MXPA00012237A - Biblioteca de compuestos combinatorios derigidos y ensayos de alto rendimiento para seleccionar los mismos. - Google Patents

Abstract

Se describe una biblioteca de compuestos combinatorios que comprende una coleccion una coleccion predeterminada de moleculas de peptidos de nucleosidos para inhibir la transferencia de un azucar a partir de un nucleotido donador de azucar seleccionado a un aceptor seleccionado mediante una enzima procesadora de carbohidratos. La molecula de peptido de nucleosido comprende (a) un monomero de nucleosido, (b) un monomero espaciador acoplado al monomero de nucleosido, en donde el monomero espaciador comprende una o mas amidas unidas a residuos de aminoacidos, o un peptidometico; y (c) monomeros de casquete acoplados al monomero espaciador. Las moleculas de peptido de nucleosidos difieren una de la otra por la identidad de al menos un elemento del monomero de nucleosido monomero espaciador, o monomero de casquete.

Description

BIBLIOTECA DE COMPUESTOS COMBINATORIOS DIRIGIDOS Y ENSAYOS DE ALTO RENDIMIENTO PARA SELECCIONAR LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está dirigida hacia acervos ó bibliotecas predeterminadas de compuestos, compuestos relacionados útiles para elaborar tales acervos, y composiciones que contienen los compues os.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las interacciones entre proteínas y carbohidratos están involucradas en un amplio rango de eventos de reconocimiento biológicos, que incluyen fertilización, elección de objetivos moleculares, reconocimiento intracelular, y patogénesis viral, bacteriana y fúngica. Las porciones de oligosacáridos de las glicoproteínas y el reconocimiento mediado por glicolípidos entre células y células y ligandos, entre células y la matriz extracelular, y entre células y patógenos .

La inhibición de las enzimas que procesan carbohidratos involucradas en la síntesis, transporte, y fragmentación de oligosacáridos puede usarse como medio de REF.125849 inhibir las interacciones entre proteínas y oligosacáridos e inhibir el fenómeno de reconoci imiento. En particular, dos grupos de enzimas asociadas con la síntesis in vivo de oligosacáridos pueden ser elegidas como objetivo. Las enzimas del ciclo de Leloir transfieren azúcares activadas como fosfatos de nucleósidos de azúcar para un crecimiento de la cadena olisacárida.. El fosfato de nucleósido que construye bloques involucrados en el ciclo de Leloir incluye: UDP-Glc, UDP-GlcUA, UDP-GlcNAc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, UDP-Idua, GDP-Man, GDP-Fuc, y CMP-NeuAc. El otro grupo de enzimas asociado con la síntesis in vivo de oligosacáridos son las enzimas que no siguen el ciclo de Lelsir que transfieren unidades carbohidratos activadas como fosfatos de azúcar, pero no como fosfatos de nucleósidos de azúcar.

Las glicosiltransferasas catalizan la adición de azúcares activados de nucleótidos de un modo escalonado a una proteína ó lípido ó al extremo no reductor de un olicosacárido en desarrollo. Se ha estimado que hay más de 200 glicosiltransferasas codificadas en células de mamíferos, muchas de las cuales parecen ser reguladas experimentalmente, dando como resultado patrones específicos de glicosilación de tejido (Schachter, H. Curr. Opin. Struct-Biol. 1:755-765, 1991; y Pulson J. C, y Colley, K. J. J. Biol.. Chem. 264:17615-17618, 1989). Cada residuo de azúcar-NDF requiere una clase distinta de glicosiltransferasa y cada una de las glicosiltransferasa parece catalizar la formación de una unión glicosídica única. Los oligosacáridos pueden unirse a proteínas por uniones N-glicosídicas ó O-glicosídicas. En una unión-N, un residuo N-acetil glucosamina es unido en ß al nitrógeno de la amida de una Asn en la secuencia Asn-X-Ser ó Asn-X-Thr (X es cualquier aminoácido) . En una unión 0, el disacárido ß-galactosil- (1, 3) -alfa-N-acetilgalactosamina está unido en alfa al grupo hidroxilo de serina ó treonina.

Las enzimas ß de Golgi (T1-6)N-acetilglucosaminiltransferasa V (ver GlcNAc-TV) y el núcleo 2 ß (Tl-6) N-acetilglucosaminiltransferasa (ver el núcleo 2 GlcNAc-T) son responsables de la extensión de GlcNAc ß(Tl-6) ramificada unida a la cadena lateral del carbohidrato en N- y en O- de las glicoproteínas de superficie celular. Estas cadenas laterales se encuentran sobre la superficie de células tumorales humanas y se han asociado con invasión de cáncer y metástasis (Dennis y colaboradores, Science 236:582, 1987; De etriou y colaboradores, J. Cell Biol . . 130: 383, 1995). GlcNAc-TV y el núcleo 2 GlcNAc-T se ha demostrado que están sobre-regulados en carcinomas humanos (Fernández y colaboradores, Cáncer Res . 51:718-723, 1991; Shi odaira K. y colaboradores Cáncer Research 57:5201, 1997), un fenómeno que se ha asociado con la activación de la ras que indica el camino (Dennis y colaboradores, Science 236: 582-585, 1987; Dennis y colaboradores Oncogene 4:853-860, 1989)). La sobre-expresión de GlcNAc-TV en células epiteliales se ha encontrado que dan como resultado transformación morfológica y formación de tumores en ratones (Demetrius y colaboradores J. CelJ Biol . . 130:383-392, 1995) . Por consiguiente, GlcNac-TV así como también las enzimas que abasteces los substratos receptores para GlcNAc-TV (ver Glc?Ac-TI, a-manosidasas II y el núcleo 2 GlcNAc-T del ciclo unido a O) son objetivos útiles para productos farmacéuticos anti-cáncer.

Las Fucosiltransferasas están involucradas en la determinación de la expresión del antígeno sialilo de Lewis (sLexx) sobre la superficie de las células sanguíneas. En el proceso inflamatorio, la selectina-sLexx media la fijación de los leucocitos en una etapa clave para la activación de los leucocitos y la migración trans-endotelial. La inhibición de las flucosiltransferasas responsable de la síntesis de sLexx prevendrá la formación de los complejos selectin-carbohidrato y por consiguiente interferirá con la primera etapa del proceso inflamatorio. Los inhibidores serían útiles para el tratamiento de transtornos inflamatorios crónicos tales como asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y arterieesclerosis. Todos estos transtornos son condiciones en las que la respuesta inflamatoria está involucrada y la supresión es deseable.

El bloqueo de ciertas enzimas en el ciclo de procesamiento de los carbohidratos conduce a un incremento en la sensibilidad de células inmunes a las citocinas Thl (interferon e interleucina-2) , que promueve así la respuesta inmune de Thl. Mientras que los interferones-alfa mismos tienen actividad anti-viral, parecen ser insuficiente sobre sí misma en eliminar infecciones crónicas tales como hepatitis. Por consiguiente, inhibidores enzimáticos pueden usarse para mejorar el efecto de las citocinas Thl en el tratamiento de muchas infecciones virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias, que incluyen hepatitis B y C.

Los inhibidores de enzimas que sintetizan estructuras de carbohidratos específicos de bacterias que desempeñan un papel importante en la patogenicidad, pueden usarse para mejorar la susceptibilidad de la bacteria en el sistema del huésped y para inhibir la entrada de la bacteria en células y tejidos humanos. Por ejemplo, juna estructura de carbohidrato bacteriano específica llamada oligosacárido de bajo peso molecular (LOS) que es similar a una estructura de carbohidrato encontrada en glicoproteínas y glicolípidos humanos, protege el bacterium desde que es reconocido y clarificado por el sistema inmune del huésped. Los inhibidores de las enzimas responsables de sintetizar la estructura LOS pueden reducir la capacidad de bacterias tales como N. Gonorrea para eludir la vigilancia inmune en un huésped.

Es obvio que hay una necesidad de inhibidores de pequeñas moléculas de enzimas procesadoras de carbohidratos que incluyen GlcNAc-transferasas I hasta V, galactosiltransferasas, sialo transferasas, fucosil transferasas, y el núcleo 2-GlcNAc, con diversidad estructural y de conformación. Hay también necesidad de métodos de alto rendimiento para seleccionar a los inhibidores para conducir a la "identificación" de compuestos farmacéuticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención utiliza una aproximación química combinatoria. La química combinatoria generalmente concierne a unir juntos, en forma de etapas secuenciales, bloques de construcciones no- idénticas típicamente mencionadas como "unidades monoméricas'', ó "grupos químicos". Utilizando estas aproximaciones, los inventores de la presente desarrollaron bibliotecas ó acervos combinatorios de inhibidores de molécula pequeña de enzimas que procesan carbohidratos los cuales trasfieren un azúcar desde un nucleótido de azúcar específico donante hasta un receptor específico. Los inhibidores de molécula pequeña tienen diversidad estructural y de conformación. Las enzimas que pueden ser inhibidas por los inhibidores de molécula pequeña incluyen glicosiltransferasas eucarióticas y procarióticas. Las moléculas pueden ser seleccionadas utilizando métodos de alto rendimiento que facilitan la identificación de compuestos farmacéuticos derivados.

La presente invención concierne a una biblioteca ó acervo combinatorio ampliamente establecido que comprende una colección pre-determinada de moléculas de péptido nucleosido para inhibir la transferencia de un azúcar desde un nucleótido de azúcar donante a un receptor seleccionado por una enzima procesadora de carbohidratos en la que una molécula de péptido nucleosido comprende un (a) un monómero nucleósido ; (b)un monómero espaciador acoplado al monómero nucleósido en el que el monómero espaciador comprende uno ó más aminoácidos, ó un péptidomimético ó péptido análogo; y (c) monómeros encubridores fijados al monómero espaciador; en los que las moléculas de péptido nucleósido difieren cada una de las otras de modo que la identidad en al menos un elemento del monómero nucleósido, monómero espaciador ó monómero encubridor.

Además, una molécula de péptido nucleosido se contempla que comprenda (a) un monómero nucleosido; (b) un monómero espaciador acoplado a un monómero nucleosido, en el que el monómero espaciador comprende uno ó más aminoácidos, ó un péptidomimético ó péptido análogo; y (c) monómeros encubridores fijados al monómero espaciador.

La invención también concierne a un proceso para preparar una biblioteca ó acervo combinatorio que contiene una colección pre-determinada de moléculas de péptidos nucleosidos para inhibir la tranferencia de azúcar desde un nucleótido de azúcar donante seleccionado que tiene una base amina heterocíclica, a un receptor seleccionado por una enzima procesadora de carbohidratos que comprende: (a) acoplar uno ó más aminoácidos ó un péptidomimético ó péptido análogo, a una unidad de monómero nucleósido comprende una base amina heterocíclica acoplada a un azúcar en la que la base corresponde a la base aminada heterocíclica del nucleótido de azúcar donante, ó una forma modificada ó análogo de la base; y (b) encubrir cualquiera de los grupos funcionales ó grupos amina con una unida monómera encubridora.

La invención también concierne a métodos de usar la biblioteca ó acervo combinatorio para seleccionar por moléculas activas famacéuticamente; y composiciones que contienen compuestos identificados por los métodos.

Adicionalmente, la invención contempla un bioensayo en fase sólida para identificar un compuesto que tiene actividad inhibidora contra una enzima procesadora de carbohidratos que comprende (a) acoplar un receptor para la enzima procesadora de carbohidratos a un polímero y recubrir sobre un vehículo; (b) añadir una enzima procesadora de carbohidratos, un nucleótido de azúcar donante marcado con una substancia detectable, y un compuesto de prueba; y (c) medir el cambio detectable producido por la substancia detectable.

La invención también contempla un método para identificar un compuesto que inhibe el proceso de oligosacáridos N-enlazados que comprende (a) hacer reaccionar un compuesto de prueba con células que expresan a oligosacáridos N-enlazados, en presencia de fitohemaglutinina leucoaglutinante (L-PHA) y medir la actividad de la fosfatasa alcalina; y (b) comparar a un control en ausencia del compuesto en el que un incremento en la actividad fosfatasa alcalina indica que el compuesto inhibe el proceso del oligosacárido N-enlazado. El método puede usarse para identificar compuestos que inhiben todas las etapas en el ciclo del oligosacárido N-enlazado antes de lá Gal-transferasa ßl-4, que incluye compuestos que inhiben a las enzimas procesadoras de carbohidratos específicamente descritas en la presente, y a la a-maosidasa de Golgi.

Un compuesto contemplado en la presente invención que tiene actividad inhibidora contra una enzima procesadora de carbohidratos puede ser útil para el . tratamiento y profilaxis del crecimiento de tumores y metástasis de tumores; la prevención de la recurrencia de tumores después de cirugía; el tratamiento de otras condiciones antiproliferativas tales como infecciones virales; el estimulo de la proliferación celular en la médula ósea, el tratamiento de pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes infectados con HIV, u otros virus ó agentes infecciosos que incluyen bacterias y hongos; la prevención y tratamiento de enfermedades causadas por bacterias patógenas que tienen estructuras de carbohidratos en su superficie asociadas con virulencia tal como especies de Neisseria, Haempphilus, E. coli , Bacillus, Salmonella, Campylobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Borrelia, Coxiella, Helicobacter, y Mycobacterium; ó el tratamiento de transtornos inflamatorios tales como asma, artritis reumatoide, enfermedades intestinales inflamatorias, y arterioesclerosis . Un compuesto de la invención puede también usarse en pacientes sometidos a trasplantes de médula ósea, y como agentes hemorestauradores ó quimioprotectores en pacientes con supresión inmune inducida por tumores ó química.

Otros objetos, características -y ventajas de la presente invención serán obvios de la siguiente descripción detallada. Se comprenderá, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos mientras que indican modalidades preferidas de la invención se dan a manera de ilustración solamente, puesto que varios cambios y modificaciones en el espíritu y alcance de la invención serán obvias a los expertos en la materia desde esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención será descrita en relación a los dibujos en los cuales: La figura 1, es un diagrama esquemático que expone un proceso para preparar 2, 3-0-isopropildineuridina desde uridina; La figura 2, es un diagrama esquemático que expone un proceso para preparar sulfinil uridina de 2,3-0-isopropilideno-5-0-metano desde 2, 3-O-isopropilidina uridina; La figura 3 es un diagrama esquemático que expone un proceso para preparar 5-desoxi-5-azido-2, 3-0-isopropilidenil uridina desde 2, 3-0-isopropilideno-5-0-metansulfonil uridina; La figura 4 es un diagrama esquemático que expone un proceso para preparar 5-desoxi-5-amino-2, 3, -0-isopropilidenil uridina desde el genitor azida; La figura 5 es un diagrama esquemático que expone un proceso para acoplar una unidad monómera espaciadora protegida N-Boc a una unidad monómera nucleosida; La figura 6 es un diagrama esquemático para un proceso para desproteger una unidad monómera espaciadora protegida N-Boc acoplada a una unidad monómera nucleosida; La figura 7 es un diagrama esquemático que expone un proceso para acoplamiento repetido de -unidades monómeras espaciadoras protegidas-F oc a una unidad monómera nucleosida; La figura 8 es un diagrama esquemático para cubrir una unidad monómera espaciadora que está acoplada a una unidad monómera nucleosida; La figura 9 es un diagrama esquemático que expone la síntesis de un glicopolímero por un ensayo de núcleo 2 GlcNAc-T en fase sólida; La figura 10 es un diagrama esquemático que expone un glicopolímero por un ensayo GlcNAc-T V en fase sólida; La figura 11 es una gráfica que expone la distribución de los ensayos normalizados del núcleo 2 GlcNAc-T para 1600 ensayos expresados como % del control; y La figura 12 es una gráfica que expone los resultados de una selección de alto rendimiento para detectar extractos microbianos con efectos inhibidores sobre el oligosacárido N-enlazado que se procesa en células D2-MDAY DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INV?NCION Moléculas de Péptido nucleosido Como se utiliza en la presente, "unidad monómera" se refiere a una molécula antes de acoplamiento ó conjugación a otra unidad monómera. Un "monómero" se refiere a una molécula después de acoplamiento ó conjugación para formar una molécula de péptido nucleosido. Las unidades monómeras usadas en la presente invención para formar las moléculas de péptido nucleosido predeterminadas incluyen una unidad monómera nucleosida, una unidad monómera espaciadora, y una unidad monómera encubridora.

