MXPA00005746A - Metodo genetico - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método para incrementar el rendimiento de las plantas, también se describen los constructos de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican para las proteínas implicadas en el transporte, metabolismo y la absorción de la sucrosa, enlazados operablemente a las regiones promotoras controlables y a las plantas transformadas con dichos constructoso construcciones. Más particularmente, se describe un método para la producción controlada de dichas proteínas que da como resultado una alteración en las características del crecimiento, tiempo de floración y rendimiento de las plantas.

Description

" MÉTODO GENÉTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para incrementar el rendimiento de las plantas, a constructos de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican las proteínas implicadas en el transporte, metabolismo y la absorción de la sucrosa enlazada opera lemente para regiones promotoras controlables y a plantas transformadas con dichos constructss. Más particularmente la presente invención se refiere a la producción controlada de dichas proteínas que dan como' resultado una alteración en las características del crecimiento, tiempo de floración y rendimiento de la planta.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fotosíntesis es la principal fuente de energia utilizada para soportar los procesos biológicos en las plantas superiores. Las células que generan la fotosíntesis sirven REF.: 121013 como fuentes importantes de compuestos f o t oas imi 1 ado s u orgánicos producidos en la planta mediante la fotosíntesis. La mayor parte del carbón orgánico fijado se transloca desde los tejidos f o tos int ét i cos de la fuente hasta los órganos no fo t o s i n t é t i co s que son conocidos como las reservas y esta es el área en la planta en donde los nutrientes translocados se usan o se almacén. El producto principal de la fijación del carbón durante la reacción fotosintética es la sucrosa di s acár ida .

Se ha encontrado ahora que al controlar la expresión de las secuencias de ADN que codifican las proteínas implicadas en el transporte, metabolismo y absorción de la sucrosa utilizando sistemas promotores inducibles, es posible alterar los niveles de sucrosa en la planta de una manera controlada para producir el cambio deseado en la floración y/o peso de la planta y/o altura en la etapa apropiada en el crecimiento de la planta por lo que cualquier efecto nocivo en la planta se puede evitar y se incrementa el rendimiento total de la planta. El uso de regiones promotoras controlables permite la expresión de dichas secuencia de ADN y también que puedan ser reguladas de una manera muy precisa tal como los niveles óptimos de expresión, el tiempo óptimo en el cual la secuencia de ADN se expresa y la localización óptima en la planta también se puede de te rmi nar.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo al primero aspecto de la invención se proporciona un método para incrementar el rendimiento de una planta que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifican para una proteina implicada en la sensibilización, transporte, metabolismo y/o absorción de. la sucrosa enlazada operablemente a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de las secuencias de ADN de la región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el rendimiento de dicha planta transgénica, se ve incrementado .

De acuerdo a una modalidad p r e f e r i da ' de 1 primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para incrementar el rendimiento de una planta para incrementar sel ctivamente la importación del carbono fijado en el tejido de declinación inactivo fotos int ét icamente que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifican para una proteina implicada en la sensi ilización, transporte, metabolismo y/o absorción de la sucrosa opera lemente enlazada a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de las secuencias de ADN de dicha región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el transporte del carbono fijado desde el tejido fuente activo fot os int é t i camen t e hasta el tejido de almacenamiento inactivo fot os int ét i camen t e de dicha planta transgénica se incrementa selectivamente.

Como se usa aqui el término "tejido fuente" se usa para denotar aquellos tejidos activos f o t o s i n t é t i c ame n t e de la planta que son exportadores netos del carbón fijado y el "tejido de almacenamiento" aquellos tejidos inactivos fot os int ét i camen t e de la planta que son importadores netos del carbón fijado.

Es económica y prácticamente deseable ser capaces de controlar tanto la capacidad de la floración y el tiempo de floración de una planta. En algunos casos puede ser deseable sincronizar la floración o para que pueda volverse una floración más temprana. o manipular el comportamiento de la floración para que se ajuste a la restricción impuestas por el crecimi e'n to en áreas geográficas particulares. De manera general un incremento en el número de flores se refleja en un incremento en el rendimiento eventual de la planta debido al incremento en el número de s emi lias.

De manera similar, un incremento en el peso fresco de una planta se mide mediante un incremento en el área de las hojas que resulta en un incremento en el rendimiento debido al incremento en la capacidad f o t o s in t é t i ca de la planta .

El rendimiento depende de al menos dos parámetros: (i) la inducción de la declinación y (ii) el crecimiento de declinación. Entre otros factores, la inducción -de la declinación se puede estimular mediante la reducción del suministro de asimilados. Esto sucede cuando la invertasa, por ejemplo, es inducida en las hojas. El crecimiento de la declinación depende de la cantidad de asimilados localizados en la declinación específica. Esto se pude estimular mediante una expresión especifica de la declinación de la invertasa. Puesto que la actividad de la invertasa tiene un efecto negativo en la síntesis del almidón, el almidón químico de la expresión de la invertasa es claramente ventajosa sobre s u expresión constitutiva.

Un incremento en el suministro de declinación da como resultado tubérculos más grandes cuando se induce la expresión de la invertasa. El fenotipo de floración temprana es, sin embargo, de acuerdo a la explicación que se ha obtenido una merma o déficit transiente del suministro del asimilado.

De acuerdo a un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un método para controlar el comportamie to de floración de una planta que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifica para una proteína implicada en la sensi ilización, transporte, metabolismo y/o absorción de la sucrosa, enlazada operablemente a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de las secuencias de" ADN desde la región promotora controlab'le mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el comportamiento de floración de dicha planta transgénica, se ve alterado.

El método para controlar el comportamiento de floración se puede utilizar para agilizar el ciclo de crecimiento de una planta de tal manera que se produzcan más generaciones .

La región promotora controlable en todos los aspectos y modalidades de la presente invención mencionada -aquí comprende preferibleme te un sistema promotor de conmutación inducible tal como, por ejemplo, el sistema promotor de conmutación del gen alcA/alcR descrito en la Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 93./21334; el promotor GST como se describió en las Solicitudes de Patentes Internacionales publicadas Nos. WO 90/08826 y WO 90/031294; y el sistema de conmutación ecdysone como se describió en la Solicitud de Patente Internacional " publicada No. WO 96/37609 las enseñanzas de la cual se incorporan aquí como referencia. Tales sistemas promotores se refieren aquí como "promotores de conmutación" . Los sistemas promotores de conmutación son particularmente adecuados para usarse en el método de la presente invención puesto que permiten que la expresión de las secuencias de ADN sea conmutadas en partes diferentes de una planta transgénica a tiempos diferentes por medio de la inducción secuencial en donde el inductor químico se puede aplicar al área deseada de la planta en la etapa de crecimiento deseada. Por ejemplo, el químico de conmutación -se puede aplicar como un rocío o vapor a todo o parte de la planta transgénica o tal como una parte de la r ai z .

