MX2015005270A

MX2015005270A - Polinucleotidos, polipeptidos y metodos de uso novedosos de aciltransferasa.

Info

Publication number: MX2015005270A
Application number: MX2015005270A
Authority: MX
Inventors: Richard William Scott; Marissa Roldan; Nicholas John Roberts; Amy Christina Curran; Somrutai Winichayakul
Original assignee: Agres Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2015-07-17
Also published as: NZ706829A; EP2914725A2; EP2914725A4; WO2014068438A3; IN2015DN03967A; AU2013340444A1; WO2014068438A2; US9957519B2; BR112015009303A2; US20150252378A1; CN105121646B; CA2889980A1; CN105121646A; MX359167B; AU2013340444B2; AR093293A1

Abstract

La invención proporciona una proteína DGAT1 novedosa con propiedades mejoradas con respecto a las proteínas DGAT conocidas, particularmente proteínas DGAT1 conocidas de plantas. La proteína DGAT1 novedosa de la invención se puede expresar en células para incrementar la acumulación de lípido celular. La expresión de la proteína DGAT1 de la invención en células resulta en una concentración más alta de lípidos en comparación con cualquiera de las otras proteínas DGAT1 vegetales probadas por los solicitantes. La invención proporciona polinucleótidos que codifican para la proteína DGAT1 novedosa de la SEC ID NO: 39, construcciones, células, plantas, partes de una planta y descendencia que comprende los polinucleótidos y métodos de uso de los polinucleátidos y polipéptidos de la invención.

Description

POLINUCLEÓTIDOS, POLIPÉPTIDOS Y MÉTODOS DE USO NOVEDOSOS DE ACILTRANSFERASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con composiciones y métodos para la manipulación de producción de lípido celular y/o perfil lípido celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El aceite vegetal es un producto económicamente importante no solo debido a su amplia utilización en la industria alimenticia y como un componente de ingredientes de pienso, sino que también tiene una amplia gama de aplicaciones como biocombustibles o en la elaboración de diversos productos nutracéuticos e industriales. Dentro de la planta misma, el aceite es esencial para llevar a cabo numerosos procesos metabólicos los cuales son fundamentales para el crecimiento y desarrollo, particularmente durante la germinación de la semilla y las etapas tempranas del crecimiento de la planta. Considerando su valor, existe un interés de investigación cada vez mayor dentro del campo de la bioteenología por mejorar la producción de aceite vegetal y volver el suministro más sostenible.

El componente principal del aceite vegetal es triacilglicérido (TAG, por sus siglas en inglés). Es la forma principal de lípido de almacenamiento en semillas oleosas y Ref.256208 es la fuente principal de energía para la germinación de semillas y el desarrollo de plántulas. La biosíntesis de TAG por medio de la vía de Kennedy involucra etapas de acilación secuenciales que comienzan a partir del precursor sn-glicerol-3-fosfato (G3P, por sus siglas en inglés). En primer lugar, G3P se esterifica por una acil-CoA para formar ácido lisofosfatídico (LPA, por sus siglas en inglés) en una reacción catalizada por glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT, EC 2.3.1.15). Esto es seguido por una segunda etapa de acilación catalizada por ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LAPT; EC 2.3.1.51) que forma el ácido fosfatídico (PA), un intermediario clave en la biosíntesis de glicerolípidos. El PA después es desfosforilado por la enzima ácido fosfatídico fosfatasa (PAP; EC3.1.3.4) para liberar el precursor inmediato para TAG, el sn-1,2-diacilglicerol (DAG). Finalmente, el DAG es acilado en la posición sn-3 por la enzima diacilglicerol aciltransferasa (DGAT; EC 2.3.1.20) para formar TAG.

Puesto que está última acción catalítica es una única etapa solitaria en la biosíntesis de TAG, se denomina a DGAT como la enzima formadora de triacilglicerol comprometida. Dado que DAG se localiza en el punto de ramificación entre TAG y la biosíntesis de fosfolípidos de membrana, DGAT juega un papel potencialmente decisivo en regular la formación de TAG en la vía de síntesis de resultados modestos (Xu et al., 2008, Plant Biotechnol J., 6: 799-818 y referencias en la misma).

Aunque los biocombustibles líquidos proporcionan ser una promesa considerable, la realidad de utilización de material biológico se atempera por los usos en competencia y las cantidades disponibles. En consecuencia, las plantas de manipulación y los microorganismos que tienen como objetivo esto es el foco de múltiples grupos de investigación; en particular la acumulación de triacilglicerol (TAG) en tejidos vegetativos y bacterias oleaginosas (Fortman et al., 2008, Trends Biotechnol 26, 375-381; Ohlrogge et al., 2009, Science 324, 1019-1020). TAG es un lípido neutro con dos veces la densidad de energía de la celulosa y se puede utilizar para generar biodiesel, un biocombustible deseable de alta densidad energética con uno de los procesos de manufactura más sencillos y más eficientes. La manipulación de acumulación de TAG en las hojas hasta ahora ha resultado en un incremento de 5 a 20 veces sobre WT utilizando una diversidad de estrategias las cuales incluyen: la sobreexpresión de factores de transcripción de desarrollo de semillas (LEC1, LEC2 y WRI1); bloqueo de la expresión de APS (un gen clave involucrado en la biosíntesis de almidón); mutación de CGI-58 (un regulador de acumulación de lípidos neutros); y regulación por aumento de la enzima que sintetiza TAG, DGAT (diacilglicerol O aciltransferasa, EC 2.3.1.20) en plantas y también en levaduras (Andrianov et al., 2009, Plant Biotech J 8, 1-11; Mu et al., 2008 Plant Physiol 148, 1042-1054; Sanjaya et al 2011, Plant Biotech J 9, 874-883; Santos-Mendoza et al., 2008, Plant J 54, 608-620; James et al., 2010, Proc Nati Acad Sci U S A 107, 17833-17838; Beopoulos et al., 2011, Appl Microbiol Biotechnol 90, 1193-1206; Bouvier-Navé et al., 2000, Eur J Biochem 267, 85-96; Durrett el al., 2008, Plant J 54, 593-607). No obstante, se ha reconocido que para obtener incrementos adicionales en TAG, la prevención de su catabolismo debe ser crucial dentro de tejidos no oleaginosos y sobre una gama de etapas de desarrollo (Yang y Ohlrogge, 2009, Plant Physiol 150, 1981-1989).

La manipulación positiva del rendimiento y calidad de triacilglicéridos (TAG) en eucariotas son difíciles de obtener. La enzima diacilglicerol-O-aciltransferasa (DGAT, por sus siglas en inglés) tiene la actividad más baja específica de las enzimas de la vía de Kennedy y se le considera como un "cuello de botella" en la síntesis de TGA.

Se han realizado intentos previamente por mejorar DGAT1 por métodos bioteenológicos, con éxito limitado. Por ejemplo, Nykiforuk et al., (2002, Biochimica et Biophysica Acta 1580: 95-109) reportaron corte en la parte N-terminal de DGAT1 de Brassica napus, pero reportaron aproximadamente 50% de actividad menor. McFie et al., (2010, JBC., 285: 37377-37387) reportaron que el corte en la parte N-terminal de DGAT1 de ratón resulta en una actividad específica aumentada de la enzima, pero también reportaron una gran disminución en el nivel de proteína que se acumula.

Xu et al., (2008, Plant Biotechnology Journal, 6: 799-818) recientemente identificaron una secuencia de consenso (X-Leu-X-Lys-X-X-Ser-X-X-X-Val) dentro de Tropaeolum majus (nastuerzo de Indias) secuencias de DGAT1 (TmDGATl) como un motivo objetivo típico de miembros de la proteína relacionada con SNF1 cinasa 1 (SnRKl), en donde Ser es el residuo para fosforilación. Las proteínas SnRKl son una clase de proteínas cinasas Ser/Thr que han sido implicadas cada vez más en la regulación global del metabolismo de carbono en plantas, por ejemplo, inactivación de sacarosa fosfato sintasa por fosforilación (Halford & Hardie 1998, Plant Mol Biol. 37: 735-48. Review) . Xu et al., (2008, Plant Biotechnology Journal, 6: 799-818) realizaron mutagénesis dirigida a sitios sobre seis regiones/motivos funcionales putativos de la enzima TmDGATl. La mutagénesis de un residuo serina (S197) en un sitio objetivo SnRKl putativo resulta en un incremento en 38%-80% en la actividad de DGAT1, y una sobre expresión de TmDGATl mutada en Arabidopsis resulta en un incremento de 20% a 50% en el contenido de aceite, en una base por semilla.

Sería útil proporcionar formas mejoradas de DGAT1, que superen una o más de las deficiencias en la téenica anterior y que se puedan utilizar para incrementar la producción de aceite celular.

Un objetivo de la invención es proporcionar proteínas DGAT1 mejoradas y métodos para su uso para alterar por lo menos una de la producción de lípidos celulares y el perfil de lípidos celulares y/o por lo menos proporcionar al público con una elección útil.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores han demostrado que es posible producir proteínas DGAT1 quiméricas con propiedades ventajosas sobre ya sea las moléculas DGAT1 originales utilizadas para producir las proteínas DGAT1 quiméricas. Las proteínas DGAT1 quiméricas de la invención se puede expresar en células para alterar el contenido de lípidos y el perfil de lípidos de la células, o de los organismos que contienen las células.

Polinucleótido que codifica para un polipéptido En el primer aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido DGAT1 que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 39 (ZmDGATl-larga) o una variante o fragmento de la misma.

En una modalidad, la variante tiene por lo menos 70% de identidad con la SEC ID NO: 39. En una modalidad adicional, la variante tiene actividad de DGAT1.

En una modalidad adicional, el polipéptido DGAT1 tiene una actividad DGAT1 mayor que por lo menos otra proteína DGAT1.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 10%, de modo más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 20%, de modo más preferible por lo menos 25%, de modo más preferible por lo menos 30%, de manera más preferible por lo menos 35%, de modo más preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 45%, de modo más preferible por lo menos 50% mayor actividad de DGAT1 en relación a por lo menos otra proteína de DGAT1.

Preferiblemente, por lo menos otra proteína DGAT1 tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la SEC ID NO: 44 (ZmDGATl-corta).

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene la mayor actividad DGAT1 cuando se expresa en una célula.

En una modalidad adicional, el polipéptido DGAT1 tiene una actividad DGAT1 mayor que cualquier proteína DGAT1 conocida previamente.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene una actividad DGAT1 mayor cuando se expresa en una célula.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 10%, de modo más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 20%, de modo más preferible por lo menos 25%, de manera más preferible por lo menos 30%, de modo más preferible por lo menos 35%, de manera más preferible por lo menos 40%, de modo más preferible por lo menos 45%, de manera más preferible por lo menos 50% mayor actividad de DGAT1 que cualquier proteína DGAT1 conocida previamente.

En una modalidad adicional el polipéptido de la invención tiene especificidad de sustrato alterada en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene la especificidad a sustrato alterada cuando se expresa en una célula.

En una modalidad adicional el polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene una especificidad de sustrato alterada en relación a cualquier proteína DGAT1 vegetal conocida previamente.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene la especificidad del sustrato alterada cuando se expresa en una célula.

En una modalidad adicional, la proteína DGAT1 de la invención no se expresa en plantas como se encuentra de modo natural.

Fragmento polipeptídico Preferiblemente el fragmento comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos, de manera más preferible por lo menos 100 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 150 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 200 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 250 aminoácidos contiguos y de manera mucho más preferible por lo menos 300 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 350 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 400 aminoácidos contiguos, de manera más preferible por lo menos 450 aminoácidos contiguos del polipéptido de la invención.

En una modalidad, el fragmento del polipéptido DGAT1 de la invención puede conferir actividad aumentada de DGAT1 agregada a por lo menos parte de otro polipéptido DGAT1.

Polinucleótido En un aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 10 (ZmDGATl-larga) o una variante o fragmento de la misma.

En una modalidad, la variante tiene por lo menos 70% de identidad con la SEC ID NO: 10. En una modalidad adicional la variante codifica para un polipéptido con actividad de DGAT1.

Fragmento polinucleotídico En una modalidad preferida, el fragmento del polinucleótido de la invención codifica para un fragmento del polipéptido de la invención.

Polipéptido En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido con la secuencia de la SEC ID NO: 39 (ZmDGATl-larga) o una variante o fragmento de la misma.

En una modalidad, la variante tiene por lo menos 70% de identidad con la SEC ID NO: 39. En una modalidad adicional la variante tiene actividad de DGAT1.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 10%, de modo más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 20%, de modo más preferible por lo menos 25%, de manera más preferible por lo menos 30%, de modo más preferible por lo menos 35%, de modo más preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 45%, de modo más preferible por lo menos 50% mayor actividad de DGAT1 en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

Preferiblemente, por lo menos una proteína DGAT1 tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la SEC ID NO: 44 (ZmDGATl-corta).

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene especificidad de sustrato alterada en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

En una modalidad adicional del polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene una especificidad de sustrato alterada en relación a cualquier proteína DGAT1 vegetal conocida previamente.

Preferiblemente, el fragmento comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos, de manera más preferible por lo menos 100 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 150 aminoácidos contiguos, de manera más preferible por lo menos 200 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 250 aminoácidos contiguos, de manera más preferible por lo menos 300 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 350 aminoácidos contiguos, de manera más preferible por lo menos 400 aminoácidos contiguos, de modo más preferible por lo menos 450 aminoácidos contiguos del polipéptido de la invención.

En una modalidad, el fragmento del polipéptido DGAT1 de la invención puede conferir actividad DGAT1 incrementada cuando se agrega a por lo menos parte de otro polipéptido DGAT1.

Construcción En una modalidad adicional la invención proporciona una construcción genética que comprende un polinucleótido de la invención.

Células En una modalidad adicional la invención proporciona una célula que comprende un polinucleótido de la invención. Preferiblemente la célula, o su predecesor, se transforma para comprender el polinucleótido de la invención.

En una modalidad adicional la invención proporciona una célula que comprende una construcción genética de la invención.

En una modalidad preferida, la célula expresa el polinucleótido de la invención.

En una modalidad preferida, la célula expresa el polipéptido de la invención.

En una modalidad preferida, la célula o su predecesor se transforman o modifican genéticamente para expresar el polinucleótido o polipéptido de la invención.

En una modalidad el polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene una actividad aumentada de DGAT1 en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

En una modalidad, el polipéptido DGAT1 tiene por lo menos 5% de manera más preferible por lo menos 10%, de manera más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 20%, de manera más preferible por lo menos 25%, de manera más preferible por lo menos 30%, de manera más preferible por lo menos 35%, de manera más preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 45%, de manera más preferible por lo menos 50% mayor actividad de DGATl en relación a por lo menos otra proteína de DGATl.

Preferiblemente, por lo menos una proteína de DGATl tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la SEC ID NO: 44 (ZmDAGTl-corta).

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene una actividad DGATl incrementada en relación a cualquier proteína de DGATl vegetal conocida previamente.

En una modalidad adicional, la célula produce más lípido que el que produce una célula control.

En una modalidad, la celda produce por lo menos 5% más, preferiblemente por lo menos 10% más, preferiblemente por lo menos 15% más, preferiblemente por lo menos 20% más, preferiblemente por lo menos 25% más, preferiblemente por lo menos 30% más, preferiblemente por lo menos 35% más, preferiblemente por lo menos 40% más, preferiblemente por lo menos 45% más, preferiblemente por lo menos 50% más, preferiblemente por lo menos 55% más, preferiblemente por lo menos 60% más, preferiblemente por lo menos 65% más, preferiblemente por lo menos 70% más, preferiblemente por lo menos 75% más, preferiblemente por lo menos 80% más, preferiblemente por lo menos 85% más, preferiblemente por lo menos 90% más, preferiblemente por lo menos 95% más, preferiblemente por lo menos 100% más, preferiblemente por lo menos 105% más, preferiblemente por lo menos 110% más, preferiblemente por lo menos 115% más, preferiblemente por lo menos 120% más, preferiblemente por lo menos 125% más, preferiblemente por lo menos 130% más, preferiblemente por lo menos 135% más, preferiblemente por lo menos 140% más, preferiblemente por lo menos 145% más, preferiblemente por lo menos 150% más lípido que el que produce una célula control.

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene una especificidad de sustrato alterada en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

Preferiblemente, por lo menos una proteína DGAT1 tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido o la SEC ID NO: 44 (ZmDGATl-corta).

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención, cuando se expresa en la célula, tiene especificidad de sustrato alterada en relación a cualquier proteína DGAT1 vegetal conocida previamente.

En una modalidad adicional la célula tiene un perfil de lípidos alterado en relación a una célula control.

En una modalidad, la proporción de 16:0 en el triacilglicerol se altera en relación al que se encuentra en una célula control.

En una modalidad, la proporción de 16:0 en el triacilglicerol se altera en por lo menos 1%, preferiblemente por lo menos 2%, de manera más preferible por lo menos 3%, de manera más preferible por lo menos 4%, de manera más preferible por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 6%, de manera más preferible por lo menos 7%, de manera más preferible por lo menos 8%, de manera más preferible por lo menos 9%, de manera más preferible por lo menos 10%, de manera más preferible por lo menos 11%, de manera más preferible por lo menos 12%, de manera más preferible por lo menos 13%, de manera más preferible por lo menos 14%, de manera más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 16%, de manera más preferible por lo menos 17%, de manera más preferible por lo menos 18%, de manera más preferible por lo menos 19%, de manera más preferible por lo menos 20%, en relación con el que se encuentra en una célula control.

En una modalidad adicional el perfil de lípidos alterado tiene una proporción de 16:0 en el triacilglicerol en el intervalo de 6% a 16%. En esta modalidad, la proporción de 16:0 en el triacilglicerol se altera dentro del intervalo de 6% a 16%.

En una modalidad adicional la proporción de 18:0 en el triacilglicerol se altera en relación al de una célula control.

En una modalidad la proporción de 18:0 en el triacilglicerol se altera por al menos 1%, preferiblemente al menos 2%, de manera más preferible al menos 3%, de manera más preferible al menos 4%, de manera más preferible al menos 5%, de manera más preferible al menos 6%, de manera más preferible al menos 7%, de manera más preferible al menos 8%, de manera más preferible al menos 9%, de manera más preferible al menos 10%, de manera más preferible al menos 11%, de manera más preferible al menos 12%, de manera más preferible al menos 13%, de manera más preferible al menos 14%, de manera más preferible al menos 15%, de manera más preferible al menos 16%, de manera más preferible al menos 17%, de manera más preferible al menos 18%, de manera más preferible al menos 19%, de manera más preferible al menos 20% en relación a lo que se encuentra en una célula control.

En una modalidad adicional, el perfil de lípidos alterado tiene una proporción de 18:0 en el triacilglicerol en el intervalo de 7% a 15%. En esta modalidad la proporción de 18:0 en el triacilglicerol se altera dentro del intervalo de 7% a 15%.

En una modalidad adicional la proporción de 18:1 en el triacilglicerol se altera en relación a la de una célula control.

En una modalidad, la proporción de 18:1 en el triacilglicerol se altera por al menos 1%, preferiblemente al menos 2%, de manera más preferible por lo menos 3%, de manera más preferible por lo menos 4%, de manera más preferible por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 6%, de manera más preferible por lo menos 7%, de manera más preferible por lo menos 8%, de manera más preferible por lo menos 9%, de manera más preferible por lo menos 10%, de manera más preferible por lo menos 11%, de manera más preferible por lo menos 12%, de manera más preferible por lo menos 13%, de manera más preferible por lo menos 14%, de manera más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 16%, de manera más preferible por lo menos 17%, de manera más preferible por lo menos 18%, de manera más preferible por lo menos 19%, de manera más preferible por lo menos 20% en relación a lo que se encuentra en una célula control.

En una modalidad adicional, el perfil de lípidos alterado tiene una proporción de 18:1 en el triacilglicerol en el intervalo de 39% a 55%. En esta modalidad la proporción de 18:1 en el triacilglicerol se altera dentro del intervalo de 39% a 55%.

La célula control puede ser cualquier célula del mismo tipo que no este transformada con el polinucleótido, o la construcción de la invención para expresar el polipéptido de la invención. La célula control también se puede transformar con un vector "vacío" en donde el vector vacío no incluye una secuencia de inserto que corresponde a un polinucleótido de la invención o que expresa un polipéptido de la invención.

En una modalidad, la célula control es una célula no transformada. En una modalidad adicional, la célula control es una célula transformada para expresar el polipéptido de la SEC ID NO: 44 (ZmDGATl-corta). En una modalidad adicional, la célula control es una célula transformada para expresar cualquier proteína DGAT1 vegetal conocida previamente.

Células transformadas también para expresar una oleosina En una modalidad, la célula también se transforma para expresar por lo menos uno de: una oleosina, esteroleosina, caloleosina, polioleosina y una oleosina que incluye por lo menos una cisteína introducida artificialmente (W02011/053169).

Partes de planta En una modalidad adicional, la invención proporciona una parte, propágulo o descendencia de una planta de la invención.

En una modalidad preferida, la parte, propágulo o descendencia comprende por lo menos uno de un polinucleótido, construcción o polipéptido de la invención. Preferiblemente, la parte, propágulo o descendencia, o su planta predecesora, se transforma para comprender el polinucleótido de la invención.

En una modalidad preferida, la parte, propágulo o descendencia expresa por lo menos uno de: un polinucleótido y un polipéptido de la invención.

En una modalidad preferida, la parte, propágulo o descendencia expresa un polipéptido de la invención.

En una modalidad preferida, la parte, propágulo o descendencia comprende por lo menos uno de un polinucleótido, construcción o un polipéptido de la invención.

En una modalidad preferida, la parte, propágulo o descendencia expresa por lo menos uno de un polinucleótido, construcción o polipéptido de la invención.

En una modalidad preferida, la parte, propágulo o descendencia expresa una proteína DGAT1 quimérica de la En una modalidad adicional, la parte, propágulo o descendencia produce más lípido en comparación con una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad, la parte, propágulo o descendencia produce por lo menos 5% más, preferiblemente por lo menos 10% más, preferiblemente por lo menos 15% más, preferiblemente por lo menos 20% más, preferiblemente por lo menos 25% más, preferiblemente por lo menos 30% más, preferiblemente por lo menos 35% más, preferiblemente por lo menos 40% más, preferiblemente por lo menos 45% más, preferiblemente por lo menos 50% más, preferiblemente por lo menos 55% más, preferiblemente por lo menos 60% más, preferiblemente por lo menos 65% más, preferiblemente por lo menos 70% más, preferiblemente por lo menos 75% más, preferiblemente por lo menos 80% más, preferiblemente por lo menos 85% más, preferiblemente por lo menos 90% más, preferiblemente por lo menos 95% más, preferiblemente por lo menos 100% más, preferiblemente por lo menos 105% más, preferiblemente por lo menos 110% más, preferiblemente por lo menos 115% más, preferiblemente por lo menos 120% más, preferiblemente por lo menos 125% más, preferiblemente por lo menos 130% más, preferiblemente por lo menos 135% más, preferiblemente por lo menos 140% más, preferiblemente por lo menos 145% más, preferiblemente por lo menos 150% más lípido en comparación con una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad adicional, la parte, propágulo o descendencia tiene un perfil de lípidos alterado en relación a una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad, la proporción de 16:0 en el triacilglicerol está alterada en relación a la que se encuentra en una parte control, propágulo o descendencia o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad, la proporción de 16:0 en el triacilglicerol está alterado por lo menos 1%, preferiblemente por al menos 2%, de manera más preferible al menos 3%, de manera más preferible al menos 4%, de manera más preferible al menos 5%, de manera más preferible al menos 6%, de manera más preferible al menos 7%, de manera más preferible al menos 8%, de manera más preferible al menos 9%, de manera más preferible al menos 10%, de manera más preferible al menos 11%, de manera más preferible al menos 12%, de manera más preferible al menos 13%, de manera más preferible al menos 14%, de manera más preferible al menos 15%, de manera más preferible al menos 16%, de manera más preferible al menos 17%, de manera más preferible al menos 18%, de manera más preferible al menos 19%, de manera más preferible al menos 20% en relación con una planta, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad adicional, el perfil de lípidos alterado tiene una proporción de 16:0 en el triacilglicerol en el intervalo de 6% a 16%. En esta modalidad, la proporción de 16:0 en el triacilglicerol está alterado dentro del intervalo de 6% a 16%.

En una modalidad adicional, la proporción de 18:0 en el triacilglicerol está alterada en relación a la de una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad, la proporción de 18:0 en el triacilglicerol está alterada en por lo menos 1%, preferiblemente por lo menos 2%, de manera más preferible por lo menos 3%, de manera más preferible por lo menos 4%, de manera más preferible por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 6%, de manera más preferible por lo menos 7%, de manera más preferible por lo menos 8%, de manera más preferible por lo menos 9%, de manera más preferible por lo menos 10%, de manera más preferible por lo menos 11%, de manera más preferible por lo menos 12%, de manera más preferible por lo menos 13%, de manera más preferible por lo menos 14%, de manera más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 16%, de manera más preferible por lo menos 17%, de manera más preferible por lo menos 18%, de manera más preferible por lo menos 19%, de manera más preferible por lo menos 20% en relación a la de una parte, propágulo o descendencia control, o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad adicional, el perfil de lípidos alterado tiene una proporción de 18:0 en el triacilglicerol en el intervalo de 7% a 15%. En esta modalidad, la proporción de 18:0 en el triacilglicerol está alterada dentro del intervalo de 7% a 15%.

En una modalidad adicional la proporción de 18:1 en el triacilglicerol está alterada en relación a la de una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad, la proporción de 18:1 en el triacilglicerol está alterada en por lo menos 1%, preferiblemente por lo menos 2%, de manera más preferible por lo menos 3%, de manera más preferible por lo menos 4%, de manera más preferible por lo menos 5%, de manera más preferible por lo menos 6%, de manera más preferible por lo menos 7%, de manera más preferible por lo menos 8%, de manera más preferible por lo menos 9%, de manera más preferible por lo menos 10%, de manera más preferible por lo menos 11%, de manera más preferible por lo menos 12%, de manera más preferible por lo menos 13%, de manera más preferible por lo menos 14%, de manera más preferible por lo menos 15%, de manera más preferible por lo menos 16%, de manera más preferible por lo menos 17%, de manera más preferible por lo menos 18%, de manera más preferible por lo menos 19%, de manera más preferible por lo menos 20% en relación a la de una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

En una modalidad adicional, el perfil de lípidos alterado tiene una proporción de 18:1 en el triacilglicerol en el intervalo de 39% a 55%. En esta modalidad, la proporción de 18:1 en el triacilglicerol se altera dentro del intervalo de 39% a 55%.

La planta control puede ser cualquier planta del mismo tipo que no esté transformada con el polinucleótido, o la construcción de la invención para expresar el polipéptido de la invención.

En una modalidad, la planta control es una planta no transformada. En una modalidad adicional, la planta control es una planta transformada para expresar el polipéptido de la SEC ID NO: 44 (ZmDGATl-corta).

Preferiblemente, la parte, propágulo o descendencia control es de una planta control como se describe en lo anterior.

En una modalidad, la parte es de un tejido vegetativo. En una modalidad, la parte es una hoja. En una modalidad adicional la parte es una raíz. En una modalidad adicional la parte es un tubérculo. En una modalidad adicional la parte es una mazorca. En una modalidad adicional la parte es un tallo. En una modalidad adicional, la parte es un tallo de una planta monocotiledónea. En una modalidad adicional la parte es un stovum (tallo y cuchilla de la hoja).

En una modalidad adicional la parte es de un tejido reproductivo. En una modalidad adicional la parte es una semilla. En una modalidad preferida la parte es de o incluye tejido de endosperma.

Pienso para animales En un aspecto adicional la invención proporciona una materia prima para animales que comprende por lo menos uno de un polinucleótido, polipéptido, construcción, célula, célula vegetal, parte de una planta, planta, propágulo y descendencia de la invención.

Materia prima de biocombus tibie En un aspecto adicional, la invención proporciona una materia prima de biocombustible que comprende por lo menos uno de un polinucleótido, polipéptido, construcción, célula, célula vegetal, parte de una planta, planta, propágulo y descendencia de la invención.

Lípido En una modalidad, el lípido es un aceite. En una modalidad adicional el lípido es triacilglicerol (TAG). Metodos para producir lípidos/aceite En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir un lípido, el método comprende hacer crecer una célula, célula vegetal o planta que es transformada o modificada genéticamente para expresar un polinucleótido o polipéptido de la invención en donde la planta produce aceite a través de la actividad del polipéptido expresado.

En una modalidad la célula, célula vegetal o planta produce el lípido como resultado de la actividad de DGAT1 del polipéptido.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir lípido, el método comprende extraer lípido de por lo menos una de una célula, una célula vegetal, planta, parte de una planta, propágulo y descendencia de la invención.

En una modalidad el lípido es triacilglicerol (TAG).

En una modalidad adicional el lípido es procesado en por lo menos uno de: a) un combustible, b) una sustancia oleoquímica, c) un aceite nutricional, d) un aceite cosmético, e) un ácido graso poliinsaturado (PUFA), y f) una combinación de cualquiera de los incisos (a) a (e).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir lípido, el método comprende expresar una proteína DGAT1 de la invención en una célula, célula vegetal o planta.

En una modalidad preferida que expresa la proteína DGAT1 de la invención en la planta induce la producción del lípido en la célula, célula vegetal o planta.

En una modalidad el método incluye la etapa de transformar una célula, célula vegetal o planta con un polinucleótido de la invención que codifica para la proteína DGAT1.

En una modalidad adicional el método incluye la etapa de extraer el lípido de la célula, célula vegetal o planta o a partir de una planta, propágulo o descendencia de la planta.

En una modalidad el lípido es un aceite. En una modalidad adicional el lípido es triacilglicerol (TAG).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico y tres marcos de traducción de la región transcrita de DGAT1 de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO: 116). Las secuencias que codifican para exón se muestran en negrillas, subrayadas y en rectángulos grises.

La figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico y tres marcos de traducción de la región transcrita de DGAT1 corta de Zea mays (SEC ID NO: 117). Esta secuencia genómica tiene suprimido F469 y agregado Q67 en comparación con el ADNc (EU039830) y las secuencias peptídicas (ABV91586) que se utilizan en realidad en esta patente. Las secuencias codificantes de exón se muestran en negrillas, subrayadas y en rectángulos grises.

La figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico y la traducción de tres marcos de la región transcrita DGAT1 larga de Zea mays (SEC ID NO: 118) derivada de la biblioteca CHORI-201 Maize B73 BAC (disponible de la red mundial en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AC204647; http://bacpac.chori.org/maize201.htm). Las secuencias que codifican para exones se muestran en negrillas, subrayadas, en rectángulos grises.

La figura 4 muestra la secuencia peptídica de la región citoplásmica N-terminal de diversos DGAT1 vegetales que incluyen versiones tanto largas como cortas a partir de los pastos así como ejemplos de especies dicotiledóneas. El rectángulo izquierdo representa el sitio de unión acil-CoA (Nykiforuk et al., 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1580:95-109). El rectángulo derecho representa la primera región transmembranal (McFie et al., 2010, JBC., 285:37377-37387). La flecha izquierda representa el límite entre exón 1 y exón 2. La flecha derecha representa el límite entre el exón 2 y el exón 3. Las secuencias son AtDGATl (SEC ID NO: 119), BjDGATl (SEC ID NO: 120), BnDGATl (SEC ID NO: 121), BjDGATl (SEC ID NO: 122), TmajUSDGAT1 (SEC ID NO: 123), EpDGATl (SEC ID NO: 124), VgDGATl (SEC ID NO: 125), NtDGATl (SEC ID NO: 126), PfDGATl (SEC ID NO: 127), ZmL (SEC ID NO: 128), SbDGATl (SEC ID NO: 129), OsL (SEC ID NO: 130), OsS (SEC ID NO: 131), SbDGATl (SEC ID NO: 132), ZmS (SEC ID NO: 133), PpDGATl (SEC ID NO: 132), SmDGATl (SEC ID NO: 135), EaDGATl (SEC ID NO: 136), VvDGATl (SEC ID NO: 137), GmDGATl (SEC ID NO: 138), GmDGATl (SEC ID NO: 139), LjDGATl (SEC ID NO: 140), MtDGATl (SEC ID NO: 141), JcDGATl (SEC ID NO: 142), VfDGATl (SEC ID NO: 143), RcDGA l (SEC ID NO: 144), PtDGA l (SEC ID NO: 145), PtDGATl (SEC ID NO: 146).

La figura 5 muestra las estructuras en línea en negrillas de los residuos aminoácidos lisina (K) y arginina (R).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta descripción, en donde se ha hecho referencia a descripciones de patente, otros documentos externos u otras fuentes de información, generalmente es con el propósito de proporcionar un contexto para la presentación de los rasgos de la invención. A menos que se establezca en otro sentido específicamente, la referencia a estos documentos externos no debe considerarse como admisión de que estos documentos o estas fuentes de información, en cualquier jurisdicción sean téenica anterior o que formen parte del conocimiento general común de la técnica.

El término "que comprende", como se utiliza en esta descripción significa "que consiste por lo menos en parte de". Cuando se interpreta cada oración en esta descripción que incluye el término "que comprende", los rasgos diferentes de aquellos colocados previamente por el término también pueden estar presentes. Los términos relacionados tales como "que comprende" o "comprendido" deben interpretarse de la misma manera. En algunas modalidades, el término "que comprende" (y términos relacionados, tales como "comprendido" y "que comprende") se pueden sustituir por "que consiste de" (y términos relacionados "consistente" y "que consiste" ) .

Definiciones El término "DGATl" como se utiliza en la presente, significa acil CoA:diacilglicerol aciltransferasa (EC 2.3.1.20).

DGATl típicamente es la principal enzima sintetizante de TAG en semillas y en hojas senescentes (Kaup et al . , 2002, Plant Physiol.129(4):1616-26; para revisiones véase Lung y Weselake 2006, Lipids. Diciembre de 2006; 41(12):1073-88; Cahoon et al . , 2007, Current Opinión in Plant Biology. 10:236-244; and Li et al . , 2010, Lipids. 45:145-157).

DGATl contiene aproximadamente 500 aminoácidos y tiene 10 dominios transmembranales predichos mientras que DGAT2 tiene únicamente 320 aminoácidos y se predice que contiene únicamente dos dominios transmembranales; ambas proteínas también se predice que tienen sus partes N- y C-terminales localizadas en el citoplasma (Shockey et al., 2006, Plant Cell 18:2294-2313). Ambos DGATl y DGAT2 tienen ortólogos en animales y hongos y son proteínas transmembranales localizadas en el ER.

En la mayor parte de las plantas dicotiledóneas, DGATl y DGAT2 parecen ser los genes de una copia única mientras que típicamente existen dos versiones de cada uno en los pastos los cuales probablemente surgieron durante la duplicación del genoma del pasto (Salse et al . , 2008, Plant Cell, 20:11-24).

La frase "actividad DGAT1 aumentada" significa actividad específica aumentada en relación a la de la primera y/o la proteína DGAT1.

Una persona experta en el ámbito sabrá como probar la "actividad específica" de una proteína DGAT1 o una variante de la misma de la invención. Esto habitualmente se puede realizar mediante aislamiento, enriquecimiento y cuantificación de DGAT1 recombinante y después utilizar este material para determinar ya sea la velocidad de formación de triacilglicérido y/o la desaparición de sustratos precursores (que incluye diversas formas de acil-CoA y DAG) según Xu et al . , (2008), Plant Biotechnology Journal.6:799-818.

Lípidos En una modalidad, el lípido es un aceite. En una modalidad adicional el aceite es triacilglicerol (TAG). Producción de lípidos En ciertas modalidades, la célula, células, tejidos, plantas o partes de planta de la invención producen más lípidos que las células, tejidos, plantas y partes de plantas control.

Los expertos en el ámbito tendrán conocimiento de los métodos para medir la producción de lípidos. Esto típicamente se puede realizar por análisis espectral y cromatografía de masas por gas de áster metílico de ácido graso cuantitativo (FAMES GC-EM). Los métodos adecuados también se describen en la sección de ejemplos de esta descripción.

Especificidad de sustrato En ciertas modalidades, los polipéptidos de la invención presentan especificidad de sustrato alterado en relación a otras proteínas DGAT1 originales. Las proteínas DGAT1 vegetales son relativamente promiscuas en términos de los sustratos de ácidos grasos y las especies DAG que son capaces de utilizar para generar TAG. De esta manera se les puede considerar que tienen especificidad de sustrato relativamente baja. No obstante, esto puede modificarse de manera que ciertos ácidos grasos se vuelvan un sustrato preferido con respecto a otros. Esto tiene como resultado un incremento en las proporciones de los ácidos grasos preferidos en la TAG y disminuye en las proporciones de las especies de ácidos grasos no preferidas. Se puede determinar la especificidad de sustrato mediante análisis cuantitativo in vitro de producción de TAG posterior a la adición de cantidades específicas y conocidas de sustratos purificados a cantidades conocidas de DGAT recombinante como lo describe Xu et al., (2008), Plant Biotechnology Journal.6: 799-818.

Perfil de lípidos En una modalidad adicional, la célula, células, tejidos, plantas y partes de las plantas de la invención tienen un perfil de lípidos alterado en relación a las células, tejidos, plantas y partes de las plantas control.

Los expertos en el ámbito tendrán conocimiento de los métodos para determinar el perfil de lípidos. Esto puede involucrar determinar la proporción o porcentaje de por lo menos uno de las especies de ácidos grasos 16:0, 16:1, 18:0, 18:lc9 presentes en el lípido. Esto típicamente se puede realizar por análisis de éster metílico de ácido graso (FA E) (Browse et al., 1986, Anal. Biochem. 152, 141-145). Los métodos adecuados también se describen en la sección de ejemplos de esta descripción.

Células El polipéptido DGAT1 de la invención, o como se utiliza en los métodos de la invención, se puede expresar en cualquier tipo de células.

En una modalidad, la célula es una célula procariótica. En una modalidad adicional la célula es una célula eucariótica. En una modalidad la célula se selecciona de una célula bacteriana, una célula de lavadura, una célula micótica, una célula de insecto, una célula de alga y una célula vegetal. En una modalidad la célula es una célula bacteriana. En una modalidad adicional la célula es una célula de levadura. En una modalidad la célula de levadura es una célula de S. ceriviseae . En una modalidad adicional la célula es una célula micótica. En una modalidad adicional la célula es una célula de insecto. En una modalidad adicional la célula es una célula de alga. En una modalidad adicional la célula es una célula vegetal.

En una modalidad la célula es una célula que no es vegetal. En una modalidad la especie diferente de una planta se selecciona de E . coli, P. pastoris , s . ceriviseae, D. salina y C. reinhardtii . En una modalidad adicional, la especie que no es una planta se selecciona de , P. pastoris , s . ceriviseae, D. salina y C. reinhardtii .

En una modalidad, la célula es una célula microbiana. En otra modalidad, la célula microbiana es una célula de alga de la división clorofita (algas verdes), rodofita (algas rojas), faeoficeae (algas cafés), Bacillarioficaeae (diatomeas), o dinoflagelata (dinoflagelados). En otra modalidad, la célula microbiana es una célula de alga de la especie Chlamydomonas , Dunaliella, Botrycoccus, Chlorella, Crypthecodinium, Gracilaria, Sargassum, Pleurochrysis , Porphyridiu , Phaeodactylum, Haematococcus , Isochrysis , Scenedesmus, Monodus , Cyclotella, Nitzschia, o Parietochloris . En otra modalidad, la célula de alga es Chlamydomonas reinhardtii . En otra modalidad adicional la célula es del género Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus , Trichosporon, Lipomyces , Pythium, Schizochytrium, Thraustochytrium o Ulkenia . En otra modalidad adicional la célula es una bacteria del género Rhodococcus , Escherichia o una cianobacteria. En otra modalidad adicional la célula es una célula de levadura. En otra modalidad la célula es una célula sintética.

Plantas Las secuencias DGAT1 variantes de la invención pueden ser secuencias de DGAT1 como se encuentran de modo natural. Preferiblemente, las secuencias de DGAT1 variantes son de plantas. En ciertas modalidades, las células dentro de las cuales las proteínas DGAT1 de la invención que se expresan son a partir de plantas. En otras modalidades, las proteínas DGAT1 de la invención se expresan en plantas.

Las células vegetales, a partir de las cuales las proteínas DGAT1 de la invención se derivan, las plantas a partir de las cuales se derivan las células vegetales y las plantas en las cuales las proteínas DGAT1 de la invención que se expresan pueden ser de cualquier especie vegetal.

En una modalidad, la célula vegetal o planta se deriva de una especie de planta gimnosperma.

En una modalidad adicional, la célula vegetal o planta se deriva de una especie de planta angiosperma.

En una modalidad adicional, la célula vegetal o planta se deriva de una especie de planta dicotiledónea.

En una modalidad adicional, la célula vegetal o planta se deriva de una especie de planta monocotiledónea.

Otras plantas preferidas son especies de plantas de forraje de un grupo que comprende pero que no se limita a los siguientes géneros: Zea, Lolium, Hordium, Miscanthus, Saccharum, Festuca, Dactylis, Bromus , Thinopyrum, Trifolium, Medicago, Pheleum, Phalaris, Holcus, Glycine, Lotus, Plantago y Cichorium.

Otras plantas preferidas son plantas leguminosas. Las plantas leguminosas o partes de las mismas pueden abarcar cualquier planta en la familia de plantas Leguminosae o Fabaceae. Por ejemplo, las plantas se pueden seleccionar de leguminosas de forraje que incluyen alfalfa, trébol, leucaena; legumbres de grano que incluyen frijoles, lentejas, altramuz, chícharos, cacahuates, soja; legumbres de floración que incluyen altramuz, legumbres farmacéuticas o industriales y especies de legumbres de barbecho o composta verde.

Un género preferido particularmente es Trifolium. Las especies de Trifolium preferidas incluyen Trifolium repens; Trifolium arvense, Trifolium affine y Trifolium occidentale . Una especie de Trifolium preferida particularmente es Trifolium repens.

Otro género preferido es Medicago . Las especies de Medicago preferidas incluyen Medicago sativa y Medicago truncatula . Una especie de Medicago preferida particularmente es Medicago sativa, conocida comúnmente como alfalfa.

Otro género preferido es Glycine . Las especies de Glycine preferidas incluyen Glycine max y Glycine wightii (también conocida como Neonotonia wightii) . Una especie de Glycine preferida particularmente es Glycine max, conocida comúnmente como soja. Una especie de Glycine preferida particularmente es Glycine wightii conocida comúnmente como soja perenne.

Otro género preferido es Vigna . Una especie de Vigna preferida particularmente es Vigna unguiculata conocida comúnmente como caupí.

Otro género preferido es Mucana. Las especies de Mucana preferidas incluyen Mucana pruniens. Una especie de Mucana preferida particularmente es Mucana pruniens conocida comúnmente como frijol terciopelo.

Otro género preferido es Arachis . Una especie de Arachis preferida particularmente es Arachis glabrata, conocida comúnmente como cacahuate perenne.

Otro género preferido es Pisum. Una especie de Pisum preferida es Pisum sativum conocida comúnmente como chícharo.

Otro género preferido es Lotus. Las especies de Lotus preferidas incluyen Lotus corniculatus , Lotus pedunculatus , Lotus glabar, Lotus tenuis y Lotus uliginosus. Una especie de Lotus preferida es Lotus corniculatus , conocida comúnmente como loto de los prados. Otra especie de Lotus preferida es Lotus glabar, conocida comúnmente como loto de los prados de hoja estrecha. Otras especies de Lotus preferidas son Lotus pedunculatus conocida comúnmente como trébol grande. Otra especie de Lotus preferida es Lotus tennuis conocida comúnmente como trébol delgado.

Otro género preferido es Brassica . Una especie de Brassica preferida es Brassica olerácea conocida comúnmente como coles forrajeras y repollos. Un género de Brassica preferido es Camelina. Una especie de Camelina preferida es Carne lina sativa.

Otras especies preferidas son cosechas de semillas oleosas que incluyen pero que no se limitan a los siguientes géneros Brassica, Carthumus, Helianthus , Zea y Sesamu .

Un género de semilla oleosa preferida es Brassica. Una especie de semilla oleosa preferida es Brassica napus .

Un género de semilla oleosa preferida es Brassica . Una especie de semilla oleosa preferida es Brassica oleraceae .

Un género de semilla oleosa preferida es Carthamus. Una especie de semilla oleosa preferida es Carthamus tinctorius .

Un género de semilla oleosa preferida es Helianthus . Una especie de semilla oleosa preferida es Helianthus annuus .

Un género de semilla oleosa preferida es Zea.

Una especie de semilla oleosa preferida es Zea mays .

Un género de semilla oleosa preferida es Sesamum. Una especie de semilla oleosa preferida es Sesamum indicum.

Un género de semilla silage preferida es Zea . Una especie de silage preferida es Zea mays .

Un género productor de grano preferido es Hordeum. Una especie productora de grano preferido es Hordeum vulgare.

Un género de pasto preferido es Lolium. Una especie de pasto preferido es Lolium perenne.

Un género de pasto preferido es Lolium. Una especie de pasto preferido es Lolium arundinaceum .

Un género de pasto preferido es Trifolium. Una especie de pasto preferido es Trifolium repens.

Un género de pasto preferido es Hordeum.

Una especie de pasto preferido es Hordeum vulgare.

Las plantas preferidas también incluyen forraje o plantas de materia prima para animales. Tales plantas incluyen pero no se limitan a los siguientes géneros: Miscanthus , Saccharum, Panicum.

Un género de biocombustible preferido es Miscanthus . Una especie de biocombustible preferida es Miscanthus giganteus .

Un género de biocombustible preferido es Saccharum. Una especie de biocombustible preferida es Saccharum officinarum.

Un género de biocombustible preferido es Panicum. Una especie de biocombustible preferida es Panicum virgatum. Partes de plantas, propágulos y descendencia Se pretende que el término "planta" incluya una planta completa, cualquier parte de una planta, una semilla, un fruto, propágulos y descendencia de una planta.

El término "propágulo" significa cualquier parte de una planta que se puede utilizar en la reproducción o propagación, sexual o asexual, que incluye semillas y cortes.

Las plantas de la invención se pueden hacer crecer ya sea autopolinizadas o cruzadas con diferentes cepas de plantas y la descendencia resultante, que comprende los polinucleótidos o construcciones de la invención y/o que expresan secuencias de DGAT1 quiméricas de la invención también forman parte de la presente invención.

Preferiblemente, las plantas, partes de las plantas, propágulos y descendencia comprenden un polinucleótido o construcción de la invención y/o expresan una secuencia DGAT1 de la invención.

Polinucleótidos y fragmentos El término "polinucleótido", como se utiliza en la presente, significa un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido de cadena sencilla o doble de cualquier longitud pero preferiblemente de por lo menos 15 nucleótidos e incluye, como ejemplos no limitantes, secuencias codificantes y no codificantes de un gen, secuencias directas y antisentido, complementos, exones, intrones, ADN genómico, ADNc, pre-ARNm, ARNm, ARNr, ARNsi, ARNmi, ARNt, ribozimas, polipéptidos recombinantes, secuencias de ADN o ARN aisladas y purificadas, que se encuentran de modo natural, secuencias de ARN y ADN sintético, sondas de ácido nucleico, cebadores y fragmentos.

Un "fragmento" de una secuencia polinucleotídica que se proporciona en la presente es una subsecuencia de nucleótidos contiguos.

El término "cebador" se refiere a un polinucleótido corto, que habitualmente tiene un grupo 3'OH libre que es hibridizado a una plantilla y que se utiliza para polimerización por cebado de un polinucleótido complementario al objetivo.

El término "sonda" se refiere a un polinucleótido corto que se utiliza para detectar una secuencia de polinucleótidos que es complementaria a la sonda en un análisis basado en hibridación. La sonda puede consistir de un "fragmento" o un polinucleótido como se define en la presente.

Polipéptidos y fragmentos El término "polipéptido", como se utiliza en la presente, abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud pero preferiblemente de por lo menos 5 aminoácidos que incluyen proteínas de longitud completa en los cuales los residuos aminoácidos se unen por enlaces peptídicos covalentes. Los polipéptidos de la presente invención, o los utilizados en los métodos de la invención pueden ser productos naturales purificados o se pueden producir parcial o completamente utilizando téenicas recombinantes o sintéticas.

Un "fragmento" de un polipéptido es una subsecuencia del polipéptido que preferiblemente realiza una función/actividad de y/o que influye en la estructura tridimensional del polipéptido.

El término "aislado", como se aplica a las secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos que aquí se describen se utiliza para referirse a secuencias que son removidas de su ambiente celular natural. La secuencia aislada preferiblemente se separa de las secuencias que se pueden encontrar flanqueando la secuencia en su ambiente como se encuentra de manera natural. Una molécula aislada se puede obtener por cualquier método o combinación de métodos que incluyen técnicas bioquímicas, recombinantes y sintéticas.

El término "recombinante" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que se remueve de secuencias que rodean en su contexto natural y/o que se recombinan con secuencias que no están presentes en su contexto natural.

Una secuencia de polipéptidos "recombinantes" se produce por traducción de una secuencia polinucleotídica "recombinante".

El término "derivado de" con respecto a los polinucleótidos o polipéptidos de la invención que son derivados de un género o especie particular significa que el polinucleótido o polipéptido tiene la misma secuencia que el polinucleótido o polipéptido encontrado de manera natural en ese género o especie. El polinucleótido o polipéptido derivado de un género o especie particular por lo tanto se puede producir de manera sintética o recombinante.

Variantes Como se utiliza en la presente, el término "variante" se refiere a secuencias de polinucleótidos o polipéptidos diferentes de las secuencias identificadas específicamente, en donde uno o más nucleótidos o residuos aminoácidos se suprimen, sustituyen o agregan. Las variantes pueden ser variantes alélicas como se producen de modo natural, o variantes que no se producen de manera natural. Las variantes pueden ser de la misma o de otras especies y pueden abarcar homólogos, parálogos y ortólogos. En ciertas modalidades, las variantes de los polipéptidos de la invención y los polipéptidos poseen actividades biológicas que son iguales o similares a las de los polipéptidos de la invención o polipéptidos. El término variante con referencia a los polipéptidos y polipéptidos abarca todas las formas de polipéptidos y polipéptidos como se definen en la presente.

Variantes de polinucleótidos Las secuencias de polinucleótidos variantes preferiblemente presentan por lo menos 50%, de manera más preferible por lo menos 51%, de manera más preferible por lo menos 52%, de manera más preferible por lo menos 53%, de manera más preferible por lo menos 54%, de manera más preferible por lo menos 55%, de manera más preferible por lo menos 56%, de manera más preferible por lo menos 57%, de manera más preferible por lo menos 58%, de manera más preferible por lo menos 59%, de manera más preferible por lo menos 60%, de manera más preferible por lo menos 61%, de manera más preferible por lo menos 62%, de manera más preferible por lo menos 63%, de manera más preferible por lo menos 64%, de manera más preferible por lo menos 65%, de manera más preferible por lo menos 66%, de manera más preferible por lo menos 67%, de manera más preferible por lo menos 68%, de manera más preferible por lo menos 69%, de manera más preferible por lo menos 70%, de manera más preferible por lo menos 71%, de manera más preferible por lo menos 72%, de manera más preferible por lo menos 73%, de manera más preferible por lo menos 74%, de manera más preferible por lo menos 75%, de manera más preferible por lo menos 76%, de manera más preferible por lo menos 77%, de manera más preferible por lo menos 78%, de manera más preferible por lo menos 79%, de manera más preferible por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 81%, de manera más preferible por lo menos 82%, de manera más preferible por lo menos 83%, de manera más preferible por lo menos 84%, de manera más preferible por lo menos 85%, de manera más preferible por lo menos 86%, de manera más preferible por lo menos 87%, de manera más preferible por lo menos 88%, de manera más preferible por lo menos 89%, de manera más preferible por lo menos 90%, de manera más preferible por lo menos 91%, de manera más preferible por lo menos 92%, de manera más preferible por lo menos 93%, de manera más preferible por lo menos 94%, de manera más preferible por lo menos 95%, de manera más preferible por lo menos 96%, de manera más preferible por lo menos 97%, de manera más preferible por lo menos 98% y de manera más preferible por lo menos 99% de identidad con una secuencia de la presente invención. La identidad se encuentra sobre un intervalo de comparación de por lo menos 20 posiciones nucleotídicas, preferiblemente por lo menos 50 posiciones nucleotídicas, de manera más preferible por lo menos 100 posiciones nucleotídicas y de manera mucho más preferible sobre toda la longitud de un polinucleótido de la invención.

La identidad de secuencias de polinucleótido se puede determinar de la siguiente manera. La secuencia de polinucleótido objeto se compara con una secuencia de polinucleótido candidata utilizando BLASTN (a partir del conjunto BLAST de programas, versión 2.2.5 [Noviembre del 2002]) en bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett.174:247-250), la cual está disponible públicamente del sitio de la red de NCBI de la red mundial en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. Los parámetros implícitos de bl2seq se utilizan excepto que el filtrado de partes de baja complejidad debe ser apagado.

La identidad de las secuencias de polinucleótidos se puede examinar utilizando los siguientes parámetros de líneas de instrucciones unix: bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2-F F -p blastn El parámetro -F F inactiva el filtrado de secciones de baja complejidad. El parámetro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. El programa bl2seq reporta identidad de secuencia tanto en el número como en el porcentaje de nucleótidos idénticos en una línea "identidades =".

La identidad de secuencia de polinucleótidos también se puede calcular sobre toda la longitud de la superposición entre secuencias polinucleotídicas candidata y objeto utilizando programas de alineación de secuencia global (por ejemplo, Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Una implementación completa del algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch se encuentra en el programa de aguja del paquete EMBOS (Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics Junio del 2000, vol 16, No 6, pp.276-277) el cual se puede obtener de la red mundial en http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/. El servidor de la European Bioinformatics Institute también proporciona la instalación para realizar alineaciones globales EMBOSS-aguja entre dos secuencias en línea en http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/.

De manera alternativa, se puede utilizar el programa GAP el cual calcula una alineación global óptima de dos secuencias sin castigar las separaciones terminales. GAP se describe en el siguiente documento: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment, Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.

Un método preferido para calcular el % de identidad de secuencia de polinucleótidos se basa en alineación de secuencias que van a ser comparadas utilizando ClustalX (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci.23, 403-5).

Las variantes de polinucleótido de la presente invención también abarcan aquellas las cuales presentan una similitud con una o más secuencias identificadas específicamente que es probable que conserven la equivalencia funcional de aquellas secuencias y la cual no se espera de modo razonable que se hayan presentado por probabilidad aleatoria. Esta similitud de secuencia con respecto a polipéptidos se puede determinar utilizando el programa bl2seq disponible públicamente del conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [Noviembre del 2002]) del sitio de la red de NCBI en la red mundial en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/.

La similitud de secuencias de polinucleótidos se puede examinar utilizando los siguientes parámetros de líneas de instrucciones unix: bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2-F F -p blastx El parámetro -F F inactiva el filtrado de secciones de baja complejidad. El parámetro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. Este programa encuentra regiones de similitud entre las secuencias y para cada una de las regiones reporta un "valor E" el cual es el número esperado de veces que uno esperaría observar la coincidencia por probabilidad en una base de datos de un tamaño de referencia fijo que contiene secuencias aleatorias. El tamaño de esta base de datos se establece de modo implícito en el programa bl2seq. Para valores E pequeños, mucho menores de uno, el valor E es aproximadamente la probabilidad de una coincidencia aleatoria.

Las secuencias de polinucleótidos variantes preferiblemente presentan un valor E de menos de 1 x 106 de manera más preferible menor que 1 x 109, de manera más preferible menor que 1 x 1012, de modo más preferible menor que 1 x 1015, de manera más preferible menor que 1 x 1018, de manera más preferible menor que 1 x 1021, de manera más preferible menor que 1 x 103°, de manera más preferible menor que 1 x 1040, de manera más preferible menor que 1 x 105°, de manera más preferible menor que 1 x 106°, de manera más preferible menor que 1 x 1CT70, de manera más preferible menor que 1 x ÍO80, de manera más preferible menor que 1 x 1CT90 y de manera mucho más preferible menor que 1 x IO100 cuando se compara con cualquiera de las secuencias identificadas específicamente.

De manera alternativa, los polinucleótidos variantes de la presente invención, o utilizados en los métodos de la invención, hibridizan con secuencias de polinucleótidos especificadas o complementos de las mismas bajo condiciones rigurosas.

El término "hibridizar bajo condiciones rigurosas" y equivalentes gramaticales de los mismos hacen referencia a la capacidad de una molécula polinucleotídica a hibridizar con una molécula polinucleotídica objetivo (tal como una molécula polinucleotídica objetivo inmovilizada en una mancha de ADN o ARN, tal como transferencia Southern o transferencia Northern) bajo condiciones definidas de temperatura y concentración de sal. La capacidad para hibridizar bajo condiciones de hibridación rigurosas se puede determinar inicialmente por hibridación bajo condiciones menos rigurosas que aumentan la rigurosidad hasta la rigurosidad deseada.

Con respecto a moléculas de polinucleótidos mayores de aproximadamente 100 bases de longitud, las condiciones de hibridación rigurosas típicas son no mayores de 25 a 30°C (por ejemplo, 10°C) por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del dúplex nativo (véase de modo general Sambrook, et al . , Eds.1987, Molecular Cloning, A Laboratory Maual, 2nd Ed. Coid Spring Hrbor Press; Ausubel et al . , 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing). La Tm para moléculas de polinucleótidos mayores de aproximadamente 100 bases se puede calcular por la fórmula Tm = 81.5 + 0.41% (G + C-log(Na+). (Sambrook et al . , Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Coid Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). Las condiciones típicas de rigurosidad para polinucleótidos mayores de 100 bases de longitud serían condiciones de hibridación tales como prelavado en una solución de 6X SSC, SDS 0.2%; hibridación a 65°C, 6X SSC, SDS 0.2% durante la noche; seguido por dos lavados de 30 minutos cada uno en IX SSC, SDS 0.1% a 65°C u dos lavados de 30 minutos cada uno en 0.2X SSC, SDS 0.1% a 65°C.

Con respecto a moléculas de polinucleótidos que tienen una longitud menor de 100 bases, las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares son 5 a 10°C por debajo de la Tm. En promedio, la Tm de una molécula de polinucleótido de una longitud menor de 100 pares de bases se reduce en aproximadamente (500/longitud del oligonucleótido)°C.

Con respecto a las imitaciones de ADN conocidas como ácidos peptidonucleicos (PNA) (Nielsen et al . , Science 1991 Diciembre 6;254 (5037):1497-500) los valores Tm son mayores que aquellos para los híbridos ADN-ADN o ADN-ARN y se pueden calcular utilizando la fórmula descrita en Giesen et al . , Nucleic Acids Res. 1998 Noviembre 1;26(21):5004-6. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares para un híbrido ADN-PNA que tiene una longitud menor de 100 bases son 5 a 10°C por debajo de la Tm.

Los polinucleótidos variantes de la presente invención, o utilizados en los métodos de la invención también abarcan polinucleótidos que difieren de las secuencias de la invención pero, como una consecuencia de la degeneración del código genético codifican para un polipéptido que tiene actividad similar con un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Una alteración de secuencia que no cambia la secuencia de aminoácidos del polipéptido es una "variación silenciosa". Excepto para ATG (metionina) y TGG (triptofano), otros codones para el mismo aminoácido se pueden cambiar por téenicas reconocidas en el ámbito, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones en un organismo hospedador particular.

Las alteraciones de secuencia de polinucleótidos que resultan en sustituciones conservadoras de uno o varios aminoácidos en la secuencia de polipéptidos codificada sin alterar de manera significativa su actividad biológica también se incluyen en la invención. Una persona experta en el ámbito conocerá los métodos para realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas (véase, por ejemplo, Bowie et al . , 1990, Science 247, 1306).

Las variantes de polinucleótidos debidas a variaciones silenciosas y sustituciones conservadoras en las secuencia de polipéptidos codificada se puede determinar utilizando el programa bl2seq disponible públicamente del conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [Noviembre del 2002]) a partir del sitio de red de NCBI en la red mundial en ftp://ftp.ncbi.gov/blast por medio del algoritmo tblastx como se ha descrito previamente.

Variantes de polipéptidos El término "variantes" con referencia a polipéptidos abarca polipéptidos como se encuentran de manera natural, producidos de modo recombinante y sintético. Las secuencias de polipéptidos variantes preferiblemente presentan por lo menos 50%, de manera más preferible por lo menos 51%, de manera más preferible por lo menos 52%, de manera más preferible por lo menos 53%, de manera más preferible por lo menos 54%, de manera más preferible por lo menos 55%, de manera más preferible por lo menos 56%, de manera más preferible por lo menos 57%, de manera más preferible por lo menos 58%, de manera más preferible por lo menos 59%, de manera más preferible por lo menos 60%, de manera más preferible por lo menos 61%, de manera más preferible por lo menos 62%, de manera más preferible por lo menos 63%, de manera más preferible por lo menos 64%, de manera más preferible por lo menos 65%, de manera más preferible por lo menos 66%, de manera más preferible por lo menos 67%, de manera más preferible por lo menos 68%, de manera más preferible por lo menos 69%, de manera más preferible por lo menos 70%, de manera más preferible por lo menos 71%, de manera más preferible por lo menos 72%, de manera más preferible por lo menos 73%, de manera más preferible por lo menos 74%, de manera más preferible por lo menos 75%, de manera más preferible por lo menos 76%, de manera más preferible por lo menos 77%, de manera más preferible por lo menos 78%, de manera más preferible por lo menos 79%, de manera más preferible por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 81%, de manera más preferible por lo menos 82%, de manera más preferible por lo menos 83%, de manera más preferible por lo menos 84%, de manera más preferible por lo menos 85%, de manera más preferible por lo menos 86%, de manera más preferible por lo menos 87%, de manera más preferible por lo menos 88%, de manera más preferible por lo menos 89%, de manera más preferible por lo menos 90%, de manera más preferible por lo menos 91%, de manera más preferible por lo menos 92%, de manera más preferible por lo menos 93%, de manera más preferible por lo menos 94%, de manera más preferible por lo menos 95%, de manera más preferible por lo menos 96%, de manera más preferible por lo menos 97%, de manera más preferible por lo menos 98% y de modo mucho más preferible por lo menos 99% de identidad con secuencias de la presente invención. La identidad se encuentra sobre un intervalo de comparación de por lo menos 20 posiciones de aminoácidos, preferiblemente por lo menos 50 posiciones de aminoácidos, de manera más preferible por lo menos 100 posiciones de aminoácidos y de manera mucho más preferible sobre toda la longitud de un polipéptido de la invención.

La identidad de secuencias de polipéptidos se puede determinar de la siguiente manera. La secuencia de polipéptido objetivo se compara con una secuencia de polipéptidos candidatos utilizando BLASTP (del conjunto de programas BLAST, versión 2.2.5 [Noviembre del 2002]) en bl2seq la cual está disponible públicamente del sitio de la red de NCBI de la red mundial en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. Los parámetros implícitos de bl2seq se utilizan excepto que se debe inactivar el filtrado de regiones de complejidad baja.

La identidad de las secuencias de polipéptidos también se puede calcular sobre toda la longitud de la superposición entre secuencias de polinucleótidos candidatas y objetivo utilizando programas de alineación de secuencia global. EMBOSS-aguja (disponible en http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) y GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235) como se describe en lo anterior y también programas de alineación de secuencia global adecuados para calcular la identidad de secuencia de polipéptidos.

Un método preferido para calcular el % de identidad de secuencia de polipéptido se basa en alineación de las secuencias que se van a comparar utilizando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci.23, 403-5).

Las variantes de polipéptidos de la presente invención, o utilizados en los métodos de la invención también abarcan aquellos los cuales presentan una similitud con una o más de las secuencias identificadas específicamente que es probable que conserven la equivalencia funcional con aquellas secuencias y las cuales no se espera de modo razonable que se hayan presentado por probabilidad aleatoria.

La similitud de secuencia con respecto a los polipéptidos se puede determinar utilizando el programa bl2seq disponible públicamente del conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [Noviembre del 2002]) a partir del sitio de la red de NCBI en la red mundial en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/. La similitud de secuencias de polipéptidos se puede examinar utilizando los siguientes parámetros de línea de instrucción de unix: bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2-F F -p blastp Las secuencias de polipéptidos variantes preferiblemente presentan un valor E de menos de 1 x 106 de manera más preferible menor que 1 x 109, de manera más preferible menor que 1 x 1012, de manera más preferible menor que 1 x 1015, de manera más preferible menor de 1 x 101B, de manera más preferible menor de 1 x 1021, de manera más preferible menor de 1 x 103°, de manera más preferible menor de 1 x 104°, de manera más preferible menor de 1 x 105°, de manera más preferible menor d 1 x 10ÍO, de manera más preferible menor de 1 x 107°, de manera más preferible menor de 1 x 108°, de manera más preferible menor que 1 x 109° y de manera mucho más preferible menor que 1 x 10100 cuando se compara con cualquiera de las secuencias identificadas específicamente.

El parámetro -F F inactiva el filtrado de secciones de baja complejidad. El parámetro -p selecciona el algoritmo apropiado para el par de secuencias. Este programa encuentra regiones de similitud entre las secuencias y para cada una de estas regiones reporta un "valor E" el cual es el número esperado de veces que uno esperaría observar esta coincidencia por probabilidad en una base de datos de un tamaño de referencia fijo que contenga secuencias aleatorias. Para valores E pequeños, mucho menores de uno, esta es aproximadamente la probabilidad de tal coincidencia aleatoria.

Las sustituciones conservadoras de uno o varios aminoácidos de una secuencia polipeptídica descrita sin alterar de modo significativo su actividad biológica también se incluye en la invención. Una persona experta en el ámbito sabrá de los métodos para producir sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas (véase, por ejemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

Construcciones, vectores y componentes de los mismos El término "construcción genética" se refiere a una molécula de polinucleótidos, habitualmente ADN de cadena doble la cual puede haber sido insertada dentro de otra molécula de polinucleótidos (la molécula de polinucleótidos insertada) tal como, pero sin limitarse a una molécula de ADNc. Una construcción genética puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripción de la molécula de polinucleótidos insertada y, opcionalmente, traducir el transcrito en un polipéptido. La molécula de polinucleótidos de inserción se puede derivar de la célula huésped o se puede derivar de una célula u organismo diferente y/o puede ser un polinucleó ido recombinante. Una vez dentro de la célula hospedadora, la construcción genética se puede integrar en el ADN cromosómico del hospedador. La construcción genética se puede enlazar a un vector.

El término "vector" se refiere a una molécula de polinucleótidos, habitualmente ADN de cadena doble, el cual se utiliza para transportar la construcción genética en una célula hospedadora. El vector puede ser capaz de replicación en por lo menos un sistema hospedador adicional, tal como E. col i .

El término "construcción de expresión" se refiere a una construcción genética que incluye los elementos necesarios que permiten la transcripción de la molécula polinucleotídica inserta y, opcionalmente, traducir el transcrito en un polipéptido. Una construcción de expresión típicamente comprende, en una dirección 5' a 3': a) un promotor funcional en la célula hospedadora dentro de la cual se transformará la construcción, b) el polinucleótido que se va a expresar, y c) un terminador funcional en la célula hospedadora en la cual se transformará la construcción.

El término "región codificante" o "marco de lectura abierto" (ORF, por sus siglas en inglés) se refiere a la cadena codificante o directa de una secuencia de ADN genómico o una secuencia de ADNc que es capaz de producir un producto de transcripción y/o un polipéptido bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. La secuencia codificante en algunos casos, se puede identificar por la presencia de un codón de inicio de traducción 5' y un codón de detención de traducción 3 '. Cuando se inserta en una construcción genética, una "secuencia codificante" es capaz de ser expresada cuando se enlaza operablemente a secuencias promotoras y terminadoras.

El término "unido operablemente" significa que lo secuenciado que se va a expresar se coloca bajo el control de elementos reguladores que incluyen promotores, elementos reguladores específicos de tejido, elementos reguladores temporales, mejoradores, represores y terminadores.

El término "región no codificantes" se refiere a secuencias no traducidas que están hacia el extremo 51 del sitio de inicio de traducción y hacia el extremo 3' del sitio de detención de traducción. Estas secuencias también se les denomina respectivamente como 5' UTR y 3' UTR. Estas regiones incluyen elementos que se requieren para inicio y finalización de transcripción, estabilidad de ARNm y para regulación de eficiencia de traducción.

Los terminadores son secuencias las cuales finalizan la transcripción y se les encuentra en los extremos 3' no traducidos de genes hacia el extremo 31 de la secuencia traducida. Los terminadores son determinantes importantes de la estabilidad de ARNm y en algunos casos se ha encontrado que tienen funciones reguladoras espaciales.

El término "promotor" se refiere a elementos reguladores cis no transcritos hacia el extremo 5' de la región codificante que regulan la transcripción de genes. Los promotores comprenden elementos de iniciadores cis los cuales especifican el sitio de inicio de transcripción y las secuencias o cajas conservadas tales como la caja TATA y los motivos que se encuentran en factores de transcripción. Los intrones dentro de secuencias codificantes también pueden regular la transcripción e influencia de procesamiento post-transcripcional (que incluye empalme, rematado y poliadenilación).

Un promotor puede ser homólogo con respecto al polinucleótido que se va a expresar. Esto significa que el promotor y el polinucleótido se encuentran enlazados operablemente en la naturaleza.

De manera alternativa, el promotor puede ser heterólogo con respecto al polinucleótido que se va a expresar. Esto significa que el promotor y el polinucleótido no se encuentran enlazados operablemente en la naturaleza.

En ciertas modalidades, los polinucleótidos/polipé tidos DGAT1 de la invención ventajosamente se pueden expresar bajo el control de secuencias promotoras seleccionadas como se describe más adelante.

Promotores específicos para tejido vegetativo Un ejemplo de un promotor específico vegetativo se encuentra en los documentos US 6,229,067; US 7,629,454; US 7,153,953; y US 6,228,643.

Promotores específicos de polen Un ejemplo de un promotor específico de polen se encuentra en los documentos US 7,141,424; US 5,545,546; US 5,412,085; US 5,086,169 y US 7,667,097.

Promotores específicos de semillas Un ejemplo de un promotor específico de semillas se encuentra en los documentos US 6,342,657; US 7,081,561; US 7,405,335; US 7,642,346 y US 7,371,928. Un promotor específico de semillas preferido es el promotor napina de Brassica napus (Josefssson et al., 1987, J Biol Chem. 262(25):12196-201; Ellerstróm et al., 1996, Plant Molecular Biology, Volumen 32, Issue 6, pp.1019-1027).

Promotores específicos de frutos Un ejemplo de un promotor específico de fruto se encuentra en los documentos US 5,536,653; US 6,127,179; US 5,608,150; y US 4,943,674 Promotores preferidos de tejido no f os f osinteticos Los promotores preferidos de tejido no fotosintéticos incluyen aquellos que se expresan de manera preferencial en tejidos/órganos no fotosintéticos de la planta.

Los promotores preferidos de tejido no fotosintéticos también pueden incluir promotores reprimidos en luz.

Promotores reprimidos en luz Un ejemplo de un promotor reprimido en luz se encuentra en los documentos US 5,639,952 y US 5,656,496. Promotores específicos de raíz Un ejemplo de un promotor específico de raíz se encuentra en los documentos US 5,837,848; y US 2004/0067506 y US 2001/0047525.

Promotores específicos de tubérculos Un ejemplo de un promotor específico de tubérculo se encuentra en el documento US 6,184,443.

Promotores específicos de bulbos Un ejemplo de un promotor específico de bulbo se encuentra en Smeets et al., (1997) Plan Physiol.113:765-771. Promotores preferidos de rizoma Un ejemplo de un promotor preferido de rizoma se encuentra en Seong Jang et al., (2006) Plant Physiol. 142:1148-1159.

Promotores específicos de endosperma Un ejemplo de un promotor específico de endosperma se encuentra en el documento US 7,745,697.

Promotores de mazorca Un ejemplo de un promotor capaz de inducir expresión en una mazorca se encuentra en Schenk et al . , (2001) Plant Molecular Biology, 47:399-412.

Promotores preferidos de tejido fotosintetico Los promotores preferidos de tejido fotosintético incluyen aquellos que se expresan de modo preferencial en tejidos fotosintéticos de las plantas. Los tejidos fotosintéticos de las plantas incluyen hojas, tallos, brotes y partes por encima del piso de la planta. Los promotores preferidos de tejido fotosintético incluyen promotores regulados por luz.

Promotores regulados por luz Se conocen numerosos promotores regulados por luz por aquellos expertos en el ámbito e incluyen, por ejemplo, promotores de proteína que une clorofila a/b (Cab, por sus siglas en inglés) y los promotores de la subunidad pequeña de Rubisco (SSU, por sus siglas en inglés). Un ejemplo de un promotor regulado por luz se encuentra en el documento US 5,750,385. En este contexto, regulado por luz significa inducible por luz o inducido por luz.

Un "transgen" es un polinucleótido que se toma de un organismo y que se incluye dentro de un organismo diferente por transformación. El transgen de puede derivar de la misma especie o de una especie diferente que la especie del organismo en la cual se introdujo el transgen.

Celulas hospedadoras Las células hospedadoras se pueden derivar, por ejemplo, de organismos bacterianos, micóticos, de levadura, insectos, mamíferos, de algas o plantas. Las células hospedadoras también pueden ser células sintéticas. Las células hospedadoras preferidas son células eucarióticas. Una célula hospedadora preferida particularmente es una célula vegetal, particularmente una célula vegetal en un tejido vegetativo de una planta.

Una "planta transgénica" se refiere a una planta la cual contiene material genético nuevo como resultado de la manipulación genética o transformación. El material genético nuevo se puede derivar de una planta de la misma especie que la planta transgénica resultante o de una especie diferente. La descendencia subsecuente o generaciones de la planta que aún contienen el material genético nuevo también son plantas transgénicas, de acuerdo con la invención.

Métodos para aislar o producir polinucleótidos Las moléculas de polinucleótidos de la invención se pueden aislar mediante la utilización de una diversidad de téenicas conocidas por aquellos habitualmente expertos en el ámbito. A modo de ejemplo, estos polipéptidos se pueden aislar mediante el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) descrita en Mullís et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser incorporada en la presente como referencia. Los polipéptidos de la invención se pueden amplificar utilizando cebadores, como se define en la presente, derivados de las secuencias de polinucleótidos de la invención.

Los métodos adicionales para aislamiento de polinucleótidos de la invención incluyen el uso de la totalidad o porciones de los polipéptidos que tienen la secuencia que se establece en la presente como sondas de hibridación. La téenica de hibridación de sondas de polinucleótidos marcadas a polinucleótidos inmovilizados sobre soportes sólidos tales como filtros de nitrocelulosa o membranas de nylon se pueden utilizar para el cribado de bibliotecas genómicas o de ADNc. La hibridación ejemplar y las condiciones de lavado son: hibridación durante 20 horas a 65°C en 5.0 X SSC, dodecilsulfato de sodio 0.5%, solución de Denhardt IX; lavado (tres lavados de veinte minutos cada uno, a 55°C) en 1.0 SSC, dodecilsulfato de sodio 1% (p/v) y opcionalmente un lavado (durante 20 minutos) en 0.5X SSC, dodecilsulfato de sodio 1% (p/v), a 60°C. Un lavado adicional opcional (durante veinte minutos) se puede llevar a cabo bajo condiciones de 0.1 X SSC, dodecilsulfato de sodio 1% (p/v), a 60°C.

Los fragmentos de polinucleótidos de la invención se pueden producir por téenicas bien conocidas en el ámbito tales como digestión por endonucleasa de restricción, síntesis de oligonucleótidos y amplificación de PCR.

Se puede utilizar una secuencia polinucleotídica parcial, en métodos bien conocidos en el ámbito para identificar la secuencia de polinucleótidos de longitud completa correspondiente. Estos métodos incluyen métodos basados en PCR, 5'RACE (Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218:340-56) e hibridación, o métodos basados en computadora/base de datos. Además, a modo de ejemplo, la PCR inversa permite la adquisición de secuencias desconocidas, que flanquean las secuencias polinucleotídicas descritas en la presente, partiendo con cebadores en base en una región conocida (Triglia et al . , 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186, incorporada en la presente como referencia) . El método utiliza varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. El fragmento después se circulariza por ligación intramolecular y se utiliza como una plantilla de PCR. Los cebadores divergentes se diseñan a partir de la región conocida. Con el fin de ensamblar físicamente clones de longitud completa, se pueden utilizar enfoques de biología molecular convencionales (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Coid Spring Harbor Press, 1987).

Puede resultar benéfico, cuando se produce una planta transgénica a partir de una especie particular, transformar la planta con una secuencia o secuencias derivadas de esa especie. El beneficio puede ser que se alivian las preocupaciones públicas respecto a transformación de especies cruzadas en la generación de organismos transgénicos. Por estos motivos entre otros, es deseable poder identificar y aislar ortólogos de un gen particular en varias especies vegetales diferentes.

Las variantes (que incluye ortólogos) se pueden identificar por los métodos descritos.

Métodos para identificar variantes Métodos físicos Los polipéptidos variantes se pueden identificar utilizando métodos basados en PCR (Mullís et al . , Eds.1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser). Típicamente, la secuencia de polinucleótidos de un cebador, útil para amplificar variantes de moléculas de polinucleótido de la invención por PCR se pueden basar en una secuencia que codifica para una región conservada de la secuencia de aminoácidos correspondiente.

De manera alternativa, se pueden utilizar métodos de cribado de biblioteca, bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Coid Spring Harbor Press, 1987). Cuando se identifican variantes de la secuencia de sonda, la hibridación y/o la rigurosidad de lavado típicamente se reducirán en relación a el momento en que se buscan las coincidencias de secuencia exacta.

Las variantes de polipéptido también se pueden identificar por métodos físicos, por ejemplo, por cribado de bibliotecas de expresión utilizando anticuerpos generados contra polipéptidos de la invención (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Coid Spring Harbor Press, 1987) o al identificar polipéptidos a partir de fuentes naturales con la ayuda de estos anticuerpos.

Métodos basados en computadora Las secuencias variantes de la invención, que incluyen variantes tanto de polinucleótidos como de polipéptidos también se pueden identificar por métodos basados en computadora bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito utilizando algoritmos de alineación de secuencia de dominio público y herramientas de búsqueda de similitud de secuencias para el análisis de bases de datos de secuencias (las bases de datos de dominio público incluyen Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR y otras). Véase, por ejemplo, Nucleic Acids Res.29:1-10 y 11-16, 2001 para ejemplos de recursos en línea. Las búsquedas de similitud recuperan y alinean secuencias objetivo para comparación con una secuencia que se va a analizar (es decir, una secuencia interrogadora). Los algoritmos de comparación de secuencias utilizan matrices de calificación para asignar una calificación general a cada una de las alineaciones.

Una familia ejemplar de programas útiles para identificar variantes en bases de datos de secuencia es el conjunto de programas BLAST (versión 2.2.5 [Noviembre del 2002]) que incluye BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN y tBLASTX, las cuales están disponibles públicamente de (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) o del National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Buildin 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894 USA. El servidor en NCBI también proporciona facilidad para utilizar los programas para cribar un número de bases de datos de secuencias disponibles públicamente. BLASTN compara una secuencia interrogadora de nucleótidos contra una base de datos de secuencias de nucleótidos, BLASTP compara una secuencia interrogadora de aminoácido contra una base de datos de secuencias de proteínas. BLASTX compara una secuencia interrogadora de nucleótidos traducida en todos los marcos de lectura contra una base de datos de secuencia de proteínas. tBLASTN compara una secuencia interrogadora de proteína contra una base de datos de secuencia nucleotídica traducida dinámicamente en todos los marcos de lectura. tBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia interrogadora nucleotídica contra la traducción de seis marcos de una base de datos de secuencia nucleotídica.

Los programas BLAST se pueden utilizar con parámetros preestablecidos o los parámetros se pueden alterar según se requiera para ajustar la búsqueda.

El uso de la familia de algoritmos BLAST, que incluye BLASTN, BLASTP y BLASTX se describe en la publicación de Altschul et al., Nucleic Acid Res.25:3389-3402, 1997.

Los "aciertos" para una o más secuencias de base de datos por una secuencia interrogadora producidos por BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX, o un algoritmo similar alinean e identifican porciones de secuencias similares. Los aciertos se distribuyen en orden del grado de similitud y la longitud de superposición de secuencia. Los aciertos a una secuencia de base de datos generalmente representan una superposición sobre solo una fracción de la longitud de secuencia de la secuencia interrogada.

Los algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX también producen valores "esperados" para alineaciones. El valor esperado (E) indica el número de aciertos que uno puede "esperar" observar por probabilidad cuando se busca una base de datos del mismo tamaño que contiene secuencias contiguas aleatorias. El valor esperado se utiliza como un umbral de significancia para determinar si el acierto a una base de datos indica similitud verdadera. Por ejemplo, un valor E de 0.1 asignado a un acierto de polinucleótido se interpreta que significa que en un a base de datos del tamaño de la base de datos analizada, uno puede esperar observar 0.1 coincidencias sobre la porción alineada de la secuencia con una calificación similar simplemente por probabilidad. Para secuencias que tienen un valor E de 0.01 o menor sobre porciones alineadas y pareadas, la probabilidad de encontrar a una coincidencia por probabilidad en esa base de datos es de 1% o menos utilizando los algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX.

Las alineaciones de secuencias múltiples de un grupo de secuencias relacionadas se puede llevar a cabo con CLUSTALW (Thompson, J. D., Higgins, D. G. y Gibson, T. J. (1994) CLAUSTALW: improving the sensitivity of Progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids research, 22: 4673-4680, http://www.igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html) o T-C0FFEE (CedricNotredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate múltiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: 205-217)) o PILEUP, el cual utiliza alineaciones pareadas progresivas (Feng and Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.25, 351).

Las aplicaciones de programas de reconocimiento de patrones están disponibles para encontrar motivos o secuencias de firma. Por ejemplo, MEME (múltiple Em para dilucidación de motivos) encuentra motivos y secuencias de firma en un conjunto de secuencias y MAST (herramienta de alineación y búsqueda de motivos) utiliza estos motivos para identificar motivos similares o iguales en secuencias analizadas. Los resultados MAST se proporcionan como una serie de alineaciones con datos estadísticos apropiados y una generalidad visual de los motivos encontrados. MEME y MAST fueron desarrollados en la University of California, San Diego.

PROSITE (Bairoch and Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res.27, 215) es un método de identificación de las funciones de proteínas no caracterizadas traducidas a partir de secuencias genómicas o de AD c. La base de datos PROSITE (www.expasy.org/prosite) contiene patrones y perfiles biológicamente significativos y se diseña de manera que puede ser utilizada con herramientas de computación apropiadas para asignar una secuencia nueva a una familia conocida de proteínas o para determinar cuales dominios conocidos están presentes en la secuencia (Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235). Prosearch es una herramienta que puede buscar en las bases de datos SWISS-PROT y EMBL con un patrón o firma de secuencia dado.

Métodos para aislamiento de polipéptidos Los polipéptidos de la invención, o utilizados en los métodos de la invención, que incluyen polipéptidos variantes, se pueden preparar utilizando métodos de síntesis de péptidos bien conocidos en el ámbito tales como la síntesis de péptidos directo utilizando téenicas en fase sólida (por ejemplo, Stewart et al., 1969, in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California, o síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems 431A (Foster City, California). Las formas mutadas de los polipéptidos también se pueden producir durante esta síntesis.

Los polipéptidos y variantes de polipéptidos de la invención, o utilizados en los métodos de la invención también se pueden purificar a partir de fuentes naturales utilizando una diversidad de técnicas que son bien conocidas en el ámbito (por ejemplo, Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol.182, Guide to Protein Purification).

De manera alternativa, los polipéptidos y variantes de polipéptidos de la invención o utilizados en los métodos de la invención se pueden expresar de manera recombinante en células hospedadoras adecuadas y se pueden separar de la células como se describe más adelante.

Métodos para producir construcciones y vectores Las construcciones genéticas de la presente invención comprenden una o más secuencias de polinucleótidos de la invención y/o polinucleótidos que codifican para polipéptidos de la invención y pueden ser útiles para transformación, por ejemplo, de organismos bacterianos, micóticos, insectos, de mamíferos o plantas. Las construcciones genéticas de la invención están destinadas para incluir construcciones de expresión como se definen en la presente.

Los métodos para producir y utilizar construcciones genéticas y vectores son bien conocidos en el ámbito y se describen de manera general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Coid Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987).

Métodos para producir células hospedadoras que comprende polinucleótidos, construcciones o vectores La invención proporciona una célula hospedadora la cual comprende una construcción genética o vector de la invención.

Las células hospedadoras que comprenden construcciones genéticas, tales como construcciones de expresión, de la invención son útiles en métodos bien conocidos en el ámbito (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Coid Spring Harbor Press, 1987; Autsubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987) para la producción recombinante de polipéptidos de la invención. Estos métodos pueden involucrar el cultivo de células hospedadoras en un medio apropiado en condiciones adecuadas para, o que inducen la expresión de un polipéptido de la invención. El polipéptido recombinante expresado, el cual opcionalmente puede ser secretado al cultivo, después se puede separar del medio, de las células hospedadoras o del medio de cultivo por métodos bien conocidos en el ámbito (por ejemplo, Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology, Vol . 182, Guide to Protein Purification).

Métodos para producir células vegetales y plantas que comprenden construcciones y vectores La invención proporciona además células vegetales que comprenden una construcción genética de la invención y células vegetales modificadas para alterar la expresión de un polinucleótido o polipéptido de la invención, o utilizado en los métodos de la invención. Las plantas que comprenden a estas células también forman un aspecto de la invención.

Los métodos para transformar células vegetales, plantas y porciones de las mismas con polipéptidos se describen en Draper et al., 1988, Plant Genetic Transíormation and Gene Expression. A Laboratory Manuak. Blackwell Sci. Pub. Oxford, p.365; Potrykus and Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-verlag, Berlín.; and Gelvin et al . , 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad, Pub. Dordrecht. Una revisión de las plantas transgénicas, que incluye téenicas de transformación se proporciona en Galun and Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, Londres.

Metodos para manipulación genética de plantas Están disponibles numerosas estrategias de transformación de plantas (por ejemplo, Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol. 48, 297, Hellens et al . , (2000) Plant Mol Biol 42:819-32, Hellens et al . , Plant Meth 1: 13).

Por ejemplo, se pueden diseñar estrategias para incrementar la expresión de un polinucleótido al polipéptido en una célula vegetal, órgano y/o en una etapa de desarrollo particular en donde/cuando normalmente se expresa o para expresar ectópicamente un polinucleótido/polipéptido en una célula, tejido, órgano y/o una etapa de desarrollo particular la cual/cuando normalmente no se expresa.

El polinucleótido/polipéptido expresado se puede derivar de la especie vegetal para que se transforme o pueda ser derivado de una especie vegetal diferente.

Las estrategias de transformación se pueden diseñar para reducir la expresión de un polinucleótido/polipéptido en una célula, tejido u órgano vegetal o en una etapa de desarrollo particular la cual/cuando normalmente se expresa. Estas estrategias se conocen como estrategias de bloqueo de expresión de genes.

Las construcciones genéticas para expresión de genes en plantas transgénicas típicamente incluyen promotores para inducir la expresión de uno o más polinucleótidos clonados, terminadores y secuencias marcadoras seleccionables para detectar la presencia de la construcción genética en la planta transformada.

Los promotores adecuados para uso en las construcciones de esta invención son funcionales en una célula, tejido u órgano de una planta monocotiledónea o dicotiledónea e incluyen promotores específicos de célula, de te ido o de órgano, promotores específicos de ciclo celular, promotores temporales, promotores inducibles, promotores constitutivos que son activos en la mayor parte de los tejidos vegetales y promotores recombinantes. La elección del promotor dependerá de la expresión temporal y parcial del polinucleótido clonado, si así se desea. Los promotores pueden ser aquellos normalmente asociados con un transgen de interés o promotores los cuales se derivan de genes de otras plantas, virus o bacterias y hongos patógenos para las plantas. Los expertos en el ámbito podrán ser capaces, sin experimentación indebida, de seleccionar promotores que son adecuados para uso en la modificación y modulación de rasgos vegetales utilizando construcciones genéticas que comprenden las secuencias de polinucleótidos de la invención. Los ejemplos de promotores vegetales constitutivos incluyen el promotor 35S de CaMV, el promotor de nopalina sintasa y el promotor de octopina sintasa, así como el promotor Ubi 1 de maíz. Los promotores los cuales son activos en tejidos específicos responden a señales de desarrollo internas o tensiones abióticas o bióticas externas y se describen en la literatura científica. Los promotores ejemplares se describen, por ejemplo, en WO 02/00894 y WO 2011/053169, la cual se incorpora en la presente como referencia.

Los terminadores ejemplares que se utilizan habitualmente en construcción genética de transformación de plantas incluyen, por ejemplo, el terminador 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV, por sus siglas en inglés), los terminadores de nopalina sintasa u octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen de zeina de Zea mays, el terminador ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa y el terminador PI-II de Solanum tuberosum.

Los marcadores seleccionables utilizados habitualmente en transformación de plantas incluyen el gen para neomicina fosfotransferasa II (NPT II) el cual confiere resistencia a canamicina, el gen aadA, el cual confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina, la fosfinotricina acetil transferasa (gen bar) para resistencia a Ignite (AgrEvo) y Basta (Hoechst) y el gen de fosfotransferasa para higromicina (hpt) para resistencia a higromicina.

El uso de construcciones genéticas que comprenden genes indicadores (secuencias codificantes las cuales expresan una actividad que es extraña para el hospedador, habitualmente una actividad enzimática y/o una señal visible (por ejemplo, luciferasa, GUS, GFP) los cuales se pueden utilizar para análisis de expresión de promotores en plantas y tejidos vegetales también se contemplan. La literatura de gen de indicadores se revisa en Herrera-Estrella et al . , 1993, Nature 303, 209, and Schrott, 1995, En: Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, p .325-336.

Las siguientes son publicaciones representativas que describen protocolos de transformación genética que se pueden utilizar para transformar genéticamente las siguientes especies de plantas: arroz (Alam et al . , 1999, Plant Cell Rep. 18, 572); manzana (Yao et al., 1995, Plant Cell Report 14, 407-412); maíz (Patente US Nos. de Serie 5,177,010 y 5,981,840); trigo (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep.15, 1996, 877); tomate (patente US No. de Serie 5,159,135), papa (Kumar et al., 1996 Plant J.9,: 821); mandioca (Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736); lechuga (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep.6, 439); tabaco (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229); algodón (Patentes Nos. de Serie 5,846,797 y 5,004,863); pastos (patentes US Nos. 5,187,073 y 6,020,539); menta piperita (Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17,165); plantas cítricas (Pena et al., 1995, Plant Sci., 104,183); alcaravea (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39), plátano (patente US No. de Serie 5,792,935); soja (patentes US Nos. 5,416,011; 5,569,834; 5,824,877; 5,563,04455 y 5,968,830); piña (patente US No. de Serie 5,952,543); álamo (patente US No. de Serie 4,795,855); monocotiledóneas en general (patentes US Nos. 5,591,616 y 6,037,522); col (patentes US Nos. de Serie 5,188,958; 5,463,174 y 5,750,871); cereales (patente US No. de Serie 6,074,877); pera (Matsuda et al . , 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51); ciruela pasa (Ramesh et al . , 2006 Plant Cell Rep. 25(8):821-8; Song y Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006; 25(2):117-23; González Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep. 22(1):38-45); fresa (Oosumi et al . , 2006 Planta. 223(6):1219-30; Folta et al . , 2006 Planta Abril 14; PMID: 16614818), rosa (Li et al . , 2003), zarza (Graham et al . , 1995 Methods Mol Biol. 1995; 44:129-33) tomate (Dan et al . , 2006, Plant Cell Reports V25:432-441), manzana (Yhao et al . , 1995, Plant Cell Rep. 14, 407-412), cañóla ( Bassica napus L.).

(Cardoza y Stewart, 2006 Methods Mol Biol. 343:257-66), cártamo (Orlikowska et al . , 1995, Plant Cell Tissue and Organ Culture 40:85-91), ballico (Altpeter et al, 2004 Developments in Plant Breeding 11(7):255-250), arroz (Christou et al , 1991 Nature Biotech. 9:957-962), maíz (Wang et al . , 2009 In:Handbook of Maize pp. 609-639) y Actinidia eriantha (Wang et al., 2006, Plant Cell Rep. 25,5: 425-31).

La transformación de otras especies también se contempla por la invención. Los métodos y procedimientos adecuados están disponibles en la literatura científica.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación de la secuencia DGAT1 de la invención Varias secuencias de ácido nucleico y secuencias de polipéptidos para las DGAT tipo 1 vegetales se pueden encontrar por número de acceso en bibliotecas de dominio público (Tabla 1). Para crear alineaciones iniciales utilizamos el programa ClustaW (Thompson et al . , 1994, Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680); este fue editado manualmente y se utilizó para crear los modelos para la búsqueda de las secuencias DGAT, utilizando el paquete HMMER2 (HMMER 2.3.2 (Octubre de 2003) Marca registrada MR 1992-2003 HHMI/Washington University School of Medicine, disponible de la red mundial en http://hmmer.org). La coincidencia inicial de secuencias proteínicas contra ADN genómico con predicción de empalme se realiza con el paquete GeneWise (Birncy et al., 2004, Genome Res. 14: 988-995). Algunas de las secuencias recuperadas parecen tener errores; en particular sitios de empalme predichos incorrectamente los cuales podrían resultar en supresiones internas que probablemente resulten en proteínas no funcionales. Aunque ambas DGAT tipo 1, de dicotiledóneas y monocotiledóneas tienen 16 exones, existen ciertas diferencias en la posición del empalme. El exón 8 en el gen para DGAT1 de dicotiledóneas corresponde a los exones 8 y 9 en el gen para DGAT1 de monocotiledóneas mientras que el exón 14 en el gen de monocotiledóneas corresponde a los exones 13 y 14 en el gen de las dicotiledóneas. Hemos encontrado que el método más preciso para determinar la probabilidad de secuencia codificante genuina a partir de datos genómicos ha sido utilizar el programa Vector NTI Advance MR 11.0 (e 2008 Invitrogen Corporation) para traducir el genoma y los tres marcos de lectura abiertos y alinear estos con las DGAT1 funcionales demostradas a partir de especies dicotiledóneas y monocotiledóneas según sea apropiado (por ejemplo, ADNc de A. thaliana cDNA NM_127503, proteína NP_179353 y ADNc de Z. mays EU03980, proteína ABV91586). La secuencia genómica y las posiciones límites de exón/intrón correspondientes para Arabidopsis thaliana que codifica para NP_179535 y Zea mays que codifica para ABV91586 que se pueden utilizar como una plantilla para determinar otras regiones codificantes de DGAT vegetal se muestran en la figura 1 y en la figura 2, respectivamente.

Utilizando este método, los solicitantes han ensamblado/identificado una secuencia DGAT1 novedosa a partir de DGAT1 de Z mays (SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 39 [figura 3]). Hasta el mejor conocimiento de los solicitantes, una porción funcional de la secuencia no está presente en ninguna base de datos de ADNc pública, lo cual puede indicar que la proteína funcional no se expresa en plantas como se encuentran de manera natural.

Los solicitantes designaron esta secuencia como DGAT-larga de Zea mays (ZmDGATl-L o Zm-L DGAT1) debido a que los polipéptidos codificados son más grandes que Zea mays conocido de la SEC ID NO: 44, a la que se hace referencia como Zea mays DGAT1-corta o ZmDGATl-S o Zm-S DGAT1), como se indica en la figura 4.

Una relación similar existe entre DGAT1 corta de Oryza sativa o OsDGATl-S u Os-S DGAT1 (SEC ID NO: 41, y Oryza sativa DGATl-larga, u OsDGATl-L u Os-L DGAT1 (SEC ID NO: 42).

TABLA 1 Ejemplo 2 La secuencia de DGAT1 de la invención tiene actividad sorprendentemente alta cuando se expresa el contenido de lípido celular, y los fragmentos de la secuencia DGAT1 de la invención son útiles en conferir actividad alimentada a otras proteínas DGAT1.

Sumario Los solicitantes compararon la actividad de la secuencia de DGAT1 de la invención con otras secuencias DGAT1 conocidas. Sorprendentemente, la secuencia DGAT1 de la invención muestra una mayor actividad, en incremento en el contenido de lípido celular, en comparación con cualquier otra de las secuencias DGAT1 probadas.

Además, los solicitantes han demostrado que los fragmentos de la proteína DGAT1 de la invención son útiles en conferir incremento de actividad sobre por lo menos parte de otras proteínas DGAT1.

Materiales y metodos Las construcciones de ácido nucleico codifican las secuencias de aminoácidos, SEC ID NO: 30 (DGAT1 de A. thaliana) , 34 (DGAT1 de T. majus) , 39 (DGAT1-L de Zea mays ) , 41 (DGAT1-S de 0. sativa) , 42 DGAT1 -L de O. sativa) y 44 (tabla 1) se optimizan para expresión en Saccharomyces cerevisiae por GeneArt AG (Alemania). Estos son manipulados a un sitio Xhol interno con el exón 1 que codifica la acil-Co N-terminal conservada con la región de unión (identificada por Lung y Weselake, 2006, Lipids. Diciembre 2006;41(12):1073-88) sin alterar la secuencia de aminoácidos leucina-serina-serina (LSS). La figura 4 muestra la alineación de diversas secuencias DGAT1 a partir de plantas. El rectángulo a la izquierda muestra la posición del sitio de unión de acil-CoA.

Un sitio BcoRI se manipula hacia el extremo 51 de la secuencia codificante 5' mientras que un sitio Xhal se coloca hacia el extremo 31 del codón de detención 3'.

Los sitios internos Xhol y flanqueante EcoRI y Xhal se utilizan para generar quimeras entre la secuencia DGAT1 de la invención y cada uno de otros clones DGAT1; esencialmente esto fusiona la región citoplásmica reputada N-terminal (en base en Lung y Weselake, 2006. Lipids. Diciembre 2006/41(12):1073-88) y McFie et al . , 2010, JBC., 285:37377-37387) a partir de una DGAT1 con la región luminal ER C-terminal de una DGAT1 diferente. En algunas combinaciones esto resulta en un cambio de aminoácidos en la región citoplásmica remanente hacia la parte 3' del sitio Xhol manipulado. La región de unión acil-Co putativa de DGAT1 de A. thaliana, DGAT1 de T. majus, DGAT1 de Z-mays-L y DGAT1 de O. sativa-L tienen una secuencia de aminoácidos idéntica hacia el extremo 3' del sitio Xhol (LSSDAIFKQSHA). Aunque en DGAT1 de Z. mays-S y DGAT1 de O. sativa-S en residuo lisina (K) está sustituido por un residuo arginina (R) (LSSDAIFRQSHA). Puesto que la posición de este residuo se localiza 3' respecto al sitio Xhol codificado por LLS, entonces las quimeras que se derivan de un precursor que contiene la lisina y un precursor que contiene el residuo arginina resultarán de manera efectiva en una sustitución de este residuo. Esto se considera que es una disrupción mínima puesto que ambos, lisina y arginina son aminoácidos básicos, hidrofílíeos, cargados positivamente grandes que contienen un grupo amina o guanidinio libre, respectivamente en el extremo de una cadena lateral alifática (figura 5).

Las construcciones con intercambio del dominio de la región N-terminal/región C-terminal y las construcciones de origen (resaltadas en negrillas) se muestran en la tabla 2, con sus SEC ID NOS: correspondientes.

TABLA 2 Las secuencias se sintetizan ya sea por GENEART AG (Alemania) o GeneScript (Estados Unidos). Las secuencias se optimizan para expresión en Saccharomyces cerevisiae y se flanquean con los sitios de restricción apropiados incorporados para facilitar la clonación en el vector pYES2.1 (Invitrogen).

Expresión de la construcción en S. cerevisiae Las construcciones DGAT1 originales y las construcciones DGAT1 quiméricas se colocan en el vector de expresión de levadura inducible por galactosa pYES2.1/V5-His TOPOMR (Invitrogen). Esto resulta en la adición de un epítopo V5 C-terminal en marco y una etiqueta de histidina 6x. Las construcciones quiméricas y el número de sus secuencias polipeptídicas correspondientes se muestran en la Tabla 2 anterior.

El mutante cuádruple de Saccharomyces cerevisiae (H1246) en el cual la totalidad de los cuatro genes para la biosíntesis de lípido neutro se han interrumpido (Sandager et al . , . 2002, The Journal of Biological Chemistry, 277:6478-6482) se transforman según Elble (1992, BioTechniques 13, 18-20) y se seleccionan por la capacidad para crecer en ausencia de uracilo. Habitualmente, las células de levadura se hacen crecer aeróbicamente durante la noche en un medio sintético con YNB 0.67% sin uracilo (SC-U) y que contiene glucosa 2%. Las células del cultivo durante la noche se utilizan para inocular 200 mi de medio inducción (SC-U que contiene galactosa 2% y rafinosa 1%) a una D06oo de 0.4. Se permite que las células crezcan adicionalmente a 30°C, con agitación a 200 rpm hasta la fase estacionaria tardía, normalmente 48 h. Las células se cosechan por centrifugación a 1500 x g durante 5 min y después los sedimentos celulares se lavan con agua destilada y ya sea que se utilicen de inmediato para análisis subsecuente o que se mantengan a -80 “C hasta que se requiera. Los sedimentos de células para extracción de lípidos neutros se liofilizan durante 48 h y se almacenan en un congelador a -20°C hasta que se requieren.

Análisis de lípido de S. cerevisiae Aproximadamente 10 mg de material de células de levadura liofilizado se pesa con precisión cuando se rompe utilizando esferas de vidrio al someter a remolino durante 1 minuto. Este lisado se extrae en HCl metanólico caliente para análisis de éster metílico de ácido graso (FAME) (Browse et al . , 1986, Anal. Biochem.152, 141-145).

Para el análisis de perfil de FA aproximadamente 50 mg de levadura liofilizada se colocan en un tubo con tapa roscada de 13 mm y un volumen igual de esferas de vidrio se agregan antes de someter a remolino a alta velocidad en descargas de 1 min, 3 x. Después de la adición de 50 mg de un estándar interno de TAG 19:0, se agregan 2.4 mi de NaCl 0.17 M en MeOH y la mezcla se somete a remolino durante 15 seg seguido por la adición después de 4.8 mi de heptano y todo el contenido se mezcla.

La solución después se incuba en baño María 80 “C durante 2 h sin agitación. Después de incubación, la solución se enfría a temperatura ambiente. Después de enfriar, la fase superior (fase lipídica) se transfiere a un tubo con tapa roscada nuevo y se evapora a sequedad bajo una corriente de nitrógeno gaseoso. El residuo seco después se disuelve en 1 mi de heptano y se mezcla perfectamente para separación de SPE TAG utilizando una columna de sílice Strata Si-1 (Phenomen wx, 8B-S012-EAK).

Después de preacondicionamiento con metanol y equilibrio, la columna de sílice con heptanos y 1 mi de extracto TAG (que incluye 50 mg del estándar interno de TAG 17:0 que se hace pasar a través de una columna preequilibrada, seguido por 1.2 mi de heptano y después por 2 mi de cloroformo:heptano (1:9 v/v/) y el eluato se recolecta. El eluato total recolectado se evapora a sequedad bajo una corriente de N gaseoso y el residuo se utiliza para extracción de FAME.

FAME de TAG extraído Al residuo de TAG anterior se agregan 10 ml del estándar interno 15:0 FA (4 mg/ml disueltos en heptano) y 1 mi de HCl metanólico (1N) de reactivo que contiene 5% de 2,2-dimeetoxipropano (como eliminador de agua).

El tubo después se purga con N gaseoso, después se sella de inmediato con una tapa revestido con Teflon y se calienta a 80°C en baño María durante 1 h. Después de enfriar, se agregan 0.6 mi de heptano y 1.0 mi de NaCl 0.9% (p/v), la mezcla se somete a remolino a 500 rpm durante 1 min.

Para la capa de heptano superior se recolectan 100 ml y se transfieren a un inserto de vidrio con fondo plano acoplado al frasco para análisis de GC/EM FAMES. Extracción de proteína y digestión con tripsina Los sedimentos de células de levadura se lavan con amortiguador de lisis (fosfato de sodio 50 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM, glicerol 5%, PMSF 1 mM), después se resuspende en 500 ml de amortiguador de lisis, se agregan esferas de vidrio y se rompen las células al someter a remolino 2 x a velocidad media durante 30 segundos. El residuo celular se sedimenta por centrifugación a 1000 x g durante 5 min, el sobrenadante se transfiere a tubos frescos y las membranas celulares totales se sedimentan por ultracentrifugación a 100,000 x g durante 1 h. Las proteínas de la membrana se resuspenden en amortiguador de lisis con o sin detergente (dodecil maltósido 1%) y se cuantifica en un fluorómetro Qubit utilizando el equipo de cuantificación Qubit IT.

Se agrega tripsina para proporcionar una concentración final de 25 mg/ml a 50 m? de extracto de proteína y la mezcla se incuba a 30°C durante 30 min. La reacción se finaliza por adición de inhibidor de tripsina de Glycine max (Sigma-Aldrich, catálogo #T6414) a una concentración final de 0.4 mg/ml. Después de la adición del inhibidor de tripsina, se agregan 4x de tinte de cargado SDS y lOx de agente reductor (Invitrogen) y la proteína se incuba a 70°C durante 10 min antes de SDS-PAGE posterior seguido de inmunotransferencia. La mancha se sondea ya sea con anticuerpo anti V5-HRP (Cat #R96125, Invitrogen) a una dilución 1:2500 o con anticuerpo anti Kar2 (y-115) producido en conejo (SC-33630, Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:200. Se utiliza anti Kar2 para detectar la proteína de levadura Kar2, una proteína localizada en el lumen del ER (Rose et al . , 1989, Cell 57, 1211-1221) la cual sirve como un control para demostrar la presencia de microsomas intactos. Expresión de DAGT1 quimérica en Brassica napus Se utiliza la misma estrategia a lo descrito antes para generar una diversidad de construcciones quiméricas de DAGT1 para expresión en las semillas de Brassica napus. Esto incluye las DAGT1 originales de DGAT1 de T. majus, DGAT1 de Z. mays-L y DAGT1 de Z. mays-S (los aminoácidos de las SEC ID NOs: 34, 39 y 44 respectivamente, Tabla 1) optimizado para expresión en Brassica napus por GeneArt AG. La construcción de T. majus se manipula para contener una mutación puntual única S197A (Xu et al . , 2008, Plant Biotechnology Journal, 6:799-818). Todas las construcciones se manipulan para tener un intrón UBQ10 de Arabidopsis thaliana Kozak, y un codón de detención tetranucleotídico como en Scott et al., (2010, Plant Biotechnology Journal, 8:912-917) como se indica en la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3 El mismo patrón de digestión utilizado para generar las quimeras para la expresión en S. cerevisiae (Ejemplo 2) se utilizaron en las construcciones optimizadas para B . napus para generar las quimeras Tm-ZmL y ZmL-Tm (S189A); lo que resulta en las secuencias de péptidos que se enumeran en la tabla 4.

TABLA 4 Las DAGT originales y sus quimeras se transfieren en un vector binario compatible con GatewayMR, pMD107 (cortesía del Dr Mark Smith, NRC Saskatoon, SK, Cañada, S7N 0W9) el cual los coloca bajo el control del promotor napina específico para semilla (Ellerstróm et al . , 1996, Plant Molecular Biology, Volume 32, Issue 6, pp 1019-1027). Transformación vegetal Se transforma B. napus (cv. DH12075) por medio de Agrobacteriu tumefaciens (GV3101) utilizando el método de cocultivo de cotiledones (adaptado del de Maloncy et al . , 1989, Plant Cell Re . 8, 238-242). Las líneas de control contienen un vector vacío y, cuando se identifica, las líneas mellizas nulas subsecuentemente se utilizan como controles verdaderos.

Se producen aproximadamente 200 To líneas transformadas y sus semillas autopolinizadas Ti correspondientes se analizan para contenido de aceite por CG. Aproximadamente 50 líneas transgénicas individuales (que incluyen líneas de control) se seleccionan para la siguiente generación (10 plantas/línea) en base en su contenido de aceite o peso de semilla (8 líneas).

Se hacen crecer un total de aproximadamente plantas Ti y se criban por PCR para número de copias e identificación de líneas mellizas nulas. Las semillas T2 se analizan por triplicado para contenido de aceite por RMN.

Expresión de DGAT1 de Z. mays-L y T. majus en Camelina sativa La estrategia anterior también se puede utilizar para generar una diversidad de contrucciones de DGAT1 quiméricas para expresión en las semillas de Camelina sativa y otras plantas.

Las secuencias con modificaciones se sintetizan por GENEART AG (Alemania) o GeneScript (Estados Unidos) .

Las secuencias con modificaciones se sintetizan ya sea por GENEART AG (Alemania) o GeneScript (Estados Unidos) .

Las secuencias se optimizan para expresión en Brassica species e incluyen un intrón (SEC ID NO: 102) de DGAT1 -intrón 3 de Arabidopsis thaliana. Cada secuencia se flanquea con sitios de recombinación attL apropiados, sitios para permitir la clonación de vectores adaptados para GatewayMR.

TABLA 5 DAGT1 DGAT1 Modificación C-terminal Información Tipo de SEC ID N-terminal C-terminal de residuo mod adicional secuencia NO: original original T. majus T. majus S197A Etiqueta + intrón NUCLEICO 103 V5-His T. majus T. majus S197A Etiqueta ORF NUCLEICO 104 V5-His únicamente T. majus T. majus S197A Etiqueta PÉPTIDO 105 V5-His 2. mays-L Z. mays-L Ninguno Etiqueta + intrón NUCLEICO 106 V5-His Z. mays-L Z. mays-L Ninguno Etiqueta ORF NUCLEICO 107 V5-His únicamente Z. mays-L Z. mays-L Ninguno Etiqueta PÉPTIDO 108 V5-His T. majus Z. mays-L Ninguno Etiqueta + intrón NUCLEICO 109 V5-His T. majus Z. mays-L Ninguno Etiqueta ORF NUCLEICO 110 V5-His únicamente T. majus Z. mays-L Ninguno Etiqueta PEPTIDO 111 V5-His Z. mays-L T. majus S189A Etiqueta + intrón NUCLEICO 112 V5-His Z. mays-L T. majus S189A Etiqueta ORF NUCLEICO 113 V5-His únicamente Z. mays-L T. majus S189A Etiqueta PEPTIDO 114 V5-His Las DGAT originales y sus formas modificadas se transfieren en pRShl binario compatible con GatewayMR, vector binario adaptado de Gateway (Winichayakul et al., 2009, Biotechnol. Appl . Biochem. 53, 111-122) modificado por sustitución del promotor CaMV35S sustituido con el promotor Napina de Brasslca napus (SEC ID NO: 115).

Transformación de Carne lina sativa Se transforma C. sativa (cf. Caleña) por medio de Agrobacterium tumefaciens (GV3101) utilizando el método de inmersión floral (adaptado de Clough y Bent, 1998, Plant J. 16(6):735-745). Esencialmente, las semillas se siembran en mezcla de macetas en macetas de 10 cm, en un ambiente controlado, aproximadamente 6 semanas después de la plantación las flores se sumergen durante 5 a 14 minutos bajo vacío (178 cm-203 cm Hg (70-80 pulgadas Hg)) en un cultivo durante la noche de células Agrobacterium GV3101 apropiadas resuspendidas en amortiguador de inmersión floral. Después de transformación al vacío, las plantas se mantienen durante 24 h bajo condiciones de poca luz al cubrirlas parcialmente con un lienzo de plástico negro. Las transformaciones al vacío se repiten tres veces a intervalos de aproximadamente 10 a 12 días, que corresponden a la duración de floración. Las plantas se hacen crecer en una mezcla para macetas en un ambiente controlado (16 h de duración del día, 21 a 24°C, 65 a 70% de humedad relativa).

Las semillas Ti producidas se pueden recolectar y cribar para transformantes al hacerlas germinal y al hacer crecer las plántulas a 22°C con iluminación continua en un medio EM de fuerza media (pH 5.6) en una placa de selección que contiene sacarosa 1% (p/v), 300 mg/1 de Timentin y 25 mg/1 de de DL-fosfinotricina para seleccionar la resistencia a herbicida. La población de semillas autopolinizadas T2 también se pueden cribar por inmunotransferencia para determinar la presencia del epítopo V5.

Las semillas autopolinizadas T2 se pueden analizar para contenido de aceite por CG. Aproximadamente 50 líneas transgénicas individuales (que incluyen líneas control) se pueden seleccionar para la siguiente generación (10 plantas/línea) en base en su contenido de aceite, o peso de semilla. Las plantas T2 se pueden hacer crecer y cribar por PCR para número de copias e identificación de líneas de mellizas nulas. Las semillas T2 se pueden analizar por triplicado para contenido de aceite por RMN o CG/EM.

Resultados Adición de fragmentos del polipeptido DGAT1 de la invención a otras secuencias de DGAT1 incrementan la producción de lípidos en Saccharomyces cerevisíae en relación a aquella con otras secuencias DGAT1 solas Las tablas 8 a 14 muestran los rendimientos de lípidos de una diversidad de DGAT1 quiméricas en las cuales la parte N-terminal o la región C-terminal ha sido derivada de la secuencia DGAT1 de la invención mientras que el resto de la proteína ha sido derivado de otra DGAT1 vegetal. Los rendimientos de lípidos se presentan ya sea como gramos de lípidos producidos por litro (lo cual por lo tanto compensa cualquier diferencia en la velocidad de crecimiento) o se ha normalizado como un porcentaje del rendimiento de lípidos de la DGAT1 original no modificada correspondiente.

Una comparación de las DGAT1 originales entre sí y con cada una de las DGAT1 quiméricas realizado utilizando un padre donador para la región N-terminal y un padre donador diferente para la región C-terminal se muestra en la tabla 5. Las secuencias de DGAT1 originales se resaltan en negrillas.

Sorprendentemente, la secuencia de DGAT1 de la invención muestra mayor actividad en la producción de rendimiento de lípido en comparación con cualquier otra de las secuencias probadas.

Los rendimientos de lípidos a las 32 h se ha normalizado contra el progenitor productor de lípido más grande (Z. mays-L) y se presentan en orden ascendente.

TABLA 6 Los resultados también muestran que la adición de la región N-terminal de Z. mays-L a la región ex termina! de DGAT1 original de A . thaliana resulta en un rendimiento de lípidos aumentado sobre la longitud completa de la secuencia de DGAT1 de A. thal iana (véase la SEC ID NO: 84 versus la SEC ID NO: 59).

Los resultados también muestran que la adición de la región N-terminal o C-terminal de la región C-terminal o N-terminal, respectivamente, T. majus de DGAT1 resulta en un rendimiento de lípidos aumentado sobre la longitud completa de la secuencia de DGAT1 de T. majus (véase la SEC ID NO: 88 y 94 versus la SEC ID NO: 89).

Los resultados también muestran que la adición de la región N-terminal o C-terminal de Z . mays-L a la región C-terminal o N-terminal, respectivamente, de la secuencia de DGAT1 original de O. sativa -S resulta en un rendimiento de lípidos incrementado con respecto a la secuencia DGAT1 de O. sativa-S de longitud completa (véase la SEC ID NO: 85 y 69 versus la SEC ID NO: 65).

Los resultados también muestran que la adición de la región N-terminal o C-terminal de Z . mays-L a la región C-terminal o N-terminal, respectivamente, de la secuencia DGAT1 0. sativa-L resulta en un rendimiento de lípidos aumentado con respecto a 0. sativa-L de longitud completa (véase la SEC ID NO: 86 y 75 versus la SEC ID NO: 71).

Los resultados también muestran que la adición de la región N-terminal o C-terminal de Z. mays-L a la región C-terminal o N-terminal, respectivamente, de la secuencia Z. mays-S resulta en un rendimiento de lípidos aumentado con respecto a la secuencia de C. mays-S de longitud completa (véase la SEC ID NO: 87 y 81 versus la SEC ID NO: 77).

En resumen, la adición de fragmentos (ya sea la región N-terminal o la región C-terminal) del polipéptido de Z. mays-L de la invención a otra secuencia DGAT1 puede incrementar el rendimiento de lípido celular asequible por la secuencia combinada con respecto a la de otra secuencia DGAT1.

Adición de fragmentos del polipéptido DGAT1 de la invención a otras secuencias de DGAT1 incrementa la producción de lípidos en Brassica napus en relación a aquella con otras secuencias de DGAT1 solas Los fragmentos (región N-terminal o región C-terminal) del polipéptido de Z. mays-L de la invención también se puede combinar con fragmentos de otras DGAT1 vegetales para incrementar el contenido de aceite en semillas de Brassica napus . Las tablas 21 a 22 muestran los contenidos de aceite de semilla de una diversidad de plantas transgénicas que expresan las DGAT1 quiméricas. En la tabla 6 los contenidos de aceite de las semillas se presentan como % de materia seca (DM, por sus siglas en inglés) así como un porcentaje normalizado del contenido de aceite de semilla de los progenitores DGAT1 no modificados correspondientes.

TABLA 7 En la tabla 7, los contenidos de aceite se presentan tanto en una base de % de DM como un porcentaje normalizado del contenido de aceite de semilla de un mellizo nulo segregante correspondiente.

TABLA 8 Juntos, estos resultados muestran que la adición de fragmentos (N-terminal a C-terminal) del polipéptido DGAT1-L de Z . mays de la invención se puede agregar a partes de la secuencia DGAT1 de T. maj us para incrementar el rendimiento de aceite en relación al producido por DGAT1 de T. maj us de longitud completa. Di scusión Los solicitantes de esta manera han demostrado que la proteína de DGAT1-L de Z . mays novedosa de la invención se puede utilizar para manipular la acumulación de lípido celular. La DGAT1 de la invención también tiene una actividad mayor en incrementar el contenido de lípido celular en comparación con cualquier otra proteína DGAT1 probada por los solicitantes. Los solicitantes también han demostrado que las subsecuencias o fragmentos de la DGAT1 de la invención se pueden combinar con partes de otra DGAT1 para incrementar la actividad sobre la mostrada sobre las secuencias DGAT1.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica para un polipéptido DGAT1 que comprende por lo menos uno de: a) una secuencia con por lo menos 95% de identidad con la secuencia de la SEC ID NO: 39, b) la secuencia de la SEC ID NO: 39, c) una secuencia que comprende por lo menos 450 aminoácidos contiguos de la secuencia de los incisos a) o b).

2. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad de DGAT1.

3. El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el polipéptido DGAT1, cuando se expresa en la célula, tiene por lo menos uno de: a) una actividad DGAT1 mayor que por lo menos otra proteína DGAT1, y b) especificidad de sustrato alterada en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

4. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque por lo menos otra proteína DGAT1 tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la SEC ID NO: 44 (ZmDGATl-corta).

5. El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polipéptido de DGAT1 tiene por lo menos uno de: a) actividad DGAT1 mayor en comparación con una proteína DGAT1 conocida previamente, y b) especificidad de sustrato alterada en relación a cualquier proteína DGAT1 conocida previamente.

6. Una construcción genética caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La construcción genética de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el polinucleótido está unido operablemente a un promotor.

8. La construcción genética de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido y el promotor no se encuentran enlazados operablemente en la naturaleza.

9. Una célula caracterizada porque comprende un polinucleótido de la invención de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. La célula d’e conformid’ad’ con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula o su predecesor, están transformados para comprender el polinucleótido.

11. Una célula caracterizada porque comprende una construcción genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

12. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque expresa el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. La célula de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque expresa el polipéptido DGAT1.

14. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada porque el polipéptido DGAT1 tiene actividad DGAT1 aumentada en comparación con uno o ambos de: a) por lo menos otra proteína DGAT1, y b) cualquier proteína DGAT1 conocida previamente.

15. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizada porque el polipéptido DGAT1 expresado tiene especificidad de sustrato alterada en relación a uno o ambos de: a) por lo menos otra proteína DGAT1, y b) cualquier proteína DGAT1 conocida previamente.

16. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizada porque produce más lípido en comparación con una célula control.

17. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizada porque tiene un perfil de lípido alterado en relación a una célula control.

18. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizada porque es una célula vegetal.

19. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, caracterizada porque también se transforma para expresar por lo menos uno de: una oleosina, estereoleosina, caloleosina. polioleosina y una oleosina que incluye por lo menos una cisteína introducida artificialmente.

20. Una planta, caracterizada porque comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

21. La planta de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la planta, o su predecesor, han sido transformados para comprender el polinucleótido.

22. Una planta, caracterizada porque comprende una construcción genética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

23. Una planta, caracterizada porque comprende una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 18.

24. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizada porque la planta o su predecesor, ha sido transformado o modificado genéticamente para expresar el polinucleótido o el polipéptido codificado.

25. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizada porque el polipéptido expresado, tiene actividad DGAT1 aumentada en relación a por lo menos otra proteína DGAT1.

26. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizada porque la planta produce más lípido, en por lo menos uno de sus tejidos o partes, o en su totalidad en comparación con una planta control.

27. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizada porque la planta tiene un perfil de lípido alterado, en por lo menos uno de sus tejidos o partes o en su totalidad, en relación a una planta control.

28. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizada porque la planta también se transforma para expresar por lo menos uno de: una oleosina, una estereoleosina, una caloleosina, una poliolesina y una oleosina que incluye por lo menos una cisteína introducida artificialmente.

29. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende por lo menos uno de: a) una secuencia con por lo menos 95% de identidad con la secuencia de la SEC ID NO: 39, b) la secuencia de la SEC ID NO: 39, c) una secuencia que comprende por lo menos 450 aminoácidos contiguos de la secuencia de los incisos a) o b).

30. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad de DGAT1.

31. Una parte, propágulo o descendencia de la planta caracterizada porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28.

32. Una parte, propágulo o descendencia de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la parte, propágulo o descendencia comprende por lo menos uno de un polinucleótido, construcción, célula o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y 29 a 30.

33. La parte, propágulo o descendencia de conformidad con la reivindicación 31 ó 32, caracterizada porque la parte, propágulo o descendencia, o su planta predecesora, ha sido transformada para comprender el polinucleótido o construcción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

34. La parte, propágulo o descendencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 33, caracterizada porque la parte, propágulo o descendencia expresa el polinucleótido o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 29 a 30.

35. La parte, propágulo o descendencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 34, caracterizada porque la parte, propágulo o descendencia, produce más lípido en comparación con una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

36. La parte, propágulo o descendencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 35, caracterizada porque la parte, propágulo o descendencia, tiene un perfil de lípido alterado en relación a una parte, propágulo o descendencia control o una parte, propágulo o descendencia de una planta control.

37. Una materia prima para animal, caracterizada porque comprende por lo menos uno de un polinucleótido, un polipéptido, construcción, célula, célula vegetal, planta, parte de una planta, propágulo y descendencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36.

38. Una materia prima de biocombustible caracterizada porque comprende por lo menos uno de un polinucleótido, polipéptido, construcción, célula, célula vegetal, planta, parte de una planta, propágulo y descendencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36.

39. Un método para producir un lípido, caracterizado porque comprende hacer crecer una célula, célula vegetal o planta que es transformada o modificada genéticamente para expresar un polinucleótido o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 29 a 30, en donde la planta produce aceite a través de la actividad del polipéptido expresado.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula, célula vegetal o planta produce el lípido como un resultado de la actividad de DGAT1 del polipéptido.

41. Un método para producir lípido, caracterizado porque comprende extraer lípido de por lo menos una de una célula, célula vegetal, planta, parte de una planta, propágulo y descendencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 36.

42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque el lípido es triacilglicerol (TAG).

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39, 70 (SIC) y 42, caracterizado porque el lípido es procesado en por lo menos uno de: a) un combustible, b) una sustancia oleoquímica, c) un aceite nutricional, d) un aceite cosmético, e) un ácido graso poliinsaturado (PUFA), f) una combinación de cualquiera de los incisos a) a e).