MXPA00001530A - Derivados de 13-dióxidoantraciclina y procesos para prepararlos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la aplicación de derivados de 13-Deoxiantraciclina como derivados de Antraciclina no cardio-tóxica para el tratamiento de cáncer en mamíferos y procesos para preparar estos derivados 13-dioxiantraciclinas de fórmula general:en donde R1 es H o OH;R2 es H, OH o Ome;R3 es H o OH;y R5 es un carbohidrato o un sustituto de carbohidrato, para preparar un medicamento anti-cáncer.

Description

DERIVADOS DE 13-DIOXIDOANTRACICLINA Y PROCESOS PARA PREPARARLOS.

REFERENCIA CRUZADA DE SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de ta patente norteamericana número de serie 09/910,218, presentada el 13 de agosto de 1998, por Xini Zhang, el contenido completo de la descripción se incorpora a la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a derivados de 13-ANTRACICLINA , como derivados que no muestran efectos colaterales cardiotóxicos y métodos para preparar dichos derivados *.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las antraciclinas tienen el espectro mas amplio de actividad en cánceres humanos en comparación con todas las demás quimioterapias conocidas para cáncer. Las drogas anti-cáncer mas ampliamente conocidas son doxorubicina y daunorubicina, las cuales contienen un grupo de 13-queto. De éstas, la dexorubicina, revtxada en la patente Norteamericana 3,590,028, tiene un amplio espectro de utilidad anti-cáncer , y es una de la drogas mas efectivas en casos de sarcomas y carcinomas, adicionalmente a las leucemias, linfomas y tumores sólidos.

Una sustancia análoga estructural, es la daunorubicina, revelada en la patente norteamericana No. 3,616,242 no es efectiva en casos de sarcomas y carcinomas y esta diferencia se da debido a la ausencia de 14-OH en la daunorubicina. Sin embargo, la daunorubicina es inútil en el tratamiento de leucemias agudas.

No obstante lo anterior, la cardiotoxicidad limita comúnmente la duración del tratamiento de doxorubicina a aproximadamente 9 mese sen dosis usuales. La dosis total de doxorubicina o daunorubicina no puede exceder de 550 mg/m2 (E.A. Lefrak et al., Cáncer, 32:302, 1973). Aún y en o cerca del total máximo recomendado de dosis ( 430-650 mg/ m2) ocurre en un 60% de lo pacientes una disfunción del corazón significante y persistente y un 14 % desarrollan una falla congestiva del corazón (A. Dresdale et al., Cáncer, 52:51 , 1983). Por lo tanto, mientras estas drogas son útiles para inhibir el crecimiento de tumores cancerigenos, el paciente puede morir de una falla en el corazón debido al severo efecto colateral de cardiotoxicidad de las drogas.

Adicionalmente a los efectos cardiotóxicos de los componentes en si mismos, los procesos conocidos para la preparación de antraciclina tienen relativamente bajos rendimientos, sobre el orden de 30% (ver Smith et al., J. Med. Chem., 21:280-283, 1978).

El éxito de la doxorubicina en la eliminación de tumores y sus limitaciones en el uso clínico han sido la base para que investigadores de todo el mundo intenten desarrollar una mejor dexorubicina. Ha habido una gran necesidad por un análogo de la dexorubicina que no este limitado por la cardiotoxicidad acumulativa irreversible. A pesar de que a lo largo de los últimos 25 años se han sintetizado mas de 2000 análogos, ninguno a probado tener una mejora significante respecto a la doxorubicina (R.B. Weiss, The anthracyclines: Alguna vez encontraremos una mejor dexorubicina?, Seminarios en Oncología, 19: 670-686, 19992).

Se ha desarrollado una extensa investigación en los últimos 25 años para entender el mecanismo de la cardiotoxicidad de las antraciclinas. Una teoría popular que se desarrolló fue la teoría de los radicales libres. De acuerdo a esta teoría, la cardiotoxicidad de las antraciclinas se deriva de la generación de radicales libres. De acuerdo a esta teoría, la cardiotoxicidad de las antraciclinas resulta de la generación de radicales libres por la división quinone moiety de la molécula de la antraciclina (J. Dorowshow et al., J. Clin. Invest., 68:1053, 1981; D.V. Unverferth et al., cáncer Treat. Rev., 9:149, 1982; J. Goodman et al., Biochem, Biophys. Res Commun., 77:797; J:L: Zweier, J. Biol. Chem., 259:6056, 1984).

Sin embargo, esta teoría ha sido decepcionante ya que los antioxidantes y los inhibidores de radicales libres han fallado en evitar la toxicidad cardiaca acumulativa (D. Propper and E. Maser, Carbonyl reduction of daunorubiciba in rabbit liver and hart, Pharmacology and Toxicology, 80:240-245, 1997; J.F. VanVIeet et al., Am. J. Pathol., 99:13, 1980; D.V. Unverferth et asi., Am. J. Cardiol., 56:157, 1985; C. Myers ?t al., Seminars in Oncology, 10: 53, 1983; R.H.M. Julicher et al., J. Pharm. Pharmacol., 38:277, 1986; y E.A. Porta et al., Res. Comm. Chem. Pathol Pharmacol., 41 :125, 1983).

En otras palabras, se ha encontrado que el inhibir los radicales libres no elimina la cardiotoxicidad de las antraciclinas (P.S. Mushlin et al., Fed. Proc., 45:809, 1986) Los doctores Richard D. Olson y Phillip S. Mushlin han pasado lo últimos 15 años estudiando el mecanismo de la inducción de cardiotoxicidad de la antraciclina y han desarrollado la "teoría metabolita2 la cual se espera se convierta en la teoría prevaleciente (R.D. Olson and P.S. Mushlins, Doxorubicina cardiotóxicity: Analysis of prevailing hypotheses, FASEB Journal, 4:3076-33086, 1990) de acuerdo con esta teoría, la cardiotoxicidad de la antraciclina esta mediada por el metabolito 13-0H del componente - original.

Esta investigación muestra la cardiotoxicidad de la doxorubicina y de la daunorubicina, manifestada por la reducción en la contractilidad miocardial, depende de la reducción metabólica de la mitad13-queto a un metabolito 13 dihidro. En las pruebas los sistemas en donde la dexorubicina no es metabolizada al componente 13-dihidro, los efectos cardiotóxicos se observan sólo a muy altas concentraciones (200-400 microgramos /mL) (P.S. Mushlins et al., Fed Proc., 44: 1274, 1985; R.D. Olson et al., Fed. Proc., 45:809, 1986).

Si a la dexorubicina se le permite permanecer aún y en periodos cortos de tiempo, ocurre alguna conversión metabólica y se forma el metabólito 13-dihidro en suficiente cantidad para que la cardiotoxicidad se comience a desarrollar (L: Rossini et al., Arch. Toxicol. Suppl., 9:474, 1986; M. Del Tocca et al., Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Se ha acumulado suficiente evidencia para determinar que la cardiotoxicidad de las drogas como la doxorubicína y daunorubicina resulta de los potentes efectos cardiotóxicos producidos por los metabolitos 13-dihidro (P. Mushlin et al., rational >Drug Therapy, 22:1 , 1988; S. Kuyper et al., FASEP Journal, 2.A1133, 1988; R. ßoucek et a , J. Biol. Chem., 262:15851 , 1987, 1988).

En contraste a lo anteriormente dicho, los metabolitos 13-dihidro, doxorubicinol y daunorubicinol, producen cardiotoxicidad en estas mismas pruebas de sistemas a relativamente bajas concentraciones (1-2 microgramos/ml, R.D. Olson et al., Proceed. Am Assoc. Cáncer Res., 28:441 , 1987).

