. Sci. American (19849 251, páginas 58 a <o 6) . En el sistema circulatorio, los triglicéridos en la particula VLDL son hidrolizados por una enzima llamada lipasa de lipoproteina (LPL) y el procesamiento adicional por la lipasa hepática finalmente las convierte en LDL (Dolphin, P.J.: Can. J. : Biochem. Cell. Biol. (1985) 63, páginas 850 a 869) . Por lo tanto, el higado produce la VLDL, la precursora de la LDL. Como la VLDL es un precursor de la LDL, las disminuciones en la producción de la VLDL se traducen en niveles disminuidos de LDL. Los niveles altos de LDL en circulación han sido correlacionados, de manera positiva con el desarrollo de la enfermedad coronaria. Mientras el colesterol LDL es claramente un factor de riesgo positivo independiente, el colesterol HDL es considerado que es un factor de riesgo negativo (D.L. Tribble, R.M. Krauss Avances en Medicina Interna (Advances in Internal Medicine) (1993) 38: páginas del 1' a 1 29) . Apoproteina B. La apoproteina B-100 (apoB) es la apoproteina principal de la LDL y su ligante para el receptor LDL. La apoB-100 es una proteina grande con un peso molecular (MW) de 549,000. La proteina es altamente hidrofóbica y es insoluble en ausencia de lipidos. La estructura de la apoB-100 ha sido estudiada utilizando anticuerpos monoclonales elevados a regiones especificas (regiones antigénicas o epitopes) en la proteina. Estos anticuerpos monoclonales han sido utilizados para (trazar) el sitio en la apoB-100, en el cual se enlaza al receptor LDL. El trazado de varios epitopes en la proteina apoB en el VLDL y LDL utilizando anticuerpos monoclonales ha sido un método productivo para entender el rol de las diferentes porciones de esta proteina en la asimilación de la lipoproteina. Los cambios en la inmunoreactividad de los epitopes en la proteina apoB a anticuerpos monoclonales, ha mostrado una correlación con la asimilación de la LDL por las células en cultivo (N.F. Galeano y asociados, J. Biol. Chem. vol. 269, no.l, páginas 511 a 519, 1994) . Los anticuerpos monoclonales, han sido utilizados para enlazar los epitopes a las regiones conocidas de la proteina apoB con el objeto de determinar la región de enlace para el receptor LDL (Milne, R. y asociados J. Biol. Chem. vol. 264, no. 33, 1988 páginas 10754 a 10760; Milne, R. y asociados, Arteriosclerosis, vol. 3, no.l, 1983, páginas 23 a 30) . El establecimiento de la posición del epitope, para el receptor que bloquea los anticuerpos monoclonales, puede ser utilizado para predecir el punto de la región de enlace del receptor LDL de la proteina apoB (Pease, R. y asociados J.

Biol. Chem. vol. 266, no.l, 1990, páginas 553 a 568) . Apolipoproteína E. La apolipoproteina E (apoE) de un modo similar que la apoB, se enlaza a los receptores LDL y tiene la capacidad de transportar al colesterol a través del sistema. La apoE interviene en el transporte y la asimilación del colesterol y los lipidos debido a su alta afinidad de enlace con el receptor LDL. El receptor LDL reconoce tanto la apoB como la apoE con afinidad comparable (Wilson, C. y asociados Science vol. 252 páginas 1817 a 1822, 1991) . El campo de enlace del receptor de la proteina apoB, ha sido caracterizado mediante estudios de inhibición los cuales, utilizaron anticuerpos monoclonales (Weisgraber, K.H., y asociados J. Biol. Chem., vol. 258, No. 20, Octubre 25, 1983, páginas 12348 a 12354) . Además, la estructura tridimensional del campo de enlace del receptor LDL de la apoE ha sido determinado por cristalografía de rayos-x (Wilson, C, y asociados, Science vol.252 páginas 1817 a 1822, 1991) . Eliminación de la LDL de la circulación. La LDL es removida del plasma mediante un receptor de alta afinidad llamado el receptor LDL, presente en la superficie celular de las células periféricas del higado (Goldstein, J.L. y Brown, M.S.: Ann. Rev. Biochem. (1977) 46, páginas 897 a 930) . Esta trayectoria transmitida por el receptor, es responsable de la asimilación y degradación de la LDL por las células, y en el proceso, el colesterol es entregado a estas células. Por lo tanto, la asimilación de la LDL por el proceso transmitido por el receptor, permite que las células adquieran el colesterol de la lipoproteina, y este a su vez proporciona colesterol para la síntesis de membrana en todos los tejidos y la síntesis esteroide de las hormonas en las glándulas adrenales, los ovarios y testículos . La asimilación por la trayectoria del receptor LDL, es el mecanismo principal de eliminación de la LDL del plasma. Este proceso de la asimilación de la lipoproteina es un proceso altamente coordinado y orquestado dictado por la composición de la apolipoproteina y el contenido de lipidos de la lipoproteina. La apolipoproteina en la LDL, llamada apoB-100 transmite la interacción con el receptor LDL. Las secuencias especificas de aminoácidos de la apoB forma un sitio de enlace para la apoB a la superficie celular de los receptores LDL (Knott y asociados Nature (1986) 323: páginas 734 a 738.

Además de la LDL, la VLDL también se puede enlazar a los receptores LDL ya que contiene apoB-100 asi como apoB, otra apolipoproteina, la cual contiene el receptor LDL que se puede reconocer en las secuencias de aminoácidos. Es bien reconocido que las VLDL son heterogéneas con respecto al tamaño y composición, y cada una de las subclases de VLDL difieren en su capacidad para interactuar con el receptor LDL. Por ejemplo, la VLDL de tamaño grande no se enlaza normalmente al receptor LDL aunque que contienen apoB-100 y apoE . Una VLDL más pequeña se enlaza al receptor. Se sugiere que tanto la apoB-100 como la apoE en la VLDL grande no posee la estructura tridimensional apropiada para el reconocimiento del receptor. De un modo similar, ciertos tipos de LDL por ejemplo, aquellos que se encuentran en el plasma diabético (LDL glicosilado) y LDL oxidado, tampoco se enlazan con los receptores LDL debido a la estructura incorrecta de la apoB-100 ( ang X, Bucala R, Milne R. Proc. Nati. Acad. Sci (1998) 95: páginas 7643 a 7647). Por lo tanto, además del requerimiento de la secuencia de aminoácidos, también existe un requerimiento estructural estricto de la apoB-100 para el enlace óptimo a la LDL mediante el receptor LDL.

La importancia de los receptores apoB y apoE en la eliminación de la LDL está demostrada por los pacientes que poseen una predisposición genética a la enfermedad coronaria. Una condición conocida como hipercolesterolemia familiar (FH) daña la eliminación del LDL del plasma sanguíneo, en pacientes que carecen de receptores LDL de apoB o apoE o tienen receptores LDL de apoB o apoE defectuosos (Innerarity, T. y asociados Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., vol. 84, páginas 6919 a 6923 1987). Se ha reportado por lo menos una especie anormal de apoB en los humanos. Young y asociados documentaron la existencia de una de dichas proteinas de apoB anormales, apoB-37 (J. Clin. Invest., Vol. 79, Junio 1987, páginas 1831 a 1841). Se descubrió que esta proteina anormal, ocurre frecuentemente en personas que sufren de una forma de hipobetalipoproteinemia familiar, codificando la proteina normal alelos que son heredados y trazados a través de tres generaciones de una familia afectada. Terapias existentes de diminución de lipidos. La dieta contribuye hasta en un 40% en el colesterol que se introduce dentro del intestino y la bilis, contribuye al resto del colesterol "exógenos" absorbido a través del intestino (Wilson M.D., Rudel L.L.: J. Lipid Res. (1994) 35: páginas 943 a 955). Por lo tanto, la disminución de la absorción de colesterol dietético es un punto regulatorio para la homeostásis total del colesterol del cuerpo. Los inhibidores de absorción del colesterol disminuyen el colesterol en el plasma mediante la reducción de la absorción del colesterol dietético en el intestino, o actuando como inhibidores del ácido biliar (Stedronsky ER: Biochim. Biophys. Acta (1994) 1210: páginas 255 a 287) . Como ya ha sido determinado que la hipercolesterolemia es debida al LDL elevado (hiperlipidemia) , se ha intentado la disminución de los niveles de LDL mediante terapia por medicamentos.

