MXPA00011754A - Celulas, plantas y semillas de algodon geneticamente manipuladas para expresar proteinas de union a quitina (lectinas) con actividad insecticida y fungicida - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a genes quiméricos que codifican lectinas que presentan actividad pesticida, por ejemplo actividad insecticida y/o fungicida, los cuales se pueden utilizar para transformar algodón para dar células, plantas y semillas de algodón en las cuales se expresan los genes quiméricos;tales células de algodón transformadas son pesticidas cuando son ingeridas por las plagas de algodón.

Description

CÉLULAS, PLANTAS Y SEMILLAS DE ALGODÓN GENÉTICAMENTE MANIPULADAS PARA EXPRESAR PROTEÍNAS DE UNION A QUITINA fLECTINAS) CON ACTIVIDAD INSECTICIDA Y FUNGICIDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a genes quiméricos que se expresan en células, plantas y semillas de algodón, y que codifican para insecticidas y fungicidas que sustancialmente tienen la toxicidad de las lectinas de cebada, ortiga y heveina hacia insectos y hongos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas que se unen a quitina (lectinas) están presentes en una amplia gama de especies vegetales, incluyendo tanto monocotilédoneas como dicotiledóneas, aún cuando estas plantas no contienen quitina. Se cree que éstas están relacionadas con la defensa, y muchas presentan actividades insecticidas y/o antifúngicas (Murdock et al., 1990; Lerner, D.R. y Raikhel, N.V., 1992). Las lectinas presentan propiedades especificas de unión a carbohidrato. Las lectinas son, supuestamente, proteínas relacionadas con la defensa en vegetales las cuales ejercen su efecto uniéndose a N-acetilglucosamina en las especies de plagas susceptibles (Schroeder, M.R. y Raikhel, N.V. 1992).

