MX2015004792A - Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas. - Google Patents

Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas.

Info

Publication number
MX2015004792A
MX2015004792A MX2015004792A MX2015004792A MX2015004792A MX 2015004792 A MX2015004792 A MX 2015004792A MX 2015004792 A MX2015004792 A MX 2015004792A MX 2015004792 A MX2015004792 A MX 2015004792A MX 2015004792 A MX2015004792 A MX 2015004792A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
virus
plant
composition
polynucleotide
tospovirus
Prior art date
Application number
MX2015004792A
Other languages
English (en)
Other versions
MX360305B (es
Inventor
Johannes C Hemmes
Lijie Jia
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology Llc filed Critical Monsanto Technology Llc
Publication of MX2015004792A publication Critical patent/MX2015004792A/es
Publication of MX360305B publication Critical patent/MX360305B/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/60—Isolated nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/30—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests characterised by the surfactants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/175—Bunyaviridae, e.g. California encephalitis virus, Rift valley fever virus, Hantaan virus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona métodos para el tratamiento tópico y prevención de la enfermedad por Tospovirus y/o Geminivirus en plantas; la invención proporciona además composiciones para el tratamiento de la enfermedad por Tospovirus y/o Geminivirus en las plantas, y métodos para reducir la expresión de un gen del Tospovirus y/o Geminivirus y para identificar polinucleótidos útiles para modular la expresión genética en los virus de las plantas.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA CONTROLAR LA INFECCIÓN VIRAL EN PLANTAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisoria de los Estados Unidos de América No. 61/714,733, presentada el 16 de octubre, 2012 y de la Solicitud de Patente Provisoria de los Estados Unidos de América No. 61/786,032, presentada el 14 de marzo, 2013, las cuales son incorporadas a la presente como referencia en su totalidad.
INCORPORACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias que está contenido en el archivo llamado "MONS317WOsequencelisting.txt", el cual tiene un tamaño de 251 kilobytes medido en el sistema operativo Microsoft Windows y se creó el 11 de octubre de 2013, se presenta electrónicamente de manera adjunta y se incorpora en la presente como referencia.
CAMPO DELAINVENCIÓN Los métodos y composiciones generalmente se refieren al campo del control de enfermedades en plantas. Más específicamente, la invención se refiere a métodos y composiciones para tratar o prevenir los síntomas asociados con la infección de Tospovirus o Geminivirus en las plantas.
ANTECEDENTESDELAINVENCION Los virus de las plantas de los géneros Tospovirus y Geminivirus son importantes desde ei punto de vista económico, y causan una producción vegetativa reducida y la muerta de las plantas infectadas. Los cultivadores que buscan proteger sus cultivos de los tospovirus han intentado tradicionalmente proteger a sus cultivos de los vectores de insectos, ya sea con la aplicación de insecticidas, o con acolchados reflectivos o cubiertas de plástico. Debido a que estas estrategias han tenido un éxito limitado, y son costosas e insumen mucho tiempo, se necesitan estrategias alternativas para el control de la infección por Tospovirus y Geminivirus.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Las modalidades descritas en esta invención se refieren a métodos y composiciones para la prevención o tratamiento de la infección viral en una planta que comprende la administración tópica a una planta de un polinucleótido que comprende por lo menos 18 nucieótidos contiguos que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a un gen viral. El polinucleótido puede ser ADN de una sola hebra (ssADN, por sus siglas en inglés), ADN de doble hebra (dsADN, por sus siglas en inglés), ARN de una sola hebra (ssARN, por sus siglas en inglés), o ARN de doble hebra (dsARN, por sus siglas en inglés).
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento o prevención de una infección por Tospovirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia, donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En algunas modalidades, el polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido comprende por lo menos 18 nucieótidos contiguos que son esencialmente complementarios a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En una modalidad, el agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o compuesto contenido en la misma. En otra modalidad, la composición comprende más de un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética de Tospovirus esencial, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética de Tospovirus esencial, o su fragmento. En otra modalidad, el polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-12 o su fragmento. En otra modalidad, el Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en virus mosaico necrótico de la haba, virus de la clorosis del pimiento, virus de la necrosis del brote del maní, virus de las manchas en anillo del maní, virus de las manchas amarillas del maní, virus de las manchas necróticas del impatiens, virus de las manchas amarillas en la cebolla, virus de las manchas amarillas del melón, virus de necrosis del brote del maní, virus de las manchas amarillas del maní, virus asociado a la necrosis venosa de la soja, virus de las manchas cloróticas del tomate, virus de las manchas en anillos necróticas del tomate, virus de la marchitez manchada del tomate, virus de mancha zonada del tomate, virus de la necrosis del brote de la sandía, virus de las manchas plateadas de la sandía, y virus de la clorosis letal del calabacín. En otra modalidad, el gen esencial del Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en gen de nucleocápside (N), gen de proteína de cubierta (CP, por sus siglas en inglés), factores de virulencia NSm y NSs, y segmento L de la polimerasa de ARN dependiente de ARN (segmento RdRp/L). En otra modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En otra modalidad, la composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo o se aplica a la superficie de la planta como ADN encapsulado en matriz.
En otro aspecto, la Invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia, donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En algunas modalidades, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46, o el agente de transferencia es una composición de organosilicona, o el polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-12.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir la expresión de un gen esencial del Tospovirus que comprende poner en contacto una partícula de Tospovirus con una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia, donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentldo es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Tospovirus o un transcripto de ARN del mismo, donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En otra modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona. En otra modalidad, el polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-12 o su fragmento.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar polinucleótidos de ADN de una sola hebra antisentido útil para modular la expresión del gen del Tospovirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de ADN de una sola hebra antisentido que comprenden una región complementaria a todo o parte de un gen esencial del Tospovirus o su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos polinucleótidos de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Tospovirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ADN de una sola hebra antlsentldo capaz de modular los síntomas o la aparición de la Infección por Tospovirus. En una modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un pesticida, donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a su transcripto de ARN, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, el pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopestlcidas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una infección por Tospovirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, donde dicho ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente complementario a la totalidad o una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En algunas modalidades, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En una modalidad, el agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o un compuesto contenido en la misma. En otra modalidad, la composición comprende más de un ARN de doble hebra que comprende un polinucleótido que es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética de Tospovirus esencial, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética de Tospovirus esencial, o su fragmento. En otra modalidad, el polinucleótido de ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia nucleotídica según lo expuesto en SEQ ID NOs: 47-103, 448-483, o su fragmento. En algunas modalidades, el polinucleótido antisentido del dsARN (ARN de doble hebra) comprende un segmento protuberante (overhang) de dos (2) nucleótidos en el extremo 3' que es complementario al gen objetivo. En otra modalidad, el Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en virus mosaico necrótico de la haba, virus de la clorosis del pimiento, virus de la necrosis del brote del maní, virus de las manchas en anillo del maní, virus de las manchas amarillas del maní, virus de las manchas necróticas del impatiens, virus de las manchas amarillas en la cebolla, virus de las manchas amarillas del melón, virus de necrosis del brote del maní, virus de las manchas amarillas del maní, virus asociado a la necrosis venosa de la soja, virus de las manchas cloróticas del tomate, virus de las manchas en anillos necróticas del tomate, virus de la marchitez manchada del tomate, virus de mancha zonada del tomate, virus de la necrosis del brote de la sandía, virus de las manchas plateadas de la sandía, y virus de la clorosis letal del calabacín. En otra modalidad, el gen esencial del Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en gen de nucleocápside (N), gen de proteína de cubierta (CP), factores de virulencia NSm y NSs, y Segmento L de la polimerasa de ARN dependiente de ARN (segmento RdRp/L). En otra modalidad, el gen esencial del Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En otra modalidad, la composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo, o es aplicada a la superficie de la planta como ARN encapsulado en la matriz.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En otra modalidad, el agente de transferencia es una composición de organosilicona. En otra modalidad, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 47-103 y 448-483. En algunas modalidades, el polinucleótido antisentido del dsARN (ARN de doble hebra) comprende un segmento protuberante (overhang) de dos (2) nucleótidos en el extremo 3' que es complementario al gen objetivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir la expresión de un gen esencial del Tospovirus que comprende poner en contacto una partícula de Tospovirus con una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, donde dicho ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Tospovirus o un transcripto de ARN del mismo, donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46. En otra modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona. En otra modalidad, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia nucleotfdica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 47-103, 448-483, o su fragmento. En algunas modalidades, el polinucleótido antisentido del dsARN (ARN de doble hebra) comprende un segmento protuberante (overhang) de dos (2) nucleótidos en el extremo 3' que es complementario al gen objetivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un polinucleótido de ARN de doble hebra útil para modular la expresión del gen del Tospovirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de ARN de doble hebra que comprenden una región complementaria a todo o parte de un gen esencial del Tospovirus o su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos polinucleótidos de ARN de doble hebra y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Tospovirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ARN de doble hebra capaz de modular los síntomas o la aparición de la infección por Tospovirus. En una modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona. En algunas modalidades, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ARN de doble hebra y un pesticida, donde dicho ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a su transcripto de ARN, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, el pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopesticidas.
En aun otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una infección por Geminivirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, donde dicho ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Gemlnlvlrus, o a su transcripto de ARN, donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, el agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o compuesto contenido en la misma. En otra modalidad, la composición comprende más de un ARN de doble hebra que comprende un pollnucleótldo que es esencialmente complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética esencial del Geminivirus, o su fragmento. En otra modalidad, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótldo que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-268 o su fragmento. En otra modalidad, el Geminivirus se selecciona del grupo que consiste en el virus del enanismo amarillo de la cebada, virus mosaico de las cucurbitáceas, virus mosaico del pepino, virus de la hoja enrollada del algodón, virus de la hoja enrollada amarilla del tomate, virus mosaico dorado del tomate, virus mosaico amarillo de la papa, virus de la hoja enrollada del pimiento, virus mosaico dorado del poroto, virus mosaico dorado del poroto, virus del moteado del pimiento. En aun otro aspecto, el gen esencial del Geminivirus se selecciona del grupo que consiste en gen de nucleocápside (N), un gen de la proteína de cubierta (CP), factores de virulencia NSm y NSs, y segmento L de la polimerasa de ARN dependiente de ARN (segmento RdRp/L), un gen supresor del silenciamiento, proteína de movimiento (MP), Nia, CP-N, un bloque de genes triple, CP-P3, MP-P4, C2, y AC2. En otra modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En otra modalidad, la composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo, o es aplicada a la superficie de la planta como ARN encapsulado en la matriz.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótldo de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, donde dicho ARN de doble hebra comprende un polinucleótldo que es esencialmente complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus, tal como es expuesto en SEQ ID NOs: 104-268, 269-447, o su transcripto de ARN, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En otra modalidad, el agente de transferencia es una composición de organosilicona. En otra modalidad, el polinucleótldo de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104- En otro aspecto, un método para reducir la expresión de un gen esencial del Geminivirus que comprende poner en contacto una partícula del Gemlnivirus con una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, donde dicho ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Geminivirus o su transcripto de ARN, donde los síntomas de infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En otra modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona. En otra modalidad, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-268 o su fragmento.
En aun otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un polinucleótido de ARN de doble hebra útil para modular la expresión del gen del Geminivirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de ARN de doble hebra que comprende una región complementaria a la totalidad o una parte de un gen esencial del Geminivirus o su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos polinucleótidos de ARN de doble hebra y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Geminivirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ARN de doble hebra capaz de modular los síntomas o la aparición de la infección por Geminivirus. En una modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona. En algunas modalidades, el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En algunas modalidades, el Geminivirus es el Virus Mosaico de las Cucurbitáceas y el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-316. En algunas modalidades, el Geminivirus es el Virus mosaico del pepino y el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 317-349. En algunas modalidades, el Geminivirus es el Virus de la hoja enrollada amarilla del tomate y el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 386-421. En algunas modalidades, el Gemini virus es el Virus de la hoja enrollada del algodón y el ARN de doble hebra comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a por lo menos 18 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 422-441.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ARN de doble hebra y un pesticida, donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus o su transcripto de ARN, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, el pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopesticidas.
En un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una infección por Geminivirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia, donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus o su transcripto de ARN, donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En algunas modalidades, el polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos que son esencialmente complementarios a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-268. En algunas modalidades, el polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos que son esencialmente complementarios a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En una modalidad, el agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o un compuesto contenido en la misma. En otra modalidad, la composición comprende más de un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética esencial del Geminivirus, o su fragmento. En otra modalidad, el Geminivirus se selecciona del grupo que consiste en el virus del enanismo amarillo de la cebada, el virus mosaico de las cucurbitáceas, el virus mosaico del pepino, el virus de la hoja enrollada del algodón, el virus de la hoja enrollada amarilla del tomate, el virus mosaico dorado del tomate, el virus mosaico amarillo de la papa, el virus de la hoja enrollada del pimiento, el virus mosaico dorado del poroto, el virus mosaico dorado del poroto, y el virus del moteado del pimiento. En aun otro aspecto, el gen esencial del Geminivirus se selecciona del grupo que consiste en el gen de la nucleocápslde (N), un gen de la proteína de cubierta (CP), factores de virulencia NSm y NSs, y el segmento L de la pollmerasa de ARN dependiente de ARN (segmento RdRp/L), un gen supresor del silenciamiento, la proteína de movimiento (MP), Nia, CP-N, un bloque de genes triple, CP-P3, MP-P4, C2, y AC2. En otra modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En otra modalidad, la composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo, o es aplicada a la superficie de la planta como ARN encapsulado en la matriz.
En otro aspecto, la Invención proporciona una composición que comprende un pollnucleótido de ADN de una sola hebra antlsentldo y un agente de transferencia, donde dicho pollnucleótido de ADN de una sola hebra antisentldo es complementarlo a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus o su transcripto de ARN, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la Infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En algunas modalidades, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-447, o el agente de transferencia es una composición de organosilicona.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir la expresión de un gen esencial del Geminivirus que comprende poner en contacto una partícula del Geminivirus con una composición que comprende un pollnucleótido de ADN de una sola hebra antlsentido y un agente de transferencia, donde dicho pollnucleótido de ADN de una sola hebra antisentldo es complementarlo a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Geminivirus o en su transcripto de ARN, donde los síntomas de la Infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, la secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-447. En otra modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
En otro aspecto, la Invención proporciona un método para identificar polinucleótidos de ADN de una sola hebra antlsentldo útil para modular la expresión genética del Geminivirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de ADN de una sola hebra antisentido que comprende una región complementaria a la totalidad o una parte de un gen esencial del Geminivirus o su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos pollnucleótidos de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Geminivirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido capaz de modular los síntomas o la aparición de la infección por Geminivirus. En una modalidad, el agente de transferencia es un compuesto de organoslllcona. En algunas modalidades, el ADN de una sola hebra antisentido es esencialmente complementarlo a por lo menos 18 nudeótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447. En algunas modalidades, el Geminivirus es el virus mosaico de las cucurbitáceas y el ADN de una sola hebra antisentido es esencialmente complementarlo a por lo menos 18 nudeótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-316. En algunas modalidades, el Geminivirus es el virus mosaico del pepino y el ADN de una sola hebra antlsentido es esencialmente complementarlo a por lo menos 18 nudeótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 317-349. En algunas modalidades, el Geminivirus es el virus de la hoja enrollada amarilla del tomate y el ADN de una sola hebra antisentido es esencialmente complementario a por lo menos 18 nudeótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 386-421. En algunas modalidades, el Geminivirus es el virus de la hoja enrollada del algodón y el ADN de una sola hebra antisentido es esencialmente complementario a por lo menos 18 nudeótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 422-441.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un pesticida, donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus o a su transcripto de ARN, donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y donde los síntomas de la infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones. En una modalidad, el pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, Insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopesticidas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y son incluidas para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la función de las composiciones y métodos. La función puede ser mejor comprendida por referencia a una o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente. La función puede ser comprendida más completamente a partir de la siguiente descripción de las figuras: FIG. 1: Muestra un gráfico que ilustra los resultados del tratamiento tópico de plantas de lechuga ( SVR3606 L4) con oligonucleótidos (oligos) de ADN de una sola hebra (ss) antisentido. Se gráfico el tejido aéreo en peso fresco (en gramos) contra los tratamientos llevados a cabo a -1 Día de infección, 0 Día de Infección y +1 Día de Infección.
FIGS. 2A, 2B: Muestran el desarrollo de los síntomas en plantas de lechuga ( SVR3606 L4) 18 días después de la inoculación del virus. (FIG. 2A) Las plantas a la derecha fueron pulverizadas con oligos de ssADN antisentido a 136 kPa (20 psi, libra por pulgada cuadrada) usando un aerógrafo (airbrush) varias horas después de la inoculación del virus. A la izquierda se muestran las plantas control Inoculadas con el virus de las manchas necróticas del impatiens (INSV, por sus siglas en inglés) solamente. Las hojas fueron perforadas con una perforadora de agujeros para el análisis ELISA. (FIG. 2B) Gráfico que ilustra los resultados del puntaje visual para el desarrollo de los síntomas de INSV en plantas sin tratamiento previo o en plantas tratadas con ssADN antisentido.
FIG. 3: Muestra un gráfico de los resultados del análisis ELISA de los efectos del tratamiento tópico con ssADN antisentido sobre la reducción de la acumulación del virus en hojas de lechuga. La unidad de medición es la absorbancia proteica a densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) de 450 nm. Los círculos representan los puntos de información recogida de las plantas control (virus solamente, sin polinucleótido). Los triángulos representan puntos de información recogida de plantas tratadas con una mezcla de oligos de ssADN antisentido (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2).
FIGS. 4A a 4D: Las Figuras 4A, 4B, y 4D muestran gráficos que ilustran la densidad óptica (OD 450 nm) de extractos de plantas de lechuga en el día 5 (FIG. 4A), día 8 (FIG. 4B), y en el día 14 (FIG. 4D) luego del tratamiento con oligos de ssADN antisentido. (FIG. 4C) Muestra un gráfico que ilustra los resultados de la evaluación visual de las plantas en el día 13 después del tratamiento con oligos de ssADN antisentido.
FIGS. 5A a 5D: Muestran los resultados de los efectos del tratamiento tópico con oligos de ssADN antisentido en plantas de lechuga. Las Figuras 5A y 5B muestran los datos del ELISA de OD 450 nm a 5 y 14 días después del tratamiento, respectivamente. La Figura 5C muestra un gráfico del rendimiento efectivo medio del fotosistema II (PSII, por sus siglas en Inglés) determinado por un fluorímetro portátil de clorofila en el día 21 después del tratamiento con oligos de ssADN antisentido. La Figura 5D muestra un gráfico del tejido aéreo en peso fresco (en gramos) para plantas sin tratamiento previo o tratadas con ssADN antisentido en el día 21 después del tratamiento.