Existen varias clases de medicamentos que son usados generalmente para disminuir los niveles de LDL, incluyendo inhibidores del ácido biliar, ácido nicotinico (niacina) , e inhibidores de la reductasa 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG CoA) . A veces se han utilizado el probucol, y los derivados de fibrato en terapia adjunta, generalmente en combinación con otros medicamentos. Los agentes de disminución del colesterol disminuyen el contenido total en el plasma, y el colesterol LDL y pueden aumentar el HDL. La neomicina, un colesterol dietético que enlaza los aminoglucósidos no absorbibles evita la absorción intestinal. Otro medicamento de esta categoría es la colestiramina . La colestiramina es una resina de intercambio de anión la cual, actúa mediante el enlace de los ácidos biliares dentro del lumen intestinal, interfiriendo de este modo con su reabsorción, y mejorando la excreción fecal. Los agentes que diminuyen el colesterol de esta clase requieren grandes dosis, y generalmente están asociados con un funcionamiento deficiente y la mala absorción de otros nutrientes y medicamentos. Las clases importantes de medicamentos que actúan en el higado son fibratos . Los fibratos son derivados de ácido fibrico (bezafibrato, fenofibrato, gemfibrozil y clofibratos) los cuales disminuyen de una manera profunda, los niveles de triglicéridos en el plasma y elevan el HDL (Sirtori C.R., Franceschini G.:Pharmac Ther. (1988) 37: páginas 167 a 191 y Grundy S.M., Vega G.L.: Amer J. Med. (1987) 83: páginas 9 a 20) . El uso tipico clínico de los fibratos es generalmente en pacientes con hipertrigliceridemia, HDL bajo e hiperlipidemia combinada . El mecanismo de acción de los fibratos no es comprendido completamente, pero comprende la inducción de ciertas apolipoproteinas y enzimas comprendidas en el metabolismo del VLDL y HDL. El cumplimiento de los pacientes con los fibratos es bueno, pero no son medicamentos de elección para disminuir el colesterol LDL. El ácido nicotinico (niacina) una vitamina soluble en agua, que tiene un perfil de disminución de lipidos similar a los fibratos y puede dirigirse al higado . Las estatinas, representan una clase de compuestos los cuales son inhibidores de la reductasa HMG CoA, una enzima clave en la trayectoria de biosintesis del colesterol (Endo A, en: Metabolismo Celular de la Pared Arterial, y el Sistema Nervioso Central. Aspectos Seleccionados (Cellular Metabolism of the Arterial Wall and Central Nervous System. Selected Aspects.) Schettler G, Greten H, Habenicht AJR (eds.) Springer-Verlag, Heidelberg (1993)). Las estatinas disminuyen la biosintesis del colesterol en el higado, la cual aumenta la producción de receptores LDL disminuyendo de este modo el total en el plasma y el colesterol LDL (Grundy S.M. New Engl. J. Med. (1988) 319: páginas 24 a 32 y Endo A: J. Lipid Res. (1992) 33: páginas 1569 a 1582) . Dependiendo del agente y la dosis utilizada, las estatinas pueden disminuir los niveles de triglicéridos en el plasma y pueden aumentar el HDL. Actualmente las estatinas que se consiguen en el mercado son Lovastatina (Merck) , Simvastatina (Merck) , Pravastatina (Sankyo y Squibb) y Fluvastatina (Sandoz) . Una quinta estatina Atorvastatina (Parke-Davis/Pfizer ) , la estatina que ha entrado más recientemente al mercado. Las estatinas se han convertido en la terapia estándar para la disminución del colesterol LDL. Las estatinas son agentes de disminución del LDL efectivos pero tienen efectos colaterales, siendo los más comunes, los aumentos de enzimas en el suero (transaminasas y quinasa de creatinina) . Además, estos agentes también pueden causar miopatia y rabdomiolisis especialmente cuando son combinados con fibratos . Otro medicamento que puede impactar en parte el higado es el probucol (P. Zimetbaum, M.D., H. Eder. M.D., y W. Frishman, M.D.: Clin. Pharmacol. (1990) 30: páginas 3 a 9) . El probucol es utilizado principalmente para disminuir los niveles de colesterol en el suero, en pacientes hipercolesterolémicos y es administrado generalmente en forma de tabletas que se pueden conseguir bajo la marca comercial Lorelco™. El probucol está relacionado químicamente con los aditivos para alimentos utilizados de manera amplia 2, [ 3 ] -tert-butil-4-hidroxianisol (BHA) y 2 , 6-di-tert-butil-4-metil fenol (BHT). Su nombre químico completo es 4,4'-isopropilidenoditio) bis (2 , 6-di-tert-butilfenol ) . El probucol, es un agente soluble en lipidos utilizado en el tratamiento de la hipercolesterolemia incluyendo la hipercolesterolemia familiar (FH) . El probucol reduce el colesterol LDL generalmente de un 10% a un 20% pero también reduce el HDL en un 20% a 30%. El medicamento no tiene efecto en los triglicéridos del plasma. El mecanismo de acción del probucol en la disminución de lipidos no se comprende completamente. El efecto de disminución del LDL ocasionada por el probucol puede ser debida a la producción disminuida de la apoB que contiene lipoproteinas y a la eliminación aumentada del LDL. El probucol disminuye el LDL en el modelo de animal deficiente del receptor LDL (conejos WHHL) asi como en las poblaciones FH . El probucol, a mostrado que realmente disminuye el progreso de la aterosclerosis en los conejos deficientes del receptor LDL tal y como lo explican Carew y asociados Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 84: páginas 7725 a 7729 (1987) . El efecto de disminución del HDL del probucol puede ser debido a la síntesis disminuida de las apolipoproteinas HDL y la eliminación aumentada de esta lipoproteina. Se requieren dosis altas de probucol en el uso clínico.

La Patente Norteamericana No. 5,262,439 otorgada a Parthasarathy describe análogos de probucol con una solubilidad en agua aumentada en la cual, uno o ambos de los grupos hidroxilos son reemplazados con grupos éster que aumentan la solubilidad en agua del compuesto. En una modalidad, el derivado es seleccionado del grupo consistente de éster mono- o di-probucol de ácido succinico, ácido glutárico, ácido adipico, ácido sebérico, ácido sebácico, ácido azelaico, o ácido maleico. En otra modalidad, el derivado de probucol es mono- o di-éster en el cual, el éster contiene un grupo alquilo o alquenilo que contiene una funcionalidad seleccionada del grupo consistente de un grupo de ácido carboxilico, grupo amina, sal de un grupo amina, grupos amida y grupos aldehido . El Documento WO 98/09773 presentado por AtheroGenics , Inc, describe que los monoésteres de probucol y en particular el éster de ácido monosuccinico de probucol, son efectivos para reducir simultáneamente el colesterol, disminuir el LDL e inhibir la expresión del VCAM-1, y de este modo estos compuestos son útiles como agentes cardiovasculares compuestos . Como los compuestos exhiben tres actividades protectoras vasculares importantes simultáneamente, el paciente puede tomar un medicamento en vez de medicamentos múltiples para lograr el efecto terapéutico deseado. El Documento WO 98/09781 describe agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares, que son transmitidas por el VCAM-1. La Patente Norteamericana No. 5,807,884 reivindica un método para el tratamiento de una enfermedad (incluyendo una enfermedad cardiovascular) transmitida por VCAM-1 que incluye la administración de una substancia que inhibe la oxidación de un ácido graso poliinsaturado . La Patente Norteamericana No. 5,811,449 cubre el método para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular que incluye la eliminación de la expresión de un gen sensible redox, seleccionado del grupo consiste de MCP-1 IL-6, y receptor de trombina que incluye la administración de una cantidad efectiva de una substancia que evita o minimiza la oxidación de un ácido graso poliinsaturado . La Patente Norteamericana No. 5,846,959 reivindica un método para el tratamiento de una enfermedad cardiovascular transmitida por la expresión VCAM-1, que incluye la administración de una cantidad efectiva de una substancia la cual, inhibe la oxidación de un ácido graso poliinsaturado en combinación con otro medicamento cardiovascular seleccionado del grupo consiste de agentes de disminución de lipidos, inhibidores de agregación de plaquetas, agentes antitrombóticos, bloqueadores de canal de calcio, inhibidores de enzima convertidores de angiotensina, y ß-bloqueadores . La Patente Norteamericana No. 5,750,351, reivindica un método para evaluar un compuesto de prueba por su capacidad para tratar una enfermedad transmitida por la expresión VCAM-1 que incluye la evaluación de la capacidad del compuesto para inhibir la oxidación de un ácido graso poliinsaturado. La Patente Norteamericana No. 5,773,209 reivindica un método para la predicción o establecimiento in vivo de una enfermedad transmitida por el gen sensible redox, que incluye la cuantificación del nivel de ácido graso poliinsaturado oxidado en el tejido o en la sangre, o un transmisor de inflamación que es inducido por el ácido graso poliinsaturado o un ácido graso poliinsaturado oxidado. La Patente Norteamericana No. 5,773,231 reivindica un método para la evaluación de la sensibilización de las células endoteliales vasculares del huésped de los ácidos grasos poliinsaturados o sus contrapartes oxidadas, que incluye el desafiar un huésped con un ácido graso poliinsaturado o ácido graso poliinsaturado oxidado y compararlo con una población normal que da como resultado la concentración de VCAM-1 u otros transmisores de la inflamación expresada por el gen sensible redox a la exposición al ácido graso poliinsaturado o al ácido graso oxidado. Las Patentes Norteamericanas Nos. 5,380,747 y 5,811,449 reivindican un método para el tratamiento de una enfermedad cardiovascular en los humanos que incluye, la administración de una cantidad efectiva de un ditiocarbamato de estructura definida. La Patente Norteamericana No. 5,792,787, describe un método para la eliminación de la expresión VCAM-1 en los humanos que incluye la administración de una cantidad efectiva de un ditiocarbamato de estructura definida. La Patente Norteamericana No. 5,877,203, se enfoca a un método para el tratamiento de enfermedades inflamatorias suprimiendo la expresión de VCAM-1 en los humanos que incluye la administración de un ditiocarbamato de estructura definida. Una serie de patentes Francesas describen que ciertos derivados de probucol, son agentes hipocolesterolémicos e hipolipémicos : Fr 2168137 esteres (bis 4-hidroxifeniltioalcano) ; Fr 2140771 esteres tetralinil fenoxi alcanoicos de probucol); Fr 2140769 derivados de ácido benzofuriloxialcanoico de probucol); Fr 2134810 (bis- (3-alquil-5-t-alquil-4-tiazol-5-carboxi) feniltio) alcanos; FR 2133024 (bis- (4-nicoinoiloxifeniltio) propanos ; y Fr 2130975 (bis(4- (fenoxialcanoiloxi ) alcanos La Patente Norteamericana No. 5,155,250 describe que los 2 , 6-dialquil-4-sililfenoles son agentes antiateroscleróticos . Los mismos compuestos se describen como agentes de disminución de colesterol en el suero en la Publicación WO 95/15760 publicada el 15 de Junio de 1995. La Patente Norteamericana No. 5,608,095 describe, que los fenoles alquilados 4-sililo inhibe la peroxidación del LDL, disminuye el colesterol en el plasma e inhibe la expresión de VCAM-1 y por lo tanto son útiles en el tratamiento de la aterosclerosis . Debido a que la enfermedad cardiovascular es la causa principal de la muerte en Norteamérica, existe una necesidad de proporcionar terapias nuevas para su tratamiento, especialmente aquellas que funcionan a través de un mecanismo diferente al de los medicamentos actuales y que pueden ser utilizados en conjunto con ellos.