En forma pura, las lectinas de cebada, ortiga y heveina han demostrado actividad insecticida y fungicida contra ciertas especies de plagas que se sabe atacan al algodón (por ejemplo Heliothis y Fusarium). Se dispone de varios métodos para utilizar las lectinas en el control de tales plagas, pero todos requieren proveer a dichas proteínas en forma suficientemente pura y en cantidad suficiente para efectuar el control del insecto o patógeno objetivo. Incluso cuando se pueden conseguir en cantidad o con pureza suficiente, éstas deben ser aplicadas al cultivo de tal manera que efectivamente lleguen a las especies objetivo. Además, debido a que las lectinas son proteínas, si se aplican por vía tópica a los cultivos éstas están sujetas a ia luz y a inactivación con proteasa antes de que éstas puedan ejercer su efecto de control. No se puede tratar fácilmente a patógenos asociados a la raíz con tales preparaciones. Por lo tanto, no se ha podido disponer de lectinas para utilizarlas en el control de muchas plagas serias de algodón, aunque podrían ser efectivas si se pudiera disponer de éstas en concentraciones suficientemente puras y elevadas. Tomando ventaja de la ingeniería genética, un gen responsable de la producción de un polipéptido útil puede ser transferido desde una célula donadora, en la cual el gen se presenta en forma natural, hacia una célula hospedera, en la cual el gen no se presenta en forma natural; Cohén y Boyer, patentes E.U.A. Nos. 4,237,224 y 4,468,464. De hecho existen unas cuantas limitaciones inherentes a tales transferencias. Los genes se pueden transferir entre virus, bacterias, plantas y animales. En algunos casos, el gen transferido es funcional, o puede hacerse funcional, en la célula hospedera. Algunas veces, cuando la célula hospedera es una célula vegetal, se pueden regenerar plantas enteras a partir de la célula. Los genes típicamente contienen regiones de secuencias de ADN que incluyen un promotor y una región transcrita. La región transcrita normalmente contiene una región 5' no traducida, una secuencia de codificación y una región 3' no traducida. El promotor contiene la secuencia de ADN necesaria para la iniciación de la transcripción, durante la cual la región transcrita se convierte en ARNm. En las células eucariontes, se creé que el promotor incluye una región reconocida por una ARN polimerasa y una región que coloca la ARN polimerasa sobre el ADN para iniciar la transcripción. Esta última región, la cual es conocida como la caja TATA, usualmente se presenta alrededor de 30 nucleótidos hacia el extremo 5' desde el sitio de inicio de la transcripción. Después de la región promotora está una secuencia que se transcribe a ARNm pero que no se traduce en polipéptido. Esta secuencia constituye la denominada región 5' no traducida y se cree que contiene secuencias que son responsables de la iniciación de la traducción, tales como un sitio de unión a ribosoma. La región de codificación es la secuencia que esta justo hacia el extremo 3' desde la región 5' no traducida en el ADN o el ARN correspondiente. Esta es la región de codificación que se traduce en polipéptidos de conformidad con el código genético. Por ejemplo Bacillus thuringiensis, tiene un gen con una secuencia de codificación que se traduce en la secuencia de aminoácidos de una proteína cristalina insecticida. La región de codificación es seguida por una secuencia que se transcribe a ARNm, pero que no se traduce en polipéptido. Esta secuencia es denominada la región 3' no traducida y se cree que contiene una señal que conduce a la terminación de la transcripción y, en el ARNm eucarionte, una señal que ocasiona la poliadenilación de la cadena de ARNm transcrita. Se cree que la poliadenilación del ARNm tiene funciones de procesamiento y transportación. Los genes naturales pueden ser transferidos en su totalidad desde una célula donadora hasta una célula hospedera. Con frecuencia se prefiere, sin embargo, construir un gen que contenga la región de codificación deseada con un promotor y, opcionalmente, la regiones 5' y 3' no traducidas que no existen, en la naturaleza, en el mismo gen como la región de codificación. Tales construcciones son conocidas como genes quiméricos. La lectina de cebada es una proteína vacuolar sintetizada con una secuencia de señal aminoterminal para que entre a la ruta de secreción y un pro-péptido carboxilo terminal necesario para que sea dirigida apropiadamente a la vacuola (Bednarek, S.Y., y Raikhel, N.V., 1991 ). El polipéptido carboxilo-terminal glucosilado (CTPP) se retira antes o al mismo tiempo con la deposición de la proteína activa, madura en las vacuolas (Bednarek et al., 1990). La lectina madura de cebada es una proteína dimérica compuesta . de dos polipéptidos idénticos de 18 kilodaltons (Wilkins, T.A., Bednarek, S.Y. y Raimkhel, S.V., 1990). Se han reportado la secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácidos deducida de la región de codificación de lectina de cebada (clon BLc3 de ADNc de lectina de cebada) (véase Lerner y Rainkhel, 1989; y la patente E.U.A. número 5,276,269, incorporados en la presente invención para referencia). Se creó una construcción de gen quimérico fusionando la región de codificación para BLc3 al promotor 35S de CaMV y transfiriendo la construcción de gen quimérico a plantas de tabaco mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (patente E.U.A. número 5,276,269). Se reportó que las plantas presentan propiedades insecticidas y fungicidas. Se aisló un clon de ADNc de longitud completa (HEVI) que codifica para la lectina de Hevea brasiliensis a partir de la genoteca de ADNc del látex de H. Brasiliensis, se le determinó la secuencia, y se caracterizó (véase Broekaert et al., 1990; Lee et al., 1991 ; y la patente E.U.A. número 5,187,262, incorporados en la presente invención para referencia). En breve, HEV1 es de una longitud de 1018 nucleótidos e incluye un marco de lectura abierto de 204 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida contiene una secuencia de señal putativa de 17 residuos de aminoácidos seguida por un polipéptido de 187 aminoácidos. La región amino-terminal de 43 aminoácidos es idéntica a la de heveina y muestra homología con varias proteínas que se unen a quitina y a los extremos amino-terminales de genes inducidos por lesión en papa y en álamo. Los análisis Northern blots, utilizando ADNc de HEV1 como una sonda, mostraron que el gen es inducido por lesión y por las hormonas vegetales ácido abscísico y etileno. La acumulación de estos transcritos se observó en hojas, tallos y látex, pero no en las raíces. No se reportaron construcciones de gen quimérico que se fusionen a la región de codificación de heveina con promotores heterólogos. Sin embargo las pruebas con proteína heveina demostraron actividad antifúngica contra Trichoderma, Phycomyces, Botrytis, Septoria, Pyricularia, y Fusarium. Las actividades observadas difieren de aquellas de la aglutinina de germen de trigo (otra lectina). Además, la actividad antifúngica de heveina se encontró como estable incluso después de calentar a 90°C, una condición bajo la cual ciertas actividades de quitinasa se destruyen por completo. Se ha clonado un ADNc de longitud completa que codifica para la lectina de ortiga aglutinina de Urtica dioica), se le determinó la secuencia y se caracterizó (Lerner y Raikhel, 1992). La proteína está constituida por 374 aminoácidos. 21 son una secuencia de señal putativa y 86 aminoácidos codifican para los dos dominios de unión a quitina de la lectina de ortiga. Estos están fusionados a un dominio "separador" de 19 aminoácidos y a una extensión de carboxilo de 244 aminoácidos con identidad parcial a un dominio catalítico de quitinasa. Este gen representa otra lectina hasta hoy día no disponible como una fuente para resistencia hacia insectos y patógenos fúngicos importantes del algodón. Los estudios indicados anteriormente subestimaron la complejidad de la bioquímica de las lectinas vegetales. Estas son proteínas que deben ser procesadas adecuadamente y transportadas hacia el compartimento subcelular apropiado, normalmente una vacoula, en donde éstas se almacenan. Con el fin de hacer uso de estas proteínas para combatir las plagas de algodón, un método viable es generar construcciones de gen quimérico utilizando diversos genes de lectina y después transfiriendo éstas hacia el algodón utilizando sistemas de transformación disponibles (véase por ejemplo, Rangan et al., patente de E.U.A. No. 5,244,802). El lograr un nivel efectivo de expresión no es algo que se dé por hecho en sistemas heterólogos. No se puede garantizar que las proteínas no presenten algunos efectos tóxicos inesperados sobre la planta de algodón misma, o que las proteínas pudieran presentar el patrón de actividad predicho. Además, como se indicó anteriormente, algunas plagas objetivo atacan tejidos vegetales (por ejemplo, raíces) en los cuales algunas de estas lectinas normalmente no se expresan en las plantas de las cuales provienen. Por lo tanto, una lectina que tenga actividad contra una plaga determinada en un ensayo de alimentación seguido de la aplicación tópica al tejido vegetal (véase, por ejemplo Cavalieri et. al., patente de E.U.A. No. 5,407,454), podría no presentar la misma actividad cuando se expresa in vivo. Cavalieri et al. proveen evidencias que de alguna forma sugieren que un amplio intervalo de lectinas vegetales podría proveer un nivel de control contra ciertas plagas de maíz. Desafortunadamente, esos estudios se realizaron utilizando preparaciones aisladas de lectina para las cuales no se provee esencialmente una caracterización bioquímica. Algunas podrían incluso haber provenido de proveedores comerciales, en los cuales la composición puede variar de preparación a preparación. Por lo tanto, los proveedores comerciales incluyen números de lotes con sus productos de modo que los problemas puedan ser rastreados hasta una base lote por lote. Cavalieri no analizó la pureza de las preparaciones, ni tampoco provee información sobre cómo ellos obtuvieron sus lectinas ni analiza el número real de lectinas diferentes que podrían haber estado presentes en una preparación determinada. Cualquier especie vegetal puede producir varias lectinas diferentes, y las preparaciones de proteína se contaminan fácilmente con especies de proteínas múltiples que pudieran estar presentes en cantidades traza, pero que tienen un efecto significativo, positivo o negativo, sobre la actividad observada. Por lo tanto, las preparaciones probadas podrían en realidad haber sido mezclas de lectinas e incluso otras proteínas obtenidas de las plantas en cuestión. No se suministran datos sobre la fuente de las preparaciones de lectina utilizados, o su pureza, y por lo tanto en cuál de los genes de lectina en una planta determinada se basó la actividad real observada. Tales preparaciones podrían haber tenido actividades insecticidas y fungicidas distintamente diferentes a una lectina provista en forma pura proveniente de la expresión in planta de un gen individual de lectina. La mejor forma de proveer una proteína en forma pura, y por lo tanto de estar seguro de su actividad contra una plaga determinada, es aislar el gen y expresar la proteína en un sistema in vitro. Debido a que los genes para la mayoría de las lectinas citadas en su estudio no han sido clonados hasta esta fecha, la expresión in vitro de lectinas individuales, purificadas para análisis no fue posible al tiempo en el que Cavalieri et al, reportaron sus datos. Tan sugerentes como sus datos, con respecto a ciertas plagas de maíz, Cavalieri et al. no proveen un solo ejemplo de actividad contra una plaga seria de algodón. Por lo tanto, su estudio es sugerente, pero no describe una lectina individual, en forma purificada, que se pudiera utilizar para controlar una plaga significativa del algodón. Por el contrario, las proteínas que no tienen actividad en la prueba de alimentación después de la aplicación tópica a tejidos vegetales, podrían tener actividad cuando se expresan in vivo. Esto podría ser particularmente cierto en algodón, en donde las plantas normalmente expresan un compuesto llamado gosipol que se sabe suprime el apetito de ciertas plagas de insectos. Por lo tanto, podrían existir efectos sinergísticos entre el gosipol y las lectinas en forma tal que se mejore la actividad insecticida de una lectina determinada contra una plaga importante del algodón. En forma alternativa, la expresión de gosipol podría suprimir el apetito lo suficiente como para que el insecto objetivo no llegara a consumir nunca una cantidad potencialmente letal de lectina. Por lo tanto, no se pudo conocer el efecto insecticida o fungicida de un gen de lectina transferido al algodón hasta que tales células, plantas y semillas de algodón fueron creadas. Raikhel (Patente de E.U.A. No. 5,276,269) demostró que se puede transferir un gen quimérico de lectina de cebada bajo control del promotor 35S de CaMV a plantas de tabaco para producir una sola especie de proteína lectina que haya sido transportada apropiadamente con lo cual se crea una planta con nuevas propiedades insecticidas y fungicidas. Con la disponibilidad posterior de los genes de heveina (Raikhel, patente de E.U.A. No. 5,187,262) y de ortiga debido a la clonación (Lerner y Raikhel, 1992), actualmente es posible crear plantas de algodón que expresen en forma altamente purificada cada una de estas lectinas y probar esas células, plantas y semillas respecto a la presencia de nuevas actividades insecticidas y fungicidas.

OBJETIVOS DE LAINVENCION Es un objetivo de la presente invención proveer células, plantas y semillas de algodón que expresen genes quiméricos de lectina de cebada, ortiga y heveina en cantidades y bajo condiciones que sean suficientes para impartir sustancialmente las propiedades pesticidas tales como propiedades insecticidas y fungicidas de las lectinas de cebada, ortiga y heveina a dichas células, plantas y semillas de algodón. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer un método para aniquilar plagas de insectos y patógenos alimentándolos con células, plantas y semillas de algodón que contienen genes quiméricos que expresan cantidades pesticidas (por ejemplo, insecticidas y fungicidas) de una toxina que tiene sustancialmente las toxicidades hacia insecto y las toxicidades hacia hongos de las lectinas de cebada, ortiga y heveina.

Es un objetivo adicional de la presente invención proveer los genes y otros segmentos de ADN dentro de las células, plantas y semillas de algodón asociados con los métodos anteriores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Estos y otros objetivos de la presente invención han sido logrados proveyendo genes quiméricos que pueden expresar en células, plantas y semillas de algodón un polipéptido que tiene sustancialmente la toxicidad pesticida (por ejemplo la toxicidad hacia insectos) y toxicidad fúngica de las lectinas de cebada, ortiga y heveina, en células vegetales en cultivo y en células vegetales en plantas vivas y semillas; así como métodos para producir una toxina que tenga sustancialmente las propiedades pesticidas (por ejemplo, la toxicidad hacia insectos y la toxicidad fungicida) de las lectinas de cebada, heveina y ortiga en células, plantas y semillas de algodón; y métodos para aniquilar plagas de algodón, tales como insectos, alimentándolos con células, plantas y semillas de algodón que contienen los genes que expresan esas toxinas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ¡lustra el mapa génico y la región de promotor 35S de el vector de expresión vegetal binario pGA643 (descritos en An eí al., 1988), el cual es útil para expresar en plantas los genes de lectina (Wilkins, et al., 1990; Raikhel patente de E.U.A. No. 5,276,269, incorporados en la presente invención para referencia). La figura 2 muestra la secuencia de nucleótido del clon BLc3 de ADNc de lectina de cebada (Lerner y Raikhel, 1989; Raikhel patente de E.U.A. No. 5,276,269). La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos del clon "HEV1" de ADNc de heveina (Broekaert et al., 1990: Raikhel patente de E.U.A. No. 5,187,262, incorporados en la presente invención para referencia). La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos del clon MJK209 de ADNc de lectina de ortiga (aglutinina de Urtica dioica; Lerner, D. R. y Raikhel, N.V., 1992, incorporados en la presente invención para referencia).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a un gen quimérico que se expresa en células, plantas y semillas de algodón, y que codifica para pesticidas tales como insecticidas y fungicidas que tienen sustancialmente la toxicidad hacia insecto y la toxicidad hacia hongos de las lectinas de cebada, ortiga y heveina. Las células de planta de algodón contempladas incluyen células provenientes de cualquiera y de todas las plantas de algodón en las cuales se pueda introducir, replicar y expresar ADN extraño. Algunos ejemplos apropiados de especies de plantas de algodón incluyen Gossypium hirsutum Gossypium arboreumx y Gossypium barbadense. El término "célula vegetal" abarca a cualquier célula obtenida a partir de una planta de algodón. Algunos ejemplos de células abarcadas por la presente invención incluyen las células diferenciadas que son parte de una planta viva; las células no diferenciadas en cultivo; las células de tejido no diferenciado tal como callo o tumores; semillas, embriones; propágulos; y polen. El gen quimérico de esta invención contiene una región promotora que funciona en forma eficiente en plantas de algodón y una región de codificación que codifica para la lectina de cebada codificada en pBLc3, para la lectina de heveina codificada en el ADNc del clon HEV1 , y/o la lectina de ortiga codificada en el ADNc del clon MK209. Se desconoce si la secuencia de codificación del gen quimérico está asociada con el promotor en los genes naturales. Las regiones 5' y/o 3' no traducidas pueden, en forma independiente, estar asociadas en la naturaleza ya sea con el promotor o con la región de codificación, o con ninguno de ambos. De preferencia, cualquiera de las regiones 5' o 3' no traducidas está asociada con el promotor en los genes naturales, y más preferido, ambas regiones 5' y 3' están asociadas con el promotor en los genes naturales. No se puede predecir, tomando como base la técnica más avanzada al momento en que se hizo esta invención, que un gen quimérico de lectina de cebada, heveina o lectina pueda ser introducido funcionalmente en células de algodón. Es incluso menos predecible que tales células puedan expresar tales lectinas a niveles suficientes para impartir propiedades pest?cidas (por ejemplo, insecticidas o fungicidas) a las células Con el fin de que sean consideradas como pesticidas (por ejemplo, insecticida o fungicida), las células vegetales deben contener una cantidad insecticida o fungicida de lectina que tenga sustancialmente la actividad insecticida y fungicida de la lectina purificada proveniente de cebada, hule o de ortiga. Tener "sustancialmente la actividad insecticida y fungicida de lectína purificada" significa presentar actividad contra sustancialmente la misma gama de insectos u hongos que la actividad de lectina correspondiente purificada a partir de su hospedero original. Una cantidad insecticida o fungicida es una cantidad que cuando está presente en las células vegetales, aniquila insectos u hongos o por lo menos inhibe en forma significativa una función necesaria para el crecimiento, tal como la alimentación. Tal inhibición es aquella que puede ser medida como estadísticamente significativa cuando se compara con un control. Por consiguiente, las células vegetales plantas o semillas de la presente invención pueden soportar los ataques de plagas de algodón tales como insectos, nemátodos o de hongos sin la aplicación, o con una aplicación menor, de lectina purificada de cebada, de heveina y de ortiga o de otros insecticidas o fungicidas cuando se compara con células vegetales, plantas o semillas que no contienen un gen que produzca la lectina de cebada, de heveina o de ortiga.

Los siguientes ejemplos muestran ciertas modalidades de la presente invención. Estos ejemplos son ilustrativos y no deben ser considerados como limitaciones de la presente invención en ninguna forma.