FIG. 6: Muestra un programa de plantación de ensayo de campo y una foto del día 60 en la cual las plantas de tomate y de pimiento fueron tratadas tópicamente con oligos de ssADN antisentido contra el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV, por sus siglas en inglés).
FIG. 7: Muestra las plantas de tomate sin tratamiento (con círculo) y las tratadas tópicamente con oligos de ssADN antisentido contra TSWV.
FIGS. 8A a 8D: Muestran gráficos de los resultados de los efectos del tratamiento de plantas de tomate con oligos de ssADN antisentido. Las Figuras 8A, 8B, y 8D muestran gráficos que ilustran los datos de ELISA de la OD 450 nm para plantas tratadas con buffer solamente o pulverizadas una o dos veces con oligonucleótidos de ssADN antisentido a 15 (FIG. 8A), 60 (FIG. 8B), y 78 (FIG. 8D) días pos-tratamiento. La Figura 8C muestra un gráfico que ilustra los resultados del puntaje visual de las plantas de tomate para los síntomas en el día 78 luego del tratamiento.
FIGS. 9A a 9D: Muestran gráficos de los resultados de los efectos del tratamiento de las plantas de pimiento con oligos de ssADN antisentido. Las Figuras 9A, 9B, y 9D muestran gráficos que ilustran los datos del ELISA de la OD 450 nm para las plantas de pimiento tratadas con buffer solamente o pulverizadas una o dos veces con oligonucleótidos de ssADN antisentido a 15 (FIG. 9A), 60 (FIG. 9B), y 78 (FIG. 9D) días pos-tratamiento. La Figura 9C muestra un gráfico que ilustra los resultados de la evaluación visual de las plantas de pimiento para los síntomas en el día 78 después del tratamiento.
FIG. 10: Muestra un gráfico de los efectos del tratamiento con oligos sobre la reducción de la acumulación del virus en hojas de pimiento. Se midió la OD 450 nm para evaluar la cantidad de virus presente. Los puntos representan puntos de datos recogidos de las plantas control (virus solamente, sin tratamiento con oligos). Los diamantes (SEQ ID NOs: 5-8) y los triángulos (SEQ ID NOs: 9-12) representan puntos de datos recolectados de muestras tratadas tópicamente con la solución de oligonucleótidos de ssADN antisentido. El lado izquierdo muestra los datos de hojas inoculadas, y el lado derecho muestra los datos de las hojas sistémicas, no infectadas, no tratadas con oligos.
FIGS. HA a 11D: Muestran gráficos de los resultados de los efectos del tratamiento con oligos en plantas de cebolla. La Figura HA muestra un gráfico que ilustra el diámetro del bulbo antes del tratamiento con oligonucleótidos tópicos. La Figura 11B muestra un gráfico que ilustra los diferentes diámetros de bulbo en 4 secciones diferentes del campo. La Figura 11C muestra un gráfico que ilustra el diámetro del bulbo después del tratamiento con buffer o con oligonucleótidos tópicos de ssADN antisentido. La Figura 11D muestra un gráfico que ilustra la medición de la OD 450 nm para plantas tratadas con buffer y con ssADN antisentido.
FIGS. 12A, 12B: La Figura 12A muestra un gráfico de la altura de las plantas para los diferentes tratamientos. T25748, T25753, T25755, T25763, T25769, T25770, T25773, T25776, y T25778 son disparadores de dsARN. La Figura 12B muestra un gráfico de la altura de las plantas para las plantas Sanas (no infectadas), Infectadas por virus pero no tratadas, Infectadas con virus y tratadas con buffer (Buffer), tratadas con disparador de dsARN T25748 infectadas con virus (T25748), y plantas tratadas con disparador dsARN T25773 (T25773) e infectadas con virus.
FIG. 13: Muestra un gráfico de la altura de las plantas para los diferentes tratamientos. T25748, T25755, T25763, T25769, T25770, T25772, T25775, y T25776 son disparadores de dsARN.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos útiles para el tratamiento o prevención de la infección viral en plantas. Los aspectos de los métodos y composiciones descritos en esta invención pueden ser aplicados para tratar o prevenir la infección viral en plantas en medioambientes de agronomía y otros medioambientes cultivados.
Diversas modalidades se refieren a métodos y composiciones para la prevención o el tratamiento de la infección porTospovirus en una planta que comprende la administración tópica de un polinucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a un gen Tospoviral. En algunas modalidades, el gen Tospoviral se selecciona del grupo que consiste en un gel de la nudeocápside (N), un gen supresor (NSs), un gen de movimiento (NSm), y un gen de la polimerasa de ARN dependiente de ARN (RdRp). En algunas modalidades, se proporcionan métodos y composiciones para la prevención o tratamiento de la infección por Tospovirus en una planta que comprende la administración tópica de ADN de una sola hebra (ss) en orientación antisentido (as) según lo expuesto en SEQ ID NOs: 1-12 (Cuadros 1-3). También se proporcionan métodos y composiciones para la prevención o tratamiento de la infección por Tospovirus en una planta que comprende la administración tópica de ARN de doble hebra (ds) que comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia nucleotídica según lo expuesto en SEQ ID NOs: 47-103 (Cuadro 5) o SEQ ID NOs: 448-483 (Cuadro 12). En algunas modalidades, el polinucleótido antisentido del dsARN (ARN de doble hebra) comprende un segmento protuberante (overhang) de dos (2) nucleótidos en el extremo 3' que es complementario al gen objetivo. En ciertas modalidades, los métodos y composiciones de la invención proporcionan la regulación, represión, o retardo y/o modulación de los síntomas o enfermedad causada por Tospovirus.
Diversas modalidades se refieren a métodos y composiciones para la prevención o tratamiento de la infección por Geminivirus en una planta que comprende la administración tópica de un polinucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos contiguos que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a un gen Geminiviral. En algunas modalidades, el gen Geminiviral se selecciona del grupo que consiste en un gen de la proteína de cubierta (CP), un gen supresor del silenciamiento, y un gen del movimiento. Se proporcionan además métodos y composiciones para la prevención o tratamiento de la infección por Geminivirus en una planta que comprende la administración tópica de dsARN que comprende un polinucleótido que es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia nucleotídica según lo expuesto en SEQ ID NOs: 104-268 (Cuadro 6). Los aspectos de los métodos y composiciones pueden ser aplicados para tratar enfermedades virales de las plantas en medioambiente agrónomos y otros medioambientes cultivados.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir polinudeótidos de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN y/o oligonucleótidos de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN diseñados para direccionarse a geries virales simples o múltiples, o múltiples segmentos de uno o más genes virales, tales como genes de un Tospovirus o de otra enfermedad de las plantas, incluyendo, aunque meramente a título ejemplificativo las secuencias genéticas virales expuestas en SEQ ID NOs: 1-46 (Cuadros 1-4). En otra modalidad, dichos polinudeótidos y oligonucleótidos pueden estar diseñados para dirigirse a genes virales simples o múltiples, o a múltiples segmentos de uno o más genes virales, tales como genes de un Geminivirus, incluyendo, entre otros, secuencias genéticas virales expuestas en SEQ ID NOs: 269-447 (Cuadros 7-11). En una modalidad, las composiciones de la presente invención pueden ser dirigidas a cualquier gen viral de cualquier virus de las plantas. El gen objetivo puede incluir múltiples segmentos consecutivos de un gen objetivo, múltiples segmentos no consecutivos de un gen objetivo, múltiples alelos de un gen objetivo, o múltiples genes objetivo de una o más especies de Tospovirus. En algunas modalidades, los polinudeótidos u oligonucleótidos son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a una secuencia nucleotídica de consenso.
Los polinudeótidos de la invención pueden ser complementarios a la totalidad o a una porción de una secuencia genética viral, incluyendo un promotor, intrón, secuencia codificante, exón, región no traducida en 5', y región no traducida en 3'. Las composiciones de la presente invención comprenden además un agente de transferencia que facilita la entrega del polinucleótido de la invención a una planta, y pueden incluir solventes, diluyentes, un pesticida que complementa la acción del polinucleótido, un herbicida o pesticidas adicionales o que proporciona una modalidad de acción adicional diferente del polinucleótido, diversas sales o agentes estabilizantes que aumentan la utilidad de la composición como una mezcla de los componentes de la composición.
En ciertos aspectos, los métodos de la invención pueden incluir una o más aplicaciones de una composición de polinudeótidos y una o más aplicaciones de un agente de transferencia para el acondicionamiento de una planta o virus de planta a la penetración por polinucleótidos o actividad o estabilidad de los polinucleótidos. Cuando el agente para el acondicionamiento a la penetración es una composición de organosilicona o compuesto contenido en la misma, las moléculas del polinucleótido pueden ser oligonucleótidos de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN; o polinucleótidos de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN, oligonucleótidos o polinucleótidos químicamente modificados, o sus mezclas.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para controlar la infección por Tospovirus o Geminivirus de una planta que incluye el tratamiento de la planta con por lo menos un primer ssADN antisentido complementario a todo el gen viral objetivo o a una porción del mismo, donde las moléculas polinucleotídicas son capaces de modular al gen objetivo y de controlar la infección por Tospovirus o Geminivirus. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para controlar la infección por Tospovirus o Geminivirus de una planta que incluye el tratamiento de la planta con por lo menos un primer dsADN antisentido complementario a todo un gen viral objetivo o a una porción del mismo, donde las moléculas polinucleotídicas son capaces de modular al gen objetivo y de controlar la infección por Tospovirus o Geminivirus. En otra modalidad, la invención proporciona un método para controlar la infección por Tospovirus o Geminivirus de una planta que incluye el tratamiento de la planta con por lo menos un primer dsARN complementario a todo un gen viral objetivo o a una porción del mismo, donde las moléculas polinucleotídicas son capaces de modular al gen objetivo y de controlar la infección por Tospovirus o Geminivirus.
En ciertas modalidades, se puede incluir un paso de acondicionamiento para aumentar la permeabilidad de una planta al polinucleótido. El acondicionamiento y la aplicación del polinucleótido pueden llevarse a cabo por separado o en un solo paso. Cuando el acondicionamiento y la aplicación del polinucleótido se llevan a cabo en pasos separados, el acondicionamiento puede preceder o puede ir después de la aplicación del polinucleótido dentro de minutos, horas o días. En algunas modalidades, puede llevarse a cabo más de un paso de acondicionamiento o más de una aplicación de moléculas de polinucleótido sobre la misma planta.
En modalidades específicas del método, un polinucleótido de la invención puede ser clonado o identificado de (a) partes codificantes (que codifican proteínas), (b) no codificantes (promotor y otras moléculas relacionados con genes), o (c) ambas partes codificante y no codificante del gen viral objetivo. Las partes no codificantes pueden incluir ADN, tales como las regiones promotoras o un ARN transcripto por el ADN que proporciona moléculas reguladoras del ARN, incluyendo aunque solo a título ejemplificativo: intrones, elementos de ARN reguladores de acción cis, regiones no traducidas en 5' o 3', y microARNs (miARN), siARNs de acción trans, siARNs antisentido naturales, y otros ARNs pequeños con función reguladora o ARNs que tiene función estructural o enzimática que incluyen entre otros: ribozimas, ARNs rlbosómicos, t-ARNs, aptámeros, y riboswitches (riborreguladores).
En el presente contexto, "Tospovirus" se refiere a un virus del género Tospovirus, el cual puede incluir el virus mosaico necrótico de la haba, el virus de la clorosis del pimiento, el virus de la necrosis del brote del maní, el virus de las manchas en anillo del maní, el virus de las manchas amarillas del maní, el virus de las manchas necróticas del impatiens, el virus de las manchas amarillas en la cebolla, el virus de las manchas amarillas del melón, el virus de necrosis del brote del maní, el virus de las manchas amarillas del maní, el virus asociado a la necrosis venosa de la soja, el virus de las manchas clorótlcas del tomate, el virus de las manchas en anillos necróticas del tomate, el virus de la marchitez manchada del tomate, el virus de mancha zonada del tomate, el virus de la necrosis del brote de la sandía, el virus de las manchas plateadas de la sandía, o el virus de la clorosis letal del calabacín.
En el presente contexto, un "Geminivirus" se refiere a un virus de la Familia Geminiviridae de los virus de las plantas. Un Geminivirus puede incluir, entre otros, al virus del enanismo amarillo de la cebada (BYDW), virus mosaico de las cucurbitáceas (CMV), virus mosaico del pepino (PepMV), virus de la hoja enrollada del algodón (CuCLV), virus de la hoja enrollada amarilla del tomate (TYLCV), virus mosaico dorado del tomate, virus mosaico amarillo de la papa, virus de la hoja enrollada del pimiento (PepLCV), virus mosaico dorado del poroto (BGMV-PR), virus mosaico dorado del poroto (BGMV-DR), virus del moteado del pimiento (TMV), y similares.
Las composiciones de polinucleótidos de ADN o ARN de la presente invención son útiles en composiciones, tales como líquidos que comprenden moléculas de polinucleótidos de ADN o ARN, solas o en combinación con otros componentes ya sea en el mismo líquido o en líquidos aplicados por separado que proporcionan un agente de transferencia. En el presente contexto, un agente de transferencia es un agente que, cuando se combina con un polinucleótido en una composición que es aplicada tópicamente a una superficie de planta objetivo facilita el uso del polinucleótido en el control de un Tospovirus o Geminivirus. En una modalidad, el agente de transferencia aumenta la capacidad del polinucleótido de entrar en una célula vegetal. En ciertas modalidades, un agente de transferencia es por lo tanto un agente que acondiciona la superficie del tejido vegetal, por ej. las hojas, tallos, raíces, flores o frutos, a la penetración por las moléculas de polinucleótido en células vegetales. La transferencia de polinucleótidos en células vegetales puede ser facilitada por la aplicación previa o contemporánea de un agente de transferencia de polinucleótidos al tejido vegetal. En algunas modalidades, el agente de transferencia es aplicado posteriormente a la aplicación de la composición polinucleotídica. El agente de transferencia del polinucleótido permite una ruta para que los polinucleótidos atraviesen las barreras cerosas de las cutículas, la pared de las estomas y/o la pared celular o barreras de membrana para penetrar en las células vegetales. Los agentes de transferencia adecuados para facilitar la transferencia del polinudeótido en una célula vegetal incluyen agentes que aumentan la permeabilidad del exterior de la planta o que aumentan la permeabilidad de las células de la planta a los oligonucleótldos o polinudeótidos. Ese tipo de agentes para facilitar la transferencia de la composición en una célula de planta Incluyen un agente químico, o un agente físico, o las combinaciones de los mismos. Los agentes químicos para el acondicionamiento o transferencia incluyen (a) surfactantes, (b) un solvente orgánico o una solución acuosa o mezclas acuosas de solventes orgánicos, (c) agentes oxidantes, (d) ácidos, (e) bases, (f) aceites, (g) enzimas, o las combinaciones de los mismos. Las modalidades del método pueden incluir opcionalmente un paso de incubación, un paso de neutralización (por ej., para neutralizar un ácido, base, o agente oxidante, o para inactivar una enzima), un paso de enjuague, o las combinaciones de los mismos.
Las modalidades de agentes o tratamientos para el acondicionamiento de una planta a la penetración por los polinudeótidos incluyen emulsiones, emulsiones inversas, liposomas, y otras composiciones del tipo micelares. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionar a una planta para la penetración por los polinudeótidos incluyen contraiones u otras moléculas que se sabe que se asocian con moléculas de ácido nucleico, por ej. iones de amonio inorgánico, iones de alquil amonio, iones de litio, poliaminas tales como espermina, espermidina, o putrescina, y otros cationes. Los solventes orgánicos útiles para el acondicionamiento de una planta a la penetración por los polinudeótidos incluyen DMSO, DMF, piridina, /V-pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol, otros solventes miscibles con agua o que disolverán fosfonucleótídos en sistemas no acuosos (tales como se utilizan en reacciones sintéticas). Los aceites derivados naturalmente o sintéticos con o sin surfactantes o emulsionantes pueden utilizarse, por ej., aceites provenientes de plantas, aceites de cultivo (tales como aquellos enlistados en el 9th Compendlum of Herbicide Adjuvants (Noveno Compendio de Adyuvantes Herbicidas), disponibles públicamente en internet en herbicide.adjuvants.com, por ej. aceites parafínicos, ésteres de ácido graso de poliol, o aceites con moléculas de cadena corta modificados con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o /V-pirrolidina. Los agentes de transferencia incluyen, entre otros, las preparaciones de organosilicona.
En ciertas modalidades, una preparación de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo de cabeza trisiloxano se utiliza en los métodos y composiciones provistos en esta invención. En ciertas modalidades, una preparación de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo cabeza heptametiltrisiloxano se utiliza en los métodos y composiciones proporcionados en esta invención. En ciertas modalidades de los métodos y composiciones proporcionados en esta invención, se utiliza o proporciona una composición que comprende una molécula de polinudeótido y uno o más compuestos de organosilicona eficaces en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (porciento en peso) (por ej., aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso).
Las preparaciones de organosilicona utilizadas en los métodos y composiciones proporcionados en esta invención pueden comprender uno o más compuestos de organosilicona eficaces. En el presente contexto, la frase "compuesto de organosilicona eficaz" se utiliza para describir cualquier compuesto de organosilicona que es encontrado en una preparación de organosilicona que da lugar a que un polinucleótido entre en una célula de planta. En ciertas modalidades, un compuesto de organosilicona eficaz puede dar lugar a que un polinucleótido entre en una célula de planta de modo que permita una supresión mediada por el polinucleótido de una expresión de gen objetivo en la célula de la planta. En general, el compuesto de organosilicona eficaz Incluye, entre otros, compuestos que pueden comprender: i) un grupo cabeza trisiloxano que está ligado covalentemente a, ii) un ligante de alquilo que incluye, entre otros, un ligante de n-propilo, que está ligado covalentemente a, iii) una cadena de poliglicol, que está ligada covalentemente a, ¡v) un grupo terminal. Los grupos de cabeza trisiloxano de dichos compuestos de organosilicona eficaces incluyen, entre otros, heptametlltrisiloxano. Los ligantes de alquilo pueden incluir, entre otros, un ligante de n-propilo. Las cadenas de poliglicol incluyen, entre otros, polietilenglicol o polipropilenglicol. Las cadenas de poliglicol pueden comprender una mezcla que proporciona una longitud de cadena promedio "n" de aproximadamente "7.5." En ciertas modalidades, la longitud de cadena promedio "n" puede variar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 14. Los grupos terminales pueden incluir, entre otros, grupos alquilo tales como un grupo metilo. Los compuestos de organosilicona eficaces se cree que incluyen, entre otros, surfactantes de etoxilato de trisiloxano o heptametiltrisiloxano modificado con óxido de poiialquileno.