En vista de lo anterior, la doxorubicina es convertida mediante reductasa intracelular carbonil a doxorubicinol en donde el grupo 13-queto es reducido a un alcohol como se muestra abajo: Esta teoría ofrece una explicación para la naturaleza dilatoria en el tiempo de la cardiotoxicidad de la antraciclina. Las investigaciones de Olson y Mushlin fueron revisadas recientemente y demuestran un gran número de puntos (D.- Propper and E. Maser, Carbonyl reduction of daunorubicine in rabbit liver and hart, Pharmacology and Toxicology 80: 240-245, 1997). < Por ejemplo, las investigaciones descubren una relación directa entre la acumulación intracardiaca del metabolito C13 alcohol y la imparidad de la contracción y relajación del músculo del corazón. También, durante la administración crónica de doxorubicina, su metabolito 13-alcohol, doxorubicinol, se acumula selectivamente en el tejido cardiaco de ratones y conejos. Adicionalmente, las investigaciones demuestran que el doxorubicinol fue 30 veces mas potente que la doxorubicina para inhibir la contractibilidad cardiaca en los músculos palpitatarios del conejo. Adicionalmente, las investigaciones demostraron que el mecanismo de la disfunción cardiaca estaba relacionado a la inhibición de Tpase, ya que el doxorubicinol, y no la doxorubicina, es un potente inhibidor de la actividad Ca2 + -Mg22+ -ATPase de retículo sarcoplasmico, Mg2+ -ATPase de mitocondria, y Na-t-K+ATPase de sarcolemma. Adicionalmente se" encontró, el daunarubicinol, y no la daunorubicina, en los tejidos del corazón dos días después del tratamiento en estudios animales.

Recientemente, el mecanismo de la cardiotoxicidad de la inducción metabólica del alcohol de la antraciclina fue explicado por Minotti et al., (The secondary alcohol metabolite of doxorubicina irreversibly inactivates aconitase/iron regulatory protein-1 in cytosolic fractions from human myocardium, FASEB Journal, 12: ¡n press, 1988) Minotti et al. Demostraron que el doxorubicinol, y no la doxorubicina, interfiere con el metabolismo del hierro e irreversiblemente desactiva la proteina reguladora del hierro proteina-l (IRP-I). Como consecuencia, el hierro no es suficiente para las enzimas que requieren de hierro para funcionar. La desactivación de estas enzimas conduce a la cardiotoxicidad.

Resulta consistente con estos descubrimientos el hecho que la dexrazoxana (ICRF-187) es útil para reducir la cardiotoxicidad de la dexorubicina (G. Weiss et al., Modulation of transferrin receptor expression by dexrazoxane (ICRF-187) via activation of iron regulatory protein, Biochemical Pharmacology, 53:1419-1424, 1997). La dexrazoxana estimula la actividad de IRP-I que contraresta el efecto del doxorubicinol.

Olson y Mushlin concibieron la idea de que un análogo de la antraciclina 13-queto que no pudiera formar el metabolito alcohol no sería cardiotóxico. La posibilidad mas atractiva era reducir el grupo 13-queto a un grupo metileno. No se conocen enzimas que puedan metabolizar este grupo en alcohol. Fueron consistentes con esta idea los resultados obtenidos con la antraciclina aclarubicina.

La aclarubicina tiene un gran número de modificaciones en comparación a la doxorubicina, incluyendo la ausencia de un grupo 14-OH. Esta droga no fue efectiva en contra de los sarcomas o carcinomas, de forma consistente con la falta de un grupo 14- OH. Sin embargo, si fue efectiva en contra de leucemias. El aclarubicin tampoco tiene 13-queto, pero, incluye un grupo 13-metileno. Esta droga es utilizada comercialmente en Francia y Japón. El Aclarubicin esta aparentemente desprovisto de cardiotoxicidad acumulada e irreversible. Los pacientes han recibido mas de 3,000 mg/m2 sin evidencia de disfunción cardiaca o cardiomiopatía (D.C. Case et al., Phase II study of aclarubicin in acute myeloblastic leukemia, American Jkournal of Clinical Oncology, 10:523-526, 1987) Los expertos en el campo no entendieron la ausencia de cardiotoxicidad del aclarubicin e incorrectamente asumieron que era debido a su distribución y farmacoquinética. Sin embargo, Olson and Mushlin creyeron esto y confirmaron la importancia de la ausencia de 13 queto en la cardiotoxicidad.

La Fig.1 es un diagrama de flujo que ilustra la ruta de la cardiotoxicidad.

Un objetivo de la presente invención es el proveer una prueba de que los derivados de la dióxidoantraciclina-13 no exhiben cardiotoxicidad.

Otro objetivo de la presente invención es eJ de proveer un proceso mejorado para preparar dichos derivados de dióxidoantraciclina- 3. •• - ¡ , Otro objetivo de la presente invención es el de proveer precursores de ciertos derivados de dióxidoantraciclina-13 y métodos para preparar los precursores. ' De acuerdo con estos y otros objetivos y ventajas, los derivados de dióxidoantraciclina-13 se obtienen de la fórmula 1.

En donde R1 es H o OH; R2 es H, OH, o Ome; R3 es H o OH; R4 es H o OH; y R5 es un carbohidrato o sustituto de carbohidrato.

La presente invención, también provee sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la fórmula 1. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen sales derivadas de bases y ácidos orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de ácidos adecuados son clorhidrico, bromihidrico, sulfúrico, nítrico perclorico, fumarico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, saliciclico, succinico, sulfuro de tulueno-p, tartárico, acético, cítrico, metanesulfónico, fórmico, benzoico, malonico, naftaleno-2-sulfonico, trifluoroacetico, y benzenesulfónico. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen alkali, como el sodio y la amonia. , ? », . Otro aspecto de la presente invención, provee métodos para el tratamiento del huésped mamífero, como tratamiento anticáncer Una cantidad efectiva de anticáncerigeno, de por lo menos un componente de la fórmula 1 se administra al huésped en una cantidad efectiva.

En donde R1 es H o OH; R2 es H, OH o Ome; R3 es H o OH; R4 es H o OH; y R5 es un carbohidrato o un sustituto de carbohidrato.

Otro aspecto de la presente invención es él de proveer un proceso para preparar derivados de 13-dióxidoantraciclina. El proceso incluye el formar una solución acida de antraciclina 13 tosilhidrazona con cianoborohidratos como agente reductor. La solución es mezclada con suavidad. La mezcla es enfriada. Se adiciona NaHCO3 saturado, acuoso, seguido de un solvente halocarbon. La mezcla se filtra. El mezcla filtrada es acidificada. La mezcla filtrada es sujeta a una cromatografía preparativa para aislar los derivados de 13-dióxidoantraciclina.

Adicionalmente, la presente invención pretende resolver Jas deficiencias arriba descritas de procesos conocidos para preparar derivados 13-dióxidoantraciclina. ¡ > - .. . , - De conformidad a lo anterior, otro objetivo de la presente invención es el proveer procesos mejorados para preparar derivados 13- dióxidoantraciclina que provea una mejora en comparación con los procesos conocidos.

De acuerdo a lo anterior, otro aspecto de la presente invención es el de proveer un proceso para la preparación de derivados de13-dióxidoantraciclina .

Generalmente, las antraciclinas de la fórmula I En donde m. , R2, R3, R4 y R5 son definidos como anteriormente se describió. Las antradiclinas son rápidamente convertidas en 13-tosilidrazonas de acuerdo a los métodos clonocidos. Las antraciclinas 13-tosilidrazonas son reducidas. a derivados 13-dióxidoantraciclina con cianoborohidrato de sodio bajo condiciones acidas. Los productos son purificados al preparar quimioterapia sin pasos de extracción. Se ha encontrado que el proceso tiene un éxito de un 70% a un 80%. Otro aspecto adicional de la presente invención provee un proceso para la preparación de derivados de 13-dióxidoantraciclina. El proceso incluye la formación de una substancia acida de alntraciclinas 13 tosilidrazonas con cianoborohidratos. La solución se remueve con suavidad . La mezcla resultante es enfriada. Se adiciona NaHCo3 acuoso, saturado, seguido por un solvente de halocarbon. La mezcla es filtrada. La mezcla filtrada es acidificada La mezcla filtrada es sujeta a cromatografía preparativa para aislar los derivados de 13-dióxidoantraciclinas.

Otro aspedto de la presente invención provee un proceso para preparación de derivados de 13- dió/idoantraciclina. El proceso incluye el formar una solución disolviendo cerca de 1 g de d Dxorubicina 13-tosilhidrazona , clorhídrica y cerca de 2.4 g de ácido p-toluenosulf ónico en cerca de 50 mL de metanol anhídrico. Se agrega cerca de 0.8g de sodio ciarjoborohídrico a la solución. La solución es calentada a una temperatura entre 689 C a 7$9C. La solución se remueve con suavidad por cerca de una hora bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla es concentrada a 20 mL. La mezcla es enfriada en un congelador a una temperatura de 09C a 4aC. Se adiciona alrededor de 2 mL de bicarbonato de sodio, saturado de agua. Se adiciona cerca de 200 mL de cloroformo a la mezcla. Se adiciona a la mezcla sulfato de sodio Anhídrico. Se filtran al exterior las sales. La mezcla filtrada es acidificada con cloruro de hidrógeno en éter dietil . La solución se pasa a través de una columna de gel sílice . Posteriormente la columna es lavada con clorof ormo/metanol, hasta que el residuo es incoloro. Una porción del producto es lavada con metanol. El metanol se evapora. Los residuos que resultan de la evaporación son disueltos en 30% de acetonitrilo en amonio, formando un buffer. El producto es aislado con HPLC preparativo utilizando una columna fénica. El producto es separado de otras impurezas utilizando acetonitrilo/amonio. La fracción purificada de HPLC es liopilizada para producir cerca de 600 mg de hidrocloridos 13-dióxidodorubicina..

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig. 1 representa un diagrama de flujo que muestra la trayectoria de la cardiotoxicidad; Fig. 2 representa una gráfica que ilustra la concentración de doxorubicinol en preparaciones ventriculares y atriales del lado derecho incubadas en 175 µM de un prototipo de un compuesto acorde con la presente invención o doxorubicina, haciendo referencia al tiempo.

Fig. 3 representa una gráfica ilustrando (3H)-timidina tomada en células HL-60 de un prototipo de un compuesto acorde con la presente invención o doxorubicina, mostrando la inhibición de crecimiento de las células; Rg. 4 representa una gráfica ilustrando (3H)-timidina tomada en células p388 de un prototipo de un compuesto acorde con la presente invención o doxorubicina, mostrando la inhibición de crecimiento de las células; Fig. 5 representa una gráfica ilustrando (3H)-timidina tomada en células MCF7 de un prototipo de un compuesto acorde con la presente invención o doxorubicina, mostrando la inhibición de crecimiento de las células; Fig. 6 representa una gráfica ilustrando. (3H)-timidina tomada en células MDA-MB-231 de un prototipo de un compuesto acorde con la presente invención o doxorubicina, mostrando inhibición de crecimiento de células; Fig. 7 representa una gráfica que ilustra el efecto del Compuesto B de la presente invención y la daunorubicina en función contráctil; y Figuras 8 a-c representan, respectivamente, fotomicrográficas magnificadas a 200 que muestran histopatología del tejido ventricular izquierdo obtenido de conejos tratados durante 20-23 semanas con un prototipo de un compuesto acorde con la presente invención, tratados con doxorubicina, o con una muestra de control, mostrando ausencia de división y pérdida miofibrilar en la muestra de doxorubicina, no mostrada ni en el compuesto A de la presente invención, ni en control de muestras.

DESCRIPCIÓN DE DISTINTOS Y MEJORES MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La presente invención hace uso del hecho de que las 13 dióxido formas de doxorubiciba, daunorubicina, u otras antraciclinas similares, no serán convertidas metabólicamente a formas 13-dihidro cardiotóxicas, por lo tanto se proveen medios para administrar los compuestos de la presente invención en cantidades no cardiotóxicas sin limitación de dosis total acumulativa.

La presente invención incluye una doxorubicina mejorada con la siguiente fórmula A, en lo sucesivo Compuesto A: El compuesto mejorado A fue sintetizado de la doxorubicina mediante la reducción de la mitad 13-queto a un grupo metileno. Experimentos in vitro demostraron que el Compuesto A no era metabolizado por el tejido del corazón a doxorubicinol bajo las mismas condiciones que la doxorubicina era convertida a este metabolito.

Los experimentos in vitro descritos arriba estudiaron la bio-transformación de la doxorubicina mejorada de la presente invención. El propósito del estudio fue el determinar si el Compuesto A acorde a la presente invención, era metabolizado al metabolito c-13 hidróxido en preparaciones aisladas de músculo cardiaco de conejo. La doxorubicina, el doxorubicinlol y el Compuesto A fueron probados en tejidos ventriculares y atriales derechos ce conejos blancos, despellejados, de Nueva Zelanda, utilizando técnicas de fluorescencia H.PCL. Delgados tejidos atriales y ventriculares se incubaron en baños al músculo (30 9C) conteniendo krebs- bicarbodato oxigenado. Se adiciono doxorubicina (175 µM)o Compuesto A (175 µM) a los baños de los atriales y ventriculares y se removieron a intervalos de 30 minutos durante 210 minutos. Cada tejido fue lavado en salina norplial , secado, cortado a la mitad y pesado. Los tejidos fueron almacenados en ampolletas a -709C para determinar la concentración en los tejidos de doxorubicina, doxorubicinjol y Compuesto A. Las concentraciones en el tejido de doxorubicina, doxorubicinol y Compuesto A fueron determinados de curvas estándares en tres experimentps por separado y expresados en +-SEM.. Se observó una dependencia del tiempo en l a concentración del compuesto A y se observó doxorubicina después de 210. minutos de incubación, las concentraciones en el tejido atrial (ng/mg) del Compuesto A y de doxorut ¡ciña no fuero diferentes en forma significante (El Compuesto A; 743+-89; doxorubicinla 617+-35). Las concentraciones del Compuesto A en el ventrículo fueron s liignif icante nente mas altas que las concentraciones de la doxorubicina después de 210 minutos d 3 incubación (Compuesto A: 743+-89; doxorubicina 617 +- 35) Las concentraciones del Compuesto A en el ventrículo fueron significantemente mas altas que las concentraciones de doxorubicina después de 210 minutos de incubación (Compuesto A: 626+-31 ) Sin embargo, sólo la doxorubicina fue metabolizada al metabolito C-13 hidróxido, doxorubicinol. No se detecto metabolismo del Compuesto A. Estos experimentas indican que el Compuesto A no formo el metabolito C 13 hidróxido en preparaciones cardiacas aisladas.

El propósito era el determinar si el Compuesto A era metabolizado al metabolito C-13 en preparaciones aisladas de músculo cardiaco de conejo.

Las pruebas se llevaron a cabo utilizando el Compuesto A de acuerdo a la presente invención.

Se llevaron a cabo ensayos utilizando el ventrículo derecho del conejo, y tejido atrial derecho e izquierdo, Krebs-bicarbonato (pH 7.4), Normal (0.9%) salino, (Nha)2SO4, alcohol isoprilo, cloroformo, daunorubicina, doxorubicina, doxorubicinol y metanol.

Las pruebas de protocolo incluyeron: delgados tejidos (80 a 100 mg cada uno) de la pared ventricular derecha libre y atrial de conejos de NZW que fueron incubados en baños de músculo aislados (30aC) conteniendo krebs-bicarbonato oxigenado (pH 7.4) de la siguiente composición: 127 mM NaCI, 2.5 mM CaCI2, 2.3 mM KCl, 25 mM Na HCO3, 1.3 mM KH2PO4, 0.6 mM MgSO4 y 5.6 mM glucosa, como sé1 reportó previamente (P.S. Mushlins et al., Br. J. Pharmacol., 110: 975-982, 1993).

De acuerdo a la síntesis de doxorubicinol, el doxorubicinol fue sintetizado por el método de Takanashi y Bachur (S. Takanashi and N:R: Bachur, Drug Metab. Disp., 4:17-87 1976) con ligera modificación (P.S. Mushlin et al., Br. J. Pharmacol., 110:975-982, 1993).

De acuerdo al análisis estadístico de los resultados del experimento, las concentraciones de tejido (ng mg) de doxorubicina, doxorubicinol y Compuesto A, se determinaron en tres diferentes experimentos y se expresaron en +-SEM. Se empleó un análisis de doble factor (ANOVA) para analizar el efecto del tratamiento en varios intervalos de tiempo utilizando el programa Primz (Trayectoria gráfica).

Los resultados de observaciones y exámenes, incluyeron la observación de un incremento dependiente del tiempo en la concentración del Compuesto A y doxorubicina en los tejidos de las paredes atriales libres (Tabla 1)y ventriculares (Tabla 2) de los conejos (Figura 1 ) Las concentraciones del Compuesto A en tejidos atriales y ventriculares fueron iguales o mayores que las concentraciones de doxorubicina. Sin embargo, sólo la doxorubicina fue metabolizada al metabolito C-13 hidróxido, doxorubicinol, y se observó una acumulación de doxorubicinol dependiente del tiempo, tanto en el tejido atrial (Tabla 1) como en el ventricular (Tabla 2) (Figura 2). No se observó metabolismo del Compuesto A (Figura 2).

