MXPA00003811A - Peptidos capaces de inhibir la interaccion entre las presenilinas y los precursores del peptido beta - amiloide y/o el peptido beta - amiloide y pruebas de interaccion para la investigacion de moleculas inhibidoras de la mencionada interaccion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas secuencias peptídicas y nucleotídicas, y su utilización farmacéutica. Más particularmente, la presente invención concierne a nuevos polipéptidos capaces de inhibir al menos en parte la interacción entre la presenilinaa 1óla presenilina 2 por una parte y el precursor del péptido beta-amiloide y /o el péptido beta-amiloide por otra parte. La presente invención concierne también a la elaboración de pruebas in vitro para la puesta en evidencia de moléculas y en particular de pequeñas moléculas capaces de inhibir esta interacción.

Description

• PEPTIDOS CAPACES DE INHIBIR LA INTERACCIÓN ENTRE LAS PRESENILINAS Y LOS PRECURSORES DEL PEPTIDO ß-AMILOIDE Y/O EL PEPTIDO ß-AMILOIDE Y PRUEBAS DE INTERACCIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN DE MOLÉCULAS INHIBIDORAS DE LA MENCIONADA INTERACCIÓN La presente invención concierne a nuevas secuencias peptidicas y nucleotídicas . Más particularmente, la presente invención concierne a nuevos polipéptidos capaces de inhibir al menos parcialmente la interacción entre la presenilina 1 ó. la presenilina 2 por una parte y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß- amiloide por otra parte. La presente invención concierne también a la elaboración de pruebas in vitro para la puesta en evidencia de moléculas y en particular de pequeñas moléculas capaces de inhibir esta interacción.

El péptido amiloide Aß, de 37 a 42 ácidos aminados, es el principal componente proteico de las placas senilecaracteristicaas de la enfermedad de Alzheimer. Este péptido es producto por división de su precursora, la proteina precursora de péptido amiloide (APP) . Mutaciones en el gen de la APP son responsables de ciertas formas familiares precoces de la enfermedad de Alzheimer. REF.119032 No obstante la mayoría de estas formas están relacionadas a la presencia de mutaciones sobre dos genes de presenilinas PS1 (inicialmente denominado S182) y el PS2 (inicialmente STM2) . Recientemente identificados por clonación de posición (Hardy, 1997) . Estas formas son dominantes y estas anomalías corresponden todas a mutaciones en sentido equivocado con excepción de una que arrastra la supresión de un exon. Las presenilinas son proteínas hidrófobas embranarias de aproximadamente 45-50 kDa de masa molecular y que presentan 61 % de identidad entre ellas. Son homologas de dos proteínas de C. elegans, SPE4 y Sel-12, que están implicadas de forma directa respectivamente en el transporte intracelular y en señales de los receptores Notch. No obstante, la función fisiológica de las presentaciones es todavía desconocida. La implicación de la enfermedad de Alzheimer, de dos proteínas tan vecinas, permite pensar que las presenilinas contribuyen en una vía fisiológica esencial en la etiología de esta patología.

La proteína PS1 comprende 467 ácidos a inadoss y PS2 448. Las dos presentan la estructura de una proteína membranaria con de 6 a 8 regiones trans embranarias potenciales. Cada una de las presenilinas está sujeta in vivo a una división proteolítica precisa que dá como resultado dos fragmentos generalmente denominados fragmentos N (amino)- y C (carboxi)- terminales. Thinakaran y colaboradores, 1996) . Esta división ha sido cartografiada entre los residuos 291 y 299 de PSI (Podlisny y colaboradores, 1997) y en una región ho ólogaa de PS2. Se entiende pues en generaal por fragmento N- terminal (N-ter) , el fragmento de la posición 1 de aproximadamente 291 de PS1 y por fragemnto C- terminal, el complemento. Aunque la topología exacta de las presenilinas en las membranas lipídicas no esté claramente establecida, se ha propuesto que sus extremos N- y C- terminales [RCI], así como la gran desviación hidrófila, estén presentes en el compartimento criosólico (Doan y colaboradores, 1996, ver esquemaa de la figura 1) .

Actualmente se ha demostrado que las formas mutadas de las presenilinas inducen el aumento de la producción del péptido amiloide largo Aß 1- 40 tanto en pacientes portadores (Scheuner y colaboradores, 1996) , como en células transfectadas (Borchelt y colaboradores, 1996) ó en ratas transgénicas (Duff y colaboradores, 1996) . El péptiddo amiloide Aß, que forma las placas seniles, lesiones características de la patología, y sus diferentes formas son derivadas del catabolismo de la proteínaa precursora del amiloide, APP. En particular, dos formas esenciales del péptido amiloide han sido descritas, uno de cuarenta residuos, Aß40, y el otro que posee dos residuos suplementarios en su carboxi terminal, Aß42. In vitro el péptido Aß presenta fuertes propiedades de agregación que son acrecentadas para la forma Aß42 y este último conjunto efectivamente formar los primeros agregados detectables en la patología. Por otra parte, la forma Aß42 es específicamente producida después de trauma craniano en el hombre, el cual constituye uno de los factores de riesgo ambientales mejor establecidos de la enfermedad de Alzheimer. Además, las formas genéticas precoces de la enfermedad relacionadas a mutaciones tanto sobre el APP (habiendo 6) que actualmente sobre las presenilinas 1 y 2, concurriendo todas en un aumento de la proporción Aß42/ Aß40. El conjunto de estos factores parece designar el Aß42 como el agente clave de la patología tanto en las formas genéticas como esporádicas de la enfermedad y la elucidación de su mecanismo de formación se ha convertido en una cuestión fundamental.

A este respecto, la formación de complejo en la misma envoltura celular entre el precursor del péptiddo ß-amiloide y PS1 ó PS2 ha sido reportado (Weidemann y colaboradores 1997, Xia y colaboradores, 1997) no obstante no se conoce la naturaleza precisa de los eventos responsables de la producción del péptido ß- amiloide y ninguna relación no se ha podido todavía 5 establecer entre el papel posible de estos complejos y la producción del peptido ß- amiloide Aß42. Es sin embargo importante hacer notar que el péptido Aß42, pero no el Aß40, parece estar localizado en el reticulum endoplásmico en las células neuronales (Hartmann y 10 colaboradores, 1997) . • La presente invención resulta de la identificación y de la caracterización por la solicitantee de regiones particulares de la preselinilinaa 1 (PS1) y de la 15 presenilina 2 (PS2), así como regiones particulares del precursor del péptido ß- amiloide (APP) implicados en la formación de complejos APP/PS1 y APP/PS2.

Laa presente invención resulta en particular de la 20 puesta en evidencia de la capacidad de la región N- terr inal hidrófila (ácidos aminados 1-87) de la PS2 de reconocer diferentes regiones de APP. Resulta además de la puesta en evidenica de propiedades similares para la reggión N- terminal de PS1 (fragmento 1- 213) . Resulta 25 igualmente de la demostración de la capacidad de los polipéptidos derivados de las regiones de las presenilinas definidas anteriormente de inhibir la formación de los complejos entre la APP y las presenilinas. Las presenilinas de la presente solicitud corresponden esencialmente a la presenilina 1 (PS1) y/ó a la presenilina 2 (PS2) .

La presente invención resulta además de la puesta en evidencia de la localización celular particular, no esperada, de las regiones en interacción en relación a la membrana lipídica. Resulta más particularmente del hecho de que sus interacciones pueden tomar lugar no solamente al nivel membranl sino igualmente al nivel de la luz del reticulu endoplásmico y en el compartimento extracelular. Esto es inesperado en la medida en la que la región N- terminal de los PS (implicaados en la interacción) es generalmente considerada como estando localizada en el citoplasma en condiciones estándares.

La caracterización de las regiones de interacción de la APP y de las presenilinas y la puesta en evidencia de las diferentes localizaciones celulares de estas interacciones permiten contemplar la preparación de nuevos polipéptidos utilizables farmacéuticamente.

Un primer objeto de la invención concierne entonces a polipéptidos capaces de inhibir al menos en partee la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide.

En el sentido de "capaz de inhibir la interacción" se entiende que la presencia de los polipéptidos de la invención y/ó de los ligandos y/ó moléculas puestos en evidencia con la ayuda del procedimiento de la invención, bastan para inhibir al menos parcialmente la mencionada interacción entre una presenilina y/ó su extremo N-terminal y el precursor del péptido ß-amiloidee y/ó el péptido ß-amiloide y de preferencia el péptido Aß?_2.

Se ha demostrado en los ejemplos de la presente solicitudd que la inhibición de esta interacción con uno de los polipéptidos de la invención, conduce a la disminución de la producción del péptido amiloide intracelular Aß?_42. Esta consecuencia funcional es entonces contemplada para todo polipéptiddo de la invención y/ó ligandos y/ó moléculas puestas en evidencia ccon la ayuda del procedimiento de la invención. Inhibir esta interacción y entonces inhibir la producción de Aßi-42, representa en consecuencia un objetivo terapéutico de selección en las enfermedades que implican esta forma del péptido amiloide.

Según una modalidad particular, los polipéptidos según la invención contienen al menos una parte de la presenilina 2 (PS2) que permite la interacción con el precursor del péptido ß-amiloide y/ó del péptido ß-amiloide. De manera preferidas, los polipéptidos según la invención están caracterizados porque la parte de PPs2 corresponde al fragmento N- terminal hidrófilo de PS2. Más preferencialmente los polipéptidos según la invención comprenden toda ó parte de la secuencia correspondiente a la secuencia SEC ID No. 1 ó de una secuencia derivada de ésta.

Según otra modalidad de realización, los polipéptidos según la invención contienen al menos una parte de PS1 que permite la interacción con el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. De manera preferida los polipéptidos según la invención comprenden toda ó parte de la secuencia correspondiente a la SEC ID No. 2 ó de una secuencia derivada de ésta.

Según otra modalidad de realización los polipéptidos según la invención comprenden al menos las regiones de homología comunes que corresponden a las secuencias SEC ID No. 1 y SEC ID No. 2.

Según otra modalidad de realización los polipéptidos según la invención contienen al menos una parte del precursor del péptido ß-amiloide (APP) . De manera preferida, los polipéptidos según la invención contienen una parte del APP excepto la región -correspondiente aal péptido ß-amiloide. Aún más preferencialmentee, los polipéptidos están caracterizadoss porque la parte del precursor del péptido ß-amiloide comprende todo ó parte del fragmento 1-596. Más preferencialmente, los polipéptidos según la invención contienen todo ó parte de una secuencia seleccionada entre la secuenciaa correspondiente al fragmento 1-596 de la secuencia SEC ID No. 3, ó una secuencia derivada.

En el sentido de la presente invención, el término secuencia polipeptídica derivada designa toda secuencia polipeptídica que difiere de las secuencias polipeptídicas correspondientes a las secuencias presentadas en SEC ID No. 1 ó SEC ID No. 2 ólos fragmentos designados de la SEC ID No. 3, obtenida por una ó varias modificaciones de naturaleza genética y/ó química, y que posee la capacidad de inhibir al menos en parte la interacción entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. Por modificación de naturaleza genética y/ó químicaa, se debe entender toda mutación, substitución, supresión , adición y/ó modificación de uno ó varios residuos. Tales derivados pueden ser generados en objetivos diferentes, tales como particularmente el de aumentar la afinidad del péptido por su sitio de interacción, el de mejorar su nivel de producción, el de aumentar su resistencia a las proteasas, el de aumentar su eficiencia terapéutica ó reducir sus efectos secundarios, ó el de conferir nuevas propiedades fármacocinéticas y/ó biológicas.

La invención proporciona igualemnte compuestos no peptídicos ó no exclusivamente peptídicos utilizables farmacéuticamente. Es en efecto posible, a partir de los motivos polipeptídicos descritos en la presente solicitud, realizar moléculas que inhiben al menos parcialmente la interacción entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide, y que no sean exclusivamente peptídicos y compatibles con una utilización farmacéutica. A este respecto, la invención concierne a la utilización de polipéptidos tales como los descritos anteriormente para la preparación de moléculas no peptídicas, ó no exclusivamente peptídicas, activas farmacológicamente, por determinación de los elementos estructurales de estos polipéptidos que son importantes para su actividad y reproducción de estos elementos por estructuras no peptídicas ó no exclusivamente peptídicas. La invención tiene también por objeto composiciones farmacéuticas que comprenden una ó varias moléculas así preparadas .

Los polipéptidos según la invención deben comprender secuencias que permitan una localización celular precisa a fin de inhibir la interacción entre las presenilinas y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. Preferencialmente estos son los polipéptidos derivados de SEC ID 1 y SEC ID 2 que comprenden secuencias de localización celular exógena y de manera aún más preferida un polipéptido que comprende el extremo N- terminal de PS1 ó el PS2. Entre estas secuencias se puede citar las secuencias de péptido indicadoras tales como la secuencia del péptido indicador IgkB, el péptido indicador del APP, los péptidos indicadores de las subunidades de los receptores nicotínicos de las acetocolinas musculares y centrales.

Entre los polipéptidos particularmente interesantes se puede citar un polipéptido que comprende los 87 primeros residuos del extremo N- terminal de PS2 y el péptido indicador de IgkB.

La presente invención tiene igualmentee por objeto toda secuencia nucleotídica que codifica para un péptido capaz de inhibir al menos en parte la interacción entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. Según una modalidad particular, se trata de una secuencia nucleotídica que comprende todo ó parte de la secuencia nucleotídica SEC ID No. 1 ó de una secuencia derivada de ésta. Según otra modalidad, se trata de una secuencia nucleotídica que comprende toda ó parte de la secuencia nucleotídica SEC ID No. 2 ó de una secuencia derivada de ésta. De manera preferida, se trata de una secuencia nucleotídica que comprende las zonas de homología comunes a las secuencias nucleotídicas SEC ID No. 1 y SEC ID No. 2. Según otra modalidad, se trata de la secuanica nucleotídica correspondiente al fragmento 1-596 (ácidos nucleicos 1 a 1788) de la secuencia SEC ID No. 3, ó una secuencia derivada.