Una unidad monómera nucleosida es seleccionada en base al tipo de enzima procesadora de carbohidratos elegida como objetivo para inhibición, y en particular el nucleótido de azúcar donante para la enzima desde la cual un azúcar es transferida a un receptor. Un "nucleótido de azúcar donante" se refiere a una molécula que comprende un nucleótido que tiene un componente azúcar, una base amina heterocíclica, y una unidad fosfato, acoplada a un azúcar seleccionada que es transferida por una enzima procesadora de carbohidratos a un receptor. Un "receptor" se refiere a la parte de una estructura carbohidrato (por ejemplo, glicoproteína, glicolípido) en la que el azúcar seleccionado es transferido por una enzima procesadora de carbohidratos .

Las_ enzimas procesadoras de carbohidratos para las que pueden prepararse acervos combinatorios de conformidad con la invención incluyen las glicosiltransferasas eucarióticas involucradas en la biosíntesis de glicoproteínas, glicolípidos, glicosilfosfatidilinositoles y otros complejos glicoconjugados, y las glicosiltransferasas procarióticas involucradas en la síntesis de las estructuras carbohidratos de bacterias y virus, que incluyen a las enzimas involucradas en la biosíntesis de LOS y lipopolisacáridos. Ejemplos de enzimas incluyen glicosiltransferasas tales como N-acetilglucosaminiltransferasas, que incluyen N- acetilglucosaminiltransferasas I hasta V y ß-1,3-galactosil-O-glicosil-glicoproteínas ß- 1, 6-N-acetilglucosaminil transferasa (núcleo 2 GlcNAc) ; fucosiltransferasa; ?-acetilgalactosaminiltransferasas; galactosiltransferasas; manosiltransferasas; y glucuronosiltransferasas, preferiblemente ?-acetilglucosaminiltransferasas . La tabla I proporciona ejemplos de enzimas procesadoras de carbohidratos eucarióticas, y sus nucleótidos de azúcar donantes y receptores. La tabla 2 proporciona una lista de enzimas procesadoras de carbohidratos procarióticas .

Una unidad monómera nucleosida usada en las moléculas de la presente invención está compuesta de una base amina heterociclica en un enlace ß-?-glicosídico con un azúcar. Generalmente, el azúcar es ribosa, ó desoxiribosa, y la base amina heterocíclica corresponde a la base amina heterociclica de nucleótido de azúcar donante para una enzima procesadora de carbohidratos seleccionada. Por ejemplo, el uracilo puede ser seleccionado para ?-acetilglucosaminiltransferasas y galactosiltransferasas: citosina para asíalo transferasas, y guanina para fucosiltransferasas .

Análogos estructurales de las bases aminas heterocíclicas pueden también usarse. Por ejemplo, cuando la' base es uracilo puede tener grupos en la posición C-5 que incluyen pero no se limitan a alquilo ó arilo con grupos donantes de electrones y extractores de electrones. Los grupos hidroxilo en la base pueden también estar protegidos. El azúcar puede ser modificada, por ejemplo, los hidroxilos 2' y 3' pueden estar bloqueados con acetonida, acilado, ó alquilado ó substituido con otros grupos tales como halógeno.

Ejemplos específicos de unidades m?nómeras nucleosidas incluyen uridina, 2 ' -desoxiuridina, y 5' -a ino-5' -desoxi-2 ' , 3'-0-isopropilidina uridina (para galactosiltransferasas y GlcNAc transferasas, histidina, 2 ' -desoxicitidina, 5' -amino-5' -desoxi-2' , 3' -0-isopropilidincitidina (para asíalo transferasas) , una guanosina, 2 ' -desoxiguanosina, 5' -amino-5' -desoxi-2' -3' -O-isopropilidenguanosina (para fucosiltransferasas) respectivamente.

Una unidad monómera nucleosida es enlazada a una unidad monómera espaciadora por acoplamiento apropiado de grupos reactivos tales como ácidos carboxílicos, ó esteres activados de los mismos (por ejemplo hidroxibenzotriazol, pentafluorofenol ó esteres de N-nidroxisuccinimida) , anhídridos carboxílicos (mezclados ó simétricos) , haluros de acilo, cloroformiatos, haluros, cetonas, aldehidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos, ó isotiocianatos, a otros grupos funcionales reactivos tales como aminas para formar un enlace estable tal como una amida, carbamato, amino, "sulfonamida, urea, ó isourea, preferiblemente una unión ami da. Cada una de las unidades monómeras pueden tener uno ó más grupos reactivos idénticos ó diferentes.

Una unidad monómera espaciadora para uso en la invención puede comprender cualquier grupo funcional que simule la unión fosfato/azúcar en un nucleótido de azúcar donante para cada enzima procesadora de carbohidratos, ó que interactúa con la enzima por otros mecanismos . La unidad monómera espaciadora puede tener un centro cargado . Ejemplos de unidades monómeras espaciadoras que pueden usarse en las moléculas de la invención incluyen uno ó más aminoácidos, preferiblemente un solo aminoácido, un dipéptido, ó tripéptido, ó péptidomiméticos/péptido análogo .

. Los aminoácidos usados en la unidad monómera espaciadora pueden ser aminoácidos sintéticos ó naturales, y pueden ser alifáticos, ó aromáticos. Un aminoácido en la unidad monómera espadadora puede ser un aminoácido quiral ó aquiral que incluye pero no se limita a un L-aminoácido, un D-aminoácido, un a-aminoácido, unß-aminoácido, ó un análogo de un aminoácido. Además, uno ó más aminoácidos, en la unidad monómera espaciadora pueden ser substituidos con un grupo substituyente tal como una amida, alquilo, amina, halógeno, éter, heterociclo, ó un grupo ácido tal como -COOH, ó S03H. Los aminoácidos pueden ser cubiertos con grupos protectores adecuados como se describe en la presente. El aminoácido ó péptidos pueden comprender residuos de aminoácidos ácidos que incluyen ácido aspártico ó ácido glutámico, y esteres mono-nencílicos ó t-butil esteres del ácido glutámico ó aspártico (por ejemplo, en las posiciones a- y ß- para el formador, y a- y ?- para el siguiente) .

Ejemplos de los aminoácidos que pueden usarse en las unidades monómeras espaciadoras incluyen éster del ácido-a-bencil L-aspártico, éster del ácido-?-bencil L-glutamico, éster del ácido-ß-bencil D-aspártico, éster del ácido-ß-bencil L-aspártico, éster del ácido-a-bencil L-glutámico, L-triptofan, ácido 6-aminohexanoico, L-valina, m-tosil-L-histidina, L-leucina, p-metoxi-bencil-L-cisteína, sarcosina, L-isoleucina, L-aspargina, tp-p-tosil-L-arginina, tp-nitro-L-arginina, N-e-CBz-L-lisina, L-glutamina, L- alanina, O-bencil-L-treonina, O-bencil-L-tirosina, L-metionina, O-bencil-L-serina, L-prolina, L-fenilalanina, ß-alanina, ácido a-aminobutírico, homoarginina, homoprolina, homoserina, norarginina, norleucina, ornitina, y p-nitrofenilalanina.

Los análogos de péptidos ó peptidomiméticos pueden también usarse en la unidad monómera espaciadora. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un paradigma, tales como péptidos naturales, pero tienen una ó más enlaces péptidos opcionalmente reemplazados por ejemplo, por un enlace seleccionado del grupo gue consiste de -CH_NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -C0CH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO- por métodos conocidos en la materia y adicionalmente descritos en las siguientes referencias: Spatola, A. F. "En CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMI?O ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEI?S, B.

Weinstein, eds. Marcel Dekker, ?ew York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Marzo de 1983), Vol. I, Issue 3, PEPTIDE BACKBO?E MODIFICATIO?S (revisión general) ; Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468 (revisión general); Gaute (1994) Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 33: 1699-1720; Giannis y Kolter (1993), Angew, Chem. Int. Ed. Engl., 32: 1244-1267; Hudson, D. y colaboradores, (1979) Int J. Pept Prot. Res. 14: 177-185 (—CH2?H—, CH2-CH2—); Spatola y colaboradores (1986) Life Sci 38:1243-1249 (—CH2-S) ; Hann (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (-CH=CH-, cis y trans); Almquist y colaboradores (1980) J. Med Chem 23: 1392-1398 (-COCH2-) ; Jennings-White y colaboradores (1982) Tetrahedron Lett 23:2533 (-COCH2-) ; Szelke y colaboradores, (1982) European Appln. EP 45665 CA: 97:39405 (1982) (- CH(OH)CH2-); Holladay y colaboradores, (1983) Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (-C (OH)"CH2-) ; y Hruby (1982) Life Sci 31:189-199 (-CH__-S-) ; cada una de las cuales se incorpora a la presente co o referencia. Los análogos de péptidos ó peptidomiméticos también incluyen péptidos en los que el N-terminus es derivado por ejemplo a un grupo -NXXt, a un grupo -NXC(0)X, a un grupo -NXC (0) OX, a un grupo -NXS(0)2X, a un grupo -NHC(0)NHX en donde X y Xt son hidrógeno ó alquilo inferior con la condición de que X y Xt no sean ambas hidrógeno, a un grupo succinimida, a un grupo benciloxicarbonil-NH— (CBZ—NH—), a un grupo benciloxicarbonil-NH— que tiene desde 1 hasta 3 substituyentes sobre el anillo fenilo seleccionado del grupo gue consiste de alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro, y bromo, péptidos en los que el C terminus es derivado a -C(0)X2 en donde X2 es seleccionado del grupo gue consiste de alcoxi inferior, y -NX3X4 en donde X3 y X4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo inferior.

Grupos funcionales libres en una molécula de péptido nucleosido, en particular grupos amina libres en el monómero espaciador, pueden ser cubiertos utilizando el mismo ó diferentes grupos reactivos químicos usados por una unidad monómera espaciadora que acopla a una unidad monómera nucleosida. Ejemplos de unidades monómeras encubridoras incluyen ureas, tioureas, carbamatos, y residuos de amidas, las cuales pueden ser parte de anillos aromáticos, anillos no-aromáticos, heterocíclicos, carbocíclicos, ó sistemas anulares fusionados. Derivados reactivos de alcaloides naturales tales como swainsonina ó castanospermina pueden también usarse como monómeros encubridores. Ejemplos de reactivos disponibles comercialmente que pueden usarse para formar las unidades monómeras encubridoras incluyen: cloruro de benzoilo, isocianato de bencensulfonilo, isocianato de 4-toluensulfonilo, cloruro de 2-furonilo, isocianato de (R) -a-metilbencilo, isocianato de 4- (trifluorometiltio) fenilo, 2-metoxicarbonilo, isocianato de fenilo, cloruro de 4-morfolin carbonilo, l-isotiocianato-4- (trans-4-ocrilciclohexil) enceno, isocianato de 3- (trifluorometil) fenilo, cloruro de 1-adamantancarbonilo, isocianato de 4-clorobencen sulfonilo, cloruro de quinoxay, cloruro de 2-tiofencarbonilo, isocianato de 2-naftilo, cloruro de 2-tiofenacetilo, isocianato de 1-adamantilo, cloruro de 3-ciclopentilpropionilo, cloruro de pirrolidin carbonilo, cloruro de 4-trifluorometoxi-benzoilo, cloruro de 3-metoxi benzoilo, 4-[4-isotiocianati fenil azo]N,N-dimetil anilin, anhídrido cloro acético, isocianato de 4-fluoro benzoilo, ácido picolínico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácido 6-metilnicotínico, ácido 3-pididilacético, ácido trans-3- (3-piridil) acrílico, ácido (4-piridiltio) acético, ácido 2-cloronicotínico, ácido 6-cloronicotínico, ácido 5, 6-dicloronicotínico, ácido 6-hidroxipicolínico, ácido 6-hidroxinicotínico, ácido 3-hidroxipicolínico, ácido 5-cloro-6-hidroxinicotínico, ácido 4-piridóxico, ácido citracínico, ácido 2-furoico, ácido 3-furoicó, ácido 5-bromo-2-furoico, ácido 2-tiofencarboxílico, ácido 3-tiofencarboxílico, ácido 4-nitro-3-pirazolcarboxílico, ácido 5-nitro-3-pirazolcarboxílico, ácido 4-hidroxi-7-fluorometil-3-quinolincarboxílico, y ácido 4, 8-dihidroxiquinolin-2-carboxílico. Ejemplos de monómeros encubridores que pueden ser usados para cubrir un NH_. libre y formar parte de las moléculas de péptidos nucleosidos incluyen pero no se limitan a metilo (Me) , formilo (CHO) , etilo (Et) , acetilo (Ac) , t-butilo (t-bu) , anisilo, trifluoroacetilo (Tfa) , benzoilo (Bz) , 4-metilbencilo (Meb) , tioanisilo, tiocresilo, benci?oximetilo, 4-nitrofenilo (Pnp) , f benciloxicarbonilo (Z) , 2-nitrobenzoilo (NBz) , 2-nitrofenilsulfenilo (Nps) , 4-toluensulfonilo (Tosilo, Tos), pentafluorofenilo (Pfp) , difenilmetilo (Dpm) , 2-clorobenciloxicarbonilo (Cl-Z) , 2, 4, 5-triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z) , trifenilmetilo (tritilo, Trt), 2, 2, 5, 7, 8-pentametil-croman-6-sulfonilo (Pmc), t-butiloxicarbonilo (Boc) , bencilo (Bzl) , benciloximetilo (Bom) , y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) .

Los análogos en el estado de transición del azúcar (por ejemplo análogos de GlcNAc) pueden acoplarse a las moléculas de péptidos nucleosidos en una posición en espacio cerrado en donde un enlace azúcar-fosfato sería fragmentado en un nucleótido de azúcar donante correspondiente.

Ejemplos específicos de moléculas de péptidos nucleosidos de la invención tienen la fórmula I: en donde X es H, -COOH, -OS03-H, (CH2)qS03H en donde q es 0 ó 1, ó -OPO3H, y R representa (Y)m en donde Y es un grupo amida substituido (por ejemplo un residuo de aminoácido enlazado a una amida) y m es 1-3, Z' y Z son iguales ó diferentes y representan hidroxilo ó alcoxi, ó Z' y Z forman juntos un grupo acetonido, y en el que los grupos NH2 libres en el compuesto de fórmula I son preferiblemente cubiertos con los monómeros cubridores mencionados en la presente, preferiblemente con Fmoc y Boc.

Ejemplos específicos de moléculas de péptidos nucleosidos de la invención tienen la fórmula I en donde X es H, .COOH, -COSO3H, ó (CH2)qS03H en dónde q es 0 ó 1, Z y Z' son ambos hidroxilo ó forman juntos un grupo acetonido, R representa -?HCOR1, en donde R1 representa en donde R es alcoxi; ó (b) -CHR?3JtR.44 en donde RJ es hidrógeno ó -?H2 y R es en donde R es halógeno, alquilo ó alcoxi, ,-CH2N(CH3)CH2CH2R6 ó -N ( (CH3) CH2CH2R6, en donde R6 es halógeno, -CH2N(C2H5)CH;CH(CH3)OH, ó -CH,NHCOCH (CH3) 2, ó R4 representa (CH=)nR8 en donde n=0 a 5, R8 es halógeno, Q- en donde R es alcoxi, -N(CH3)CH2CH£R10 en donde R10 es halógeno, N(C2H5)CH2CH(CH3)OH, ó -NHCOCH (CH3) 3 y en donde los grupos amino libres son protegidos con un monómero encubridor.