En ciertas modalidades, una preparación de organosilicona que está disponible en el mercado como surfactante Silwet® L-77 que tiene Número CAS 27306-78-1 y Número EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, y que está actualmente disponible de Momentlve Performance Materials, Albany, Nueva York puede utilizarse para preparar una composición de polinucleótido. En ciertas modalidades donde se utiliza una preparación de organosilicona Silwet L-77 como un tratamiento pre-pulverizaclón de hojas de plantas o de otras superficies de plantas, concentraciones recientemente preparadas en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en p.) (por ej., aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de la planta para la transferencia de moléculas de polinucleótidos en células de planta de una aplicación tópica sobre la superficie. En ciertas modalidades de los métodos y composiciones proporcionados en esta invención, se utiliza o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y una preparación de organosilicona que comprende Silwet L-77 en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en p.) ( por ej., aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en p.).
En ciertas modalidades, se puede utilizar cualquiera de las preparaciones de organosilicona disponibles en el mercado proporcionadas tales como las siguientes Breakthru S 321, Breakthru S 200 Cat# 67674-67-3, Breakthru OE 441 Cat#68937-55-3, Breakthru S 278 Cat #27306-78-1, Breakthru S 243, Breakthru S 233 Cat# 134180-76-0, disponible del fabricante Evonik Goldschmidt (Alemania), Silwet® HS 429, Silwet® HS 312, Silwet® HS 508, Silwet® HS 604 (Momentive Performance Materials, Albany, Nueva York) como agentes de transferencia en una composición de polinucleótido. En ciertas modalidades donde se utiliza una preparación de organosilicona como un tratamiento pre-pulverización de hojas de plantas o de otras superficies, concentraciones recientemente preparadas en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en p.) ( por ej., aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en p.) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de la planta para la transferencia de moléculas de polinucleótido en células de plantas de una aplicación tópica sobre la superficie. En ciertas modalidades de los métodos y composiciones proporcionados en esta invención, se utiliza o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y una preparación de organosilicona en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en p.) {por ej., aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, La administración de un polinucleótido de acuerdo con la invención puede lograrse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, (1) cargar liposomas con una molécula de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN proporcionada en esta invención y (2) formar complejos de una molécula de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN con lípidos o liposomas para formar complejos de ácido nucleico- lípidos o ácido nucleico- liposomas. El liposoma puede estar compuesto por lípidos catiónicos y neutros utilizados comúnmente para transfectar células in vitro. Los lípidos catiónicos pueden formar complejo (por ej., asociación de cargas) con ácidos nucleicos cargados negativamente para formar liposomas. Los ejemplos de liposomas catiónicos incluyen, entre otros, lipofectina, lipofectamina, lipofectace, y DOTAP. Los procedimientos para formar liposomas son bien conocidos en la téenica. Las composiciones de liposomas pueden ser formadas, por ejemplo, a partir de fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidil glicerol, dioleoil fosfatidiletanolamina o liposomas que comprenden dihidrosfingomielina (DHSM). Se encuentran disponibles en el mercado numerosos agentes lipófilos, que incluyen Lipofectin® (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) y Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.). Por añadidura, los métodos de administración sistémica pueden ser optimizados usando lípidos disponibles en el mercado tales como DDAB o DOTAP, cada uno de los cuales puede mezclarse con un lípido neutro tal como DOPE o colesterol. En algunos casos, se pueden utilizar liposomas tales como aquellos descritos por Templeton et ai. ( Nature Biotechnoiogy, 15:647-652, 1997). En otras modalidades, se pueden utilizar policationes tales como polietilenimina para lograr la administración in vivo y ex vivo (Boletta et ai., J. Am Soc. Nephroi. 7:1728, 1996). La información adicional con respecto al uso de los liposomas para administrar ácidos nucleicos puede encontrarse en la Pat. de los Estados Unidos de América No. 6,271,359, Publicación PCT WO 96/40964 y Morrisscy et ai. ( Nat Biotechnol. 23(8): 1002-7, 2005).
Las definiciones y métodos que siguen a continuación son proporcionados para guiar a los expertos en la técnica. A menos que se indique lo contrario, los términos deben ser entendidos de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante. Cuando se proporciona un término en el singular, los inventores también contemplan aspectos descritos por el plural de ese término.
Por polinucleótidos "que no se pueden transcribir" se quiere significar que los polinudeótidos no comprenden una unidad de transcripción de la polimerasa II completa.
En el presente contexto "solución" se refiere a mezclas homogéneas y mezclas no homogéneas tales como suspensiones, coloides, micelas, y emulsiones.
Un "activador" o "polinucleótido activador" es una molécula de polinucleótido de ADN que es homologa o complementaria a un polinucleótido de gen objetivo. Las moléculas de polinucleótido activador modulan la expresión del gen objetivo cuando se aplican tópicamente a una superficie de la planta con un agente de transferencia, por lo cual una planta infectada con un virus que es tratada con dicha composición es capaz de sostener su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva, o dicha planta es menos sensible a un virus como resultado de dicha composición que contiene polinucleótido con relación a una planta no tratada con una composición que contiene la molécula activadora. Una planta tratada con ese tipo de composición puede ser resistente a la expresión viral como resultado de dicha composición que contiene el polinucleótido con relación a una planta no tratada con una composición que contiene la molécula activadora. Los polinucleótidos activadores descritos en esta invención pueden ser generalmente descritos con relación a la secuencia genética objetivo en una orientación antisentido (complementaria) o sentido como moléculas de ssADN, dsADN, ssARN, o dsARN o variantes nucleotídicas y sus nucleótidos modificados dependiendo de las diversas regiones de un gen que está siendo objetivo.
Se contempla que la composición puede contener múltiples polinucleótidos de ADN o ARN y/o pesticidas que incluyen, entre otros, compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopesticidas. Los genes esenciales son genes en una planta que proporcionan enzimas clave u otras proteínas, por ejemplo, una enzima biosintética, enzima metabolizante, receptor, proteína de transduccíón de señales, producto genético estructural, factor de transcripción, o proteína de transporte; o ARNs reguladores, tales como, microARNs, los cuales son esenciales para el crecimiento o la supervivencia del organismo o célula o que están involucrados en el crecimiento y desarrollo normal de la planta (Meinke et al, Trends P/ant Sci. 2008: 13(9):483— 91). Los genes esenciales en un virus pueden incluir genes responsables de la producción de cápside, ensamblaje viral, infectividad, formación de brote y similares. La supresión de un gen esencial en un virus afecta la fundón de un producto genético que da lugar a la infección viral en una planta. Las composiciones pueden incluir diversos polinucleótidos de ADN o ARN activadores que modulan la expresión de un gen esencial en un Tospovirus.
En el presente contexto, el término "ADN", "molécula de ADN", o "molécula de polinucleótidos de ADN" se refiere a una molécula de ssADN o dsADN de origen genómico o sintético, tal como un polímero de bases de desoxirribonucleótido o una molécula de polinucleótido de ADN. En el presente contexto, el término "secuencia de ADN", "secuencia nucleotídica de ADN", o "secuencia polinucleotídica de ADN" se refiere a la secuencia nucleotídica de una molécula de ADN. A menos que se indique lo contrario, se brindan las secuencias nucleotídicas en el texto de esta memoria descriptiva, cuando se lee de izquierda a derecha, en la dirección 5' a 3'. La nomenclatura empleada en esta invención es aquella requerida por el Título 37 del Código de los Estados Unidos de América de Regulaciones Federales (United States Code of Federal Regulations) § 1.822 y es expuesta en los Cuadros en WIPO Standard ST.25 (1998), Apéndice 2, Cuadros 1 y 3.
En el presente contexto, el término "ARN," "molécula de ARN," o "molécula de polinucleótido de ARN" se refiere a una molécula de ssARN o dsARN de origen genómico o sintético, tal como un polímero de bases ribonucleotídicas o una molécula de polinucleótido de ARN. En el presente contexto, el término "secuencia de ARN," "secuencia nucleotídica de ARN," o "secuencia polinucleotídica de ARN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARN. A menos que se Indique lo contrario, se brindan las secuencias nucleotídlcas en el texto de esta memoria descriptiva, cuando se lee de Izquierda a derecha, en la dirección de 5' a 3'. La nomenclatura empleada en esta Invención es aquella requerida por el Título 37 del Código de los Estados Unidos de América de Regulaciones Federales (United States Code of Federal Regulatlons) § 1.822 y es expuesta en los Cuadros en WIPO Standard ST.25 (1998), Apéndice 2, Cuadros 1 y 3.
En el presente contexto, "pollnucleótldo" se refiere a una molécula de ADN o ARN que contiene múltiples nucleótidos y generalmente también se refiere a "oligonucleótidos" (una molécula de polinucleótido de típicamente 50 o menos nucleótidos de largo). Las modalidades incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos que tienen una longitud de 18-25 nucleótidos (18-meros, 19-meros, 20-meros, 21-meros, 22-meros, 23-meros, 24-meros, o 25-meros), por ejemplo, oligonucleótidos según lo expuesto por SEQ ID NOs: 1-12, 47-268, y 448-483 o sus fragmentos. Un gen objetivo comprende cualquier molécula de polinucleótido en una célula de planta o su fragmento para la cual se proporciona la modulación de la expresión del gen objetivo mediante los métodos y composiciones. Un gen tiene elementos genéticos no codificantes (componentes) que proporcionan la función del gen, estos elementos son polinudeótidos que proporcionan la regulación de la expresión genética, tal como, un promotor, un intensificador, una región no traducida en 5', regiones intrónicas, y una región no traducida en 3'. Los oligonucleótidos y polinudeótidos pueden prepararse para cualquiera de los elementos genéticos de un gen y para polinudeótidos que abarcan la región de unión de un elemento genético, tal como un intrón y exón, la región de unión de un promotor y una región transcripta, la región de unión de una secuencia guía 5' y una secuencia codificante, la unión de una región no traducida en 3' y una secuencia codificante.
Las composiciones polinucleotídicas empleadas en las diversas modalidades incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos o polinudeótidos, o una mezcla de ambos, de ADN o ARN, u oligonucleótidos o polinudeótidos químicamente modificados o una mezcla de los mismos. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos químicamente modificados. Los ejemplos de oligonucleótidos o polinudeótidos químicamente modificados son bien conocidos en la téenica; ver, por ejemplo, Publicación de Patente de los Estados Unidos de América 20110171287, Publicación de Patente de los Estados Unidos de América 20110171176, y Publicación de Patente de los Estados Unidos de América 20110152353, Publicación de Patente de los Estados Unidos de América, 20110152346, Publicación de Patente de los Estados Unidos de América 20110160082, que se incorporan a la. presente en su totalidad a modo de referencia. Por ejemplo, incluyendo, entre otros, la estructura del fosfodiéster natural de un oligonucleótido o polinucleótido puede ser parcial o completamente modificada con fosforotioato, fosforoditioato, o modificaciones de ligación internucleotídica de metilfosfonato, bases de nucleósidos modificadas o azúcares modificados pueden utilizarse en la síntesis de los oligonucleótidos o polinucleótidos, y los oligonucleótidos o pollnucleótidos pueden ser etiquetados con un resto fluorescente (por ejemplo, fluoresceína o rodamina) u otra etiqueta (por ejemplo, biotina).
El término "gen" se refiere a componentes que comprenden ADN cromosómico, ARN, ADN plásmido, ADNc, ADN intrónico y exónico, polinucleótido de ADN artificial, u otro ADN que codifica un péptido, polipéptido, proteína, o moléculas de transcripción de ARN, y los elementos genéticos que flanquean la secuencia codificante que están involucrados en la regulación de la expresión, tales como, regiones promotoras, regiones líderes 5', región no traducida en 3' que pueden existir como genes o transgenes nativos en un genoma de una planta. El gen o su fragmento es aislado y sometido a métodos de secuenciamiento de polinucleótidos que determina el orden de los nucleótidos que comprenden el gen. Cualquiera de los componentes del gen son potenciales objetivos para un oligonucleótido activador y polinucleótidos.
Las moléculas de polinucleótido activador están diseñadas para modular la expresión induciendo la regulación o la supresión de un gen viral y están diseñadas para tener una secuencia nucleotídica esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia nucleotídica de un gen viral o a la secuencia de ARN transcripto de un gen viral de una planta, su secuencia determinada por el aislamiento del gen o un fragmento del gen de la planta, que puede ser secuencia codificante o secuencia no codificante. Las moléculas eficaces que modulan la expresión son denominadas "una molécula activadora, o polinucleótido activador". Por "esencialmente idéntica" o "esencialmente complementaria" se refiere a que los polinucleótidos activadores (o por lo menos una porción de un polinucleótido) están diseñados para hibridarse a la secuencia no codificante del gen endógeno o a ARN transcripto (conocido como ARN mensajero o un transcripto de ARN) del gen endógeno para efectuar la regulación o supresión de la expresión del gen endógeno. Las moléculas actívadoras son identificadas por "embaldosados" de los objetivos genéticos con sondas parcialmente superpuestas o sondas no superpuestas de polinucleótidos antisentido que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a la secuencia de nucleótidos de un gen endógeno. Las múltiples secuencias objetivo pueden ser alineadas y las regiones de secuencias con homología en común, de acuerdo con los métodos, son identificadas como potenciales moléculas actívadoras para los múltiples objetivos. Las múltiples moléculas activadores de diversas longitudes, por ejemplo 18-25 nucleótidos, 26-50 nucleótidos, 51-100 nucleótidos, 101-200 nucleótidos, 201-300 nucleótidos o más pueden agruparse en unos pocos tratamientos a fin de investigar las moléculas polinucleotídicas que cubren una porción de una secuencia genética (por ejemplo, una porción de una región codificante versus una porción de una región no codificante, o una porción 5' versus una porción 3' de un gen) o una secuencia genética entera que incluye regiones codificantes y no codificantes de un gen objetivo. Las moléculas polinucleotídicas de las moléculas activadoras agrupadas pueden dividirse en grupos más pequeños o moléculas únicas a fin de identificar moléculas activadoras que proporcionan el efecto deseado.
Las moléculas de polinucleótidos de ssADN del gen objetivo, incluyendo SEQ ID NOs: 1-12, o moléculas de dsARN, incluyendo SEQ ID NOs: 47-268 y 448-483 pueden ser secuenciadas mediante cualquier cantidad de métodos disponibles y equipos conocidos en la técnica. Algunas de las tecnologías de secuenclamlento están disponibles en el mercado, tales como la plataforma de secuenciamiento por hibridación de Affymetrix Inc. (Sunnyvale, Calif.) y las plataformas de secuendamiento por síntesis de 454 Life Sciences (Bradford, Conn.), Hlumina/Solexa (Hayward, Calif.) y Hellcos Biosclences (Cambridge, Mass.), y la plataforma de secuenciamiento por ligación de Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Además del secuenciamiento de molécula única realizado usando secuenclamlento por síntesis de Helicos Blosciences, se encuentran Incluidas otras tecnologías de secuendamiento de molécula única e incluyen la tecnología SMRT™ de Pacific Blosciences, la tecnología Ion Torrent™, y el secuenciamiento de nanoporos están siendo desarrollado por ejemplo, por Oxford Nanopore Technologies. Un gen objetivo viral que comprende ADN o ARN puede ser aislado usando cebadores o sondas esencialmente complementarios o esencialmente homólogos al gen objetivo o su fragmento. Puede producirse un fragmento genético de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) usando cebadores esencialmente complementarios o esencialmente homólogos a un gen viral o a su fragmento que es útil para aislar un gen viral de un genoma de una planta. Se pueden emplear diversas tecnología de captura de secuencias para aislar secuencias de gen objetivo adicionales, por ejemplo, Incluyendo, entre otros, Roche NimbleGen® (Madison, WI) y Streptavdin-coupled Dynabeads® (Life Technologies, Grand Island, NY) y US20110015084, que se Incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
Las modalidades de los polinucleótidos de una sola hebra o de doble hebra funcionales tienen complementariedad de secuencias que no necesita ser del 100 por ciento, aunque es por lo menos suficiente para permitir la hibridación al ARN transcripto del gen objetivo o ADN del gen objetivo para formar un dúplex para permitir un mecanismo de silenciamiento genético. Por lo tanto, en modalidades, un fragmento de polinucleótido es diseñado para ser complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética de Tospovirus o Geminivirus objetivo esencial. Por ejemplo, el fragmento puede ser esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en ya sea la secuencia del gen viral objetivo o ARN mensajero transcripto del gen objetivo. Por "esencialmente idéntica" se quiere significar que tiene una identidad de secuencia del 100 por ciento o por lo menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento de identidad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o en el ARN transcripto del gen objetivo; por "esencialmente complementario" se quiere significar que tiene 100 por ciento de complementariedad de secuencia o por lo menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento de complementariedad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen objetivo o bien en el ARN transcripto del gen objetivo. En algunas modalidades, las moléculas del polinucleótido son diseñadas para tener un 100% de identidad de secuencia con o complementariedad con un alelo o un miembro de la familia de un gen objetivo determinado (secuencia codificante o no codificante de un gen); en otras modalidades las moléculas del polinucleótido son diseñadas para tener un 100% de identidad de secuencias con o complementariedad a múltiples alelos o miembros de la familia de un gen objetivo determinado.
"Identidad" se refiere al grado de similitud entre dos secuencias de ácido polinucleico o de proteína. Una alimentación de las dos secuencias se lleva a cabo mediante un programa informático adecuado. Un programa informático ampliamente utilizado y aceptado para llevar a cabo alineaciones de secuencias es CLUSTALW vi.6 (Thompson, et al. Nucí. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). La cantidad de bases o aminoácidos apareados se divide por la cantidad total de bases o aminoácidos, y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de bases tenían 145 bases apareadas, las mismas serían 25 por ciento idénticas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, la cantidad de apareamientos se divide por la más corta de las dos longitudes. Por ejemplo, si hay 100 aminoácidos apareados entre una proteína de 200 y de 400 aminoácidos, son 50 por ciento idénticas con respecto a la secuencia más corta. Si la secuencia más corta tiene una longitud de menos de 150 bases o 50 aminoácidos, la cantidad de apareamientos se divide por 150 (para las bases de ácido nucleico) o 50 (para los aminoácidos), y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad.
Las moléculas activadores para miembros de la familia de genes virales específicos pueden ser identificadas a partir de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de un virus de planta o múltiples virus de planta, alineando y seleccionando fragmentos de 200-300 polinucleótidos de las regiones menos homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleótidos aplicados tópicamente (ssADN antisentido o dsARN) para determinar su eficacia relativa para proporcionar el fenotipo antiviral. En algunas modalidades, la familia de genes virales es Tospovirus y las secuencias se seleccionan entre SEQ ID NOs: 13-46. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus mosaico de las cucurbitáceas y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 269-316. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus mosaico del pepino y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 317-349. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus del enanismo amarillo de la cebada y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 350-385. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus de la hoja enrollada amarilla del tomate y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 386-421. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus de la hoja enrollada del algodón y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 422-441. Los segmentos efectivos son adicionalmente subdivididos en fragmentos de 50-60 polinucleótidos, priorizados por menor homología, y reevaluados usando polinucleótidos aplicados tópicamente. Los fragmentos de 50-60 polinucleótidos efectivos están subdivididos en fragmentos de 19-30 polinucleótidos, priorizados por menor homología, y nuevamente son evaluados para determinar la inducción del fenotipo antiviral. Una vez determinada la eficacia relativa, los fragmentos son utilizados individualmente, o son nuevamente evaluados en combinación con uno o más otros fragmentos para determinar la composición activadora o mezcla de polinucleótidos activadores para proporcionar el fenotipo antiviral.