En el sentido de la presente invención, el término "secuencia nucleotídica derivada" designa toda secuencia que difieree de la secuencia considerada en razón de la degeneración del código genético, obtenida por una ó varias modificaciones de naturaleza genética y/ó química, así como toda secuencia que hibridiza con estas secuencias ó fragmentos de ésta y que codifica para un polipéptido según la inención. Por modificación de la naturaleza genética y/ó química, se puede entender toda mutación, substitución, supresión, adición y/ó modificación de uno ó varios residuos. El término derivado comprende igualmente las seucencias homologas a la secuencia considerada, proveniente de otras fuentes celulares y particularmente de células de origen humano, ó de otros organismos. Tales secuencias homologas pueden ser obtenidas por experiencias de hibridización. Las hibridizaciones pueden ser ralizadas a partir de banco de ácidos nucleicos, utilizanddo como sonda, la secuencia nativa ó un fragmento de ésta, en condiciones variables de hibridización (Maniatis y colaboradores 1982) .

Las secuencias nucleotídicas según la invención pueden ser de origen artificial ó no. Puede tratarse de secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas ó de secuencias sintéticas ó semisintéticas .

Estas secuencias pueden ser obtenidas por ejemplo por cribaje de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) por medio de sondas elaboradas sobre la base de secuencias presentadas anteriormente. Tales bancoss pueden ser preparados a partir de células de diferentes orígenes por técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en la materia. Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden igualmente ser preparadas por síntesis química ó aún por métodos mixtos que incluyen la modificación química ó enzimática de secuencias obtenidass por cribaje de bancos. De una manera general los ácidos nucleicos de la invención pueden ser preparadoss según toda técnica conocida por el experto en la materia.

Otro objeto de la presente invención concierne a un procedimiento de preparación de los polipéptidos de la invención según el cual se cultiva una célula que contiene una secuencia nucleotídica según la invención, en condiciones de expresión de la mencionada secuencia y se recupera el popilpéptido producto. En ese caso, la parte que codifica para el mencionado polipéptido es generalmente colocada bajo el control de indicadores que permiten su expresión en un huésped celular. La selección de estas indicadores (promotores, terminadores, secuencia líder de secreción, etc.) puede variar en función del huésped celular utilizado. Por otra parte, las secuencias nucleotídicas de la invención pueden formar parte de un vector que puede ser una réplica autónoma ó integrativa. Más particularmentee, vectores de réplica autónoma pueden ser preparados utilizando secuencias de réplica autónoma en el huésped seleccionado. Tratándose de vectores integrativos, éstos pueden ser preparadoss, por ejemplo, utilizando secuencias homologas a ciertas regiones del genoma del huésped, permitiendo por recombinación homologa, la integración del vector.

La presente invención tiene igualmente por objeto células huéspedes transformadas con un ácido nucleico que contiene una secuencia nucleotídica según la invención. Los huéspedes celulares utilizables para la producción de los péptidos de la invención por vía recombinante son tanto huéspedes eucariotas como procariotas. Entre los huéspedes eucariotas que convienen, se puede citar las células animales, las levaduras, ó los hongos. En particular, tratándose de las levaduras, se puede citar las levaduras del género Saccaromyces, Kl uyveromyces , Pichia , Scchwanni omyces, ó Hansemula . Tratándose de células animales, se puede citar las células COS, CHO, C127, de neuroblastomas humanos etc. Entre los hongos, se puede citar más particularmente Aspergillus sp, ó Tricchoderma sp. Como huéspedes procariotas, se prefiere utilizar las bacterias siguientes E. Coli, Bacillus, ó Streptomyces.

Según una modalidad preferida, las células huéspedes son ventajosamente representadas por cepas de levaduras recombinantes para la expresión de los ácidos nucleicos de la invención así como la producción de las proteínas derivadas de éstos.

Preferencialmente, las células huéspedes comprenden al menoss una secuenciaa ó un fragmento de secuencia seleccionado entre las secuencias SEC ID No. 1 ó SEC ID No. 2, ó los fragmentos designados de la SEC ID No. 3 para la producción de polipéptidos según la invención.

Las secuencias nucleotídicas según la invención pueden ser utilizadas en el cuadro de terapias genéticas particularmente gracias a la adición de un péptido indicador para los derivados de las SEC ID No. 1 y SEC ID No. 2, para la producción y la transferencia in vivo de polipéptidos capaces de inhibir al menos en parte la interacción entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. En efecto, de manera inesperada, es puesto en evidencia en la presente solicitud que un péeptido indicador es necesario para la dirección en la luz del reticulum endoplásmico de los polipéptidos de la invención y para conferir así a los polipéptidos derivados de las secuencias SEC ID No. 1 y Sec ID No. 2 una actividad biológica con el objetivo de inhibir la interacción entre las presenilinass y el precursor del péptido ß-amiloide y/ ó el péptido ß-amiloide.

Según otra modalidad de realización de la invención, las secuencias nucleotídicas de la invención son utilizadas para la construcción de un cartucho de expresión, utilizable en un vector de expresión. En particular, el cartucho de expresión sirve para la producción de los polipéptidos según la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden ser obtenidos por expresión en un huésped celular de una secuencia nucleotídica tal como la descrita posteriormente, incorporada ó no a un ADN recombinante, utilizando las técnicas conocidas por el experto en la materia, ó por una combinación de estas técnicas.

Preferencialmente, las secuencias nucleicas según la invención forman parte de un vector útil para inducir in vivo, ex viwo y/ó in vitro la expresión de los polipéptidos reivindicados. El vector utilizado puede ser de origen de orígenes diversos, aunque es capaz de transformar las células animales, de preferencia las células nerviosas humanas. Puede tratarse de vector viral, no viral ó de un vector plasmídico. En una modalidad preferida de aplicación de la invención, se utiliza un vector viral, que puede derivar de los adenovirus, retrovirus, virus adeno-asociados (AAV) , de los virus del herpes, del citomegalovirus (CMV) , del virus de la vacuna, etc. Vectores derivados de los adenovirus, de los retrovirus, ó de los AAV que incorporaan secuencias de ácidos nucleicos heterólogos han sido descritos en la literatura [Akli y colaboradores, Nature Genetics 3 (1993) 224, Straford-Perricaudet y colaboradores Human Gene Therapy 1 (1990) 241, EP 185 573., Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195, Le Gal la Salle y colaboradores, Science 259 (1993 998, Roemer y Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211, Dobson y colaboradores, Neuron 5 (1990) 353, Chiocca y colaboradores New Biol. 2 (1990) 739, Miyanohara y colaboradores, New Biol. 4 (1992) 238, WO91/18088J.

La presente invención concierne entonces igualmente todos los virus recombinantes que comprenden, insertada en su genoma, una secuencia nucleica tal como la definida antes y que codifica para un polipéptido de la invención.

Ventajosamente, el virus recombianante según la invención es un virus defectuoso. El término "virus defectuoso" designa un virus incapaz de replicarse en la célula objetivo. Generalmente, el genoma de los virus defectosos utilizados en el marco de la presente invención está entonces desprovisto al menos de las secuencias necesarias para la réplica de dicho virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser ya sea eliminadas ( total ó parcialmente) , ó bien convertidas en no funcionales, ya sea substituidas por otras secuencias y particularmente por el ácido nucleico de la invención. Preferencialmente, el virus defectuoso conserva sin embargo las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsulación de las partículas virales.

Es particularmente ventajoso utilizar las secuencias nucleicas de la invención bajo la forma incorporada a un adenovirus, un AW ó un retrovirus recombinante defectuoso. Según una modalidad de realización preferida, se trata de un adenovirus.

Existe diferentes serotipos de adenovirus, cuya estructura y propiedades varían ligeramente. Entre estos serotipos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención los adenovirus humanos de tipo 2 ó 5 (Ad 2 ó Ad 5) ó los adenovirus de origen animal (ver solicitud W094/26914) . Entre los adenovirus de origen animal utilizables en el marco de la presente invención se puede citar los adenovirus de origen canino, bovino, murino, (ejemplo; Mavl, Beard y colaboradores, Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar ó aún simiano (ejemplo; SAV) . De preferencia, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferencialmente un adenovirus CAV2 [cepa manhattan ó A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. De preferencia, se utiliza en el marco de la invención de los adenovirus de origen humano ó canino ó mixto. Preferencialmente, en el genoma de los adenovirus de la invención, la región El al menos es no funcional. El gen viral considerado puede ser convertido en no funcional por toda técnica conocida por el experto en la materia, y particularmente por supresión total, substitución, eliminación parcial, ó adición de una ó varias bases en el ó los genes considerados. Otras regiones pueden igualmente ser modificados, y particularmente la región E3 (WO95/02697) , E2 (W094/28938) , E4 (W094/28152, W094/12649, WO95/02697) y L5 (WO 95/02697) . Según una modalidad preferida de aplicación, el adenovirus comprende una supresión en las regiones El y E4. Según otra modalidad preferida, comprende una supresión en la región El al nivel de la cual son insertadas la región E4 y la secuencia codificante. En los virus de la invención, la supresión en la región El se extiende preferencialmente desde los nucleótidos 455 a 3329 sobre la secuencia del adenovirus Ad5. Según otra modalidad de realización preeferida, la secuencia de ácido nucleico exógena es insertada al nivel de la supresión en la región El.

Los virus recombinantes defectuosos de la invención pueden ser preparados por recombinación homologa entre un virus defectuoso y un plásmido que contiene entre otras la secuencia nucleotídica tal como la definida anteriormente (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinación homologa se produce después de co-transfección de dichos virus y plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular utilizada debe de preferencia (i) ser transformable por los elementos mencionados, y (ii) , contener las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del virus defectuoso, de preferencia bajo forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. A título de ejemplo de línea utilizable para la preparación de adenovirus recombinantes defectuosos, se puede mencionar la línea de riñon embrionario humano 293 (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene particularmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12 %) . A título de ejemplo de línea utilizable para la preparación de retrovirus defectuosos, se puede mencionar la línea CRIP (Danos y Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460) . A continuación, los virus que se han multiplicado son recuperados y purificados según las técnicas clásicas de biología molecular.

La presente solicitud tiene igualmente por objeto virus recombinantes defectuosos que comprenden una secuencia nucleica heteróloga que codifica para un polipéptido según la invención.

Otro objeto de la invención reside en anticuerpos ó fragmentos de anticuerpos policlonales ó monoclonales.

Tales anticuerpos pueden ser generados por métodos conocidos por el experto en la materia. En particular estos anticuerpos pueden ser preparados por inmunización de un animal contra un polipéptido cuya secuencia es seleccionada entre las secuencias SEC ID No. 1 ó SEC ID No. 2 ó los fragmentos designados de la SEC ID No. 3, después del muestreo de la sangre y aislamiento de los anticuerpos. Estos anticuerpos pueden igualmente ser generados por preparación de hibridomas según las técnicas conocidas por el experto en la materia. Los anticuerpos ó fragmentos de anticuerpos según la invención pueden particularmente ser utilizados para inhibir al menos parcialmente la interacción entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide.

Otro objeto de la presente invención concierne a un procedimiento de identificación de compuestos capaces de modular ó de inhibir al menos parcialmente la interacción entre la presnilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß- amiolide y/ó el péptido ß-amiloide. En Particular, el procedimiento es utilizable como prueba de cribaje de moléculas para identificar tales compuestos inhibidores.

Esta prueba descansa en particular sobre la detección de la inhibición de la interacción de una manera general entre las presenilinas (1 6 2) y el APP ó el péptido Aß y de una manera particular entre el péptido Aß?-42 y el extremo N- terminal de PS2. en efecto, con la ayuda de proteínas marcadoras fijadas a las presenilinas ó fragmentos de éstas y sistemas de revelación apropiada y particularmente por inmunoprecipitación, utilización de cromoforos ó fluoroforos, es totalmente posible detectar una inhibición en la interacción de las proteínas ó fragmentos de éstas, precedentemente citadas. Un procedimiento tal comprende entonces al menos una etapa de mareaje de las presenilinas y/ó de la APP ó de los fragmentos de éstos y una etapa de detección de la inhibición de la interacción ya sea entre el péptido Aß?_ 42 y el extremo N- terminal de las presenilinas y preferencialmente PS2, ya sea entre las proteínas completas APP y presenilinas.

Según una primera modalidad de realización del procedimiento, la puesta en evidencia y/ó identificación de tales compuestos es realizada según las etapas siguientes : - el péptido Aß?_42 es absorbido previamente sobre una membrana de nitrocelulosa por incubación. un extracto bacteriano que contenga total ó parcialmente una presenilina (PS1 ó PS2) y ventajosamente el extremo N- terminal, es a continuación añadido para incubación con la molécula ó una mezcla que contenga diferentes moléculas para probar. después de lavados, la interacción de la presenilina con el péptido Aß?_42 sobre el filtro de nitrocelulosa es puesta en evidencia con la ayuda de proteínas marcadoras de las presenilinas. Las moléculas investigadas inhiben la interacción y disminuyen entonces la intensidad de la señal de las proteínas marcadoras.

Las proteínas marcadoras utilizadas son ventajosamente a) la proteína fijadora del S-tag, acoplada a la fosfatasa alcalina ó a un cromoforo fluorescente, ó b) un anticuerpo anti-PSNT es decir dirigido contra el extremo N- terminal de una presenilina.

Según otra modalidad de realización del procedimiento, la investigación de nuevos compuestos es efectuada de la manera siguiente: - el péptido Aß 2 incubado previamente sobre una placa que contenga pocilios (formato de 96 pocilios ó superior) . - el extremo N- terminal de una presenilina recombinante purificada es a continuación añadido con la molécula ó una mezcla que contenga diferentes moléculas para probar, para incubación - después de lavados, la interacción de la presenilina con el péptido Aß?_42 en la placa es puesta en evidencia con la ayuda de proteínas marcadoras de las presenilinas. La parte de la interacción entre las presenilinas y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide es detectado por espectrofotometría.

En el caso preciso de la utilización de la proteína fijadora del S-tag acoplada a la fosfatasa alcalina como proteína marcadora, después de revelado con un substrato colorimétrico, la señal es detectada a 450 nm.