Los ejemplos adecuados de químicos de conmutación se proporcionan en las referencias indicadas arriba, que describen los sistemas promotores de conmutación y se ilustran en los ejemplos acompañantes. Los químicos de conmutación son químicos aceptables agr i cul t ur alme'n t e , de manera deseable Los sistemas promotores inducibles incluyen preferiblemente uno o dos sistemas componentes. Los sistemas que comprenden más de dos componentes, sin embargo, están también incluidos. El sistema de conmutación puede ser accionado mediante un promotor constitutivo, o, preferiblemente, mediante un promotor especifico de tejido o de órgano, por lo' que el gen objetivo solamente se conmuta en un órgano o tejido objetivo.

El sistema promotor de conmutación alcA/alcR es particularmente preferido para usarse en todos los aspectos de la presente invención mencionada aquí.

El sistema promotor inducible alcA/alcR es un sistema componente de dos partes que implica las secuencias de ADN que codifican al promotor alcA y a la proteína alcR, la expresión de los cuales se coloca bajo el control de los promotores deseados. La proteína alcR activa al promotor alcA en la presencia del -i ductor y cualquier gen colocado bajo el control del promotor alcA por lo tanto será expresado solamente en la presencia del inductor. El promotor que controla la expresión de la proteína reguladora alcR es preferiblemente un promotor selectivo del tejido u órgano, tal como un promotor específico de una hoja o tubérculo, de tal manera que el alcR se produzca y el alcA activado que da como resultado la expresión de la secuencia de ADN que codifica para la proteína de interés solamente en partes seleccionadas de la planta tal como por ejemplo las hojas, los frutos, los granos, el endosperma o las semillas. Cuando el método de la presente invención se utilice para cultivos de cereales, la expresión de alcR es controlada deseablemente mediante un promotor específico de semillas; para usarse en granos la expresión es controlada deseableme te mediante los promotores asociados con los genes implicados en la sintesis del almidón o con las proteínas de almacenamiento de semillas y para utilizarse con los cultivos de forraje la expresión del alcR es controlada deseableme te por los promotores específicos de las hojas. Los ejemplos de los promotores selectivos de tejidos u órganos se conocen bien en la técnica y incluyen por ejemplo los promotores específicos de semillas tales como el promotor Ltp2 (Kalla et al, Plant J 6_(6) 846-60, (1994, los promotores zmGBS, zmZ27, osAGP y osGTl (Russell y Fromm, Transgenic Res 1997, 6_(2) 157-68) , el promotor CMd (Grosset et al, Plant Mol Biol 1997 3_4_(2) 331-338), el promotor de glicinina A2B1 (Itoh et al Mol Gen Genet 1994 243 ( 3 ) 353-357) , el promotor de oleosina de Brassica napus (Keddie et al Plant Molecular Biology 1_9_ 443-453, (1992) ) , el promotor de oleosina MatP6 del algodón (Hughes et al, Plant Physiol (1993) 101 697-698) , el promotor de oleosina de Arabidopsis (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25 193-205 (1994) ) , el promotor de zeina (Ottoboni et al Plant Mol Biol (1992)21, 765-778), y los promotores específicos de las frutas y órganos tales como el promotor de patatina (Rocha-Sosa et al EMBO J 8_ 23-30 1989) , la familia del promotor asociada con los genes de la subunidad pequeña de carboxi lasa / oxi genada de ribulosa-1 , 5-bisfosfato del tomate (Meier, Plant Physiol 107 (4) 1105-1118 (1995) ), los promotores del tomate rbcS3B y rbcS3C (Carrasco Plant Mol Biol 2L_ (1) 1-15 (1993) , el promotor STL1 de las hojas (Eckes et al Mol. Gen Genet 205 14-22 (1986) y los promotores rolC.

De acuerdo a una modalidad preferida adicional de la presente invención se proporciona un método para incrementar el rendimiento de las plantas que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifican para una proteína implicada en la sensi iliz ción, transporte, metabolismo y/o absorción de la sucrosa enlazada operablemente a una región promotora controlable alcA/alcR, en donde el promotor que controla la expresión de la proteina reguladora alcR es promotor específico de teji'do u órgano y está enlazado operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de las secuencias de ADN de dicha región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el rendimiento de dicha planta transgénica, se i n creme n t a .

Los ejemplos de las secuencias de ADN que se pueden utilizar en el método de la presente invención para incrementar el rendimiento de las plantas y para controlar el comportamie to de la floración incluyen aquellas secuencias de ADN que codifican para las proteínas implicadas en el transporte, absorción y metabolismo subsecuente de la sucrosa, por ejemplo f o s f o f ru c t o - c i n a s a , invertasa y hexocinasa; la -biosíntesis de la sucrosa por ejemplo la sintasa de la sucrosa, la sintasa del fosfato de sucrosa y la f ru c t os a -1 , 6 -b i f o s f a t a s a ; en el transporte de las reversas durante el periodo inactivo tal como la carga de floema por ejemplo, las proteínas que transportan ATPase y sucrosa y hexosa; en el transporte de la floema en distancias largas y en la descarga de floema, por ejemplo pirofosforilasa inorgánica (iPPase) ; en la utilización de asimilados por ejemplo la utilización de" los metabolitos derivados de la sucrosa; en el bloqueo de la síntesis del algodón (que lleva indirectamente a niveles incrementados de sucrosa) ; y a los inhibidores de in ve rt a s a .

El uso de una región promotora controlable permite que la producción de la secuencia de ADN sea conmutada de una manera controlada a un tiempo apropiado en el ciclo de crecimiento de la planta. Se ha encontrado inesperadamente que la expresión controlada -de un gen de invertasa que utiliza al sistema promotor de conmutación alcA/alcR lleva a un incremento en la altura d-e la planta, un incremento en el tamaño del as hojas y a un incremento de hasta el 10% en el peso fresco de una planta y acelera el tiempo en el cual la planta florea, es decir la floración temprana de las plantas.

De acuerdo a otra modalidad preferida de la presente invención se proporciona un método para incrementar el rendimiento de las plantas, que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una invertasa enlazada operablemente a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo, y ubicación espacial de la expresión de dicha secuencia de ADN desde la región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el rendimiento de la planta transgénica se ve incrementado .

De acuerdo a otra modalidad preferida de la presente invención se proporciona un método para controlar el comportamiento de floración de una planta que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una invertasa enlazada operablemente a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo, y ubicación espacial de la expresión de dicha secuencia de ADN desde la región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el comportamiento de floración de dicha planta transgénica se ve alterado.

La invertasa se puede derivar de fuentes de mamíferos, bacterianas, levaduras, hongos o plantas y pueden ser de diferentes tipos tal como la invertasa acida o la invertasa neutra. La invertasa sé puede dirigir a localizaciones celulares diferentes tal como la pared celular, el citosol, las vacuolas o los apoplastos por medio de péptidos de señal (ver Soone ald et a l . , 1991 Plant J. 1:95-106) .

De acuerdo a un tercer aspecto de la presente invención se proporciona un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una proteína implicada en el metabolismo, absorción y/o transporte de la sucrosa enlazada opera lemente a una región promotora controlable.

Los constructos de ADN de acuerdo a la presente invención pueden opcionalmente contener una " secuencia del terminador de transc ipción y/o una secuencia de objetivo de tal manera que la invertasa sea dirigida como objetivo a una localización deseada dentro de la planta. Los ejemplos de los terminadores de transcripción incluyen el terminador de transcripción de nopalina sintasa y ejemplos de secuencias de objetivo adecuadas incluye por ejemplo las secuencias de señal ~ y las secuencias de objetivo de las vacuolas.

En una modalidad preferida de este aspecto de la presente invención los códigos de secuencia de ADN para la invertasa y la región promotora controlable es una región promotora inducible que comprende el sistema promotor de conmutación alcA/al cR .

Las células de las plantas se pueden transformar con los constructos de ADN recombinantes de acuerdo a una variedad. de métodos conocidos tales como los plásmidos de Agr ob a c t e ri um Ti, electroporación, microinyección, pistolas de microproyectil. Las células transformadas se pueden regenerar entonces en las plantas completas en las cuales los nuevos materiales nucleares se incorporan establemente dentro del genoma.

Algunos de la progenie de estos transformantes primarios generarán una herencia del ADN recombinante de acuerdo a la presente i n en ción.

De acuerdo a un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona el tejido de plantas transformado con un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una proteina implicada en el metabolismo, absorción y/o transporte de la sucrosa enlazada operablemente a una región promotora controlable y a- la progenie de dichas plantas.

Los ejemplos de plantas adecuadas en relación al rendimiento de la invención, que se puede incrementar y el comportamiento de floración del cual se puede controlar de acuerdo a los métodos de la presente invención y que se pueden transformar con los constructos de ADN de acuerdo a la presente invención incluyen, por ejemplo, plantas monocot i 1 edóneas y dicotiledóneas tales como los cultivos de campo, cereales, frutas y vegetales tales como: ca óla, girasol, tabaco, remolacha, algodón, soya, maiz, trigo, centeno, arroz, sorgo, tomates, mangos, duraznos, manzanas, peras, fresas, plátanos, melones, papas, zanahorias, lechuga, coles y cebollas; árboles tales como el eucalipto y árboles álamos y flores y cultivos ornamentales.

El método de la presente invención puede ser particularme te útil para mejorar la uniformidad del relleno de los plátanos por un lado de los plátanos en donde los dedos de los plátanos en la parte superi-or de la mano se llenan primero y cortar aquéllos de l_a parte inferior que no están completamente llenos. De acuerdo al método de la presente invención, la resistencia de la declinación de los plátanos se puede alterar de manera tal que el carbón fijado desde aquéllos en la parte superior de la mano se pueda extraer en aquellos plátanos en la parte inferior llevando a un tamaño más un i forme .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se ilustra adicionalmente sólo a manera de ejemplo con referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras en los cuales: La Figura 1 muestra la actividad de la invertasa en las hojas fuentes de la invertasa transgénica Alc:citosólica y el Ale: invertasa de pared celular de las plantas de tabaco que siguen luego de la inducción del etanol.

La Figura 2 muestra una representació gráfica del rendimiento del cuantum del tipo salvaje y las plantas de tabaco transgénicas en varios puntos de tiempo después de la indu c c i ón .

La Figura 3 muestra un análisis del histograma de la actividad de la invertasa en plantas transgénicas en dos diferentes concentraciones de etanol (es decir para el tipo nativo, alc:INV27, alc.INVIO, alc:INV28 y 35ScytINV) .

La Figura 4 muestra el análisis del histograma de a) la actividad de la invertasa; b) el peso fresco; e) la altura y d )" el % de floración de las plantas en el tipo nativo o salvaje, y las plantas de tabaco transgénicas inducidas por etanol (es decir tipo nativo o salvaje, alc:INV27, alc.INVIO y alc:INV28) .

La Figura 5 muestra una fotografía de la líneas 27, 28 y 10 de la Ale invertasa y el tipo s a 1 va j e A) sin etanol B) con etanol La Figura 6 muestra la expresión transiente del número de flores incrementado por la invertasa en Alc:cyINV pero no en las plantas de tabaco Alc:c INV.

La Figura 7 muestra la alteración del comportamiento de floración tanto en Alc:cyINV como en Alc:cwINVen la expresión de la i ve r t a s a .

La Figura 8 muestra la expresión transiente de la invertasa que lleva a una floración temprana en las plantas de tabaco.

La Figura 9 muestra la estrategia de injerto para la clonación de un constructo de Ale GUS con un promotor L700.

La Figura 10 muestra la expresión específica del órgano del L700: :Alc:GUS de las plantas de tabaco después de la inducción en 48 horas .

La Figura 11 muestra la estrategia de injerto para la clonación de un constructo Ale GUS con el promotor patatina B33.

La Figura 12 muestra un análisis de histograma de la actividad GUS en el tipo salvaje y los tubérculos de la papa transgénica en los dias 0 y 7 después de la inducci ón .

La Figura 13 muestra un análisis del histograma de los niveles de la actividad de GUS observada en los tubérculos de la papa, transformados con un constructo de patatina:alc:GUS inducido con etanol.

La Figura 14 muestra el tejido específico y la expresión de GUS inducible en las plantas de tabaco transgénicas: la expresión específico del tubérculo de la proteína alcR.

La Figura 15 muestra la construcción del plásmido de la patatina B33 : : Ale : c INV .

La Figura 16 muestra la actividad de la invertasa en los tubérculos de la pat atina : Al c : cwINV, inducida con etanol.

La Figura 17 muestra el contenido de carbohidratos en los tubérculos crecientes de las papas Pat: :cwINV y Pa t : : Al c : c INV .

La Figura 18 muestra el tamaño de los tubérculos incrementados de las papas resultantes de la inducción temprana de la expresión de la invertasa apoplástica.

EJEMPLOS Se ha adaptado por los inventores el reguión ale del hongo de ascomicetos A. nidu 1 a ns , que ha sido bien caracterizado (Pateman et al, Proc. Roy. Soc. London B 217, 243 (1983) , Creaser et al, Biochem J. 225 449 (1985) , Lockington et al, Mol. Microbiol 1, 275 (1987) . Felenbok et al, Gene 73, 385 (1988), Felenhok et al, J. Biotechnol. 17, 11 (1991) , Kulmberg et al, J. Biol. Chem 267, 21146 (1992) , Kulmberg et al, Mol. Microbiol. 7 847, (1993) , y Fillinger y Felenbok, Mol.

Microbiol 20 475 (1996) ) . A partir de la genética clásica, se ha supuesto que este es un sistema genético au t o- con t en i do que controla la respuesta celular al etanol y a otros químicos relacionados. En el A. nidulans , los genes alcA y aldA codifican la alcohol des idrogenasa I y la aldehido deshidrogenasa, respectivamente (Pateman et al, Proc. Roy. Soc. London B 217, 243 (1983) , Creaser et al, Biochem J. 225 449 (1985) , Lockington et al, Mol. Microbiol 1, 275 (1987) , Felenbok et al, Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al, J. Biotechnol. 17, 11 (1991) , Kulmberg et al, J. Biol. Chem 267, 21146 (1992) , Kulmberg et al, Mol. Microbiol. 7 847, (1993) , y Fillinger y Felenbok, Mol. Microbiol 20 475 (1996) ) . Ambos genes están regulados por el factor de transcripción AlcR específico de la vía (Pateman et al, Proc. Roy. Soc.

London B 217, 243 (1983), Creaser et al, Biochem J. 225 449 (1985) , Lockington et al, Mol. Microbiol 1, 275 (1987) , Felenbok et al, Gene 73, 385 (1988) , Felenbok et al, J.

Biotechnol. 17, 11 (1991) , Kulmberg et al, J.

Biol. Chem 267, 21146 (1992) , Kulmberg et al.

Mol. Microbiol. 7 847, (1993) , y Fillinger y Felenbok, Mol. Microbiol 20- 475 (1996) ) . La proteína AlcR se enlaza a los sitios específicos dentro de la región promotora a l cA y, como se demuestra aquí, debe responder directamente a la molécula inductora (Pateman et _ al, Proc. Roy. Soc. London B 217, 243 (1983) , Creaser et al, Biochem J. 225 449 (1985) , Lockington et al, Mol. Microbiol 1, 275 (1987) , Felenbok et al, Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al, J. Biotechnol. 17, 11 (1991) , Kulmberg et al, J. Biol. Chem 267, 21146 (1992) , Kulmberg et al, Mol. Microbiol. 7 847, (1993) , y Fillinger y Felenbok. Mol. Microbiol 20 475 (1996) ) .

El reguló n ale se consideró adecuado para un cásete de expresión del gen de la planta por un número de razones. Primero, el reguión mínimo incluiría solamente el gen alcR y el promotor al-cA. Segundo, la divergencia evolucionaría entre A . ni dulans y las plantas superiores haría imposible que cualquier homólogo de plantas de la proteína AlcR activará al promotor: AlcR que contiene un amontonamiento binuclear de zinc similar al Gal4 (Pateman et al, Proc. Roy. Soc. London B 217, 243 (1983), Creaser et al. Biochem J. 225 449 (1985), Lockington et al, Mol. Microbiol 1, 275 (1987) , Felenbok et al, Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al, J. Biotechnol. 17, 11 (1991) . Kulmberg et al. J. Biol. Chem 267, 21146 (1992) , Kulmberg et al, Mol. Microbiol. 7 847, (1993) , y Fillinger y Felenbok, Mol. Microbiol 20 475 (1996) ) que sólo se ha encontrado en los hongos hasta ahora. Además, ningún otro factor de t ansc ipción de las plantas se consideró como una causa de la inte ferencia en el promotor alcA. Tercero, los inductores químicos son moléculas orgánicas relativamente simples con baja f i t o t oxi c i dad . Cuarto, bajo condiciones de crecimiento normales, los niveles de inductores naturales en la planta serían e tremadame te bajos.

Para probar la eficiencia del sistema, se construyeron los casetes de expresión de la planta. La construcción de los constructos de los genes derivados de ale. El p 35 S : alcR (A) utilizó el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor para expresar la proteína AlcR a partir de un ADNc. Un ADNc de alcR parcial (proporcionado por Felenbok) se escindió de su vector Bluescript (Stratagene) mediante digestión parcial con BamEl , ligado al pJRl digerido con BamEI (Smith et al, Nature 334, 724 1988) ) , un vector derivado de pUC que contenia al promotor 35S de CaMV y al terminador nos, y se transformó en E. coli XL-1 Blue (W.O. Bullock et al. Bi oTeehn i que s 5, 376 (1987) ; J. Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, edn . (Cold Spring Harbor - Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, 1989) . El cásete reportero alcA, palcA: CAT (B), se construyó mediante digestión de pCaMVCN con HindI 11 y BamEl para eliminar al promotor, (el pCaMVCN es un vector de expresión de las plantas disponible de Pharmacia. Es un vector derivado del pUC en el cual el promotor 35S del CaMV expresa el gen CAT bacteriano. El terminador es del gen nos del A. turna fa ci en s) . Puesto que las cajas TATA del alcA y los promotores 35S fueron idénticos ( 5 ' TCTATATAA3 ' ) , se utilizó PCR recombinante para amplificar y fusionar ambos fragmentos a través de este s i t i o ( H i gu ch i en PCR Protocols, M.A. Innis et eds (Academic' Press, San Diego (1990) p 177-183) . El producto de PCR de alcA se extendió desde la caja TATA para 246 bp en dirección 5', e incluyó los sitios de enlace ALCR (Pateman et al, Proc. Roy. Soc. London B 217, 243 (1983), Creaser et al, Biochem J. .225 449 (1985) , Lockington et al, Mol. Microbiol 1, 275 (1987) , Felenbok et al, Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al. J. Biotechnol. 17, 11 (1991) , Kulmberg et al, J. Biol. Chem 267, 21146 (1992) , Kulmberg et al. Mol. Microbiol. - -7 847, (1993) , y Fillínger y Felenbak, Mol. Microbiol 20 475 (1996) ) . El producto de PCR 35S incluyó la secuencia de la caja TATA común y se extendió en dirección 3' para generar un espacio de un sitio Bam I conveniente para clonación subsecuente; el promotor 35S minimo se sabe que no se expresa en las plantas. (Se ha mostrado que. un promotor 35S mínimo que contiene solamente aquellas secuencias entre las posiciones -46 y +5 carece de la capacidad para iniciar la transcripción (Odell et al Nature 346, 390 (1985) ; Hilson et al. Plant Cell 2 651 (1990) Schena et al Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 10421 (1991) . Es razonable esperar que la fusión del palcA a través de la secuencia TATA (posiciones -31 a +1) también serían inactivas) . El producto resultante fue digerido con Hindl 11 y BamEI, y se ligó en el pCaMVCN sin promotor. Después de la transformación en E. coli, las colonias, se seleccionaron para obtener un plásmido que contuviera el promotor de fusión palcA:35S apropiado, y el fragmento HindI I I y BamEI se secuenció para asegurar que no hubiera errores en el PCR. El constructo palcA: :Inv se obtuvo mediante la eliminación del gen reportero GUS del plásmido pal cA: GOS y la inserción _del gen sue2 de levadura truncado aislado del plásmido rolC-suc2 como un fragmento BamHI (Lerchl et al (1995) Plant Cell 7, 259 (1995) . Para la transformación de las plantas, el cásete p35S : aJcjR se clonó en un vector derivado de Binl9 (Deblacre et al, Nucleic Acids Res. 13, 4777 (1985) , junto con ya sea el constructo pa!cA:CAT o el constructo palcA:Inv, transformado en A. tumefaciens (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978) ; Vervliet et al. J. Gen. Virol 26, 33 (1975) ) . La transformación del tabaco utilizando la transferencia del gen mediado por Agrobacterium se realizó como se describió previamente (Rosahl et al EMBO J. 6 1159 (1987) y Komari et al Plant Science 60 223 (1989) ) .

Se utilizó el gen de acet i 11 r ans f e ra s a de cloranfenicol bacteriano (CAT) como un gen reportero de manera que los niveles de la proteína expresada pudiera ser determinado utilizando ELISA. Cuando se transformó en A. nid?lans' (Ballannce y Turner Gene 36, 321 (1983); Campbell et al) . Curr. Genet. (1989), el constructo palc?:CAT mostró una actividad de CAT inducible, y el p35S:alCjR restauró el fenotipo de tipo salvaje a un mutante alcR (los datos no se muestran) . Los ensayos transientes (Callis et al Genes and Develop 1 1183 (1987)) en los protoplastos de maíz revelaron que la proteína AlcR podría estimular la transcripción desde el promotor alcA en las células de plantas y que la expresión era al menos parcialmente regulada por etanol (los datos no se muestran) .

Después de la tra sformación mediada por Agrobacterium tumefaciens , se- seleccionaron las plantas de tabaco transgénicas que llevaban los casetes p35S:alcR y palcA:CAT y se probaron mediante PCR para detectar la presencia de ambos casetes (los datos no se muestran) . Esta planta fue autofecundada y la progenie de las semillas se sometió a un ensayo tanto para el marcador seleccionable como para la expresión CAT. El constructo segregado entre la progenie en una proporción Mendeliana (1 no transgénico: 2 he icigoto: 1 homocigoto) consistía de una simple copia de los casetes de la planta madre (los datos no s e ué s t ra n ) .

Las semillas seleccionadas se hicieron crecer hasta la madurez para producir una línea homo c i gó t i ca . Las semillas de estas plantas se probaron para la proteína CAT en comparación a las semillas de una planta similar transformada con un constructo que expresaba el CAT a partir de el promotor 35S de C aMV con actividad altamente constitutiva (Tabla 1) . Las semillas de los homocigotos palc:CAT tuvieron una cantidad de proteínas CAT muy poco detectable en la ausencia de inducción, pero tuvieron 39% de la actividad de CAT de las semillas p35S : CAT no tratadas y 55% en relación a las semillas p35S:CAT tratadas con etansl. Asi, el tratamiento con etanol de las semillas de p35S : CAT dio como resultado una reducción [29%] en los niveles de la proteína CAT en relación al control no tratado .

Mientras que los niveles inducidos de la expresión fueron inferiores que aquellos del promotor 35S, la actividad basa despreciable indicó su capacidad de adecuarse para la manipulación del metabolismo del carbón. Un rango de vectores de invertasa inducibles fueron preparado mediante remplazo del gen reportero CAT con el GEN 100 suc2 de levadura truncada, una levadura citosólica derivada de la invertasa. En relación a esto, el fragmento Bam Hl aislado del plásmido RolC: : Suc2 (Lerchl et a l . , 1995, Plant Cell 7, 259-270) se utilizó para remplazar el gen reportero. El fragmento contenía los nucleótidos 848 a 2393 del gen such2 de levadura (Número de acceso YO 1311) y codificaba una p-ro teí a invertasa sin un péptido de señal. Las Invertasas de otras fuentes y de diferentes tipos, tales como la invertasa acida y otras invertasas objetivo también se hicieron o fabricaron utilizando las combinaciones de la invertasa del péptido de tránsito descritas en Sonnewald et a l . , 1992, Plant J. 1:95-106 que se pueden expresar en la pared celular o en localizaciones subcelulares tales como las vacuolas o los apoplastos (los detalles de la clonación se describen en Caddick et al . Nature Biotech., Vol 16, Feb . de 1988 página 177 y en Lerchl et al. , 1995, Plant Cell 7, 259-270 y Sonnewald et al. ) . Las plantas de tabaco transgénicas que llevaban el palcA:cyInv se aislaron (La transformación del tabaco (Nicotiana tabacum cv . Samsun NN) utilizando la transferencia del gen mediado por Agrobacte ium se realizó como se describe por Rosahl et al EMBO J. 13, 1 (1987) ) . Después de la selección aproximadame te 100 regenerantes resistentes a la kanamicina, independientes, para la actividad de la invertasa inducible con etanol, 23 plantas que expresan la invertasa se identificaron. De las 23 plantas que mostraron actividad de la invertasa inducible, se seleccionaron tres lineas [10, 27 y 28] para un análisis más detallado. Hasta este punto, las plantas se multiplicaron en el cultivo de tejido y 50 plantas de cada linea se transfirieron al invernadero. Después de 21 días de crecimiento en macetas de 2 L, la inducción inicial se realizó vía el remojado de la raíz con 100 ml de una solución de etanol al 1% (v/v) . Para acelerar la respuesta al etanol, la inducción se repitió a 48 y 72 horas después del remojado inicial de la raiz. Para ensayar la actividad de la invertasa, se tomaron muestras a 0, 1, 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la inducción inicial (ver Figura 1) . La actividad elevada de la invertasa fue medible en las tres lineas transgénicas a las 6 horas después de la primera adición de etanol. La actividad de la invertasa se incrementó sostenidame te alcanzó una meseta de 96 horas después del remojado inicial de la raíz en donde en dos líneas [10 y 27], mientras que en la tercera [28], aún se estaba incrementando. • Las modificación fenotípica inició a las 72 horas después de la inducción con etanol y fue más fuerte después de 96 horas. El fenotipo final fue idéntico a los resultados publicados previamente utilizando el promotor 35S CaMV para iniciar o accionar la expresión de la invertasa citosólica de levadura (Sonne ald et al Plant J. 1, 95 (1991) ) . El desarrollo de este fenotipo siguió a la actividad máxima de la invertasa y fue la más severa en el tra sforma te 28. Se usaron las mediciones' de fluorescencia de fotosíntesis para monitorear los cambios en el rendimiento del cuantum (Schreiber et al, en Ecophy s i o 1 ogy of Pho t o s y n t h e s i s Vol. 100, Schuize y Caldwell, Eds (Springer Verlag, Berlín, 1994), pp 49-70) de las tres líneas transformantes i n vi vo durante todo el experimento de inducción. Durante el curso del tratamiento con etanol, el rendimiento del cuantum no cambio marcadamente en las hojas más jóvenes (hojas A 8% del área máxima de la hoja) . Sin embargo, coinciden te con el desarrollo del rendimiento del cuantum del fenotipo visual disminuyó significativamente (p > 0.05) en las hojas B (15% como máximo) y C (45% como máximo) de las plantas de la línea 10 y la 28 iniciando a las 72 horas después de la inducción inicial y desarrollándose inicialmente hasta el punto de tiempo final a 96 horas.

La Figura 2 muestra evidencia para una proporción reducida de fotosíntesis que sigue al incremento de la actividad de la invertasa en plantas de tabaco transgénicas cuando se determinan mediante las mediciones del rendimiento del cuantum. Se usaron las mediciones de fluorescencia para monitorear los cambios en los parámetros f o t o s in t é t i co s durante la inducción de la actividad de la invertasa utilizando el instrumento PAM-2000 (Walz, Effeltrich, Alemania) . La eficiencia del uso del cuantum (rendimiento del cuantum) del fotosistema II (PSII) se midió aplicando un haz de luz saturante en las hojas adaptadas a la luz del tipo salvaje y las plantas transformadas (palcrlnv) . Antes de cada medición, se verificó que el pulso de saturación hubiera alcanzado una meseta para permitir una determinación exacta del Fm' . Las intensidades de la medición y la saturación del haz de luz se ajustaron para alcanzar un valor FO' cercano a 0.4. Las mediciones se realizaron en diferentes hojas que habían alcanzado el 8% (A), 15% (B), ó 45% (C) del área máxima de las hojas de cinco plantas de cada genotipo en los puntos de tiempo indi cados .

El rendimiento del cuantum de tres hojas adaptadas a la luz que se suceden una a otra (hojas A-C) inició desde la parte superior de la planta y se midió utilizando un instrumento PAM-2000 en los puntos de tiempo indicados. Los valores dados son las medias +-SE (n = 5) . Para las plantas de la línea 28, el rendimiento del cuantum se redujo mediante 23% (p<0.05) y 27% (p < 0.05) y para las plantas de la línea 10 solamente mediante 6% y 17% (p < 0.05) , respectivamente. Debido a la heterogeneidad del fenotipo en desarrollo entre las plantas individuales desde cada fenotipo, los errores estándar fueron más altos en las hojas afectadas (B y C) .

La tabla a continuación muestra los niveles de actividad de CAT en el tabaco transgénico. Las plántulas individuales de una línea de una línea de tabaco transgénico homo c i gó t i co , que llevan el gen CAT expresado del promotor a l cA se compararon con aquéllas de una línea similar transformada con p35S:CAT. Las plantas se hicieron crecer en medio líquido hasta las 4 semanas de edad, y mostraron cuatro hojas verdaderas (progenie de semillas de las plantas de tabaco se hicieron mediante el sembrado de las semillas directamente en una capa de 2 cm de cuentas de alcatene estériles (5 mm diámetro) que flotan en una solución estéril de 0.5% (p/v) en vasos de laboratorio de 500 ml Miracle Gro . Los vasos de laboratorio se cubrieron con una bolsa de plástico perforada y se incubaron a 25°C bajo luces de alta intensidad en un cuarto de crecimiento) . La inducción se logró mediante la adición de etanol al 0.1% al medio de crecimiento durante 120 horas. El medio de inducción se remplazó a las 58 horas para mantener las concentraciones de etanol. Se tomó una hoja antes de la • inducción, y una hoja después de la inducción. Se realizó el CAT ELISA (Boehringer Mannheim) en extractO'S crudos de células; se determinó la proteina total como se describió previamente (Bradford, Anal Biochem 72: 243 (1976) . Todos los valores fueron ng de proteína CAT pro mg de proteína total y representan la media de nueve replicados individuales ± una desviación estándar .

Línea No tratada Inducida con etanol palcA:CAT 0.36+0.43 30.37+3.91 P35S:CAT 78.08+30.44 55.46+10.85 Como se puede ver de la Figura 3 que la actividad de la invertasa en las plantas transgénicas es dependiente de la dosis y que la actividad del etanol al 5% es significativamente mayor que lo que es al 1%. Por lo tanto, es posible regular la invertasa de una manera dependiente de la dosis utilizando la conmutación Ale.

Para ver el impacto de la expresión de la invertasa en el crecimiento de las plantas y el tiempo de floración, las plantas de tabaco se propagaron vegetativamente en cultivos de tejido (Figura 4) . Subsecuentemente 50 planteletas de cada genotipo se transfirieron al invernadero. En_la Figura 4, wt denota un control transgénico de tipo salvaje y las líneas 10, 27 y 28 representan 50 líneas independientes propagadas de clonación que contienen 35S:alc A:suc 2. Tres semanas después de la tra sferencia, las plantas fueron inducidas con 100 ml al 1% (v/v) via el remojo de las raíces de las plantas. La inducción se repitió tres veces (0, 48 y 72 horas) . En particular, la Figura 4a) muestra la actividad de la invertasa neutra citosólica (suc 2) medida 96 horas después del a inducción inicial. La Figura 4b) muestra los pesos frescos de la biomasa de tierra, anterior, 45 días después de la transferencia y la Figura 4c) muestra la altura de las plantas 45 días después de la transferencia. La Figura 4d) muestra el porcentaje de las plantas que se hicieron florecer cuando se" registraron 45 días después de la transferencia.

Para mostrar el impacto de la invertasa citosólica inducible con etanol en la altura de las plantas y la floración, las plantas se propagaron en cultivos de tejido y se transfirieron hacia el invernadero (Figura 5) . Tres semanas después de la transferencia la mitad de las plantas fueron inducidas con etanol como se describió en la Figura 4. La segunda mitad de las plantas se transfirió hacia un segundo invernadero sin ningún tratamiento con etanol. El panel superior (A) muestra cuatro plantas de tabaco *de 7 semanas después de la transferencia del cultivo de tejido sin inducción con etanol. El panel inferior (B) muestra los mismos genotipos 4 semanas después de la inducción inicial con eta.nol. De izquierda a derecha se muestran los siguientes genotipos: 1, línea 27; 2, línea 10; 3, línea 28; línea 4, control no transformado. El fenotipo de floración temprana se encontró consistentemente en todos los experimentos.

Para mostrar que la expresión de la invertasa inducible lleva a un incremento en el número de flores por planta, 25 plantas de cada genotipo (wt, cyt invlO, cy inv 27, cyt inv 28, cw inv 19, cw inv 28 y cw inv 45) se propagaron en el cultivo de tejido y se transfirieron hacia el invernadero (Figura 6) . Tres semanas después las plantas de transferencia se indujeron como se describió arriba. El número total de flores producidas por cada planta se determinó al final del periodo de crecimiento.

Como se puede ver de la Figura 7, las plantas transgénicas que expresan la invertasa inducible han acelerado la inducción de las flores. 25 plantas de cada genotipo se propagaron en cultivos de tejido y se transfirieron hacia el invernadero. Tres semanas después las plantas de transferencia se indujeron como se describió arriba. Subsecuentemente, la formación de flores fue seguida durante todo el periodo de crecimiento. Las plantas se clasificaron como floreadas cuando se abrió el primer botón de flor. Los valores se dan en [%] de plantas que florean por el número -total de plantas ( n - 25 ) .

Como se puede ver de la Figura 8, el fenotipo de reproducción temprana es reproducible a diferentes estaciones de crecimiento por medio de la expresión transiente de la invertasa. En relación a esto, 50 (primavera) y 25 (verano y otoño) plantas de cada genotipo se usaron para los experimentos indi iduales, respec ivamente.

- -Después de la propagación, las plantas se transfirieron hacia el invernadero y la inducción inició tres semanas después de la transferencia como se describió arriba. En el tiempo indicado después de la transferencia (dpt, días después de la transferencia) las plantas con los botones floreados abiertos fueron contabilizadas. Los valores se dan en [%] de plantas floreadas por el número total de plantas.

Preparación del Plásmido pSTLS 1 : Al cR : AlcA: GUS (SC08) Para obtener el plásmido SC08, el fragmento EcoRI /H i ndl I I del plásmido AlcR/A GUS que contenia la región de codificación alcR y el terminadsr NOS se subclonó en el plásmido pAlcR que genera pBluescript SK. Subsecuentemente, el plásmido pAlcR se digirió con EcoRI, se cortó en el extremo con polimerasa de ADN (fragmento Klenow) , adicionalmente se restringió con HindIII y se ligó en el plásmido pBINSTLSl después de la digestión con BamHI, el tratamiento Klenow y la digestión' con Hind III generaron ~ e 1 plásmido p B I : ST S L 1 : Al cR . El plásmido pBINSTSLl consiste del promotor STSLl que corresponde al nucleótido +1 hasta +1585 de la secuencia publicada del gen STSLl de la papa (Eckes et al (1986) Mol. Gen. Genet. 205 14-22) y el terminador OCS (octopina sintasa) . El constructo final SC08 se obtuvo mediante la ligación del fragmento HindIII del plásmido AlcR/A GUS que contiene el promotor AlcA, la región codificante GUS y el terminador NOS en el vector pB IN : S T SL 1 : Al cR digerido con HindIII. La estrategia para la clonación de un constructo Ale GUS con el promotor L700 se muestra en la Figura 9.

El tejido específico y la expresión GUS inducible con etanol en las plantas de tabaco transgénico es decir control específico de hoja/tallo de la proteína alcR se muestra en la Figura 10. Las plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen reportero GUS bajo control del sistema inducible con etanol se propago en el cultivo de tejido y se transfirió hacia el invernadero. Tres semanas después las plantas transferidas se indujeron vía el remojado de la raíz utilizando 100 ml de etanol al 1%. 48 horas después de la inducción las muestras de tejido se cosecharon y se determinó la actividad GUS en los extractos de proteína: hojas con disminución o declinadas, < 3 cm; hojas fuente, 35S:Alc:GUS, la expresión en el tallo y en la raíz de la proteína alcR bajo control del promotor 35S CaMV se utilizó como un control constitutivo. La expresión del L700 : : l c : GUS de la proteína alcR bajo control del promotor ST-LS1 específico de las hojas/tallos de la papa en 4 líneas transgénicas independientes (6, 9, 27 y 74) también fue utilizado.

Preparación del Plásmido B33 : l cR : Al c : GUS (SCO 9 ) Para obtener el plásmido SC09, _ el fragmento EcoRI /HindI I I del plásmido AlcR/A GUS que contenía la región de codificación alcR y el terminador NOS se subclonó en el plásmido pAlcR que genera pBluescript SK. Subsecuentemente, el plásmido pAlcR se digirió con EcoRI, se cortó en el extremo con polimerasa de ADN (fragmento Klenow) , adici nalmente se restringió con HindIII y se ligó en el plásmido pBIN:B33AlcR digerido con SamI/HindIII . El plásmido pBIN:B33AlcR consiste del promotor clase I de patatina, que corresponde al nucleótido +1520 hasta +14 del gen B33 de patatina (Rocha-Sosa et al. (1989) EBO J. 8 23-29) y el terminador OCS . El constructo final SC09 se obtuvo mediante la ligación del fragmento HindIII del plásmido AlcR/A GUS que contiene el promotor AlcA, la región codificante GUS y el terminador NOS en el vector pBIN:B33AlcR digerido con HindIII. Una estrategia para la clonación de un constructo Ale GUS con el promotor B33 de patatina se muestra en la Figura 11.

Vector ale A GUS de patatina ale R El ?SC09 (B33-alc GUS en Bin 19) se transformó directamente en la cepa C58 C 1 : pGV2260 de A groba c t eri um t um efa ci en s utilizando el protocolo descrito por Hofgen y Willmitzer (1988) . La transformación de la papa (var Solara) utilizando la transferencia del gen mediada por A gr ob a c t e ri um se realizó como se describe por Roscha-Sosa et al (1989) . Las plantas transgénicas se duplicaron en el cultivo de tejido y un conjunto se transfirió a un invernadero siguiendo la formación de la raíz. Las plantas se hicieron crecer hasta la madurez y se cosecharon los tubérculos. Para cada tubérculo transformante independiente, se tomaron las muestras para el análisis de GUS en la ausencia del tratamiento con etanol. Los tubérculos adicionales se tra sfirieron a cajas perspex que contienen una maceta de etanol al 1%. Después de 7 días de tratamiento con vapor de etanol, se cosecharon los tubérculos y se ensayaron para la actividad GUS. La Figura 13 demuestra que los altos niveles de la expresión del transgen se observaron en los tubérculos después del tratamiento con etanol.

Las plantas de papa transgénicas que expresan el gen reportero GUS bajo control del sistema inducible con etanol se propagaron en el tejido del cultivo y se transfirieron al invernadero. Dos meses después de la transferencia, las plantas fueron inducidas vía el remojo de la raíz utilizando 100 ml de etanol al 1%. 48 horas después de la inducción, las muestras de tejido se cosecharon y se determinó la actividad de GUS en los extractos de proteínas: hojas, tallos y tubérculos > 5 g. La expresión Pat :GUS del gen reportero GUS bajo control del promotor B33 de la patatina clase L actuó como un control. La expresión de Pat: :Alc:GüS de la proteína alcR bajo control del promotor B33 específico del tubérculo de la papa también fue utilizado. La actividad se da en p ol MU/mg/min. La Figura 14 muestra la especificidad' del tejido y la expresión de GUS inducible con etanol en las plantas de tabaco mediante la expresión específica del tubérculo de la proteína alcR. El fragmento EcoRI y HindIII que contiene el gen AlcR t ran s a c t i vado r y el t e rmi nado r . OS fue del plásmido 35 S : Al cR-Al cA : GUS (35S- Alc:GUS," Plant Journal 1998, 16 (1) 127-132) y se subclonó subsecuentemente en Bluescript SK- (STRATAGENE) (AlcR en SK) . El plásmido AlcR en SK se digirió con EcoRI y se llenó con el fragmento Klenow para hacerlo con una punta roma y posteriormente cortarlo con HindIII. Este fragmento E c oRI ( - ) - H i d 11 I se clonó en el vector binario Bin-B33 y se cortó mediante Small y HindIII dando como resultado el plásmids de patatina B33:AlcR en p B I N 19. El producto PCR de la invertasa de levadura con la secuencia del péptido de señal II inhibidor de la proteína (SP) (von Schaewen et a l . (1990) EMBO J. 9, 3033-3044) se clonó en el vector pGEM-T mediante el cebador K83 y K84 que contenía el sitio Small. El fragmento Small se subclonó en el plásmido pUC-AlcA vía el sitio BamHI que fue generado con una punta roma mediante la polimerasa de ADN T4. La orientación se verificó combinando Asp718 y EcoRI, y también con Xbal. El plásmido de orientación correcta se subclonó subsecuentemente en patatina B33:AlcR en pBIN19 dando como resultado la patatina del plásmido final B33 : lcR-Alc : cwINV en BIN19 (patatina B33 : : Al c : cwINV ) . La construcción del plásmido se muestra en la Figura 15.

Las plantas de papa transgénicas se propagaron en el cultivo de tejido y subsecuentemente se transfiriero al invernadero. Después de fijar los tubérculos, las plantas se indujeron una vez con 100 ml de etanol al 1% (se remojaron las raíces) y se determinó la actividad de la invertasa en los tubérculos. El panel izquierdo muestra la actividad de la invertasa antes de (0) y después de (1) la inducción de etanol visualizado después de SDS-PAGE. Un tipo salvaje no transformado se utilizó como control y se comparó contra las líneas transgénicas independientes 2, 3, 4, 5, 7 y 13 ( e r Figura 16) .

La Figura 17 muestra el contenido de carbohidrato de los tubérculos de papa dos meses después de la inducción inicial. Las plantas transgénicas Pat: :cwINV, que expresan la invertasa de levadura se colocaron . bajo control del promotor de patatina B33 específico de los tubérculos (líneas transgénicas independientes 3, 33 y 41) . Las plantas transgénicas SC12 ( Pa t : : Al c : : c w IN ) (líneas transgénicas independientes 2, 3, 4, 5, 7 y 13) son inducibles co-n etanol. La expresión específica de los tubérculos de la invertasa de las paredes celulares se provoca vía la expresión específica de los tubérculos de la proteína alcR mediada por el promotor B33.

Las plantas de papa transgénica se propagaron en el cultivo de tejido y se transfirieron al invernadero. La inducción con etanol ocurrió en tres diferentes etapas de desarrollo. La primera inducción, 25 días después de la transferencia, la segunda inducción 32 días después de la transferencia y la tercera inducción 39 días después de la transferencia. 10 plantas de cada genotipo se utilizaron para cada uno de los experimentos de inducción. La inducción inicial ocurrió vía el remojo de la raíz. Debido al procedimiento de la inducción las plantas se indujeron después de 25 días y se indujeron con vapor después de una transferencia de 32 y- 39 días. Las plantas inducidas 32 días después de la transferencia se indujeron una segunda vez, mientras que las plantas inducidas 39 días después de la transferencia se indujeron solamente una vez (ver Figura 18) .

Otras modificaciones de la presente invención serán aparentes para aquellos hábiles en la técnica sin apartarse del alcance de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica ia citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la inven ción.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (16)

REIVINDICACIONES 1.- Un método para incrementar el rendimiento de una planta, caracterizado porque comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifican para una proteína implicada ' en la sensibilización, transporte, metabolismo y/o absorción de la sucrosa, enlazada operablemente a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de tra scripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de dichas secuencias de ADN de la región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que se incrementa el rendimiento de dicha planta transgénica . 2.- Un método para incrementar el rendimiento de una planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque se incrementa selecti amente la importación del carbono fijado en el tejido de declinación inactivo f o t o s i t é t i c ame n t e que comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifican para una proteína implicada en la sensibilización, transporte, metabolismo y/o absorción de la sucrosa operablemente enlazada a una región promotora controlable y enlazada operablemente de manera opcional a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de dichas secuencias de ADN de dicha región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el transporte del carbono fijado desde el tejido fuente activo fot os i t ét i camen te hasta el tejido de inactivo f o t o s i n t é t ic ame n t e de dicha planta transgénica se incrementa selectivamente . 3.- Un método para controlar . el comportamiento de floración de una planta, aracterizado porque comprende transformar una planta con un constructo de ADN que comprende una o más secuencias de ADN que codifica para una proteína implicada en la se si ilización, transporte, metabolismo y/o absorción de la sucrosa, enlazada operablemente a una región promotora controlable y opcionalmente a un terminador de transcripción y que controla el nivel, tiempo y localización espacial de la expresión de dichas secuencias de ADN desde la región promotora controlable mediante la aplicación de un inductor químico externo por lo que el comportamie to de floración de dicha planta transgénica, se ve alterado. 4. - Un mé t odo de conf or i dad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dichas secuencias de ADN incluyen aquellas secuencias de ADN que codifican para las proteínas implicadas en el transporte, absorción y metabolismo subsecuente de la sucrosa, tal como en la biosíntesis de la sucrosa, en el transporte de las reversas durante el estado latente tal como en la carga de floema, en el transporte de la floema a largas distancias y en la descarga de floema; y en la utilización de asimilados tales como los metabolitos derivados de la sucrosa. 5.- Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque dichas secuencias de ADN incluyen aquéllas que codifican para la sucrosa sintasa, f os fof ruct ocinasa , invertasa, hexocinasa, pi rof os for i lasa inorgánica o ATPase. 6.- Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de ADN codifica para una invertasa.

1 . - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicha región promotora controlable comprende un sistema promotor inducible químicamente. 8.- Un método de conformidad con la rei indicación 7, caracterizado porque el promotor inducible químicamente está bajo, el control de un promotor de selección de órgano o tejido. 9.- Un método de conformidad con la reivindicación 7 ó la reivindicación 8, caracterizado porque dicho sistema promotor inducible químicamente comprende el sistema promotor alcA/alcR. 10.- Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la expresión de la proteina reguladora a le R está bajo el control de un promotor selectivo de órgano o tejido. 11.- Un constructo de ADN caracterizado porque comprende una secuencia o secuencias de ADN que codifican para una proteína implicada en el metabolismo, la absorción y/o transporte de la sucrosa enlazado operablemente a la región promotora controlable. 12.- Un constructo o construcción de .ADN de conformidad con la rei indicación 11, caracterizado porque dicha región promotora controlable comprende un sistema promotor inducible químicame te. 13.- Un constructo o construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque dicho sistema promotor inducible químicamente es el sistema promotor de conmutación alcA/alcR. 14.- Un constructo o construcción de ADN de conformidad con la rei indicación 13, caracterizado porque la proteína reguladora alcR está bajo el control de un promotor selectivo de órgano o tejido. 15.- Un constructo o construcción de ADN de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 14, caracterizado porque las- secuencia.s de ADN comprenden una secuencia de ADN que codifica para una invertasa. 16.- Un tejido de planta transformado con un- constructo de ADN conformidad con . la reivindicación cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 y la progenie de dichas plantas. - - 17.- Un método o un constructo de ADN substancialmente co o se describió aquí con referencia a cualquiera de las figuras.