Tabla 1 ND indica no se detectó metabolito C-13 hidróxido en la concentración del Compuesto A. Las concentraciones de tejido obtenidas de tres experimentos separados están expresadas en +- SEM. ND y los valores de media fueron obtenidos de tres experimentos separados.

Tabla 2 Concentraciones de los compuestos probados y de doxorubicinol en paredes de tejido ventricular derecho de conejo .

TIEMPO COMPUESTO A COMPUESTO A MÉTABOLITO PQXQflUB?CINA jDOXORUBIG?rlOL - £.13 , 30 183±9 ND Í29±I9 0.03±0.03 60 287±28 ND 251*34 0.12±0.06 90 412±87 ND 221±21 0.22±0.03 120 425±23 ND 331±27 0.80±0.08 150 443±19l ND 349±26 1.04±0.21 180 489±13 ND 377±47 1.27±0.21 210 626±31x ND 407±30 2.00±0.20 1 P>0.05, Compuesto A vs. Doxorubicina. ND indica concentración de Compuesto A C-13 hidróxido no detectable. Las concentraciones de los tejidos obtenidas de tres experimentos separados están expresadas en +- SEM. Los valores de la media y Nd, fueron obtenidos de tres experimentos separados.

Las discusiones y conclusiones del experimento incluyen que los resultados del experimento indican que el Compuesto A no forma el metabolito C-13 hidróxido en preparaciones cardiacas aisladas de conejos. Sin embargo, la doxorubicina , si fue metabolizada a doxorubicinol, a C-13 metabolito hidróxido. Adicionalmente, los resultados del experimento indican que el cambio metabólico de la doxorubicina en doxorubicinol parece ser mayor en el tejido atrial que en el ventricular.

La Figura 2 ilustra la concentración de doxorubicinol en las preparaciones atrial derecha (A) y ventricular (V) incubadas en 175 µM del> Compuesto A o en doxorubicina. Como se puede ver en la Fig. 2, el compuesto de la presente invención esta presente en una concentración mucho menor en comparación con la doxorubicina.

Otros estudios in vitro mostraron que el Compuesto A de la presente invención fue tan efectivo como la doxorubicina en inhibir el crecimiento de células de cáncer en humanos.

Los experimentos que demuestran la efectividad del compuesto de la presente invención al inhibir el crecimiento de células de cáncer, comparan los efectos del Compuesto A de la presente invención y la doxorubicina en proliferación de células in vitro.

De acuerdo a los experimentos que demuestran la efectividad del compuesto de la presente invención, el efecto anti-proliferativo del Componente A fue comparado con la doxorubicina en líneas de células derivadas de leucemia humana y murina (HL60 y P388) y de cáncer mamario humano (MCF 7 y MDA-MB 231). La inhibición de la proliferación de células cancerígenas fue estudiada midiendo la incorporación celular de (3H) timidina. El efecto anti proliferativo del componente A fue comparado con la doxorubicina bajo las mismas condiciones. La concentración que produjo 50% de máxima inhibición (IC50) fue obtenida de análisis de curva . Se muestran abajo valores de la media de IC50 (en nM) con 95% de seguridad en los intervalos. Los valores fueron determinados en 3 - 4 ensayos separados repetidos por triplicado.

LINEA CELULAR COMPUESTO A DOXQRUB?CTNA POTENCIA RACTON HL60 127 (10,8-149) 5-8(47-70) 2.2 P388 1980(1830-2140) 269(242-299) 7.4 MCF7 72(68-77) 17(17-18) 4.2 MDA- B231 182(81-408) 43(34-53) 4.2 Tanto el compuesto A como la doxorubicina abolieron completamente la incorporación de (3H) Timidina en la células, en cada una de las cuatro líneas de células estudiadas. Como se muestra por los valores de IC50 (potencia), la doxorubicina fue mas potente que el Compuesto A para inhibir la incorpotación de timidina en las cuatro líneas celulares estudiadas. Ver figuras 3-6. Estos estudios demuestran que tanto el Compuesto A como la doxorubicina son potentes inhibidores de proliferación de células de cáncer in vitro, aunque, como se muestra por los valores de IC50, la doxorubicina fue, de alguna manera mas potente que el Compuesto A para inhibir la incorporación de (3H) timidina en las cuatro líneas celulares (P<0.05).

El propósito del estudio incluyó el determinar la potencia del Compuesto A para inhibir la proliferación del crecimiento de células en líneas de células malignas cultivadas de leucemia humana y murina (HL 60 y P388) y cáncer de seno humano (MCF7 y MDA-MB 231), utilizando un protocolo de incorporación de timidina bien establecido (E: Severison y E.L. Larsson, Lymphocyte responses to polyclonal B and T cell activators, in D.M. Weir (Ed.), Cellular immunology, Vol 2, Fourth edition, Blackwell Scientífic Publications, p. 631 , 1986), para calcular una concentración efectiva produciendo 50% de la máxima respuesta (IC50) para el compuesto probado en cada una de las cuatro líneas celulares, y para comparar el valor con el valor obtenido para la doxorubicina.

La dilución de los compuestos fue hecha en células especificas sobre los siguientes rangos: Las diluciones fueron adicionadas a todos los pozos en triplicado en 50µl y las células crecieron en la presencia de los compuestos probados durante 24 horas.

Análisis estadísticos incluyeron pruebas t disparejas cuando era apropiado. El nivel significante fue elegido como P<0.05.

Los resultados de las observaciones y exámenes fueron las siguientes. En las cuatro líneas de cáncer probadas, el Compuesto A y la doxorubicina produjeron concentraciones de inhibición dependiente a la toma de (3H) timidina. Las concentraciones que produjeron el 50% de las respuestas máximas a los valores () fueron obtenidas de la curva de análisis. Los valores IC50 (en NM) se muestran abajo y reflejan la media (con 95% de limite de seguridad en paréntesis) de 3 a 4 pruebas se repitieron en triplicado.

Los resultados indican que el Compuesto A es menos potente que la doxorubicina en inhibir la proliferación celular en las cuatro líneas celulares in vitro. Sin embargo, ambos compuestos son igualmente eficaces.

Las conclusiones y discusiones de los resultados de las pruebas in vitro indican que tanto el compuesto A como la doxorubicina abolieron completamente la incorporación de (3H) Timidina en la células, en cada una de las cuatro líneas de células estudiadas. Como se muestra por los valores de IC10 (potencia), la doxorubicina fue mas potente que el Compuesto A para inhibir la incorpotación de timidina en las cuatro líneas celulares estudiadas (P<0.05). Ver figuras 3-6. Estos estudios demuestran que tanto el Compuesto A como la doxorubicina son potentes inhibidores de proliferación de células de cáncer in vitro. Las figuras 89-c representas fotomicrográficas que ilustran los efectos en el tejido de corazón de un compuesto de la presente invención en comparación al compuesto doxorubicina en una muestra de control.

Estudios en vivo mostraron que el Compuesto A fue efectivo en prolongar la sobrevivencia de un ratón en un modelo de leucemia de ratón con menos toxicidad sistémica que la doxorubicina como se muestra abajo.

A continuación se describen los efectos del Compuesto A sobre leucemia P388 los ratones.

Varios ratones machos CDF1 fueron inoculados con 106 P338 células de leucemia murina en el día cero. De los días 1 a 9 los ratones fueron tratados con el Compuesto A o doxorubicina. Se midió el peso del cuerpo diariamente y se registró la sobrevivencia. En uno de esos estudios, los ratones fueron tratados con dosis de doxorubicina o Compuesto A de 0.8 mg/Kg/día. En el día 22 habían 0/8 sobrevivientes en el grupo vehículo, 7/8 en el grupo de doxorubicina, y 5/8 en el grupo del Compuesto A. Los valores para la doxorubicina y para el Compuesto A fueron muy diferentes de los valores para el vehículo, pero no entre ellos.

En otro estudio con el mismo modelo de leucemia murina, se inyectó doxorubicina en una dosis de 0.8 mg/Kg/día y el Compuesto A fue inyectado a 1.6, 2.4, 0 3.2 mg/Kg/día Tabla 3 Los valores de la tabla son la media +-SE; * P>0.05 versus vehículo; # p<0.05 versus doxorubicina.