EJEMPLO 1 Los genes En este estudio se evaluaron tres diferentes genes de lectina vegetal quiméricos (cebada, heveina y ortiga). Cada uno comprendía ADNc para una lectina especifica determinada, controlada por un promotor activo en algodón. Por conveniencia, se utilizo el promotor 35S CaMV, pero podría utilizarse cualquier promotor que haya probado ser activo en algodón tal como los promotores de ADN-T de A. tumefaciens, los promotores de ADN-T de A. rhizogenes o el promotor de gen de proteína de unión A/B de clorofila de algodón (Anderson, et al., 1993). Esta lista es a manera de ejemplo y no se pretende que sea inclusiva. Un experto en la técnica reconocerá otros promotores útiles que podrían ser utilizados para expresar las lectinas de cebada, heveina y ortiga en células, plantas y semillas de algodón apropiadas para controlar las plagas problemáticas de algodón tales como los insectos y los hongos. Se creó un cassette de expresión que comprende la región de codificación para la lectina de cebada enlazada en forma operable al promotor 35S de CaMV ligando la secuencia ADNc de pBLc3 (figura 2) en el vector de clonación vegetal pGA643 (figura 1 ; An ef al., 1988) tal como se describe en Raikhel, E.U.A. Patent No. 5,276,269 e incorporada en la presente para referencia, tomando ventaja de los sitios de endonucleasa de restricción de Xbal en pBLc3 y pGA643. La transformación se llevó a cabo en la cepa DH5a de E. coli. La orientación apropiada de la región de codificación del inserto con relación a la región de promotor se confirmó mediante mapeo con endonucleasa de restricción y análisis de secuencia de ADN. El clon que comprende la región de codificación para pBLc3 de ADNc de lectina de cebada en pGA643 se puede obtener del Dr. N. Raikhel, MSU DOE Plant Research Laboratory, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, 48824. Se creó un cassette de expresión que comprende la región de codificación para heveina (aglutinina de Hevea brasiliensis) enlazado en forma operable al promotor 35S de CaMV ligando HEV1 de la secuencia de ADNc de heveina (figura 3); Brockaert et al., 1990; Raikhel, E.U.A. Patent No. 5,187,262) en el vector de clonación vegetal pGA643 (figura 1 ; An et al., 1988) tomando ventaja de las endonucleasas de restricción para Xbal y Bglll, las cuales liberan el inserto de HEV1 y cortan dentro de la región de polienlazador de pGA643. La transformación se hizo en la cepa DH5a de E. coli. La orientación apropiada de la región de codificación del inserto con relación a la región de promotor se confirmó mediante mapeo con endonucleasa de restricción y análisis de secuencia de ADNc. El clon que comprende el ADNc de HEV1 insertado en pGA643 puede ser obtenido del Dr. N. Raikhel, MSU DOE Plant Research Laboratory, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, Ml, 48824. Se creó un cassette de expresión que comprende la región de codificación para la lectina de ortiga enlazada operablemente al promotor 35S de CaMV ligando la secuencia de ADNc de ortiga (figura 4) en el vector de clonación vegetal pGA643 (figura 1; An et al., 1988). Esto se logro liberando el inserto proveniente del clon MK209 de ADNc de ortiga con Xbal y ligando este fragmento en el sito de endonucleasa de restricción Xbal dentro de la región polienlazadora de pGA643. La transformación se hizo en la cepa DH5a de E. coli. La orientación adecuada de la región de codificación del inserto con relación a la región promotora se confirmó mediante mapeo con endonucleasa de restricción y análisis de secuencia de ADN. El clon MK209 del ADNc de ortiga y el clon que comprende la región de codificación de ortiga insertado en pGA643 se pueden obtener del Dr. N. Raikhel, MSU DOE Plant Research Laboratory, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, 48824. Las tres construcciones de vector binarios se movilizaron desde la cepa DH5 de E. coli hacia A. tumefaciens LBA4404 mediante apareamiento triparental (Hooykaas, P.J.J., 1988) utilizando la cepa HB101 de E. coli. que contiene al plásmido pRK2013 de movilización de intervalo amplio de hospedero (Clonetech, Palo Alto, California). Los transconjugados se seleccionaron en placas con nutrientes mínimos (An et al., 1988) que contienen kanamicina (5 µg/ml) y tetraciclina (12.5 µg/ml).

TRANSFORMACIÓN DE ALGODÓN CON GENES DE LECTINA QUIMÉRICOS EJEMPLO 2 Regeneración de algodón El establecimiento y mantenimiento de cultivos embriogénicos de algodón en suspensión se hizo como se describe en Rangan eí al., (E.U.A. Patent No. 5,244,802, como fue modificado posteriormente en Rajasekaran eí al., 1996 (incorporado en la presente para referencia). Por conveniencia, se utilizo la línea B1654 de algodón. Muchas otras variedades de algodón alto o Pima trabajaran igualmente bien y los expertos en la técnica podrán hacer su selección de variedad tomando como base las necesidades de su programa. Se esterilizó la superficie de las semillas tratándolas primero con etanol al 70% durante tres minutos, seguido por un tratamiento de 20 minutos con una solución de CLOROX al 20% (1 % de cloro disponible) que contiene 0.01% del agente tensioactivo TWEEN 20. Los brotes se hicieron crecer bajo un régimen de 16 horas luz (40-60 µE m"2s"1) y 8 horas de oscuridad a 26 ±2°C sobre medio de White solidificado con agar (agar TC, Hazleton Biologies, Lenexa, KS) (Singh y Krikorian, 1981) que contiene 1 mg/l de cinetina. Primero se establecieron cultivos de callo embriogénicos provenientes de explantes de los brotes de conformidad con los procedimientos de Rangan (Patente E.U.A. No. 5,244,802). En breve, se colocaron explantes de cotiledón e hipocotiledón provenientes de brotes de 7 a 10 días de edad en un medio de inducción de callo (MS, Murashige y Skoog, 1962) complementado con 0.4 mg/l de clorhidrato de tiamina, 30 g/l de glucosa, 2.0 mg /I de ácido a-naftalenacético (NAA), 1.0 mg/l de cinetina, 100 mg/l de mio-inositol y 0.8% (p/v) de agar. Los cultivos se incubaron a 27±2°C bajo condiciones de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad, con intensidad luminosa a 60 µE m'2s"1, en una incubadora controlada ambientalmente (Percival, Boone, 1A). Los callos se formaron a partir de estos explantes dentro de 3 a 4 semanas. Se subcultivaron selectivamente piezas de callo para obtener callos de color amarillento-verde desmenuzables, cada 3 o 4 semanas en el mismo medio, excepto que la fuente de carbón no fue sacarosa (20 g/l) sino glucosa. Dependiendo de la variedad, aparecieron 1 a 4 subcultivos de callos embriogénicos capaces de formar embriones somáticos, globulares, pequeños, después de la iniciación. Los callos embriogénicos se mantuvieron y multiplicaron mediante subcultivo rutinario cada 3 a 4 semanas en medio MS que contiene 100 mg/l de mio-inositol, 20 g/l de sacarosa, 2.0 mg/I de NAA y 0.8% (p/v) de agar (medio de mantenimiento). Los cultivos de suspensión celular se iniciaron a partir de cultivos de callo embriogénico finamente dispersos en medio de mantenimiento líquido agitado (120 rpm, 27 ± 2°C) en una agitador giratorio (New Brunswick G-10, Edison, NJ). Los cultivos en suspensión fueron enriquecidos respecto a células pequeñas, isodia métricas, densamente citoplásmicas y altamente embriogénicas, mediante eliminación periódica de las células sueltas flotantes y agregados grandes (> 840 µm) cada semana. Dos días antes de utilizarlos, estos cultivos se subcultivaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contienen 40 ml de medio de mantenimiento. Los cultivos en suspensión celular utilizados en los experimentos fueron células embriogénicas de rápido crecimiento que presentaron un doblamiento de peso fresco en cuatro a seis días (la fase logarítmica de crecimiento empieza dos días después del subcultivo). Todos los cultivos de suspensión celular utilizados para los experimentos de transformación biolística tienen una edad acumulativa de tres a cuatro meses.