En una modalidad de un compuesto de la fórmula I de la invención X es -COOH, y R representa -NHCOR1 en donde R1 representa -CHR3R4 en donde R3 es hidrógeno y R4 es (CH2)nR8 En donde n-0 a 5, preferiblemente 1 a 4, R8 es halógeno, en donde R9 es alcoxi, halógeno, ó alquilo, Co CO ó -N (CH3) CH2CH2R10 en donde R10 es halógeno, N (C2Hs) CH2CH (CH3) OH, ó -NHCOCH (CH3) 2.

En otra modalidad de la invención, un compuesto de la fórmula I se proporciona en la presente, X es --COOH, y R representa -NHCOR1 en donde R1 representa -CHR3R4 en donde R3 representa -NH2, y R4 es, en donde R es halógeno, alquilo ó alcoxi, -CH2N (CH3) CH2CH2R6 en donde R6 es halógeno, CH2N (C2H5) CH2CH (CH3) OH," CH2NHCOCH ( CH3) __ , ó En una modalidad adicional de la invención, un compuesto de la fórmula I es -0S03H, ó (CH2)qS03H en donde q es O ó 1, R representa -NHCOR1 en donde R1 representa CHR3R4 en donde R3 representa -NH2 y R4 es O" En donde R es halógeno, alguilo ó alcoxi, CH2N (C2H5) CH2CH (CH3 ) OH, ó -CH2?HCOCH (CH3) 2 • En una modalidad particular, una molécula de péptido nucleósido de la fórmula I es proporcionado, en donde X es -COOH, R está representado por -?HCOR1 en donde R1 representa -C (CH3) (?H_.)CH__ R' en donde R~ es alcoxi.

Como se usa en la presente el término "alquilo", solo ó en combinación, se refiere a un radical hidrocarburo lineal ó ramificado, que contiene típicamente de 1 hasta 10 átomos de carbono, preferiblemente 1 hasta 5. Los grupos a?quilo típicos incluyen pero no se limitan a metilo, etilo, 1-propilo, 2-propilo, 1-butilo, 2-butilo, terbutilo, ó pentilo, preferiblemente metilo ó etilo.

El término "alcoxi" se refiere a un alquilo enlazado a la porción molecular genitora por medio de un átomo de oxígeno. Los ejemplos de grupos .alcoxi incluyen 0-metilo, por ejemplo metoxi; O-alilo por ejemplo aliloxi; O-propilo por ejemplo propoxi; O-butilo por ejemplo butoxi, y los similares, preferiblemente metoxi ó aliloxi.

El término "halo" ó "halógeno", solo ó en combinación, se refiere a un miembro de la familia flúor, cloro, bromo, ó yodo .

Ejemplos específicos de moléculas de péptidos nucleósidos se exponen en las Tablas 3, 4 y 5.

En las moléculas de péptidos nucleosidos de la invención la estereoquímica de átomos de carbono quirales en la unidad monómera nucleósida, unidad monómera espaciadora, ó unidad monómera cubridora puede independientemente estar en la configuración R ó S, ó una mezcla -de las dos. Por ejemplo, aminoácidos del mómero espaciador pueden estar en las configuraciones L- ó D-, dando como resultado el mismo aminoácido, que varía solamente en su estereoquímica. Por consiguiente, la presente invención abarca una molécula de péptido de nucleósido de la invención como una mezcla de diastereómeros, así como también en la forma de un diastereómero individual, y la presente invención abarca una moléculas de péptidos nucleosidos como una mezcla de enantiómeros, así como también en la forma de un enantiómero individual. Todas las formas de isómeros ópticos y racémicos de los mismos de las moléculas de péptidos de nucleósido de la invención se contemplan en la presente, y las moléculas de péptidos nucleosidos expuestas en la presente se pretende que abarque todos los isómeros ópticos posibles de los compuestos así expuestos.

La formación de diastereómeros puede llevarse a cabo pre ó post fijación de espaciadores a la unidad monómera nucleosida por utilización de aminoácidos L y/ó D durante la síntesis ó por racemización de los centros quirales después de la fijación ó construcción, de los espaciadores con la base.

Las moléculas de péptidos nucleosidos de la invención pueden estar presentes como sales farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" abarca las sales que se forman por reacciones ácido-base estándares con grupos básicos y ácidos orgánicos e inorgánicos, ó grupos ácidos y bases. Los ejemplos de ácidos incluyen ácido clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, fumárico, palmítico, cólico, pamoico, múcico, D-glutámico, ftálico, tartárico, láurico, esteárico, salicílicco, metansulfónico, bencensulfónico, sórbico, benzoico, cinámico, y los ácidos similares. Los ejemplos de bases incluyen LiOH, NaOH, KOH y Ca(CH2). Los aminoácidos básicos (por ejemplo glicina, ornitina, histidina, fenilglicina, lisina, y arginina) en una unidad monómera espaciadora pueden estar en forma protonada.

Preparación de un Acervo Combinatorio Una unidad monómera es químicamente conjugada por ejemplo enlazada ó acoplada covalentemente a una unidad monómera adjunta ó bloque que se construye para preparar un acervo combinatorio de la invención. Después de conjugación, una unidad monómera se altera, por ejemplo, por reacción para formar un enlace covalente, el monómero puede perder una molécula de agua, ó puede ser sometida a la formación de una urea ó grupo carbamato. Hay innumerables variaciones en la naturaleza de las unidades monómeras y en los tipos de reacciones químicas que pueden usarse para conjugar químicamente los monómeros. Además, químicas en fase de solución y fase sólida pueden usarse para sintetizar un acervo combinatorio de la invención.

Los bloques construidos ó monómeros usados en los compuestos contenidos en el acervo de la invención pueden ser conjuntos "regresivos", por ejemplo los últimos bloques construidos añadidos a la "cadena en desarrollo" pueden ser análogos al extremo 5' terminal de un péptido ó polipéptido. Por ejemplo, en un acervo expuesto esquemáticamente como uridina-espaciado-cubierta, el bloque uridina ó unidad monomérica puede _ estar químicamente conjugada a una unidad espaciadora adjunta al final del tiempo. En este esquema, la unidad monomérica encubridora es generalmente fijada a una matriz en fase sólida hasta liberación de la uridina-espaciador-c bierta siguiendo la última reacción de conjugación química.

Ejemplos de procesos para preparar compuestos en acervos combinatorios de la invención se exponen a continuación.

Un acervo combinatorio de la invención en el que el grupo reactivo sobre la unidad monómera nucleosida es una amina puede prepararse utilizando un acetónido, u otros grupos protectores adecuados para proteger temporalmente, sitios activos químicamente. En particular, un acervo basado en estructuras uridinas puede producirse utilizando plantillas 5' -desoxi-5' -amino-2' , 3' -O-isopropilidinil uridina. La plantilla puede prepararse por bloqueo acetónido de los grupos 2'- y 3' -hidroxilo, activación del 5'hidroxi utilizando mesilación, tosilación, ó triflación, reacción subsecuente con azida sódica, y reducción (por ejemplo, ver las figuras 1 a 4). Una unidad monómera espaciadora que comprende un aminoácido, dipéptido, ó tripéptido que está protegido adecuadamente, por ejemplo N-t-butiloxicarbonil (Boc) , ó N-9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) -protegido, puede estar acoplado con la plantilla uridina en forma de base libre (por ejemplo, ver la figura 5) . Esto es seguido por la desprotección (ver por ejemplo, la figura 6) . La purificación de la unidad monómera de péptido nucleosido y la unidad espaciadora se lleva a cabo utilizando métodos convencionales, y las bases amina libres pueden ser cubiertas con por ejemplo ácidos carboxílicos, anhídridos, esteres, isocianatos, cloruro ácido, ó aldehidos (ver por ejemplo, la figura 7) .

La invención también contempla intermediarios usados en los procesos de la invención, que incluyen moléculas de péptidos nucleósidos de los acervos combinatorios déla invención que tienen un hidroxi protegido en la base amina heterocíclica y/ó puede estar bloqueado en los hidroxilos 2' 6 3'.

La unidad monómera espaciadora puede estar acoplada a la unidad monómera nucleosida utilizando una estrategia sintética que consiste de tres etapas químicas y dos etapas de purificación, todas las cuales pueden ser automáticas. Ejemplos de esquemas de reacción para añadir unidades monómeras espaciadoras se exponen en las figuras 5 y 6. las reacciones pueden efectuarse en pocilio profundo (1 ó 2 ml) , placas de microtítulo en formato de 96 pocilios. La primera etapa es para acoplar los aminoácidos protegidos Boc, dipéptidos ó tripéptidos a la plantilla uridina en forma de base libre. Esto es seguido por desprotección concomitante de N y desblogueo acetónido utilizando un exceso de TFA. Las sales de TFA se neutralizan por intercambio iónico de "la suspensión utilizando una placa de un filtro Polyfiltronic™ (en formato de 96 pocilios) , permitiendo la generación de los residuos de amina libres. Los grupos amina libres son cubiertas por ejemplo con isocianatos, isotiocianatos, ácidos carboxílicos, cloruros de sulfonilo, y cloruros de acilo para dar cinco acervos de productos. La purificación, si es necesaria, puede llevarse a cabo por elaboración de una suspensión con resinas aminometílicas las cuales barren el exceso de reactivo cubridor, ó con sílice alúmina ó Fluorisil™ que retiene los reactivos y sub-productos en exceso. La elaboración de la suspensión puede efectuarse en una placa Polyfiltronic™. Los grupos amina terminales libres pueden también cubrirse con aldehidos bajo condiciones de aminación reductoras. Para derivados bencilo éster-protegidos (por ejemplo residuos de ácido aspártico y glutámico en la unidad monómera espaciadora) la hidrogenación por transferencia manual utilizando formiato de amonio, Pd-C (10 % en peso) y metanol, hidrólisis (TFA, H20) ó saponificación (metanol, KOH, H20) pueden efectuarse para liberar el carboxilato y racemizar los residuos de aminoácidos quirales si se desea.

Un esquema de reacción alternativa para añadir unidades monómeras espaciadoras utilizando una estrategia Fmoc se expone en la figura 7. Las reacciones pueden efectuarse en pocilios profundos (1 ó 2 ml) , placas de microtítulo en formato de 96 pocilios, si se desea. La primera etapa es para acoplar los ^ aminoácidos Fmoc protegidos, dipéptidos ó tripéptidos al grupo amina libre de la plantilla monómera uridina. Esto es seguido por la desprotección de Fmoc con morfolina en DMF como solvente. Este método libera a la amina terminal libre sin eliminar al grupo protector isopropilideno. La etapa de neutralización no es necesaria y la morfolina es fácilmente eliminada por evaporación bajo presión reducida. Las aminas terminales son entonces cubiertas como se requiere, como se describió anteriormente. El grupo protector acetónido puede eliminarse de todos ó de los péptidos de uridina cubiertos ó no cubiertos en una secuencia de reacciones finales por tratamiento con TFA a la temperatura ambiente seguido por evaporación de los reactivos y solventes bajo presión reducida (ver la figura 8) .

Un acervo combinatorio de la invención en el que el grupo amida enlaza a una unidad monómera nucleosida y a una unidad monómera espaciadora puede prepararse por formación de un compuesto de la fórmula I en donde R representa -NHC0CHR3R4 en donde R3 y es NH2 utilizando el método que se describe en N.P. Damodaran y colaboradores J. Am. Chem. Soc. 93, 3812, 1971. La forma amino libre del compuesto se somete a condensación con un éster correspondiente de R3 en DMF acuosa en presencia de N-metil morfolina a una temperatura apropiada. Otros esteres reactivos tales como N-hidroxi succinimidilo, hidroxibenzotriazol, ó esteres de pentafluorofenilo, u otros esteres reactivos comúnmente usados en síntesis de péptidos pueden también usarse. Por ejemplo, la síntesis de un compuesto de la fórmula I en donde R4 es (CH2)nR8 en donde n es 2 y R8 es halógeno (compuesto A en la Tabla 3) puede lograrse por utilización del metil éster del ácido 1-fluorobutírico. Similarmente, los compuestos B, C y D en la Tabla 3 pueden sintetizarse por utilización de un éster del ácido correspondiente, el cual puede ser sintetizado por métodos convencionales. Los compuestos E a J en la Tabla 3 pueden ser sintetizados por utilización de los esteres apropiados de los ácidos correspondientes, que están comercialmente disponibles. Para los compuestos F a H en la Tabla 3, antes de condensación, el grupo amino libre en el reactivo esterificado es bloqueado con un grupo adecuado.

Un acervo combinatorio que contenga los compuestos seleccionados se exponen en las Tablas 4 y 5 en donde X es sulfato puede ser sintetizado por una condensación similar de un éster con una amina libre.

Compuestos predeterminados en el acervo combinatorio en donde C-5 de una uridina tiene grupos alquilo y arilo diferentes puede prepararse por mercuración de UDP comercialmente disponible con acetato de mercurio para dar acetato mercúrico-C-5-UDP, el cual en tratamiento con un compuesto alqueno apropiado en presencia de tetracloropaladiato de potasio produce el correspondiente derivado C-5-alqueno. En reducción selectiva, estos compuestos dan compuestos C-5-alquilo. Este tipo de derivación es conocida como la reacción de Heck y puede llevarse a cabo en una variedad de maneras conocidas en la especialidad (Ryabov, Síntesis (1985)233-252; y Heck; Org. React. (1982)27:345-390).

Un estado de transición análogo de un azúcar que es transferida por un nucleótido de azúcar donante puede acoplarse a una molécula de péptido nucleósido de la invención. Por ejemplo, un análogo de catión GlcNAc puede generarse, y prepararse de forma que puediera permitir acoplarse a una molécula de ribosa uridina de la invención.

Bioensayos El acervo combinatorio de la invención contiene inhibidores putativos de enzimas procesadoras de carbohidratos. Los inhibidores con selectividad y actividad apropiada contra una enzima procesadora de carbohidratos particular puede seleccionarse utilizando bioensayos convencionales y los bioensayos descritos en la presente. Los bioensayos pueden ser adaptados por incorporación de la selección de alto rendimiento automática y robótica para facilitar la verificación de miles a millones de compuestos en un tiempo relativamente corto. La selección preliminar de 5408 compuestos de un acervo de la invención, reveló que 2-3 % de los compuestos tuvieron actividad inhibidora en ensayos convencionales del núcleo 2 GlcNAc-T, GlcNAc-TV, y GlcNAc-TI.

Una vez que los compuestos "derivados" son identificados utilizando las técnicas de selección, se pueden usar métodos químicos combinatorios para optimizar los derivados iniciales. Las variantes/análogos optimizados pueden ser verificados en los mismos ensayos de selección que identificaron el derivado inicial.

Los métodos indicados por los inventores de la presente describen en ésta el uso de ensayos funcionales simples, y rápidos que puedan identificar uno ó más ingredientes activos en los grupos verificados sin la necesidad de un proceso de gran desconvolución. Los ensayos se utilizan en sistemas de robótica que pueden manejar grades números de muestras para proporcionar, mezclar, y manejar muestras. La invención por consiguiente elabora elementos de robótica que puedan efectuar reacciones químicas múltiples a temperaturas variables, y subsecuentemente preparar el manejo y caracterización de derivados bioactivos. La selección significa facilitar la identificación de compuestos activos en acervos combinatorios que pueden generar enriquecimiento por afinidad ó una selección por afinidad, y este enriquecimiento y selección puede ser seguida por identificación por espectroscopia de masa de cualquier compuesto bioactivo.

La presente invención contempla un bioensayo en fase sólida para identificar un compuesto en un acervo combinatorio de la invención que tiene actividad inhibidora contra una enzima procesadora de carbohidratos que incluye glicosiltransferasas ó glicosidasas . El método es particularmente útil para selección de fármacos. El bioensayo en fase sólida involucra acoplar un receptor carbohidrato para la enzima procesadora de carbohidratos a un polímero y recubrir sobre un vehículo ó soporte. Se añade una enzima . procesadora de carbohidratos, un nucleótido de azúcar donante marcado con una substancia detectable, y un compuesto de prueba , y se mide el cambio detectable producido por la substancia detectable.