El día 19, el Compuesto A a 1.6 mg/Kg/día fue tan efectivo como la doxorubicina en suprimir el aumento de peso que resulta del crecimiento de la leucemia mas la ascitis asociada. Tanto la dosis 2.4 como la 3.2 mg/Kg/día del Compuesto A fueron mas eficientes que la doxorubicina en suprimir el aumento de peso. En el día 25 todas las dosis del Compuesto A fueron tan eficientes como la doxorubicina en mantener la sobrevivencia. En el día 32, sólo el compuesto A, 3.2 Mg/Kg/día, fue efectivo en prolongar la sobrevivencia, en comparación al vehículo y la doxorubicina. La dosis de doxorubicina utilizada en este estudio es la dosis mas efectiva en este modelo. Dosis mas altas de doxorubicina decrecen la sobrevivencia. Por lo tanto, a pesar de que el Compuesto A es menos potente que la doxorubicina, aquel es mas efectivo en dosis mas altas para prolongar la sobrevivencia.

El Compuesto B, el análogo de daunorubicina 13-dióxido, también mostró no tener las propiedades cardiotóxicas de la daunorubicina en un modelo de rata in vivoeLa discusión que sigue abajo, demuestra la falta de efectos cardiotóxicos del Compuesto B de la presente invención en una rata después de su administración intravenosa.

La Daunqrubicina hidro cloruro o Compuesto B hidrocloruro en agua fue inyectada intravenosamente a 5 Mg/Kg/día cada tercer día durante 3 días (dosis total 15 mg/Kg) en ratas machos Sprague Dawley. Un grupo vehículo separado fue estudiado con cada compuesto. En el séptimo día después de la primera dosis, cada rata fue anestesiada con sodio pentobarbital, 50 mg/Lg c/u. La traquea fue entubada y las ratas respiraron 100% oxigeno. La temperatura del cuerpo se mantuvo a 379C con una lámpara calentadora y un control de temperatura. Se colocó un catéter en la arteria carótida derecha y se avanzó a la aorta para medir la presión Arterial (MAP) y el ritmo cardiaco (HR) utilizando un transductor de presión Statham y una grabadora Gould. El catéter se adentró dentro del ventrículo izquierdo, para registrar la presión sistólica ventricular izquierda (LVSP), la máxima dP/dt ventricular izquierda (dP/dt), y la presión diastólica ventricular izquierda (LVEDP).

En las ratas tratadas con daunorubicina, MAP, LVSP. Y dP/dt fueron deprimidos substancial y significativamente, en comparación con los vehículos de control (Tabla 4). El peso corporal también disminuyó substancialmente en ratas tratadas con daunorubicina. En contraste, el MAP.LVSP, d/Pdt, y el peso similar entre los vehículos y las ratas tratadas con el Compuesto B fue similar (Tabla 5). Los datos muestran que el Compuesto B carece de cardiotoxicidad en una dosis en la que la daunorubicina produce una disminución sustancial en el comportamiento contráctil cardiaco. Los resultados ilustran que el Compuesto B puede ser administrado en una dosis terapéutica sin producir cardiotoxicidad, siendo que la misma dosis terapéutica de daunorubicina produce una función cardiaca dispareja.

TABLA 4 Efectos de daunorubicina y vehículo sobre la función ventricular izquierda en la rata después de dosis repetidas. ,ft MAP HR LVSP dP/dt LVEDP B 1 B 2 TRATAMIENTO ^g b/mintntnHg mmHg/Sec tranHg gms gms 358 381 EHÍCULO 113 353 126 5,850 3.9 n=5 ±9 ±21 ±7 ±400 ±0.8 ±13 ±13 DAUNORUBTCINA 54* 325 71* 3,000* 5.6 397 309* ±10 ±6 ±13 ±500 ±1.3 ±12 ±3 n=4 Los valores en la tabla 4 son medias + - errores estándar; las ratas fueron inyectadas con el compuesto a 5 mg/Kg/día de manera intravenosa cada tercer día durante 3 días; las medidas se tomaron en el día 7 después de la primera inyección. BW1= peso del cuerpo en el día 0, BW2= peso del cuerpo en el día 7. * =p<0.05 versus vehículo TABLA 5 TRATAMIENTO Rat MAP HR LVSP dP/dt LVEDP BW1 BW2 # mmHg b/minmmHg mmHg/sea mmmmHHgg » gms gms VEflICULO 1 125 350 145 .5,500 2.81 380. 389 2 127 335 150 5,250 7.50 378 372 MEDIA 126 343 148 5,375 5.20 379 381 ±SE ±1 ±8 ±3 ±125 ±2 ±1 ±9 COMPUESTO 3 112 410 135 5,000 3.13 388 383 B 4 125 340 163 6,850 7.50 373 373 MEDIA 119 375 149 6,175 5.30 381 378 ±SE ±7 ±35 ±14 ±675 ±2.19 ±8 ±5 Las ratas fueron inyectadas con el compuesto a 5 mg/Kg/día intravenosamente cada tercer día, durante tres días, las medidas se tomaron en el día 7, después de la primera inyección; BW1= peso del cuerpo en el día cero, BW2= peso del cuero en el día 7.

El Compuesto A también fue evaluado en un modelo de cardiotoxicidad crónica de doxorubicina en un conejo. En este modelo la doxorubicina produce función cardiaca dispareja y cambios histopatológicos similares a los vistos en los humanos tratados crónicamente con doxorubicina se observó Histopatología y/o funcionamiento disparejo del corazón del conejo en 5/6 conejos tratados con doxorubicina. Bajo las mismas ] o condiciones, el componente A no produjo cardiotoxicidad clínicamente relevante.

La naturaleza no-cardiotóxica del componente de la presente invención es soportada por el siguiente estudio, que mide la cardiotoxicidad de la doxorubicina y dei Compuesto A en un modelo de conejo. 15 De acuerdo al estudio, cuatro conejos blancos machos de Nueva Zelanda fueron colocados al azar en cuatro grupos. Seis conejos fueron inyectados con 1 mg/Kg de doxorubicina dentro de la vena marginal del oído, dos veces a la semana durante 8 semanas. Seis conejos adicionales fueron inyectados con 1 mg/kg del compuesto A dentro de la vena marginal del oído dos veces a la semana durante 8 semanas. Se monitoreó diariamente el consumo de alimentos de los conejos tratados con doxorubicina y con el Compuesto A y la misma cantidad de alimento se le dio a conejos de control del mismo sexo y edada los que se les administró dentro de la vena marginal del oído con el vehículo (0.9% NaCI) se monitoreó la aceleración aórtica semanalmente con una técnica de ultrasonido. Se determino un acortamiento fraccional cada tercer día mediante ecocardiografía modo-M comenzando le décima semana del estudio y durante la duración del estudio. Se les hizo eutanasia a los conejos al comienzo de la semana 20 cuando el acortamiento fraccional fue menor que el 25% o permanecía entre un 25-29% durante por lo menos tres semanas. Se prepararon muestras del músculo de palpitación ventricular izquierdo y de la pared libre ventricular de los conejos sacrificados para análisis histológico. Las lesiones fueron graduadas como leves, moderadas o severas con base en el grado de degeneración miofibrilar, inflamación mononuclear y necrosis. Ocurrió un acortamiento fraccional anormal en 4/6, 0/6, 1/6 y 0/6 conejos en el grupo tratado con doxorubicina, Compuesto A, grupo de control de doxorubicina y grupo de control de Compuesto A respectivamente. Ocurrió aceleración de la raíz aórtica anormal (valores menores a 9/m/s/s en 3/6, 0/6, 0/6 y 0/6 en el grupo tratado con doxorubicina, Compuesto A, grupo de control de doxorubicina y grupo de Control A respectivamente. Los 6 conejos tratados con doxorubicina tuvieron histopatología anormal en un rango de media a severa; 2/6 conejos en el grupo tratado con el Compuesto A tuvieras anormalidades histológicas leves. No se observaron lesiones histopatológicas ert el tejido cardiaco de ambos grupos de control de conejos. El estado cardiaco general fue definido como anormal cuando por lo menos dos de tres pruebas de cardiotoxicidad fue anormal. Utilizando este criterio, 5/6 conejos en el grupo tratado con doxorubicina tuvieron un estado cardiaco general anormal; 0/6 fueron anormales en los otros tres grupos (P<0.05, Fisher Exact test). En comparación a la doxorubicina, el Compuesto A esta esencialmente libre de cardiotoxicidad en el nivel de dosis experimentado. Adicionalmente, El Compuesto A no tiene efectos apreciables sobre hematología y aumento de peso, siendo que la doxorubicina alteró significantemente la hematología y deprimió el aumento de peso Con la dosis señalada, el Compuesto A produce menos cardiotoxicidad y toxicidad sistémica en los conejos que la doxorubicina.