Las moléculas activadoras para la actividad antiviral amplia pueden ser identificadas a partir de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de un virus de planta o múltiples virus de planta, alineando y seleccionando fragmentos de 200-300 polinucleótidos de las regiones más homologas entre las secuencias alineadas y son evaluados usando polinucleótidos aplicados tópicamente (ssADN o dsARN antisentido) para determinar su eficacia relativa para inducir el fenotipo antiviral. En algunas modalidades, la familia de genes virales es Tospovirus y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 13-46. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus mosaico de las cucurbitáceas y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 269-316. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus mosaico del pepino y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 317-349. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus del enanismo amarillo de la cebada y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 350-385. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus de la hoja enrollada amarilla del tomate y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 386-421. En algunas modalidades, la familia de genes virales es el virus de la hoja enrollada del algodón y las secuencias son seleccionadas entre SEQ ID NOs: 422-441. Los segmentos eficaces son subdivididos en fragmentos de 50-60 polinucleótidos, priorizados por la mayor homología, y son reevaluados usando polinucleótidos aplicados tópicamente. Los fragmentos de 50-60 polinucleótidos eficaces están subdivididos en fragmentos de 19-30 polinucleótidos, priorizados por la mayor homología, y son nuevamente evaluados para la inducción del fenotipo antiviral. Una vez determinada la eficacia relativa, los fragmentos pueden ser utilizados individualmente, o en combinación con uno o más otros fragmentos para determinar la composición activadora o mezcla de polinucleótidos activadores para proporcionar el fenotipo antiviral.
Los métodos para preparar polinucleótidos son bien conocidos en la téenica. Los métodos de síntesis química, síntesis in vivo y síntesis in vitro y las composiciones son conocidos en la téenica e incluyen diversos elementos virales, células microbianas, polimerasas modificadas, y nucleótidos modificados. La preparación comercial de oligonucleótidos a menudo proporciona dos desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de la hebra sentido. Las moléculas de polinucleótidos largas pueden ser sintetizadas de kits disponibles en el mercado. Las moléculas largas de polinucleótidos también pueden ser ensambladas a partir de fragmentos múltiples de ADN. En algunas modalidades, los parámetros de diseño tales como la puntuación Rcynolds (Reynolds et al. Nature Biotechnology 22, 326-330 (2004), reglas de Tuschl (Peí y Tuschl, Nature Methods 3(9):670-676, 2006), i-score ( Nucleic Acids Res 35:el23, 2007), herramienta i-Score Designer y algoritmos asociados ( Nucleic Acids Res 32:936-948, 2004. Biochem Biophys Res Commun 316:1050-1058, 2004, Nucleic Acids Res 32:893-901, 2004, Ceii Cyde 3:790-5, 2004, Nat Biotechnoi 23:995-1001, 2005, Nucleic Acids Res 35 :e27, 2007, BMC Bioinformatics 7:520, 2006, Nucleic Acids Res 35 :el23, 2007, Nat Biotechnoi 22:326-330, 2004) son conocidos en la técnica y pueden utilizarse para seleccionar secuencias de polinucleótidos eficaces en el silenciamiento genético. En algunas modalidades, la secuencia de un pollnucleótido se selecciona contra el ADN genómico de la planta pretendida para reducir al mínimo el silenciamiento no intencional de otros genes.
Los ligandos pueden mantenerse atados a un polinucleótido de ssADN o dsARN. Los ligandos en general pueden Incluir modificadores, por ej., para aumentar la absorción; compuestos de diagnóstico o grupos informantes por ej., para monitorear la distribución; agentes de entrecruzamlento; restos que confieren resistencia a nucleasa; y nucleobases naturales o inusuales. Los ejemplos generales incluyen lipófilos, lípidos (por ej., colesterol, un ácido biliar, o un ácido graso (por ej., litocólico-oleilo, lauroílo, docosnilo, estearoílo, palmitoílo, miristoil oleoilo, linoleoilo), esteroides ( por ej., uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos ( por ej., triterpenos, por ej., sarsasapogenina, Friedelin, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas ( por ej., ácido fólico, vitamina A, biotina, piridoxal), carbohidratos, proteínas, agentes de unión a proteínas, moléculas de direccionamiento a integrina, policatiónicos, péptidos, poiiaminas, y mímicos peptídicos. El ligando también puede ser una molécula recomblnante o sintética, tai como un polímero sintético, por ej., polietilenglicol (PEG), PEG-40K, PEG-20K y PEG-5K. Otros ejemplos de ligandos incluyen moléculas lipófilas, por ej., colesterol, ácido cólico, adamantano ácido acético, ácido 1-plrenbutírico, dihidrotestosterona, glicerol por ej., ásteres y éteres de los mismos, por ej., alquilo C10, Cu, Ci2, C13, Cu, Cis, Ci6, Cu, C18, Ci9, o C20; por ej., lauroílo, docosnilo, estearoílo, oleoilo, linoleoil 1,3— bis— 0(hexadecil)gl¡cerol, 1,3-bis-0(octaadecil)glicerol), grupo geranlloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mental, 1,3-propandiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)colénico, dodecanoílo, litocolilo, 5 -colanilo, N,N-diestearil-litocolamida, 1 , 2— d i— O— estea ro i I g I icé rid o , dimetoxitritilo, o fenoxazina) y PEG {por ej., PEG-5K, PEG-20K, PEG-40K). Los restos lipófilos preferidos incluyen lípido, colesteroles, oleílo, retinilo, o residuos de colesterilo.
El método de la Invención puede ser aplicado a plantas que son transgénicas o que no lo son. Los ejemplos no limitativos de plantas transgénicas incluyen aquellas que comprenden uno o más transgenes que confieren una característica distintiva seleccionada del grupo que consiste en resistencia a Insectos, resistencia a pesticida, mayor vida útil, coloración del fruto, maduración del fruto, dulzura del fruto, valor nutricional, y características similares.
En modalidades específicas de la invención, una composición para el control de una enfermedad de una planta según lo proporcionado en esta invención puede ser proporcionada adlcionalmente en una composición formulada para la aplicación a una planta que comprende por lo menos un ingrediente activo diferente. Los ejemplos de ese tipo de ingredientes activos pueden incluir, entre otros, una proteína insecticida tal como una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporous, y una proteína insecticida de Bacillus sphearicus. En otro ejemplo no limitativo, ese tipo de ingrediente activo es un herbicida, tal como uno o más de acetoclor, acifluorfen, acifluorfen-sodio, aclonifen, acroleína, alaclor, aloxldim, alil alcohol, ametrina, amicarbazona, amidosulfuron, amlnopiralid, amitroi, sulfamato de amonio, anilofos, asulam, atraton, atrazina, azimsulfuron, BCPC, beflubutamida, benazolina, benfluralina, benfuresato, bensulfuron, bensulfuron-metilo, bensulida, bentazona, benzfendizona, benzobiciclon, benzofenap, bifenox, bilanafos, bispiribac, bispiribac— sod ¡o, bórax, bromacil, bromobutide, bromoxinilo, butador, butafenacil, butamifos, butralina, butroxidim, butllato, ácido cacodílico, clorato de calcio, cafenstrol, carbetamida, carfentrazona, carfentrazona-etilo, CDEA, CEPC, clorflurenól, clorflurenol-metilo, cloridazon, clorimuron, clorimuron-etilo, ácido cloroacético, clorotoluron, clorprofam, clorsulfuron, dortal, clortal— dimetllo, cinidon— etilo, cinmetilina, cinosulfuron, cisanilide, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargilo, clomazone, clomeprop, clopiralid, cloransulam, cloransulam-metilo, CMA, 4-CPB, CPMF, 4-CPP, CPPC, cresol, cumiluron, cianamida, cianazina, cicloato, ciclosulfamuron, cicloxidlm, cihalofop, cihalofop-butilo, 2,4-D, 3,4-DA, daimuron, dalapon, dazomet, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4-DEB, desmedifam, dicamba, diclobenil, orto-diclorobenceno, para-dlclorobenceno, diclorprop, diclorprop-P, didofop, diclofop-metilo, diclosulam, difenzoquat, difenzoquat metilsulfato, diflufenican, diflufenzopir, dlmefuron, dimeplperato, dimetaclor, dimetametrina, dimetenamida, dimetenamida-P, dimetipin, ácido dlmetilarsínico, dinitramina, dinoterb, difenamida, diquat, dibromuro de diquat, ditiopir, diuron, DNOC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, endotal, EPTC, esprocarb, etalfluralina, etametsulfuron, etametsulfuron-metilo, etofumesato, etoxifen, etoxlsulfuron, etobenzanid, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fentrazamida, sulfato ferroso, flamprop-M, flazasulfuron, florasulam, fluazifop, fluazifop— butilo, fluazifop-P, f I uazifop—P— butilo, flucarbazona, flucarbazona-sodio, flucetosulfuron, flucloralina, flufenacet, flufenpir, flufenpir— etilo, flumetsulam, flumiclorac, flumiclorac-pentilo, flumioxazina, fluometuron, fluorglicofeno, fluorglicofeno-etilo, flupropanato, flupirsulfuron, flupirsulfuron-metil-sodio, flurenol, fluridona, fluorcloridona, fluorxipir, flurtamona, flutiacet, flutiacet-metilo, fomesafen, foramsulfuron, fosamina, glufosinato, glufosinato-amonio, glifosato, halosulfuron, halosulfuron-metilo, haloxifop, haloxifop-P, HC-252, hexazinona, imazametabenz, imazametabenz-metilo, imazamox, ¡mazapic, ¡mazapir, imazaquin, ¡mazetapir, imazosulfuron, indanofan, iodometano, iodosulfuron, iodosulfuron-metil-sodio, ioxinil, isoproturon, isouron, isoxaben, isoxaclortol, isoxaflutol, carbutilato, lactofen, lenacil, linuron, MAA, MAMA, MCPA, MCPA-tioetilo, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, mefenacet, mefluidide, mesosulfuron, mesosulfuron-metilo, mesotriona, metam, metamifop, metamitron, metazaclor, metabenztiazuron, ácido metilarsónico, metildimron, isotiocianato de metilo, metobenzuron, metolaclor, S-metolaclor, metosulam, metoxuron, metribuzin, metsulfuron, metsulfuron-metilo, MK-66, molinate, monolinuron, MSMA, naproanilide, napropamida, naptalam, neburon, nicosulfuron, ácido nonanoico, norflurazon, ácido oleico (ácidos grasos), orbencarb, ortosulfamuron, orizalin, oxadiargil, oxadiazon, oxasulfuron, oxaziclomefone, oxifluorfen, paraquat, paraquat dicloruro, pebulate, pendimetalina, penoxsulam, pentaclorofenol, pentanoclor, pentoxazona, petoxamida, aceites de petróleo, fenmedifam, fenmedifam-etilo, picloram, picolinafen, pinoxaden, piperofos, arsenita de potasio, azida de potasio, preti!aclor, primisulfuron, primisulfuron-metilo, prodiamina, profluazol, profoxidim, prometon, prometrina, propaclor, propanil, propaquizafop, propazina, profam, propisoclor, propoxicarbazona, propoxicarbazona-sodio, propizamida, prosulfocarb, prosulfuron, piraclonil, piraflufen, piraflufen-etilo, pirazoiinato, pirazosulfuron, pirazosulfuron-etilo, pirazoxifen, piribenzoxim, piributicarb, piridafol, piridato, piriftalida, piriminobac, piriminobac-metilo, piri isulfan, piritiobac, piritiobac-sodio, quinclorac, quinmerac, quinoclamina, quizalofop, quizalofop-P, rimsulfuron, setoxidim, siduron, simazina, simetrina, SMA, arsenita de sodio, azida de sodio, clorato sódico, sulcotriona, sulfentrazona, sulfometuron, sulfometuron-metilo, sulfosato, sulfosulfuron, ácido sulfúrico, aceites de alquitrán, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-sodio, tebutiuron, tepraioxidim, terbacil, terbumeton, terbutilazina, terbutrina, tenilclor, tiazopir, tifensulfuron, tifensulfuron-metilo, tiobencarb, tiocarbacilo, topramezona, tralcoxidim, tri-alato, triasulfuron, triaziflam, tribenuron, tribenuron-metilo, tricamba, triclopir, trietazina, trifloxisulfuron, trifloxisuifuron-sodio, trifluralina, triflusuifuron, triflusulfuron-metilo, trihidroxitriazina, tritosulfuron, éster etílico del ácido [3-[2-cloro-4-fluor-5-(-metil-6-trifluormet¡l-2,4-dioxo-,2,3,4-t- etrahidropirimidin— 3— il)fenoxi]— 2— piridiioxi]acético (CAS RN 353292-3-6), ácido 4-[(4,5-dihidro-3-metox¡-4-metil-5-oxo)-H-,2,4-triazolilcarbon¡l-sulfamoil]-5-met¡l-tiofen-3-carboxílico (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), topramezona (CAS RN 2063-68-8), 4- hidroxi— 3— [[2— [(2— metox¡etox¡)metil]— 6— (trifluor— metil)— 3— piridi— nil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona (CAS RN 35200-68-5), y 4-hidroxi-3-[[2-(3-metoxipropil)-6-(difluormetil)-3-pmdiniljcarbon- il]-bicido[3.2.]oct-3-en-2-ona.
Las composidones de moléculas de polinucleótidos y/u oligonucleótldos de ADN o ARN activador son útiles en composiciones, tales como líquidos que comprenden las moléculas de polinucleótidos en bajas concentraciones, solos o en combinación con otros componentes, por ejemplo una o más moléculas herbicidas, ya sea en la misma solución o en líquidos aplicados por separado que también proporcionan un agente de transferencia. Si bien no existe límite superior sobre las concentraciones y dosificaciones de moléculas de polinucleótidos que pueden ser útiles en los métodos, en general se buscarán concentraciones y dosificaciones eficaces inferiores para lograr la eficiencia. Las concentraciones pueden ser ajustadas en consideración del volumen de pulverización o tratamiento aplicadas a las hojas de las plantas o a otras superficies de partes de plantas, tales como pétalos de flores, tallos, tubérculos, fruto, anteras, polen o semilla. En una modalidad, un tratamiento útil para plantas herbáceas usando moléculas de oligonucleótldos de 25 meros es aproximadamente 1 nanomol (nmol) de moléculas de oligonucleótldos por cada planta, por ejemplo, entre aproximadamente 0.05 y 1 nmol por cada planta. Otras modalidades para las plantas herbáceas incluyen rangos útiles de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 nmol, o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 nmol, o aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 10 nmol de polinucleótidos por cada planta. Las plantas, árboles o parras muy grandes pueden requerir correspondientemente cantidades más grandes de polinucleótidos. Para ¡lustrar las modalidades, el factor IX, cuando se aplica a las moléculas de oligonucleótldos es utilizado arbitrariamente para denotar un tratamiento de 0.8 nmol de molécula de polinucleótido por cada planta; 10X, 8 nmol de molécula de polinucleótido por cada planta; y 100X, 80 nmol de molécula de polinucleótido por cada planta.
Un campo agrónomo que necesita de control viral puede ser tratado por aplicación de una composición química agrícola directamente a la superficie de las plantas en crecimiento, tal como por una pulverización. Por ejemplo, el método es aplicado para controlar la infección viral en un campo de plantas de cultivo por pulverización del campo con la composición. La composición puede ser proporcionada como una mezcla en tanque con uno o más productos químicos pesticidas o herbicidas para controlar plagas y enfermedades de las plantas de cultivo que necesitan de control de plagas y enfermedades, un tratamiento consecutivo de componentes (generalmente la composición que contiene polinucleótidos seguido por el pesticida), o un tratamiento simultáneo o mezclado de uno o más de los componentes de la composición de envases separados. El tratamiento del campo puede ocurrir tan frecuentemente como resulte necesario para proporcionar el control del virus y los componentes de la composición pueden ser ajustados para dirigirse a Tospovirus o Geminivirus específicos a través de la utilización de polinucleótidos o composiciones de polinucleótidos específicos capaces de dirigirse selectivamente hacia el virus específico que será controlado. La composición puede ser aplicada en proporciones de uso eficaces de acuerdo con el tiempo de aplicación al campo, por ejemplo, previo a la plantación, en la plantación, después de la plantación, o post recolección. Los polinucleótidos de la composición pueden ser aplicados en proporciones de 1 a 30 gramos por aere (4046.8 m2) dependiendo de la cantidad de moléculas activadoras necesarias para el alcance de la infección viral en el campo.
Las plantas de cultivo e las cuales puede ser necesario el control viral incluyen, entre otras, maíz, soja, algodón, cañóla, remolacha, alfalfa, caña de azúcar, arroz, cebada, y trigo; plantas vegetales que incluyen, entre otras, tomate, pimiento dulce, pimiento picante, melón, sandía, pepino, calabacín, berenjena, coliflor, brócoli, lechuga, espinaca, cebolla, porotos, zanahoras, choclo tierno, col de China, puerro, hinojo, calabaza, calabacín o calabaza, rábano, papa, zapallitos de Bruselas, tomatillo, maní, alubias, alubias para grano, o gombo (okra); plantas culinarias que incluyen, entre otras, albahaca, perejil, café, o té; o plantas frutales que incluyen, entre otras, manzana, pera, cereza, durazno, ciruelta, damasco, banana, banana, uva, uva de vino, cítricos, palta, mango, o baya; un árbol cultivado para uso ornamental o comercial, incluyendo, entre otros, un árbol de frutos o avellano; planta ornamental ( por ej., una planta ornamental floral o arbusto o césped), tal como iris e impatiens. Los métodos y composiciones proporcionados en esta invención también pueden ser aplicados a plantas producidas mediante un proceso de corte, clonación o injerto (es decir, una planta que no se cultiva a partir de una semilla) incluyendo árboles frutales y plantas que incluyen, entre otras, paltas, tomates, berenjena, pepino, melones, sandías, y uvas, así como también diversas plantas ornamentales.