Según una modalidad de realización ventajosa y preferida del procedimiento, la puesta en evidencia y/ó aislamiento de compuestos capaces de modular ó de inhibir al menos parcialmente la interacción de una manera general entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide y de una manera particular entre el péptido Aß?_ 42 y el extremo N- terminal de PS2, es realizada según las etapas siguientes. - se pone en contacto una molécula ó una mezcla que contienen diferentes moléculas con el péptido Aß?-42 sintetizado con una biotina y un brazo de 3 ßalaninas (ó de 3 usinas) en su extremo N- terminal (hacia el inicio de la posición 1) . - se incuba la mezcla reaccionante precedente con el extremo N- terminal de una presenilina purificada con la ayuda de un primer fluoroforo. Ventajodamente, el fluoforo es el criptato de Europium - se añade la estreptavidina (que se fijará sobre la biotina del péptido biot-Aß?-42) acoplada a un segundo fluoforo , capaz de ser excitado a la longitud de onda de emisión del primer fluoforo a fin de que se beneficie de una transferencia de fluorescencia si los dos fluoforos se encuentran muy próximos. - la puesta en evidencia de los nuevos compuestos que inhiban la interacción es detectada por fluorometría a la longitud de emisión del primer fluoforo y/ó midiendo la disminución de la señal a la longitud de onda de emisión del segundo fluoforo.

Según una modalidad particular, este sgundo fluoforo es el XL665 que es aloficocianina reticulada químicamente para aumentar su fluorescencia a 665 nm (CisBiointernacional) . La pérdida de la interacción es entonces detectada por fluorometría a la- longitud d onda de emisión del primer fluoforo y por la disminución de la señal del XL665 cuya longitud de onda de emisión es de 665 nm.

Este procedimiento es totalmente ventajoso ya que permite poner en evidencia directamente la interacción entre las presnilinas y el APP y/ó el péptido Aß en fase líquida y homogénea y en consecuencia poner en evidencia las moléculas inhibidoras de la mencionada interacción. En efecto, este procedimiento descansa sobre la transferencia de fluorescencia entre dos fluoforos si estos dos cromoforos están en proximidad física (entonces en el caso de interacción entre Aßl-42 y la proteína recombinante) . Según una variante preferida del procedimiento, el primer fluoroforo es el criptato de Europium, llevado por la proteína recombinante marcada (excitada a 337 nm) que reacciona con la estreptavidina- XL665 fijada sobre el péptido biot-Aß, y en particular el péptido biot-Aßl-42. Ventajosamente, la proteína marcada está constituida por el extremo N- terminal de una ó de la otra de las presenilinas (PSNT-K) . La pérdida de la fluorescencia a 665 nm y el aumento de la fluorescencia a 620 nm característica del criptato de Europium indica una inhibición de la interacción entre las presenilinas ó sus extremos N- terminales y el APP y/ó el péptido Aß por las moléculas investigadas.

Según una variante de este procedimiento, la molécula ó la mezcla que contiene las diferentes moléculas pueden ser puestas en contacto primero con el extremo N- terminal de una presenilina purificada marcada con la ayuda de criptato de Europium (PSNT-K) luego con el péptido Aß?_40 ó Aß?-42 que contienen una biotina en un brazo de 3 ß-alaninas (ó de 3 usinas) en su extremo N-terminal. La puesta en evidencia de nuevas moléculas capaces de modular ó de inhibir al menos parcialmente la interacción entre la presenilina 1 ó la presenilina 2 y' el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide será heca igualmente, después de adjunción de la estrepatvidina marcada a la XL665, or espectrofluorometría según el procedimiento precedente y particularmente por lectura de la fluorescencia a 665 nm.

Según una última modalidad de realización del procedimiento de puesta en evidencia de compuestos que inhiban la interacción de una manera general entre las presenilinas (1 ó 2) y el APP ó el péptido Aß y de una manera particular entre el péptido Aß?-2 y el extremo N-terminal de PS2 contiene las etapas siguientes: - se pone en contacto una mezcla a) de usados celulares que contengan total ó parcialmente una presenilina (PS1 ó PS2) y ventajosamente el extremo N-terminal, b) de usados celulares que contengan la APP, lisados obtenidos a partir de células infectadas por virus y en particular por baculovirus y c) la molécula ó una mezcla que contenga diferentes moléculas para probar. - se co-inmunoprecipita con la ayuda de anticuerpos apropiados y bien conocidos por el experto en la materia, las proteínas solubilizadas y correspondientes a las presenilinas ó a la APP ó al péptido Aß - la pérdida de la co-inmunoprecipitación de las presenilinas y del APP es revelado por manchado Western con anticuerpos marcadores que indican que las moléculas probadas tienen la propiedad inhibidora investigada.

En una modalidad particular, los procedimientos de la invención descritos precedentemente son adaptados a la puesta en evidencia y/ó al aislamiento de ligandos, agonistas ó antagonistas de la interacción entre las presenilinas y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide.

La presente invención concierne igualmente a la utilización de los polipéptidos definidos precedentemente para la puesta en evidencia de ligandos de los polipéptidos pero sobre todo de ligandos de las presenilinas, del precursor del péptido ß-amiloide y/ó del péptido ß-amiloide, y preferencialmente del péptido Aßl-42 y/ó del extremo N-terminal de PS2, así como de compuestos capaces de inhibir al menos parcialmente la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide.

Otro objeto de la invención concierne a la utilización de un ligando ó de un modulador identificado y/ó obtenido según los procedimientos descritos anteriormente como medicamento. Tales ligandos ó moduladores de por su capacidad de interferir al nivel de la interacción entre las presenilinas y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide pueden entonces modular la producción del péptido amiloide Aßl-42 y permitir tratar ciertas afecciones nueurológicas y particularmente la enfermedad de Alzheimer.

Otro objeto de la invención concierne a la puesta en evidencia de una prueba de interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide, y preferencialmente entre el péptido Aßl-42 y el extremo N- terminal de PS2, caracterizado porque comprende al menos una etapa de transferencia de fluorescencia entre dos fluoforos fijados a las moléculas precedentes y una etapa de revelación de la interacción medida por espectrofluorometría. Como se mencionó precedentemente esta prueba es igualmente utilizada para la puesta en evidencia de moléculas inhibidoras de la mencionada interacción, según el procedimiento de detección de la inhibición de la interacción, descrita en la presente solicitud.

La invención tiene aún por objeto toda composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos un polipéptido tal como el definido anteriormente.

Tiene también por objeto toda composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos un anticuerpo ó un fragmento de anticuerpo tal como el definido anteriormente, y/ó un oligonucleótido antisentido, y/ó un ligando tal como el definido anteriormente. La invención tiene igualmente por objeto toda composición farmacéutica que comprenda como principio activo al menos una secuencia nucleotídica tal como la definida anteriormente.

Por otra parte, tiene también por objeto las composiciones farmacéuticas en las cuales los péptidos, anticuerpos, ligandos y secuencias nucleotídicas definidas anteriormente son asociadas entre ellos ó con otros principios activos.

Tiene igualmente por objeto las composiciones en las cuales las secuencias nucleotídicas según la invención son incorporadas en un vector recombinante viral ó no-viral.

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden ser utilizadas para inhibir al menos parcialmente la interacción entre una presenilina y el precursor del ^| péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. Se trata 5 más preferencialmente de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer.

Otro objeto de la presente invención es la utilización de los polipéptidos descritos antes para inhibir al menos parcialmente la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide y de manera preferida la utilización de estos polipéptidos para la obtención de un medicamento destinado al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas y particularmente la enfermedad de Alzheimer.

Para su utilización según la presente invención, los polipéptidos de la invención por una parte ó toda molécula capaz de inhibir al menos parcialmente la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide, las secuencias nucleicas correpondientes por otra parte ó aún los vectores tal como los descritos precedentemente están preferencialmente asociados a uno ó a vehículos farmacéuticamente aceptables para ser formulados en vista de administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, intraocular, transdérmica, etc. De preferencia, son utilizados bajo una forma oral. La forma inyectable puede ser sin embargo contemplada y podrá en particular ser formulada con soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio ó magnesio, etc. Ó mezclas de tales sales) , estériles, isotónicas, ó de composiciones secas, particularmente liofilizadas, que, por adición según el caso de agua esterilizada ó de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables.

Las dosis de vector y en particular de virus utilizados para la administración pueden ser adaptados en función de diferentes parámetros, y particularmente en función del sitio de administración considerado (órgano, tejido nervioso ó muscular), del número de inyecciones, del género a expresar, ó aún de la duración del tratamiento investigado. De una manera general, los adenovirus recombinantes según la invención son formulados y administrados bajo la forma de dosis comprendidas entre 104 y 1014 pfu, y de preferencia 10 a ÍO10 pfu. El término pfu ( (unidad formadora de placas") corresponde al poder infeccioso de una solución de virus, y está determinado por infección de un cultivo celular apropiado, y medido, generalmente después de 15 días, del número de playas de células infectadas. Las técnicas de determinación del título de pfu de una solución viral están bien documentadas en la literatura.

La presente invención ofrece un medio eficaz para tratar las enfermedades para las cuales la interacción entre una presenilina y el precursor del péptidoß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide está implicada y de manera preferida para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas y particularmente la enfermedad de Alzheimer .

La presente invención será más ampliamente detallada con la ayuda de los ejemplos considerados a continuación de manera descriptiva y no limitativa.

Lista de figuras Figura 1: A) Esquema de las construcciones PS2 truncadas B) Expresión en células COSÍ.

Figura 2 : Interacción de las formas truncadas de PS2 con APP.

Figura 3: A) Interacción del N- terminal secretaddo de PS2 (SecPS2NT) pero no de su forma citoplásmica (myc-PS2NT) y de APP extracelular.

B) Puesta en evinencia de la interacción SecPS2NT/APP pero no de myc-PS2NT/APP en medio extracelular.

Figura 4: Interacción de PS2 con la forma SPA4CT del APP pero no con la región citoplásmica del APP (MC45F) .

B) Interacción de PS2 con la forma C100 del APP.

Figura 5: Interacción de PS1 y PS1DC2 con APP y su forma corta: A) Interacción de PS1 con la forma entera de la APP y la forma truncada SPA4CT.

B) Interacción de la forma truncada de PS1 (PS1 ?C2) con el APP.

Figura 6: Interacción de PS1 y de APP en células de insectos .

A) Inmunoprecipitados anti-histidina (etiqueta sobre PS1), reveladdo de la APP.

B) Inmunoprecipitados anti-PSl, revelado de la APP.

C) Inmunoprecipitados inversos anti-APP, revelado de PS11.

Figura 7: Interacción de la forma secretada de PS2NT con el péptido Aß en el medio extracelular.

Figura 8: Reconstitución de la interacción Aß/PS2Nt in vitro sobre filtro de nitrocelulosa.

A) Dosis- dependencia en función de la concentración de PS2Nt.

B) Dosis-dependencia en función de la concentración de Aß.

Figura 9: Inmunoprecipitación anti-histidina.

B) Inmunoprecipitados anti-PSl.

Figura 10: Desplazamiento por el extremo N-terminal de PS2 precediddo de un péptido indicador (SecPS2NT) de la interacción entre PS1 y el fragmento SPA4CT.

Figura 11: Interacción de PS2 NT con el péptido Aßl-42 in vitro puesto en evidencia por la prueba en placa de p6 pocilios (ELISA) .

Figura 12: Interacción de PS2 NT con el péptiddo Aßl-42 puesto en evidencia por la prueba de transferencia de fluorescencia HTRF ("Homogenous Time-Resolved Fluorescence") .

Figura 13: El bloqueo de la interacción APP/ PS1 con SecPS2NT conduce a la inhibición de la producción de péptido amiloide Aßl-42 intracelular.

A) puesta en evifdencia de cómo el bloqueo de la interacción APP/PS1 con SecPS2NT conduce a la inhibición de la producción de péptido amiloide Aßl-42 intracelular.

B) control de cómo la expresión de SecPS2NT no tiene influencia sobre la expresión de los diferentes transgenes .

Figura 14: Detección de la interacción de PS2 con el APP endógeno de las células COS con la ayuda del tratamiento farmacológico de la lactacistina.

Figura 15: Interacción de PS2 y PS2 NT con una segunda región de la APP, diferente del péptido Aß.

Materiales y Métodos A/MATERIALES 1.Construcciones que expresan a las presenilinas La obtención de vectores de expresión (vector huésped, pcDNA3, Invitrogen) en células de mamíferos de las proteínas humanas PS1 y PS2 ha sido descrita precedentemente (Pradier y colaboradores, 1996) . Varias eliminaciones sucesivas por el extremo C-terminal de PS2 han sido generadas (ver figura IA) . Las numeraciones son hchas a partir del codón de iniciación de PS2 como posición 1.

El fragmento de restricción HindIII del vector PS2 (del 5' no-codificante, posición -55, en el sitio interno en la posición 1080) ha sido purificaddo y puesto en ligado con el vector pcDNA3 linealizado por HindIII y tratado con la fosfatasa alcalina. El PS2 truncado así producido (PS2?C1) se extiende del extremo N-terminal aal residuo 361 más 7 residuos aportados por el extremo 3' y comprende entonces las seis primeras regiones transmembranaarias y una gran parte de la desviación hidrófila (Fig ÍA) .

El PS2?C2 ha sido construido por digestión del plásmido PS2 por PstI (sitio interno en posición 679) y ligado con el fragmento PstI correspondiente a la parte 3' no-codificantee del vector PS2. La proteína truncada PS2?C2 se extiende de la posición 1 al residuo 228 de PS2 más 18 residuos suplementarios aportados por el extremo 3' . Incluye las cuatro primeras regiones transmembranarias de PS2.

Una construcción similar ha sido efectuada para PS2 que contiene la mutación N1411, PS2?C2*.

El fragmento de restricción HindIII (-55) /Mscl (590) de la construcción PS2?C2 ha sido a continuación clonado en el vector pcDNA3 tratado por HindIII y cuyo extremo Apal ha sido convertido en extremo libre. Esta construcción PS2?C3 se extiende del extremo N-terminal al residuo 198 más 2 residuos suplementarios que comprenden entonces las tres primeras regiones transmembranarias de PS2.

El fragmento de restricción de PS2?C2. HindIII (-55) /Ncol (504) convertido en extremo libre en su extremo Ncol por tratamiento en el fragmento Klenow del ADN polimerasa ha sido reclonado en el mismo vector pcDNA3 HindIII/ (Apal extremo libre) para construir PS2?C4 que se extiende hasta el residuo 168 de PS2 más tres residuos suplementarios .

La construcción del extremo N- terminal hidrófilo de PS2 ha sido obtenisa por amplificación de la secuencia PS2 con los oligonucleótidos ext5' .

' -CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC-3' (SEC , ID4) (cabalgando el ATG inicial, en anegrilla, e introduciendo un sitio de restricción EcoRI, subrayado) ext3' : '-CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG-3' (SEC ID 5) (introducienddo un codón de detención después del residuo 90 PS2 así como un sitio de restricción Xhol, subrayado) .

Después de clonación en el vector pCRII por el método TA clonando (Invitrogen) , la conformidad del fragmento de PCR ha sido verificada por formación de secuencias. Este fragmento (EcoRI/Xhol) ha sido a continuación introducido en un vector pcDNA3 en fase con una secuencia correspondiente al epítope myc en su extremo N- terminal: mycPS2Nter.

Para no prejuzgar la topologíaa de PS2, el mismo fragmento Nter ha sido reclonado en el vector pSectagB, en fase con la secuencia del péptido indicador de IglB para dirigir la secreción de la proteína pS2ter: SecPS2- Nter.

El extremo C-term de PS2 ha sido construido de forma similar con la ayuda del fragmento de restricción HindIII (1080) /PstI (en 3' no codificante) reclonado en el vector pSecTagB HindIII/PstI, SecPS2ter que se extiende del residuo 361 al extremo C-terminal, ó en el vector pcDNA3myc en fase con el epítope myc.

Asimismo, una construcción truncada de PS1 ha sido obtenida. El vector pcDNA3-PSl ha sido digerido por Pflml (sitio en la posición 636 de la secuencia nucleicaa ccodificantee de PS1) en Xhol en el 3' no codificante de la secuencia de PS1. Estos sitios han sido transformados en extremo libre por tratamiento de la T4 ADN polimerasa. El fragmento vector, purificado sobre gel de agarosa, ha sido religado sobre sí mismo para proporcionar un vector de espresión de un PS1 truncado que se extiende del N-ter de PS1 hasta el residuo Ile213 (después del 5ava región transmembranar) más 12 residuos ssuplementarios. Esta construcción corresponde a la quimera ?C2 y es llamada PS1 ?C2. 2. Construcción que expresa el APP 2.1. Construcciones APP Las diferentes construcciones APP ccompletas (isoforma 695) y SPA4CT (los 100 últimos residuos del APP (ácido aminado 597 a 695) precedidos de un péptido indicador para inserción en ela membrana) han sido descritos precedentemente (Dyrks y colaboradores, 1993) .

Los vectores, para la expresión de ClOO y de la región citoplásmica del APP, han sido obtenidos de la manera siguiente: los cDNA correspondientes han sido obtenidos por amplificación enzimática del ADN (PCR ("Polimerase Chain Reaction") ) utilizando, como cebo de síntesis, los oligonucleótidos siguientes: Para el ClOO: los oligonucleótidos 8172 y 8181; para la región citoplásmica del APP: los oligonucleótidos 8171 y 8181.

Oligo 8172 5' CAAAGATCTGATGCAGAATTCCGACAT 3' (SEC ID 6) que contiene: un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Bglll (subrayado) - la secuencia codificante para los ácidos aminados 597-602 del APP (en negrilla) [numeración APP de 695 ácidos aminados]. oligo 8181 5' CAAGCGGCCGCTCATCCCTGGGCAGCGGCGGCCG TGTAGTCGCCGTTCTTGCATCTGCTC 3' (SEC ID 7) que contiene: - un sitio de reconocimiento para la enzzima de restricción Notl (subrayado) la secuencia complementaria de la secuencia codificante para los ácidos aminados 691-695 del APP (een negrilla) [numeración APP de 695 ácidos aminados]. - la secuencia complementaria a la secuencia Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys correspondiente al epítope FLAG (en cursiva) .

Oligo 8171 5' CAAAGATCTAAGAAACAGTACACATCC 3' (SEC ID 8), que contiene: - un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Bglll (subrayado) . - la secuencia codificante para los ácidos aminadoss 650-655 del APP (en negrilla) [numeración APP de 695 ácidos aminados].

Los productos de amplificación enzimática del ADN han sido clonados en el vector pCRII. La secuencia nucleotídica ha sido verificada por el método de las determinaciones específicas de ADN.

Los cDNA son a continuación introducidos por ligado en el plásmido de expresión derivado del plásmido pSV2 y que contiene, en el mismo marco de lectura, un epítope MYC. 2.2.Construcción de las formas solubles del APP a-s-APP y ß-sAPP.

Los ADNc correspondientes a las formas secretadas del APP que se terminan en los sitios a- y ß- de división han sido obtenidos por PCR.

El oligonucleótido 1: 'ccaatcgatggctaCATCTTCACTTCAGAG-3' (SEC ID 9) introduce: - un codón de detención (secuencia complementaria inversa subrayada) después de la posición 1788 del APP que corresponde al sitio de división ß. - y un sitio de restricción Clal.

El oligonucleótido 2: '-ccatcgatggctaTTTTTGATGATGAACTTC-3' (SEC ID 10) introduce: - un codón de detención (secuencia complementaria inversa subrayada) después de la posición 1836 del APP que corresponde a un sitio de división a. - y un sitio de restricción Clal.

El oligonucleótido 3: '-CCGTGGAGCTCCTCCCG-3' (SEC ID 11), ccomún para las dos formas, corresponde a la región 1583 a 1600 del APP que incluye el sitio de restricción interno del APP Sacl (subrayado) .

El ADNc del APP ha sido amplificado por PCR utilizando los pares oligo3-oligol y oligo3-oligo2 para ß-sAPP y a-sAPP respectivamente. Los productos de amplificación han sido sub-clonados como precedentemente en pCRII y las secuencias verificadas por formación de secuencias. Para cada uno, el fragmento de restricción Sacl-Clal han sido purificados y reclonados en el vector de expresión APP (ver lo anterior) digerido el también por Sacl-Clal para reemplazar la parte C- terminaal del APP por los fragmentos C-terminales de ß-sAPP y a-sAPP respectivamente y reconstituir las proteínas completas. 3.Construcciones de baculovirus La obtención del vector de transferencia para baculovirus que codifica para la proteína humana PS1 ha sido realizada a partir del vector de expresión para células de mamíferos (Pradier y colaboradores, 1996) . El ADNc que codifica para la proteína PS1 ha sido extraído por una digestión por las enzimas de restricción Xhol y Notl, luego clonaddo en el plásmido de transferencia pAcHTLB (proteína de fusión 6Histidinas) y pAcSG2 (proteína nativa) . La obtención de baculovirus recombinantes se efectúa según el protocolo del proveedor (Pharmigen) y consiste en cotransfectar 2 X 106 células de insectos (sf9) ccon 1 g de plásmiddo de transferencia que contenga el gen de interés y 0.5 µg de ADN viraal (Baculogold) . Después de 5 días a 27 °C, las células son raspadas, luego centrifugadas, el sobrenadante es utilizado como ssolución madre viral para la amplificación y la determinación del título viral, la expresión de la proteína es contemplada por manchado western sobre asiento celular.

La obtención del baculovirus que expresa el APP humano (695) ha sido descrito precedentemente (Essalmani y colaboradores, 1996) .

Para el estudio de la expresión de PS1 y de APP, las células sf9 son coinfectadas a una M.O.I. de 2 de los baculovirus que expresan el APP humano (695), la proteína humana Presenilina 1 (PS1), ó PS1 con un tag 6 histidina en N terminal (6HisPSl), ó la proteína de control de pseudomonaa pútrida XylIE con un taag 6 histidina en N terminal (6HisXylE), luego solubilizadoss por un tampón 10 mM de Tris, 130 mM de NaCl, Tritón al 1 % X 100, NP 40 al 1 % , pH 7.5.

Las proteínas solubilizadass sson inmunoprecipitadas por un anticuerpo antiHistidina (A), antiPSl (1805) (B) , ó antiAPP (2C1) (C) . La presencia del APP ó de PS1 ha sido revelada por manchado Western con el anticuerpo antiAPP aCT43(A), 22C11 (B) , ó el anticuerpo antiPSl 95/23 (C) .

Las fracciones solubilizadas que contienen el APP, PS1 ó 6HisPSl son mezclados, luego inmunoprecipitados en presenciaa de anticuerpos anti Histidinas ó antiPSl durante una noche a 4 °C. La coinmunoprecipitación del APP es revelada después de manchado western con los anticuerpos aCT43 ó 22C11. 4.Los Plásmidos Los plásmidos utilizados para la invención son los siguientes : pcDNA es un plásmido comercial (In Vitrogen) utilizado para la clonación y la expresión en células de mamíferos de las secuencias PS1 y PS2 y de sus formas truncadas . - pCRII es un plásmido comercial (IN Vitrogen), utilizado para la clonación de fragmentos de PCR. - pSecTagB es un plásmiddo comercial (In Vitrogeen) , utilizaddo para la clonación y la expresión en células de mamíferos de ADNc a los cuales son re-añadidos el indicador de secreción (péptido indicador Ig K) . pSV2 es un plásmido comercial (Pharmacia) , utilizado para la clonación y la expresión en células de mamíferos de ADNc. - pAcHTLB es un plásmido comercial (Pharmigen) , para la inserción de un epítope (His) 6 a ADNc y la recombinación homologa con baculovirus. - pAcSG2 es un plásmido comercial (Pharmigen) , para la recombinación homologa con baculovirus. - pET29a es un plásmido comercial (Novagen) , para la expresión de ADNc en bacterias.

B/METODOS 1. Transfección de células El método establecido para las células COSÍ ó las células CHO, consiste en utilizar un lipofectante en una proporción de 1 por 8 (en peso) en relación al ADN y un péptido sintético Hl (secuencia: KTPKKKKAKKPKTPKKAKKP) en la misma proporción a fin de optimizar la compactación del ADN y la eficiencia de transfección. Este método descansa particularmente sobre la neutralización de las cargas de los fosfatos del ADN por las cargas positivas del lipofectante.

Las células COSÍ son cultivadas en incubadora a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de C02 en el medio DMEM ("Dulbecco' s Modified Eagle' s Médium") que contiene 4.5 g/1 de glucosa (Gibcco-BRL) suplementado con 3 % de glutamina, 1 % de penicilina-estreptomicina y 10 10 % de Suero de Ternera Fetal.

La víspera de la transfección, las células son sembradas a una densidad de 2.5 X 106 células por caja de 100 mm. El día de la transfección las células son enjuagadas 2 veces por PBS (solución salina reguladora de fosfato) y una vez en OptiMEM (composición patentada; Gibco-BRL) para un habituamiento de al menos 15 minutos en incubadora.

Por equivalente-caja de 100 mm, 8 µg de ADN plasmídico en el totaal son añadidos a 300 µl de OptiMEM y 64 µg de péptido Hl . Después de haber vorticeado vigorosamente durante 10 segundos, se espera 5 minutos y la lipofectamina (32 µl, ó sea 64 µg) diluida en 300 µl de OptiMEM es añadido a la mezcla precedente. El conjunto es nuevamente vorticeado vigorosamente luego dejado 30 minutos reposaar. Cinco mililitros de OptiMEM son añadidos por tubo y la mezcla vorticeada es colocada sobre las células (cuyo medio ha sido previamente aspirado) . Las células son entonces colocadas en incubadora durante 4 horas, en el término de los cuales la mezcla es reemplazada por medio completo. 2. Lisis de las células y dosificación de las proteínas Las células son frecuentemente usadas 48 horas después de la transfección (al máximo de expresión habitual) . El tampon de lisis ccontiene 10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM de EDTA, 1 % de Tritón X 100, 1 % de NP40 y un cocktail de inhibidores de proteasas (Complete©, Boehringer-Mannheim) . Para cada placa, después de enjuague al PBS, 800 µl del tampón frío son añadidos. Los lisadoss sufren entonces una sonicación seguida de una agitación con barra magnética a 4 °C durante una noche. Una centrifugación de 30 minutos a 15000r.p.m. separa el tipé del sobrenadante. Las proteínas solubles son entonces dosificadas según el equipo BCA (Pierce) a fin de poder normalizar las experiencias siguientes. 3. Inmunoprecipitaciones Los anticuerpos diriigidos contra el péptido del N-ter de PS2, 95041, (Blanchard y colaboradores, 1997) y contra los veinte primeros ácidos aminados de PS1 (Duff y colaboradores, 1996) han sido obtenidos en el conejo por inmunización con péptidos sintéticos. Para la inmunoprecipitación, 100 µg de proteínas son diluidas en 400 µl de RIPA modificada (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris pH 8.0, 1 % de Tritón X100 en volumen, 1 % de NP40 en volumen) . Treinta microlitros de suspensión de proteína A Sepharosa (0.1 % peso en volumen, en solución de PBS) y 3 µl de anticuerpos son añadidos. Las suspensiones son mezcladas lentamente sobre un agitadorr rotatorio a 4 °C durante una noche. El complejo de proteína A Sepharose es lavado 3 veces con 0.5 ml de RIPA modificado y una vez con 0.5 ml de tampon de lavado "Wash C" (10 mM de Triss pH 7.5) . 4. Inmunotransferencia Las muestras (usados de células) son desnaturalizadas en un volumen igual de tampón depósito (125 mM de Tris pH 6.8, 4 % peso en volumen de SDS, 20 % de glicerol, 0.02 % de Azul de Bromofenol, 50 mM de Ditiotritol) a 95 °C durante 5 minutos. Para el análisis de la expresión de las presenilinas, las muestras son desnaturalizada en presencia de 8 M de urea y a 37 °CC a fin de evitar la agregación aproppiada en las presenilinas a 95 °C.

Las muestras son depositadas sobre geles Tris-Glicina (Novex) , con un porcentaje de acrilamida diferente según el peso molecular a discriminar. Un marcador de Peso Molecular es igualmente depositado (Broad Range, BioRad) . La migración' tiene lugar durante aproximadamente 2 horas a 100 volts constantes en un tampon SDS IX final (novex) . El gel es a continuación transferido sobre una membrana de nitrocelulosa ó de PVDF (Tampon de transferencia IX final (Novex) con 10 % de metanol) durante 2 horas a 150 mA constantes.

Después de transferencia, la membrana es bloqueada durante 2 horas a temperatura ambiente en 50 ml de PBS-T (PBS ccon 0.5 % de Tween) que contiene 2 % de leche descremada (merck) . El anticuerpo primario (diluíddo a la concentración óptima del orden del l/1000e al l/5000e, en PBS-T con ó sin 2 % de lech descremada) es dejado sobre una noche a 4 °C. Después de un breve lavado en PBS-T, la membrana es incubada 45 minutos en presencia del segundo anticuerpo (IgG anti-ratón ó anti-conejo según el caso, acoplado a la peroxidasa de Raifort) diluido al l/5000c en un tampon llamado "ECL" (Triss 20 mM, NaCl 10 M, Tween 0.1 %) .

La membrana es entonces enjuagada 4 veces 15 minutos en el tampon "ECL". Puede ser revelada por el reactivvo ECL (Amersham) constituido de 2 tampones para mezclar extemporáneamente en volúmenes iguales. Diferentes exposiciones de una película fotográfica (Hyperfilm ECL: Amersham) son efectuadas, seguidas de un revelado.

. Fijación on vitro de PS2 NT con el péptido Aß amiloide .1. Producción de la proteína recombinante PS2 NT en bacteria Para la creación de un vector de expresión bacteriana de PS2NT (amino ácidos 1 a 87), el ADNc de PS2 ha sido amplificado por PCR con los oligonucleótidos 3' (CCGCTCGAGGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG) y 5' (CCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC) . El fragmento resultante ha sido clonado en pCRII y la secuencia confirmada. Este fragmento ha sido a continuación sub-clonado en el vector pET29a (Novagene) en fase con la secuencia de la etiquetaa S-tag. La proteína ha sido producida en la bacteria BL21. Después de inducción en el IPTG por 5 horas, las bacterias han sido recuperadas por centrifugación (10 minutos a 6000 r.p.m.) y el asiento celular disuelto en tampon RIPA (volumen calculado multiplicando el DO del cultivo después de inducción por el volumen de cultivvo dividido por 23) . Las bacterias han sido usadas por sonicación y el usado centrifugado a 13000 r.p.m. durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante (extracto total) ha sido utilizado para los estudios de fijación.

La proteína recombianante PS2NT ha sido también purificadaa del extracto total sobre columna de níquel (etiqueta poli-His aportada en el vector pET29a) como describió el proveedor (Novagene) . .2. Prueba de fijación PS2NT/Aß42 ssobre membrana de nitrocelulosa El péptido Aß sintético (en solución) ha sido depositaddo sobre membrana de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell) utilizando un aparato de manchado dot de 96 pocilios. Después de depósito, el filtro ha sido bloqueado (hacia los sitios no- específicos de fijación de proteínas) con el reactivo de bloqueo gelatina (Novagen) diluido a la décima en TBST. Después de bloqueo, eel filtro ha sido recolocado sobre el aparato de manchado-dot y el extracto bacteriano PS2NT añadido en los pocilios para una incubación de 2 h a temperatura ambiente. Como control, un extracto bacteriano que contiene el plásmido vacío pET29 ha sido utilizado sobre pocilios en duplicado. El filtro ha sido a continuación lavado una vez con tampon RIPA, luego retirado del parato y lavado tres veces con PBST (15 minutos por cada lavado) . La detección de la etiqueta S-tag ha sido a continuación efectuada como prescribió el proveedor (Novagen) con un substrato colorimétricco. La cuantificación de la reacción colorimétrica (precipitado) ha sido efectuada por exploración óptica del filtro y cuantificación de la intensidad en cada pocilio por el lógico Tina 2.1 (Raytest) . .3. Prueba de interacción de PS2NT/Aß42 en formaato ELISA El péptido Aß (1-40 y 1-42) sintético (100 µl, 2 µg/ml) es incubado durante la noche en placas de 96 pocilios por fijación sobre el plástico. Las placas son enjuagadas dos veces con PBS y los sitios de fijación no específicos son saturados por incubación con 5 % (peso en volumen) de aalbúmina de suerro de ternera en PBS. La proteína recombinante purificada (según el protocolo descrito en 5.1), PS2NT, diluida en tampon (25 mM de Tris/HCl, pH 7..5, 0.5 % de Tritón X-100, 0.5 % de NP40) es añadida e incubada durante 4 h, a temperatura ambiente. Después de dos enjuagues en PBS-Tween 0.5 %, la proteína PS2NT retenida sobre la placa (en interacción con el péptido Aß) es revelada por incubación con la proteína fijadora ciel S-Tag acoplada a la fosfatasa alcalina como precedentemente. La detección de la señal es efectuada en un espectrofotómetro a 450 nm. .4. Prueba de interacción PS2NT/Aßl-42 en formato HTRF ("Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) La proteína purificada PS2NT (producida según el protocolo descritoo en 5.1) ha sido marcada con la ayuda del fluoforo criptato de Europium (PS2NT-K) . Los péptidos Aßl-40 y Aßl-42 han sido sintetizados con una biotina y un brazo separador de 3 ßalaninas (ó de 3 usinas) en su extremo N- terminal (hacia el inicio de la posición 1 de los péptidos Aß) y dos Argininas (R) en su extremo C-terminal para facilitar la síntesis, péptidos biot-3K-Aß40R y biot-3K-A-ß42R.

La reacción de interacción de PS2NT-K ccon biot-Aß40 ó biot-Aß42 es efectuada en un tampon de 10 mM de "HEPES, pH = 7.2, que contiene 150 mM de NaCl, 3.4 mM de EDTA y.3 mM de CHAPS (detergente) . La proteína PS2NT marcada (concentración final 6 nM, ó sea 40 µl de solución inicial a 15 nM) es incubada con el péptido biot-Aß40 ó biot-Aß42 (concentración final 2 µM, ó sea 40 µl de solución inicial a 5 µl de tampon) durante 10 minutos seguido por la adición de estrepatvidina marcada con XL665 (XL665 es una aloficocianina reticulada, CisBio International) a la concentración de 8 µg/ml (ó sea 100 µl de solución inicial a 16 µg/ml) en un tampon HEPES 100 mM pH = 7 que contiene 400 mM de KF, 133 mM de EDTA y 1 g/1 de BSA. La reacción es incubada, ya sea 4 h a temperatura ambiente, ó bien 24 horas a 4 °C y las placas son leídas sobre un contador "Packard Discovery" que mide por una parte la emisión del criptato de Europium a 620 nm después de excitación a 337 nm ypor otra parte la emisión de la XL665 a 665 nm después de transferencia de la fluorescencia a 620 nm por el criptato de Europium áttb sobre la XL665. La formación del complejo XL665- 5 estreptavidina/biot-Aß42/PS2NT-criptato conduce a una transferencia de fluorescencia del criptato hacia la XL665 que es medida a 665 nm por el contador. En ausencia de formación de un complejo XL665-estreptavidina/biot- Aß42/PS2NT-criptato, el criptato de Europium emite fluorescencia a 620 nm. • EJEMPLOS Ejemplo 1. Interacción entre los APP y PS2 y 15 cartografía de la zona de interacción sobre PS2.

Este ejemplo tiene por objetivo disminuir la zona de interacción sobre PS2 y de poner en evidencia una interacción entre la mencionada región y el APP. 20 La interacción entre las proteínas APP y PS2 en células de mamíferos es ejemplificada en la figura 2. El usado de células COS transfectadas con PS2 y APP está sometido a una inmunoprecipitación con un anticuerpo dirigido contra el N-term de PS2 (95041, Blanchard y * colaboradores, 1997) . El inmunoprecipitado es a continuación analizaddo por inmunotransferencia con un anticuerpo contra el APP. El APP es claramente detectado en los inmunoprecipitados de las células co- transfectadas con APP y PS2 pero no en ausencia de PS2 (Fig. 2, pista 6 en relación a la pista 7) como precedentemente se descibió (Weideman y colaboradores, 1997) . Para cartografiar la zona de interacción entre estas dos proteínas, varias formas truncadas de PS2 han sido construidas. A fin de conservar la topología membranariaa de PS2 determinadaa en generaal por la parte N-terrm de las proteínas membranarias, de las truncaciones progresivas del extremo C-terrm de PS2 han sido producidaas terminándose después de diferentes regiones trans embranarias TM6 (PS2?C1), TM4 (PS2?C2), TM3 (PS2?C3) y TM2 (PS2?C4), esquema de la figura ÍA. El extremo N-term hidrófilo (87 residuos) de PS2 ha sido también construido bajo la forma citoplásmica (secuencia nativa) ó bajo la forma secretada por la inserción del péptido indicador de la cadena Igk. La expresión de estas diferentes formas es ejemplificada en la figura IB, reveladaa con la ayuda del anticuerpo anti-PS2 (95041) . Las construcciones que posean regiones hidrófobas presentan además bandas correspondientes a las formas monoméricas en los pesos moleculares esperados (que forman aquídobletes en proximidad) , formas diméricas y agregados de altos pesos moleculares típicos de PS2 (Fig IB, pistas 3-5) . En particular para PS2 completo, solos estos agregados son detectables en esta figura mientras que la forma monomérica no es detectable (pista 6) . Las dos construcciones del N-term hidrófilo de PS2: mycPS22Nt y SecPS2Nt dan lugar a las bandas en los pesos moleculares esperadoss (Fig IB, pistas 1 y 2). La construcción SecPS2Nt es igualmente secretada en el medio extracelular (Fig 3B, pista 2) mientras que la construcción mycPS2Nt es, citoplásmica.

Estas construcciones han sido contrafectadas individualmente con el APP. La fracción detergente-ssoluble de los usados celulares ha sido inmunoprecipitadaa con el anticuerpo dirigiddo contra el N-term de PS2 y los inmunoprecipitados analizadoss por inmunomanchaddo . Como con la PS2 completaa, el APP es detectablee en los inmunoprecipitadoss con todas las formas truncadas de PS2, PS2?C2 a PS2?C4 (Fig. 2, pistas 3-5) que demuestran la interacción entre APP y las formas que contienen el N- term de PS2. Esta interacción con el APP es conservada con la construcción N- term de PS2 bajo su forma secretada (Fig. 2, pista 2) que demuestra que el anclajee de PS2Nt en la membrana lipídica no es necesaria para esta interacción. Por oposición, la forma citoplás icaa mycPS2NT no interactúa con APP (Fig. 2, pista 1) .

La experiencia inversa de inmunoprecipitación por un anticuerpo anti-APP y de la detección por el anticuerpo N-term de PS2 ha permitido confirmaar la interacción entre el APP y SecPS2Nt en condiciones experimentales diferentes .

Een el medio de cultivo de las células co-transfectadas con APP y Sec PS2Nt, una interacción entre las dos proteínas es igualmente demostrada por co-inmunoprecipitación (Fig. 3A, pista 4 y Fig. 3B, pista 2) . La presencia de esta interacción en el medio, demuestra que el complejo APP/PS2Nt es relativamente estable en el curso del proceso de secreción.

Ejemplo 2. Interacción entre el APP y el PS2 y cartografía de la zona de interacción ssobre el APP.

Este ejemplo tiene por objetivvo determinar la zona de interacción sobre el APP y de poner en evidencia una interacción entre la mencionada región y la presenilina 2.

Para este efecto, formas truncadas del APP han sido utilizadas para delimitar la zona de interacción sobre el APP. Una construcción que contiene los 100 últimos residuos del APP bajo el control ó no de un péptiddo de secreción (SPA4CT y ClOO, Dyrks y colaboradores, 1993) y una construcción que contiene solamente la región citoplásmica (los 45 últimos residuos del APP) han sido utilizados y su presencia detectada con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra la región citoplásmica del APP (aCT43, Stephens y Austen, 1996) . En las células cotransfectadas ccon PS2, una interacción de SPA4CT pero no de la región citoplásmica del APP con PS2 ha podido ser puesto en evidencia (Fig 4A, comparar pistas 4 y 5) . La interacción de PS2 con la construcción ClOO (sin señal de secreción) ha podido también ser demostrado (Fig 4B, pista 7) . También asociando la región citoplásmica del APP a la membrana en una construcción quimérica con el receptor alfa del IL2, ninguna interacción con PS2 ha podido ser observada. Este ejemplo demuestra que existe una interacción con SPA4CT (residuos 597 a 695 del APP) pero no con la región citoplásmica (resíduoss 651 a 695) que indican entonces que sobre el APP, la región del Aß (residuos 597 a 637) y el resto del segmento transmembranar (hasta el residuo 650 son suficientes para la interacción con PS2.

Ejemplo 3. Interacción día PS1 con el APP y cartogra ía inicial .

Este ejemplo tiene por objetivo determinar la zona de interacción sobre PS1 y validar la interacción entree la mencionada región y el APP.

Por analogía a los ressultados obtenidos para PS2 (ejemplos 1 y 2) , el estudio de la interacción de PS1 con el APP ha sido realizada en el mismo sistema celular COSÍ. Después de inmunoprecipitación con un anticuerpo dirigido contra los 20 últimos ácidos aminados de PS1 (Duff y colaboradores, 1996), el SPA4CT, el fragmento C-ter inal del APP, ha podido ser detectado en los precipitados (Fig. 5A, pista 4) . El APP también interactúa con PS1. También, la forma truncada de PS1, PS1?C2 (1-213) , interactúa con el APP (Fig. 5B, pista 4). Estos primeros datos nos permiten visualizar que las regiones de interacción entre el APP y PS1 deben ser vecinas de las ejemplificadas precedentemente con PS2.

Para verificaar la validez y la generalidad de esta interacción PS1/APP, un sistema celular diferente ha sido utilizao, en el cual las células de insectos han sido ?jj infectadas por baculovirus recombinantes que expresan la PS1 con ó sin etiqueta His6 y el APP (ver Materiales y Métodos) . El estudio de los lisados celulares ha permitido detectar el APP en los inmunoprecipitados antiHisd (para la PSl-His6, Fig 6A, pista 4) ó anttiPSl (para la PS1 con ó sin His6, Fig 6B, pistas 4 y 5) cuando las células son co-infectadas con los dos tipos de virus recombinantes pero no cuando una sola de las proteínas es expresada (pistas 1, 2 y 3 correspondientes) . Inversamente, en los inmunoprecipitados anti-APP, las proteínas PS!-His6 y PS1 son detectables (Fig 6C, pistas 4 y 5) para las dobles infecciones. Esta experiencia permite confirmar la interacción en el sentido inverso con anticuerpos diferentes.

Ejemplo . Interacción de Aß y PS2 en células 20 Siendo dado que la región de interacción entre el APP y la PS2 i plicaa sobre el APP, una región que incluye el péptido amiloide (de 595 a 635) y sobre la PS2, su región N- term hidrófila, se ha demostrado en este ejemplo que esta última interactúa directamente con el péptido amiloide (Aß) producido por células. La expresión de SPA4CT (correspondiente a los 100 últimos residuos de la APP precedidos de un péptido indicador) en fl| células COS cconduce a una fueerte producción del péptido 5 amilioide, en parte ya que SPA4CT es considerado como el precursor biológico del Aß. Las células COS han sido transfectadas con SPA4CT solo, SPA4CT y SecPS2Nt ó con SecPS2Nt solo. Los medios extracelulares correspondientes han sido inmunoprecipitados con el 10 anticuerpo antiPS2 y el péptido Aß ha sido detectadoo ^^ gracias al anticueerpo específico W02 (Nida y colaboradores (1996) J. Biol. Chem. 271, 22908-914) (Fig. 7). El péptido Aß es identificado solamente para las células contransfectadas con SecPS2Nt y SPA4CT como una 15 banda de ligera densidad (Fig. 7, pista 1) pero no con los controles individuales (pistas 2 y 3) . Por otra parte, una banda suplementaria de aproximadamente 40 kDA es también detectada de forma específica para las células doblemente transfectadas. Después de lavado del filtro y 20 detección con el anticuerpo PS2, parece que una banda del mismo pesoo molecular es igualmente PS2-inmunoreactiva (Fig 7, pista 4) . Esta banda está también presente para las células transfectadas con SecPS2Nt como se esperó. Así, en las células doblemente transfectadas, esta banda 25 representa un complejo SDS-estable entre SecPS2Nt y el Aß, pudiendo confirmar la interacción entre estas dos entidades. La ligera diferencia de masa aportada por el péptido Aß (4kDa) explicaría que no haya diferencia de (fl talla detectable con las células transfectadas con SecPS2Nt solamente. Los resultados de estas experiencias permiten concluir que la forma secretada de PS2 (secPS2Nt) inetractúa in vitro con el péptido Aß (residuos 597- 637 del APP 695) . ^ 10 Ejemplo 5. Reconstitución de la interacción de A] y de PS2Nt en pruebas in vitro sobre membranas de nitrocelulosa.

Este ejemplo tiene por objetivo demostrar la 15 reconstitución de la interacción de PS2Nt-APP (A ]) in vitro. mU Para confirmar la interacción entre el péptido Aß y PS2Nt (extremo N- terminal de PS2) , una prueba de fijación in vitro ha sido desarrollada. Una proteína de fusión PS2Nt que contiene el péptido etiqueta/marcador S (S-tag) en su extremo N-terminal ha sido construido y expresado en bacteria. Los péptidos Aß?_40 y Aßa-42 han sido depositados sobre membranas de nitrocelulosa que han sido incubadas en presencia de un extracto bacteriano que expresa la proteína PS2Nt. El S-tag ha sido a continuación revelado por la proteína fijadora del S-tag acoplado a la fosfatasa alcalina y por reacción colorimétrica. La proteína S-tag-PS2Nt se fija bien ssobre los péptidos Aß en la prueba in vitro (Fig 8A) . Como controles, duplicados han sido incubados en presencia de un extracto bacteriano que no expresa más que el péptido S que es utilizado ccomo nivel de fijación no- específico sobre el péptido Aß (formas 1-40 y 1-42) . Diluciones estériles del extracto bacteriano permiten establecer que esta fijación es dosis- dependiente y saturable. En esta experiencia, la fijación parece ser más importante sobre el Aß?_42 que sobre el Aß?_40 con sin embargo una cierta variabilidad. Por ejemplo, la fijación de PS2Nt es dependiente de la dosis de Aß depositada sobre la membrana, ya que Aß?-40 y Aß?-42 presentan valores equivalentes de fijación.

Este ejemplo proporciona entonces una demostración de la reconstitución de la interacción PS2Nt-APP (Aß) in vitro entre Aß sintético y la PS2NT de origen bacteriano. Siendo daddo que las mutaciones patológicas de PS2 conducen a un aumento de la proporción Aßl-42/Aßl-40 produce numerosos ssistemas y que por otra parte, hay interacción física entre PS2 y APP, parece que esta interacción física podría estar implicada en la producción del péptido Aß?_42. Así, la inhibición de esta interacción constituye una aproximación terapéutica extremadamente original para la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 6. Prueba de interacción Aß42/PS2NT een formato de 96 pocilios (tipo ELISA) . Fig. 11 El ejemplo 5, proporciona resultados que demuestran la interacción directa entre el péptido Aß y la proteína PS2NT sobre membrana de nitrocelulosa. Este ejemplo tiene por objetivo confirmaar las informaciones del ejemplo 5 t describir la puesta en evidencia de la interacción en un formato de placas de 96 pocilios. El péptido Aß (Aß40 ó Aß42) es fijado por incubación sobre placas de 96 pocilios plástica. Las placas son a continuación incubadas con la proteína PS2NT recombinante. Después de enjuagues, la detección de la interacción (Aß/PS2NT) se hace por fijación de la proteína fijadora del S-tag en los pocilios de revelación colorimétrica. PS2NT se fija de forma dosis-dependiente sobre el péptido Aßi_42 (Fig 11) pero no sobre el péptido Aß?-40 ó sobre el péptido de secuencia invertida Aß40-?, ni sobre otro péptido amiloidógeno, la amilina. Las cantidades de péptidos Aß?_ 2 ó Aß?-40 fijados sobre las placas son idénticas como se verificó por inmunodetección) . La constante de fijación de PS2NT sobre Aß42 es de 0.18 µM. La especificidad de PS2Ntpara la forma Aß42 del péptido en relación a Aß40 no fl) había sido más que sugerida en el ejemplo 5. Este ejemplo 5 establece esta especificidad que es perfectamente reproductible en la presente prueba.

Este formato de prueba de interacción Aß42/PS2NT permite entonces visualizar fácilmente una prueba de M| 10 cribaje de moléculas que inhiben esta interacción.

Ejemplo 7. Prueba de interacción Aß42/PS2NT en formato HTRF En los ejemplos 5 y 6, la interacción directa entre el péptido Aß42 y la proteína PS2NT ha sido demostrada por una parte sobre membrana de nitrocelulosa y por otra parte sobre placas de 96 pocilios (tipo ELISA) .

Este ejemplo tiene por objetivo confirmar estas informaciones y describe la puesta en evidencia de la interacción en fase líquida/homogénea utilizando la técnica de transferencia de la fluorescencia.

El principio de la prueba en Materiales y Métodos (5.4) descansa sobre la transferencia de fluorescencia.

La proteína recombinante PS2NT marcadaa al criptato de Europium (PS2NT-K) interactúa con el péptido biot-Aß42 como lo muestra la figura 12 (barra No. 3) . Esta señal es disminuida y lueggo la interacción PS2NT-K/biot-Aß42 es desplazadaa por un exceso de PS2NT no marcada (C150=400 nM) . La señal de fluorescencia detectada es estable en el tiempo: de 4 h a temperatura ambiente a 24 h a 4 °C (según las condiciones seleccionadas, descritass en Materiales y Métodos) .

Esta interacción es dosis-dependiente para el péptido biot-Aß42 (zona de linearidad de la señal de 0 a 2.5 µM) y para PS2NT-K (zona de linearidad de la señal de 0 a 7.5 nM) . Como lo indica la figura 12, barra 5, no hay interacción de PS2NT-K con el péptido biot-Aß40 que aporta un elemento suplementario de especificidad. La especificidad de PS2NT para la forma Aß42 del péptido en eralción a Aß40 que no había sido más que sugerida en el ejemplo 5 es entonces confirmada en el ejemplo 6 y el presente ejemplo.

Esta prueba HTRF de interacción entre PS2NT y Aß42 (que refleja la interacción APP/PS en células) permite entonces la identificación de moléculas químicas que inhiben esta interacción por un cribaje a alto flujo.

Ejemplo 8. Reconstitución de la interacción APP/PS1 in vi ro Este ejemplo tiene por objeto demostrar que la interacción entre las proteínas completas APP y PS1 puede ser recreada a partir de Usados celulares diferentes, mezclados únicamente para poner en evidencia la interacción.

El sistema de expresión baculovirus que permite la expresión de grandes cantidades de proteínas recombinantes, los usados de células infectadas individualmente por cada uno de los tres virus han sido utilizados como fuente de proteínas APP, PS1 y PSl-His6. Las fracciones solubilizadas que contengan el APP, PS1 ó 6HisPSl son mezclados, luego inmunoprecipitados en presencia de anticuerpo anti Histidinas ó antiPSl durante una noche a 4 °C. El APP es claramente detectado en los inmunoprecipitados (Fig 9A, pista 3 y Fig 9B, pista 3) que demuestran la interacción APP con PSl-His ó PS1 es reconstituida in vitro por incubación de dos proteínas. La APP solo parece ser ligeramente precipitado por el anticuerpo anti-PSl (Fig 9B, pista 1) pero no con el anticuerpo anti-His que confirma la especificidad de la interacción en este caso. Estos resultados permiten el á ) ' ajuste de una prueba de interacción in vitro de las dos proteínas completas APP y PS1.

Ejemplo 9. SecPS2Nt bloquea la interacción de APP y PS1 en células transfectadas.

Se ha demostrado en los ejemplos precedentes que APP interactúa con PS1 de forma parecida a PS2 y que por esta ésta última, la construcción SecPS2Nt basta para la interacción con APP. Este ejemplo tiene por objetivo evaluar si la fijación de SecPS2Nt sobre el APP puede bloquear la interacción con PS1 de forma cruzada (heteróloga) . En el sistema COSÍ, el SPA4CT (correspondientee a los 100 últimos residuos del APP precedidos de un péptido indicador) puede ser detectado en los inmunoprecipitados anti-PSl de las células que expresan SPA4CT y PSlwt ó PS1 mutante, PS1*, (Fig 10a, pistas 1 y 2) . Además, cuando SecPS2NT es igualmente co- transfectado, la señal de SPA4CT casi desaparece en los inmunoprecipitados anti-PSl (Fig 10A, pistas 3 y 4) . Después de la inmunoprecipitación anti-PSl, los sobrenadantes (fracción no-relacionada a la proteína A sepharose) han sufrido una segunda inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-PS2. El SPA4CT es claramente detectado en las células co-transfectadas con PS1 y SecPS2Nt (Fig 10B, pistas 3 y 4) que demuestran que en estas células, SecPS2Nt fijándose, ha desplazado la fijación de SPA4CT sobre PS1. Esta experiencia nos permite entonces de concluir que SecPS2Nt es una molécula capaz no solamente de fijarse sobre APP, pero también de desplazar la fijación de APP sobre PS1 y verosímilmente PS2. SecPS2Nt puede entonces en células servir de señuelo para bloquear la interacción APP con las dos presenilinas, PS1 y PS2. En efecto, los resultadoos de la cartografía de la interacción PS1/APP, confirman que las zonas de interacción puestas en juego son similares a las de PS2.

Ejemplo 10. El bloqueo de la interacción APP/PS1 conduce a la inhibición de la producción del péptido amiloide Aß42 intracelular.

El ejemplo precedente demuestra que la expresión de SecPS2NT puede bloquear la interacción entre APP y PS1 mutante. El presente ejemplo analiza las consecuencias de esta inhibición sobre la producción del péptido amiloide, en particular de estas dos formas Aß40 y Aß42. En efecto, ha sido precedentemente descritto en la literatura que las mutaciones patológicas de las presenilinas (PS1 ó PS2) conducían a un aumento de la proporción de la forma larga del péptido Aß, forma Aß42, sobre la forma Aß40, proporción Aß42/Aß40 (berchelt y colaboradores, 1996 y para revissar Hardy, 1997) .

SPA4CT ha sido co-expresada con PS1 wt (Fig 13a, pistas 1 y 3) ó con PSl mutante (Fig 13 A, pistas 2 y 4) ya sea en ausencia (pistas 1 y 2) ó bien en presencia de SecPS2NT (pistas 3 y 4) . Los usados celulares y los medios acondicionados de las células han sido analizados para la producción del péptido amiloide. Las formas Aß40 y Aß42 han sido analizadas por inmunoprecipitación con anticuerpos que reconocen específicamnete los extremos C-terminales Aß40 (FCA3340) ó Aß42 (FCA3542, Barelli y colaboradores, 1997) y los inmunoprecipitados analizados por inmunomanchado con un anticuerpo reconocedor de las dos formas. En los usados celulares, la expresión de PS1 mutante conduce bien a un aumento de la producción de Aß42 (1.5 a 2 veces) y de sus formas multiméricas en relación a PS1 wt y un poco de variación de niveles de Aß40 (comparar la Fig 13 A, pistas 1 y 2, paneles Aßß42 y Aß40 usados celulares) como se esperó. En presencia de SecPS2NT, los niveles de Aß42 (y ultímeros) son considerablemente reducidos (Fig 13a, pistas 3 y 4) tanto con PS1 wt que con PS1 mutante. En el medio extracelular, los niveles de Aß42 parecen también disminuidos pero de forma menos importante. No hay variación de los niveles de péptido amiloide Aß40 entre las diferentes condiciones lo que demuestra que el efecto ssobre el Aß42 es específico y no debido a una modificación global de los niveles de expresión. Esto es confirmado por el análisis de la expresión de los diferentes genes transfectados: SPA4CT, SecP?2NT y PS1 (Fig 13B) . En este ejemplo ha sido entonces demostrado que inhibir la interacción PS1/APP con el dominante genético SecPS2NT conduce a una disminución de los niveles de producción de Aß42 intracelular tanto con PS mutante que con PS1 wt. En atención del papel primordial acordado al Aß42 en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, este ejemplo aporta la demostración de que la inhbición de la interacción APP/PS representa entonces un objetivvo terapéutico importante tanto para las formas genéticas como para las formas esporádicas de la enfermedad.

Ejemplo 11.Detección de la interacción de PS2 con el APP endógeno de las células COS con la ayuda de un tratamiento farmacológico.

Este ejemplo tiene por objetivo demostrar que los resultados obtenidoss en los ejemplos precedentes (estos resultadoss en células, correspondían a la sobre-flj) expresión de los dos compañeros de la interacción APP y 5 PS (PS1 ó PS2) ) son igualmente válidos con proteínas no sobre expresadas ó endógenas. En efecto, la fuerte sobre expresión de las dos proteínas podría conducir a un artefacto de interacción. La detección de la interacción en condiciones que no implican la sobreexpresión 10 simultánea de los dos compañeros ha sido investigada en • este ejemplo.

Las células COS expresan el APP de forma endógena aaunque a niveles ligeros. Las células COS han sido entonces transfectadas con PS2 solamente. Los lisadoss celulares han sido analizadoss por inmunoprecipitación con el anticuerpo dirigido contra el péptido del N- term de PS2 y revelados por inmunomanchado con el anticuerpo anti-APP, W02. La constante superior de la figura 14 muestra que la transfección ccon PS2 solaa no permite detectar interacción ccon APP endógerno por cco- inmunoprecipitación (Fig. 14, pista 1) .

Por otra parte, ya que la interacción APP/PS 25 conducee a la producción del péptido aamiloide Aß42 (ejemplo precedente), luego al catabolismo del APP, al niveel del reticulum endoplásmicco, el proteasoma que es el sistema de degradación proteolítica en este compartimento celulaar podría estar implicado. El efecto de la lactacistina, un inhibidor selectivvo del proteasoma ha sido analizaddo. Después de incubación de las células transfectadas con PS2 en presencia de lactacistina, la APP endógena de las células COS puede ser claramente puesta en evidencia en los inmunoprecipitados PS2 (Fig 14, pista 5, bandaa de 110 kDa) . Esta interacción con el APP endógeno presenta las mismas características que precedentemente ya que puede ser desplazada por el dominante genético SecPS2NT (Fig 14, pista s 6 y 7) con un efecto dosis- dependiente. En efecto, la pista 7 muestra que a unaa dosificación moderada de SecPS2NT, una banda de ligera intensidad correspondiente al APP endógeno es siempre visiblee. A una dosificación más importante de SecPS2NT (pista 6) , la banda correspondiente al APP endógeno parecía muy ligeraa y demuestra el carácter de dosificación dependiente. Una leve señal residual la APP está siempre presente (banda de aproximadamentee 110 kDA) y es debido al complejo entre APP y SecPS2NT que es rápidamente secretada (ya que SecPS2NT no tiene más regiones transmembranarias de anclaje) y entonces no se acumula intracelularmente.

La figura 14 (constante medio e inferior) muestra que el tratamiento a la lactacistina no afecta los niveles de APP totales tanto celulares como secretadas. En efecto, las bandas correspondientes a los niveles de expresión del APP son casi constantes en intensidad. La especificidad del efecto lactacistina es así demostrado sobre la sub-población de APP en interacción con PS2.

Por estos resultados, se ha podido demostrar que la interacción APP/PS2 puede ser detectada con el APP endógeno de las células COS si el proteasoma es inhibido. Además, estos resultados demuestran que la interacción APP/PS2 puede ser detectada en condiciones menos artificiales. No obstante esta interacción es muy lábil. También, a fin de obtener una detección más marcada, Se ha recurrido ya sea a un inhibidor de degradación proteolítica en el presente ejemplo ó bien a la sobreexpresión de los dos compañeros en los ejemplos precedentes. Este ejemplo demuestra entonces que los resultados obtenidos en los ejemplos precedentes con sobre expresión en células de los dos compañeros de la interacción (APP y PS1 ó PS2) son igualmente válidos con proteínas no sobre expresadas ó endógenas.

Ejemplo 12.El PS2 interactúa ccon un segundo segmento de APP, diferente de Aß.

) Ha sido demostrado precedentemente que SecPS2NT inetractúa en el medio extracelular con las formas secretadas de APP (Fig 3A, pista 4) . Las formas secretadas del APP son liberadas después de división ya sea en el sitio ß (posición 595) , correspondiente al inicio del péptido Aß, ya sea en el sitio a (posición 612) en el seno mismo de este péptido. Estos resultados sugieren que PS2NT interactúa también con una región N- ter del APP diferente de Aß. Formas truncadas de APP han siddo construidas, por inserción de un codón de detención en los sitios ß (ß-sAPP) y a(a-sAPP) y han sido probados. PS2 completo y SecPS2NT interactúan efectivamentee con a-sAPP (Fig 15, pistas 3 y 5) y ß-sAPP (Fig 15, pistas 4 y 6) . Estos resultados estableceen que un segmento de APP comprendido entre la posición 1 y 5595 (y luego otra diferente del Aß) es igualmente capaz de interactuar con PS2 y PS2NT. Estos resultados permiten además confirmar además confirmar que la interacción PS2NT/APP puede tener lugar en ausencia de anclaje a la mebrana de dos compañeros y en el compartimento luminal (ó extracelular) de la célula. 25 Referencias - Doan y colaboradores (1996) Protein Topology of presenilina 1. Neuron 17: 11023-11030.

- Thinakaran y colaboradores, (1996) Endoproteolysis of Presenilin 1 and acumulation of processed derivatives in vivo. Neuron 17: 1811-1190.

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- Pradier, L. Czecch, C. Mercken, L. Revah. F. e Imperato, A. (1996) Biochemical characterization of presenilins (S182 y STM2) proteins. Neurobiol. Aging 17: S137.

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M., Kim, G., Seekins, S. Yager, D., Slunt, H. H., Wang, R., Seeger, M., Levey, A. I. Gandy, s. E., Copeland, N. G., Jenkinss, N., pricee, D. L., Younkin, Ss. G. y S. Sisodía (1996) Familial alzheimer's disease-linked presenilin I variants elévate Abl-42/I-40 ratio in vitro and in vivo Neuron 17: 1005-1013.

- Duff, K., Ecckman, C. Zehr, Ce, Yu, X., Pradaa, C. - M., Perez-tur, J., Hutton, M. Buee, L. Harigayaa, Y., Yager, D., Morgan, D., Gordon, M. N., Holcomb, L., Refolo, L., Zenk, B., Hardy, J.,y S. Younkin (1996) Increased amyloid- b42(43) in brain of mice expressing mutant presenilin 1. Nature 383: 710-713.

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LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIONES GENERALES: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: RHONE-POULENC RORER (B) CALLE: 20 avenue Raymond Aaron (C) CIUDAD: Antony (E) PAÍS: France (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (H) TELECOPIA: 01.55.71.72.91 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos capacess de inhibir la interacción entre las presenilinas y el precursor del péptido beta-amiloide y ó el péptido beta-amiloide. ;iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 11 ;ív) FORMA DESCIFRABLE POR CCOMPUTADORA: (A) TIPO DE SOPORTE: disquette (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SISTEMA LÓGICO: Patentin Reléase No. 1.0, versión no. 1.30 (OEB) (2) INFORMACCION PARA LA SEC ID NO. 1: (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 1: (A) LONGITUD: 26 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: doble (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) COLOCACIÓN: 1...261 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1 ATG CTC ACÁ TTC ATG GCC TCT GAC AGC GAG GAA GAA GTG TGT GAT GAG 48 Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu 1 5 10 15 CGG ACG TCC CTA ATG TCG GCC GAG AGC CCC ACG CCG CGC TCC TGC CAG 96 Arg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gln 20 25 30 GAG GGC AGG CAG GGC CCA GAG GAT GGA GAG AAT ACT GCC CAG TGG AGA 144 Glu Gly Arg Gln Gly Pro -Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gln Trp Arg 35 40 45 AGC CAG GAG AAC GAG GAG GAC GGT GAG GAG GAC CCT GAC CGC TAT GTC 192 Ser Gln Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val 50 55 60 TGT AGT GGG GTT CCC GGG CGG CCG CCA GGC CTG GAG GAA GAG CTG ACC 240 Cys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr 65 70 75 80 CTC AAA TAC GGA GCG AAG CAT 261 Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His 85 ( 2 ) INFORMACCION PARA LA SEC ID NO . 2 : ( i ) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO . 2 (A) LONGITUD : 243 PARES DE BASES (B ) TIPO : nucleótido ( C ) NUMERO DE FILAMENTOS : doble ( D) CONFIGURACIÓN : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO I» 5 (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS 10 (B) COLOCACIÓN: 1...243 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2 ATG ACÁ GAG TTA CCT GCA CCG TTG TCC TAC TTC CAG AAT GCA CAG ATG 48 ir Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met 1 5 10 15 TCT GAG GAC AAC CAC CTG AGC AAT ACT GTA CGT AGC CAG AAT GAC AAT 96 Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gln Asn Asp Asn 20 25 30 AGA GAA CGG CAG GAG CAC AAC GAC AGA CGG AGC CTT GGC CAC CCT GAG 144 Arg Glu Arg Gln Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu 35 40 45 CCA TTA TCT AAT GGA CGA CCC CAG GGT AAC TCC CGG CAG GTG GTG GAG 192 Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu 50 55 60 CAÁ GAT GAG GAA GAA GAT GAG GAG CTG ACÁ TTG AAA TAT GGC GCC AAG 240 Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys 65 70 75 80 CAT 243 His > (2) INFORMACCION PARA LA SEC ID NO. 3: (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 3: (A) LONGITUD: 2088 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: doble (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO 20 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) COLOCACIÓN: 1...20E 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3 ATG CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC CTG CTG GCC GCC TGG ACG GCT CGG 48 5 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 GCG CTG GAG GTA CCC ACT GAT GGT AAT GCT GGC CTG CTG GCT GAA CCC 96 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 CAG ATT GCC ATG TTC TGT GGC AGA CTG AAC ATG CAC ATG AAT GTC CAG 144 Gln lie Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 AAT GGG AAG TGG GAT TCA GAT CCA TCA GGG ACC AAA ACC TGC ATT GAT 192 IQ Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys He Asp 50 55 60 ACC AAG GAA GGC ATC CTG CAG TAT TGC CAÁ GAA GTC TAC CCT GAA CTG 240 Thr Lys Glu Gly He Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 CAG ATC ACC AAT GTG GTA GAA GCC AAC CAÁ CCA GTG ACC ATC CAG AAC 288 Gln He Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr He Gln Asn 85 90 95 TGG TGC AAG CGG GGC CGC AAG CAG TGC AAG ACC CAT CCC CAC TTT GTG 336 |5 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 ATT CCC TAC CGC TGC TTA GTT GGT GAG TTT GTA AGT GAT GCC CTT CTC 384 He Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 GTT CCT GAC AAG TGC AAA TTC TTA CAC CAG GAG AGG ATG GAT GTT TGC 432 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 GAA ACT CAT CTT CAC TGG CAC ACC GTC GCC AAA GAG ACÁ TGC AGT GAG 480 0 Glu thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 AAG AGT ACC AAC TTG CAT GAC TAC GGC ATG TTG CTG CCC TGC GGA ATT 528 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly He 165 170 175 GAC AAG TTC CGA GGG GTA GAG TTT GTG TGT TGC CCA CTG GCT GAA GAA 576 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 AGT GAC AAT GTG GAT TCT GCT GAT GCG GAG GAG GAT GAC TCG GAT GTC 624 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 TGG TGG GGC GGA GCA GAC ACÁ GAC TAT GCA GAT GGG AGT GAA GAC AAA 672 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 GTA GTA GAA GTA GCA GAG GAG GAA GAA GTG GCT GAG GTG GAA GAA GAA 720 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 GAA GCC GAT GAT GAC GAG GAC GAT GAG GAT GGT GAT GAG GTA GAG GAA 768 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 GAG GCT GAG GAA CCC TAC GAA GAA GCC ACÁ GAG AGA ACC ACC AGC ATT 616 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser He 260 265 270 GCC ACC ACC ACC ACC ACC ACC ACÁ GAG TCT GTG GAA GAG GTG GTT CGA 864 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 GTT CCT ACÁ ACÁ GCA GCC AGT ACC CCT GAT GCC GTT GAC AAG TAT CTC 912 Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu 290 295 300 GAG ACÁ CCT GGG GAT GAG AAT GAA CAT GCC CAT TTC CAG AAA GCC AAA 960 Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys 305 310 315 320 GAG AGG CTT GAG GCC AAG CAC CGA GAG AGA ATG TCC CAG GTC ATG AGA 1008 Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg 325 330 335 GAA TGG GAA GAG GCA GAA CGT CAÁ GCA AAG AAC TTG CCT AAA GCT GAT 1056 Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp 340 345 350 AAG AAG GCA GTT ATC CAG CAT TTC CAG GAG AAA GTG GAA TCT TTG GAA 1104 Lys Lys Ala Val He Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu 355 360 365 CAG GAA GCA GCC AAC GAG AGA CAG CAG CTG GTG GAG ACÁ CAC ATG GCC 1152 Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala 370 375 380 AGA GTG GAA GCC ATG CTC AAT GAC CGC CGC CGC CTG GCC CTG GAG AAC 1200 Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn 3ß5 390 395 400 TAC ATC ACC GCT CTG CAG GCT GTT CCT CCT CGG CCT CGT CAC GTG TTC 1248 Tyr He Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe 405 410 415 AAT ATG CTA AAG AAG TAT GTC CGC GCA GAA CAG AAG GAC AGA CAG CAC 1296 Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His 420 425 430 ACC CTA AAG CAT TTC GAG CAT GTG CGC ATG GTG GAT CCC AAG AAA GCC 1344 Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala 435 440 445 GCT CAG ATC CGG TCC CAG GTT ATG ACÁ CAC CTC CGT GTG ATT TAT GAG 1392 Ala Gln He Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val He Tyr Glu 450 455 460 CGC ATG AAT CAG TCT CTC TCC CTG CTC TAC AAC GTG CCT GCA GTG GCC 1440 Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala 465 470 475 480 GAG GAG ATT CAG GAT GAA GTT GAT GAG CTG CTT CAG AAA GAG CAÁ AAC 1488 Glu Glu He Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn 485 490 495 TAT TCA GAT GAC GTC TTG GCC AAC ATG ATT AGT GAA CCA AGG ATC AGT 1536 Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met He Ser Glu Pro Arg He Ser 500 505 510 TAC GGA AAC GAT GCT CTC ATG CCA TCT TTG ACC GAA ACG AAA ACC ACC 1584 Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr 515 520 525 GTG GAG CTC CTT CCC GTG AAT GGA GAG TTC AGC CTG GAC GAT CTC CAG 1632 Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln 530 535 540 CCG TGG CAT TCT TTT GGG GCT GAC TCT GTG CCA GCC AAC ACÁ GAA AAC 1680 Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn 545 550 555 560 GAA GTT GAG CCT GTT GAT GCC CGC CCT GCT GCC GAC CGA GGA CTG ACC 1728 Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr 565 570 575 ACT CGA CCA GGT TCT GGG TTG ACÁ AAT ATC AAG ACG GAG GAG ATC TCT 1776 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn He Lys Thr Glu Glu He Ser 580 585 590 GAA GTG AAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 1824 Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 595 600 605 CAT CAT CAÁ AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 1872 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 610 615 620 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACÁ GTG 1920 Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Ala Thr Val 625 630 635 640 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACÁ TCC ATT 1968 He Val He Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser He 645 650 655 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 2016 His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 660 665 670 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 2064 His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 675 680 685 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC TAG 2088 Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 690 695 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO . 4 : Oligo ( i ) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO . 4 (A) LONGITUD : 38 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: -(B) COLOCACIÓN:!...38 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4 CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 5: Oligo (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 5: (A) LONGITUD: 43 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: - (B) COLOCACIÓN : 1...43 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5 CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGTCCGTATTTGAGG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 6: Oligo 8172 (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 6; (A) LONGITUD: 27 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO ;ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: - (B) COLOCACIÓN: 1...27 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: CAAAAAAGAATCTGAATGCAGAAATTCCGAACAT (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 7: Oligo 8181 (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 7 (A) LONGITUD: 59 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO ;iv) ANTI-SENTIDO: NO ;ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: - (B) COLOCACIÓN: 1...59 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: CAAAGCGGCCGCTCATCCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCCGTTCTGC ATCTGCTC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 8: Oligo 8171 (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 8: (A) LONGITUD: 27 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO ;ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: - (B) COLOCACIÓN: 1...27 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: CAAAGAAATCTAAAGAAAACAAAGTAACAACAATCC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 9: Oligo (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 9: (A) LONGITUD: 29 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: -(B) COLOCACIÓN:!...29 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: ccaatcgaatggctaaCATCTTCACTTCAGAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 10: Oligo (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 10: (A) LONGITUD: 31 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: - (B) COLOCACIÓN: 1...31 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: ccatcgaatggctaaTTTTTGATGATGAACTTC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 11: Oligo (i) CARACTERÍSTICAS PARA LA SECUENCIA SEC ID NO. 11 (A) LONGITUD: 17 PARES DE BASES (B) TIPO: nucleótido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: simple (D) CONFIGURACIÓN: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: - (B) COLOCACIÓN : 1...17 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11: CCGTGGAGCTCCTCCCG Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad en las siguientes:

Claims (50)

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido qque está caracterizado porque es capaz de inhibir al menos parcialmente la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó del péptido ß-amiloide.

2. Polipéptido según la reivindicación 2 que está caracterizado porque la parte de PS2 corresponde al fragmento N- terminal hidrófilo de PS2.

3. Polipéptido según la reivindicación 2 que está caracterizado porque la parte de PS2 corresponde al fragmento N- terminaal hidrófilo de PS2.

4. Polipéptido según alguna de las reivindicaciones 1 a 3 que está caracterizado porque se trata de un polipéptido que comprende total ó parcialmente de la secuencia SEC ID No. 1 ó de una secuencia derivada de ésta.

5. Polipéptiddo según la reivindicación 1 que está caracterizado porque contiene al menos una parte de PS1 que permite la interacción con el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide.

6. Polipéptido según la reivindicación 5 que está caracterizada porque se trata de un polipéptido que comprende total ó parcialmente la secuencia SEC ID No. 2 ó la secuencia SEC ID No. 2 ó una secuencia derivada de ésta.

7. Polipéptido según alguna de las reivindicaciones 1 a 6 que está caracterizada porque comprende al menos las regiones de homología comunes a las secuencias SEC ID No. 1 y SEC ID No. 2.

8. Polipéptido según la reivindicación 1 que está caracterizada porque contiene al menos una parte del precursor del péptido ß-amiloid'e salvo la parte correspondiente al péptido ß-amiloide.

9. Polipéptiddo según la reivindicación 8 que está caracterizado porque la parte del precursor del péptido ß-amiloide comprende tal ó parcialmente el fragmento 1-596.

10. Péptido según la reivindicación 9 que está caracterizado porque contiene toatl ó parcialmente una secuencia seleccionada entre la secuencia correspondiente al fragmento 1-596 de la secuencia SEC ID No. 3, ó una secuencia derivada.

11. Compuesto no peptídico ó no exclusivamente peptídico capaz de inhibir al menos parcialmente la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide obtenido por reproducción de los motivos activos de los péptidos según las reivindicaciones 1 a 10 por estructuras no peptídicas ó no exclusivamente peptídicas.

12. Polipéptido según alguna de las reivindicaciones 1 a 11 que está caracterizado porque comprende además una secuencia indicadora.

13. Polipéptido según la reivindicación 12 que está caracterizado porque la secuencia indicadora es seleccionada entre la secuencia del péptido indicador de IgkB, el péptido indicador del APP, los péptidos indicadores de sub-unidades de los receptores nicotínico del acetilcolina musculares y centrales.

14. Polipéptiddo según la reivindicación 13 que está caracterizado porque se trata de un polipéptido que comprende el extremo N-terminal de PS1 ó de PS2. 15. Polipéptido según la reivindicación 14 que está caracterizado porque se trata de un polipéptido que fj) comprende los 87 primeros residuos del extremo N- 5 terminal de PS2 y el péptido indicador de IgkB. 16. Secuencia nucleotídica que está caracterizada porque codifica para un polipéptido tal como el definido según alguna de las reivindicaciones 1 a 15. 10 17. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 16 que está caracterizado porque se trata de una secuencia que comprende total ó parcialmente a la secuencia nucleotídica SEC ID No. l o a una secuencia 15 derivada de ésta. 18. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 16 que está caracterizada porque se trata de una secuencia que comprende total ó parcialmente a la 20 secuencia nucleotídica SEC ID No. 2 ó a una secuencia derivada de ésta. 19. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 16 que está caracterizada porque se trata de una 25 secuencia que comprende esencialmente las zonas de homologías comunes a las secuencias nucleotídicas SEC ID No. 1 y SEC ID No. 2. 20. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 16 que está caracterizada porque se trata de una secuencia correspondiente al fragmento 1-596 (ácidos nucleicos 1 a 1788) de la secuencia SEC ID No. 3, ó una secuencia derivada. 21. Procedimiento de preparación de un polipéptiddo según alguna de las reivindicaciones 1 a 15 que está caracterizada porque cultiva una célula que contiene una secuencia nucleotídica según alguna de las reivindicaciones 16 a 20 en condiciones de expresión de la mencionada secuencia y se recupera el polipéptido producido. 22. Célula huésped para la producción de un péptido según alguna de las reivindicaciones 1 a 15, que está caracterizada porque ha sido transformada con un ácido nucleico que contiene una secuencia nucleotídica según alguna de las reivindicaciones 16 a 20. 23. Procedimiento de puesta en evidencia ó de aislamiento de compuestos capaces de inhibir al menos parcialemnte la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide, que está caracterizado porque comprende al menos una etapa de marcado de las presenilinas y/ó del APP ó de los fragmentos de éstas y una etapa de detección de la inhibición de la interacción ya sea entre el péptido Aßl-42 y el extremo N- terminal de las presenilinas ó bien entre las proteínas completas APP y presenilinas. 24. Procedimiento según la reivindicación 23 que está caracterizado porque los compuestos aislados por él procedimiento son capaces de inhibir al menos parcialmente la interacción entre el péptido Aßl-42 y el extremo N- terminal de PS2. 25. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 23 a 24 que está caracterizado porque se realiza en las etapaas siguientes: - el péptido Aßl-42 es absorbido previamente sobre una membrana de nitrocelulosa por incubación. - un extracto bacteriano que contiene todo ó parte de una presenilina (PS1 ó PS2) y ventajosamente el extremo N- terminal, es a continuación añadido para incubación con la molécula ó una mezcla que contenga diferentes moléculas á probar. - la interacción de la presenilina con el péptido Aß?-42 sobre el filtro de nitrocelulosa es puesto en evidencia con la ayuda de proteínas marcadoras de las presenilinas. Las moléculas investigadas inhiben la interacción y disminuyen entonces la intensidad de la señal de las proteínas marcadoras. 26. Procedimientos según la reivindicaicón 25 que está caracterizado porque alguna de las proteínas marcadoras es la proteína fijadora del S-tag, acoplada a la fosfatasa alcalina. 27. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 23 a 24 que está caracterizado porque se realiza en las etapas siguientes: - el péptido Aßl-42 es incubado previamente sobre una placa que contiene pocilios (formato de 96 pocilloss ó superior) -el extremo N- terminal de una presenilina recombinante purificada es a continuación añadida con la molécula ó una mezcla que contenga diferentes moléculas a probar, para incubación. después de lavados, la interacción de la presenilina con el péptido Aß?-2 en la placa es puesta en evidencia con la ayuda de proteínas marcadoras de las presenilinas. La pérdida de la interacción entre las presenilinass y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide es detectada después de revelado con un substrato colorimétrico, por espectrofotometría. 28. Procedimiento según la reivindicación 27 que está caracterizado porque alguna de las proteínas marcadoras es la proteína fijadora del S-tag, acoplada a la fosfatasa alcalina y el revelado de la pérdida de la interacción es efectuada a 450 nm. 29. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 23 a 24 que está caracterizado porque se realiza en las etapas siguientes: - se pone en contacto una molécula ó una mezcla que contiene diferentes moléculas con el péptiddo Aßl-42 sintetizado con una biotina y un brazo de 3ßalaninas (ó de 3 usinas) en su extremo N- terminal (hacia el inicio de la posición 1) . - se incuba la mezcla reaccional precedente con el extremo N- terminal de una presenilina purificada marcada con la ayuda de un primer fluoforo. - se añade una estreptavidina acoplada a un segundo fluoforo capaz de ser excitado a la longitud de onda de emisión del primer fluoforo a fin de que se beneficie de una transferencia de fluorescenciaa si los dos fluoforos se encuentran a fuerte proximidad. - la puesta en evidencia de los nuevos compuestos que inhiban la interacción es detectada por espectrofluorometría a la longitud de onada de emisión del primer fluoforo y/ó midiendo la disminución de la señal a la longitud de onda de emisión del segunddo fluoforo. 30. Procedimiento según la reivindicación 29 que está caracterizado porque el primer fluoforo es el cripatato de europium y el segunddo fluoforo es la XL665. 31. Procedimiento según la reivindicación 30 que está caracterizado porque la revelación de la pérdida de la interacción es efectuada a 620 nm y/ó por medida de la disminución de la señal a 665 nm. 32. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 23 a 24 que contienen las etapas siguientes : - se pone en contacto una mezcla a) de lisados celulares que contengan todo ó parte de un apresenilina (PS1 ó PS2) y ventajosamente el extremo N- terminal, b) delisados celulares que contengan el APP, lisados obtenidos a partir de células infectadas por virus y en particular por baculovirus y c) la molécula ó una mezcla que contenga diferentes moléculas a probar. - se co-inmunoprecipita con la ayuda de anticuerpos apropiados las proteínas solubilizadas y correspondientes a las presenilinas ó al APP ó al péptido Aß - la pérdida de la co-inmunoprecipitación de las presenilinas y del APP es revelada por manchado western con anticuerposs marcadores que indican que las moléculas probadas tienen la propiedad inhibidora investigada. 33. Pruebas de interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide, y preferencialmente entre el péptido Aßl-42 y el extremo N- terminal de PS2, que está caracterizado porque comprende al menos una etapa de transferencia de fluorescencia entre dos fluofoross fijados a las moléculas precedentes y una etapa de revelado de la interacción medida por fluorometría. 34. Prueba de puesta en evidencia de moléculas capaces de inhibir la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide, y preferencialmente entre el péptido Aß?-42 y el extremo N- terminaal de PS2, que está caracterizado porque la inhibición de la mencionada interacción es detectada según el procedimiento en las reivindicaciones 23 a 32. 35. Ligando a) polipéptidos tal como los definidos según las reivindicaciones 1 a 15, b) presenilinas y/ó del precursor del péptido ß-amiloide y/ó del péptido ß-amiloide, y preferencialmentee del péptido ß?_42 y/ó del extremo N- terminal de PS2, susceptible de ser obtenido por el procedimiento según alguna de las reivindicaciones 23 a 32. 36. Virus recombinante defectuoso que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptído según alguna de las reivindicaciones 1 a 15. 37. Vector que comprende una secuencia nucleotídica según alguna de las reivindicaciones 16 a 20. 38. Vector según la reivindicación 37 que está caracterizado porque se trata de un vector plasmídico. 39. Vector según la reivindicación 37 que está caracterizado porque se trata de un vector viral. 40. Vector según la reivindicación 39 que está caracterizado porque se trata de un virus defectuoso para la réplica. 41. Composición farmacéutica que está caracterizado porque comprende uno ó varios vectores según alguna de las reivindicaciones 36 a 40. 42. Composición farmacéutica que está caracterizado porque comprende como principio activo al menos un polipéptido según alguna de las reivindicaciones I a 15. 43. Composición farmacéutica que está caracterizada porque comprende como principio activo al menos un ligando según la reivindicación 35. 44. Composición según alguna de las reivindicaciones 41 a 43 que está caracterizada porque está destinada a inhibir al menos en parte la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. 45. Composición según alguna dé las reivindicaciones 41 a 43 que está caracterizada porque está destinada al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. 46. Utilización de los polipéptidos según las reivindicaciones 1 a 15 para inhibir al menos en parte la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. 47. Utilización de los polipéptidos según las reivindicaciones 1 a 15 para la obtención de un medicamento destinado al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas y particularmente de la enfermedad de Alzheimer. 48. Utilización de los polipéptidos según las reivindicaciones 1 a 15 para la puesta en evidencia de ligandos de los polipéptidos, de ligandos de las presenilinas, del precursor del péptido ß-amiloide y/ó del péptido ß-amiloide, y preferencialmente del péptido Aßl-42 y/ó del extremo N- terminal de PS2, y/ó de compuestos capaces de inhibir al menos en parte la interacción entre una presenilina y el precursor del péptido ß-amiloide y/ó el péptido ß-amiloide. 49. Utilización de las secuencias nucleotídicas según las reivindicaciones 16 a 20 para la construcción de un cartucho de expresión utilizable en un vector según las reivindicaciones 36 a 40. 50. Cartucho de expresión utilizable en un vector definido según las reivindicaciones 35 a 39 para la producción de polipéptidos según las reivindicaciones 1 a

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