Ejemplos de polímeros a los cuales se puede acoplar un receptor, incluyen poliacrilamida. El t vehículo ó soporte puede ser por ejemplo nitrocelulosa, ó vidrio, garbos, ó magnetita. El material soporte puede tener cualquier configuración posible que incluye esférica, (por ejemplo, perlas), cilindrica (por ejemplo la superficie interior de un tubo de ensayo ó pocilio, ó la superficie externa de un rodillo), ó plana (por ejemplo, lámina, probeta).

Ejemplos de substancias detectables incluyen, pero no s'e limitan a, radioisótopos (por ejemplo 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos) , marcadores luminiscentes tales como luminol, marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxifdasa de rábano, beta-galactosidasa, luciferaza, fosfatasa alcalina, acetilcolinisterasa) , y grupos biotinilos ( que pueden ser detectados por avidina marcada por ejemplo, estreptavidina que contenga un marcador fluorescente ó actividad enzimática que pueda ser detectada por métodos colorimétricos u ópticos) . En una modalidad de la invención, la substancia detectable es un material radioactivo, más preferiblemente tritio.

Una enzima procesadora de carbohidratos usada en el método puede obtenerse utilizando métodos de extracción convencionales desde fuentes naturales, puede ser una enzima recombinante, ó puede ser obtenida de fuentes comerciales .

En una modalidad de la invención, el ensayo involucra acoplar carbohidratos receptores a un polímero (por ejemplo poliacrilamida) y recubrirlo en un vehículo, tal como la superficie de placas plásticas de 96 pocilios. La reacción glicosiltransferasa se efectúa con enzimas recombinantes y un nucléotido de azúcar tritiado donante, seguido por lavado, adición de fluido para conteo por centelleo, y medición de la radioactividad con un contador-ß. La construcción del glicopolímero y recubrimiento de las placas plásticas, concentraciones de enzima y substrato, y linearidad con el tiempo se optimizó utilizando UDP-GlcNAc : Galßl-3GalNAc-R ßl-6-?-acetilglucosaminiltransferasa (Glc?Ac a Gal?Ac) (ver el núcleo 2Glc?Ac-T) , una reacción en proporción limitante para expresión de polilactosamina y el ligando de selectina, sal de Lewisx. La expresión de polilactosamina se ha asociado con transformaciones malignas (Itzkowitz, SH y colaboradores, Cáncer Res. 46, 2627-2632, 1986; Kim YS y colaboradores, Cáncer Res, 46. 5985-5992, 1986), desarrollo (Pennington JE y colaboradores J. Embriol, 90. 335-361, 1985) y activación proliferadora de linfocitos (Higgins EA y colaboradores J. Biol.. Chem. 266.6280-6290,1991). Se ha demostrado que estructuras de polilactosamina desempeñan un papel significativo en procesos de adhesión célula-célula y célula-substrato (Zhu BC y Laine RA, J. Biol.. Chem., 260, 4041-4045, 1985: Laferte'S y Dennis JW, Cáncer Res., 48, 4743-4748, 1988) . Adicionalmente, pueden actuar como ligandos para lectinas de mamíferos (Merkle RK y Cummings RD, J. Biol.. Chem., 263, 16143-16149, 1988).

En una selección para detectar los inhibidores del núcleo 2 GlcNAc-T en un acervo de extracto microbiano, el CV para controles positivos fue +/- 9.4 %, y la concordancia completa por validación certera se observó entre el ensayo en fase sólida y el ensayo con solución estándar.

Un ensayo de glicosiltransferasa puede usarse para identificar inhibidores de una variedad de enzimas procesadoras de carbohidratos, que incluyen las enzimas descritas en la presente, preferiblemente núcleo 2 Glc-Nac- T, Glc?Ac-TI y Glc?Ac-TV.

Ensayos de * sensibilidad-lectina se han empleado ampliamente para estudiar los patrones carbohidrato de líneas celulares. Por enlazar específicamente a estructuras de oligosacáridos a la superficie celular, las lectinas generalmente ejercen efecto citotóxico que ocasiona crecimiento desventajoso. La L-PHA es una lectina que reconoce a oligosacáridos ?-enlazados tri- y tetra- anterarios que llevan la estructura (Galßl, 4GlcNAcßl, 6)Galßl, 4-GlcNAcßl , 2Mana) , que representa de ese modo una sonda válida para detección de oligosacáridos tipo ^ complejo, ß 1,4 ramificados. Estas estructuras están 5 asociadas con la progresión de tumores y aparición sobre células malignas (Dennis y colaboradores, 1986) [por ejemplo el linforeticular de murina, altamente metastáticos, línea tumoral modelo ?DAY-D2 (VanderElst y Dennis, 1991)]. La reducción y/ó truncado de las cadenas de __~ 10 carbohidratos ?-enlazadas a la superficie celular en células MAY-D2 está directamente correlacionado con niveles disminuidos de la sensibilidad a la L-PHA y a su vez, con proliferación celular mejorada igualmente en presencia de la lectina. Así, puede ser explotado tal como un sistema 15 para revelar cualquier medio de bloquear la biosíntesis de estructuras 1, 6, ramificadas, ?-enlazadas. Dado el significado funcional de ?-oligosacáridos complejos durante É la transformación maligna, ensayos con L-PHA en gran escala se han desarrollado por los inventores de la presente para 20 identificar compuestos en las bibliotecas ó acervos combinatorios que son inhibidores nuevos del ciclo del proceso del oligosacárido ?-enlazado.

Los términos "proceso del oligosacárido ?-enlazado" ó 25 ciclo del proceso del oligosacárido ?-enlazado" se refiere al ciclo biosintético para la síntesis in vivo de glicoproteínas con oligosacáridos N-enlazados, los oligosacáridos N-enlazados están enlazados a la amida N en la cadena lateral de Asn en la secuencia consensus Asn-X-Ser/Thr de la porción proteína, en donde X puede ser cualquier aminoácido. El método de la invención puede ser particularmente aplicado para identificar compuestos que inhiben oligosacáridos N-enlazados tipo complejo, en particular oligosacáridos tipo complejo ß 1, 6-ramificados asociados con crecimiento tumoral y metástasis. El proceso de oligosacáridos N-enlazados involucra la síntesis de una molécula precursora, transferencia del precursor a Asn por oligosacariltransferasa seguido por proceso adicional por glucosidasas de enlace de membrana y y reticulum endoplásmico a 1, 2-manosidasa, y transporte del reticulum endoplásmico rugoso de los montículos de Golgi. En los montículos de Golgi, tiene lugar proceso adicional que depende del destino final de la glicoproteína y puede involucrar enzimas lisosomáticas ó enzimas no lisosomátics. Cadenas de oligosacáridos tipo complejo y tipo híbrido se sintetizan a través de segundo ciclo de proceso no lisosomático y se pueden añadir residuos por enzimas que incluyen la manosidasa 1 de Golgi (al,2 específica), y N-acetilglucosaminiltransferasas I, II, y III (Una descripción de el ciclo de proceso N-enlazado puede encontrarse en httpj_//www. uni .mainz . de/-frosc0Q0/STRUC22. html ) .

El método a la L-PHA de la invención puede usarse para identificar compuestos que inhiben todas las etapas en el ciclo del oligosacárido N-enlazado antes de ßl,4 Gal transferasa, que incluye compuestos que inhiben las enzimas procesadoras de carbohidratos descritas en la presente, y las a-manosidasas de Golgi.

En una modalidad de la invención, se contempla un método enzimático automático completo, que está basado en medidas de la actividad de la fosfatasa alcalina. El método está basado en la observación de que el número de células y su nivel de actividad de fosfatasa alcalina están estrechamente correlacionados. El método emplea un ensayo colorimétrico para monitorear la proliferación celular de células transformadas después del tratamiento con L-PHA. La mezcla de reacción es añadida directamente a células en crecimiento en su propio medio. De ese modo, el método puede ser llevado a cabo en una sola etapa, sin eliminación del medio de cultivo ó compactación y lavado celular, permitiendo con esto los procedimientos automáticos completos. El método de ensayo es también altamente reproducible (CV=4%) y barato, representando así un instrumento válido cuando se efectúan experimentos en gran escala. La reacción es lineal con el tiempo en un amplio intervalo de tiempo (5-180 min.), y el valor de Km de la enzima para el substrato para-nitrofenilfosfato es relativamente bajo (0.81 mM) . El tiempo de incubación y concentración del substrato puede cambiarse a fin de modular la velocidad de la reacción y ajustar el protocolo, para propósitos de automatización y cronometraje, al número de muestras. El uso de la plataforma robótica también permite el proceso simultáneo de un gran número de muestras, por ejemplo por ejemplo 36 placas de 96 pocilios.

Por consiguiente, se proporciona un método automático para verificar un compuesto por su capacidad para inhibir un proceso de oligosacárido N-enlazado que comprende (a) incubar el compuesto con células que expresan oligosacáridos N-enlazados (preferiblemente oligosacáridos tipo complejo, ß 1, 6-ramificados) en presencia de L-PHA, y medir la actividad de la fosfatasa alcalina; y (b) comparar a un control en ausencia del compuesto en el que la actividad de la fosfatasa alcalina más alta indica que el compuesto tiene la capacidad para inhibir el proceso del oligosacárido N-enlazado. El método puede ser usado para identificar compuestos que inhiben todas las etapas en el ciclo del oligosacárido N-enlazado antes de las ßl.4 Gal transferasas, que incluyen compuestos que inhiben las enzimas procesadoras de carbohidratos descritas en la presente, en particular N-acetilglicosaminiltransferasas, que incluyen N-acetilglucosaminiltransferasas I, II y V. El método puede usarse para identificar compuestos que inhiben las a-manosidasas de Golgi.

El método automático de la invención puede generalmente usarse para identificar antagonistas de inhibidores del crecimiento celular, tal como TGF-ß, IL-l?, TNFa, y IFN. Por consiguiente, la invención contempla ampliamente un método que comprende (a) hacer reaccionar un compuesto de prueba con células que expresan oligosacáridos N-enlazados en presencia de un inhibidor de crecimiento celular; (b) medir la actividad de la fosfatasa alcalina; y (c) comparar a un control en ausencia del compuesto de prueba en el que un aumento en la actividad de la fosfatasa alcalina indica que el compuesto tiene la capacidad para antagonizar al inhibidor de crecimiento celular.

Las células que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen MDAY-D2, L1210, células tumorales de melanoma, y células tumorales humanas tales como SW 480, LS174T, HT-29, WiDr, T2, MDA-231. MCF7, BT-20, Hs578T, K562, Hs578T, SK-BR-3, CY 6T, MDA-468, H23, H157, H358, H1334, H1155, H28, H460, Hmesol, H187, H510A, N417, H146, H1092, H82, (Restifo, N.P. y colaboradores, J. Esper. Med. 177:265-272, 1993). Las líneas celulares pueden contener ya sea actividad enzimática constitutiva ó inducible tales como líneas celulares osteoblásticas .

La Proliferación celular se mide por determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina puede medirse utilizando métodos convencionales por ejemplo por utilización de paranitrofenilfosfato como un substrato y determinación de la absorbancia a aproximadamente 405 nm.

Las condiciones para llevar a cabo el método se seleccionaran teniendo en cuenta la naturaleza del compuesto y las células empleadas. Por ejemplo, si las células son células tumorales MEAY-D2 una concentración de aproximadamente 1-6 x 103 células, preferiblemente 5 x 103 pueden usarse . Las células MEPY-D2 son generalmente cultivadas por aproximadamente 10 a 30 horas, preferiblemente 16 a 20 horas, seguido por adición de L-PHA a una concentración de aproximadamente 50 a 150 µg/ml, preferiblemente 100 µg/ml. La mezcla del ensayo de fosfatasa alcalina puede contener un regulador por ejemplo regulador de dietanolamina, y para-nitrofenilfosfato a una concentración inicial de aproximadamente 1.5 a 4 mM, 4 *-preferiblemente 2 a 3 mM, más preferiblemente 2 .5 mM.

Utilidad de los Ipíiibidores Los inhibidores de moléculas pequeñas con selectividad apropiada y actividad contra una enzima procesadora de carbohidratos particular pueden seleccionarse de acervos ó bibliotecas combinatorias de la invención utilizando bioensayos de selección de alto rendimiento. Los inhibidores de moléculas pequeñas seleccionados tendrán propiedades farmacológicas valiosas. En particular, los inhibidores serán útiles en el tratamiento y profilaxis de crecimiento de tumores y metástasis de tumores. Los efectos anti-metastáticos de los inhibidores pueden demostrarse utilizando un ensayo de colonización del pulmón. Por ejemplo, células de melanoma tratadas con un inhibidor pueden inyectarse en ratones y la capacidad de las células de melanoma para colonizar los pulmones de los ratones puede examinarse por conteo de los nodulos tumorales en el pulmón después de muertas. La supresión del crecimiento de tumores en ratones por el inhibidor administrado oral ó intra-venosamente puede examinarse por determinación del volumen del tumor.

Un inhibidor de molécula pequeña puede tener aplicación en la prevención de la recurrencia de tumor después de cirugía, por ejemplo como una terapia adyuvante.

Un inhibidor de molécula pequeña puede ser especialmente útil en el tratamiento de varias formas de neoplasia tales como leucemia, linfomas, melanomas, adenomas, sarcomas, y carcinomas de tejidos sólidos en pacientes. En particular, los inhibidores de molécula pequeña pueden usarse para tratar melanoma maligno, cáncer pancreático, cáncer cérvico-uterino, cáncer ovárico, cáncer del riñon tal como carcinoma de células renales metastáticas, cánceres de estómago, pulmón, recto, seño, intestino, gástrico, hígado, tiroides, cabeza y cuello tales como cánceres de cabeza inextirpables y cuello, carcinomatosis linfagitis, cánceres de la cerviz, seño, glándulas salivales, pierna, lengua, labio, ducto biliar, pelvis, mediastinum, uretra, broncogénico, vejiga, esófago y colon, cáncer de pulmón de células no pequeñas y Sarcoma de Kaposi el cual e suna forma de cáncer asociada con pacientes infectados con HIV con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) Los inhibidores pueden también ser usados para otras condiciones proliferativas tales como infecciones bacterianas y virales, en particular SIDA.

Un inhibidor de molécula pequeña de la presente invención puede usarse para tratar a sujetos inmunocomprometidos. Por ejemplo, pueden usarse en sujetos infectados con HIV, u otros virus ó agentes infecciosos que incluyen bacterias, hongos, y parásitos, en un sujeto sometido a trasplante de médula ósea, y en sujetos con inmunosupresión inducida por tumor ó química.

Un inhibidor de molécula pequeña puede usarse como agentes hemorestaurador y en particular para estimular el crecimiento celular en la médula ósea, en particular siguiendo a quimioterapia ó radioterapia. La actividad mieloproliferativa de un inhibidor de la invención puede determinarse por inyección del inhibidor en ratones, sacrificando a los ratones, retirando las células de la médula ósea y midiendo la capacidad del inhibidor para estimular la proliferación de la médula ósea por conteo directamente, de las células de la médula ósea y por determinación de células progenitoras clonogénicas en ensayos de metilcelulosa. Los inhibidores, pueden también usarse como quimioprotectores y en particular para proteger el epitelio mucoso después de quimioterapia.

Tjn inhibidor de molécula pequeña de la invención también puede usarse como un agente antiviral en particular sobre virus desarrollados en membrana tales como retrovirus, virus de la influenza, citpmegalovirus y virus del herpes . Un inhibidor de molécula pequeña puede también usarse para tratar infecciones bacterianas, fúngicas, y parasitarias. Por ejemplo, un inhibidor de molécula pequeña puede usarse para prevenir ó tratar infecciones -causadas por lo siguiente: especies de Neisseria tales como Neissería meningitidis, y N. Gonorrheae,- especies de Chlamydia tales como Chlammydia pneumoniae, Chlamydia psittaci , Chlamydia Trichomatis; Escherichia coli, especies de Haemophilus tales como Haemophilus influenza; yersinia enterocolitica; especies de Salmonella tales como S. typhimurium,- especies de Shigella tales como Shigella flexner i ,- especies de Streptococcus tales .como S. Agalactiae y S. Pneumoniae,- especies de Bacillus tales como Bacillus subtilis; Bronhamella catarrhalis; Borrelia burgdorfer; Pseudomona aeruginosa; Coxiella burnetti; especies de Campylobacter tales co o C. hyoilei ; helicobacter pylori ,- y especies de Klebsiella tales como Klebsiella pneumoniae .

Un inhibidor de molécula pequeña puede también usarse en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide, asma, enfermedades intestinales inflamatorias, y arterioesclerosis.

Un inhibidor de molécula pequeña puede también usarse para aumentar los efectos anti-cáncer de agentes tales como interleucina-2 y poli-IC, para aumentar la muerte natural y actividad tumoricida macrófaga, inducir la síntesis y secreción de la citosina, mejorar la expresión de antígenos específicos clase I, LAK y HLA; activar la proteína cinasa C, estimular la proliferación de células de la médula ósea que incluye la proliferación celular del progenitor hematopoyético, e incrementar la eficiencia de injertos y la actividad de unidades formadoras de colonias, para conferir protección contra quimioterapia y terapias de radiación (por ejemplo agentes quimioprotectores y radioprotectsres) , y para acelerar la recuperación de la celularidad de la médula ósea particularmente cuando se usa en combinación con agentes comerciales comúnmente usados en el tratamiento de enfermedades humanas que incluyen cáncer y síndrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA) . Por ejemplo, un inhibidor de molécula pequeña puede usarse como un quimioprotector en combinación con agentes anti-cáncer que incluyen doxorubicina, 5-fluorouracilo, ciciofosfamida, y metotrexate, y en combinación con isoniacida ó NSAID.

El término "paciente " en la presente se refiere a un animal de sangre caliente tal como un mamífero que está afligido de un estado ó condición „ de una enfermedad particular como se describe, en la presente. Ejemplos de animales en los que el alcance del significado del término son perros, gatos, ratas, ratones, caballos, ganado bovino, ovejas, y humanos .

Inhibidores de molécula pequeña pueden convertirse utilizando los métodos acostumbrados en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas contienen los inh.ibidores ya sea solos ó junto con otra substancias activas. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para uso oral, tópico, rectal, parenteral, local, inhalante, ó intracerebral . Están por consiguiente en forma sólida ó semi-solida, por ejemplo, pildoras, tabletas, cremas, gelatinas, cápsulas, supositorios, cápsulas de gelatina blanda, liposomas (ver por ejemplo, Patente USA No. 5,376,452), geles, membranas, y tabletas. Para usos pareñteral e intracerebral, las formas para administración intramuscular ó subcutánea pueden usarse, ó las formas por infusión ó inyección intravenosa ó intracerebral pueden usarse, y pueden por consiguiente prepararse como soluciones de los inhibidores ó como polvos de los inhibidores para mezclarse con uno ó más excipientes ó diluyentes farmacéuticamente aceptables, adecuados para los usos antes mencionados y con una osmolaridad que es compatible con los fluidos fisiológicos. Para uso local, las preparaciones en la forma de cremas ó ungüentos para uso tópico ó en forma de pulverizaciones podrían considerarse; para usos como inhalantes, las preparaciones en la forma de pulverización pueden ser considerados .

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse por métodos conocidos per se para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden ser administradas a pacientes, y en las cuales una cantidad efectiva de la substancia activa está combinada a mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos adecuados son descritos, por ejemplo, en Remington ' s Pharmaceutical Sciences (Remington's Pñarmaceutical Sciences Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985) . Con la base de que una composición farmacéutica incluye, implícitamente no exclusivamente, a los inhibidores en asociación con uno ó más vehículos ó diluyentes farmacéuticamente aceptables, y contenidos en soluciones reguladoras con un pH adecuado e iso-ssmótico con los fluidos fisiológicos.

Un inhibidor puede estar indicado como un agente terapéutico ya sea solo ó conjuntamente con otros agentes terapéuticos u otras formas de tratamiento (por ejemplo, quimioterapia ó radioterapia) . Un inhibidor puede ser usado para mejorar la activación de macrofagos, células T, y células NK en el tratamiento de cáncer y enfermedades inmunodepresivas. A manera de ejemplo, un inhibidor puede usarse en combinación con agentes anti-proliferantes, agentes anti-microbianos, agentes inmunoestimulantes, ó anti-inflamatorios . En particular, un inhibidro puede usarse en combinación con agentes anti-virales y/ó antiproliferantes, tales como citocinas Th 1 que incluyen interleucina-2, interleucina-12, e interferon-?, y análogos de nucleósidos tales como AZT y 3TC. Los compuestos de la invención pueden ser administrados corrientemente, separadamente ó secuencialmente con otros agentes terapéuticos ó terapias.

Las composiciones que contienen inhibidores de molécula pequeña pueden administrarse para tratamientos profiláctico y/ó terapéutico. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya padece de una enfermedad ó condición que se describieron anteriormente, en una cantidad suficiente para curar ó al menos aliviar los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto está definida como "dosis terapéuticamente efectiva". Cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad, el peso y estado general del paciente, la naturaleza de la vía de administración, la naturaleza de la formulación, y el tiempo ó intervalo en el cual es administrado.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen inhibidores de pequeña molécula se administran a un paciente susceptible a ó de otro modo en riesgo de una enfermedad particular. Una cantidad tal se define que es una "dosis profilácticamente efectiva'1. En este uso, las cantidades precisas dependen del estado de salud y peso del paciente y la naturaleza de la vía de administración, la naturaleza de la formulación, y el tiempo ó intervalo en el que es administrada.

Se apreciará que cuando se administran cantidades mayores para un tratamiento terapéutico ó profiláctico, puede contemplarse dividir ésta en varias administraciones durante el trascurso de un día.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención EJEMPLO 1 Síntesis combinatoria de inhibidores GnT-V A continuación se describe, la síntesis de la de 5'-desoxi-5' -amino-2' , 3' -O-isoproilidinil uridina y derivaddos ramificados del péptído de 5' -desoxi-5' -amino-2' , 3' -0-isopropilidinil uridina. La invención contempla intermediarios, 2, 3-0-isopropiliden-5-0-metansulfonil uridina, y derivados de 5-desoxi-5-azido-2, 3-0-isopropilidenil uridina.

Síntesis de 5' -desoxi-5' -amino-2' ,3' -O-isopropilideniluridina A. Preparación de 2 ,3-O-isopropilideniluridina (Figura 1) Se agitaron vigorosamente, uridina (65.0 g, 266.2 minóles), ácido sulfónico alcanforado (1.0 g, 4.3 mmoles), 2,2-dimetoxi propano (98.0 ml, 798.5 mmoles), y acetona (anhidra, 1000 ml) , por 24 horas a la temperatura ambiente.

La reacción se monitoreó por TLC (sistema de solvente 7:93, MeOH:CHCl3). Una vez que el material inicial se consumió, se añadió trietilamina (1.12 ml, 8.6 mmoles) y la mezcla se agitó por otra hora. Se evaporó la acetona a presión reducida (< 40 °C) para dar un polvo blanco _(77.0 g) , que fue usado en la siguiente etapa sin purificación alguna.

B. Preparación de 2 ,3-Q-Isopropiliden-5-Q-me an sulfonil uridina (Figura 2) Se disolvió el 2, 3-O-isopropilidenil uridina crudo (77.0 g; obtenido en la etapa A) en DMF. Se añadió trietilamina (74.2 ml) y la mezcla se enfrió a 0 °C. Se añadió cloruro de metansulfonilo (31.2 ml), gota a gota durante un período de 30-60 minutos mientras se continuó agitando rápidamente. Después de 1 hora adicionadle agitación a la temperatura ambiente, se evaporó el DMF. Se disolvió el residuo en acetato de etilo (2.0 L) y se lavó tres veces con agua (3 X 250 ml) . La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró, la torta del filtro se enjuagó con EtOAc y se evaporó el solvente. El residuo ligeramente amarillo (jarabe espeso) se usó directamente para la etapa siguiente sin purificación adicional. La reacción se monítoreó por TLC (7:3, acetato de etilo :hexano) .

C. Preparación de 5-azido-5-desoxi-2,3-Q-isopropílidenil uridina (Figura 3) Se disolvió el mesilato crudo (obtenido de la etapa B anterior) en DMF (400 ml, grado reactivo) y se agitó a 60 °C con azida sódica (34.6 g, 532 mmoles) por 12 horas hasta consumo completo del mesilato, se observó por TLC (TLC 7:3, acetato de etilo: hexano) . La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite. El filtrado se evaporó hasta sequedad. Se disolvió el residuo en acetato de etilo (2.0 L) y se lavó tres veces con agua (3 X 250 ml) . La capa orgánica se secó sobre MgS04 y se evaporó a presión reducida a 30 °C. el residuo sólido se recristalizó desde acetato de etilo/hexano (1:1) para dar como resultado 65.0 g de la azido uridina deseada como un sólido cristalino blanco (P.F. 118 °C) . tE NMR (500 MHz, CD3OD) : i 34, 1.53 (2s, 6H) ; 3.52 (dd, 1H, J=4.4, 12.9 Hz) ; 3.6 (dd, 1H, J=5.9, 12*.9 Hz) ; 4.2 (ddd, 1H, J=4.4, 4.4, 6.2 Hz) ; 4.8 (dd, 1H, J= 4.2, 6.2 Hz); 5.06(dd, 1H, 2.3, 6.2 Hz); 5.7 (d, 1H, J= 7.8 Hz) ; 5.78 (d, 1H, J= 2.2 Hz) ; 7.65 (d, 1H, J= 8.0 Hz) .

D. Preparación de 5-amino-5-desoxi-2 ,3-0-isopropilidenil uridina (Figura 4) Se disolvió 5.0 g de azida en etanol (150-200 ml) . a esta solución, se añadió Pd(0H)2 y ?aHC03. El matraz de reacción se evacuó y se llenó con H2 gas. Esto se repitió tres veces y la mezcla se agitó por 3-6 horas a la temperatura ambiente bajo H2. La mezcla se filtró a través de lecho de Celite y se evaporó. El residuo se usó para reacciones de acoplamiento de péptido y cobertura.

XE NMR (500 MHz, CDC1 ) : 1.35, 1.57 (2s, 6H) ; 2.95 (dd, 1H, J=6.0, 13.6 Hz) ; 3.06 (dd, 1H, J=4.6, 13.6 Hz) ; 4.1 aparece como dd, de hecho es ddd, 1H, J= 4.3, 4.35, 6.4 Hz); 4.76 (dd, 1H) , J= 4.5, 6.4 Hz) ; 4.95 (dd, 1H, 2.6 6.4 Hz) ; 5.7 (d, 1H, J=2.4 Hz) ; 5.73 (d, 1H, J=8.1 Hz) ; 7.38 (d, 1H, J= 8.2 Hz) .

II. Procedimiento de acoplamiento (Figura 5) Se disolvió la amina libre (Figura 5) en diclorometano (250 ml) y se añadió , WSC.HC1 [l-etil-3- (3' -dimetilaminopropil) carbodiimida HCl, 1.2 eq.]. a esta solución clara, se añadió los aminoácidos protegidos de ?-t-butoxicarbonilo (1.0 eq) y se agitó bajo argón por 1-3 horas. La reacción se monitoreó por TLC (7:93, MeOH/CHCl3) . Después de que la reacción se completó se añadió más diclorometano y la solución se lavó con agua (para unos cuantos aminoácidos similares a arginina, tp-nitroarginina, aspargina el lavado con agua no es posible, porque los derivados son solubles en agua) , y la capa orgánica se secó sobre MgS04 y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía de columna (eluyente MeOH al 2.5 % en CH2C12) para dar sólidos blancos. Los rendimientos variaron de 75 a 85 % ) . Este procedimiento se efectuó en escalas de 25.0 g. en una manera similar, se hicieron reaccionar la amina libre (1 eq) , aminoácidos N-FMOC-protegidos (1.1 eq) y HBTU en DMF (1.1 eq.) para dar monopéptidos de uridina ?-FMOC-protegidos.

III. Desprotección ?-Boc (Figura 6) Se trataron separadamente los péptidos de uridina (Figura 6) con TFA/CHC13/H20 (3:4:1) a la temperatura ambiente por 12 horas. El exceso de reactivo y el solvente se evaporaron a presión reducida. El residuo se disolvió en el etanol, se trató con resina OH- hasta neutralidad, se filtró, y se evaporó a sequedad.

IV.Encubrimiento (Figura 8) Se trataron separadamente los derivados monopéptidos y dipéptidos de uridina completamente desprotegidos, con reactivos encubridores (cloruro de acilo, isocianato, e isotiocianato, 1.2 eq) y diisopropiletil amina (1.5 eq) en DMF a lá temperatura ambiente. Después de 12 horas, el solvente*' se eliminó y los residuos se disolvieron en metanol.. Estas soluciones se trataron con resina poliestirénica aminometilada por 48 horas para extinguir el exceso de reactivo encubridor. Las mezclas se filtraron, se evaporaron, y se disolvieron en DMSO.

Se encubrieron también los dipéptidos N-t-Boc y N-FMOC-desprotegidos (1 eq) con varias cubiertas de ácido carboxílico (1.05-1.2 eq) en la presencia de HBTU (1.05-1.2 eq) en DMF. El solvente se evaporó a presión reducida (tem = 60 °) . Los residuos se disolvieron en 8/8/1 [MeCN/MeOH/H20], y luego se filtraron individualmente a través de una capa de alúmina básica en un formato de 96 pocilios utilizando placas de filtro politrónicos . El solvente se evaporó entonces de nuevo a presión reducida (< 40 °), y los residuos se diluyeron en DMSO para almacenamiento y verificación.

Los derivados monopéptidos y dipéptidos completamente desprotegidos se cubrieron exitosamente separadamente con una variedad de ácidos carboxílicos (1.1 equiv.) con etil diisopropilamina en DMF vía un acoplamiento carbodiimida con ó sin HOBT ó por un protocolo asistido por HBTU.

EJEMPLO 2 ABREVIACIONES Gal galactosa GalNAc D-N-acetilgalactosamina GlcNAc D-?-acetilglucosamina FCS suero de ternera fetal T transferasa Un ensayo de glicosiltransferasa en fase sólida sé desarrolló para _selección dé fármacos. La glicosiltransferasa cataliza la formación de enlaces glicosídicos entre monosacáridos donados por nucleótido-azúcar, y oligosacáridos específicos receptores. El ensayo en fase sólida se ilustra para el núeclo 2 GlcNAc-T y puede adaptarse para otras glicosiltransferasas. El ensayo utiliza receptores oligosacáridos multivalentes enlazados a placas plásticas recubiertas de polímero y con esto elimina la necesidad de separación -cromatográfica del producto .

MATERIALES Y MÉTODOS Químicos: Se preparó poli[?- (acriloxi) succinimida] (pNAS) (1. Figura 9) con una viscosidad-peso molecular promedio M, de 42.1 kDa (DP ~ 250) conforme a Mammen y colaboradores (Mammen y colaboradores J. Med. Chem., 38, 4179-4190, 1995) . Se prepararon el disacárido Galßl-3GalNAca-0(CH2)3S (CH2)2NH2 (2) (núcleo 2 GlcNAc-T receptor) y [GlcNAc-T receptor) y [GlcNAc (ßl-2) ]Man (ßl-6) Gle (ß-O (CH2) 3S (CH2)NH2. desde el correspondiente alilo glicosido que sigue al procedimiento descrito por Roy y Tropper (R. Roy y F. D. Tropper, J. Chem. Común. 1058 (1988) : Glicoconjugado J. 5:203 (1988)). Polímeros Galßl-3GalNAca-pNp y GalNAca UDP-6-[3H]-N-acetilglucosamina (16.0 Ci/rr mol) se adquirieron de Toronto Research Chemicals (Toronto, Canadá) mientras que el UDP-6-N-acetilglucosamina no marcada se obtuvo de Sigma Chemicals.