Por lo tanto es un objeto de la presente invención, proporcionar un método nuevo para disminuir el colesterol en el plasma, y en particular las lipoproteinas, de baja densidad y las lipoproteinas de muy baja densidad. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un ensayo para evaluar la efectividad del método nuevo para disminuir el colesterol en el plasma .

Sumario del Invento Se ha descubierto que el colesterol en el plasma, puede ser disminuido mediante la aplicación de un compuesto que enlaza la lipoproteina portadora del colesterol (por ejemplo LDL ó VLDL) de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 al receptor LDL, incluyendo aquellos que se encuentran en la superficie de la células hepáticas. A dichos compuestos nos referimos en la presente descripción como "medicamentos que mejoran la eliminación de LDL" aumentando la afinidad de enlace de la lipoproteina al receptor LDL, el medicamento que aumenta la eliminación del LDL ocasiona que la lipoproteina sea removida (por ejemplo suprimida) del plasma de una manera más efectiva, lo cual disminuye los niveles de colesterol en el plasma. Por lo tanto, en una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un método para disminuir el colesterol en un huésped que necesita dicho método, incluyendo un humano, el cual, incluye la administración de una cantidad efectiva de un compuesto el cual, se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol (por ejemplo, LDL ó VLDL, de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 al receptor LDL incluyendo aquellas que se encuentran en la superficie de una célula hepática, de acuerdo con la presente invención, se puede determinar si un compuesto es un medicamento que aumenta la eliminación del LDL utilizando cualquiera de los métodos aqui descritos, incluyendo la mezcla del medicamento con lipoproteinas que contienen colesterol in vivo o in vi tro, aislando el complejo, y determinando si el enlace del complejo ocasiona un cambio en la conformación tridimensional de la apoB-100 en la lipoproteina que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteina al receptor LDL. En un aspecto de esta primera modalidad, el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol o un mono- o di-éster de probucol. Én otro aspecto de esta primera modalidad, el medicamento que aumenta la eliminación no es un compuesto descrito en el documento WO 98/09773. Todavía en otro aspecto de esta primera modalidad. El medicamento que aumenta la eliminación del LDL no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5,608,095. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un ensayo para determinar si un compuesto se enlaza a la lipoproteina tal como LDL ó VLDL de una manera en la cual, disminuye el colesterol en el plasma el cual incluye, la evaluación de la capacidad del compuesto para formar un complejo con la lipoproteina, por ejemplo LDL ó VLDL, y luego determinar si el complejo recientemente formado ocasiona un cambio en la estructura de la apoB-100 que da como resultado una afinidad de enlace aumentada al receptor LDL. Como un ejemplo no limitativo de esta modalidad, el compuesto de prueba puede ser administrado a un huésped animal, por ejemplo, un conejo junto con una dieta con alto contenido de grasas durante seis semanas en una dosis oral adecuada. Luego se extrae sangre al animal, preferentemente a las seis semanas, y las lipoproteinas de plasma son aisladas utilizando una centrifugación de alta velocidad. La cantidad de un compuesto de prueba enlazado a cada una de las proteinas entonces es calculada, para determinar si el compuesto de prueba enlazado ocasiona un cambio en la estructura de la apoB-100 que seria útil terapéuticamente, se proporciona un ensayo de inmunoreactividad de emparedado el cual mide la presentación del epitope especifico conocido como importante para el enlace de la apoB-100 al receptor LDL. El ensayo de ELISA de emparedado, utiliza un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal descrito con mayor detalle más adelante, enviado al epitope especificado en la apoB-100, como un anticuerpo de captura que se encuentra sobre una placa de microtitulación. El LDL agregado en la placa es enlazado al anticuerpo como resultado del reconocimiento del epitope especifico. Entonces un segundo anticuerpo el cual puede ser policlonal o monoclonal es utilizado para cuantificar la cantidad del LDL capturado. En otro aspecto de la presente invención, el uso de la electroforesis agarosa u otra técnica adecuada, evalúan los cambios en el patrón de movilidad electroforetica del complejo de LDL ó VLDL con el compuesto de prueba, para investigar la interacción entre compuesto de prueba y la lipoproteina. Si la movilidad electroforética es alterada, o si por medio de otra evaluación se determina que el compuesto se enlaza a la lipoproteina y altera la configuración tridimensional de la estructura, entonces utilizando otro método, incluyendo pero sin limitarse a la reacción con un cuerpo monoclonal dirigido a un epitope importante en la apoB-100, se puede determinar si y hasta que punto el compuesto aumenta o disminuye el enlace de la apoB-100 al receptor LDL para la eliminación del colesterol. Se ha descubierto que el éster _ de ácido monosuccinico de probucol (MSE) se enlaza fuertemente al suero LDL y VLDL, ocasionando un cambio en la conformación de la proteina apoB-100 el cual aumenta el enlace de la lipoproteina a los receptores LDL hepáticos .

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1, es una gráfica de barras de la distribución del éster de ácido monosuccinico ("MSE") de probucol en lipoproteinas en la circulación. La Figura 2, es una ilustración de los cambios en la presentación del epitope del LDL- apoB-100 antes y después de la elaboración del complejo MSE.

La Figura 3, es una gráfica de barras del efecto del MSE en la asimilación de 125I-LDL en las células HepG2 en concentraciones de 18,25.5 y 33 µM. Tal y como se indicó, el MSE aumenta la asimilación del LDL radio marcado en las células HepG2 en una modalidad dependiente de la dosis. La Figura 4, es una ilustración de los estudios de rotación de la LDL, utilizando la técnica estable de isótopo asi como una gráfica del porcentaje de marcado apoB en el plasma con una función del tiempo en la fase de secreción, en la fase de eliminación. La gráfica ilustra la eliminación mejorada, la eliminación normal, y los patrones de eliminación demorados de apoB con el paso del tiempo. Las Figuras 5a y 5b, son gráficas que comparan el Índice de eliminación mejorado de VLDL del componente del plasma en monos, que se dosificaron en 25 mg/kg/dia de éster de ácido monosuccinico de probucol comparados con los índices de eliminación de los animales no tratados . La Figura 6a, es una gráfica que demuestra el enlace aumentado de LDL a la captura del anticuerpo monoclonal por el éster de ácido monosuccinico de probucol y varios otros derivados de probucol.

La Figura 6b, es una gráfica que demuestra el enlace aumentado del epitope apoB-100 en el VLDL al anticuerpo monoclonal para el éster de ácido monosuccínico de probucol en relación con el VLDL nativo . La Figura 7, es una gráfica que demuestra la especificidad de los cambios de expresión del epitope por el éster de ácido monosuccinico del probucol, comparando sus efectos en otros cuatro anticuerpos monoclonales con el anticuerpo Boehringer Mannheim.