Las composiciones de polinucleótidos activadores también pueden utilizarse como mezclas con diversos productos químicos agrícolas y/o Insecticidas, miticidas y fungicidas, agentes pesticidas y biopesticidas. Los ejemplos incluyen, entre otros, azinfos-metilo, acefato, isoxation, isofenfos, etion, etrimfos, oxidemeton-metilo, oxideprofos, quinalfos, clorpirifos, clorpirifos-metilo, clorfenvinfos, cianofos, dioxabenzofos, diclorvos, disulfoton, dimetilvinfos, dimetoato, sulprofos, diazinon, tiometon, tetraclorvinfos, temefos, tebupirimfos, terbufos, naled, vamidotion, piraclofos, piridafention, pirimifos-metilo, fenitrotion, fention, fentoato, flupirazofos, protiofos, propafos, profenofos, foxime, fosalona, fosmet, formotion, forato, malation, mecarbam, mesulfenfos, metamidofos, metidation, paration, metil paration, monocrotofos, triclorfon, EPN, isazofos, ¡samidofos, cadusafos, diamidafos, diclofention, tionazin, fenamifos, fostiazato, fostietan, fosfocarb, DSP, etoprofos, alanicarb, aldicarb, isoprocarb, etiofencarb, carbarilo, carbosulfan, xililcarb, tiodicarb, pirimicarb, fenobucarb, furatiocarb, propoxur, bendiocarb, benfuracarb, metomil, metolcarb, XMC, carbofuran, aldoxicarb, oxamil, acrinatrina, aletrina, esfenvalerato, empentrina, cicloprotrina, cihalotrina, gamma-cihalotrina, lambda-dhalotrina, dflutrina, beta-ciflutrina, cipermetrina, alfa— dpermetrina, zeta-cipermetrina, silafluofen, tetrametrina, teflutrina, deltametrina, tralometrina, bifentrina, fenotrina, fenvalerato, fenpropatrina, furametrina, praletrina, flucitrinato, fluvalinato, flubrocitrinato, permetrina, resmetrina, etofenprox, cartap, tiocidam, bensultap, acetamiprid, imidadoprid, clotianidina, dinotefuran, tiadoprid, tiametoxam, nitenpiram, dorfluazuron, diflubenzuron, teflubenzuron, triflumuron, novaluron, noviflumuron, bistrifluoron, fluazuron, fluddoxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, cromafenozida, tebufenozida, halofenozida, metoxifenozida, diofenolan, dromazina, piriproxifen, buprofecina, metopreno, hidropreno, quinopreno, triazamato, endosulfan, dorfenson, dorobendlato, dicofol, bromopropilato, acetoprol, fipronil, etiprol, piretrina, rotenona, sulfato de nicotina, agente de BT (Bacillus Thuringiensis), spinosad, abamectina, acequinocil, amidoflumet, amitraz, etoxazol, quinometionato, clofentecina, óxido de fenbutatina, dienoclor, cihexatina, espirodiclofeno, espiromesifeno, tetradifon, tebufenpirad, binapacril, bifenazato, piridabeno, pirimidifeno, fenazaquin, fenotiocarb, fenpiroximato, fluacripirim, fluazinam, flufenzin, hexitiazox, propargita, benzomato, complejo de polinactina, milbemectina, lufenuron, mecarbam, metiocarb, mevinfos, halfenprox, azadiractina, diafentiuron, indoxacarb, benzoato de emamectina, oleato de potasio, oleato sódico, clorfenapir, tolfenpirad, pimetrocina, fenoxicarb, hidrametilnon, almidón de hidroxipropilo, piridalilo, flufenerim, flubendiamida, flonicamida, metaflumizol, lepimectina, TPIC, albendazol, oxibendazol, oxfendazol, triclamida, fensulfotion, fenbendazol, clorhidrato de levamisol, tartrato de morantel, dazomet, metam-sodio, triadimefon, hexaconazol, propiconazol, ipconazol, procloraz, triflumizol, tebuconazol, epoxiconazol, difenoconazol, flusilazol, triadimenol, ciproconazol, metconazol, fluquinconazol, bitertanol, tetraconazol, triticonazol, flutriafol, penconazol, diniconazol, fenbuconazol, bromuconazol, imibenconazol, simeconazol, miclobutanil, himexazol, imazalil, furametpir, tifluzamida, etridiazol, oxpoconazol, fumarato de oxpoconazol, pefurazoato, protioconazol, pirifenox, fenarimol, nuarimol, bupirimato, mepanipirim, ciprodinil, pirimetanil, metalaxil, mefenoxam, oxadixil, benalaxil, tiofanato, tiofanato-metilo, benomil, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol, manzeb, propineb, zineb, metiram, maneb, ziram, tiuram, clorotalonil, etaboxam, oxicarboxin, carboxin, flutolanil, siltiofam, mepronil, dimetomorf, fenpropidina, fenpropimorf, espiroxamina, tridemorf, dodemorf, flumorf, azoxistrobina, kresoxim-metilo, metominostrobina, orisastrobina, fluoxastrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, iprodiona, procimidona, vinciozolin, clozolinato, flusulfamida, dazomet, isotiocianato de metilo, cloropicrina, metasulfocarb, hidroxiisoxazol, hidroxiisoxazol de potasio, eclomezol, D-D, carbam, cloruro de cobre básico, sulfato de cobre básico, nonilfenolsulfonato de cobre, oxina cobre, DBEDC, sulfato de cobre anhidro, sulfato de cobre pentahidrato, hidróxido cúprico, azufre inorgánico, azufre humedecible, cal azufre, sulfato de zinc, fentin, carbonato de hidrógeno de sodio, carbonato de hidrógeno potásico, hipoclorito de sodio, plata, edlfenfos, tolclofos-metilo, fosetil, iprobenfos, dinocap, pirazofos, carpropamida, ftallda, tricielazol, plroquilon, diclocimet, fenoxanil, kasugamidna, validamicina, polioxinas, blasti din 5, oxitetraciclina, mildiomicina, estreptomicina, aceite de semilla de colza, aceite de máquina, bentiavalicarbisopropilo, iprovalicarb, propamocarb, dietofencarb, fluoroimida, fludioxanil, fenpiclonil, quinoxifen, ácido oxolínico, clorotalonil, captan, folpet, probenazol, acibenzolar-S-metilo, tiadinil, ciflufenamida, fenhexamida, diflumetorim, metrafenona, picobenzamida, proquinazid, famoxadona, ciazofamid, fenamidona, zoxamida, boscalid, cimoxanil, ditianon, fluazinam, diclofluanide, triforine, isoprotiolane, ferimzone, diclomezine, tecloftalam, penclcuron, quinometionato, acetato de iminoctadina, albesilato de iminoctadina, ambam, policarbamato, tiadiacina, doroneb, dimetilditiocarbamato de níquel, guazatina, acetato de dodecilguanidina, quintoceno, tolilfluanid, anilazina, nitrotalisopropilo, fenitropan, dimetirimol, bentiazol, proteína de horquilla de cabello, flumetover, mandipropamida y pentiopirad.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes son incorporadas a la presente a modo de referencia en la misma medida como si cada publicación o solicitud de patente individual estuviese indicada de manera específica e individual como incorporada a modo de referencia.
Los siguientes Ejemplos son presentados con fines ilustrativos y no deben ser interpretados como limitaciones. Los expertos en la téenica deberían apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que son descritas en esta invención y aun obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance.
EJEMPLO 1 Aplicación tópica de oliaonucleótidos de ssADN antisentido a plantas de lechuga para el control del virus de las manchas necróticas del imoatiens fINSV, por sus siglas en inglés) Los fragmentos de ADN de una sola hebra (ssADN) en orientación antisentido (as) fueron identificados y mezclados con un agente de transferencia y con otros componentes. Esta composición fue aplicada tópicamente a las plantas de lechuga para efectuar la represión del gen de la nucleocápside (N) de INSV objetivo para reducir o eliminar los síntomas de infección viral en las plantas. El procedimiento fue el siguiente.
Las plantas de lechuga en crecimiento ( Lactuca sativa, c.v. SVR3606-L4) se trataron tópicamente con una composición para inducir la supresión de un gen objetivo en una planta. La composición incluía: (a) un agente para dar lugar a la penetración de los polinucleótidos en la planta, y (b) por lo menos una hebra de polinucleótido que incluye por lo menos un segmento de 17-25 nucleótidos contiguos del gen objetivo en orientación antisentido. Las plantas de lechuga fueron tratadas tópicamente con una solución adyuvante que comprende ssADN antisentido, esencialmente homólogo o esencialmente complementario a la secuencia codificante de la proteína de la N de INSV. Las plantas se cultivaron y se trataron en cámaras de crecimiento [22°C, ciclos de 8 hora de luz (~50 pmol), 16 horas de oscuridad].
Las plantas de lechuga fueron germinadas durante aproximadamente 16-21 días antes del ensayo. Se infectaron hojas individuales de plantas de lechuga (40 plantas en total) con aproximadamente 200 nanogramos (100 ng/pL en buffer de fosfato) de virus INSV. Aproximadamente 3 horas después de la infección con el virus, se rociaron 20 plantas con una mezcla de oligonucleótidos en solución (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, mezclados en conjunto) usando un aerógrafo a 136 kPa (20 psi). Las secuencias de los oligonucleótidos de ssADN antisentido se enlistan en el Cuadro 1. Las 20 plantas restantes no fueron tratadas con los oligonucleótidos y sirvieron como el control.
La concentración final de cada oligonucleótido o polinucleótido fue de 20 nMoles para ssADN (en 0.1% Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio, buffer de fosfato sódico 5 m , pH 6.8) a menos que se indique lo contrario. Se aplicó la solución de pulverización a la planta para proporcionar un volumen total de 200-300 pL. Se midió el peso fresco de tejido aéreo (véase la FIG. 1).
CUADRO 1 La secuencia de oliaonucleótidos de ssADN antisentido dirigida al gen de la nucleocápside N de INVS EJEMPLO 2 Cuantificación del virus usando ELISA Perforaciones de hojas recolectadas de plantas de lechuga no tratadas o tratadas (FIGS. 2A, 2B) según lo descrito en el Ejemplo 1 fueron trituradas en buffer de antígeno usando un mortero y mano de mortero. El homogeneizado se centrifugó a 10,000 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se extrajo y se sometió a ELISA indirecto contra la proteína N anti-INSV.
Según lo mostrado en la FIG. 3, los círculos representan una lectura de la proteína N del INSV en perforaciones de hojas individuales recolectadas de las plantas control (virus solamente, sin polinucieótido). Los triángulos representan una lectura de la proteína N del INSV en perforaciones de hojas individuales recolectadas de plantas tratadas con una mezcla de ollgonucleótldos de ssADN antisentido (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). Aproximadamente 65% de las plantas tratadas con oligos exhibieron valores de OD40s de 0.2 o más bajos, y 100% de las plantas control exhibieron un valor OD405 de 1 o más alto. Las FIGS. 4A a 4D y las FIGS. 5A a 5D muestran una densidad óptica (OD, por sus siglas en Inglés) y evaluación visual de extractos de plantas de lechuga después del tratamiento con los oligos de ssADN antisentido.
EJEMPLO 3 Aplicación tópica de oligonudeótidos de ssADN antisentido a Plantas de lechuga después del tratamiento viral mejora la función del fotosistema II En este ejemplo, se midieron plantas de lechuga que no fueron tratadas (sin tratamiento) o que habían sido infectadas con el virus INSV y tratadas con oligonudeótidos ss antisentido usando un fluorímetro de clorofila portátil (PAM-2500). Esta medición proporciona un rendimiento efectivo de la función del fotosistema II (PSII), una medida del rendimiento total. Un grupo de seis plantas no tratadas escogidas al azar y de seis plantas tratadas escogidas al azar se midieron en el número de hoja 2, 4, 6 y 8. El número de hoja es indicativo de la edad de la cabeza de lechuga estando la hoja más joven (hoja 2) dentro de la cabeza de la lechuga en formación y la hoja más vieja (hoja 8) situada en el lado de afuera de la cabeza de la lechuga en formación. Las plantas tratadas con oligos de ADN antisentido ss exhibieron la mayor protección sobre las hojas externas en comparación con las plantas no tratadas (sin tratamiento).
EJEMPLO 4 Aplicación tópica de oligonudeótidos de ssADN antisentido a plantas de tomate y pimiento para el control del virus de la marchitez manchada del tomate fTSWVJ Fragmentos de ADN o ARN de una sola hebra o de doble hebra en orientación sentido o antisentido, o ambos, fueron identificados y mezclados con un agente de transferencia y con otros componentes. Esta composición fue aplicada tópicamente a plantas de tomate para efectuar la expresión de los genes de la nucleocápside o de la cápside del TSWV objetivos para reducir o eliminar los síntomas de la infección viral en las plantas. El procedimiento fue el siguiente.
Se cultivaron plantas de tomate {Sotan um lycopersicum HP375) y de pimiento {c.v.
Yoto Wonder ) en una jaula en el exterior. Las plantas de pimiento infectadas con TSWV, un virus de ARN de sentido negativo, se transplantaron desde un campo de pimientos infectados del cultivador en el centro de las hileras que contienen plantas de tomate o de pimiento. Cualquier infección posterior se debía a los trips que transmiten TSWV desde las plantas del centro infectadas, imitando de ese modo una infección natural de TSWV (véase la FIG. 6). Se llevó a cabo el tratamiento tópico con una mezcla de por lo menos una hebra de polinucleótido que incluye por lo menos un segmento de 17-25 nucleótidos contiguos del gen objetivo en orientación antisentido o sentido. Las plantas fueron tratadas con una solución adyuvante aplicada tópicamente de moléculas activadoras que comprenden oligonucleótidos de ssADN esencialmente homólogos o esencialmente complementarios a la secuencia codificante de la nucleocápside de TSWV. La secuencia de la molécula activadora empleada en cada tratamiento se muestra en el Cuadro 2.
CUADRO 2 La secuencia de oligonucleótidos de ssADN antisentido dirigida al gen de la nucleocápside N del TSWV En estos ensayos se emplearon plantas en la etapa de la hoja 2-5 completamente expandida. Se trataron siete u 8 plantas como control (infección viral solamente) y 7 u 8 plantas fueron tratadas con polinudeótidos. Dos hojas completamente expandidas por cada planta fueron tratadas con la solución de polinucleótido /Silwet L-77. La concentración final para cada oligonucleótido o polinucleótido fue de 10 nmoles para ssADN (en 0.1% Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio, buffer de fosfato sódico 5 mM, pH 6.8) a menos que se indique lo contrario. Se aplicaron veinte microlitros de la solución a la superficie superior de cada una de las dos hojas para proporcionar un total de 40 mL para cada planta. La FIG. 7 muestra plantas de tomate tanto sin tratar (en círculo) y plantas tratadas tópicamente con oligos de ssADN antisentido contra TSWV, mientras que las FIGS. 8A a 8D y 9A a 9D muestran los resultados del tratamiento tópico de plantas de tomate y de pimiento, respectivamente.
EJEMPLO 5 Aplicación tópica de de ssADN antisentido a plantas de pimi< el control del virus mosaico de las cucurbitáceas f CMV) En este ejemplo, las plantas de pimientos en crecimiento (c.v. Yob Wonder B) fueron inoculadas con el virus mosaico de las cucurbitáceas (CMV), un virus de ARN de hebra positiva, y las plantas fueron separadas en dos grupos. El grupo experimental fue tratado luego tópicamente con una mezcla de por lo menos una hebra polinucleotídica que incluía por lo menos un segmento de 17-25 nucleótidos contiguos del gen objetivo en orientación antisentido o sentido. Las moléculas activadoras en la solución adyuvante tópica comprendían dsARN y ssADN esencialmente homólogos o esencialmente complementarios a la secuencia codificante de la cápside de CMV. Las secuencias de las moléculas activadoras empleadas en cada tratamiento se muestran en el Cuadro 3.
CUADRO 3 La secuencia de oliaonucleótidos de ssADN antisentido dirigidos a la proteína de cubierta (CP, por sus siglas en inalésj del CMV Se emplearon en los ensayos plantas de pimientos en la etapa de 2-5 hojas completamente expandidas. Se emplearon siete u 8 plantas como el control (infección viral solamente) y 7 u 8 plantas fueron tratadas con virus seguido por una solución activadora de polinucleótidos. Dos hojas completamente expandidas por planta fueron tratadas con la solución de polinucleótido /Silwet L-77. Un conjunto de plantas se trató con una mezcla de polinucleótidos que comprende SEQ ID NOs: 5-8 y otro conjunto de plantas se trató con una mezcla de polinucleótidos que comprenden SEQ ID NOs: 9-12. La concentración final para cada oligonucleótido o polinucleótido fue 5 nmol para ssADN (en 0.1% Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio, buffer de fosfato de sodio 5 mM, pH 6.8) a menos que se indique lo contrario. Se aplicaron veinte microlitros de la solución a la superficie superior de cada una de las dos hojas para proporcionar un total de 40 mL para cada planta.
Como se muestra en la FIG. 10, los círculos representan puntos de datos recogidos de las plantas control (virus solamente, sin tratamiento con oligos). Los diamantes (SEQ ID NOs: 5-8) y triángulos (SEQ ID NOs: 9-12) representan puntos de datos recogidos de muestras tratadas tópicamente con la solución de oligonucleótidos de ssADN antisentido. La parte izquierda muestra los datos de hojas inoculadas, y la parte derecha muestra los datos de las hojas no tratadas con oligos, no infectadas sistémicas.
EJEMPLO 6 Aplicación tópica de oliaonucleótidos de ssADN antisentido a plantas de cebolla para el control del virus de las manchas amarillas en la cebolla flYS1H En este ejemplo, las plantas de cebolla en crecimiento fueron inoculadas con el virus de las manchas amarillas en la cebolla (IYSV, por sus siglas en inglés), y las plantas fueron separadas en dos grupos (31 plantas por grupo). Luego, el grupo experimental fue tratado tópicamente con una mezcla de por lo menos una hebra polinucleotídica que incluye por lo menos un segmento de 17-25 nucleótidos contiguos del gen objetivo en orientación antisentido. Las moléculas activadoras en la solución adyuvante tópica comprendían ssADN esencialmente homólogo o esencialmente complementario a una secuencia codificante del IYSV. Los resultados del tratamiento de las plantas de cebolla con ssADN antisentido se muestran en las FIGS. HA a 11D.
EJEMPLO 7 Aplicación tópica de activadores de polinucleótidos para el control de aislados de Tospovirus comercialmente relevantes En el Cuadro 4 de este ejemplo, se identificaron secuencias de genes de aislados de Tospovirus que son considerados comercialmente relevantes debido a las pérdidas de rendimiento en el tomate, pimiento, papa o soja y constituyen SEQ ID NOs: 13-46.
Se empleó una alineación por ordenador para identificar áreas altamente conservadas dentro de los genes de la Nucleocápside (N), Supresor del Silenciamiento (NSs), Movimiento (NSm), y de la polimerasa de ARN dependiente del ARN (SEQ ID NOs: 47-103 en el Cuadro 5) para servir como candidatos para los polinucleótidos de ssADN o dsARN antisentido homólogos a la secuencia genética para el tratamiento de la aplicación tópica para controlar la infección por Tospovirus (Cuadro 5). Estos polinucleótidos pueden ser analizados en plantas de tomate infectadas con Tospovirus para controlar la infección viral.
CUADRO 4 Secuencias de ARN de los Tospovirus SEQ ID NO: Gen Aislado N° de Acceso No.