EJEMPLO 3 Transformación biolística de cultivos de algodón embriogénicos Se utilizaron los tres plásmidos (región de codificación de lectina de cebada en pGA643; región de codificación de lectina en pGA643; y región de codificación de lectina de ortiga en pGA643) para revestir 1.0 uM de partículas de oro, y después se proyectaron en los cultivos de células embriogénicas de algodón en suspensión utilizando un dispositivo biolístico activado por helio (PDS 1000/He; BioRad). En breve, se utilizaron 50 µl de una suspensión micro-portadora de oro (1 µ de partículas de oro) en agua. En un tubo de micro-centrífuga de 1.5 mi, bajo acción de remolino continuo, se agregó lo siguiente en el orden indicado: 5 µl DNA (1 µg/µl), 50 µl de 2.5M CaCI y 20 µl de 0.1 M espermidina (base libre, grado cultivo de tejido). La acción de remolino se continuó durante 3 minutos, los microportadores se centrifugaron a 10,000 rpm durante 10 segundos y se retiró tanto como fue posible, el sobrenadante. Los microportadores se lavaron con 250 µl de etanol al 100% (grado HPLC o espectrofotométrico) sometiéndolos brevemente a acción de remolino, seguido por centrifugación y remoción del sobrenadante. Los microportadores se volvieron a suspender en 60 µl de etanol al 100%. Se utilizaron 7.5 µl de esta mezcla de microportador revestido con ADN por cada disco de macroportador. Los bombardeos se realizaron utilizando una presión de ruptura de membrana de 109.0 kg/cm2 y otros parámetros del dispositivo como se describe por Hamilton et al (8). Las suspensiones celulares establecidas como se indicó anteriormente, (fracción de <840 µm ), subcultivadas dos días antes, se depositaron al vacío como una capa delgada sobre papel filtro húmedo (Whatman No. 1; 3.5 cm de diámetro) en cajas Petri estériles (5.5 cm de diámetro). Se transfirió un mililitro de células en suspensión (1 X 106 células) a cada caja. Se colocó sobre la superficie de la suspensión una pantalla de nylon de malla 400 para que sirva como un deflector. Las condiciones de bombardeo óptimas incluyen la utilización de discos de ruptura de 10 MPa, una distancia entre la pantalla de detención y la suspensión celular de 7.5 cm y una distancia de trayectoria del macroportador de 10 mm. Durante el bombardeo, el vacío en la cámara de la muestra fue de 95 kPa. El bombardeo de las células se repitió de tres veces a cinco veces a intervalos de dos días para llevar al máximo la frecuencia de transformación. Después del bombardeo de partículas, los cultivos de suspensión celular se cultivaron durante una semana sin ninguna selección en medio de mantenimiento. El vector binario pGA643 porta un gen de neomicina fosfotransferasa II para la selección de células transformadas (figura 1 ). Por consiguiente, las suspensiones se seleccionaron con el antibiótico G418 (10 µg/ml). Se aplicó la selección con el antibiótico G418 incrementando gradualmente la concentración cada semana. La selección con G418 se inició a una concentración de 10 µg/ml y se incrementó con incrementos de 10 µg/ml a intervalos de cinco a siete días para lograr una concentración final de 50 µg/ml después de tres a cuatro semanas.. En forma alternativa, en algunos experimentos, las células se expusieron directamente a un solo nivel elevado de antibiótico (G418 a 50 µg/ml) al inicio del procedimiento de selección. Los eventos de transformación independientes surgen como colonias en desarrollo separadas en presencia del agente selectivo. Cada colonia que surge de esta manera se mantiene por separado y se verifica como un transformante verdadero mediante NPTH ELISA (Firoozabady et al., 1987). Las plantas de algodón se regeneran a partir de cultivos en suspensión embriogénicos como se describe en Rangan et al., patente E.U.A. No. 5,593,036 (incorporada en la presente invención para referencia).

EJEMPLO 4 Transformación de Agrobacteríum con genes de lectina Los tres plásmidos de vector binario (regió de codificación para lectina de cebada en pGA643; región de codificación para heveína en pGA643; y región de codificación para lectina de ortiga en pGA643) se movilizaron en la cepa LBA4404 del hospedero binario A. tumefaciens mediante apareamiento triparental como se describió previamente. La transformación de explantes primarios de algodón se puede lograr mediante un número de métodos (Firoozabady eí al., 1987 Umbreck eí al., Rangan eí al., patente E.U.A. No. 5,244,802). Por conveniencia se describe brevemente el método de Rangan et al., patente E.U.A. No. 5,244,802, tal como fue modificado por Rajasekartan et al., 1996. Los cultivos de Agrobacterium para los experimentos de transformación se iniciaron en 50 ml de medio líquido YEB utilizando reservas de glicerol congelado (500µl) como inoculo. Estos cultivos se desarrollaron durante toda la noche durante aproximadamente 18 horas a 26±2°C en un agitador giratorio. Los valores de densidad óptica (A600) se ajustaron a 0.6-0.8 en medio MS líquido antes de utilizarlos. Se prepararon explantes de cotiledón (1 cm2) para las transformaciones con Agrobacterium provenientes de brotes de 5 a 7 días de edad. Los explantes se tratan con una suspensión de Agrobacterium tal como la que se preparó anteriormente durante 15 a 30 minutos, se secan mediante blotting, y después se siembran sobre papel filtro de 12 cm de diámetro (Whaltman No. 1) colocado en medio de inducción de callo solidificado con agar recién preparado, Rangan eí al., patente E.U.A. No. 5,244,802 en cajas Petri de 15 cm de diámetro que contienen 60 ml de medio. La co-cultivación se realiza durante 48 horas en un incubador Percival mantenido a 26+2°C, 16 horas luz, 60-90 µE m"2s"1. Después del co-cultivo, los explantes se lavan completamente en medio líquido MS que contiene 200 mg/l de cefotaxima (Cal-Biochem) y 200 mg/l de carbenicilina (Sigma), se secan mediante blotting, y se colocan en medio de inducción de callo recién preparado que contiene al antibiótico G418 (10 mg/l; Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) como el agente de selección y las mismas concentraciones de cefotaxima y carbenicilina indicadas anteriormente para controlar el crecimiento de bacterias. Los segmentos de cotiledón se siembran en cantidades de siete por cada caja Petri (9 cm de diámetro) que contienen 25 ml de medio de inducción de callo. Después del primer subcultivo, los explantes se transfieren a medio de inducción para callo recién preparado para fomentar la producción de más callos en presencia de la presión de selección. Los callos transformados (resistentes a antibióticos) se desarrollan 3-8 semanas después de la transformación. Las colonias de callos individuales se subcultivan por separado para mantener la identidad de los eventos de integración separados. Se realizan pruebas NPT II ELISA de conformidad con los procedimientos de Firoozabady et al., 1987 para confirmar que las colonias de callos resistentes a antibióticos estén transformadas. Las colonias transformadas se regeneran en plantas como se describe (Rangan et al., patente E.U.A. No. 5,244,802).

RESULTADOS EJEMPLO 5 Confirmación de la transformación de algodón con genes de lectina Las líneas celulares de algodón (colonias embriogénicas) transformadas con los genes de lectina de cebada, ortiga o heveina en pGA643 se mantuvieron como colonias independientes en cultivo y se confirmó su transformación mediante NPTII ELISA como se describió anteriormente. Para verificar la co-transformación del gen de lectina apropiado junto con el marcador seleccionable en el sistema de transformación utilizado, se evaluaron varias colonias positivas a NPTII ELISA transformadas con BLc3 utilizando ELISA de unión doble en métodos similares en principio a aquellos de Raikhel et al., 1984, pero modificados para que sean más apropiados para las células de algodón transformadas. El anticuerpo de aglutinina de germen de trigo , el cual se puede conseguir comercialmente, tendrá una reacción cruzada con la lectina de cebada (Wilkins et al., 1990) y por lo tanto puede ser utilizado para detectar la expresión de la proteína BLc3 en células de algodón transformadas utilizando WGA ELISA. En los estudios iniciales con células de algodón transformadas se observó que los extractos de algodón dan una lectura de fondo alta cuando se prueba en estos mediante WGA ELISA para transformación. Se desarrolló el siguiente protocolo, el cual supera este problema de fondo y permite la confirmación de co-transferencia de genes de lectina junto con el gen marcador para antibiótico utilizando los métodos de la presente invención. Se adquirieron de E.Y. Laboratories, antiaglutinina de germen de trigo, de conejo, (6 mg/ml) y anti WGA de conejo con biotina (3.5 mg/ml). La solución de anticuerpo primario (1 µg/ml) se preparó diluyendo 1.8µl de solución de reserva de anti-WGA de conejo con 11 ml de solución reguladora de carbonatos para unión (Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g, H2O hasta 1 L, pH 9.6) y se mantuvo sobre hielo. Se aplicaron 100 µl a cada cavidad de una placa de ELISA de 96 cavidades (Corning #25805-96), se selló y se mantuvo a 44°C durante toda la noche. El anticuerpo pre-adsorbido se preparó después como sigue. Se homogenizaron 4 gramos de callo de control (no transformado) en 6 ml de PBS Tween preparado a partir de un concentrado 50X (Agdia, Elckhart, Indiana) que contiene 1 % de PVP 40,000 y se centrifugó a 8,000 rmp durante 10 segundos para convertir en pastilla el desecho celular. Se mezclaron 5.5 ml del sobrenadante con 5.5 ml de PBS TWEEN que contiene 0.5% de BSA y 4% de PEG 8,000. A esto se agregaron 9.4 µl de anti-WGA de conejo con biotina (E.Y. Laboratories, 3.5 mg/ml para una concentración final de anticuerpo de 3 µg/ml. Esto después se incubó sobre hielo durante 3 horas para preadsorber el anticuerpo.

Las placas para ELISA se retiraron de la incubación durante toda la noche y se lavaron completamente (4X) con PBS TWEEN. Se realizó un paso de bloqueo llenando cada cavidad de la placa con 1 % de BSA en PBS sin TWEEN. La PBS sin TWEEN se preparó combinando 5 ml de una solución de reserva al 10% p/v de seroalbúmina de bovino (fracción V, ICN Pharmaceuticals #81-066 en agua) con 5 ml de PBS (NaCI 8.0 g, Na2HPO4.2H2O 1.44 g, KH2PO4 0.2 g, KCl 0.2 g, H2O hasta IL, ajustado a pH 7.4). Las placas se incubaron a temperatura ambiente (22°C durante 1 hora) y después se lavaron 4X con PBS TWEEN. Los extractos de líneas celulares embriogénicas transformadas con BLc3 se prepararon como sigue. Se homogeneizaron aproximadamente 0.5 g de callo en 130 µl Tween que contiene 1% de PVP 40,000 en un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml, se centrifugó a 10,000 rpm para convertir en pastilla el desecho celular y se mantuvo sobre hielo. Se agregaron 100 µl de sobrenadante a cada cavidad de las placas de ELISA después del paso del lavado para bloqueo durante 1 hora como se indicó anteriormente. Las placas se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente y se lavaron 4X con PBS TWEEN. Después de agregaron 100 µl de anticuerpo preadsorbido, biotinilado, a cada cavidad de la placa, las placas se incubaron durante toda la noche a 4°C y se lavaron 4X con PBS TWEEN. Se prepararon 11 ml de una dilución de 1 :3,000 de estreptavidina/conjugado de fosfatasa alcalina (desde 5' hasta 3') en PBS (sin TWEEN) que contiene 1% de BSA. Se aplicaron 100 µl a cada cavidad de las placas de ELISA y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4X con PBS TWEEN. Se agregaron 200 µl de PNP (fosfato de paranitrofenilo, substrato de fosfato 104 de Sigma #104-0) en 10% de dietanolamina + 0.5 mM de MgCI2, pH 9.8 (preparado inmediatamente antes de utilizarlo) por cavidad y se permitió que el color de la reacción se desarrollara durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo agregando 50 µl de NaOH 3N y las placas se leyeron en un lector para microplacas a una longitud de onda de 41 O?. Los resultados de las pruebas con varias líneas embriogénicas transformadas se presentan en el siguiente cuadro.