Síntesis de Glicopolímeros : el poli[N-(acriloxi) succinimida] (1) se trató primero a la temperatura ambiente con el disacárido del antígeno T amina terminado 2 en DMSO (16 horas) para__ dar un núcleo de copolímero que contiene un residuo azúcar por cada diez residuos acrilamida N-substituídos . El polímero que contenía el éster activo se trató entonces a la temperatura ambiente por tres horas con exceso de aminas primarias (amoníaco, metilamina, etilamina, ó propilamina) para dar cuatro copolímeros 3-6 diferentes que tienen la misma proporción de comonómeros pero que difieren por la lipofilicidad de las estructuras copolímeras. Los glicopolímeros fueron entonces purificados por cromatografía de exclusión de talla sobre BioGel P-10 utilizando agua como eluyente. Alternativamente, el disacárido 2 se trató con cloruro de metacriloilo y el monómero resultante se copolimerizó con metacrilamida para proporcionar el copolímero 8, mientras la copolimerización directa del precursor de 2 alilo de glicosida con acrilamida dio el copolímero 10. utilizando la misma estrategia, copolímeros receptores 11-14 para GlcNAc-TV se prepararon utilizando el mismo núcleo pNAS 1 y las proporciones molares de acrilamida: azúcar de 10:1 (Figura 10) .

Núcleo 2 GlcNAc-T recombinante : Una forma truncada del cDNA del núcleo 2 GlcNAc-T, que le faltaban 37 aminoácidos de los N- terminus se preparó por PCR. El cDNA truncado se clonó en la configuración en el vector pPROTA (Sánchez-López y colaboradores J. Biol . . Chem. 263, 11892-11899, 1988) por expresión de una proteína quimérica secretada por una proteína A. El vector de expresión fue co-transfectado en células CHO, junto con pSV2neo, en una proporción molar 10:1, utilizando un método al fosfato de calcio. Las células se cultivaron en presencia de 800 µg/ml de G418, y clones de células resistentes se seleccionaron, y examinaron por la actividad del núcleo 2 GlcNAc-T en medio de cultivo. El clon 614 C2 representativo demostró expresión estable de actividad del núcleo 2 GlcNAc-T, y se seleccionó para producción enzimática. Las células se propagaron rutinariamente en medio MEM que contenía 5 % de suero fetal bovino y G418 (0.2 mg/ml). se añadieron perlas de Sepharose Fast Flow™- impregnadas de IgG (Pharmacia Biotech.) en una proporción de 5 µde una suspensión de perlas al 50 %, 2.5 µl de TricHCl 2 M pH 8.0, y 5 µl de Tween 20 al 10 % por ml de medio de cultivo. A continuación incubación sobre una plataforma oscilante a 4 °C por 20 horas, las perlas se colectaron por centrifugación, se lavaron con 10 volúmenes de regulador TST (50 mM de Tris-HCl pH 8.0, 150 mM de naCl, 0.05 % de Tween 20) y 2 volúmenes de 5 mM de NH4Ac pH 5.0. La enzima ProtA-núcleo 2 Glc?Ac-T se eluyó entonces con 1 volumen de ácido acético 0.5 M pH 3.4 y se resuspendió en tres volúmenes de MES 0.5 M pH 7.5 (Calbiochem). Un µU de actividad enzimática se define como la cantidad de proteína que forma 1 pmol/min del producto de reacción.

Ensayo del Núcleo 2 GlcNAc-T en fase sólida: Una solución madre , del copolímero 3 receptor del núcleo 2 se preparó por re-suspensión del receptor en agua a una concentración de 1.25 mg/ml y luego incubación de la solución a 60 °C por 1 hora. La solución se mezcló suavemente a intervalos de 15 minutos durante este tiempo para permitir al polímero desarrollar y disolverse completamente. La solución del glicopolímero no se sometió a vórtice puesto que la agitación enérgica podría ocasionar corte en la estructura del polímero. Se añadió azida sódica (0.05 %) como un preservativo y la solución madre de glicopolímero se almacenó a la temperatura ambiente. Se utilizaron Placas para Muestras rígidas Impresas Wallac de 96 pocilios (1450-511; Wallac, Fl ) en todos los casos para los ensayos en fase sólida. Para preparar las placas para recubrir con el receptor, los pocilios se lavaron dos veces con 100 µl de metanol y luego se enjuagaron 3 veces con 200 µl de agua. Después de dejar a las placas secar a la temperatura ambiente, los pocilios se recubrieron con receptor por adición de 60 µl de una solución de 33.3 µg/ml de glicopolímero y se incubaron toda la noche a la temperatura ambiente. Después de la incubación, se eliminó el glicopolímero sin enlazar por lavado 3 veces con 200 µl de agua y el líguido remanente en los pocilios se dejó evaporar por incubación de las placas a 37 °C (ó temperatura ambiente) pro aproximadamente 1 h. Las placas recubiertas-secas podrían ser usadas inmediatamente ó selladas y almacenadas para uso en una fecha posterior.

El ensayo del núcleo 2 GlcNAc-T en HTS consistió de 20 µl de compuesto de prueba, 20 µl de 3 x regulador de ensayo al 3 % que consistió de 90 mM de MES pH 6.7, 10 mM de EDTA (Sigma), 0.0075 mM de UDP-GlcNAc (Sigma) y 0.1 µCi de UDP-[1H]G1C?AC (16 Ci/ oles) ; Toronto Research Chemicals) y 20 µl de núcleo 2 ClcNAc-T recombinante (que' contiene 8-10 µU/µl) para reacción en placas de 96 pocilios. Para minimizar el pipeteo, la enzima y 3 x regulador se combinaron rutinariamente y 40 µl de la mezcla enzima-regulador se añadió a los pocilios siguiendo la adición de los compuestos de prueba. Después de incubar las placas a 25 °C por 60 minutos, la reacción se detuvo por adición de 175 µl de agua a cada pocilio, aspirando el contenido y lavando 4 veces con 190 µl de agua. La señal radioactiva se midió utilizando un contador de placas MicroBeta (Wallac, Fl) después de añadir 100 µl de la mezcla de centelleo OptiPhase Supermix (Wallac) a cada pocilio y se incubaron por > 2 h, para permitir la mezcla. Cada placa en HTS tuvo 4 controles con el vehículo añadido de preferencia a los extractos de prueba, y el blanco se determinó con la omisión de la enzima, también 4 pocilios por placa. El blanco se sustrajo de cada placa, y los resultados de HTS se expresaron como un porcentaje de reacciones control sobre la placa. Los ensayos de HTS se corrieron en una plataforma robótica integrada Beckman que utiliza una estación de pipeteo Biomek 200 y un brazo robótico rotatorio Zymark. PanLabs (Seattle, WA) abasteció una colección de 31), 000 extractos bacterianos y fúngicos en placas de 96 pocilios. Los extractos secos se re-suspendieron en DMSO, y se diluyeron en agua a 0.15 % de DMSO para el núcleo 2 GlcNAc-T HTS.

Ensayos del núcleo 2 Glc?Ac-T en fase solución. La mezcla de ensayo en fase solución del núcleo 2 Glc?Ac-T fue similar a la usada en estudios anteriores (Yousefi y colaboradores, J. Biol.. Chem. 266:1722-1783, 1991; William y colaboradores, J. Biol.. Chem. 255:11253-11261, 1980) pero se adaptó por automatización en la plataforma robótica Beckman. Para ensayos de HYS, 10 µl de extracto de prueba, 10 µl de 3 x regulador de ensayo (90 mM de MES pH 6.7, 10 mM de EDTA, 3 mM de Galßl-3Gal?Aca-pNp como receptor, 3 mM de UDP-GlcNAc (Sigma) y 0.1 µCi de UDP-^HjGlc?Ac (16 Ci/mmol; Toronto Research Chemicals), y se añadieron 10 µl de la enzima del núcleo 2 Glc?Ac-T recombinante (4-5 µU de actividad) a los pocilios de la placa de titulación. Las reacciones en un volumen total de 30 µl se incubaron por 1-2 horas a 37 °C y se detuvieron por adición de 200 µl de agua fría. Las placas se procesaron inmediatamente ó se almacenaron a -20 °C. Para recuperar el producto, la mezcla de ensayo se aspiró a través del extremo de una pipeta empacada C18 (BGBS96C18 Biotips™, national Scientific) y el empaque se lavó 3 veces con 200 µl de H20. El producto enlazado se eluyó en placas de conteo por centelleo-ß (Placa para Muestras Rígidas Impresas de 96 pocilios: 1450-511 Wallac) por lavado del empaque C18 3 veces con 100 1 de etanol al 100 %. Los eluyentes se secaron entonces durante toda la noche a la temperatura ambiente para eliminar el etanol y la señal radioactiva se contó en el contador por centelleo-ß después de la adición del fluido para conteo. Se encontró que los productos de reacción se acumularon de una manera lineal por hasta 2 horas de incubaciones. Los extremos empacados C18 se limpiaron y regeneraron siguiendo las etapas del proceso por lavado una vez con 200 µl de etanol y luego 3 veces con 100 µl de H20.

RESULTADOS Glicopolímeros para ensayos glicosiltransferasa en fase sólida: El disacárido receptor Galßl-3GalNAca-R en donde R es ya sea octimetilo ó paranitrofenilo se ha usado rutinariamente en ensayos del núcleo 2 GlcNAc-T en solución en donde UDP-^HjGlcNAc es el nucleótido-azúcar donante. El producto, Galßl-3 ([3H]GlcNAcßl-6) GalNAca-R es capturado en el soporte sólido C18, eluído con etanol, y medido en un contador ß (Yousefi y colaboradores J. Biol.. Chem. 266:1772-1783, 1991). Este procedimiento de ha miniaturizado y automatizado, pero permanece relativamente lento comparado con los ensayos de alto rendimiento (HTS) estilo ELISA. Los glicopolímeros con grupos Galßl-3Gal?Aca se prepararon por síntesis química y se hicieron reaccionar con el núcleo 2 GlcBAc-T-ProtA recombinante para establecer la condición para los ensayos glicosiltransferasa en fase sólida. Los glicopolímeros receptores solubles en agua (3-8, 10 y 11-14 Figura 9) usados en los ensayos glicosiltransferasa en fase sólida son substratos polivalentes compuestos de estructuras de poliacrilamida ?-substituídas que contienen un residuo de disacárido Galßl-3Gal?Aca-0 (CH2) 3S (CH2) z (2) ó residuo de trisacárido [Glc?Ac (ßl-2) ]Man (ßl-6) Gle (ß-O] (CH2) 3S (CH2) ) por cada diez monómeros en la estructura acrilamida. La viscosidad-peso molecular promedio M, del núcleo polímero se determinó que es 42.1 kDa en base a un derivado poliacrilamida de 1 por tratamiento con amoníaco acuoso solo. La proporción de azúcar a acrilamida de uno a diez se determinó utilizando espectroscopia -"?-?MR de alto rendimiento y se basó en experimentos de optimización previos que utilizaron glicopolímeros análogos en ensayos de lectina enlazada a enzima (ELLA) (Roy, Trends in Glycoscience and Glycotech. 8:79-99 1996). Las estructuras de copolímero se modificaron con varias alquilaminas para mejorar su liofilicidad y asi, incrementar su comportamiento de adsorpción en la superficie de las placas de microtítulo de poliestireno.

Los copolímeros 6 y 14, que tienen las estructuras de N-poliacrilamida más liofílicas, fueron aproximadamente 8 veces más sensibles que ya sea los copolímeros de ?-etilo (5, 13) ó de acrilamida (3,11) mientras que los copolímeros 4 y 12 que tienen un substituyente ?-metilo, fué el receptor recubierto menos efectivo. El copolímero 10, que contiene un expaciador alilo más corto se encontró también inadecuado para la glicosilación enzimática, presumiblemente a causa de la inaccesibilidad de los re'siduos GalNAc en el sitio activo de la enzima. Similarmente, los copolímeros 7 (co-biotina) ó 8 (co-metacrilamida) proporcionaron ya sea pobre recubrimiento ó pobre glicosilación enzimática. El copolímero 7 que contenía biotina se indicó inicialmente que sirve como substrato recubierto después de captura por el pre-recubrimiento estreptavidina-avidina. El glicopolímero 6, gue tiene la estructura de ?-propilacrilamida más lipofílica, fue aproximadamente ocho veces más efectiva que ya sea los glicopolímeros de N- etilo (5) ó de acrilamida (3) mientras que el glicopolímero 4, que tiene un substituyente N-metilo, fue el recubrimiento receptor menos efectivo.

Pocilios plásticos recubiertos con glicopolímero.

Anteriormente en el desarrollo de los ensayos en fase sólida, se observaron resultados variables con diferentes lotes de placas plásticas. Un número de soluciones de pre-lavado se verificaron por su capacidad para eliminar la consistencia de la reacción del núcleo 2 GlcNAc-T.Los plásticos pre-lavados con solventes orgánicos mejoraron la señal en 2-4 veces y eliminaron la variación entre diferentes lotes de placas. El lavado con detergentes no-iónicos redujo la eficiencia de la reacción. Con base en estos resultados, las placas plásticas de 96 pocilios se lavaron rutinariamente dos veces con metanol, luego dos veces con agua y se almacenaron en seco antes de recubrir con el glicopolímero 3. El lavado de las placas plásticas se efectuó en la terminal de trabajo Beckman 2000 con brazo robótico. La dependencia del tiempo y la temperatura para recubrimiento de los pocilios con glicopolímero se determinó, y se determinó que fue óptimo, durante toda la noche el recubrimiento con 2 µg/ml, a 20 °C. El glicopolímero 3 se determinó que estaba en exceso, cuando la solución de recubrimiento de polímero se usó para recubrir pocilios posteriormente y produjo 80-90 % del producto de reacción realizada con el primer recubrimiento. Sin embargo, las soluciones de glicopolímero se usaron rutinariamente solo una vez.

Caracterización del ensayo en fase sólida, del núcleo 2 GlcNAc-T. En los experimentos iniciales, placas de 96 pocilios se recubrieron con una solución de 2 µg/pocillo de glicopolímero receptor 3, y se observó que los productos de reacción eran proporcionales a la enzima añadida durante 60 minutos. Sin embargo, la Km para UDP-GlcNAc, y para el receptor que utiliza el núcleo 2 GlcNAc-T-ProtA en el ensayo en solución se determinó que fue 1.75 mM y 146 µM respectivamente. En contraste, las condiciones de la reacción glicosiltransferasa en fase sólida emplearon substratos bien inferiores a las concentraciones de Km, de modo que la cantidad de glicopolímero 3 enlazada al plástico es limitante. Por consiguiente, la concentración azúcar-nucleótido se ajusta para optimizar la detección de producto radioactivo y es también inferior a las concentraciones de Km. Para establecer que los substratos no son agotados durante los 60 minutos de reacción, se efectuó una medida del tiempo y la titulación de UDP-GlcNAc a 37 °C. a concentraciones superiores de UDP-GlcNAc, la reacción se completó en menos de 5 minutos. Sin embargo, con UDP-GlcNAc a 2.5 µM, y 200 µU de actividad enzimática, el producto de reacción del núcleo 2 GlcNAc-T acumulado de una manera dependiente del tiempo por 30-60 minutos. El producto máximo formado fue 6-10 pmoles por pocilio, y cuando 2.5 µM de UDP-GlcNAc se usó en la reacción, esto representó aproximadamente 4 % de utilización del azúcar-nucleótido donante. Para simplificar el protocolo de HTS, estas condiciones (2.5 µM de UDP-GlcNAc, 200 µU de enzima) fueron entonces adicionalmente verificadas a la temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) . Bajo estas condiciones, se encontró que la acumulación de producto fue lineal con el tiempo por aproximadamente 60 minutos, y así, el ensayo HTS se efectuó rutinariamente a la temperatura ambiente.

Se elaboraron los glicopolímeros receptores de GlcNAc-TV y se probó que utilizan la enzima recombinante (Figura 10) . Similar a lo observado para el núcleo 2 GlcNAc-T, el glicopolímero 14, con la estructura de N-poliacrilamida más lipofílica más efectiva que ya sea glicopolímeros de ?-etilo (13) ó de acplamida (11) . El glicopolímero 12, un substituyentes ?-metilo enlazador fue el recubrimiento receptor menos efectivo. El producto de las reacciones GlcNAc-TV que utilizan el glicopolímero 14 acumulado de una manera dependiente del tiempo y de la enzima.

Selección de alto rendimiento (HTS) del núcleo 2 GlcNAc-T de extractos microbianos. Un acervo microbiano de 10,000 extractos se sometió a HTS utilizando los ensayos en fase sólida con el núcleo 2 GlcNAc-T como la selección primaria (por ejemplo glicopolímero 3) . Los resultados normalizados de una corrida típica de 1,600 ensayos se exponen en la figura 11. La señal de divulgación fue 20 veces y la CV de los controles positivos fue ± 9.4 % de los ensayos. Una serie de 48 extractos certeros, seleccionados de los datos de selección primaria (por ejemplo, inhibición de > 50 %) se colocaron sobre placas con otros 88 extractos inactivos, y se re-verificaron en una serie de diluciones de 5 puntos que utiliza los ensayos del núcleo 2 GlcNAc-T en solución y fase sólida. 94.4 % (17/18) de los aciertos identificados en el ensayo en solución fueron también aciertos en el ensayo en fase sólida. Aciertos adicionales, 3 con bien y 8 con curvas de titulación inconclusas se observaron en los ensayos en fase sólida. Extractos activos identificados en el núcleo HTS por 2 GlcNAc-T pueden fraccionarse para identificar moléculas activas para examinar adicionalmente en cultivos celulares y modelos de enfermedades animales .

DISCUSIÓN Un ensayo de glicosiltransferasa en fase sólida se optimizó para uso con el núcleo 2 GlcNAc-T recombinante. El ensayo se verificó también con glicopolímeros receptores para GlcNAc-TV y GlcNAc-TI y demostró ser aceptable para enzimas glicosiltransferasas. El ensayo con el Núcleo 2 GlcNAc-T en fase sólida se usó en una HTS de un acervo de extractos microbianos y extractos activos se confirmaron con un alto grado de concordancia en la fase sólida y un ensayo en solución convencional. El formato de ensayo en fase sólida permitió aumentar 5-6 veces el rendimiento en comparación con un ensayo en solución, en una proporción de 7, 500 por día.

La HTS por el núcleo 2 GlcNAc-T de 30,000 extractos mcirobianos produjo aciertos a una frecuencia de 1.5 % en el ensayo en solución. Un tercio del acervo fue también seleccionado utilizando el ensayo en fase sólida y produjo un alto grado de concordancia con los resultados previamente encontrados con el ensayo en solución.

EJEMPLO 3 Ensayo con L-PHA de alto rendimiento Materiales y métodos Químicos. L-PHA. Se obtuvo Tritón X-100 y para-nitrofenilfosfato de Sigma; se adquirió dietanolamina de Fisher.

Células. El origen y propiedades de la cepa DBA-2 de tumor linforeticular MAY-D2 se ha descrito previamente (Kerbel, RS, Florian, M. Man. MS, Dennis J. McKenzie IF (1980) J. Nati Cáncer Inst, 64, 1221-1230) . Las células se cultivaron en el medio de Eagle modificado que contenía suero de ternera fetal al 2 % inactivado-caliente (Gibco BRL) a 37 °C en una atmósfera humidificada de 95 % de 02/5 % de C02.

Ensayo de fosfatasa alcalina. La determinación se llevó a cabo utilizando placas de 96 pocilios. Cada pocilio contenía un número variable de células MAY-D2 mantenidas en 125 µl de medio de cultivo suplementado con suero de ternera fetal al 2 % . La reacción de la fosfatasa alcalina se inició por adición de 75 µl de la mezcla de ensayo (regulador dietanolamina 1 M, pH 9.8, 2 mM de MgCl2, Tritón X-100 al 2 % y 2.5 mM de paranitrofenilfosfato) y se incubó a 37 °C por hasta 90 minutos. La reacción se detuvo con 80 µl de NaOH 3.5 M. Después de 15-30 minutos de desarrollo de color, se determinó la absorbancia del producto cromogénico paranitrofenol a 405 nM utilizando el fotómetro de exploración multipocillos (Los Dispositivos Moleculares del Lector Multiplaca Thermomax) . Los valores del blanco se determinaron a través de ensayos efectuados sobre medio de cultivo solo en ausencia de células y sustraídas rutinariamente. La linearidad entre la absorbancia a 405 nM y la concentración de para-nitrofeno estaba en el rango de 0-2.5 (e - 17.23 mM"1 cm"1) .

Ensayos de selección vía L-PHA. El procedimiento estaba completamente automatizado por utilización de una terminal robótica (Biomek-2000, Beckman) capaz de procesar nueve placas de 96 pocilios simultáneamente. Las determinaciones se efectuaron en placas de 96 pocilios de fondo plano (88 muestras + 8 controles por placa) . Cada pocilio (columnas 1-11) recibió 10 µl de compuesto (en DMSO al 2.5 %), mientras que 10 µl de DMSO al 2.5 % en agua se añadieron a la columna 12. los 96 pocilios recibieron 5 x 107 células MAY-D2 en 90 µl de medio de cultivo suplementado con FCS al 2 %. Después de 16-20 horas de incubación a 37 °C, 25 µl de L-PHA (100 µg/ml en medio de cultivo) se añadió a las primeras 11 columnas y a 4 pocilios de la doceava (control positivo) . Los otros 4 pocilios recibieron 25 µl de medio suplementado con FCS al 2 % (control negativo) . Las placas de ensayo se mantuvieron por 30-36 horas a 37 °C, y se determinó la actividad de la fosfatasa alcalina conforme al protocolo descrito anteriormente utilizando un tiempo de incubación de 1 hora. La densidad celular fue subconfluente en el transcurso del ensayo. Los índices de proliferación se expresaron como valores en porcentaje calculados con la fórmula: Señal normalizada = (A_05 de muestra- A405 media del control positivo) / (A40s medio del control negativo- A405 media del control positivo) RESULTADOS En ensayos de selección homogéneos los resultados se determinaron sin lavar ó transferir proteínas ó células, reactantes, y compuestos de prueba seleccionadas como objetivos desde las placas de ensayo. Los formatos de ensayo homogéneo ahorran tiempo en efectuar el ensayo, y con menos manipulaciones, se observaron pocos errores. Esto se tradujo en menos ensayos continuos sobre aciertos putativos en una gran selección. Un ensayo basado en células homogéneas ha desarrollado medidas de crecimiento y variación celular utilizando la actividad de la fosfatasa alcalina endógena.

Las células tumorales MDRY-E2 conservadas en cultivo de tejido en fase logarítmica de crecimiento exhibe actividad de fosfatasa alcalina en el rango de 40-80 nmoles/h/104 células. Las determinaciones de fosfatasa alcalina fueron lineales con el tiempo por al menos 90 minutos, y directamente proporcionales al número de células, permitiendo la detección de 1500 células. El tiempo al que se duplicaron las MDA-D2 calculado hasta la acumulación de la actividad de la fosfatasa alcalina fue de ~ 14 horas, similar al medido por conteo celular. El ensayo de la fosfatasa alcalina es comparable en reproductibilidad y sensibilidad, con un método quimioluminométrico, disponible comercialmente .

La Km aparente de la fosfatasa alcalina medida en las células MLAY-D2 completas fue de 0.86 mM, mientras que el valor exhibido por la enzima soluble presente en el suero de ternera fetal fue de 0.21 mM. la actividad presente en el blanco en medio de cultivo celular que contiene FCS al 2 % produjo un A405 de 0.2 después de 1 hora de incubación y representó aproximadamente 10 % de la señal con las condiciones estándares de ensayo.

Bloques protectores de la a-manosidasa II, que actúan como un inhibidores de la biosíntesis del N-oligosacárido tipo complejo dio como resultado una resistencia a la toxicidad de la lectina L-PHA. Células MDAY-D2 protegidas con preservadores de la toxicidad de L-PHA con un valor de IC50 de 0.528 +/- 0.0087 µM (n=8) . Un valor de IC50 de 0.2 µM se reportó anteriormente utilizando la incorporación de timidina como una medida de crecimiento celular (Dennis y colaboradores, 1993, Biochem, Pharmacol . , 46, 1459-1466).

En ensayo celular de la fosfatasa alcalina se aplicó a selecciones de alto rendimiento de un acervo de extractos microbianos. La señal en proporciones de fondo (por ejemplo crecimiento de L-PHA tratada/células _y_D&Y-D2 control) fue 5 y el coeficiente de variación de ambas muestras control negativa y positiva fue de 4.2 % y 2.4 % respectivamente. Veinte extractos microbianos de los 30,000 examinados incrementaron la factibilidad celular en presencia de L-PHA en un grado mayor que 3 x SD de la media. Esto cayó en el lado derecho de la distribución normal, Figura 12) . En re-verificación 4 de los 20 extractos se confirmaron como certeros para fracción adicional. Un número de extractos suprimió el crecimiento inferior al observado en presencia de L-PHA (ver a la izquierda de la distribución normal) . Estos contienen probablemente compuestos que son generalmente tóxicos, y no son de interés.

DISCUSIÓN La proporción de proliferación de células MAY-D2 se monitoreó empleando un ensayo de actividad de la fosfatasa alcalina. El motivo de este trabajo fue establecer un procedimiento simple, reproducible, y de costo efectivo para aplicarse para ensayos de elección de alto rendimiento vía L-PHA. Una determinación colorimétrica de la actividad de la fosfatasa alcalina se encontró adecuada para medir la proliferación de células B dependiente de linfocina (Hashimoto N y Zubler RH (1986) J. Inmuno 1 . Methods 90, 97-103.); la ventaja del protocolo descrito en la presente es que el método puede llevarse a cabo en una sola etapa sin eliminación del medio de cultivo ó compactación y lavado de las células, por consiguiente que permiten procedimientos completamente automatizados. Además, el uso de una plataforma robótica permitió el proceso simultáneo de 36 placas d e96 pocilios. El método es muy efectivo en costo, especialmente cuando se compara a otros equipos de ensayo disponibles comercialmente.

La sensibilidad y precisión del método de la fosfatasa alcalina está basado en varias observaciones: i) las células MEAY-D2, expresan relativamente altos niveles de enzima, mientras que la actividad del blanco presente en el suero de ternera fetal (2%) es baja; ii) se encontró que las lecturas de A405 son proporcionales a la concentración del producto de reacción; iii) la reacción es lineal con el tiempo en un intervalo relativamente amplio de hasta 1.5 horas; y, iv) los números de células MDAY-D" (ambas sin tratar y tratadas con L-PHA) se correlacionaron con la actividad enzimática en un rango relativamente amplio (por ejemplo 1 x 10J hasta 2.5 x 10 células) El ensayo se efectuó utilizando 1 mM de substrato (concentración final) , 4 veces encima de Km de la enzima en el suero (ver 0.21 mM) y similar al de la enzima celular (ver 0.86 mM) . Con esta diferencia de 4 veces en los valores de Km, la señal en proporción al blanco puede' amplificarse por incremento de la concentración del substrato por encima de 1 mM.

Se comprobó que el ensayo es confiable por varios indicios. Por ejemplo, se empleó como protector, un inhibidor conocido del proceso de oligosacárido N-enlazado, conjuntamente con el ensayo L-ALPHA/fosfatasa alcalina, el IC50 del fármaco comparado bien con el reportado previamente utilizando la incorporación de timidina para medir el crecimiento celular. Adicionalmente, los resultados de la determinación de la proliferación celular correspondieron a los obtenidos utilizando otro equipo quimioluminiscente, en una sola etapa, comercialmente disponible. Finalmente, durante la selección de acervos de extractos (30,000 muestras) , medidas control de la actividad de la fosfatasa alcalina (n=3200) demostraron coeficientes de variaciones que fueron marcadamente bajos.

Mientras que la presente invención se ha descrito con referencia a lo que es considerado en la presente para ser mencionados como ejemplos, se comprende que la invención no se limita a los ejemplos expuestos. Al contrario, la invención, pretende cubrir varias modificaciones y arreglos equivalentes incluidos en el espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan a la presente como referencia en su integridad con la misma intención que si cada publicación individual, patente ó solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia en su totalidad.

Tabla 1 Enzima Donante Receptor Glicoproteín-fucosil UDP D-GalNAc Glicoprotein galactosida-alfa-N-acetil a-L fucosil-galactosiltransferasa (l,2)-D-galac- (EC 2.4.1.40) tosa (?-acetilneuróaminil) - UDP D-GalNAc (N-acetilneura-galactosiIglucosi1cera- minil) D-galacto-mida ?-acetil galacto- sil-D-glucosil-c saminil transferasa ceramida (EC.2.4.1.92) ß-1, -?-acetil UDP D-Gal?Ac (?-acetilneura-galactosaminil transminil) D-galacto-ferasa (síntesis del sil-D-R antígeno CT del linfo-cito T de Murina) (Swiss Prot Q09199) ?-acetil lactosamida UDP-D-Gal ß-D-galactosil-Alfa 1, 3-galactosil- (l,4)?-acetil-D-transferasas (galacto- glucosaminil-R Tabla 1 (continuación) Enzima Donante Receptor sil transferasa) (EC 2.4.1.151) Glicoprotein-fucosil- UDP-D-Gal Glicoproteín-galactosida-a-galactosil- a-L-fucosil (1, transferasa (EC 2.4.1.37) 2) -D-galactosa Sintasa de N-acetil UDP-Gal N-acetil-D-glu-lactosamina cosamina (EC~2.4.1.90) 2-hidroxiacil esfingosina UDP-Gal 2- (2-hidroxi-1-galactosiltransíerasa acil) esfingo(EC 2.4.1.45) sina UDP-galactosa-Glucosa UDP-D-Gal D-glucosa galactosiltransferasa N-acetil-lactosamina sintasa Tabla 1 (continuación) Enzima Donante Receptor Fucosil glicoproteína UDP-D-GalNAc Glicoproteina a-N-acetilgalactosaminil a-L-fucosil-transferasa (l,2)-D-galac- tosa Galactosida-2-L-fucosil Transferasa (EC 2.4.1.69) GDP-L-fucosa ß-D-galactosil-R Galactosida 3 (4) -L-fucosil GDP-L-fucosa ?-acetil-D-glu -Transferasa (EC 2.4.1.65); cosaminil-R de 1 Fucosiltransferasa 6 (SWISS 1, 3-ß-D-galacto-PROTP51993) ; silo Fucosiltransferasa 5 (SWISS PROT Q11128) a-1, 3-manosil UDP-D-GlcNAc a-D-manosil-1,3 -glicoproteina (Rl) -ß-D-manosil ß-1, 2-?-acetilgluco- -R2 saminil transferasa (GnT 1) (EC 2.4.1.101) Tabla 1 (continuación) Enzima Donante Receptor a-1, 6-manosil-glicoprotein- UDP-D-GlcNAc a-D-manosil-1, ßl, 2-N-acetilglucosaminil 6(N-acetil-ß-D transferasa (Gn T II) glucosaminil-1, 2 (EC 2.4.1.143) -a-D- (manosil-1, 3-) -ß-D-manosil- R a-1, 3 (6) -manosilglico- UDP-D-GlcNAc N-acetil-ß-gluco protein ß-1, 6-?-acetil- saminil-1, 2-alfa glucosaminiltransferasa D-manosil-1, 3 (6) (EC 2.4.1.155) (Gn T V) - (?-acetil-ß-D- glucosaminil-1, 2 -a-D-manosil-1, 6 (3) -ßD-manosil- 1,4-?-acetil-ß- D-glucosaminil-R Polipéptido-?-acetil UDP-D-Gal?Ac Polipéptido -galactosaminil transferasa (EC 2.4.1.41) Tabla 1 (continuación) Enzima Donante Receptor ß-1, 4-manosil-glicoprotein UDP-D-GlcNAc N-acetil-ß-D-ß-1, 4-N-acetilglucosaminil cosaminil-1, 2-transferasa (GnT III) alfa-D-manosil- (EC 2.4.1.144) l,3-(N-acetil-ß- D-glucosaminil- 1, 2-a-D-manosil- 1, 6) -ß-D-manosil -1,4-N-acetil-ß- D-glucoaminil-R.

Quitin sintasa UDP-D-GlcNAc {(1,4) -N-acetil-(EC 2.4.1.16) ß-D-glucosami- nil) } (N) ß-1, 3-galactosil-O-glicosil UDP-D-GlcNAc ß-D-galactosil-glicoprotein-ßl, 6-N-acetil- 1, 3-?-acetil-glucosaminiltransferasa D-galactosaminil (EC 2.4.1.102) -R (ßl, 6 (núcleo 2 O-enlazado) ) Tabla 1 (continuación) Enzima Donante Receptor UDP-N-acetilglucosamina- UDP-D-GlcNAc Doliquil fosfato doliquil-fosfato de ?-acetil-glucosaminfosfo-transferasa (EC 2.7.8.15) Galactosida 3-fucosil GDP-L-fucosa 1, 4-ß-D-galac-transferasa (EC 2.4.1.152) tosi1-?-acetil- D-glucosaminil-R Fucosiltransferasa 7 GDP-L-fucosa a-2,3-Neu-N-(SWISS PROT Q11130) acetil-1, 4-ß-D- galactosil-?- acetil-D-gluco- saminil-R Tabla 2 (KDO) transferasa del ácido 3 -des oxi -D -mano -octulosónico KDO transferasa de Chlamydia pneumoniae gb:z31593 KDO transferasa de Chlamydia psittaci gb:x80061 gseA transferasa de Chlamydia psittaci gb:x69476 KDO transferasa de Chlamydia trichomatis gb:m64618 gseA transferasa de Chlamydia trachomatis gb:z22653 gb:z22654 gb:z22655 gb:z22656 gb:z22659 kdtA de Escherichia coli gb:m86305 gb:u00039 sw:p23282 (kdta ecoli) Gal -2 -fucosiltransferasa del antígeno-O Gen de fucosiltransferasa de Yersinia enterocolitica gb:ul8674 gb:u25113 gb:u46859 cid (extensión de cadena determinante) (similar a la undecaprenil-O-GlcNAc transferasa putativa) cldl de Escherichia coli gb:zl7241 sw:zl7241 sw:q05032 / cldl_ecolí) cld2 . de Escherichia coli gb:m89934 sw:p35272 (cld2_ecoli) cid de Salmonella typhimurium gb:zl7278 sw:q04866 (cid salty) cid de Shigella flexneri gb:x71970 sw:p37792 (cld_shifl) cpsD galactosiltransferasa Gen cpcD de Streptococcus ogalactiae gb:109116 IgtA galactosiltransferasa Rhyzobium leguminosarium All away y colaboradores (1996) sin publicar gb:x94963 murG N-asetilglusosaminil transferasa Gen murG de Bacillus subtilis gb: s56399 gb:x64259 mraY fosfo-N-acetilmuramoilpentapéptido sintasa EC 2 . 7 . 8 . 13 Gen mraY de Bacillus subtilis gb: zl5056 sw:q03521 (mray_ba csu) Gen mraY de Escherichia coli gb:x51584 gb:x55034 gb : di 0483 sw:pl5876 (mray ecoli) mtfA. mtfB, mrfC manosiltransferasas Genes mtfA, mtfB y mtfC de Escherichia coli gb:dl3231 gb:d43637 neuS de 2, 8-sialil transferasa gen neuS de Escherichia coli bg:x60598 nodC de N-acetilglucosaminil ransferasa Azotorhizobium caulidonans bg:118897 sw:q07740 (nodc_azoca) Bradyrhizobium elkanti gb: u04609 rfaB 1 , 6-galactosil transf erasa Gen rfaB de Escherichia coli gb:m80599 gb: u00039 sw:p27127 (rfab_ecoli) gen rfaB de Salmonella typhimurium gb:s56361 sw:q06994 (rfab sal ty) rfaC hepulosiltransferasa I Gen rfaC de Escherichia coli gb: u00039 sw:p24173 (rfac ecoli) rfaG glusosil ransferasa Gen rfaG de Escherichia coli sw:p25740 (rfag ecoli) rfal 1 , 3-galactosiltransf erasa EC 2.4.1.44 Gen rfal de Escherichia coli gb:m80599 gb: u00039 sw:p27128 (rfai_ecoli) Gen rjal de Salmonella typhinuriun gb:x53847 sw:pl9816 (rfai sal ty) rf aJ 1 , 2 -glucosil transf erasa EC 2.4.1.58 Gen rfaJ de Escherichia coli sw:p27129 (rfaj_ecoli) Gen rfaJ de Salmonella Typhimurium sw:pl9817 (rfaj_salty) rfaK 1 , 2 -N-asetilglucosaminil transf erasa EC 2.1.1.56 Gen rfal de Escherichia coli gb: u00039 sw:p27242 (rfai ecoli) _ __ rfbF galactosiltransferasa Gen rfbF de Campylobacter hyoilei gb:x91081 Gen rfbF de Klebsiella pneumoniae gb: 131762 gb: 141518 rfbN rhamnosil ransferasa Gen rfbN de Salmonella typhimurium gb:x56793 rfbP galactosiltransferasa Gen rfbP de Yersinia enterocplitica gb: ul8674 gb: u25113 gb: u46859 Gen rfbP de Salmonella entérica gb:x61917 rfbQ rhamnosiltransferasa Gen rfbQ de Salmonella entérica gb:x61917 rfbU manosiltransferasa Gen rfbU de Salmonella typhimurium gb:x56793 sw:p26402 (rfbu_sal ty) rfbW segunda manosiltransferasa Gen rfbW de Salmonella entérica gb:x6191 7 rfbZ primera manosil transferasa Gen efbZ de salmonella ent rica gb:x61917 rfe undecaprenil-P-GlcNAc transferasa Gen rfe de Escherichia coli gb : s75640 gb:m87049 gb:m76129 sw:p24235 (rfe_ecoli) Gen rfe de Mycobacterium leprosium gb : ul5186 sw:p45830 (rfe_mycle) rffM probable ácido N-acetil -D -manos ami nur ónico transferasa Gen rffM de Escherichia coli gb :m87049 sw:p27836 (rffm__ ecoli) Gen rffM de Salmonella Typhimuri um gb:m95047 sw:p37457 (rffm sal ty) rffT probable 4-fucosiltransferasa Gen rffT de Escherichia coli gb:m95047 sw:p37458 (rffr sal ty) RhlABr rhamnosil trans erasa Gen rhlAB de Pseudomonasaeruginosa, gb:1281 70 RhaAB ramnosiltransferasa Gen rhlAB de Pseudomonasaeruginosa gb:1281 70 Glicosiltransferasa locus de N. Gonorrhoeae Patente USA No. 5,703,367 de Gotschlich Tabla 3 Tabla 4 25 Tabla 5 q-0o 1

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un acervo ó biblioteca combinatoria que está caracterizada porque comprende una colección predeterminada de moléculas de péptido nucleósido para inhibir la transferencia de un azúcar de un donante nucleótido de azúcar seleccionado, a un receptor seleccionado por una enzima procesadora de carbohidratos en la que una molécula de péptido nucleosido comprende (a) un monómero nucleosido; (b) un monómero espaciador acoplado al monómero nucleosido en donde el monómero espaciador comprende uno ó más i residuos de aminoácidos enlazados a una amida ó miméticos de los mismos; y (c) monómeros encubridores fijados al monómero espaciador; en donde las moléculas de péptidos nucleosidos difieren cada una de las otras en la identidad de al menos un elemento del monómero nucleosido, monómero espaciador ó monómeros encubridores o de terminación.

2. Un acervo ó biblioteca combinatoria como la reclamada en la reivindicación I que está caracterizada porque la enzima procesadora de carbohidratos es una glicosiltransferasa involucrada en la biosíntesis de glicoproteínas, glicoplípidos, ó glicosil fosfatidil inositoles .

3. Un acervo ó biblioteca combinatoria como la reclamada en la reivindicación 2 que está caracterizada porque la enzima procesadora de carbohidratos es una N-acetilglucosaminiltransferasa I, II, III, IV, ó V, ó ß-1, 3-galactosil-O-glicosil-glicoproteina ß- 1,6-N-acetilglucosaminil transferasa (Núcleo 2 GlcNAc) .

4. Un acervo ó Biblioteca combinatoria como la reclamada __. en la reivindicación 1,2 ó 3 que está caracterizada porque el monómero nucleótido es uridilo, 2'-desoxiuridilo, ó 5' -amino-5' -desoxi-2' , 3' -O-isopropilidin uridilo.

5. Un acervo ó biblioteca combinatoria como la reclamada en cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está caracterizada porque el monómero encubridor es metilo (Me) , formilo (CHO) , etilo (Et) , acetilo (Ac) , t-butilo (t-bu) , anisilo, trifluoroacetilo (Tfa) , benzoilo (Bz) , 4-metilbenc?lo (Meb) , tioanisilo, benciloximetilo, 4-nitrofenilo (Pnp) , benciloxicarbonilo (Z) , 2-nitrobenzoilo (NBz) , 2-nitrofenilsulfenilo (Nps), 4-toluensulfonilo (Tosil, Tos), pentafluorofenilo (Pfp), difenilmetilo (Dpm), 2-clorobencciloxicarbonilo (Cl-Z) , 2, 4, 5-triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z) , trifenilmetilo (Tritilo, Trt), 2, 2, 5, 7, 8-pentametil-croman-6-suIfonilo (Pmc), t- butoxicarbonilo (Boc) , bencilo (Bz), benciloximetilo (Bom) , y 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) .

6. Un acervo ó biblioteca combinatoria como la reclamada en cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está caracterizada porque el monómero espaciador es una sola amida enlazada a un aminoácido, una amida enlazada a un dipéptido, ó una amida enlazada a un tripéptido, ó un mimético de los mismos.

7. Una molécula de péptido nucleósido que está caracterizada porque comprende un monómero nucleosido; un monómero espaciador acoplado a un monómero nucleosido, en donde el monómero^ espaciador comprende una ó más amidas enlazadas a residuos de aminoácidos, ó un mimético de los mismos; y monómeros encubridores fijados al monómero espaciador.

Una molécula de péptido nucleosido de la fórmula I en donde X es H, -COOH, -OS03H, ó (CH2)qS03H en donde q es 0 ó 1, y R representa (Y)m en donde Y es una amida enlazada a un residuo de aminoácido y m es 1-3, Z' y Z son iguales ó diferentes y representan hidroxilo ó alcoxi ó Z' y Z juntas forman un grupo acetónido, y en donde grupos NH2 libres en el compuesto de la fórmula I están encubiertos con un monómero encubridor.

9. Una molécula de péptido nucleosido de la fórmula I como la reclamada en la reivindicación 8 gue está caracterizada porque X es H, -COOH, -OSO3H, ó (CH2)qS03H en donde q es O ó l, y Z y Z' son ambas hidroxilo ó forman juntas un grupo acetónido, R representa -NHCOR1, en donde R1 representa en donde R es alcoxi; (b) -CHR )3°-Rr>4 en donde R es hidrógeno ó -?H2 y R4 es O en donde R5 es halógeno, alquilo, ó alcoxi, -CH2N(CH3)CH2CH2R6 ó -? (CH3) CH2CH2R6, en donde R6 es halógeno, -CH2N(C2H5)CH2CH(CH3)OH, ó -CH2NHC0CH (CH3) 2, Ó R4 representa (CH2)nR8 en donde n=0 a 5, R8 es halógeno, en donde R9 es alcoxi, ' -N(CH2)CH2CH2R .110U en donde R10 es halógeno, N(C2H5)CH2CH(CH3)OH, ó -?HCOCH (CH3) 2 y * en donde los grupos amino libres están protegidos con un monómero encubridor.

10. Una molécula de péptido nucleósido de la fórmula I como la reclamada en la reivindicación 8 que está caracterizada porque X es -COOH, y R representa -NHCOR1 en donde R1 representa -CHR3R4 en donde R3 es hidrógeno y R4 es (CH2)nR8 en donde n=0 a 5, preferiblemente 1 a 4, R8 es halógeno, en donde R es alcoxi, halógeno, ó alquilo, ó .N(CH3)CH2CH2R10 en donde R10 es halógeno, N(C2H5)CH2CH(CH3)0H, ó -?HCOCH (CH3) 2 •

11. Una molécula de péptido nucleósido de la fórmula I como la reclamada en la reivindicación 8 que está caracterizada porque, X es -COOH, y R representa_ -NHCOR1 en donde R1 representa -CHR3R4 en donde R3 representa -?H2 y R4 es O- en donde R es halógeno, alquilo ó alcoxi -CH2N (CH3) CH2CH2R en donde R6 es halógeno, CH2N ( C2H5) CH2CH (CH3) OH, -CH2NHCOCH (CH3) 2, ó

12. Una molécula de péptido nucleósido de la fórmula I como la reclamada en la reivindicación 8, que está caracterizada porque X es -OS03H, ó (CH2)qS03H en donde q es 0 ó 1, R representa -NHCOR1 en donde R1 representa -CHR3R4 en donde R3 representa NH2/ y R4 es en donde R es halógeno, alquilo ó alcoxi, CH2N (C2H5) CH2CH (CH3) OH, ó -CH2?HC0CH (CH3) 2.

13. Un proceso para preparar un acervo ó biblioteca combinatoria que está caracterizado porque contiene una colección predeterminada de moléculas de péptidos nucleósidos para inhibir la transferencia de un azúcar desde un donante nucleótido de azúcar seleccionado que tiene una base amina libre, a un receptor seleccionado por una enzima procesadora de carbohidratos que comprende: (a) acoplar uno ó más aminoácidos, ó miméticos de los mismos a una unidad monómera nucleósida que comprende una base amina heterocíclica acoplada a un azúcar en donde la base corresponde a la base amina heterocíclica del donante nucleótido de azúcar, ó una forma análoga ó modificada de la base; y ¡V. y - * (b) encubrir o terminar cualquiera de los grupos funcionales ó grupos amina con una unidad monómera encubridora o terminadora.

14. Un método de utilizar un acervo ó biblioteca combinatoria como la reclamada en la reivindicación 1 para seleccionar por moléculas farmacológicamente activas.

15. Un bioensayo en fase sólida para identificar un compuesto que tiene actividad inhibidora contra una enzima procesadora de carbohidratos que está caracterizada porque comprende (a) acoplar un receptor para la enzima procesadora de carbohidratos a un polímero y recubrir sobre un vehículo; (b) añadir una enzima procesadora de carbohidratos, un donante de nucleótido de azúcar marcado con una substancia detectable, y un compuesto de prueba; (c) medir el cambio detectable producido por la substancia detectable; y (d) comparar a un control en ausencia del compuesto de prueba en el que una disminución en la cantidad de substancia detectable con el compuesto indica que el compuesto de prueba tiene actividad inhibidora contra la enzima.

16. Un método para identificar un compuesto que inhibe el proceso de oligosacáridos N-enlazados que está caracterizado porque comprende (a) hacer reaccionar un compuesto de prueba con células que expresan oligosacáridos N-enlazados en presencia de L-PHA y medir la actividad de la fosfatasa alcalina; y (b) comparar a un control en ausencia del compuesto de prueba en el gue un aumento en la actividad de la fosfatasa alcalina indica que el compuesto inhibe el proceso del oligosacárido N-enlazado.

17. Una composición farmacéutica gue está caracterizada porque comprende un compuesto identificado por un método como el reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 14, 14, ó 16.