Descripción Detallada del Invento Se ha descubierto que se puede disminuir el colesterol en el plasma mediante la administración de un compuesto que se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol, (por ejemplo, LDL ó VLDL) de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteína apoB-100 a los receptores LDL en la superficie de las células hepáticas. A dichos compuestos nos referimos en la presente descripción como "medicamentos que aumentan la eliminación de LDL". Aumentando la afinidad de enlace de la lipoproteina a los receptores hepáticos LDL, la lipoproteina es removida (por ejemplo suprimida) del plasma de una manera más efectiva y los niveles de colesterol en el plasma son disminuidos. Por lo tanto, en una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un método para disminuir el colesterol en un huésped que lo necesita, incluyendo un humano, incluyendo dicho método la administración de una cantidad efectiva de un compuesto el cual, se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol (por ejemplo, LDL ó VLDL) de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 a los receptores LDL en la superficie de las células hepáticas . De acuerdo con la presente invención, se puede determinar si un compuesto es un medicamento que aumenta la eliminación del LDL utilizando cualquiera de los métodos aqui descritos, incluyendo la mezcla del medicamento in vivo o in vi tro de la lipoproteina que contiene el colesterol, aislando el complejo, y determinando si el enlace del complejo ocasiona un cambio en la conformación tridimensional de la apoB-100 en la lipoproteina que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteína al receptor LDL. En un aspecto de esta primera modalidad, el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol o mono- o di éster de probucol. En otro aspecto de esta primera modalidad, el medicamento que aumenta la eliminación no es un compuesto descrito en el documento WO 98/09773. Todavía en otro aspecto de esta primera modalidad, el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5,608,095. Si un huésped que exhibe un alto nivel en el colesterol del plasma, recibe un compuesto el cual ha sido identificado como un medicamento que aumenta la eliminación de LDL, y el huésped no tiene respuesta a la terapia, entonces existe la posibilidad de que el huésped tenga un alto nivel de colesterol debido a que la proteína apoB-100 en el huésped, es genéticamente diversa o está alterada de un modo tal, que no puede presentar el epitope del receptor LDL de una manera efectiva. Por lo tanto, la presente invención incluye un método para evaluar si un huésped tiene una variante de apoB-100 que cuando es elaborada en complejo en una lipoproteina, tiene una capacidad disminuida para enlazarse al receptor LDL (el cual es un resultado de los niveles de colesterol altos LDL ó VLDL naturales) que incluye la supervisión de la respuesta del huésped al medicamento de eliminación del LDL, la confirmación de que el paciente tiene una respuesta inferior a la normal al medicamento, y luego aislar y evaluar la proteina apoB-100 del huésped para encontrar variaciones que den como resultado un enlace disminuido al receptor LDL. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para determinar si un compuesto se enlaza al LDL ó VLDL de una manera la cual disminuye el colesterol en el plasma el cual incluye probar la habilidad del compuesto para formar un complejo con el LDL ó VLDL y luego evaluar si el complejo recientemente formado, ocasiona un cambio en la estructura de la apoB-100 que da como resultado una afinidad de enlace aumentada al receptor LDL. En resumen, la presente invención incluye las presentes modalidades: (i) Un método para evaluarse un compuesto es un medicamento que aumenta la eliminación de LDL el cual, incluye la mezcla del medicamento in vivo o in vi tro con la lipoproteina que contiene el colesterol; el aislamiento del complejo, y la determinación de si el enlace del compuesto al complejo ocasiona un cambio en la conformación tridimensional de la apoB-100 en la lipoproteína que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteína al receptor LDL; (ii) Un método para disminuir el colesterol en el plasma en un huésped el cual comprende, la administración a un huésped de un compuesto que forma un complejo con la lipoproteina que contiene colesterol, por ejemplo, LDL ó VLDL y luego evaluar si el complejo recientemente formado ocasiona un cambio en la estructura del apoB-100 que da como resultado una afinidad de enlace aumentada de la lipoproteina al receptor LDL; (iii) Un método para alterar la conformación de la lipoproteina que contiene el colesterol que incluye la mezcla in vi vo o in vi tro de la lipoproteína que contiene el colesterol con un compuesto y determinar si el enlace del compuesto al complejo ocasiona un cambio en la conformación tridimensional de la apoB- 100 en la lipoproteina que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteina a un receptor LDL. (iv) Un método para determinar si un alto nivel de colesterol en el plasma en un huésped, es debido a una alteración genética de la proteina apoB-100 del huésped que incluye la administración de un medicamento que aumenta la eliminación del LDL al paciente, observando una disminución inferior a la 'normal en el nivel de colesterol en el plasma y luego aislando y evaluando la proteína apoB-100 del huésped: (v)' Un método para determinar si un alto nivel de colesterol en el plasma en un huésped, es debido a una alteración genética de la proteína apoB-100 del huésped que incluye la exposición de la proteina apoB-100 del huésped a un medicamento que aumenta la eliminación de LDL in vi tro bajo condiciones en las cuales la proteína ' apoB-100 del huésped y el medicamento pueden formar un complejo, y luego aislar y evaluar el cambio en la conformación de la proteína apoB-100 en el huésped causado por cualquier elaboración del complejo. (vi) Un método para determinar si un compuesto ocasiona un cambio en la estructura de la apoB-100 en una lipoproteína que contiene colesterol que seria terapéuticamente útil, el cual comprende la realización de un ensayo de inmunoreactividad de emparedado en el cual un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal dirigido a un epitope en la apoB-100 (conocido como importante para el proceso de enlace para el receptor LDL) como un anticuerpo de captura está depositado en una placa, se le agrega a la placa el complejo del compuesto de prueba/lipoproteína que contiene el colesterol, y un segundo anticuerpo, el cual puede ser policlonal o monoclonal entonces es utilizado para cuantificar la cantidad de complejo LDL capturado; y (vii) Un método para evaluar el cambio en la conformación de la lipoproteína que contiene el colesterol causado por la elaboración del complejo con un compuesto de prueba que incluye la evaluación del cambio en el patrón de movilidad electroforética de la lipoproteina que contiene el colesterol utilizando electroforesis .

I. MEDICAMENTOS QUE AUMENTAN LA ELIMINACIÓN DE LDL.

Se ha descubierto, que el éster de ácido monosuccínico de probucol (MSE) se enlaza fuertemente al suero LDL y VLDL, ocasionado un cambio en la conformación de la proteina apoB-100 el cual aumenta el enlace de la lipoproteina a los receptores LDL hepáticos. El uso del éster de ácido monosuccinico de probucol para tratar enfermedad cardiovascular, se describe de manera general en la Patente Norteamericana No. 5,262,439; y los documentos WO98/09773 y WO98/09781. Ninguna de estas especificaciones de patente enseña que el MSE se enlaza al LDL ó VLDL de una manera que aumenta el enlace de la proteína apoB-100 elaborada en complejo con el receptor LDL para la eliminación aumentada del colesterol en el plasma. El éster de ácido monosuccínico de probucol es utilizado en esta especificación como un prototipo del medicamento que aumenta la eliminación de LDL y en ilustraciones en la manera de cómo se puede evaluar la capacidad de un medicamento para enlazar el LDL de una manera que aumenta el enlace de la apoB-100 al receptor LDL en la superficie de las células hepáticas. Debido a esta ej emplificación, una persona experta en la técnica puede evaluar fácilmente si otros medicamentos actúan de una manera similar para aumentar el enlace de la apoB-100 al receptor LDL. Se ha descubierto que algunos derivados de probucol, particularmente el éster de ácido monosuccinico de probucol aumenta de manera importante la eliminación de VLDL, aunque el probucol mismo tiene poco efecto. Se ha demostrado que el probucol disminuye el colesterol en el suero en ratones que carecen de receptor LDL (por ejemplo deficiente) lo cual proporciona una evidencia de que el probucol no disminuye substancialmente el colesterol a través de una interacción con el receptor LDL. En contraste, el MSE exhibe poco o ningún efecto en el colesterol del suero en los ratones que carecen del receptor LDL.

En otra modalidad, cualquiera de los compuestos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,262,439 otorgada a Parthasarathy, incorporada a la presente descripción en su totalidad como referencia, son utilizados como medicamentos de eliminación del LDL. La patente '439 describe los derivados de probucol en los cuales uno o ambos de los grupos hidroxilos son reemplazados por grupos éster que aumentan la solubilidad en agua del compuesto. En una modalidad, el derivado es seleccionado del grupo consiste de mono- o di- de ácido succínico de probucol, ácido glutárico, ácido adípico, ácido sebérico, ácido sebácico, ácido azelaico o ácido maleico. En otra modalidad, el derivado de probucol es un mono- o di-éster en el cual, el éster contiene un grupo alquilo o alquenilo que contiene una funcionalidad seleccionada del grupo consiste de un grupo de ácido carboxilico, grupo amina, sal de un grupo amina, grupos amida, grupos amida, y grupos aldehido. En otra modalidad, cualquiera de los compuestos descritos por "monoésteres de probucol", tal y como se usaron en el documento WO98/09773 son utilizados como medicamentos para la eliminación del LDL. Un monoéster de probucol incluye (i) cualquier monoéster de probucol que se describe en la Patente Norteamericana No. 5,262,439, por ejemplo, esteres de ácido carboxilico y esteres de ácido dicarboxilico y sales de los mismos; (ii) cualquier monoéster de probucol que tiene una solubilidad en agua mayor que el probucol y el cual disminuye el colesterol en el plasma, disminuye el LDL e inhibe la expresión de VCAM-1, tal y como se describe detalladamente en dichos documentos. En una modalidad, los monoésteres de probucol incluyen esteres de ácido dicarboxilico de probucol, incluyendo pero sin limitarse a esteres de ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido sebérico, ácido sebácico, ácido azelaico, y ácido maleico. En otra modalidad, el grupo éster incluye una porción funcional, que aumenta la solubilidad del compuesto sobre el probucol, incluyendo pero sin limitarse a, ácidos dicarboxilicos saturados e insaturados y sales de los mismos, ácidos amino carboxilicos y sales de los mismos, ácidos carboxilicos que contienen aldehido y sales de los mismos, un grupo amina, una sal de un grupo amina, un grupo amida, grupos aldehido y las sales de los mismos. Todavía en otra modalidad, el éster tiene una porción funcional selecciona del grupo consiste de ácidos sulfónicos, esteres de ácidos sulfónicos, ácidos fosfóricos, esteres de ácido fosfórico, fosfatos cíclicos, grupos polihidroxialquilo, grupos carbohidrato, C (0) -separador-S03H, en donde el separador es - (CH2 ) n-, - (CH2 ) n-C0-, - (CH2 ) n-N-, (CH2 ) n-0-, (CH2) „-S-, - (CH20) -, - (0CH2) -, - (SCH2) -, - (CH2S-) , - (arilo-0) -, - (0-arilo) -, - (alquilo-0) -, - (0-alquilo) -; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; C (O) -separador-S03M, en donde M es un metal utilizado para formar una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, de sodio o potasio, C (O) -separador-P03H2, C (O) -separador-P03M2, C (O) -separador-P03HM, C (O) -separador-P04H, C(O)-separador-P04M, S03M, -P03H2, -P03M2, -P03HM, fosfatos cíclicos, polihidroxialquilo, grupos carbohidrato, C (O) -separador- [O ( alquilo C?-3)p]n, en donde n es tal y como se definió anteriormente y p es 1, 2 ó 3, -[0( alquilo C?-3)p]n, alquilo inferior carboxi, alquilo inferior alquilcarbonilo inferior, alquilo inferior N,N-dialquil amino, alquilo inferior piridilo, alquilo inferior imidazolilo, alquilo inferior morfolinilo, alquilo inferior pirrolidinilo, alquilo inferior tiazolinilo, alquilo inferior piperidinilo, hidroxialquilo inferior morfilinilo, N-pirrilo, alquilo inferior piperazinilo, alquilo inferior N-alquil piperazinilo, alquilo inferior triazolilo, alquilo inferior tretazolilo, alquilo inferior tetrazolamino, o alquilo inferior tiazolilo.