Aislado del virus de las manchas en 13 anillo del maní N tomate Florida FL, E.E.U.U. 1.1 Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y de las manchas cloróticas del 14 tomate N Solanum / cope FL, E.E.U.U. gi 1332290587 Virus de la marchitez manchada del 15 tomate N Eustoma grandi E.E.U.U. HQ655877.1 Virus de la marchitez manchada del 16 tomate N Pimiento Brasil DQ915948.1 Virus de la marchitez manchada del 17 tomate N NC, E.E.U.U. AY856344 Virus de las manchas cloróticas del 18 tomate N Tomate Florida FL, E.E.U.U. HQ634664.1 Virus de las manchas cloróticas del 19 tomate N FL, E.E.U.U. JX244198.1 Virus de las manchas cloróticas del 20 tomate N FL, E.E.U.U. JX244196 Virus de la marchitez manchada del 21 tomate N Solanum lycope FL, E.E.U.U. HQ634670 Virus de la marchitez manchada del 22 tomate N Solanum .1 Virus de la marchitez manchada del 23 tomate N So/anum lycopersicum FL, E.E.U.U. HQ634669.1 Virus de la marchitez manchada del 24 tomate N So/anum lycopersicum FL, E.E.U.U. HQ634667.1 Aislado del virus de las manchas en 25 anillo del maní NSm Tomate Florida FL, E.E.U.U. HQ634675.1 Aislado del virus de las manchas en 26 anillo del maní NSm G/ycine max S.A HQ634674 Virus de la marchitez manchada del 27 tomate NSm E.E.U.U. NCL002050 Virus de las manchas cloróticas del 28 tomate NSm Tomate Florida FL, E.E.U.U. HQ634671.1 Virus de las manchas cloróticas del 29 tomate NSm So/anum lycopersicum FL, E.E.U.U. JX244201.1 Virus de la marchitez manchada del 30 tomate NSm So/anum lycopersicum FL, E.E.U.U. HQ634676.1 Virus de la marchitez manchada del 31 tomate NSm So/anum lycopersicum FL, E.E.U.U. AY956380 Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y del virus de las manchas cloróticas del 32 tomate NSs So/anum lycopersicum FL, E.E.U.U. gi|332290587 Aislado del virus de las manchas en 33 anillo del maní NSs Maní S.A JN571117 Virus de la marchitez manchada del So/anum 34 tomate NSs lycopersicum E.E.U.U. FR693044 Virus de la marchitez manchada del 35 tomate NSs Pimiento Brasil D00645.1 Virus de la marchitez manchada del 36 tomate NSs E.E.U.U. AF020659.1 Virus de la marchitez manchada del 37 tomate NSs E.E.U.U. AF020659 Aislado del virus de las manchas en segmento 38 anillo del maní RdRp/ L Tomate Florida FL, E.E.U.U. HQ634677.1 Aislado del virus de las FL 34945, manchas en segmento E.E.U.U. 39 anillo del maní RdRp/ L Tomate Florida 95/0188 HQ634679.1 Aislado del virus de las manchas en segmento FL, E.E.U.U. 40 anillo del maní RdRp/ L Tomate Florida 95/0137 HQ634678.1 Virus de la marchitez manchada del segmento cepa="BR-01 41 tomate RdRp/ L (CNPH1 Brasil NC 002052 Virus de las manchas cloróticas del segmento 42 tomate RdRp / L tomate Florida FL, E.E.U.U. HQ634680.1 Virus de las manchas cloróticas del segmento So/anum 43 tomate RdRp/ L lycopersicum Brasil HQ700667.1 Virus de las manchas cloróticas del segmento So/anum 44 tomate RdRp/ L lycopersicum FL, E.E.U.U. JX244205.1 Virus de las manchas cloróticas del segmento So/anum 45 tomate RdRp/ L lycopersicum FL, E.E.U.U. JX244203 Virus de las manchas cloróticas del segmento So/anum 46 tomate RdRp/ L lycopersicum E.E.U.U. FR692596 CUADRO 5 La secuencia de oliaonucleótidos de dsARN dirigidos a Tospovirus SEQ ID NO: Tipo Longi-tud Gen, Virus, Descripción 47 dsARN 101 gen N, Virus de las manchas en anillo del maní 48 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas en anillo del maní, protuberancia de 2NT en 3' 49 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas en anillo del maní, protuberancia de 2 NT en 3' 50 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas en anillo del maní , protuberancia de 2NT en 3' 51 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas en anillo del maní , protuberancia de 2NT en 3' 52 dsARN 100 gen N, Virus de la marchitez manchada del tomate 53 dsARN 47 gen N, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 54 dsARN 51 gen N, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 55 dsARN 51 gen N, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 56 dsARN 100 gen N, Virus de las manchas cloróticas del tomate 57 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 58 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 59 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 60 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 61 dsARN 47 gen N, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 62 dsARN 100 NSm, Virus de las manchas en anillo del maní +TCSV 63 dsARN 47 NSm, Virus de las manchas en anillo del maní +TCSV, protuberancia de 2NT en 3' NSm, Virus de las manchas en anillo del maní ; tramos largos de A/T's, 64 dsARN 47 protuberancia de 2NT en 3' 65 dsARN 47 NSm, Virus de las manchas en anillo del maní +TCSV, protuberancia de 2NT en 3' 66 dsARN 201 NSm, Virus de las manchas cloróticas del tomate +GRV NSm, Virus de las manchas cloróticas del tomate+GRV, protuberancia de 2NT en 67 dsARN 47 3' 68 dsARN 23 NSm, Virus de las manchas cloróticas del tomate+GRV NSm, Virus de las manchas cloróticas del tomate+GRV, protuberancia de 2 NT en 69 dsARN 51 3' 70 dsARN 150 NSm, Virus de la marchitez manchada del tomate 71 dsARN 47 NSm, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 72 dsARN 47 NSm, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 73 dsARN 47 NSm, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 74 dsARN 100 NSs, Virus de la marchitez manchada del tomate 75 dsARN 47 NSs, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 76 dsARN 47 NSs, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 77 dsARN 47 NSs, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 78 dsARN 47 NSs, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2 NT en 3' 79 dsARN 201 RdRp, Aislado del virus de las manchas en anillo del maní _ _ RdRp, Aislado del virus de las manchas en anillo del maní, protuberancia de 80 dsARN 47 2NT en 3' RdRp, Aislado del virus de las manchas en anillo del maní, protuberancia de 81 dsARN 47 2NT en 3' RdRp, Aislado del virus de las manchas en anillo del maní, protuberancia de 82 dsARN 47 2NT en 3’ 83 dsARN 201 RdRp, Virus de la marchitez manchada del tomate RdRp, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 84 dsARN 47 3' RdRp, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 85 dsARN 47 3' RdRp, Virus de la marchitez manchada del tomate, protuberancia de 2NT en 86 dsARN 47 3' 87 dsARN 201 RdRp, Virus de las manchas cloróticas del tomate 88 dsARN 47 RdRp, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2 NT en 3' 89 dsARN 47 RdRp, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2 NT en 3' 90 dsARN 47 RdRp, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 91 dsARN 100 Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate 92 dsARN 47 Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate, tramos largos de Ts, 93 dsARN 47 protuberancia de 2NT en 3' 94 dsARN 47 Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 95 dsARN 47 Nsm, Virus dejas manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 96 dsARN 47 Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 97 dsARN 47 Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' 98 dsARN 47 Nsm, Virus de las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' NSs, Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y del virus de 99 dsARN 201 las manchas cloróticas del tomate NSs, Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y del virus de 100 dsARN 47 las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' NSs, Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y del virus de 101 dsARN 47 las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' NSs, Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y del virus de 102 dsARN 47 las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' NSs, Reasortante del virus de las manchas en anillo del maní y del virus de 103 dsARN 47 las manchas cloróticas del tomate, protuberancia de 2NT en 3' _ _ EJEMPLO 8 Aplicación tópica de activadores de polinudeótidos para el control de otros virus de plantas comerciaimente relevantes en agricultura En el Cuadro 6 de este ejemplo, se utilizó un algoritmo informático comúnmente empleado para identificar regiones altamente conservadas en la proteína de cubierta (CP), la proteína de movimiento (MP), y en la proteína Supresora del Silenciamiento, de aislados de virus de plantas que son comercialmente relevantes en agricultura. Estos virus pueden ser de diferentes familias, tales como los Geminivirus (es decir, el virus de la hoja enrollada del algodón, el virus del enanismo amarillo de la cebada), o los Bromovirus (es decir, CMV), o los Potexvirus (es decir, PepMV). Los activadores identificados en el Cuadro 6 constituyen las SEQ ID NOs: 104-268 y pueden ser aplicados tópicamente con un agente de transferencia a plantas de tomate, o pimiento para analizar la eficacia contra la infección por los respectivos virus.
CUADRO 6 La secuencia de oliaonucleótidos de dsARN dirigidos a virus de importancia comercial _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i _ _ 109 dsARN 21 BYD CP overhanqs 110 dsARN 150 BYD. P__Conserved_Across_Strains_Blunt 111 dsARN 22 BYD_MP 112 dsARN 25 BYD_MP 113 dsARN 150 BYD_MP 114 dsARN 25 BYD MP 115 dsARN 25 BYD_MP 116 dsARN 150 BYD _ Silencinq_Suppressor 117 dsARN 25 BYD Silencin Suppressor 118 dsARN 21 BYD _ Silenc¡nq_Suppressor_Blunt 119 dsARN 25 BYD _ Silencing_Suppressor_Overhanq 120 dsARN 150 CMV_CP 121 dsARN 25 CMV_CP_Overhanq_Conserved_Across _Strains 122 dsARN 25 CM V CP _Overhanq_Conserved_Across_Strains 123 dsARN 25 CMV_CP_Conserved_Across_Strains 124 dsARN 150 CMV_CP 125 dsARN 150 CMV_Silencinq_Suppressor_Overhangs_Semi-Conserved_Across_Strains 126 dsARN 25 CMV _ Silencinq_Suppressor 127 dsARN 25 CMV _ Silendng_Suppressor_Overhangs_Conserved_Across_Strains 128 dsARN 25 CMV _ Silencing_Suppressor_Overhangs_Conserved_Across_Strains 129 dsARN 21 CMV _ Silencinq_Suppressor_Overhanqs 130 dsARN 25 CMV_MP_Overhanqs_Semi-Conserved_Across_Strains 131 dsARN 21 CMV_MP_Overhangs 132 dsARN 21 CMV_M P_Overhanqs 133 dsARN 21 CMV_MP_Overhangs 134 dsARN 21 CMV_MP_Overhanqs_Semi-Conserved_Across_Strains 135 dsARN 21 CMV_MP_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 136 dsARN 21 CMV_MP_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 137 dsARN 21 CMV_MP_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 138 dsARN 21 CMV_MP_Overhanqs 139 dsARN 150 CMV_MP_Overhangs 140 dsARN 150 CMV_MP_Overhangs 141 dsARN 25 CMV_I P_Overhanqs 142 dsARN 25 CMV MP Overhanqs 143 dsARN 25 CMV_M P_Overhangs 144 dsARN 25 CMV_MP_Overhangs 145 dsARN 21 CMV_MP_Overhangs 146 dsARN 150 PepMV_CP 147 dsARN 25 PepMV_CP Overhanqs Semi Conserved_Across Strains 148 dsARN 25 PepMV_CP_Overhanqs_SemLConserved_Across_Strains 149 dsARN 25 PepMV CP Overhanqs_Semi_Conserved Across Strains 150 dsARN 21 PepMV_CP 151 dsARN 21 Pep V_CP 152 dsARN 21 Pep V_CP 153 dsARN 150 PepMV_CP 154 dsARN 150 PepMV_MP 155 dsARN 150 Pep V_ P_Triple Gene Blockl_ 156 dsARN 25 PepMV MP_Triple Gene Blockl Overhanqs_Conserved_Across.. Strains 157 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Blockl_Overhangs_Conserved_Across_Strains 158 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Blockl_Overhangs_Conserved_Across_Strains 159 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Blockl_Overhanqs_Conserved_Across Strains 160 dsARN 21 PepMV MP Triple Gene Blockl_Overhangs_Conserved_Across_Strains 161 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Blockl_Overhangs_Conserved_Across_Strains 162 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Blockl_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 163 dsARN 150 PepMV_MP_Triple Gene Block2 164 dsARN 21 PepMV_ P_Triple Gene Block2_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 165 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Blgck2_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 166 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block2_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 167 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block2_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 168 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block2_Overhanqs_Conserved_Across_Strains 169 dsARN 150 PepMV_MP_Triple Gene Block2 170 dsARN 150 PepMV_MP_Triple Gene Block3 171 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block3_Overhanqs 172 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block3_Overhanqs 173 dsARN 21 Pep V_MP_Triple Gene Block3_Overhangs 174 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block3_Overhanqs 175 dsARN 150 Pep V_MP_Triple Gene Block3_Overhangs 176 dsARN 21 PepMV_MP_Triple Gene Block3_Overhanqs 177 dsARN 150 PepMV_MP Triple Gene Block3 178 dsARN 150 CuCLV_CP_Overhanqs_Conserved_across_Strains 179 dsARN 21 CuCLV_CP_Overhanqs_Conserved_across_Strains 180 dsARN 21 CuCLV_CP Overhanqs_Conserved_across_Strains 181 dsARN 21 CuCLV_CP_Overhangs_Conserved_across_Strains 182 dsARN 21 CuCLV_CP_Overhanqs_Conserved_across_Strains 183 dsARN 25 C CLV_CP_Overhanqs_Conserved_across_Strains 184 dsARN 21 CuCLV CP Overhanqs Cpnserved__across_Strains 185 dsARN 21 CuCLV_CP_Overhanqs_Conserved_across_Strains 186 dsARN 25 CuCLV_CP_Overhangs_Conserved_across_Strains 187 dsARN 21 CuCLV_CP_Overhanqs_Conserved_across_Strains 188 dsARN 150 CuCLV_Silendnq Suppressor 189 dsARN 21 CuCLV_Silencinq Suppressor_Overhanqs 190 dsARN 21 CuCLV_Silencipq Suppressor_Overhanqs 191 dsARN 21 CuCLV Silencinq Suppresspr_Overhanqs 192 dsARN 21 CuCLV_Silencinq Suppressor_Overhanqs 193 dsARN 21 CuCLV_Silencinq Suppressor_Overhangs 194 dsARN 21 CuCLV_Silencinq Suppressor_Overhanqs 195 dsARN 21 CuCLV_Silencinq Suppressor_Overhanqs 196 dsARN 150 CuCLV_MP_Overhanq_Conserved_Across_Strains 197 dsARN 21 CuCLV_M P_Overhanq 198 dsARN 21 CuCLV_MP_Overhang 199 dsARN 21 CuCLV_MP_Overhang_Conserved_Across_Strains 200 dsARN 21 CuCLV_MP_Overhanq_Conserved_Across_Strains 201 dsARN 21 CuCLV_MP_Overhanq_Conserved_Across_Strains 202 dsARN 21 CuCLV_MP_Overhanq _Conserved_Across_Strains 203 dsARN 21 CuCLV_MP_Overhanq_Conserved Across_Strains 204 dsARN 25 CuCLV_MP .Conserved_Across_Strains 205 dsARIM 150 TYLCV. CP 206 dsARN 21 TYLCV. _CP_ Overhanqs 207 dsARN 21 TYLCV. _CP_Overhangs 208 dsARN 21 TYLCV _CP_Overhangs 209 dsARN 21 TYLCV _CP_Overhangs 210 dsARN 21 TYLCV. _CP_Overhangs 211 dsARN 21 TYLCV _CP_Overhangs 212 dsARN 21 TYLCV. _CP_Overhangs 213 dsARN 150 TYLCV. CP 214 dsARN 150 TYLCV CP 215 dsARN 21 TYLCV. _CP_Overhanqs 216 dsARN 150 TYLCV. _MP 217 dsARN 21 TYLCV. _MP_Overhanqs_Conserved 218 dsARN 21 TYLCV. _MP_Overhangs_Conserved 219 dsARN 21 TYLCV. _MP_Overhangs_Conserved 220 dsARN 21 TYLCV _MP_Overhanqs_Conserved 221 dsARN 21 TYLCV. _MP_Overhanqs_Conserved 222 dsARN 21 TYLCV. _MP_Overhangs_Conserved 223 dsARN 21 TYLCV. _MP_Overhangs_Conserved 224 dsARN 150 TYLCV. .Silencing Suppressor_C2 225 dsARN 21 TYLCV .Silencing Suppressor_C2_Overhangs 226 dsARN 21 TYLCV. .Silencing Suppressor_C2_Overhangs 227 dsARN 21 TYLCV .Silencing Suppressor_C2_Overhangs 228 dsARN 21 TYLCV .Silencing Suppressor_C2_Overhanqs 229 dsARN 21 TYLCV. .Silencing Suppressor_C2_Overhangs 230 dsARN 21 TYLCV. .Silencing Suppressor_C2_Over angs 231 dsARN 21 TYLCV. .Silencing Suppressor_C2_Overhangs 232 dsARN 150 TYLCV .Silencing Suppressor_C2 233 dsARN 150 WSMV. .CP 234 dsARN 21 WSMV CP Overhangs 235 dsARN 21 WSMV _CP_Overhanqs 236 dsARN 21 WSMV ,CP_Overhangs_ 237 dsARN 21 WSMV. _CP_Overhangs 238 dsARN 21 WSMV. .CP_Overhangs 239 dsARN 21 WSMV. _CP_Overhangs 240 dsARN 21 WSMV. _CP_Overhangs 241 dsARN 150 WSMV. CP 242 dsARN 150 WSMV CP 243 dsARN 21 WSMV CP Overhangs 244 dsARN 21 WSMV_CP_Overhangs 245 dsARN 21 WSMV_CP_Overhangs 246 dsARN 21 WSMV_CP_Overhangs 247 dSARN 21 WSMV_CP_Overhangs 248 dsARN 21 WSMV_CP_Overhangs 249 dsARN 21 WSMV_CP_Overhangs 250 dsARN 25 WSMV_CP_Blunt 251 dsARN 150 WSMV_Nia_Vpg 252 dsARN 21 WSMV_Nia_Vpg_Overhanq 253 dsARN 21 WSMV_Nia_Vpg_Overhang 254 dsARN 21 WSMV Nia Vpq Overhanq 255 dsARN 21 WSMV_Nia_Vpg_Overhang 256 dsARN 150 WSMV Nia Vpg 257 dsARN 25 WSMV_Nia_Vpg_Overhang 258 dsARN 21 WSMV_Nia_Vpq_Overhang 259 dsARN 150 WSMV_Nia_Pro_Overhang 260 dsARN 21 WSMV_Nia_Pro_Overhang 261 dsARN 21 WSMV_Nia_Pro_Overhang 262 dsARN 150 WSMV_N¡a_Pro_Overhang 263 dsARN 21 WSMV_N¡a_Pro_Oyerhang 264 dsARN 150 WSMV Nia Pro 265 dsARN 21 WSMV_Nia_Pro_Overhang 266 dsARN 25 WSMV_Nia_Pro_Overhang 267 dsARN 21 WSMV Nia Pro Overhang 268 dsARN 21 WSMV_Nia_Pro_Overhang EJEMPLO 9 Aplicación tópica de activadores de polinucleótidos para el control del virus mosaico de las cucurbitáceas En este ejemplo, las secuencias de la Proteína de Cubierta (CM) Proteína de movimiento (MP) o Supresor del Sllenciamiento (S) para diferentes virus mosaico de las cucurbitáceas fueron identificadas y pueden observarse en el Cuadro 7. La aplicación tópica de secuencias de ADN o dsARN antisentido ss derivadas de las secuencias enlistadas (SEQ ID NOs: 269-316) se realizará en plantas de pimiento infectadas por el virus mosaico de las cucurbitáceas (CMV, por sus siglas en inglés) usando un reactivo de transferencia y las plantas recibirán un puntaje por análisis ELISA y evaluación visual para la reducción de los síntomas.