CUADRO 1 Resultados de las pruebas inmunológicas en WGA ELISA con células de algodón transformadas con Blc3 en pGA643 Muestra # Colonia # ADN de lectina Resultado de ELISA 1 control ninguno 2 control ninguno - 3 control ninguno 4 control ninguno 5 control ninguno 6 75 BLC 7 95 BLC - 8 105 BLC - 9 138 BLC - 10 158 BLC - 11 171 BLC - 12 173 BLC - 13 175 BLC - 14 176 BLC ++ 15 177 BLC + 16 178 BLC +++ 17 180 BLC - 18 181 BLC - 19 183 BLC - 20 184 BLC + 21 185 BLC - 22 186 BLC + 23 187 BLC - 24 188 BLC +++ 25 189 BLC - 26 190 BLC ++ 27 191 BLC - 28 192 BLC - 29 194 BLC + 30 195 BLC +++ 31 197 BLC +++ 32 198 BLC + 33 200 BLC +++ 35 203 BLC - 36 205 BLC +++ 37 207 BLC - 38 209 BLC - 39 211 BLC +++ 40 216 BLC + 41 25 g/ml WGA +++ - = no se aeiecto sepai. +, ++, +++ indica una señal detectada y da la intensidad relativa, siendo la más intensa la marcada con +++. Los datos en el cuadro 1 confirman la co-transferencia del gen de lectina junto con el marcador seleccionable NPTII. Casi el 50% de las líneas celulares embriogénicas transformadas expresaron proteína lectina suficiente para ser detectable en esta prueba. Sin embargo, también es evidente que existe variabilidad en el grado de la capacidad de detección de la proteína BLc3 en estas pruebas. Esto puede deberse a diferencias en el nivel de expresión de proteína lectina en los eventos de transformación separados representados por las diferentes líneas evaluadas.

EJEMPLO 6 Las células de algodón transformadas con BLc3 son insecticidas Con el fin de confirmar la naturaleza insecticida de las células de algodón transformadas con BLc3, se realizaron ensayos de alimentación con larvas del genero Heliothis¿ Las especies de Heliothis son plagas de algodón económicamente importantes. Para la prueba se seleccionaron los cultivos de callo embriogénico transformados que marcaron positivo tanto con NPTII ELISA como con WGA ELISA. Las colonias se dividieron en dos, con una mitad mantenida en cultivo para regenerar plantas y la otra mitad utilizada para la prueba de alimentación. Para la prueba, se congeló >1 g de tejido en nitrógeno liquido, se liofilizó, y se almacenó a -75°C hasta que se utilizaron en la prueba de alimentación. Debido a que el gusano de la mazorca de maíz es una plaga significativa del algodón, se utilizó para este ejemplo la dieta del gusano de mazorca de maíz. Un experto en la técnica puede saber como utilizar una dieta apropiada para el insecto en caso de que se deseen probar tejidos transformados en cuanto la actividad insecticida contra otros insectos. La dieta para insectos se preparó como sigue: se disolvieron 2.6 g de agar en 157 ml de H2O, se hirvió durante un minuto, y se agregaron 40.6 g de dieta de gusano de mazorca de maíz (Bioserv Product #9394) y la mezcla se agitó bien. Se agregaron 1.5 ml de esta mezcla a cada cavidad de una charola para alimentación de insectos de 16 cavidades. Se agregó después a cada cavidad 25 mg de muestra de callo liofilizado o muestra de control (no transformado) según sea apropiado. Como control positivo se utilizó callo transformado con un gen de endotoxina truncado de Bacillus thuringiensis (B.t.) cristalino (Cry 1 Ab) ("pPHY3"). El callo transformado con un gen NPTII ("pUC/NEO"), pero sin un gen de lectina, sirvió como el control negativo. En este ejemplo se utilizaron larvas de Heliothis virescens, una plaga seria para el algodón. Se permitió que los huevos eclosionaran y las larvas recién nacidas se aplicaron, una por cavidad de la charola de alimentación para insectos. Después de 6 días, las larvas se pesaron con el fin de determinar el grado de crecimiento. Los datos se muestran en el cuadro 2, como sigue.

CUADRO 2 Resultados del crecimiento de larvas de Heliothis en la dieta complementada con tejido de algodón transformado con BLc3 Callo #. Resultado de Incremento promedio Comentario WGA-ELISA en el peso de las larvas (% del control) pUC/NEO 100% Transformado solo con el gen NPTII BLC 194 97% 11 % de la supresión lograda con pPHY3 BLC 178 +++ 90% 37% de la supresión lograda con pPHY3 BLC 195 +++ 89% 40% de la supresión lograda con pPHY3 pPHY3 73% 27% de la supresión de crecimiento del control negativo Los números de BLC corresponden a los números de muestra en el cuadro I. Se evaluaron ocho larvas de Heliothis por cada muestra de prueba de callo preparada como se describe en el texto. Los incrementos en peso en por ciento de crecimiento mostrado, son el promedio para las ocho larvas después de 6 días de alimentarlas con la mezcla de prueba indicada. La muestra de control negativo se preparó utilizando callos transformados con el marcador NPTII sólo (sin gen de lectina). El control positivo provino de tejido transformado con pPHY3.

Los datos en el cuadro 2 muestran que los callos embriogénicos de algodón transformados con BLc3 suprimen el crecimiento de las larvas de Heliothis, y en efecto aniquilaron algunas larvas, incluso con las cantidades relativamente pequeñas (25 mg) de callo transformado liofilizado mezclado en la dieta artificial en estos estudios.

EJEMPLO 7 Las células de algodón transformadas con HEV1 (heveina) y MK209 (lectina de ortiga) son insecticidas Se preparó la dieta para gusano de mazorca de maíz con callo liofilizado como se describe en el ejemplo 6, excepto que las muestras de callo se obtuvieron de las transformaciones realizadas con HEV1 y con MK209. Las larvas recién eclosionadas (1 por cada cavidad de la placa de prueba de alimentación) se colocaron en el medio de prueba, se incubaron a temperatura ambiente y después de 7 días se les dio una puntuación. Los datos se resumen en el siguiente cuadro 3.

CUADRO 3 Resultados del crecimiento de larvas de Heliothis con dieta complementada con tejido de algodón transformado con cualguiera de HEV1 (heveína) o MK209 (lectina de ortiga) Callo #. Incremento promedio Comentario del peso de las larvas (% del control) pUC/NEO 100% Transformado el gen NPTII sólo HEV30 95% 35% de la supresión obtenida con Bt.

MK209 34 86% 108% de la supresión obtenida con Bt.

BLC195 87% 13% de la supresión de crecimiento contra el control negativo.

Las formulaciones de dieta para insectos utilizadas en el presente estudio incluyeron un porcentaje muy pequeño en peso del callo de prueba. Por consiguiente, el grado de actividad insecticida observado se considera significativo cuando se considera la actividad relativa contra el control positivo. Aunque todos los genes de lectina probados mostraron actividad significativa contra Heliothis, la lectina de ortiga MK209 demostró el nivel más elevado de actividad con relación a la endotoxina de ß.í. en este estudio.

Un experto en la técnica sabrá como utilizar estos métodos para probar tejidos de algodón transformados con los genes de lectina ejemplificados o con otros genes de lectina respecto a la actividad insecticida contra otros insectos y plagas de importancia económica en la producción de algodón. Ejemplos de tales insectos y plagas incluyen oruga nocturna (Agrotis spp., Paridroma spp., Euxoa spp., Feltia spp.), trips (Franklinialla spp.), áfidos (Aphis gossypii), gusanos del maíz y el algodón (Heliothis spp., Pectinophora spp., Helicoverpa spp.), gusanos de las yemas (Heliothis spp.), chinches de las plantas (Lygus spp., Euschlstus spp.), gorgojo de la cápsula del algodón (Antonomus gradis), gusanos soldado (Spodoptera spp.), oruga medidora (Alabama spp.), orugas (Estigmene spp.), perforador de la hoja de algodón (ßacculatrix spp.), acaras (Tetranychus spp.), mosca blanca (Bemisia spp., Trialeurodes spp.), nemátodos (Meloidogyne spp., Rotylenchulus spp. Hoploaimus spp.), y hongos patógenos (Verticillium spp., Fusarium spp., Pythium spp., Rhizoctonia spp., Thielaviopsis spp. Phytophthora spp.). En vista de los ejemplos anteriores, el experto en la técnica esperará que tales pruebas con otras lectinas sean exitosas. Por consiguiente, es claro que la invención es una que abarca modalidades diferentes de aquellas presentadas en los ejemplos ilustrativos, y debe ser considerada para referencia a las reivindicaciones anexas.

REFERENCIAS An G., Ebert, P.R.; Mitra, A., y Ha, S.B (1988) Binary vectors, Plant Mol. Biol. Manual A3: 1 -19. Anderson, D.M., Hudspeth, R.L., Hobbs, S.L., y Gruía, J.W. (1993) Plant Physiol. 102: 1047-1048. Blake, M.S., Johnston, K.H., Russel-Jones, G.J., y Gotschlich, E.C. (1984) Anal. Biochem. 136:175-179. Broekaert, W., Lee, H.-i., Kush, A., Chua, N.-H, y Raikhel, N. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87:7633-7637. Firoozabady, E., DeBoer, D., Merlo, D., Halk, E. Amerson, L., Rashka, K., y E. Murray (1987) Plant Mol. Biol. 10:105-116. Hooykaas, P.J.J. (1988) Plant Molec. Biol. ?fam/a/A4:1-13. Lee, Hyung-il, Broekaert, W F., y Raikhel, N.V. (1991) J. Biol. Chem. 266:15944-15948. Lerner, D.R., y Raikhel, N.V. (1989) Plant Physiol. 91 :124-129. Lerner, D.R., y Raikhel, N.V. (1992) J. Biol. Chem. 267:22694. Murashige, T. y Skoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15:4730497. Murdock et. al. (1990) Phytochemistry 29:85-89. Raikhel, N.V., Mishkind, M.L., y Palevitz, B.A. (1984) Planta 162:55-61. Rajasekaran, K. Gruía, J.W., Hudspeth, R.L., Pofelis, S., y Anderson, D.M. (1996) Malecular Breeding 2:307-319.

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Claims (49)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una pluralidad de células de algodón que comprenden una secuencia de codificación heteróloga que codifica para una lectina, siendo expresada dicha secuencia de codificación en dicha células, con lo cual dichas células se vuelven pesticidas.

2.- Las células de algodón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas además porque dichas células son insecticidas.

3.- Las células de algodón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas además porque dichas células son fungicidas.

4.- Las células de algodón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque dichas células son nematocidas.

5.- Las células de algodón de conformidad con la reivindicación

1 , caracterizadas además porque dicha secuencia que codifica para lectina se obtiene de cebada.

6.- Las células de algodón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque dicha secuencia que codifica para lectina se obtiene de ortiga.

7.- Las células de algodón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque dicha secuencia que codifica para lectina se obtiene de heveina.

8.- Una planta de algodón, que comprende células de algodón de conformidad con la reivindicación 1.

9.- La planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dichas células son insecticidas.

10.- La planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dichas células son fungicidas.

11.- La planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dichas células son nematocidas.

12.- La planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dichas células comprenden una secuencia que codifica para lectina obtenida de cebada.

13.- La planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dichas células comprenden una secuencia que codifica para lectina obtenida de ortiga.

14.- La planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dichas células comprenden una secuencia que codifica para lectina obtenida de heveína.

15.- Una semilla de la planta de algodón de conformidad con la reivindicación 8, comprendiendo dicha semilla células que comprenden una secuencia heteróloga que codifica para lectina.

16.- Una semilla de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia que codifica para lectina codifica para una lectina insecticida.

17.- Una semilla de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia que codifica para lectina codifica para una lectina fungicida.

18.- Una semilla de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia que codifica para lectina codifica para una lectina nematocida.

19.- Una semilla de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia que codifica para lectina se obtiene de cebada.

20.- Una semilla de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia que codifica para lectina se obtiene de ortiga.

21.- Una semilla de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia que codifica para lectina se obtiene de heveína.

22.- Un método para producir una lectina pesticida que comprende los pasos de: obtener un polinucleótido que codifica para una lectina pesticida; transformar una célula de algodón con dicho polinucleótido; cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales se produzcan células de algodón descendientes que comprenden a dicho polinucleótido o una planta que comprenda dichas células descendientes; y verificar que dicho polinucleótido se expresa en dicha célula descendientes, con lo cual se produce una lectina pesticida.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha lectina es insecticida.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha lectina es fungicida.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha lectina es nematocida.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de cebada.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de ortiga.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de heveína.

29.- Un método para producir una planta de algodón resistente a plagas que comprende los pasos de: obtener un polinucleótido que codifica para una lectina pesticida; transformar una célula de algodón con dicho polinucleótido; cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales se produzca una planta de algodón que comprenda a la célula descendiente de dicha célula, cuyas células descendientes comprenden a dicho polinucleótido que codifica para lectina; y verificar que dicho polinucleótido se exprese en dichas células descendientes, con lo cual se produce una lectina pesticida.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende los pasos de cultivar dicha planta bajo condiciones en las cuales se produzcan semillas de algodón; cosechar por lo menos una semilla de algodón a partir de dicha planta; y producir generaciones descendientes de plantas de algodón resistentes a las plagas a partir de dicha planta.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha lectina es insecticida.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha lectina es fungicida.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha lectina es nematocida.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de cebada.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de ortiga.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de heveína.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha lectina es insecticida.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha lectina es fungicida.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha lectina es nematocida.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de cebada.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de ortiga.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de heveína.

43.- Un método para aniquilar una plaga de algodón que comprende los pasos de: obtener un polinucleótido que codifique para lectina pesticida; transformar una célula de algodón con dicho polinucleótido; cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales se produzcan células de algodón descendientes que comprendan a dicho polinucleótido o una planta que comprenda a dichas células descendientes; verificar que dicho polinucleótido se exprese en dichas células descendientes, con lo cual se produce una lectina pesticida; y permitir que dichas células descendientes entren en contacto con una plaga de algodón.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha lectina es insecticida.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha lectina es fungicida.

46- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha lectina es nematocida.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de cebada.

48.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de ortiga.

49.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicho polinucleótido se obtiene de heveína.