Todavía en otra modalidad, los compuestos descritos en el documento WO 98/07981 son utilizados como medicamentos que aumentan la eliminación de LDL. Estos compuestos incluyen aquellos de las fórmulas (I) ó (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de la fórmula (I) son. en donde 0) X es 0,S,S0,S02,CH2, o NH; Separador es un grupo seleccionado del grupo consiste de - (CH2) n- , - ( CH2 ) n-C0- , - (CH2 ) n-N- , - (CH2) n-0-, (CH2)n-S-,-(CH20)-,-(0CH2)-,-(SCH2)-,-(CH2S) , -(arilo-0)-,-(0-arilo)-,- (alquilo-0) -, - (0-alquilo ) - ; n es O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; Y es arilo substituido o no substituido, heteroarilo substituido o no substituido, alquilo substituido o no substituido, alcoxi substituido o no substituido, alcoxialquilo substituido o no substituido, alquiltio substituido o no substituido, alquiltioalquilo substituido o no substituido; alquilsulfinilo substituido o no substituido, alquilsulfinilalquilo substituido o no substituido, alquilsulfonilo substituido o no substituido, alquilsulfonilalquilo substituido o no substituido, NH2, NHR, NR2, S02-0H, 0C(0)R, C(0)OH, C(0)0R, C(0)NH2, C(0)NHR, C(0)NR2, S02NH2, S02NHR, S02NR2; R es alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilio, alquinilo substituido, arilo, arilo substituido, alquil-COOH, alquilo-COO alquilo, alquiloCOO-arilo , heteroarilo, heteroarilo substituido, o cuando está enlazado a un átomo de nitrógeno, dos grupos R adyacentes pueden combinarse para formar un anillo de 5 a 7 miembros; R1 y R2 son alquilo de cadena recta ramificada o cíclica independientemente los cuales, pueden ser substituidos arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, alcarilo, o aralquilo; y en donde los substituyentes en los grupos R1 o R2 son seleccionados del grupo consistente de hidrógeno, halógeno, alquilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, acilo y aciloxi; R3 y R4 son independientemente cualquier grupo que no afecta de manera adversa, de otro modo las propiedades deseadas de la molécula, incluyendo H, halógeno o R1. Los compuestos de la fórmula (II) tiene la estructura siguiente: en donde . Ra, Rb, Rc y Rd son independientemente cualquier grupo que no afecta adversamente de otro modo las propiedades deseadas de la molécula, incluyendo hidrógeno, alquilo de cadena recta ramificado o cíclico el cual puede ser substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, alcarilo, alcarilo substituido, arilalquilo o arilalquilo substituido; los substituyentes en los grupos Ra, Rb, Rc y Ra son seleccionados del grupo consistente de hidrógeno, halógeno, alquilo, nitro, amino, haloalquilo, alquilamino, dialquilamino, acil y aciloxi; Z es seleccionada del grupo consistente de hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, arilo, aralquilo, alquilarilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, un grupo de carbohidratos - (CH2) -Rc, -C (O) -Rg, y -C (O) - (CH2 ) n-Rh, en donde (a) cuando cada una de Ra, Rbf Rc y Rd son t-butilo, Z no puede ser hidrógeno y (b) cuando cada una de Ra, Rb, Rc y d son t-butilo, Z no puede ser el residuo de ácido succínico; Re es seleccionado del grupo consistente de alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, alquiloxi substituido, alcoxialquilo substituido, NH2, NHR, NR2, alquilo substituido por mono- o polihidroxi, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, aciloxi, aciloxi substituido, COOH, COOR, -CH(OH)Rk, hidroxi, C(0)NH2, C(0)NHR, C(0)NR2; Rg es seleccionado del grupo consistente del grupo de alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, alcoxi, alquiloxi substituido, alcoxialquilo, alcoxialquilo substituido, NH2, NHR, NR2, alquilo substituido por mono- o polihidroxi, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido; Rh es seleccionado del grupo consistente de alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, alcoxi, alquiloxi substituido, alcoxi alquilo, alcoxi alquilo substituido, NH2, NHR, NR2, alquilo substituido por mono- o polihidroxi, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, aciloxi, aciloxi substituido, COOH, COOR, -CH(OH)R?, hidroxi, o fosfato, C(0)NH2, C(0)NHR, C(0)NR2, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; O, en una modalidad alternativa, Re, Rg, y Rh pueden ser independientemente un substituyente el cual mejora la solubilidad en agua del compuesto, incluyendo pero sin limitarse a C (O) -separador-S03H, en donde el separador es tal y como se definió anteriormente, C(O) separador- S03M, en donde M es un metal utilizado para formar una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, sodio C(0), separador- P03H2, C(O), separador-P03M2, C(O)- separador-P03HM, C(O)-separador-P04H, C (O) -separador-P04M, S03M, -P03H2, -P03M2, -P03HM, fosfatos cíclicos, polihidroxialquilo, grupos de carbohidrato, C (O) -separador-[0 (alquilo C?-3)p]n, en donde n es tal y como se definió anteriormente y p es 1, 2, ó 3, -[O(alquilo C?_3)p]n, alquilo inferior carboxi, alquilo inferior alquilcarbonilo inferior, alquilo inferior N,N, dialquil amino, alquilo inferior piridilo, alquilo inferior imidazolilo, alquilo inferior morfolinilo, alquilo inferior pirrolidinilo, alquilo inferior tiazolinilo, alquilo inferior piperidinilo, hidroxi alquilo inferior morfolinilo, N-pirrilo, alquilo inferior piperazinilo, alquilo inferior N-alquil piperazinilo, alquilo inferior triazolilo, alquilo inferior tetrazolilo, alquilo inferior tetrazolilamino, o alquilo inferior tiazolilo .

II TERAPIA DE COMBINACIÓN O ALTERNACIÓN Todavía en otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para disminuir el colesterol en los humanos, el cual comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un compuesto que se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol (por ejemplo LDL ó VLDL) de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteína apoB-100 a los receptores LDL en la superficie de las células hepáticas en combinación o alternación con un medicamento que disminuye el colesterol mediante una trayectoria biológica diferente, para proporcionar resultados aumentados .

En un aspecto, el segundo agente de disminución del colesterol es una estatina. La combinación del medicamento que aumenta la eliminación de LDL con una estatina crea una disminución sinergistica o aumentada del LDL, debido a que las estatinas disminuyen el colesterol por un mecanismo diferente, por ejemplo, inhibiendo la reductasa (HMG CoA) de la coenzima A de 3-hidroxi-3-metilglutaril, una enzima clave en la trayectoria biosintética del colesterol. Las estatinas disminuyen la biosintesis del colesterol en el higado lo que aumenta la producción de receptores LDL disminuyendo de este modo el total en el plasma y el colesterol LDL (Grundy S.M. New Engl. J. Med. (1988) 319: páginas 24-32 y Endo A: J. Lipid Res. (1992) 33: páginas 1569-1582) . Dependiendo de la gente y la dosis utilizada, las estatinas pueden disminuir los niveles de triglicéridos en el plasma y pueden aumentar el HDL. Las estatinas que se encuentran actualmente en el mercado son Lovastatina (Merck) , Simvastatina (Merck) , Pravastatina (Sankyo y Squibb) y Fluvastatina (Sandoz) . Una quinta estatina, la Atorvastatina (Parke-Davis/Pfizer ) , es la estatina que ha entrado más recientemente en el mercado. Cualquiera de estas estatinas puede ser utilizada en combinación con el medicamento que aumenta la eliminación del LDL.

En otras modalidades, el medicamento que aumenta la eliminación del LDL, es administrado en una combinación efectiva o alternación con un inhibidor de ácido biliar, ácido nicotínico (niacina), probucol, un derivado de fibrato (bezafibrato, fenofibrato, gemfibrozil, y clofibrato), y Neomicina o colestiramina III ENSAYOS La presente invención, incluye ensayos para determinar (i) el enlace de un medicamento de eliminación del LDL potencial al LDL ó VLDL puede ocasionar un cambio en la conformación de la apoB-100 el cual afectarla el enlace del receptor LDL; y (ii) un método para determinar si el complejo de un medicamento que mejora la eliminación del LDL potencial cambia el patrón de movilidad electroforética de la LDL ó VLDL, y también si la interacción altera la estructura actual de la apoB-100 en la LDL ó VLDL.

Ejemplo 1 El Ester de ácido monosuccinico de probucol se enlaza a la VLDL y LDL in vivo e in vi tro Para examinar si un éster de ácido monosuccinico de probucol se divide con las lipoproteínas circulantes en el plasma, se alimentaron conejos con una dieta alta en grasas durante seis semanas y se les dosificó con el compuesto en una dosis oral de 150 mg/Kg por día. A las seis semanas se les extrajo sangre a los animales y se aislaron las lipoproteinas del plasma a alta velocidad utilizando ultra centrifugación . El plasma completo fue fraccionado por cromatografía líquida de fase rápida (FPLC) utilizando una columna Superóse 6HR 10/30. La elusión se llevó a cabo en una solución salina regulada por fosfato con un contenido de 0.01% de EDTA y 0.02% NaN3 en un rango de flujo de 0.3m/min. Se recolectaron aproximadamente 0.6 ml por cada fracción y estuvieron disponibles para el análisis 20 fracciones. El contenido de colesterol de los picos correspondientes a la lipoproteína de baja densidad (LDL) y a la lipoproteina de alta densidad (HDL) , fue comparado con métodos de referencia CDC. La VLDL corresponde a las fracciones 4 a 8, (volúmenes de elusión 7.2 a 9.6), LDL a las fracciones del 9 a 16 (volúmenes de elusión 10.2 a 14.4) y HDL a las fracciones 17 a 23 (volumen de elusión 15 a 18.6) .

Los niveles de éster de ácido monosuccinico de probucol (MSE) en las diferentes fracciones de lipoproteina, fueron determinados por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) utilizando una columna Rainin C18 (830201-C) . Las fracciones correspondientes a las fracciones diferentes de lipoproteina fueron conjuntadas y secadas por centrifugación al vacio y se volvieron a suspender en 0.5 ml de solución salina regulada por fosfato. El MSE fue extractado con 0.5 ml de éter. 100 µl de la solución de éter fue agregada a 400 µl de acetonitrilo, y 0.02 ml fueron cargadas en la columna. La fase móvil fue 75:20:5 de acetonitrilo, metanol, y ácido acético 50 mM en metanol. La cantidad de enlace de MSE a cada una de las lipoproteinas fue calculada. La Figura 1, es una gráfica de barras de la distribución del éster de ácido monosuccinico ("MSE") de probucol de las proteinas en circulación. La mayor parte (>80%) del MSE fue recuperado en las diferentes fracciones de lipoproteina, habiéndose encontrado la mayoría en la fracción VLDL, seguido por la LDL y algo en IDL y HDL. Se encontró muy poco del éster de ácido monosuccinico de probucol en la fracción de plasma que no era de lipoproteina. Los datos demuestran que el éster de ácido monosuccinico de probucol, se divide con las lipoproteínas circulantes en el plasma principalmente, la VLDL y las fracciones de LDL.

Ejemplo 2 Con el objeto de demostrar el enlace del éster de ácido monosuccinico de probucol a la LDL humana purificada in vi tro, se empleó la electroforesis de agarosa. La electroforesis de agarosa es una técnica utilizada para separar y estudiar las lipoproteinas. El éster de ácido monosuccinico de probucol fue agregado a la LDL, humana purificada y la mezcla fue operada en electroforesis de agarosa. La adición del derivado de probucol a la LDL cambió la movilidad de la LDL, sugiriendo una interacción del éster de ácido monosuccinico de probucol con la LDL, más probablemente una asociación fisica del compuesto con la lipoproteina. En contraste, el probucol no cambió la movilidad de la LDL.

Ejemplo 3 El éster de ácido monosuccinico de probucol se enlaza a la LDL y cambia la expresión del epitope de la LDL-apoB-100 Con el objeto de determinar si el enlace del éster de ácido monosuccinico a la VLDL y LDL puede causar un cambio en la estructura de la apoB-100, se diseñó un ensayo de inmunoreactividad. Este es un ensayo de ELISA de emparedado, el cual mide la expresión de un epitope especifico en la apoB-100. Esencialmente el ensayo de ELISA de emparedado, consiste de un anticuerpo monoclonal especifico dirigido a ese epitope en la apoB-100 como un anticuerpo de captura que yace en una placa de microtitulación. Se le agregó LDL ó VLDL a la placa y se enlazó al anticuerpo como resultado del reconocimiento del epitope especifico. Entonces se utilizó un segundo anticuerpo policlonal para cuantificar la cantidad de LDL capturada. El protocolo detallado de la inmunoreactividad es el siguiente. Una placa de microtitulación nunc maxi-sorp se cubrió durante la noche a una temperatura de 4°C con lOOµl de anticuerpo monoclonal apoB antihumano de Boehringer Mannheim (catálogo número 1533 975) diluido en 1:1000 en PBS pH 7.4. Los compuestos son disueltos en DMSO con una concentración apropiada de LDL durante 15 minutos e incubados a una temperatura de 37 °C. La placa de microtitulación recubierta es lavada tres veces con 200 µl de PBS/tween, .05%, y se le agregó a cada depósito una muestra de 100 µl de LDL/compuesto o LDL estándar. Las placas entonces fueron incubadas durante dos horas a la temperatura ambiente . La placa de microtitulación es lavada tres veces con 200 µl de PBS/tween .05%, y 100 µl de 1:2000 de antiapoliproteína B policlonal humana, de Boehringer Mannheim (catálogo número 726 494) en PBS/tween .0.5% también se le agregó. La placa es incubada durante una hora a la temperatura ambiente. La placa de microtitulación es lavada tres veces con 200 µl de PBS/tween .05%, y se le agregan 100 µl de 1:2000, peroxidasa anti-borrego ig de boehringer Mannheim (catálogo números 605 345) en PBS/tween en 0.5%. La placa es incubada durante una hora a temperatura ambiente . La placa de microtitulación es lavada tres veces con 200 µl de PBS/tween .05%, y se le agregaron 100 µl de substrato de TMB y fue incubada por un período de 5 a 10 minutos en la oscuridad. La reacción es detenida con 15 µl de H2S04 8N y se leyó en el lector de placa Bio Rad Microplate en 45 mn dentro de un periodo de 30 minutos . Como se ilustra en la Figura 6a, la incubación de varios derivados de probucol y succinato de vitamina E aumentó el enlace de la LDL al anticuerpo monoclonal de captura. En contraste, el probucol, succinato y vitamina E no tuvieron un efecto importante en el enlace de la LDL. Estos datos indican que ciertos compuestos incluyendo el éster de ácido monosuccinico de probucol los cuales aumentan el enlace en un 300% en 15 µM, y 500% en 30 uM, pueden alterar la expresión de un epitope especifico en la apoB-100 y aumentan el enlace de la LDL al anticuerpo monoclonal dirigido a dicho epitope. Como se ilustra en la Figura 6b, el éster de ácido monosuccicino de probucol aumenta de un modo similar el epitope apoB-100 en la VLDL, y aumenta el enlace al anticuerpo por aproximadamente 375% en relación con la VLDL nativa.

Ejemplo 4 El éster de ácido monosuccinico de probucol aumenta la asimilación de la LDL por las células del higado (Hep62) en cultivo Con el objeto de probar si el cambio en la estructura de la LDL por el éster de ácido monosuccinico de probucol puede afectar la asimilación de esta lipoproteina por las células del higado in vi tro, se mezclaron LDL radioyodinadas humanas purificadas, con diferentes concentraciones del derivado de probucol y fueron incubadas durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Después de eso, la mezcla de LDL y el derivado de probucol se agregó a las células HepG2 en cultivo y después de 24 horas se midió la asimilación de la LDL radio marcada. En cada concentración del compuesto, la asimilación especifica de la LDL también fue determinada examinando la asimilación de LDL en la presencia de LDL en exceso excedente sin marcar. Como se ilustra en la Figura 3, el éster de ácido monosuccínico de probucol aumentó la asimilación específica de LDL en concentraciones de 18, 25.5 y 33 µM por 12.8, 77.6 y 249 %, respectivamente, en relación con la asimilación de LDL en la ausencia de MSE. Estos datos demuestran que la adición del éster de ácido monosuccinico de probucol a la LDL humana causa la concentración dependiente del aumento en la asimilación de la LDL por las células.

Ejemplo 5 Los cambios estructurales en la apoB-100 causados por el éster de ácido monosuccinico de probucol pueden ser altamente especificos , y no un cambio global en la apoB-100. La especificidad de la expresión del epitope, cambia por el éster de ácido monosuccinico de probucol en donde fue establecido, examinando los efectos del MSE's en otros epitopes eñ el LDL. Esto fue probado utilizando cuatro anticuerpos monoclonales diferentes (IDI, 2D8, 5E11, 4G3) en comparación con el anticuerpo de Boehringer Mannheim (BandM) utilizado en los ensayos descritos anteriormente. Tal como se ilustra en la Figura 7, la expresión del epitope detectada por el anticuerpo BandM en la LDL fue significativamente aumentada por el éster de ácido monosuccinico de probucol y la expresión de los epitopes detectados por los otros cuatro anticuerpos contra la apoB-100 no fue afectado por el MSE. Estos datos demuestran que los cambios estructurales en la apoB-100 causados por el MSE pueden ser altamente específicos, y no un cambio global en la apoB-100.

Ejemplo 6 El éster de ácido monosuccinico de probucol aumenta los Índices de eliminación de la VLDL y LDL y disminuye su concentración en el plasma en los modelos de mono . Un estudio de la rotación de la lipoproteina fue realizado en monos que fueron dosificados con el éster de ácido monosuccínico de probucol, ( 25mg/kg/día por cuatro semanas para cada uno) . Los índices de eliminación de VLDL y LDL fueron examinados antes y después del tratamiento de los animales utilizando una técnica de isótopo estable para marcar la apoB-100 en la VLDL y LDL. Tal y como lo ilustran las Figuras 5a y 5b, existió un aumento marcado en la eliminación de VLDL después del tratamiento con los animales con el derivado de probucol en relación con la dosificación anterior. De un modo similar, los Índices de eliminación de LDL también fueron aumentados por el tratamiento con el éster de ácido monosuccinico de probucol. No hubieron efectos aparentes con el derivado de probucol en la producción de VLDL o LDL. Estos datos demuestran que el tratamiento con el éster de ácido monosuccínico de probucol aumenta el Índice de eliminación de VLDL y LDL.

Ejemplo 7 El éster de ácido monosuccinico de probucol requiere receptores LDL funcionales para sus efectos de disminución de lipidos . Los datos presentados anteriormente sugieren que el éster de ácido monosuccínico de probucol se enlaza a las partículas de LDL, aumenta la asimilación celular de la LDL y por lo tanto aumenta el Índice de eliminación del LDL del plasma. Para explorar si la eliminación aumentada es causada por los receptores LDL del tejido, el mecanismo principal de eliminación para la LDL en el cuerpo, la actividad de disminución del LDL del éster de ácido monosuccinico de probucol fue probado en un modelo de ratón que carece de receptores LDL funcionales (eliminados mediante ingeniería genética) . El tratamiento oral de los ratones con éster de ácido monosuccinico de probucol (150 mg/kg/dia) mezclado junto con una dieta alta en colesterol y en grasas durante 12 semanas, no dio como resultado efecto significativo alguno en los niveles totales de colesterol en el plasma. En contraste el probucol administrado de un modo similar en la misma dosis, disminuyó el colesterol en el plasma de una manera moderada (17%) pero significativa estadísticamente. Estos datos demuestran que los receptores LDL funcionales son requeridos para la disminución del colesterol por el éster de ácido monosuccínico de probucol pero no para la disminución de lipidos por el probucol.

Ejemplo 8 Correlación del ensayo de célula libre con la disminución del colesterol. El éster de ácido monosuccinico de probucol y varios otros compuestos fueron probados in vi tro en el ensayo de inmunoreactividad de célula libre descrito anteriormente en el Ejemplo 3, e in vivo en Hamsters para probar su habilidad para disminuir el colesterol en el plasma. Los resultados se proporcionan en la Tabla 1.

IV Composiciones farmacéuticas . Los humanos, equinos, caninos, bovinos, y otros animales, y en particular los mamíferos, pueden ser tratados para la colesterolemia administrando al paciente una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos anteriormente definidos o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los materiales activos pueden ser administrados por medio de cualquier ruta apropiada, por ejemplo la ruta oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica . Como se usa en la presente invención, el término sales o complejos farmacéuticamente aceptables se refiere a sales o complejos que retienen la actividad biológica deseada de los compuestos anteriormente definidos y que exhiben efectos toxicológicos mínimos no deseados. Los ejemplos no limitativos de dichas sales son (a) sales de adición acida formadas con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, y similares), y las sales formadas con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succinico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, y ácido poligalacturónico; (b) las sales de adición de base formadas con cationes de metal polivalentes tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, niquel, cadmio, sodio, potasio, y similares, o con cationes orgánicos formados a partir de N, N-dibenciletileno-diamina, D-glucosamina, amonio, tetraetilamonio, o etilenodiamina; o (c) las combinaciones de (a) y (b) ; por ejemplo una sal de tanato de zinc o similar. El compuesto activo es incluido en el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva sin causar serios efectos tóxicos en el paciente tratado. Una dosis preferida del compuesto activo para todas las condiciones anteriormente mencionadas se encuentran en un rango de aproximadamente 0.1 a 500 mg/kg, preferentemente de 1 a 100 mg/kg por día. El rango de dosis efectivo de los derivados farmacéuticamente aceptables, puede ser calculado basados en el peso del compuesto antecesor que va a ser administrado. Si el derivado exhibe una actividad por si mismo, la dosis efectiva puede ser estimada como se explicó anteriormente utilizando el peso del derivado, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica. Para la administración sistémica, el compuesto es administrado de manera conveniente en una forma de dosis unitaria adecuada, incluyendo pero sin limitarse a una que contiene de 1 a 3000 mg, preferentemente de 5 a 500 mg del ingrediente activo que forma la dosis unitaria. La dosificación oral de 25-250 mg generalmente es conveniente. El ingrediente activo debe ser administrado para lograr concentraciones pico del plasma del compuesto activo de aproximadamente 0.1 a 100 mM, preferentemente de aproximadamente 1 a 10 mM. Esto puede ser logrado, por ejemplo, mediante u-na inyección intravenosa de una solución o formulación del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o un medio acuoso o administrada como un bolo del ingrediente activo. La concentración del compuesto activo en la composición del medicamento dependerá de la absorción, distribución, inactivación y rangos de excreción del medicamento, así como de otros factores conocidos para aquellos expertos en la técnica. Deberá observarse que los valores de la dosificación también variarán de acuerdo con la severidad de la condición que va ser aliviada. Deberá quedar entendido adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados con el paso del tiempo de acuerdo con la necesidad de la persona, y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de concentración aquí establecidos son únicamente de ejemplo, y no tiene la intención de limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. El ingrediente activo puede ser administrado en una sola dosis, o puede ser dividido en un número de dosis más pequeñas para ser administradas en intervalos variables de tiempo. Las composiciones -'orales generalmente incluirán un diluyente inerte, o un vehículo comestible. Pueden ser encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para propósitos de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y usado en la forma de tabletas, pildoras o cápsulas. Los agentes de enlace farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden ser incluidos como parte de la composición . Las tabletas, pildoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un enlazador tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como ácido alginico, Primogel o almidón de maiz; un lubricante tal como estearato de magnesio o esterotes; un agente de volumen tal como dióxido coloidal de silicona; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o saborizante de naranja. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener además del material de tipo anterior, un vehículo liquido tal como un aceite graso. Además, las formas de dosificación unitaria pueden contener varios otros materiales los cuales modifican la forma física de la unidad de dosis, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca, u otros agentes entéricos. El compuesto activo o la sal o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo puede ser administrado en la forma de un componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, chicle o similar. El jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservadores, tintes y colorantes y saborizantes. El compuesto activo o las sales o derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, también pueden ser administrados con otros ingredientes activos que no perjudiquen la acción deseada, o con materiales que suplementen la acción deseada, tales como antibióticos, antifungales, antiinflamatorios, o compuestos antivirales . Los compuestos activos pueden ser administrados con agentes de disminución de lipidos tales como probucol y ácido nicotínico, inhibidores de agregación de plaquetas tales como aspirina; agentes antitrombóticos tales como cumadina, bloqueadores del canal de calcio tales como verapamil, dialtiazem, y nifedipina; inhibidores de enzimas que convierten angiotensinas (ACE) tales como captopril y enalopril; y ß-bloqueadores tales como propanalol, terbutalol, y labetalol. Los compuestos también pueden ser administrados en composición antiinflamatorias no esteroides tales como ibuprofén, indometacina, aspirina, fenoprofén, ácido mefenamínico, ácido flufenaminico, y sulindac. Los compuestos también pueden ser administrados con corticoesteroides. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilénglicoles , glicerina, propilénglicol, u otros solventes sintéticos; agentes antibacteriales tales como alcohol bencílico y metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilenodiamintetraacético ; reguladores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede ser encerrada en ampolletas, jeringas desechables, y viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Los vehículos o transportadores adecuados para la aplicación tópica son conocidos, e incluyen lociones, suspensiones, ungüentos, cremas, geles, tinturas, rocíos, polvos, pastas, parches transdérmicos de liberación lenta, aerosoles para el asma, y supositorios para la aplicación rectal, vaginal, nasal, o mucosa oral. Los agentes espesantes, emolientes y estabilizadores pueden ser usados para preparar las composiciones tópicas. Los ejemplos de los agentes espesantes incluyen petróleo, cera de abeja, goma xantano o polietilénglicol, humectantes tales como sorbitol, emolientes tales como aceite mineral, lanolina y sus derivados o escualeno. Una cantidad de soluciones y ungüentos se encuentran disponibles en el mercado . Se le pueden agregar saborizantes o edulcorantes naturales o artificiales, para aumentar el sabor de las preparaciones tópicas aplicadas para el efecto local _a las superficies de la mucosa. Se le pueden agregar tintes y colores inertes, particularmente en el caso de preparaciones diseñadas para aplicación a la superficie de la mucosa oral. Los compuestos activos pueden ser preparados con vehículos que protegen el compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etileno vinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres , y ácido poliacéi-ico . Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por aquellos expertos en la técnica . Si el compuesto activo va a ser administrado de manera intravenosa, los vehículos preferidos son solución salina fisiológica, o solución salina amortiguada por sulfato (PBS) .

El compuesto activo también puede ser administrado a través de un parche transdérmico . Los métodos para preparar los parches transdérmicos son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, consultar en la publicación de Brown, L., y Langer, R., Administración transdérmica de medicamentos (Transdermal Delivery of Drugs) Annual Review of Medicine, 39: páginas 221 a 229 (1988), incorporado a la presente descripción como referencia. En otra modalidad, los compuestos activos son preparados con vehículos que lo protegerán contra la eliminación rápida del compuesto del cuerpo, tales como formulaciones de liberación controlada, incluyendo implantes, y sistemas de administración microencápsulada . Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etileno vinilo, polianhídridos , ácido poligicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliacético. Los métodos de preparación de dichas formulaciones serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales también pueden ser obtenidos comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas también pueden ser vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden ser preparados de acuerdo con los métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, tales como los que se describen en la Patente Norteamericana No. 4,522,811 (la cual está incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia) por ejemplo, las formulaciones de liposomas pueden ser preparadas disolviendo el lipido (s) apropiado (s) (tales como estearoil, fosfatidil, etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina y colesterol) en un solvente inorgánico que luego es evaporado, dejando atrás una película delgada del lípido seco en la superficie del recipiente. Posteriormente se introducen en el recipiente una solución acuosa del compuesto activo, o sus derivados monofosfato, difosfato y/o trifosfato. El recipiente entonces es agitado a mano para liberar el material lipido de los lados del recipiente, y para dispersar los agregados del lipido formando de esta manera la suspensión' liposómica. Las modificaciones y variaciones de la presente invención serán obvias para aquellos expertos en la técnica a partir de la lectura de la descripción anterior. Todas estas modalidades se considera que se encuentran dentro del alcance de la presente invención .

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método para evaluar si un compuesto es un medicamento que aumenta la eliminación de LDL, el cual incluye la mezcla del medicamento in vivo o in vi tro, con la lipoproteína que contiene el colesterol; el aislamiento del complejo, y la determinación de si el enlace del compuesto al complejo origina un cambio en la conformación tridimensional de la apoB-100 en la lipoproteina que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteina al receptor LDL; en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol, o mono-o di-éster de probucol, ni un compuesto descrito en el documento WO 98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5, 608, 095. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la lipoproteina que contiene colesterol es LDL. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la lipoproteina que contiene colesterol es VLDL. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el enlace del compuesto al complejo es determinado por un ensayo de ELISA de emparedado. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el enlace del compuesto al complejo es determinado utilizando electroforesis de agarosa . Un método para alterar la conformación de una lipoproteina que contiene colesterol que comprende la mezcla de in vivo o in vi tro de la lipoproteína que contiene el colesterol con un compuesto y la determinación de si el enlace del compuesto al complejo origina un cambio en la conformación tridimensional de la apoB-100 en la Üpoproteina que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteina a un receptor LDL. Un método para determinar si un alto nivel de colesterol en el plasma en un huésped, es debido a una alteración genética de la proteína apoB-100 del huésped que comprende la administración de un medicamento que aumenta la eliminación de LDL al paciente, observando una disminución inferior a la normal en el nivel de colesterol en el plasma, y luego aislando y evaluando la proteína apoB-100 del huésped. Un método para determinar si el alto nivel de colesterol en el plasma en un huésped, es debido a una alteración genética de la proteína apoB-100 del huésped que comprende la exposición de la proteína apoB-100 del huésped a un medicamento que aumenta la eliminación de LDL in vi tro bajo condiciones en las cuales la proteina apoB-100 del huésped y el medicamento pueden formar un complejo, y luego aislando y evaluando el cambio en la conformación de la proteína apoB-100 del huésped causado por dicho complejo. Un método para determinar si un compuesto origina un cambio en la estructura de apoB-100 en una lipoproteína que contiene colesterol que sería terapéuticamente útil, la cual comprende la realización de un ensayo de inmunoreactividad de emparedado en el cual un anticuerpo dirigido a un epitope en la proteina apoB-100 (que se sabe que es importante para el proceso de enlace del receptor LDL) como un anticuerpo de captura el cual yace sobre una placa, y se le agrega a la placa un complejo del compuesto de prueba/lipoproteina que contiene colesterol, y un segundo anticuerpo, el cual puede ser policlonal o monoclonal y luego es utilizado para cuantificar la cantidad de complejo LDL capturado . . Un método para evaluar un cambio en la conformación de la lipoproteina que contiene colesterol originado por el complejo, con un compuesto de prueba que comprende la evaluación del cambio en el patrón de movilidad electroforética de la lipoproteina que contiene colesterol utilizando electroforesis. . Un método para disminuir el colesterol en el plasma en un huésped que comprende la administración de una cantidad efectiva de un compuesto que se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteína y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 al receptor LDL, en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol o un mono-o di-éster de probucol, ni un compuesto descrito en el documento WO98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5, 608, 095. . El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el receptor LDL se encuentra en la superficie de las células hepáticas. . El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la lipoproteína portadora del colesterol es LDL. . El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la lipoproteína portadora del colesterol es VLDL. . Un método para evaluar si un compuesto se enlaza a la lipoproteína de una manera la cual, disminuye el colesterol en el plasma que comprende la elaboración de un complejo del compuesto con la lipoproteina que contiene el colesterol, aislando el complejo resultante, y determinando si el enlace del compuesto al complejo origina un cambio en la conformación tridimensional de la apoB-100 en la lipoproteína que aumenta la afinidad de enlace de la lipoproteína al receptor LDL. . Un método para disminuir el colesterol en el plasma en un huésped, el cual comprende la administración de una cantidad efectiva de un compuesto que se enlaza a la lipoproteína portadora de colesterol, de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteína y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 al receptor LDL en combinación o alternación con un segundo medicamento que disminuye el colesterol mediante una trayectoria biológica diferente; en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol, o un mono- o di-éster de probucol, no es un compuesto descrito en el documento WO 98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5,608,095. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el receptor LDL se encuentra en la superficie de las células hepáticas. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la lipoproteína portadora del colesterol es LDL. 19. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la lipoproteína portadora del colesterol es VLDL. 20. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el segundo medicamento es seleccionado del grupo consistente de una estatina, un inhibidor de ácido biliar, ácido nicotínico, probucol, un derivado de fibrato, Neomicina y colestiramina. . El uso de un compuesto para disminuir el nivel de colesterol en el plasma en un huésped, en donde el compuesto se enlaza a la lipoproteina portadora del colesterol de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteína y aumenta la afinidad de enlace de la proteína apoB-100 al receptor LDL, en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol o un mono- o di-éster de probucol, ni un compuesto descrito en el documento WO 98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5, 608, 095. . El uso de un compuesto en la preparación de un medicamento para disminuir el nivel de colesterol en el plasma de un huésped, en donde el compuesto enlaza la lipoproteína portadora del colesterol de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteína y aumenta la afinidad de enlace de la proteina apoB-100 al receptor LDL; en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol, o un mono-o di-éster de probucol, no es un compuesto descrito en el documento WO 98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5,608,095. . El uso de un compuesto para disminuir el colesterol en el plasma en un huésped, el cual comprende la administración de una cantidad efectiva de un compuesto que se enlaza a la lipoproteína portadora del colesterol de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteína y aumenta la afinidad de enlace de la proteína apoB-100 al receptor LDL en combinación o alternación con un segundo medicamento que disminuye el colesterol mediante una trayectoria biológica diferente; en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol o un mono- o di-éster de probucol, no es un compuesto descrito en el documento WO 98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5, 608, 095. . El uso de un compuesto en la preparación de un medicamento para disminuir el colesterol en el plasma en un huésped, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un compuesto que se enlaza a la lipoproteína portadora de colesterol de una manera que altera la configuración tridimensional de la lipoproteina y aumenta la afinidad de enlace de la proteína apoB-100 al receptor LDL en combinación o alternación con un segundo medicamento que disminuye el colesterol por medio de una trayectoria biológica diferente; en donde el medicamento que aumenta la eliminación de LDL no es probucol o un mono- o di-éster de probucol, no es un compuesto descrito en el documento WO 98/09773, y no es un compuesto sililo descrito en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,250 ó 5, 608, 095.