CUADRO 7 Secuencias de en el virus mosaico de las cucurbitáceas (CMV) SEQ ID NO: Secuencia ID Aislado Gen 269 CMV GenCP-N 270 AB004780 KM Japón GenCP-N 271 D10538 Fny E.E.U.U. (NY GenCP-N 272 D00462 C E.E.U.U. (NY GenCP-N 273 136251 Kor Corea GenCP-N 274 U66094 Israel GenCP-N 275 U22821 Ny Australia GenCP-N 276 D28487 FT Japón GenCP-N 277 D10544 FC E.E.U.U. GenCP-N 278 AJ890464 Lirio Oriental (Expresión) OL India GenCP-N 279 AJ831578 U India GenCP-N 280 AJ890465 Lt India GenCP -N 281 D42079 C7-2 Gen CP-N 282 A1271416 2A1-A E.E.U.U. GenCP-N 283 AF013291 As Corea GenCP-N 284 Y16926 Tfn Italia GenCP-N 285 AB042294 IA-3a GenCP-N 286 D28780 NT9 Taiwán GenCP-N 287 U31220 Banana en Hawaii Oahu E.E.U.U. GenCP-N 288 D49496 Tai Taiwán GenCP-N 289 X89652 India GenCP-N 290 AF281864 D India GenCP-N 291 AF350450 H India GenCP-N 292 L15336 Trk7 GenCP-N 293 M21464 Australia GenCP-N 294 AF063610 S E.E.U.U. GenCP-N 295 AF127976 LS E.E.U.U. GenCP-N 296 U10923 Spinacia olerácea SP103 E.E.U.U. GenCP-N 297 AB006813 m2 Japón GenCP-N 298 U22822 Sn Australia GenCP-N 299 L40953 Wem Desconocido GenCP-N 300 A3585086 AL India GenCP-N 301 FN555197 Capsicum sp AN India Gen Supresor - 2b 302 CN04 China Gen Supresor - 2b 303 FN555199.1 Capsicum sp KS44 Tailandia Gen Supresor - 2b 304 FN555200 Capsicum sp P522 China Gen Supresor - 2b 305 P3613 China _ Gen Supresor - 2b 306 Calabaza de semilla Gen Supresor - 2b 307 aj517801 Raphanus sativus Gen Supresor - 2b 308 ay827561 Paprika Gen Supresor - 2b 309 jq074218 So/anum lycopersicum Gen Supresor - 2b 310 EU432184.1 CMV-NEP MP 311 EU432178.1 CMV-ANC MP 312 JF918963.1 MP l 314 EU414791.1 tabaco CMV-RZ China MP 315 JF918961.1 Nl-03 E.E.U.U.: Ohio MP 316 JN 593378 PhA Italy Italia MP_ EJEMPLO 10 Aplicación tópica de activadores de polinucleótidos para el control de la infección por virus mosaico del pepino En este ejemplo, las secuencias de la Proteína de Cubierta (CM) y la Proteína de movimiento (MP) para diferentes aislados del virus mosaico del pepino fueron identificadas y pueden verse en el Cuadro.8. La aplicación tópica de secuencias de ADN ss antisentido o dsARN derivadas de las secuencias enlistadas (SEQ ID NOs: 317-349) se llevará a cabo en plantas de tomate infectadas por el virus mosaico del pepino (PepMV, por sus siglas en inglés) usando un reactivo de transferencia y las plantas recibirán un puntaje por el análisis ELISA y evaluación visual para la reducción de los síntomas.
CUADRO 8 Secuencias de genes objetivo en el virus mosaico del pepino f RQRMIP SEQ ID Secuencia NO: ID Huesped Cepa Aislado Gen 317 OriqnaLfile CP 714 318 FJ820177.1 So/anum lycopersicum CP 714 319 FJ820182.1 So/anum lycopersicum CP 597 320 FJ384784.1 Lycopersicon escu/entum CP 702 321 FN429033 So/anum lycopersicum PV-0554 CP 693 322 AM040187 Lycopersicon escu/entum Mu 04.12 CP 488 323 FJ263316.1 So/anum lycopersicum PMU05/5 España MP; Bloque de Triple Genes 1 708 324 FJ263326.1 So/anum lycopersicum PMU08/47 España MP; Bloque de Triple Genes 1 705 325 GQ438737.1 So/anum lycopersicum Al 2-01 España MP; Bloque de Triple Genes 1 705 326 FJ263325.1 So/anum lycopersicum PMU08/42 España MP; Bloque de Triple Genes 1 705 327 FJ384784.1 Lycopersicon escu/entum aislado 4988 España MP; Bloque de Triple Genes 1 705 328 AM041982.1 Lycopersicon escu/entum aislado 1 _ España ¡Murcia MP; Bloque de Triple Genes 1 705 329 AM041968 Lycopersicon escu/entum aislado 1 España ¡Murcia MP; Bloque de Triple Genes 1 705 330 AM041967.1 Lycopersicon escu/entum aislado 1 España:Murcia MP; Bloque de Triple Genes 1 705 331 AM041956.1 Lycopersicon escu/entum Mu 03.2 España ¡Murcia MP; Bloque de Triple Genes 1 705 332 AM041955.1 Lycopersicon escu/entum Mu 03.1 España ¡Murcia MP; Bloque de Triple Genes 1 705 333 AM041952.1 Lycopersicon escu/entum Al 01.1 España ¡Alicante MP; Bloque de Triple Genes 1 706 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 334 FJ263323.1 Solanum lycopersicum PMU08/38 España 372 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 335 FJ263322.1 So/anum lycopersicum PMU07/36 España (TGBp2) 372 aislado de virus MP; Proteína de bloque de triple genes 2 336 FJ820184.1 So/anum lycopersicum 4911 España (TGBp2) 373 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 337 FJ820181 Solanum ¡ycopersicum aislado 7156 España (TGBp2) 373 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 338 FJ820176 Solanum ¡ycopersicum aislado 5577 (TGBp2) 373 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 339 FJ820174.1 Solanum ¡ycopersicum aislado 4983 España (TGBp2) 372 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 340 GU 130080.1 Solanum I ycopersicum aislado CI-05 España (TGBp2) 372 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 341 GQ438737.1 Solanum ¡ycopersicum Al 2-01 España (TGBp2) 372 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 342 FJ263320.1 Solanum ¡ycopersicum PMU07/27 España 372 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 343 FJ263317.1 Solanum ¡ycopersicum PMU06/17a España (TGBp2) 372 MP; Proteína de bloque de triple genes 2 344 AM041992.1 Lycopersicon escu/entum aislado 1 España (TGBp2) 372 345 FJ820184.1 Solanum ¡ycopersicum aislado 4911 España MP; Proteína de bloque de triple genes 3 255 346 FJ263325 Solanum I ycopersicum PMU08/42 España MP; Proteína de bloque de triple genes 3 255 347 FJ820174 Solanum I ycopersicum aislado 4983 España MP; Proteína de bloque de triple genes 3 255 aislado 4910- 348 FJ820173.1 Solanum ¡ycopersicum 10 MP; Proteína de de triple genes 3 255 349 GQ438737.1 Solanum I ycopersicum Al2-01 España MP; Proteína de de triple genes 3 715 EJEMPLO 11 Aplicación tópica de activadores de polinudeótidos para el control de la infección por Virus del enanismo amarillo de la cebada ( BYDVJ En este ejemplo, las secuencias de la Proteína de Cubierta (CM), Proteína de movimiento (MP), y Supresor del Silendamlento (SS) para dlfetentes aislados del virus del enanismo amarillo de la cebada fueron identificadas y son expuestas en el Cuadro 9. La aplicación tópica de secuencias de ssADN o dsARN antisentido derivadas de las secuencias enlistadas (SEQ ID NOs: 350-385) puede llevarse a cabo en plantas de cebada infectadas por BYDV usando un reactivo de transferencia y las plantas pueden recibir un puntaje por análisis ELISA y evaluación visual para determinar la reducción de los síntomas.
CUADRO 9 Secuencias de genes objetivo en el virus del enanismo amarillo de la cebada fBYDVI SEQ ID NO: Secuencia ID Cepa Aislado Gen Longitud 350 Archivo_Oriqinal CP-P3 y MP P4 (superpuestos) 603 351 BYDPCT CP 605 352 JX402456.1 B-Keb Túnez: Kebili CP - P3, CDS parcial 531 353 3X402454.1 B-Bej2 Túnez: Beja CP - P3, CDS parcial 532 354 HM488005 Jordania CP - P3, CDS parcial 139 355 EF408184.1 MAV LMB2a CP - P3, CDS parcial 593 356 EU332334.1 Aislado PAV 06WH1 CP - P3, CDS parcial 600 357 EU332332.1 Aislado PAV 06 KM 14 CP - P3, CDS parcial 603 358 EU332330.1 Aislado PAV 05ZZ12 CP - P3, CDS parcial 600 359 EU332328.1 Aislado PAV 05ZZ9 CP - P3, CDS parcial 600 360 EU332326.1 Aislado PAV 05ZZ6 CP - P3, CDS parcial 600 361 EU332320.1 Aislado PAV 05ZZ1 CP - P3, CDS parcial 600 362 HM488005.1 SGV CP - P3, CDS parcial 139 363 GU002361 BYDV-MAV-OA1 Nueva Zelanda: Lincoln CP - P3, CDS parcial 501 364 GU002328 BYDV-PAV-OA4 Nueva Zelanda: Lincoln CP - P3, CDS parcial 502 365 GU002324.1 BYDV-PAS-DC2 Nueva Zelanda: Lincoln CP - P3, CDS parcial 412 366 GU002322.1 BYDV-MAV-WC5 Nueva Zelanda: Lincoln CP - P3, CDS parcial 412 367 GU002360.1 BYDV-MAV-OILU Nueva Zelanda: Lincoln CP - P3, CDS parcial 502 368 GU002329.1 BYDV-PAV-PC3 Nueva Zelanda: Lincoln CP - P3, CDS parcial 490 369 GU002325.1 BYDV-PAV-327 CP - P3, CDS parcial 502 370 EF408184.1 CP - P3, CDS parcial 593 371 EF408180.1 aislado MAV Sl-o4 CP - P3, CDS parcial 593 372 AF235167.1 CP - P3, CDS parcial 603 373 ABR26505 CP - P3, CDS parcial 596 374 AAZ93695. UCD2-PAV EEUU:California MP-P4 462 375 EF408167.1 PAV simlQ-2 Nueva Zelanda :Coromandel MP-P4 462 376 EF408166.1 PAV simlO-1 Nueva Zelanda:Coromandel MP-P4 462 377 AY855920.1 PAV-CN China MP-P4 462 378 GU002330.1 BYDV-PAV-WC2 Nueva Zelanda:Lincoln MP-P4 400 379 X07653.1 Supresor del silenciamiento, P6 192 380 EF521828.1 Supresor del silenciamiento, P6 126 381 AJ007492.1 Supresor del silenclamiento, P6 129 382 EU332332.1 05GG2 China:Ganqu Supresor del silenciamiento, P6 129 383 EF521850.1 Aislado PAV 064 EEUU:Alaska Supresor del silenciamiento, P6 120 384 EU332335.1 ChinaiZhenqzhou Supresor del silenciamiento, P6 123 385 EF521849.1I PAV 0102 _ EEUU California Supresor del silenciamiento, P6 87 EJEMPLO 12 Aplicación tópica de activadores de polinucleótidos para el control de la infección por el virus de la hoia enrollada amarilla del tomate En este ejemplo, las secuencias de la Proteína de Cubierta (CM), Proteína de movimiento (MP), y Proteína complemento (C2) para diferentes aislados del virus de la hoja enrollada amarilla del tomate fueron identificadas y están expuestas en el Cuadro 10. La aplicación tópica de secuencias de ssADN o dsARN antisentido derivadas de las secuencias enlistadas (SEQ ID NOs: 386-421) puede llevarse a cabo en plantas de tomate infectadas por TYLCV usando un reactivo de transferencia y las plantas recibieron un puntaje por análisis ELISA y evaluación visual para determinar la reducción de los síntomas.
CUADRO 10 Secuencias de genes objetivo en el virus de la hoia enrollada amarilla del tomate (TYCLV) SEQ ID Secuencia NO: ID Huésped Cepa Aislado Gen Nota 386 AJ519441.1 CP 387 JX075187.1 Corea del Sur CP 388 HM856915.1 CP 389 HM856913.il CP 390 EF210554.1 Arizona CP 391 AB116631.1 Stel/aría aquatica TYLCV-I L[ J R : M is : Ste] Japón CP 392 L27708.1 Almería España CP 393 X15656.1 CP 394 X61153.1 CP e 'ni 395 X76319.1 CP 396 GU723744.1 Tailandia CP 397 EF110890.1 Lycopersicon esculentum E.E.U.U.: Texas CP_ 398 HE603246.1 So!anum lycopersicum Nueva Caledonia:Quvea:2010 Israel P 399 H 14448447.1 Solanum lycopersicum Mauricio MP 400 EU143754.1 Calabaza Jordania MP 401 AJ842308.1 Saint Gilíes _ MP 402 AJ842307.1 Saint Gilíes MP. 403 EU143745.1 Pepino Jordania MP 404 AM409201.1 Solanum lycopersicum Reunion:Saint-Gilles les Hauts MP 405 JX456639.1 KYCT0I8 _ China MP 406 JN183880.1 Andong 2 Corea del Sur: Andong MP 407 FR851297.1 Israel MP 408 HM856914.1 Gwanqyanq 6 MP 409 HM856912.1 Corea del Sur: Gunwi MP 410 GU348995.1 Solanum /ycopersicum China: Hebei _ _ MP 411 EF490995.1 So/anum / ycopersicum Martinica MP 412 EF110890.1 Lycopersicon esculentum E.E.U.U.: Texas 413 DQ144621.1 Lycopersicon esculentum Italia: Sicilia C2 Complemento 414 AB116632 Lycopersicon esculentum Japón C2 Complemento 415 AB110218.1 Israel C2 Complemento 416 GU325634.1 Lycopersicon esculentum Corea del Sur: Boseong C2 Complemento 417 EU143745.1 Pepino Jordania: Homrat Al-Sahen C2 Complemento 418 GU178814 Soianum I ycopersicum Australia : Brisbane2 : 2006 C2 Complemento 419 EF523478.1 Méjico C2 Complemento 420 EF433426.1 pepino Jordania C2 Complemento 421 EF110890 Lycopersicon esculentum EEUU: Texas C2 Complemento EJEMPLO 13 Aplicación tópica de activadores de polinucleótidos para el control de la infección por el virus de la hoia enrollada del ala dón ÍCLCuV En este ejemplo las secuencias de la Proteína de Cubierta (CM), Proteína de movimiento (I P) y la proteína AC2 para diferentes aislados del virus de la hoja enrollada del algodón fueron identificadas y pueden observarse en el Cuadro 11. La aplicación tópica de secuencias de ADN ss antisentido o dsARN derivadas de las secuencias enlistadas (SEQ ID NOs: 422-447) se llevará a cabo en plantas de algodón Infectadas por CLCuV usando un reactivo de transferencia y las plantas recibirán un puntaje por análisis ELISA y evaluación visual para determinar la reducción de los síntomas.
CUADRO 11 Secuencias de genes objetivo en el virus de la hoja enrollada del algodón (CLCuV) SEQ ID NO: Secuencia ID Huésped Aislado Gen longitud 422 EF057791.1 Virus de la hoja enrollada del algodón CP 771 423 3N558352.1 papaya Virus de la hoja enrollada del algodón CP 771 424 FJ218487.1 Gossypium hirsutum Virus de la hoja enrollada del algodón CP 771 425 AF521594.1 Virus de la hoja enrollada del algodón India: Hisar CP 771 426 AY765254 Virus de la hoja enrollada del algodón India: Sirsa, Haryana CP 771 427 3X914662.1 CP 771 428 EF465535.1 Hibiscus rosa-sinensis CP 771 429 FJ159268.1 Hibiscus cannabinus Amada!avalasa:Sur de India CP 771 430 JX286658.1 Hibiscus rosa-sinensis China CP 772 431 JN968573.1 Hibiscus rosa-sinensis China: Guangdong CP 771 s o> 432 GU574208.1 Okra China CP 771 433 GU112008.1 Abelmoschus escuientus (okra) India: Karnal, Haryana CP 771 434 AJ002455.1 CP 771 435 AJ002455.1 Pakistán CP 771 436 JX286660 Hibiscus rosa-sinensis China CP 771 437 HQ455367.1 Hibiscus rosa-sinensis (Malvarrosa) China CP 771 438 EU384573 Gossypium hirsutum subsp. Latifoiium Pakistán: Multan CP 772 439 AJ002458.1 Virus Multan del enrollado de la hoja del aigodón-[26] Pakistán CP 772 440 AY028808.1 India MP 359 441 AF363011.1 MP 358 442 HM235774.1 Gossypium hirsutum India ~MP 358 443 AY028808.1 India MP 357 444 AY146959.1 India MP 358 445 AY146960.1 MP 357 446 AY146957.1 India: Sirsa MP 367 447 HM037923.1 Gossypium hirsutum Sirsa-Haryana-En(P) AC2 454 EJEMPLO 14 Aplicación tópica de dsARN oliaonucleótídos to pepper plants for control of Virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) En este ejemplo, se inocularon plantas de pimiento en crecimiento {c.v. Yolo Wonder B ) con el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV), un virus de ssARN de hebra negativa, y las plantas se separaron en diferentes grupos. El grupo experimental fue tratado tópicamente con una composición líquida que contenía por lo menos un polinucleótido de dsARN que comprende una secuencia de aproximadamente 100 pb que es homologa a un transcripto del gen de la nucleocápside (N), supressor (NSs) o del movimiento (NSm) de TSWV y su complemento. Las secuencias de la hebra sentido de las moléculas activadoras empleadas en los experimentos mostradas en este ejemplo se muestran en el Cuadro 12.