El propósito de los experimentos que determinaron la cardiotoxicidad incluyó el comparar la cardiotoxicidad del Compuesto A y de la doxorubicina en un modelo de conejo crónico.. 67% de los conejos tratados con doxorubicina desarrollaron un acortamiento fraccional anormal del ventrículo izquierdo,. Tres de seis conejos tratados con doxorubicina (50%) desarrolló aceleración aórtica anormal. En contraste, ninguno de los conejos tratados con el Compuesto A tuvo evidencia funcional de cardiotoxicidad. El indicador mas sensible de la cardiotoxicidad fue la histopatología. Todos los conejos tratados con doxorubicina mostraron lesiones histopatológicas caracterizadas primordialmente por pérdida miofibrilar. Cuatro de seis conejos mostraron cardiotoxicidad leve, un conejo tuvo lesiones moderadas y un conejo mostró lesiones severas. 2 de 6 conejos tratados con el compuesto A tuvieron lesiones histopatológicas leves (ver Figura 8). Al terminar el resultado de las tres pruebas de cardiotoxicidad, se observó un estado cardiaco anormal en 5 de 6 conejos tratados con doxorubicina y ningún' conejo coh estado cardiaco anormal en el grupo tratado con el Compuesto A (P< 0.02, Fisher's Exact test)-. La cardiotoxicidad general se determinó como anormal cuando por lo menos 2 de 3 pruebas de cardiotoxicidad fueron anormales). Durante la semana 8 del estudio, se tomaron muestras de sangre de la arteria marginal del oído para obtener un conteo de células sanguíneas. El tratamiento con doxorubicina produjo una reducción significante de glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas, hemoglobina, concentración crepuscular de hemoglobina, y el ancho de distribución de los glóbulos rojos, en comparación a los animales vehículo, o tratados con el Compuesto A, P>0.05. El compuesto A no alteró estas variables en comparación al grupo vehículo, excepto por un ligero incremento en el ancho de distribución de los glóbulos rojos. Adicionalmente, el tratamiento con doxorubicina inhibió la ganancia de peso en comparación con el Compuesto A. Los conejos tratados con el compuesto A pesaron 3.17 +- 0.06 Kg al principio del estudio y 4.10 +- 0.10 Kg al final del estudio, en el tratamiento con doxorubicina los conejos tratados pesaron 3.19 +- 0.1 OKg al principio del estudio y 3.54 +- 0.06 Kg al final del estudio (P>0.05, 1 way anova, Duncan's New Múltiple Range test).

La aceleración anormal aórtica es definida como valores menores a 9-0. Las unidades de aceleración son m/s/s. N= Función Cardiaca Normal; A= Función Cardiaca Anormal.

Los conejos fueron inyectados ya sea con 1 mg/kg de doxorubicina o Compuesto A (DOXA) 2 veces por semana durante 8 semanas (dosis acumulativa total de 16 mg/kg).

El grupo de doxorubicina fue significantemente diferente que el Compuesto A, CX o grupo. C (P<0.05; 2x2 continguency Chi square analysis, two tail.) Los conejos fueron inyectados iv con 1 mg/Kg de doxorubicina (DOX) o Compuesto A (DOXA) 2 veces por semana durante ocho semanas ( dosis acumulativa total 16 mg/kg).

N= función cardiaca o histapatología Normal; A Función cardiaca o histopatología anormal. El estado cardiaco general fue definido como anormal cuando por lo menos 2 de 3 pruebas de cardiotoxicidad fueron anormales. Se definió Acortamiento fraccional anormal cuando hubieron valores sostenidos en la media de veinte por ciento o menores. Se definió aceleración aórtica anormal con valores menores a 9.0 mists. Se definió histopatología anormal cuando ocurrió lesión miofibrilar, inflamación mononuclear . La histopatologia se graduó en leve, moderada y severa como se describió anteriormente, El grupo tratado con doxorubicina tuvo de manera significativa, mas animales con estado cardiaco general, anormal que el grupo tratado con el Compuesto A, C y CX (P<0.02; Fisher's Exact Test two tailed).

TABLA 6 Evaluación Cardiotóxica del Compuesto A en Conejos Incidencia Punto final cardiotoxicidad Doxorubicina Compuesto A Acortamiento fraccional Deprimido 4/6 0/6 Aceleración Aórtica Deprimida 3/6 0/6 Histopatología Anormal 6/6 2/6 Cardiotóxicida General 5/6 0/6 Dosis de doxorubicina: 1 mg/kg, dos veces por semana, durante 8 semanas. Histopatología anormal: lesión miofibrilar, vacuoles. Cardiotoxicidad General: p<0.02 versus doxorubicina.

Entre las conclusiones de los estudios de cardiotoxicidad se encuentra que el Compuesto A no alteró la función cardiaca y mostró sólo efectos histopatológicos leves en 2/6 conejos. Por otro lado, la doxorubicina alteró la función cardiaca en 5/6 conejos y todos lo conejos mostraron histopatología anormal en el modelo de cardiotoxicidad crónica en conejos. En comparación a la doxorubicina, el compuesto A carece esencialmente de cardiotoxicidad en el nivel de dosis experimentado. Adicionalmente, el compuesto A no tiene efectos perceptibles sobre la hematología y aumento de peso corporal. Con la dosis de la presente invención, el Compuesto A produce menos cardiotoxicidad y toxicidad sistemática en conejos en comparación con la doxorubicina.

En pruebas subsecuentes de toxicidad en ratones, el Compuesto a también mostró menos toxicidad en la medula del hueso que la doxorubicina, como se demuestra abajo.

TABLA 7 Los efectos del Compuesto A sobre los glóbulos rojos y linfocitos en la médula del hueso en un ratón (n=4-5).

Hembra Porcentaje total de Linfocitos en la médula Del hueso Macho Hembra Las drogas fueron administradas intravenosamente en los días 1 , 5, y 9. Las medidas se hicieron sólo el día 15. Los valores son medias +- SE. += diferente del vehículo, p< 0.05, #= diferente del Compuesto A, p< 0.05. Ambas dosis son las dosis máximas sub-letales.

Los resultados de los estudios arriba descritos claramente demuestran que el Compuesto A es una forma no cardiotóxica de la doxorubicina. , Debido a que el Compuesto A retiene la mitad 14 -OH, es probable que el Compuesto A será útil en sarcomas y carcinimas y leucemias. No se espera que ocurra un limite en la dosis de cardiotoxicidad debido a que el Componente A no forma el metabolito tóxico 13-alcohol. Consecuentemente, el compuesto A, en oposición a la doxorubicina, puede ser administrada tanto como sea necesario para producir remisión y/o prevenir la recurrencia de metástasis. En este aspecto, el Compuesto A y las otras 13-dióxidoantraciclinas representas una mejora mayor en la quimioterapia con antraciclina.

Los resultados demuestran que los derivados de la antraciclina, como el Compuesto A deberían de ser clínicamente mas efectivos que cualquiera de su contrapartes no 13-dióxidoantraciclina, debido a que pueden administrarse a dosis mas altas y por periodos mas largos de tiempo, ya que producen menos toxicidad sistémica y no producen cardiotoxicidad acumulativa. Los derivados 13, dióxidoantraciclinos empleados en la presente invención en tratamiento de pacientes que sufren de cánceres tratables con doxorubicina y daunorubicina, exhiben capacidad para ser administrados en dosis de por lo menos 1.5 veces la dosis acumulativa equipotente comparada con los compuestos 13-queto.

La presente invención también provee, métodos mejorados para formar derivados de 13-dióxidoantracivclina. La tabla 8 provee ejemplos de derivados de 13-dióxidoantraciclina que pueden sintetizarse de acuerdo a la presente invención. Como se discutió arriba, dichos compuestos tienen propiedades anti-tumor.

De manera diferente a los procesos conocidos, los procesos de la presente invención son menos sensibles a la temperatura. Por ejemplo, se puede llevar a cabo a una temperatura de cerca de 09C a cerca de 75§C. Preferentemente, tos procesos se llevan a cabo- a una temperatura de cerca de 659C a 75§C. Mas preferentemente, los procesos se. llevan a cabo a una temperatura de cerca de 65§C. Preferentemente, los procesos se llevan a cabo a una temperatura cerca de 68dC a 729C. Las temperaturas superiores a 729C. causan la descomposición de los reactores y los productos.

Los procesos de la presente invención incluyen varias condiciones generales. Por ejemplo, los procesos preferentemente se llevan a cabo en condiciones acidas. En otras palabras el pH debe de ser de 6.5 o menos. Se ha descubierto que los procesos conocidos para preparar los Compuestos arriba descritos, los cuales requieren de í condiciones básicas dentro de la mezcla de reacción, causan la descomposición de los reactores y productos. Por lo anterior La reacción, producida al mezclar las sustancias, debe de llevarse a cabo a una temperatura máxima de 759C, en ausencia de oxigeno de agua y/o bajo nitrógeno.

Adicionalmente, tanto el oxigeno como el agua deben de ser excluidas de los reactores. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en nitrógeno o en atmósfera de gas inerte , utilizando solventes anhídridos.

Los procesos de la presente invención dan resultado en un porcentaje mucho mayor que los procesos conocidos para preparar los compuestos. Por ejemplo, se ha encontrado que los compuestos tiene un porcentaje de éxito de 30% Por otro lado, se ha encontrado que los procesos de la presente invención tiene un éxito dei 70% al 80%, De acuerdo a lo anterior, la presente invención provee un ejemplo de la transformación progresiva de la molécula a través del proceso.

En donde R1 , R2, R3, R4, y R5 se han definido anteriormente.

El siguiente diagrama de flujo ilustra un ejemplo de un prototipo de un método de la presente invención para producir 13-dióxidodoxorubicina, el cual es un derivado de 13-dióxidoantraciclina.

Mezcla reactiva Adicionar NaHCO3 acuoso Adicionar CHCI3 Filtración Filtrato desecho de sales Acidificar con HCl Cromatografía de columna Sobre gel sílice.

Limpieza con 10/1 : CHCI3: CH3OH limpieza con CH3OH Desechar fracción 1 Fracción 2 Concentrado HPLC preparativo Solución de 13- dióxidoantraciclina pura Liofilizar 13-dióxidoantraciclina sólida. sigue son ejemplos de derivados de antraciclina de la presente invención.

En los compuestos, R5 puede ser una versión modificada de antraciclinas análogas diferentes. También el anillo D puede ser fluorinatado.

Generalmente, los procesos de la presente invención incluyen la formación de una solución de 13-dióxidoantraciclina con un agente reductor. La solución es mezclada suavemente. Posteriormente, la mezcla de la reacción debe de ser enfriada. De acuerdo a un ejemplo , la mezcla de la reacción es enfriada a una temperatura de 09C. a cerca de 49C. posteriormente se adiciona una base a la mezcla de reacción. La base puede ser fría. Por ejemplo, la base puede estar a una temperatura de 0 a 49C. Un ejemplo de base es NaHCO3 saturado en agua. Se debe adicionar un solvente halocarbon a la mezcla reacción. El solvente halocarbon puede adicionarse a la mezcla reacción de manera simultánea con la base. El solvente halocarbon puede estar frió. Por ejemplo, el solvente halocarbon puede estar a una temperatura de 0 a 4BC. Un ejemplo del solvente halocarbon que puede utilizarse es CHXI3. La mezcla reacción puede ser filtrada. La filtración puede hacerse a una temperatura reducida. Por ejemplo, la filtración puede hacerse a una temperatura de 4eC a 159C.

La adición de la base y del halocarbón solvente descrito arriba inician la precipitación por hidrólisis. Es la precipitación de sales inorgánicas que puede filtrarse de la mezcla de reacción. Después de la filtración, el filtrado puede acidificarse. El filtrado puede ser sujeto a una cromatografía de columna sobre gel sílice. Las impurezas hidrofóbicas pueden aislarse mediante su limpieza con menos solventes polares. Los productos 13-dióxidoantraciclina puede ser limpiados y posteriormente purificado.

Preferentemente, los procesos de la presente invención incluyen el formar una substancia de antraciclina 13-tosilidrazona en metanol anhídrido con p-ácido toluenosulfónico y cianoborohidrido de sodio . La substancia es mezclada suavemente bajo nitrógeno y posteriormente enfriada. Se adicionan cloroformo y bicarbonato de sodio saturados en agua. Las sales precipitadas son filtradas y el filtrado es acidificado con cloruro de nitrógeno en éter dietil y posteriormente es aislado sobre una columna con gel sílice. Las impurezas hidrofóbicas que resultan de la descomposición son limpiadas con una solución con mezcla de cloroformo y metanol. El fluido de metanol es posteriormente purificado con HPLC preparativo.

De acuerdo a cualquiera de los procesos descritos arriba, antes o después de la ailación de las 13-dióxidontraciclinas, las 13-dióxidoantraciclinas pueden ser tratadas con uno o mas agentes reductores, capaces de reducir la división 13-queto a división metileno.

A continuación se describe un ejemplo de un proceso conforme a la presente invención.

Ejemplo Preparación de hidrocloruro 13-dióxidodoxorubicina 1 g de doxorubicina hidrocloruro 13-tosilidrazona y 2.4 g de ácido p-toluenosulfónico son disueltos en 0.8 g de cianoborohidrido de sodio. La solución resultante es calentada a 68-729C y se mezcla suavemente durante una hora bajo una atmósfera de nitrógeno.

Posteriormente la mezcla reacción es concentrada en cerca de 20mL y enfriada en un congelador a 0-49C. Se adicionan 2 mL de bicarbonato de sodio seguido de 200 mL de cloroformo. Se adiciona sulfato de sodio anhídrido y las sales son filtradas después de agitarse. El filtrado es acidificado con cloruro de hidrogeno y éter dietil.

La solución se pasa a través de una columna de gel sílice (2.5 x 5 cm). La columna posteriormente es lavada con cloroformo/metanol (10/1 ) hasta que el fluido es incoloro. La porción que contiene el producto es limpiada con metanol. El fmetanol se evapora y los residuos son disueltos en 30% de acetonitrilo en amonio (pH= 4.0, 0.5%) y aislado mediante HPLC. Se utiliza una columna de fenol y la separación del productos y de las demás impurezas se logra utilizando un amonio/acetonitrilo (con un porcentaje de 27% a 30% de acetonitrilo durante 30 minutos) La porción de HPLC purificado es lipilizado para dar un hidroformato sólido 13-dióxidodoxorubicina, que posteriormente es disuelto en metanol con cloruro de hidrogeno. El solvente es evaporado y se produce su precipitación en metanol/etil para dar 600 mg de hidrocloruro de dióxidodoxorubicina. El éxito es de 80%.

TLC : Rf=0 .38 CHC13 : MeOH . : H2Q 30 10 1 U. V. : ?max=233 , 252 , 293 , 485 nm MS : 530 (M+H) , 1HNMR (methanol d4) : (see below) d 1.30 (d, 3H, 6'-H3) , 1.85 (m, 2H, 13 -H2) , 2.05 (m, 2H, 10-H2) , 2.60 (d, ÍH, 12-H), 3.05 (d, ÍH, 12-H), 3.55 (m, 1H, 5'-H), 3.90 (m, 2H, 14-H2) , 4.05 (m, 3H", 0-CH3) , 4.25 (m, ÍH, 4'-H), 4.95 (m, ÍH, 3'-H) , 5.40 (m, ÍH, l'-H), 7.50 (dd, ÍH, 3-H), and 7.80 (m, 2H, 1-and 2-H) .

La presente invención también incluye métodos para tratar huésped mamífero con necesidad de tratamiento anticáncer. Los métodos incluyen administrar a los huéspedes una cantidad anticáncer efectiva de por lo menos un compuesto de la formula 1 en una cantidad efectiva anticáncer.

La cantidad efectiva anticáncer del compuesto de la presente invención puede administrarse dependiendo del mamífero, el peso corporal, edad, condición individual, y forma de administración. Los componentes de la presente invención pueden administrarse por medios convencionales disponibles para su uso en conjunción con medicinas, ya sea como agentes terapéuticos individuales o en combinación con agentes terapéuticos. Ellos pueden ser administrados solos, pero generalmente son administrados con un transportador farmacéutico seleccionado sobre la base de elegir la ruta de administración y la práctica farmacéutica estándar.

Las dosis administradas variarán dependiendo de factores conocidos, como características farmacodinámicas del agente particular y su modo y ruta de administración; la edad, salud y peso del receptor, la naturaleza y extensión de los síntomas, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento; y el efecto deseado. Una dosis diaria del ingrediente activo puede ser de 0.001 a 1000 mg por Kg. De peso corporal, siendo la dosis preferente de cerca de 0.1 a cerca de 30 mg/kg.

Las dosis (composiciones adecuadas para su administración) contienen de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad de cerca de 0.5-95% por peso, basado en el peso total de la composición.

El ingrediente activo puede ser administrado oralmente en dosis sólidas, como cápsulas, tabletas y polvos, o en dosis en forma líquida como elixirs, jarabes, y suspensiones. También pueden administrarse parentarialmente en líquidos estériles. El ingrediente activo administrarse intranasalmente o por inhalación. Son posibles otras formas de administración, como la transdérmica, via mecanismo de parche o ungüento.

El ingrediente activo puede contenerse en cápsulas de gelatina, transportadores en polvo como lactosa, derivados de celulosa, esterato de magnesio, ácido estérico y otros. . Otros diluyentes puede utilizarse para hacer comprimidos en tabletas. Tanto las tabletas como las cápsulas pueden elaborarse como productos de ' liberación continua para proveer una liberación continua del producta en un periodo de tiempo. Las tabletas comprimidas pueden tener azúcar o una cubierta para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger la tableta de la atmósfera, o con cobertura entérica para desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las dosis líquidas orales pueden contener colorantes y saborizantes para incrementar la aceptación de los pacientes.

En general las substancias como el agua, aceite adecuado, sales, dextrosa acuosa (glucosa) y soluciones con azúcar y glicoles como glicol propileno, o glicol polietileno son portadores adecuados para soluciones parenterales. Las soluciones parenterales preferentemente deben de tener sal soluble en agua con el ingrediente activo y agentes estabilizadores. Los agentes antioxidantes como el bisulfato de sodio, sulfato de sodio, ácido ascórbico, ya sea solos o combinados, son agentes estabilizadores adecuados. También se utiliza ácido cítrico y sus sales y EDTA de sodio Adicionalmente los portadores farmacéuticos están descritos en el texto Remington's Pharmaceuticals Sciences, Mack Publishing Company, un texto de referencia estándar en este campo.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Nosotros reivindicamos:

1.- Un método para tratar un huésped mamífero que necesita un tratamiento anti cáncer, el método comprende los pasos de: administrar sin limitación al huésped, bajo dosis totales acumulativas, una cantidad efectiva anti cáncer de por lo menos un compuesto representado por la fórmula 1 : En donde R1 es H o OH; R2 es H, OH, o Ome; R3 es H o OH; R4 es H o OH; y R5 es un carbohidrato o un sustituto de carbohidrato.

2.- El método de la reivindicación 1 , en donde la dosis acumulativa total es de por lo menos 1.5 veces la dosis equipotente de un compuesto 13-queto correspondiente.

3.- El método de la reivindicación 1 , en donde el compuesto es 13-d?óxidodaunorubicina.

4. El método de la reivindicación, en donde el compuesto tiene la fórmula:

5. Un proceso para preparar derivados de 13-dióxidoantraciclina, dicho proceso comprendiendo los pasos de: formar una solución de antraciclina 13-tosilidrazona; adicionar un agente para reducir la mitad 13-queto a metileno; remover la solución; enfriar la mezcla reacción; adicionar NaHCO3 saturado en agua; adicionar un halocarbón solvente a la mezcla reacción; filtrar la mezcla reacción; acidificar la mezcla filtrada; y sujetar la mezcla filtrada a cromatografía para aislar los derivados de 13- dióxidoantraciclina.

6.- Un proceso para la preparación de derivados de 13-dióxidoantraciclina, dicho proceso 5 comprendiendo" los pasos de: formar una solución de antraciclina 13-tosilidrazona en metanol anhidrico con acido p- toluenosulfónico y cianoborohidrato de sodio; remover la solución suavemente bajo nitrógeno; 0 enfriar la solución; adicionar a la solución bicarbonato de sodio saturado de agua y cloroformo para formar un precipitado; filtrar la precipitación: acidificar el filtrado con cloruro de hidrogeno en éter dietil; 5 aislar la sal contenida en la precipitación filtrada en una columna de gel sílice; limpiar las impurezas hidrofóbicas que resultan de la descomposición de las sales con una solución mezclada de cloroformo y metanol; limpiar los productos 13-dióxidoantriciclinos con metanol; y purificar el metanol con HPLC preparativo. :0

7.- El proceso de la reivindicación 6, en donde dicha solución tiene un pH de 6.5 o menos.

8.- El proceso de la reivindicación 6, en donde dicha mezcla se lleva a cabo en una temperatura de 689C a cerca de 729C. 5

9.- El proceso de la reivindicación 6, en donde la mezcla se lleva a cabo a una temperatura de 659C a cerca de 759C.

10.-EI proceso de la reivindicación 6, en donde dicha mezcla se lleva a cabo a una temperatura mayor a los 759C.

11.- El proceso de la reivindicación 6, en donde dicha mezcla se lleva a cabo en ausencia de oxigeno.

12.- El proceso de la reivindicación 6, en donde dicha mezcla se lleva a cabo en ausencia de agua.

13.- El proceso de la reivindicación 6, en donde dicha mezcla se lleva a cabo en una atmósfera de nitrógeno.

14. El proceso de la reivindicación 6, en donde dicha mezcla se lleva a cabo en una atmósfera de gas inerte.

15.- El proceso de la reivindicación 6, en donde dicho proceso es exitoso en un rango de 70% a 80%.

16. Un proceso para la preparación de derivados de 13- dióxidoantraciclina, dicho proceso comprendiendo los pasos de: formar una solución de antraciclina 13-tos?lhidrazona; adicionar un agente reductor; mezclar la solución; enfriar la mezcla resultante; adherir NaHCO3 saturado de agua; adicionar un halocarbon solvente a la mezcla resultante; filtrar la mezcla reacción; acidificar el filtrado; y sujetar el filtrado a cromatograf ia para aislar los derivados 13-dióxidoantraciclina.

17. Un proceso para la preparación de 13-dióxidoantraciclina, dicho proceso comprendiendo los pasos de: formar una solución disolviendo 1 g de doxorubicina hidrocloruro 13-tosilidrazona y cerca de 2.4 g de ácido sulfónico p-toluenoen cerca de 50mL de metanol anhídrido; adicionar cerca de 0.8 g de cianoborohidrido de sodio a la solución: calentar la solución a una temperatura de 68QC a cerca de 729C; remover suavemente la solución durante una hora bajo una atmósfera de hidrógeno; concentrar la mezcla resultante en cerca de 20mL; enfriar la mezcla resultante en un congelador a una temperatura de cerca de 09C a 49C; adicionar 2mL de bicarbonato de sodio saturado en agua a la mezcla resultante; adicionar cerca de 200mL de cloroformo a la mezcla resultante; adicionar sulfato de sodio anhidrico; filtrar las sales que resultan de la adición del sulfato de sodio anhídrico; acidificar el filtrado con cloruro de hidrogeno en éter dietil pasar la solución a través de una columna de gel de sílice; posteriormente lavar la columna con cloroformo/metanol hasta que la .mezcla sea incolora; lavar con metanol una fracción que contenga el producto; evaporar el metanol; disolver el residuo que resulta de la evaporación en 30% de acetonitrilo en amonio para formar un buffer, aislar el producto con HPLC preparativo en una columna fenilica; separar el producto de otras impurezas utilizando un acetonitrilo/amonio para formar un gradiente;y liofilizar la fracción purificada de HPLC para producir 600 mg de hidrocloruro 13-dióxidodoxorubicina .