CUADRO 12 Polinucleótidos de dsARN dirigidos a transcriptos del gen de la nucleocápside (NI, supresor fNSs o del movimiento fNSmj de TSWV Las plantas se sembraron en una cámara de crecimiento [22°C, ciclos de 8 horas de luz (~50 pmol), 16 horas de oscuridad] y se transfirieron a un invernadero un par de días antes del tratamiento. Se utilizaron en este ensayo plantas de pimiento en la etapa de 2-5 hojas totalmente expandidas. El armado del experimento consistió en entre 20-24 plantas por tratamiento. Los tratamientos consistieron en: (a) controles sanos (sin infección viral), (b) control solo con virus (sin solución de polinucleótidos), (c) formulación solamente (sin polinucleótidos), o (d) aplicación experimental con solución activadora de polinucleótido/SIlwet L-77 que comprende una molécula activadora seleccionada de la lista de SEQ ID NOs: 448-483 luego de la infección viral. La Infección viral se llevó a cabo usando una téenica de inoculación mecánica estándar y usando el virus de la marchltez manchada del tomate (TSWV) o el virus mosaico de las cucurbitáceas (CMV), un virus de ARN de hebra positiva no relacionado con TSWV. La concentración final utilizada para cada polinucleótldo de dsARN fue entre 14.2-15.15 pmol/planta (en 0.1% Silwet L-77, sulfato de amonio 2%, buffer de fosfato de sodio 5 mM, pH 6.8). Mil mlcrolitros de la solución de polinucleótido /Silwet L-77 se aplicó usando un cepillo de aire (Badger 200G) a 68 kPa (10 psi) a cada grupo de plantas. Las plantas fueron dispuestas en el invernadero siguiendo un diseño de bloques completo al azar y fueron monitoreadas visualmente para determinar el desarrollo de los síntomas. El análisis de la altura de las plantas y ELISA ambos se llevaron a cabo a los 32 días post-infección (32 DPI). El análisis ELISA se llevó a cabo sobre extractos de sobrenadante de control y perforaciones de tejidos de hojas sistémicos usando un anticuerpo contra la proteína de la nucleocápslde (N) de TSWV. El experimento se repitió dos veces (véanse los Cuadros 13-17).
CUADRO 13 Experimento 1: Mediciones de la altura de las plantas a 32DPI del tratamiento con oolinucleótidos de dsARN *Los niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes.
CUADRO 14 Experimento 1: Análisis estadístico de las secuencias activadoras de rendimiento en comparación con los controles Las plantas tratadas con la secuencia activadora de polinucleótidos T25748 correspondiente a SEQ ID NO: 448 en el gen de la nucleocápside (N) del TSWV eran significativamente más altas que las plantas tratadas con otros polinucleótidos. Esto es también mostrado en las FIGS. 12A y 12B que muestra una representación gráfica de estos resultados.
CUADRO 15 Experimento 1: Análisis ELISA a 32 DPI dei tratamiento con de dsARN CUADRO 16 Experimento 2: Mediciones de la altura de las plantas a 32DPI del tratamiento con polinucleótidos de dsARN *Los niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes.
En este experimento, el tratamiento con la secuencia activadora T25748 (SEQ ID NO: 448) fue el del mejor rendimiento del grupo "BC". La FIG. 13 muestra una presentación gráfica de los resultados de este experimento.
CUADRO 17 Experimento 2: Análisis ELISA a 32DPI del tratamiento con de dsARN

Claims (60)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1.- Un método para el tratamiento o la prevención de una infección por Tospovirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, en donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o un compuesto contenido en la misma.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha composición comprende más de un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética de Tospovirus esencial, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética de Tospovirus esencial, o su fragmento.
4.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-12 o su fragmento.
5.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en el virus mosaico necrótico de la haba, el virus de la clorosis del pimiento, el virus de la necrosis del brote del maní, el virus de las manchas en anillo del maní, el virus de las manchas amarillas del maní, el virus de las manchas necróticas del impatiens, el virus de las manchas amarillas en la cebolla, el virus de las manchas amarillas del melón, el virus de necrosis del brote del maní, el virus de las manchas amarillas del maní, el virus asociado a la necrosis venosa de la soja, el virus de las manchas cloróticas del tomate, el virus de las manchas en anillos necróticas del tomate, el virus de la marchitez manchada del tomate, el virus de mancha zonada del tomate, el virus de la necrosis del brote de la sandía, el virus de las manchas plateadas de la sandía, y el virus de la clorosis letal del calabacín.
6.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho gen de Tospovirus esencial se selecciona del grupo que consiste en el gen de la nucleocápside (N), el gen de la proteína de cubierta (CP), los factores de virulencia NSm y NSs, y el segmento L de la polimerasa de ARIM dependiente de ARN (segmento RdRp/L).
7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
8.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo, o es aplicada a la superficie de la planta como ADN encapsulado en matriz.
9.- Una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, en donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y en donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
11.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho agente de transferencia es una composición de organosilicona.
12.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-12.
13.- Un método para reducir la expresión de un gen esencial del Tospovirus que comprende poner en contacto una partícula de Tospovirus con una composición que comprende un polinucleótido de ADN de una sola hebra antlsentido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Tospovirus o un transcripto de ARN del mismo, en donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1-12 o su fragmento.
17.- Un método para identificar polinudeótidos de ADN de una sola hebra antisentido útiles para modular la expresión del gen del Tospovirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinudeótidos de ADN de una sola hebra antisentido que comprenden una región complementaria a todo o parte de un gen esencial del Tospovirus o a su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos polinudeótidos de ADN de una sola hebra antisentido y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Tospovirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido capaz de modular los síntomas o la aparición de la infección por Tospovirus.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
19.- Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido y un pesticida, en donde dicho polinucleótido de ADN de una sola hebra antisentido es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a su transcripto de ARN, en donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y en donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
20.- La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque dicho pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopestlcidas.
21.- Un método para el tratamiento o prevención de una infección por Tospovirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, en donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
22.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o un compuesto contenido en la misma.
23.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicha composición comprende más de un polinucleótido de ARN de doble hebra complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética de Tospovirus esencial, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética de Tospovirus esencial, o su fragmento.
24.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho polinucleótido de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 47-103 o su fragmento.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en el virus mosaico necrótico de la haba, el virus de la clorosis del pimiento, el virus de la necrosis del brote del maní, el virus de las manchas en anillo del maní, el virus de las manchas amarillas del maní, el virus de las manchas necróticas del impatiens, el virus de las manchas amarillas en la cebolla, el virus de las manchas amarillas del melón, el virus de necrosis del brote del maní, el virus de las manchas amarillas del maní, el virus asociado a la necrosis venosa de la soja, el virus de las manchas cloróticas del tomate, el virus de las manchas en anillos necróticas del tomate, el virus de la marchitez manchada del tomate, el virus de mancha zonada del tomate, el virus de la necrosis del brote de la sandía, el virus de las manchas plateadas de la sandía, y el virus de la clorosis letal del calabacín.
26.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho gen esencial del Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en el gen de la nucleocápside (N), el gen de proteína de cubierta (CP), los factores de virulencia NSm y NSs, y el segmento L de la polimerasa de ARN dependiente de ARN (segmento RdRp/L).
27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho gen esencial del Tospovirus se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicha composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo, o es aplicada a la superficie de la planta como ARN encapsulado en la matriz.
29.- Una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a un transcripto de ARN de la misma, en donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y en donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
30.- La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
31.- La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho agente de transferencia es una composición de organosilicona.
32.- La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho polinucleótido de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 47-103.
33.- Un método para reducir la expresión de un gen esencial del Tospovirus que comprende poner en contacto una partícula de Tospovirus con una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Tospovirus o a un transcripto de ARN del mismo, en donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13-46.
35.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
36.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho polinucleótido de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 47-103 o su fragmento.
37.- Un método para identificar un polinucleótido de ARN de doble hebra útil para modular la expresión del gen del Tospovirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de ARN de doble hebra que comprenden una región complementaria a todo o parte de un gen esencial del Tospovirus o su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos polinucleótidos de ARN de doble hebra y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Tospovirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ARN de doble hebra capaz de modular los síntomas o la aparición de la infección por Tospovirus.
38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
39.- Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ARN de doble hebra y un pesticida, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Tospovirus o a su transcripto de ARN, en donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y en donde los síntomas de la infección por Tospovirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
40.- La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque dicho pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopesticidas.
41.- Un método para el tratamiento o prevención de una infección por Geminivirus en una planta que comprende: aplicar tópicamente a dicha planta una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus, o a su transcripto de ARN, en donde los síntomas de infección viral o desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
42.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es una composición surfactante de organosilicona o un compuesto contenido en la misma.
43.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicha composición comprende más de un polinucleótido de ARN de doble hebra complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminivirus, un transcripto de ARN de dicha secuencia genética esencial del Geminivirus, o su fragmento.
44.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho polinucleótido de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-268 o su fragmento.
45.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho Geminivirus se selecciona del grupo que consiste en el virus del enanismo amarillo de la cebada, el virus mosaico de las cucurbitáceas, el virus mosaico del pepino, el virus de la hoja enrollada del algodón, el virus de la hoja enrollada amarilla del tomate, el virus mosaico dorado del tomate, el virus mosaico amarillo de la papa, el virus de la hoja enrollada del pimiento, el virus mosaico dorado del poroto, el virus mosaico dorado del poroto, el virus del moteado del tomate.
46.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho gen de Geminivirus esencial se selecciona del grupo que consiste en el gen de la nucleocápside (N), un gen de proteína de cubierta (CP), factores de virulencia NSm y NSs, y segmento L de la poiimerasa de ARN dependiente de ARN (segmento RdRp/L), un gen supresor del silenciamiento, proteína de movimiento (MP), Nia, CP-N, un bloque de genes triples, CP-P3, MP-P4, C2, y AC2.
47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque dicha secuencia de gen esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447.
48.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicha composición es aplicada tópicamente por pulverización, espolvoreo, o es aplicada a la superficie de la planta como ARN encapsulado en la matriz.
49.- Una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminlvirus, tal como una expuesta como SEQ ID NOs: 269-447, o su transcripto de ARN, en donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y en donde los síntomas de la infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
50.- La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447.
51.- La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque dicho agente de transferencia es una composición de organosilicona.
52.- La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque dicho polinucleótido de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 104-268.
53.- Un método para reducir la expresión de un gen de Geminlvirus esencial que comprende poner en contacto una partícula de Geminivirus con una composición que comprende un polinucleótido de ARN de doble hebra y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial en dicho Geminlvirus o a su transcripto de ARN, en donde los síntomas de la infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
54.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicha secuencia genética esencial se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 269-447.
55.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
56.- El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho polinucleótido de ARN de doble hebra se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 104-268 o su fragmento.
57.- Un método para identificar un polinucleótido de ARN de doble hebra útil para modular la expresión del gen del Geminlvirus cuando se trata tópicamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de ARN de doble hebra que comprende una región complementaria a la totalidad o una parte de un gen esencial del Geminivirus o su transcripto de ARN; b) tratar tópicamente dicha planta con uno o más de dichos polinucleótidos de ARN de doble hebra y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para la modulación de los síntomas de la infección por Geminivirus; y d) seleccionar un polinucleótido de ARN de doble hebra capaz de modular los síntomas o la aparición de la infección por Geminivirus.
58.- El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicona.
59.- Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido de ARN de doble hebra y un pesticida, en donde dicho polinucleótido de ARN de doble hebra es complementario a la totalidad o a una porción de una secuencia genética esencial del Geminlvirus o a su transcripto de ARN, en donde dicha composición es aplicada tópicamente a una planta y en donde los síntomas de infección por Geminivirus o el desarrollo de los síntomas son reducidos o eliminados en dicha planta con relación a una planta que no es tratada con dicha composición cuando se cultiva bajo las mismas condiciones.
60.- La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada además porque dicho pesticida se selecciona del grupo que consiste en compuestos antivirales, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, esterilizantes químicos, semioquímicos, repelentes, sustancias atrayentes, feromonas, estimuladores de la alimentación, y biopesticidas.
MX2015004792A 2012-10-16 2013-10-16 Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas. MX360305B (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261714733P 2012-10-16 2012-10-16
US201361786032P 2013-03-14 2013-03-14
PCT/US2013/065193 WO2014062775A2 (en) 2012-10-16 2013-10-16 Methods and compositions for controlling plant viral infection

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2015004792A true MX2015004792A (es) 2015-08-14
MX360305B MX360305B (es) 2018-10-26

Family

ID=50488887

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2015004792A MX360305B (es) 2012-10-16 2013-10-16 Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas.
MX2017012100A MX375641B (es) 2012-10-16 2013-10-16 Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2017012100A MX375641B (es) 2012-10-16 2013-10-16 Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas.

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20150313238A1 (es)
EP (1) EP2909322A4 (es)
CN (2) CN104822833A (es)
AR (1) AR093032A1 (es)
BR (1) BR112015008593A2 (es)
CA (1) CA2887349A1 (es)
HK (1) HK1214295A1 (es)
IN (1) IN2015DN04085A (es)
MX (2) MX360305B (es)
WO (1) WO2014062775A2 (es)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104513812B (zh) * 2014-11-10 2017-05-24 浙江大学 分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN104846005B (zh) * 2015-03-02 2018-04-17 福建农林大学 利用人工合成mv3序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法
EP3302053B1 (en) * 2015-06-02 2021-03-17 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
NL2015547B1 (en) * 2015-10-02 2017-04-21 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel Bv Copy number variant leading to virus resistance.
ES2812155T3 (es) * 2016-02-02 2021-03-16 Evonik Operations Gmbh Formulaciones pulverulentas de sustancias tensioactivas sobre soportes sólidos hidrosolubles, procedimientos para su producción, así como su empleo
CN105548543A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种花生黄色斑点病毒检测试剂盒及其检测方法与应用
CN105548544A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒及其检测方法与应用
WO2017192857A2 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Kansas State University Research Foundation Multigenic transgenic resistance to cereal viruses by rna-interference
CN106234415B (zh) * 2016-09-30 2018-09-21 中国农业科学院烟草研究所 Ida成熟多肽植物衰老促进剂、制备方法及应用
CN107918012A (zh) * 2016-10-11 2018-04-17 上海市农业科学院 一种甜瓜黄斑病毒的免疫检测试剂盒及其应用
EP3575286B1 (en) 2017-01-26 2022-05-11 Mitsui Chemicals Agro, Inc. Pyridone compound and bactericide for agricultural and horticultural use, which uses said compound as active ingredient
EP3611166B1 (en) 2017-04-10 2022-09-21 Mitsui Chemicals Agro, Inc. Pyridone compound, and agricultural and horticultural fungicide having this as active component
WO2018190350A1 (ja) 2017-04-10 2018-10-18 三井化学アグロ株式会社 ピリドン化合物およびそれを有効成分とする農園芸用殺菌剤
AU2018251415B2 (en) 2017-04-11 2021-08-05 Mitsui Chemicals Crop & Life Solutions, Inc. Pyridone compounds and agricultural and horticultural fungicides containing the same as active ingredients
EP3636636B1 (en) 2017-06-08 2022-07-06 Mitsui Chemicals Agro, Inc. Pyridone compound and agricultural and horticultural fungicide
CN109280058B (zh) * 2017-07-20 2020-07-10 中国检验检疫科学研究院 一种抗植物病毒的药剂
CN109275662A (zh) * 2017-07-20 2019-01-29 中国检验检疫科学研究院 一种抗植物病毒的药剂
CN107937609B (zh) * 2017-12-13 2020-06-02 沈阳大学 一种检测辣椒脉斑驳病毒专用引物及其检测方法
CN108265054A (zh) * 2018-02-08 2018-07-10 江苏省农业科学院 赋予植物黄化曲叶病毒病抗性的sl-linc2基因的应用
WO2019173721A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for controlling plant viral infection
CN112424344A (zh) * 2018-07-03 2021-02-26 株式会社微生物化学研究所 黄瓜花叶病毒弱毒株
EP3828177B1 (en) 2018-07-25 2023-11-29 Mitsui Chemicals Crop & Life Solutions, Inc. Pyridone compound and agricultural and horticultural fungicide having this as active component
WO2020178099A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Syngenta Crop Protection Ag Suppression of target gene expression through genome editing of native mirnas
CN109913492B (zh) * 2019-03-25 2021-05-18 华南师范大学 一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法
CN112625141A (zh) * 2020-12-28 2021-04-09 昆明海关技术中心 一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质及其应用
CN113308472A (zh) * 2021-05-27 2021-08-27 上海市农业科学院 靶向黄瓜花叶病毒的rna干扰序列、其表达载体及应用
CN114480740B (zh) * 2022-02-18 2023-10-24 杭州柏熠科技有限公司 适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法
EP4353824A1 (en) * 2022-10-10 2024-04-17 Universidade de Évora Construct for inducing silencing in plants and method for protecting them against tomato spotted wilt virus
CN116426567B (zh) * 2023-03-29 2023-11-03 潍坊科技学院 一种n基因及其蛋白在抗番茄黄化曲叶病毒中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT57265A (en) * 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
EP0968063B1 (en) * 1997-03-18 2002-11-27 Disa Industries A/S Method, pressure-supply member and pressure-supply system for active after-feeding of castings
US7019195B1 (en) * 1998-05-26 2006-03-28 Syngenta Participations Ag Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells
WO2008027592A2 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 Monsanto Technology, Llc Phased small rnas
AU2010239381B2 (en) * 2009-04-20 2015-01-15 Monsanto Technology Llc Multiple virus resistance in plants
ES2641642T3 (es) * 2010-03-08 2017-11-10 Monsanto Technology Llc Moléculas de polinucleótido para regulación génica en plantas

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014062775A2 (en) 2014-04-24
IN2015DN04085A (es) 2015-10-09
MX375641B (es) 2025-03-06
CN104822833A (zh) 2015-08-05
EP2909322A2 (en) 2015-08-26
US20180368414A1 (en) 2018-12-27
CN110946137A (zh) 2020-04-03
HK1214295A1 (zh) 2016-07-22
WO2014062775A3 (en) 2014-06-19
BR112015008593A2 (pt) 2017-08-22
MX360305B (es) 2018-10-26
EP2909322A4 (en) 2016-03-16
CA2887349A1 (en) 2014-04-24
US20150313238A1 (en) 2015-11-05
AR093032A1 (es) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2015004792A (es) Metodos y composiciones para controlar la infeccion viral en plantas.
AU2012308737B2 (en) Methods and compositions for weed control
EP2755988B1 (en) Methods and compositions for weed control
CN103930549B (zh) 用于杂草控制的方法和组合物
AU2012308660B2 (en) Methods and compositions for weed control
ES2645927T3 (es) Procedimientos y composiciones para el control de malezas
EP2756086B1 (en) Methods and compositions for weed control
CN110066794A (zh) 用于杂草控制的方法和组合物
US12408674B2 (en) Methods and compositions for controlling plant viral infection
US10760086B2 (en) Methods and compositions for weed control
UA121462C2 (uk) Спосіб та композиція для боротьби із бур&#39;янами з використанням полінуклеотидів epsps

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration