MX2015001979A - Composiciones y metabolitos bioactivos de bacillus megaterium. - Google Patents

Abstract

Se proveen composiciones y metabolitos bioactivos derivados de cultivos de Bacillus y particularmente Bacillus megaterium responsable del control de plagas así como sus métodos para el uso en el control de plagas. Además se proveen cepas plaguicidas de Bacillus megaterium.

Description

COMPOSICIONES Y METABOLITOS BIOACTIVOS DE BACILLUS MEGATERIÜM REFERENCIAS A SOLICITUDES RELACIONADOS Esta solicitud invoca el beneficio de La Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/683.154, presentada el 14 de agosto de 2012 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N° 13.832.407, presentada el 15 de marzo de 2013; cuya divulgación se incorpora a modo de referencia en su totalidad para todos los propósitos. ANTECEDENES Y CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente divulgación se encuentra en el campo de las composiciones bioactivas que tienen actividad plaguicida y métodos para su uso en el control de plagas vegetales. En particular, dichas composiciones comprenden una cepa de Bacillus y/o sus metabolitos, más particularmente cepas de Bacillus megaterium y sus metabolitos.

Los productos naturales son sustancias producidas por microbios, plantas y otros organismos. Los productos naturales microbianos ofrecen una fuente abundante de diversidad química, y existe una larga historia de utilización de productos naturales con propósitos farmacéuticos. A pesar del énfasis en los productos naturales para medicamentos humanos, en donde más del 50% derivan de productos naturales, solamente el 11% de los plaguicidas derivan de fuentes naturales. Sin embargo, los plaguicidas de productos naturales tienen un potencial de tener un rol importante en el control de plagas en granjas convencionales y orgánicas. Los metabolitos secundarios producidos por microbios (bacterias, actinomicetos y hongos) proveen compuestos químicos novedosos que pueden usarse solos o en combinación con compuestos conocidos para controlar eficazmente plagas de insectos y para reducir el riesgo de desarrollo de resistencia. Hay muchos ejemplos bien conocidos de productos naturales microbianos que tienen éxito como insecticidas agrícolas (Thompson y col., 2000; Arena y col., 1995; Krieg y col.1983).

El desarrollo de un plaguicida microbiano comienza con el aislamiento de un microbio en un cultivo puro. Luego se procede con un tamizaje eficaz y de espectro usando ensayos in vitro, in vivo o a escala piloto en un vivero y en el campo. Al mismo tiempo, se aíslan y se identifican los compuestos activos producidos por el microbio. Para la comercialización de un plaguicida microbiano, el microbio tiene que ser producido económicamente por fermentación a escala industrial y ser formulado con un transportador biocompatible y aditivos aprobados para aumentar la eficacia y para maximizar la simplicidad de su aplicación.

Usos de Bacillus Mega teri m y productos producidos por el mismo La Bacillus megaterium es una bacteria Gram-positiva que crece en medio simple y en más de 62 de 95 fuentes de carbono, tales como intermediarios del ciclo del ácido tricarboxilico (por ejemplo, formiato y acetato), y forma esporas principalmente en condiciones aeróbicas (véase, por ejemplo, Vary, 2007). Se ha encontrado en una variedad de hábitats, tales como suelo, agua de mar, sedimento, arrozales, miel, pescado, y alimentos secos.

Se ha encontrado que Bacillus megaterium tiene varios usos. Específicamente, produce una variedad de enzimas industriales tales como Penicilina acilasa, diferentes amilasas, y glucosa deshidrogenasa (revisión en, Vary, 2007). Adicionalmente, se encontró una fermentación de B. megaterium ATCC 19213 crecida hasta fase estacionaria produce 17-Desoxisquizoquineno, un sideróforo, que se identificó como ácido 4- [(3(acetilhidroxiamino)propil)amino]-2-[2-[(3-(acetilamino)propil)amino]-2-oxoetil]-2-hidroxi-4-oxo-butanoico (Hu X y Boyer G. L, 1995). El esquizoquineno, un dihidroxamato que contiene citrato, un sideróforo, ha sido producido por B. megaterium y Anabaena sp (Plowman J. E. y col 1984). Se investigó la participación del grupo citrato a-hidroxicarboxilato en el quelado de hierro por comparación del comportamiento de unión a hierro de esquizoquineno con el del acetilesquizoquineno, un derivado en el cual el grupo citrato hidroxilo se modificó por acetilación.

Otro conjunto de usos de productos derivados de Bacillus megaterium han sido usos medicinales. Se ha reportado BMG 59-R2, un antibiótico peptidico, de B. megaterium (FERM-p 6177). El compuesto también inhibe la fosfatasa alcalina y el crecimiento tumoral (Patente de Japón, 83 164 561. (1983)). El cultivo en fermentación de B. megaterium en presencia de ansatrienina produce T23V y T23VI (Damberg, M. y col 1982). Estos compuestos pertenecen a la clase de antibióticos macrólidos, que también presentan actividad antitumoral. Se aisló un nucleósido llamado oxetanocina de B. megaterium NK84-0218 y la estructura se determinó por análisis por cristalografía de rayos X que es 9- [(2R,3R,4S)-3,4-bis(hidroximetil)-2-oxetanil]adenina (Shimada N. y col., 1986). La oxetanocina mostró actividad contra el virus herpes simplex-II (virus a ADN) a 5,8 mg/pocillo (50% de inhibición del efecto citopático), mientras que la citotoxicidad contra las células Vero fue 132,6 pg/pocillo (50% de inhibición del crecimiento celular). Más tarde, se aislaron los derivados de oxetanocina tales como oxetanocinas H, X, G y 2-aminooxetanocina A (Shimada N. y col., 1987) de la misma cepa que mostró actividades antivirales contra el virus herpes simplex tipo-II (HSV-II) y actividades antivirales contra el virus de la inmunodeficiencia humana. La B. megaterium IFO 12108 (Nakaha a, K. y col., 1981) se usó para la transformación microbiana de anamtiocina, un antibiótico antitumoral producido por Nocardia sp. C-15003 (N-l). La ansa itocina P-3 se convirtió a 15-hidroxiansamitocina P-3 (PHO-3), y 15-epi-15-hidroxiansamitocina P-3 (epi-PHO-3), con el uso de B. megaterium (Izawa M. y col., 1981). El producto de conversión microbiana de P-3, tiene mayores actividades antitumorales contra P 388 y L 1210 que el sustrato P-3.

Se han usado diferentes aislados de Bacillus megaterium como insecticidas, bactericidas, fungicidas y nematicidas (véase, por ejemplo, Aksoy, H.M.2008; Patentes de los EE.UU. Nos. 6.599.503, 7.906.131, 7.935.360). Algunos de estos aislados de B. megaterium han sido usados en combinación con otras bacterias para tratar lodo y desechos tales como residuo de Artemisia annua, polvo de tragante, polvo de salvado, heces de ganado y aves de corral, turba, y paja de residuos de cultivos (véase, por ejemplo, Patente de los EE.UU. No.7.279.104).

Breve descripción de la invención Se provee una B. megaterium que tiene las siguientes características: (A) actividad plaguicida; (B) produce un compuesto plaguicida que tiene las siguientes propiedades: (1) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 140 y 185 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (2) tiene valores de 1H RMN de d 7,28 (2H), 7,19 (2H), 7,17, 2,67, 2,31, 1,92 y tiene valores de 13C RMN de 177,5, 142,9, 129,5, 129,5, 129,4, 129,4, 126,9, 36,1, 34,4, 28,1 (3) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 8 y 18 minutos, en una columna C-18 HPLC en fase reversa (Phenomenex, Luna 5m C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm.; (C) no es patogénico para animales vertebrados; y (D) es susceptible a tetracielina, eritromicina, estreptomicina, Penicilina, Ampicilina, Oxitetraciclina, Cloramfenicol, Ciprofloxacina, Gentamicina, Piperacilina, Imipenem y Sulfametoxazol-Trimethoprim.

También se provee un sobrenadante, fracción celular, filtrado, extracto, compuesto o metabolito derivado de un cultivo de B. megaterlum.

Adicionalmente, la Bacillus megaterium sp. puede tener una secuencia del gen del ARNm de 16S que comprende por lo menos uno de: (A) una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:l, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:2 y por lo menos 99% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 3; (B) una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:4, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:5 y por lo menos 99% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 6; (C) una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:7, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:8 y por lo menos 99% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 9.

Adicionalmente, la Bacillus megaterium sp. puede tener una secuencia del gen recA que comprende por lo menos uno de: (A) una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:14, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:15 y por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 16? (B) una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:17, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:18 y por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 19; (C) una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:20, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:21 y por lo menos 99% de identidad y más particularmente por lo menos 99,5% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 22.

En particular, el Bacillus es una cepa de B. megaterium que tiene las características identificadoras de la cepa H491 B. megaterium (No. de acceso a NRRL B-50769), cepa M018 de Bacillus megaterium (No. de acceso a NRRL B-50770) y cepa J142 de Bacillus megaterium (No. de acceso a NRRL B-50771), o una cepa derivada de una de dichas cepas (por ejemplo, una cepa mutante). Por lo tanto, en un aspecto relacionado, se provee dicha B. megaterium. También se provee un cultivo sustancialmente puro, o caldo de células enteras que comprende dicho microorganismo o fracción celular, sobrenadante, filtrado, extracto, compuesto o metabolito derivado del mismo.

El compuesto usado en los métodos y composiciones y combinaciones puede ser un compuesto que (A) tiene actividad plaguicida; (B) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 140 y 185 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS) y (C) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 8 y 18 minutos en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 n y (D) opcionalmente puede obtenerse a partir de una B. megaterium. En una forma de realización el compuesto puede ser un poliquétido.

En una forma de realización particular, el compuesto puede derivar de B. megaterium y tiene una estructura de poliquétido aromático monosustituido que comprende por lo menos un grupo ácido, por lo menos un anillo aromático de 6 miembros y por lo menos tres grupos metileno; un peso molecular de entre 140 y aproximadamente 185 en la estructura central; por lo menos 8 carbonos y por lo menos 2 oxígenos.

En una forma de realización específica, el compuesto (A) puede obtenerse a partir de una B. megaterium; (B) es toxico para una plaga; (C) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 140 y 185 y más particularmente, 164 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (D) tiene valores de 1H RMN de d 7,28 (2H), 7,19 (2H), 7,17, 2,67, 2,31, 1,92 y tiene valores de 13C RMN de 177,5, 142, 9, 129, 5, 129, 5, 129, 4, 129, 4 , 126, 9, 36, 1, 34 , 4 , 28 , 1 (E) tiene un tiempo de retención por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente entre 8 y 18 minutos, más específicamente aproximadamente 12 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 12,16 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa (Phenomenex, Luna 5m C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm.

En una forma de realización más particular, se proveen compuestos que incluyen a título enunciativo no taxativo: (A) un compuesto que tiene la estructura ##STR001## ##STR001 ## o una sal plaguicidamente aceptable o estereoisó eros de la misma, en donde n es O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9; X es 0, NH, NR o S; R es alquilo de cadena inferior que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 grupos alquilo, grupo arilo o arilalquilo, alquilo inferior sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocielilo, heterociclilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxilo, halógeno, amino, amido o carboxilo; Ri, R2, R3, R4, R5, R6 son cada uno independientemente H, hidroxilo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocielilo, heterociclilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxilo, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (B) un compuesto que tiene la estructura ##STR001a## ##STR001a## o una sal plaguicidamente aceptable o estereoisómeros de la misma, en donde X es 0, NH, NR o S; R es alquilo de cadena inferior que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 grupos alquilo, grupo arilo o arilalquilo, alquilo inferior sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxilo, halógeno, amino, amido o carboxilo; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 80 9; Ri, R2, R3, R4 son cada uno independientemente H, hidroxilo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocielilo, heterociclilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxilo, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (C) un compuesto que tiene la estructura ##STR001b## ##STR001b## o una sal plaguicidamente aceptable o estereoisómeros de la misma, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9; Ri, R2, R3, R4, R5 son cada uno independientemente H, hidroxilo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxilo, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(O)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; En una forma de realización más particular, el compuesto es el poliquétido aromático, ácido 4- fenilbutanoico (1). Ácido 4-Fenilbutanoico (1) Estos compuestos pueden obtenerse por (A) cultivo de B. megaterium en un medio de cultivo, para obtener un caldo de célula completo de B. megaterium, bajo condiciones suficientes para producir dichos compuesto (s), y (B) aislar dicho(s) compuesto(s) producido(s) en (A) a partir del caldo de células enteras de (A).

En particular, el compuesto en el paso (B) puede aislarse por (i) aplicación del caldo de células enteras a por lo menos uno de una columna de intercambio iónico, una columna de exclusión molecular o una columna de HPLC en fase reversa para obtener fracciones de columna; (ii) ensayo de la actividad plaguicida en las fracciones de la columna y (iii) concentrado de las fracciones de la columna de (ii) para obtener el compuesto aislado. Como alternativa, dicho(s) compuesto(s) puede(n) producirse por síntesis química y el o los productos pueden usarse como un compuesto puro o como un producto en crudo.

En formas de realización adicionales, se proveen composiciones y métodos para modular el crecimiento vegetal y en particular, promover el crecimiento vegetal y/o modular la germinación de semillas y particularmente promover la germinación de semillas. Por ejemplo, el medio de cultivo obtenido después del crecimiento de las cepas de B. megaterium descrito en la presente, también indicado como caldo de células enteras (WCB), puede aplicarse a plantas, semillas y/o su sustrato de crecimiento (por ejemplo, suelo) para promover el crecimiento de las semillas y plantas o germinación de las semillas de la planta. Como alternativa, las plantas, semillas y/o su sustrato de crecimiento (por ejemplo, suelo) pueden inocularse con cualquiera o una combinación de las cepas de B. megaterium descritas en la presente con el propósito de promover el crecimiento de la planta. En otras formas de realización, un cultivo sustancialmente puro o cultivo celular que comprende B. megaterium o un sobrenadante, fracción celular, filtrado, extracto, compuesto y/o metabolito derivado del mismo puede usarse en métodos para promover el crecimiento vegetal o germinación de semillas.

En formas de realización adicionales, cualquiera de los compuestos descritos en la presente puede usarse en métodos para promover el crecimiento de plantas; por ejemplo, un compuesto que: (a) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 140 y 185 y más particularmente, 164 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (b) tiene valores de 1H RMN de d 7,28 (2H), 7,19 (2H), 7,17, 2,67, 2,31, 1,92 y tiene valores de 13C RMN de 177,5, 142,9, 129,5, 129,5, 129,4, 129,4, 126,9, 36,1, 34,4, 28,1; y (c) tienen un tiempo de retención por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente entre 8 y 18 minutos, más específicamente aproximadamente 12 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 12,16 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa (Phenomenex, Luna 5m C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm.

Los compuestos adicionales útiles en los métodos descritos y composiciones para promover el crecimiento vegetal incluyen aquellos identificados precedentemente como STR001, STROOla STROOlb y ácido 4-fenilbutanoico (Compuesto 1).

Además se provee una combinación plaguicida que puede ser sinérgica con por lo menos una plaga que comprende como componentes activos: (a) un cultivo sustancialmente puro o cultivo celular que comprende B. megaterium o un sobrenadante, fracción celular, filtrado, extracto, compuesto y/o metabolito derivado del mismo y (b) otra plaguicida sustancia, en donde (a) y (b) pueden estar presentes en cantidades sinérgicas. La plaga, en una forma de realización particular, puede ser una plaga de insecto, pero también puede incluir, a titulo enunciativo no taxativo, un nematodo, hongo de plantas, virus de plantas y bacterias de plantas y malezas. Adicionalmente, la combinación puede ser una composición. La sustancia plaguicida puede (a) derivar de un microorganismo; (b) un producto natural y/o (c) un plaguicida químico y en particular un nematicida químico.

En particular, la combinación puede comprender un microorganismo entero, sobrenadante, filtrado y/o extracto de B. megaterium y una sustancia plaguicida derivada de un microorganismo que incluye a título enunciativo no taxativo Bacillus sp. (por ejemplo, Bacillus thuringiensis o Bacillus thuringiensis kurstaki) y espinosad. Como alternativa, la combinación puede comprender un sobrenadante, filtrado y/o extracto de B. megaterium y una sustancia plaguicida derivada de un producto natural tal como piretrum. Como alternativa, la combinación puede comprender un sobrenadante, filtrado y/o extracto de B. megaterium y una sustancia plaguicida que es un plaguicida químico, particularmente, un insecticida, en donde el insecticida incluye a título enunciativo no taxativo piretrinas, espirotetramet y organoclorados.

En un aspecto relacionado, en la presente se provee un método para modular, en particular, modular sinérgicamente la infestación de por lo menos una plaga o especie de plaga en o alrededor de una planta que comprende aplicar a una planta y/o semillas de la misma y/o sustrato para el crecimiento de dicha planta las combinaciones detalladas precedentemente con una cantidad de la combinación eficaz para modular la infestación de dicha plaga o especie de plaga. En la presente también se proveen compuestos aislados que pueden obtenerse o derivarse de B. megaterium o como alternativa, organismos con capacidad de producir estos compuestos que pueden usarse para el control de diferentes plagas, y/o también particularmente, plagas nematicidas.

Además se provee el uso de (a) un compuesto el cual: (1) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 140 y 185 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (2) tiene valores de 1H RMN de d 7,28 (2H), 7,19 (2H), 7,17, 2,67, 2,31, 1,92 y tiene valores de 13C RMN de 177,5, 142,9, 129,5, 129,5, 129,4, 129,4, 126,9, 36,1, 34,4, 28,1; (3) tiene un tiempo de retención por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente entre 8 y 18 minutos, en una columna C-18 HPLC en fase reversa (Phenomenex, Luna 5m C18(2) 100 A, 100 x 4,60 iran) usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solventes en gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y una detección en UV a 210 nm.; (4) tiene propiedades plaguicidas; y (b) opcionalmente otra sustancia, en donde dicha sustancia es un plaguicida, eficaz para modular la infestación por plaga; para formular una composición plaguicida y/o modular la infestación de una o más plagas.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación esquemática del esquema de purificación para obtener los compuestos de la invención del caldo de cultivo.

La Figura 2 describe los datos de (-) ESI-LCMS para el ácido 4-Fenilbutanoico (1).

La Figura 3 describe 1H RMN para el ácido 4-Fenilbutanoico (1) en CD3OD- d4 a 600 MHz.

La Figura 4 describe 13C RMN para ácido 4-Fenilbutanoico (1) en CD3OD-d4 a 150 MHz.

La Figura 5 describe la actividad ne aticida promedio de cada lote para cada fermentación numerado de 1 a 19 en orden cronológico.

La Figura 6 muestra la eficacia del sobrenadante H491 en el control de M. hapla a diferentes tasas de dilución.

La Figura 7 muestra los resultados de dos bioensayos diferentes de extracto en placa de 96 pocilios de las fracciones de H491 1 a 6 y extracto en crudo. Se incluyen tres controles en cada ensayo; 1 positivo (1% Avid) & 2 negativos (DMSO & agua). El ensayo 1 (TI) se llevó a cabo usando nematodos M. hapla y las fracciones se disolvieron en DMSO 100%; y el ensayo 2 (T2) se llevó a cabo usando nematodos M. incógnita y las fracciones se disolvieron en DMSO. El % de inmovilidad se gráfica en su forma corregida en donde la inmovilidad del blanco con DMSO se sustrae de cada muestra ensayada.

La Figura 8 muestra los resultados de tres bioensayos diferentes de extracto en placa de 96 pocilios de los picos purificados de H491 H1-H38. Se incluyeron tres controles en cada ensayo; un control positivo (1% Avid) y 2 controles negativos (DMSO & agua). También se ensayaron la carga de la columna (inicial) y fluido (lavado). El ensayo 1 (TI) se llevó a cabo con nematodos M. hapla, los ensayos 2 y 3 (T2 y T3) se llevaron a cabo con los nematodos M. inc gnita . Los resultados de cada muestra (fracción o control) se presentan como un conjunto de tres barras: la barra del extremo izquierdo muestra resultados del Ensayo 1 ( M. hapla), la barra del centro muestra resultados del Ensayo 2 (M. inc gnita) y la barra del extremo derecho muestra resultados del Ensayo 3 (M. inc gnita) .

La Figura 9 muestra los efectos del sobrenadante de H491 sobre M. incógnita en pepino en un ensayo agua-agar.

La Figura 10 muestra la dosis-respuesta nematicida para WCB de H491 en plantas de pepino ensayado en un minitubo en un ensayo in planta . El WCB H491 (identificado como MBI303 en la figura) se usó a concentración completa (IX) y en diluciones 0,7X y 0,5X. Se midió el peso superior fresco (FTW, barra del extremo izquierdo en cada conjunto de tres), peso de raíz fresca (FRW, barra central en cada grupo de tres) e indice de agallas (barra del extremo derecho en cada conjunto de tres) para las tres concentraciones de WCB de H491 y para plantas tratadas con agua (control negativo) y con Avid (control positivo).

La Figura 11 muestra resultados de ensayos de motilidad (expresados como porcentaje de nematodos inmóviles) realizado con WCB obtenido de cuatro lotes diferentes de fermentación de H491 de B. megaterium. También se muestran resultados para nematodos tratados con agua (control negativo) y Avid (control positivo).

La Figura 12 muestra el efecto de ácido 4-Fenilbutanoico (Compuesto 1), a concentraciones diferentes (indicado en el eje de abscisas) sobre la motilidad del nematodo juvenil (J2). También se muestran los resultados para los controles negativos (DMSO y agua) y un control positivo (Avid).

La Figura 13 muestra los efectos de tres cepas diferentes de B. megaterium (H491, M018 y J142) sobre la motilidad de M. inc gnita J2. Se usó Avid como un control positivo, y agua como un control negativo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Si bien las composiciones y métodos descritos hasta el momento son susceptibles a diferentes modificaciones y formas alternativas, en la presente se describirán formas de realización ejemplificativas en detalle. Se debe entender, sin embargo, que no se tiene como intención limitar la invención a las formas particulares descritas, sino lo contrario, la intención es cubrir todas las modificaciones, equivalentes, y alternativas que caen dentro del espíritu y alcance de la invención como se definen en las reivindicaciones anexas.

Cuando se provee un rango de valores, se entiende que cada valor interviniente, a la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente lo indique de otra forma, entre el límite superior e inferior de ese rango y cualquier otro valor indicado o interviniente en el rango detallado, se incluye dentro del mismo. También se incluyen rangos menores. El límite superior e inferior de estos rangos menores también se incluye dentro del mismo, sujeto a cualquier limite específicamente excluido en el rango indicado.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con experiencia ordinaria en el arte a la cual pertenece esta invención. A pesar de que en la práctica o prueba de la presente invención también puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

Se debe hacer notar que como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/una", "y" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra forma.

Como se define en la presente, "derivado de" se refiere a directamente aislado u obtenido de una fuente particular o como alternativa que tiene características identificadoras de una sustancia u organismo aislado u obtenido de una fuente particular. En el evento en que la "fuente" es un organismo, "derivado de" se refiere a que puede ser aislado u obtenido del organismo mismo o del medio usado para cultivar o hacer crecer dicho organismo.

Como se define en la presente, "cultivo de caldo completo" se refiere a un cultivo liquido que contiene células y media. Si las bacterias se hacen crecer en una placa las células pueden recolectarse en agua u otro cultivo completo, líquido.

El término "sobrenadante" se refiere al líquido remanente cuando las células que se hacen crecer en caldo o recolectadas de otro líquido de una placa con agar son eliminadas por centrifugación, filtración, sedimentación, u otros medios bien conocidos en el arte.

Como se define en la presente, "filtrado" se refiere un líquido de un cultivo de caldo completo que se ha pasado a través de una membrana.

Como se define en la presente, "extracto o" se refiere una sustancia líquida extraída de células por un solvente (agua, detergente, solución amortiguadora) y separada de las células por centrifugación, filtración u otro método.

Cono se define en la presente, "metabolito" se refiere a un compuesto, sustancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo, o sobrenadante, filtrado, o extracto obtenido de un microorganismo que tiene actividad plaguicida y particularmente, nematicida.

Como se define en la presente, un "compuesto aislado" está esencialmente libre de otros compuestos o sustancias, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20% puro, preferentemente por lo menos aproximadamente 40% puro, más preferentemente aproximadamente 60% puro, incluso más preferentemente aproximadamente 80% puro, más preferentemente aproximadamente 90% puro, e incluso más preferentemente aproximadamente 95% puro, según lo determinado por métodos analíticos, que incluyen a título enunciativo no taxativo métodos cromatográficos y métodos electroforéticos.

Un "transportador" como se define en la presente es un material inerte, orgánico o inorgánico, con el cual se mezcla o formula el ingrediente activo para facilitar su aplicación a plantas u otro objeto a tratar, o su almacenamiento, transporte y/o manejo.

El término "modular" como se define en la presente se usa para referirse a alterar la cantidad de infestación por plaga o tasa de esparcimiento déla infestación por plaga.

El término "infestación por plaga" como se define en la presente, es la presencia de una plaga en una cantidad que produce un efecto dañino que incluye una enfermedad o infección en una población huésped o emergencia de una maleza no deseada en un sistema de crecimiento.

Un "plaguicida" como se define en la presente, es una sustancia derivada de un producto biológico o sustancia química que aumenta la mortalidad o que inhibe el la tasa de crecimiento de plagas de plantas e incluye a título enunciativo no taxativo nematicidas, insecticidas, fungicidas vegetales, bactericidas vegetales, y viricidas vegetales.

Como se usa en la presente, el término "alquilo" se refiere a grupos hidrocarbonados de cadena lineal o ramificada monovalente que tienen entre uno y aproximadamente 12 átomos de carbono, que incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, tert-butilo, n-hexilo, y similares.

Como se usa en la presente, "alquilo sustituido" se refiere a grupos alquilo que además portan uno o más sustituyentes seleccionados de hidroxilo, alcoxilo, mercapto, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ariloxilo, ariloxilo sustituido, halógeno, ciano, nitro, amino, amido, — C(O)H, acilo, oxiacilo, carboxilo, sulfonilo, sulfonamida, sulfurilo, y similares.

Como se usa en la presente, "alquenilo" se refiere grupos hidrocarbilo de cadena lineal o ramificada que tienen uno o más enlaces dobles carbono-carbono, y que tiene en el rango de aproximadamente 2 hasta 12 átomos de carbono, y "alquenilo sustituido" se refiere a grupos alquenilo que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "alquinilo" se refiere grupos hidrocarbilo de cadena lineal o ramificada que tienen por lo menos un enlace triple carbono-carbono, y que tiene en el rango de aproximadamente 2 hasta 12 átomos de carbono, y "alquinilo sustituido" se refiere a grupos alquinilo que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "arilo" se refiere a grupos aromáticos que tienen en el rango de 6 hasta 14 átomos de carbono y "arilo sustituido" se refiere a grupos arilo que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "heteroarilo" se refiere a anillos aromáticos que contienen uno o más heteroátomos (por ejemplo, N, 0, S, o similares) como parte de la estructura del anillo, y que tienen en el rango de entre 3 hasta 14 átomos de carbono y "heteroarilo sustituido" se refiere a grupos heteroarilo que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "alcoxilo" se refiere al grupo --O-alquil-, en donde alquilo es como se definió precedentemente, y "alcoxilo sustituido" se refiere a grupos alcoxilo que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "tioalquilo" se refiere al grupo --S-alquil-, en donde alquilo es como se definió precedentemente, y "tioalquilo sustituido" se refiere a grupos tioalquilo que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "cicloalquilo" se refiere a grupos alquilo que contienen anillo que contienen en el rango de aproximadamente 3 hasta 8 átomos de carbono, y "cicloalquilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquilo que adema portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

Como se usa en la presente, "heterociclilo", se refiere a grupos cíclicos (es decir, que contienen anillo) que contiene uno o más heteroátomos (por ejemplo, N, 0, S, o similares) como parte de la estructura de anillo, y que tiene en el rango de 3 hasta 14 átomos de carbono y "heterociclilo sustituido" se refiere grupos heterocíclicos que además portan uno o más sustituyentes como se detalla precedentemente.

"Identidad porcentual" se refiere al valor determinado por comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia del polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, coincidencias) en comparación a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula por determinación del número de posiciones en las cuales aparece la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para dar un número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El alineamiento óptimo de secuencias para comparar puede usar cualquier medio para analizar la identidad de secuencias (homología) conocidos en el arte, por ejemplo, por el método de alineamiento progresivo llamado "PILEUP" (Morrison, 1997), como un ejemplo del uso de PILEUP); por algoritmo de homología local de Smith & Waterman, (1981); por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch (1970); por el método de búsqueda de similitud de Pearson (1988); por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BEST FIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de programas de computación Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.); ClustalW (CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif., descrito por, por ejemplo, Higgins (1988); Corpet (1988); Huang (1992); y Pearson (1994); Pfamand Sonnhammer (1998); TreeAlign (Hein (1994); programas de computadora para alineamiento de secuencias MEG-ALIGN, y SAM; o por inspección visual manual.

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, el cual se describe en Altschul y col., (1990). Los programas de BLAST (Herramienta de búsqueda de alineamiento local básico) de Altschul, S. F., y col., (1993) buscan bajo parámetros por defecto la identidad de secuencias contenidas en la base de datos BLAST "GENEMBL". Una secuencia puede ser analizada para estudiar la identidad con todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos GENEMBL usando el algoritmo BLASTN de acuerdo con los parámetros por defecto. El programa de computación para realizar los análisis con BLAST se encuentra disponible públicamente en el Centro Nacional de Información de Bioteenología, www.ncbi.nlm.nih.gov/; véase también Zhang (1997) para la variante "PowerBLAST". Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencias con puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coincide o satisface alguna puntuación umbral valuada positiva T cuando se realiza el alineamiento con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul y col., (1990)).

Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineamiento acumulativo pueda aumentar. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo disminuye en la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de un o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el extremo de una secuencia. Los parámetros del algoritmo de BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff (1992)) alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. El término BLAST se refiere al algoritmo BLAST que realiza un análisis estadístico de similitud entre las dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin (1993).

Métodos de producción Como se indicó precedentemente, los compuestos o metabolitos pueden obtenerse, son obtenibles o derivan de un organismo que tiene las características identificadoras de B. megaterium, o como alternativa de cualquier otro microorganismo. Los métodos comprenden hacer crecer estos organismos (por ejemplo en cultivo) y obtener los compuestos y/o composiciones de la presente invención por aislamiento de estos compuestos del cultivo de estos organismos.

En particular, los organismos son cultivados en medio de nutrientes usando métodos conocidos en el arte. Los organismos pueden cultivarse por cultivo en frasco para agitación, fermentación en escala pequeña o escala grande (incluyendo a titulo enunciativo no taxativo fermentación continua, en lote, lote alimentado, o estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales realizada en medio adecuado y bajo condiciones que permiten el crecimiento celular. El cultivo puede tener lugar en medio con nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en el arte. Los medios adecuados se encuentran disponibles de fuentes comerciales o pueden prepararse de acuerdo a composiciones publicadas.

Después del cultivo, puede usarse un sobrenadante, filtrado y/o extracto de o derivado de B. megaterium para la formulación de una composición plaguicida.

Como alternativa, después del cultivo, los compuestos y/o metabolitos pueden ser un extracto de, enriquecido y/o purificado del caldo de cultivo.

El extracto puede fraccionarse por cromatografía. Las fracciones cromatográficas pueden ensayarse para el estudio de la actividad tóxica, por ejemplo, nematodos de vida libre y nematodos parásitos de plantas, M. inc gnita y/o M. hapla usando métodos conocidos en el arte. Este proceso puede repetirse una o más veces usando el mismo método cromatográfico o diferentes.

Composiciones Las composiciones pueden comprender cultivos de caldo completo, cultivos líquidos, o suspensiones de una cepa de una B. megaterium, así como sobrenadantes, filtrados o extractos obtenidos de una cepa de una B. megateriu , o el sobrenadante, filtrado y/o extracto o uno o más metabolitos o compuestos aislados derivados de una cepa de una B. megaterium o combinaciones de los anteriores los cuales en particular tienen actividad nematicida contra cualquiera de los siguientes: nematodos que forman agallas en semillas ( Afrína wevelli), nematodos de agróstide ( Anguina agrostis ) , nematodos que forman agallas en brotes ( Anguina spp.), nematodos que forman agallas en semillas ( Anguina spp., A. amsinckiae, A. balsamophila; A. tritici) , nematodos que forman agallas en hoja de festuca (A. graminis) , nematodos en forma de pabellón de oreja (o agalla de trigo) ( Anguina tritici) , nematodos de retoños y hojas (o foliar) ( Aphelenchoides spp., A. subtenuis) , nematodos de hoja de begonia (o helecho, o alechugamiento, o foliar de frutilla, o nematodos de frutilla, o enano de verano) (A. fragariae) , nematodos de helécho (A. olesistus) , nematodos de arroz (A. oryzae) , nematodos de grosella (A. ribes) , nematodos de casis (o crisantemo) (A. ritzemabosi) , nematodos foliar o de hoja de crisantemo (A. ritzemabosí), nematodos de extremo blanco del arroz (o enano de primavera, o retoño de frutilla) (A. besseyi) , nematodos que se alimentan de hongos (champiñón) ( Aphelenchoides compos tico la) , Atalodera spp. ( Atalodera lonicerae, Atalodera ucri) , nematodos de espinas ( Bakernema variabile) , nematodos de aguijón ( Belonolaimus spp., B. gracilis, B. longicaudatus ) , nematodos de madera de pino ( Bursaphalenchus spp., B. xylophilus, B. mucronatus) , nematodos de sésil ( Cacopaurus spp., C. epacris, C.pestis) , nematodos de quiste de amaranto ( Cactodera amaranthi) , nematodos de quiste de abedul (C. betulae) , nematodos de quiste de cáctus ( C. cacti) , nematodos de quiste de estonio (C. estonica) , nematodos de quiste de Thorne (C. thornei) , nematodos de quiste de centidonia (C. weissi), nematodos de anillo ( Criconema spp.), nematodos de espinas ( Criconema spp., C. civellae, C. decalineatum, C. sp inalinea tum) , nematodos de anillo ( Criconemella axeste, C. curvata, C. macrodora, C. parva) , nematodos de anillo ( Criconemoides spp., C. citri, C. simile) , nematodos de espinas ( Crossonema fimbriatum) , nematodos de quistes de eucaliptus ( Cryphodera eucalypti) , nematodos de retoño, tallo y bulbo ( Ditylenchus spp., D. angustus, D. dipsaci, D. destructor, D. intermedius), nematodos de cultivos de champiñones (D. myceliophagus) , nematodos con estilete ( Dolichodorus spp., D. heterocephalus , D. heterocephalous ) , nematodos con lanza ( Dorylaimus spp.), nematodos simuladores ( Geocenamus superbus) , nematodos de quiste ( Globodera spp.), nematodos de quiste de milenrama (G. achilleae ) , nematodos de quiste de hierba meona (G. millefolíí) , nematodos de quiste de manzana (G. malí) , nematodos de quiste de papa blanca (G. pallida) , nematodos dorados (G. rostochiensis), nematodos de quiste de tabaco (G. tabacum) , nematodos de quiste de Osborne (G. tabacum solanacearum) , nematodos de quiste de ortiga toro (G. tabacum virginiae) , nematodos alfiler ( Gracilacus spp., G. idalimus) , nematodos espiral ( Helicotylenchus spp., H. africanus, H. digonicus, H. dihystera, H. erythrinae, H. multicinctus , H. paragirus, H. pseudorobustus , H. solani, H. spicaudatus) , nematodos vainoides ( Hemicriconemoides spp., H. biformis, H. californianus, H. chitwoodi, H. floridensis, H. wessoni) , nematodos con forma de vaina ( Hemicycliophora spp., H. arenaria, H. biosphaera, H. megalodiscus , H. parvana, H. poranga, H. sheri, H. similis, H. striatula) , nematodos de quiste ( Heterodera spp.), nematodos de quiste de almendra {H. amygdali) , nematodos de quiste de avena (o cereal) (H. avenae) , nematodos de quiste de guandul (o arveja guandú) ( H . cajani ) , nematodos de quiste de bermudagrass (o con forma de corazón, o Valentín) ( H . cardíolata) , nematodos de quiste de zanahoria ( H . carotae) , nematodos de quiste de col o dorado de raíz de brassica (H. cruciferae) , nematodos de quiste de nutgrass (o juncia) ( H . cyperi ) , nematodos de quiste japonés ( H . elachista) , nematodos de quiste de higo (o ficus, o gomero) ( H . fici), nematodos de quiste de galeopsis ( H . galeopsidis) , nematodos de quiste de soja ( H . glycines) , nematodos de raíz de alfalfa (o quiste de arveja) ( H . goettingiana) , nematodos de quiste de trigo negro ( H . graduni) , nematodos de quiste de cebada (H. hordecalis ) , nematodos de quiste de lúpulo ( H . humuli) , nematodos de quiste de cereal mediterráneo (o trigo) ( H . latipons ) , nematodos de quiste de lespedeza ( H. lespedezae) , nematodos de quiste de Kansas ( H . longícolla ) , nematodos dorado de raíz de cereales o de quiste de avena ( H . major) , nematodos de quiste de césped ( H . mani) , nematodos de quiste de alfalfa ( H. medicaginis) , nematodos de quiste de cyperus (o motha) ( Heterodera mothi) , nematodos de quiste de arroz ( H . oryzae) , nematodos Amu- Darya (o quiste de espina de camello) ( H . oxiana) , nematodos de quiste de acedera ( H . rosii) , cyst nematodos de quiste de Rumex ( H . rumicis ) , nematodos de quiste de remolacha dulce [H. schachtii) , nematodos de quiste de sauce (H. salixophila) , nematodos de quiste de escleranto ( H . scleranthii) , nematodos de quiste de cerraja ( H. sonchophila) , nematodos de quiste de tadzhik (H. tadshikistanica ) , nematodos de quiste de turkmen (H. turcomanica) , nematodos de quiste de clavo de olor ( H. trifolii), nematodos de quiste de ortiga (H. urticae) , nematodos de quiste de ustinov ( H. ustinovi ) , nematodos de quiste de arveja de vaca (H. vigni) , nematodos de quiste de maíz ( H . zeae) , nematodos de raíz de arroz ( Hirschmanniella spp., H. belli, H. caudacrena, H. gracilis, H. oryzae) , nematodos lanza ( Hoplolaimus spp. ) , nematodos de Columbia ( H . columbus) , nematodos lanza de Cobb {H. galeatus) , nematodos lanza con cabeza de corona ( H . tylenchi forr is) , seudonematodos noduladores de raíz ( Hypsoperine graminis) , nematodos aguja ( Longidorus spp., L. africanus, L. sylphus) , nematodos de anillo ( Macroposthonia {=Mesocriconema) xenoplax) , nematodos quistoides ( Meloidodera spp.), nematodos quistoides de pino ( M. floridensis) , nematodos quistoides de tadzhik ( M. tadshikistanica) , nematodos de cuerpo quistoide ( Meloidoderita spp.), nematodos simuladores ( Merlinius spp., M. brevidens, M. conicus, M. grandis, M. microdorus) , nematodos noduladores de raíz ( Meloidogyne spp., M. acronea, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. carolinensis , M. chitwoodi, M. exigua, M. graminicola, M. hapla, M. hisp nica, M. inc gnita, M. inc gnita acrita, M. indica, M. inornata, M. javanica, M. kikuyuensis, M. konaensis, M. malí, M. microtyla, M. naasi, M. ovalis, M. platani, M. querciana, M. sasseri , M. tadshikistanica, M. thamesi) , nematodos de centaurea ( Mesoanguina picridis) , nematodos de abeto de Douglas ( Nacobbodera chitwoodi) , falsos nematodos nodularores de raíz ( Nacobbus aberrans , N. batatiformis, N. dorsalis) , nematodos de pasta agria ( Panagrellus redivivus) , nematodos de cerveza (P. silusiae) , nematodos aguja ( Paralongidorus microlaimus) , nematodos espiral ( Pararotylenchus spp.), nematodos de raíz gruesa ( Paratríchodorus allius, P. minor, P. porosus, P. renifer) , nematodos alfiler ( Paratylenchus spp., P. baldaccii, P. bukowinensis , P. curvitatus, P. dianthus , P. elachistus , P. hamatus, P. holdemani , P. italiensis, P. lepidus, P. nanus, P. neoamplycephalus, P. similis) , nematodos de lesión (o del prado) ( Pratylenchus spp., P. alleni, P. brachyurus, P. coffeae, P. convallariae , P. crenatus, P. flakkensis, P. goodeyi, P. hexincisus, P. leiocephalus, P. minyus, P. musicola, P. neglectus , P.penetrans , P. pratensis , P. scribneri, P. thornei, P. vulnus, P. zeae) , nematodos que forman agallas en tallo ( Pterotylenchus cecídogenus) , nematodos de quiste de grama ( Punctodera punctate) , nematodos simuladores ( Quinisulcius acutus, Q. capitatus) , nematodos excavadores ( Radopholus spp.), nematodos de raíz de banana ( R. similis) , nematodos de raíz de arroz {R. oryzae ) , nematodos de anillo rojo (o coco, o cocotero) ( Rhadinaphelenchus cocophilus) , nematodos reniformes ( Rotylenchulus spp., R. reniformis, R. parvus) , nematodos espiral ( Rotylenchus spp., R. buxophilus, R. christiei, R. robustus) , nematodos lanza de Thorne (R. uniformis), Sarisodera hidrophylla, nematodos espiral ( Scutellonema spp., S. blaberum, S. brachyurum, S. bradys, S. clathricaudatum, S. christiei, S. conicephalum) , nematodos que forman agallas en raíz de grama ( Subanguina radicicola) , nematodos cisotides circulares { Thecavermículatus andinus) , nematodos de raíz gruesa ( Trichodorus spp., T. christiei, T. kurumeensis, T. pachydermis , T. primitivus ) , anguílula del vinagre (o nematodos) ( Turbatrix aceti) , nematodos simuladoares (o estilete) ( Tylenchorhynchus spp., T. agri, T. annulatus, T. aspericutis, T. claytoni, T. ebriensís, T. elegans, T. golden, T. graciliformis, T. martini, T. mashhoodi, T. microconus , T. nudus, T. oleraceae, T. penniseti, T. punensis) , nematodos de cítricos ( Tylenchulus semipenetrans) , nematodos daga {Xiphinema spp., X. americanum, X. bakeri, X. brasiliense, X. brevicolle, X. chambersi, X. coxi, X. diver si cauda tum X. índex, X. insigne, X. nigeriense, X. radicicola, X. setariae, X. vulgarae, X. vuittenezi ) .

Las composiciones indicadas precedentemente pueden formularse de cualquier manera. Los ejemplos no limitantes de formulación incluyen a titulo enunciativo no taxativo concentrados emulsificables (EC), polvos que pueden humectarse (WP), líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones concentradas de volumen ultrabajo (ULV), polvos solubles (SP), microencapsulados, gránulos dispersados en agua, fluidos (FL), microemulsiones (ME), nanoemulsiones (NE), etc. En cualquier formulación descrita en la presente, el porcentaje del ingrediente activo está dentro del rango entre 0,01% y 99,99%.

Las composiciones pueden estar en la forma de un liquido, gel o sólido. Una composición sólida puede prepararse por suspensión de un transportador sólido en una solución de ingrediente(s) activo(s) y secar la suspensión bajo condiciones suaves, tal como evaporación a temperatura ambiente o evaporación en vacio a 65°C o menor.

Una composición puede comprender ingrediente(s) activo(s) encapsulado(s) en gel. Dichos materiales encapsulados en pueden prepararse por mezclado de un agente formador de gel (por ejemplo, gelatina, celulosa, o lignina) con un cultivo o suspensión de B. megaterium viva o inactivada, o un filtrado libre de células o fracción celular de un cultivo o suspensión de B. megaterium, o un cultivo secado por aspersión o congelamiento, célula, o fracción celular o en una solución de compuestos plaguicidas usados en el método de la invención; e inducir la formación de gel del agente.

La composición puede comprender adicionalmente un tensioactivo a ser usado con el propósito de emulsificación, dispersión, humectación, esparcimiento, integración, control de la desintegración, estabilización de ingredientes activos, y mejoramiento de la fluidez o inhibición de enmohecimiento. En una forma de realización particular, el tensioactivo es un tensioactivo no fitotóxico no iónico que preferentemente pertenece a la lista de EPA 4B. En otra forma de realización particular, el tensioactivo no iónico es polioxietileno (20) monolaurato. La concentración de tensioactivos puede variar en un rango entre 0,1 y 35% de la formulación total, un rango preferido es entre 5 y 25%. La selección de agentes dispersantes y emulsificantes, tales como agentes dispersantes y emulsificantes no iónicos, aniónicos, anfotéricos y catiónicos, y la cantidad empleada, se determina por la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de las composiciones de la presente invención.

La composición indicada precedentemente puede combinarse con otro microorganismo y/o plaguicida (por ejemplo, nematicida, fungicida, insecticida) . El microorganismo puede incluir a titulo enunciativo no taxativo un agente derivado de Bacillus sp. (por ejemplo, Bacíllus firmus, Bacillus thuringiensis , Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis) , Paecilomyces sp. (P. lilacinus) , Pasteuria sp. (P. penetrans) , Pseudomonas sp., BrevaBacillus sp. , Lecanicillíum sp., Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp (S. bikiniensis, S. costaricanus, S. avermitilis), Burkholderia sp., Trichoderma sp., Gliocladium sp., avermectina, Myrothecium sp., Paecilomyces spp., Sphingobacterium sp. , Arthrobotrys sp. , Clorosplrnium, Neobulgaria , Daldinia , Aspergillus, Chaetomium, Lysobacter spp, Lachnum papiraceum, Verticillium suchlasporium, Arthrobotrys oligospora , Verticillium chlamydosporium, Hirsutella rhossiliensis , Pochonia chlamydosporia , Pleurotus ostreatus , Omphalotus olearius, Lampteromyces jap nicas , Brevudi onas sp. , Muscodor sp.

Como alternativa, el agente puede ser un aceite natural o producto oleoso que tiene actividad nematicida, fungicida, bactericida y/o insecticida (por ejemplo, aceite parafinico, aceite de árbol de té, aceite de limoncillo, aceite de clavo de olor, aceite de canela, aceite de cítrico que incluye a título enunciativo no taxativo naranja amarga, naranja, y limón; aceite de romero, piretrum, pimienta de Jamaica, bergamota, goma azul, manzanilla, citronela, jazmín común, enebro común, lavanda común, mirra común, menta silvestre, fresia, santolina gris, hierba de hisopo, albahaca santa, árbol de incienso, jazmín, lavanda, caléndula, menta, menta acuática, caléndula de maceta, menta verde, árbol ylang-ylang, saponinas).

Adicionalmente, el plaguicida puede ser un agente antifúngico de sitio único que puede incluir a título enunciativo no taxativo bencimidazol, un inhibidor de desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolino, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor externo de quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarbono aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, bencenoide (xililalanina), un inhibidor de desmetilación seleccionado del grupo que consiste en imidazol, piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo, bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol), miclobutanilo, y un inhibidor externo de quinona (por ejemplo, estrobilurina). La estrobilurina puede incluir a titulo enunciativo no taxativo azoxistrobina, kresoxim-metilo o trifloxistrobina. En aún otra forma de realización particular, el agente antifúngico es una quinona, por ejemplo, quinoxifeno (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenil éter). El agente antifúngico también puede derivar de un extracto de Reynoutria .

El fungicida también puede ser un fungicida químico multisitio no inorgánico, seleccionado del grupo que consiste en cloronitrilo, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridin-amina, ciano-acetamida oxima.

Como se indica precedentemente, la composición además puede comprender un nematicida. Este nematicida puede incluir a título enunciativo no taxativo químicos tales como organofosfatos, carbamatos, y fumigantes, y productos microbianos tales como avermectina, Myrothecium sp. Biome ( Bacillus firmus) , Pasteuria spp. , Paecilomyces , y productos orgánicos tales como saponinas y aceites vegetales.

Las composiciones pueden aplicarse usando métodos conocidos en el arte. Específicamente, estas composiciones pueden aplicarse a y alrededor de las plantas o partes de la planta. Se debe entender que las plantas se refieren en el contexto presente a todas las plantas y poblaciones de plantas tal como plantas deseadas y no deseadas salvajes o plantas de cultivos (que incluyen plantas de cultivos de origen natural). Las plantas de cultivos pueden ser plantas que pueden obtenerse por cruza de plantas convencional y métodos de optimización o por bioteenología e ingeniería genética o por combinaciones de estos métodos, que incluyen las plantas transgénicas e incluyen los cultivares de plantas protegidos o no protegidos por los derechos de los cultivadores de plantas. Las partes de plantas se deben entender como que se refieren a todas las partes y órganos de plantas por encima y por debajo de la tierra, tales como brote, hoja, flor y raíz, los ejemplos que pueden mencionarse son hojas, espinas, pedúnculos, tallos, flores, cuerpos de frutas, frutas, semillas, raíces, tubérculos y rizomas. Las partes de las plantas también incluyen material cosechado, y material de propagación vegetativa y generativa, por ejemplo recortes, tubérculos, rizomas, retoños y semillas.

El tratamiento de las plantas y partes de plantas con las composiciones indicadas precedentemente puede realizarse directamente o permitiendo que las composiciones actúen en su alrededor, hábitat o espacio de almacenamiento por, por ejemplo, inmersión, aspersión, evaporación, niebla, dispersión, pintado, inyección. En el caso que la composición se aplique a una semilla, la composición puede aplicarse a la semilla como uno o más recubrimientos antes de plantar la semilla, o aplicarse como una lechada o polvo al plantarla, usando uno o más recubrimientos usando métodos conocidos en el arte. La semilla en una forma de realización particular puede ser una semilla modificada genéticamente.

Las plantas que pueden tratarse incluyen a titulo enunciativo no taxativo: (A) cultivos de alimentos comestibles principales, que incluyen a titulo enunciativo no taxativo (1) Cereales (por ejemplo, arroz africano, cebada, trigo candeal, trigo einkorn, trigo Emmer, mijo africano, mijo cola de zorro, pasto milán, mijo de cuadras de la India, mijo de cuadras japonés, maíz, nance, avena, mijo perlado, mijoporoso, arroz, centeno, sorgo, Sorghum spp, centeno. espelta (trigo); (2) Frutos (por ejemplo, abiú, acerola, achacha, mangostán africano, grosella alpina, ambarela o jobo indio, Grosella espinosa americana, caqui americano, manzana, damasco, arazá, palma de Palmyra asiática, Pera asiática, atemoya, uva pasa del desierto de Australia, palta, azaróle, babaco, bael, banana, grosella espinosa de Barbados, bergamota, nuez de betel, bignai, arándano, bilimbi, binjai, biriba, naranja amarga, aronia negra, mora negra, zapote negro, zarzamora, madreselva azul, borojó, fruto del pan, uva murmese, madroño, cacao, calamondina, canistel, melón cantalupo, grosella espinosa del cabo, nuez de cajú, cassabanana, cempedak, charichuelo, cherimoya, cereza, cereza del Rio Grande, cereza ciruela, espino chino, pera blanca china, aronia, toronja, cocona, coco, cocotero, café, café Arábigo, café robusto, pitahaya de Costa Rica, grosellas, chirimoya, dátil, ciruela negra, rosa silvestre, carapari, durián, saúco, manzana de elefante, berenjena de Etiopia, almez europeo, manzana silvestre europea, feijoa, higo, gac, jenipapo, granadilla gigante, grosella espinosa, baya plateada de fresa, uva, pomelo, morinda grande, ciruela Claudia, guayaba, kiwi resistente, jobo, melón kiwano, mango del sudeste asiático, higo de la India, jujube de la India, jabuticaba, jackberry, sapotillo, caqui japonés, frambuesa japonesa, jocote, jujube, lima kaffir, karanda, manzana kei, kepel manzana, lima clavo, arándalo, fruto del kiwi, korlán, kubal vid, mango kuwini, kwai muk, langsat, arándano grande, limón, café de Liberia, longan, loquat, litchi, manzana malaya, mamcy colorado o zapote, manzana marranee, mango, mangostán, maprang, marang, mediar, melón, ciruela Mirabelle, fruto del milagro, monkey jack, palmera moriche, papaya de la montaña, cachimón espinoso, mora, naranjilla, amatungulu, arándano azul del norte, olivo, grosella espinosa estrellada, quinoto oval, papaya, para guayaba, fruto de la pasión, pawpaw, durazno, tembé, pera, pepino, ananá, pitomba Eugenia luschnathiana, pitomba talisia esculenta, llantén, ciruela, granada, pomelo, pulasán, aronia púrpura, membrillo, rambután, ciruela gobernadora, frambuesa, aronia roja, grosella roja, mora roja, guayabo de frutos rojos, ruibarbo, rosa manzana, rosella, pera africana, salak o fruto serpiente, zarzamora americana, santol, sapodilla, satsuma, uva caleta, soncoya, guinda, guanábana, lima española, tamarindo español, caimito, carambola, frutilla, guayaba fresa, madroño, anón de azúcar, cereza de Surinam, rosa mosqueta, granadilla dulce, lima dulce, tamarillo, tamarindo, mandarina, tomatillo, palmera tucuma, Vaccinium spp, manzana aterciopelada, wampee, sandia, manzana de agua, manzana de agua cerosa, grosella silvestre, mora blanca, zapote blanco, caimito blanco, baya Goji ( Lyceum barbarum, L. chínense) , mombina amarilla, pitaya amarilla, frutilla de fruto amarillo, guayaba, (3) Verduras (por ejemplo, ackee, agate, papa voladora, Amaranthus spp, cacahuete americano, berenjena africana, pepino armenio, arracacha, ocumo, maranta, alcaucil, calabaza ceniza, espárrago, palta, haba azuki, cacahuete bambara, bambú, banana, grosella espinosa de Barbados, remolacha, remolacha raíz, calabaza amarga, yero, onugbu, mostaza negra, rábano negro, salsifí negro, apio blanco, fruto del pan, poroto pallar, brócoli, repollitos de bruselas, estrellamar, calabaza botón de oro, calabacete, col, caigua, calabacera, semillas de alcaravea, carob, zanahoria, curugua, mandioca, catjang, coliflor, apionabo, apio, lechuga china, acelga, chayóte, garbanzo, achicoria, chilacayote, pimiento picante ( Capsicum annuum, C. baccatum, C. chínense, C. frutescens, C. pubescens) , col chino, castaña de agua chino, yam chino, cebollas de verdeo, coyolón, cultivos de coles, haba común, verdolaga común, maíz salado, caupi, berro, pepino, zapallo cushé, árbol de moringa, ñampi, berenjena, ñame de pie de elefante, ajo elefante, endivia, enset, berenjena de Etiopia, hinojo de Florencia, calabaza acanalada, momordica o fruto del cielo, berza, ajo, cacahuete geocarpa, espárrago de los pobres, alverjón, cacahuete, habas de guar, gram caballo, rábano picante, frijol de Indias, higo marino, higo de la India, espinaca de la India, pepino cimarrón, alcaucil de Jerusalén, jicama, yute, col, colinabo, konjac, kurrat, puerro, lentejas, lechuga, frijol Lima, loto, luffa, maca-maca, maíz, remolacha forrajera, mashua, bambú moso, haba apolillada, frijol mungo, col napa, neem, oca, okra, bambú de Oldham, olivo, cebolla, chirivia, arveja, frijol guandú, llantén, calabaza parvar, papa, zapallos, calabazas, quinua, rábano, colza, amaranto rojo, ruibarbo, pepinillo estropajo, arroz negro, perejil de raiz, haba corredora, colinabo, palmera de sagú, salsifí, cebollin verde, col rizada, echalote, calabaza de serpiente, arveja china, alazán, soja, botón de oro, espinaca, espinaca remolacha, batata, taro, tarwi, melón amargo, frijol teparí, tinda, tomate, guisante tuberoso, nabo, perifollo bulboso, frijol urad, abrojo de agua ( Trapa bicornis) , abrojo de agua ( Trapa natans) , ipomoea de agua, blasón acuático, cebolla galesa, okra de África occidental, pepinillo de la India Occidental, cenizo blanco, ñame blanco, haba alada, verdolaga de invierno, yacón, yam, judia espárrago, calabacín zucchini); (4) Cultivos alimenticios (por ejemplo, abiú, acerola, achacha, ackee, mangostán africano, arroz africano, agate, papa voladora, grosella alpina, ñmarantous spp., ambarela, grosella espinosa americana, cacahuete americano, caqui americano, berenjena africana, manzana, damasco, arazá, pepino armenio, arracacha, ocumo, maranta, alcaucil, calabaza ceniza, palmera Palmyra asiática, pera asiática, espárrago, atemoya, uva pasa del desierto de Australia, palta, azaróle, haba azuki, babaco, bael, cacahuete bambara, bambú, banana, grosella espinosa de Barbados, cebada, remolacha, remolacha, bergamota, nuez de betel, bignai, arándano, bilimbi, binjai, biriba, calabaza amarga, naranja amarga, yero, onugbu, aronia negra, grosella negra, mora negra, mostaza negra, rábano negro, salsifí negro, zapote negro, zarzamora, apio blanco, madreselva azul, borojó, fruto del pan, poroto pallar, brócoli, repollitos de bruselas, Estrellamar, trigo sarraceno, árbol de sanya, calabaza botón de oro, calabacete, madroño, col, cacao, caigua, calabacera, calamondina, canistel, melón cantalupo, grosella espinosa del cabo, semillas de alcaravea, carob, zanahoria, nuez de cajú, mandioca, catjang, coliflor, apionabo, apio, lechuga china, cempedak, acelga, charichuelo, chayóte, cherimoya, cereza, cereza del Rio Grande, cereza ciruela, garbanzo, achicoria, chilacayote, pimiento picante ( Capsicum annuum, C. baccatum, C. chínense, C. frutescens, C. pubescens) , col chino, espino chino, castaña de agua chino, pera blanca china, yam chino, cebollas de verdeo, aronia, coyolón, toronja, cocona, coco, cocotero, café, café (Tipos Arábiga y Robusta), cultivos de coles, haba común, verdolaga común, maíz salado, Pitahaya de Costa Rica, caupi, berro, pepino, grosellas, zapallo cushé, chirimoya, dátil, ciruela negra, rosa silvestre, carapari, árbol de moringa, durián, trigo candeal, ñampi, berenjena, trigo einkorn, saúco, manzana de elefante, ñame de pie de elefante, ajo elefante, trigo Emer, endivia, enset, berenjena de Etiopia, Almez europeo, manzana silvestre europea, feijoa, higo, mijo africano, hinojo de Florencia, calabaza acanalada, mijo cola de zorro, momordica o fruto del cielo, berza, ajo, jenipapo, cacahuete geocarpa, granadilla gigante, espárrago de los pobres, grosella espinosa, baya plateada de fresa, uva, pomelo, alverjón, morinda grande, ciruela Claudia, cacahuete, grumichama, habas de guar, guayaba, pasto milán, kiwi resistente, jobo, melón kiwano, gram caballo, mango del sudeste asiático, rábano picante, frijol de Indias, higo marino, mijo de cuadras de la India, higo de la India, jujube de la India, espinaca de la India, pepino cimarrón, jabuticaba, ébano baya de chacal, sapotillo, jambul, mijo de cuadras japonés, caqui japonés, Frambuesa japonesa, Alcaucil de Jerusalén, jocote, jujube, yute, lima kaffir, col, karanda, manzana kei, kepel manzana, lima clavo, arándalo, fruto del kiwi, colinabo, konjac, korlan, kubal vid, kurrat, mango kuwini, kwai muk, langsat, arándano grande, puerro, limón, lentejas, lechuga, café de Liberia, frijol Lima, longan, loquat, loto, luffa, litchi, maca-maca, maíz, manzana malaya, zapote mamcy, manzana mammee, remolacha forrajera, mango, mangostán, maprang, marang, mashua, mediar, melón, ciruela Mirabelle, fruto del milagro, fruta monje, monkey jack, palmera moriche, bambú moso, haba apolillada, papaya de la montaña, cachimón espinoso, mora, frijol mungo, champiñones, nance, col napa, naranjilla, amatungulu, neem, arándano azul del norte, avena, oca, palmera oleaginosa, okra, bambú de Oldman, olivo, cebolla, naranja, grosella espinosa estrellada, quinoto oval, papaya, para guayaba, chirivia, fruto de la pasión, pawpaw, arveja, durazno, tembé, pera, mijo perlado, pepino, frijol guandú, ananá, pitombá ( Eugenia luschnathiana, Talisia esculenta) , llantén, ciruela, calabaza parvar, granada, pomelo, papa, mijo proso, pulasán, zapallos y calabazas, aronia púrpura, membrillo, quinua, rábano, rambután, ciruela gobernadora, colza, frambuesa, amaranto rojo, aronia roja, grosella roja, mora roja, guayabo de frutos rojos, ruibarbo, pepinillo estropajo, arroz, arroz negro, perejil de raiz, rosa manzana, rosella, haba corredora, colinabo, centeno, pera africana, palmera de sagú, salak o fruto serpiente, zarzamora americana, salsifí, santol, sapodilla, satsuma, cebollín verde, col rizada, uva caleta, echalote, calabaza de serpiente, arveja china, soncoya, sorgo, Sorghum spp, alazán, guinda, guanábana, soja, lima española, tamarindo español, espelta trigo, botón de oro, espinaca, espinaca remolacha, caimito, carambola, frutilla, guayaba fresa, madroño, anón de azúcar, remolacha azucarera, caña de azúcar, cereza de Surinam, rosa mosqueta, granadilla dulce, lima dulce, batata, tamarillo, tamarindo, mandarina, taro, tarwi, melón amargo, tef, frijol teparí, tinda, tomatillo, tomate, guisante tuberoso, palmera tucuma, nabo, perifollo bulboso, frijol urad, Vaccinium spp, manzana aterciopelada, wampee, abrojo de agua ( Trapa bicornis, T. natans) , ipomoea, blasón acuático, sandía, manzana de agua, manzana de agua cerosa, cebolla galesa, okra de África occidental, pepinillo de la India Occidental, trigo, grosella silvestre, cenizo blanco, mora blanca, zapote blanco, caimito blanco, ñame blanco, haba alada, verdolaga de invierno, baya Goji ( Lycium barbarum, L. chínense) , yacón, yam, árbol de fresa china, judia espárrago, mombina amarilla, pitaya amarilla, guayaba fresa de fruto amarillo, zucchini; (B) Otros cultivos comestibles, que incluyen, pero en un sentido no taxativo: (1) Hierbas (por ejemplo, ajenjo, apio caballar, albahaca, hoja de laurel, nuez de betel, manzanilla, perifollo, pimiento picante ( Capsicum annuum, C. baccatum, C. chínense, C. frutescens, C. pubescens) , pimientos picantes, cebollas de verdeo, perifollo oloroso, ruda, tomillo, coriandro, berro, cilantro, perejil de hola rizada, eneldo, epazote, hinojo, perejil común, ginseng, santolina gris, hipericón, albahaca sagrada, lúpulo, jas in, lima kaffir, lavanda, melisa, albahaca limón, pasto de limón o limoncillo, apio de monte, mejorana, menta, orégano, perejil, menta peperina, albahaca japonesa, caléndula cultivada, té roibos, romero, salvia, espino cerval de hoja brillante, alazán, hierba buena, ajedrea de jardín, estragón, albahaca tailandesa, valeriana, blasón acuático, lolot, ajedrea de invierno, yerba mate); (2) Especias (por ejemplo, ajowan, pimienta inglesa, anís, hoja de laurel, cardamomo negro, mostaza negra, pimienta negra, alcaparra, semillas de alcaravea, cardamomo, pimiento picante ( Capsicum annuum, C. baccatum, C. chínense, C. frutescens , C. pubescens) , pimientos picantes, canela, clavo de olor, enebro común, coriandro, comino, hinojo, fenogreco, ajo, jengibre, lima kaffir, regaliz, nuez moscada, orégano, pandán, perejil, azafrán, anís estrellado, cúrcuma, vainilla, mostaza blanca); (2) Plantas medicinales (por ejemplo, ajenjo, alfalfa, aloe vera, anis, alcaucil, albahaca, hoja de laurel, lolot, nuez de betel, arándano, cardamomo negro, mostaza negra, pimienta negra, goma azul, borojó, manzanilla, alcaparra, cardamomo, ricino, pimientos picantes, yam chino, cebollas de verdeo, nuez de cola, jasmín común, lavanda común, mirra común, ruda, cilantro, comino, eneldo, rosa silvestre, epazote, hinojo, fenogreco, momordica o fruto del cielo, ajo, jengibre, santolina gris, goma arábiga, hipericón, albahaca sagrada, rábano picante, árbol de incienso, lavanda, pasto de limón o limoncillo, regaliz, apio de monte, marihuana, mejorana, fruta monje, nee , opio, orégano, menta peperina, caléndula cultivada, quinina, acacia roja, grosella roja, té roibos, alazor, salvia, espino cerval de hoja brillante, alazán, botón de oro, anis estrellado, estragón, té, cúrcuma, valeriana, frijol aterciopelado, blasón acuático, mostaza blanca, zapote blanco, lolot, baya Goji (Lycium barbarum, L. chínense) , yerba mate); (3) Estimulantes (por ejemplo, lolot, nuez de betel, cacao, pimiento picante ( Capsicum annuum, C. baccatum, C. chínense, C. frutescens , C. pubescens) , pimientos picantes, café, café (arábiga, robusta), nuez de cola, khat, café de Liberia, té, tabaco, lolot, yerba mate); (4) Frutos secos (por ejemplo, almendra, nuez de betel, nuez de Brasil, nuez de cajú, castaña, castaña de agua chino, coco, nuez de cola, nuez común, cacahuete, avellana, roble de piedra japonés, macadamia, nuez moscada, nuez de pará, pacana o nuez de la isla, pistacho, nuez); (5) Semillas comestibles (por ejemplo, pimienta negra, nuez de Brasil, chilacayote, nuez de cola, calabaza acanalada, loto, opio, quinua, sésamo, girasol, abrojo de agua ( Trapa bicornis, T. natans) ; (6) Aceites vegetales (por ejemplo, de mostaza negra, de camelina, de ricino, de coco, de algodón, de linaza, de maíz, de neem, de beleño negro, de palmera oleaginosa, de oliva, de opio, de colza, de alazor, de sésamo, de soja, de girasol, del árbol de tung, de nabo); (7) Cultivos de azúcares (por ejemplo, palmera Palmyra asiática, datilera plateada, sorgo, remolacha azucarera, caña de azúcar); (8) Pseudocereales (por ejemplo, Amaranthus spp, trigo sarraceno, quinua, amaranto rojo); (9) Afrodisiacos (por ejemplo, borojó, apio, durián, berza, ginseng, maca-maca, acacia roja, frijol aterciopelado); (C) Categorías no alimenticias, incluyendo pero en un sentido no taxativo (1) cultivos de forraje y forrajeros (por ejemplo, agate, alfalfa, remolacha, poroto pallar, camelina, catjang, alverjón, habas de guar, gram caballo, mijo de cuadras de la India, mijo de cuadras japonés, trébol japonés, lupino, maíz, remolacha forrajera, mora, beleño negro, colza, arroz negro, centeno); (2) Cultivos con fibras (por ejemplo, coco, algodón, fique, cáñamo, henequén, yute, ceiba, kenaf, linaza, cáñamo de Manila, lino de Nueva Zelanda, ramio, rosella, sisal, mora blanca); (3) Cultivos para energía (por ejemplo, goma azul, camelina, mandioca, maíz, colza, sorgo, soja, pasto Sudán, remolacha azucarera, caña de azúcar, trigo); (4) Producción de alcohol, (por ejemplo, cebada, ciruela, papa, caña de azúcar, trigo, sorgo); (5) Cultivos de colorantes (por ejemplo, raíz de chaya-ver ( Oldenlandia umbellata) , henna, índigo, palo de mora, alazor, azafrán, cúrcuma); (6) Aceites esenciales (por ejemplo, pimienta inglesa, bergamota, naranja amarga, goma azul, manzanilla, citronela, clavo de olor, jasmín común, enebro común, lavanda común, mirra común, menta de campo, fresia, santolina gris, hipericón, albahaca sagrada, árbol de incienso, jasmín, lavanda, limón, caléndula, menta, naranja, menta peperina, caléndula cultivada, hierba buena, árbol de ilang-ilang); (6) Abonos verdes (por ejemplo, alfalfa, trébol, facelia, cáñamo de la India, trébol, frijol aterciopelado, tare); (7) Prevención de la erosión (por ejemplo, bambú, cocotero; (8) Mejoradores del suelo (por ejemplo, lupino, tare); (9) Cultivos de cobertura (por ejemplo, alfalfa, facelia, rábano) ; (10) Plaguicidas botánicos (por ejemplo, jicama, caléndula, neem, crisantemo); (11) Flores cortadas (por ejemplo, clavel, crisantemo, narciso, dalia, fresia, gerbera o margarita africana, caléndula, rosa, girasol, tulipán); (12) Plantas ornamentales (por ejemplo, mangostán africano, aloe vera, grosella alpina, áster, aronia negra, fruto del pan, calamondina, clavel, curugua, ricino, cereza ciruela, aronia, crisantemo, cocotero, lavanda común, crocus, narciso, dalia, fresia, gerbera o margarita africana, jacinto, roble de piedra japonés, jasmin, facelia, loto, lupino, caléndula, lino de Nueva Zelanda, opio, aronia púrpura, ramio, aronia roja, rosa, girasol, tulipán, mora blanca); (D) Árboles que incluyen, pero en un sentido no taxativo, abelia, almendro, manzano, damasco, tuya americana negra, árbol de la vida o tuya, fresno, álamo temblón, azalea, ciprés de los pantanos, arbusto de la belleza, haya, abedul, túpelo negro, zarzamora, arándano, boj, falso castaño, arbusto de las mariposas, nogal blanco, camelia, catalpa, cedro, cerezo, castaña, raigón del Canadá, manzanos, manzano silvestre, árbol de Júpiter, ciprés, cerezo falso, abeto de Douglas, ébano, sáuco americano, olmo, abeto, campanita china, ginkgo, jabonero de China, tala, espino, avellana, cicuta, pacano, acebo, acacia de tres espinas, castaño de las India, hortensia, enebro, lilo, tilo, magnolia, arce, celinda, serbal de los cazadores, roble, olivo, durazno, peral, pecana, pino, pistacho, plátanos, ciruelo, álamo, ligustro, frambuesa, retoño rojo, cedro rojo, secuoya roja, azalea, rosa de Siria, sasafrás, secuoya gigante, ciruelo silvestre, árbol de las pelucas, jaboncillo, oxidendro, picea, madroño, árbol de las anémonas, sicómoro americano, tulipero, durillo, nogal, veigela, sauce, aliso negro, escoba de bruja, olmo de agua; (E) Pastos que incluyen, pero en un sentido no taxativo, pasto azul Kentucky, festuca alta, pasto Bermuda, pasto zoysia, raigrás perenne, festucas finas (por ejemplo; festuca roja trepadora, masticable, dura o de oveja).

Las composiciones también pueden aplicarse al suelo usando métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Chitwood, "Nematicides", disponible en naldc.nal.usda.gov/download/43874/PDF). Dichos métodos incluyen a titulo enunciativo no taxativo fumigación, irrigación por goteo o quimiogación, incorporación a suelo, empapado de suelo, tratamiento y desinfección de semillas, empapado de raiz desnuda.

Usos plaguicidas Las composiciones, cultivos, sobrenadantes, metabolitos y compuestos plaguicidas detallados precedentemente pueden usarse como plaguicidas. En particular, las composiciones, cultivos, sobrenadantes, metabolitos y compuestos plaguicidas como se detalla precedentemente pueden usarse como insecticidas y nematicidas, solos o en combinación con una o más sustancias plaguicidas detalladas precedentemente.

Específicamente, los nematodos que pueden controlarse usando el método detallado precedentemente incluyen a título enunciativo no taxativo nematodos de vida libre, nematodos parásitos tales como nematodos nodularores de raíz, de quistes, y de lesiones, incluyen a título enunciativo no taxativo nematodos que forman agallas en semillas ( Afrina wevelli) , nematodos de agróstide ( Anguina agrostis) , nematodos que forman agallas en brotes ( Anguina spp.), nematodos que forman agallas en semillas ( Anguina spp., A. amsinckiae, A. balsamophila A. tritici) , nematodos que forman agallas en hoja de festuca (A. graminis) , nematodos en forma de pabellón de oreja (o agalla de trigo) ( Anguina tritici) , nematodos de retoños y hojas (o foliar) ( Aphelenchoides spp., A. subtenuis) , nematodos de hoja de begonia (o helécho, o alechugamiento, o foliar de frutilla, o nematodos de frutilla, o enano de verano) (A. fragariae), nematodos de helécho (A. olesistus) , nematodos de arroz (A. oryzae) , nematodos de grosella (A. ribes) , nematodos de casis (o crisantemo) (A. ritzemabosi) , nematodos foliar o de hoja de crisantemo (A. ritzemabosi) , nematodos de extremo blanco del arroz (o enano de primavera, o retoño de frutilla) (A. besseyi) , nematodos que se alimentan de hongos (champiñón) ( Aphelenchoides composticola) , Atalodera spp. ( Atalodera lonicerae, Atalodera ucri) , nematodos de espinas ( Bakernema variabile) , nematodos de aguijón ( Belonolaimus spp., B. gracilis, B. longicaudatus) , nematodos de madera de pino ( Bursaphalenchus spp., B. xylophilus, B. mucronatus) , nematodos de sésil ( Cacopaurus spp., C. epacris, C.pestis) , nematodos de quiste de amaranto ( Cactodera amaranthi) , nematodos de quiste de abedul (C. betulae) , nematodos de quiste de cáctus { C. cacti) , nematodos de quiste de estonio (C. estonica) , nematodos de quiste de Thorne (C. thornei) , nematodos de quiste de centidonia (C. weissi), nematodos de anillo ( Criconema spp.), nematodos de espinas ( Criconema spp., C. civellae, C. decalineatum, C. spinalineatum) , nematodos de anillo ( Criconemella axeste, C. curvata, C. macrodora, C. parva) , nematodos de anillo ( Criconemoides spp., C. citri, C. simile) , nematodos de espinas ( Crossonema fimbriatum) , nematodos de quistes de eucaliptus ( Cryphodera eucalypti) , nematodos de retoño, tallo y bulbo ( Ditylenchus spp., D. angustus, D. dipsaci, D. destructor, D. íntermedius ) , nematodos de cultivos de champiñones (D. mycelíophagus) , nematodos con estilete ( Dolichodorus spp., D. heterocephalus , D. heterocephalous), nematodos con lanza ( Dorylaimus spp.), nematodos simuladores ( Geocenamus superbus) , nematodos de quiste ( Globodera spp. ) , nematodos de quiste de milenrama (G. achilleae) , nematodos de quiste de hierba meona (G. millefolii), nematodos de quiste de manzana (G. malí), nematodos de quiste de papa blanca (G. pallida) , nematodos dorados (G. rostochiensis ) , nematodos de quiste de tabaco (G. tabacum) , nematodos de quiste de Osborne (G. tabacum solanacearum) , nematodos de quiste de ortiga toro ( G . tabacum virginiae), nematodos alfiler ( Gracilacus spp., G. ídalímus) , nematodos espiral ( Helicotylenchus spp., H. africanus, H. digonicus, H. dihystera, H. erythrinae, H. multicinctus, H. paragirus, H. pseudorobustus, H. solani, H. spicaudatus), nematodos vainoides ( Hemicriconemoides spp., H. biformís, H. californianus, H. chitwoodi, H. floridensis, H. wessoni) , nematodos con forma de vaina ( Hemicycliophora spp., Jí. arenaria, íí. biosphaera, H. megalodiscus, íf. parvana, H. poranga, H. sheri, H. similis, H. striatula ) , nematodos de quiste ( Heterodera spp.), nematodos de quiste de almendra (íí. amygdali) , nematodos de quiste de avena (o cereal) {H. avenae) , nematodos de quiste de guandul (o arveja guandú) ( H . cajani) , nematodos de quiste de bermudagrass (o con forma de corazón, o Valentín) ( H. cardiolata) , nematodos de quiste de zanahoria ( H. carotae) , nematodos de quiste de col o dorado de raíz de brassica (H. cruciferae) , nematodos de quiste de nutgrass (o juncia) {H. cyperi) , nematodos de quiste japonés ( H . elachista) , nematodos de quiste de higo (o ficus, o gomero) (H. fici) , nematodos de quiste de galeopsis (H. galeopsidis ) , nematodos de quiste de soja ( H . glycínes ) , nematodos de raíz de alfalfa (o quiste de arveja) ( H . goettingiana) , nematodos de quiste de trigo negro (H. graduni) , nematodos de quiste de cebada (H. hordecalis ) , nematodos de quiste de lúpulo {H. humuli), nematodos de quiste de cereal mediterráneo (o trigo) ( H . latipons ) , nematodos de quiste de lespedeza ( H . lespedezae) , nematodos de quiste de Kansas (fí. longicolla ) , nematodos dorado de raíz de cereales o de quiste de avena ( H . major) , nematodos de quiste de césped ( H . maní) , nematodos de quiste de alfalfa ( H . medicaginis) , nematodos de quiste de cyperus (o motha) ( Heterodera mothi) , nematodos de quiste de arroz ( H . oryzae) , nematodos Amu-Darya (o quiste de espina de camello) ( H . oxiana) , nematodos de quiste de acedera ( H . rosii) , cyst nematodos de quiste de Rumex ( H . rumicis) , nematodos de quiste de remolacha dulce ( H. schachtii) , nematodos de quiste de sauce ( H . salixophila) , nematodos de quiste de escleranto ( H . scleranthii) , nematodos de quiste de cerraja ( H . sonchophila) , nematodos de quiste de tadzhik ( H . tadshikistanica) , nematodos de quiste de turkmen (H. turcomanica ) , nematodos de quiste de clavo de olor ( H . trifolii) , nematodos de quiste de ortiga (H. urticae) , nematodos de quiste de ustinov ( H. ustinovi) , nematodos de quiste de arveja de vaca ( H. vigni ) , nematodos de quiste de maíz ( H. zeae) , nematodos de raíz de arroz ( Hirschmanniella spp., H. belli, H. caudacrena, H. gracilis, H. oryzae) , nematodos lanza ( Hoplolaimus spp.), nematodos de Columbra {H. columbus) , nematodos lanza de Cobb {H. galeatus) , nematodos lanza con cabeza de corona ( H. tylenchiformis ) , seudonematodos noduladores de raíz ( Hypsoperine graminis) , nematodos aguja ( Longidorus spp., L. africanus, L. sylphus), nematodos de anillo ( Macroposthonia {=Mesocriconema) xenoplax) , nematodos quistoides ( Meloidodera spp.), nematodos quistoides de pino ( M. floridensis) , nematodos quistoides de tadzhik ( M. tadshikistanica) , nematodos de cuerpo quistoide ( Meloidoderita spp.), nematodos simuladores ( Merlinius spp., M. brevidens, M. conicus, M. granáis, M. microdorus) , nematodos noduladores de raíz ( Meloidogyne spp., M. acronea, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. carolinensis , M. chitwoodi, M. exigua , M. graminicola, M. hapla, M. hisp nica, M. inc gnita , M. inc gnita acrita, M. indica, M. inornata , M. javanica , M. kikuyuensis, M. konaensis, M. malí, M. microtyla, M. naasi, M. ovalis, M. platani, M. querciana, M. sasseri, M. tadshikistanica, M. thamesi) , nematodos de centaurea (Mesoanguina picridís), nematodos de abeto de Douglas ( Nacobbodera chitwoodi) , falsos nematodos nodularores de raíz ( Nacobbus aberrans , N. batatiformis, N. dorsalis) , nematodos de pasta agria ( Panagrellus redivivus) , nematodos de cerveza ( P. silusiae) , nematodos aguja ( Paralongidorus microlaimus) , nematodos espiral ( Pararotylenchus spp.), nematodos de raíz gruesa ( Paratrichodorus allius, P. minor, P. porosus, P. renífer) , nematodos alfiler ( Paratylenchus spp., P. baldaccii, P. bukowinensis, P. curvitatus, P. dianthus, P. elachistus, P. hamatus, P. holdemani, P. italiensis, P. lepidus, P. nanus, P. neoamplycephalus, P. similis) , nematodos de lesión (o del prado) ( Pratylenchus spp., P. alleni, P. brachyurus, P. coffeae, P. convallariae , P. crenatus, P. flakkensis, P. goodeyi, P. hexincisus, P. leiocephalus, P. mínyus, P. musicola, P. neglectus, P.penetrans, P. pratensis, P. scribneri, P. thornei, P. vulnus, P. zeae) , nematodos que forman agallas en tallo ( Pterotylenchus cecidogenus) , nematodos de quiste de grama (Punctodera punctate) , nematodos simuladores ( Quinisulcius acutus, Q. capitatus) , nematodos excavadores ( Radopholus spp.), nematodos de raíz de banana (R. similis), nematodos de raíz de arroz (R. oryzae) , nematodos de anillo rojo (o coco, o cocotero) ( Rhadinaphelenchus cocophilus) , nematodos reniformes ( Rotylenchulus spp., R. reniformis, R. parvus), nematodos espiral ( Rotylenchus spp., R. buxophilus, R. christiei, R. robustus) , nematodos lanza de Thorne (R. uniformis) , Sarisodera hidrophylla, nematodos espiral ( Scutellonema spp., S. blaberum, S. brachyurum, S. bradys, S. clathricaudatum, S. christiei, S. conicephalum), nematodos que forman agallas en raíz de grama ( Subanguina radicicola ) , nematodos cisotides circulares ( Thecavermiculatus andinus) , nematodos de raíz gruesa ( Trichodorus spp., T. christiei, T. kurumeensis, T. pachydermis , T. primitivus) , anguílula del vinagre (o nematodos) ( Turbatrix acetí) , nematodos simuladoares (o estilete) ( Tylenchorhynchus spp., T. agri, T. annulatus, T. aspericutis, T. claytoni, T. ebriensis, T. elegans, T. golden, T. gracilíformis, T. martini, T. mashhoodi, T. microconus, T. nudus, T. oleraceae, T. penniseti , T. punensis) , nematodos de cítricos ( Tylenchulus semipenetrans) , nematodos daga ( Xiphinema spp., X. americanum, X. bakeri, X.brasiliense, X. brevicolle, X. chambersi , X. coxi, X. diver sicaudatum X. Índex, X. insigne, X. nigeriense, X. radicicola, X. setariae, X. vulgarae, X. vuittenezi) .

Se provee la aplicación de una cantidad para el control plaguicida eficaz de un sobrenadante, filtrado o extracto que contiene un metabolito plaguicidamente activo, o compuesto aislado producido por la B. megaterium o aplicación de combinaciones de los anteriores. Se aplica la cepa o sobrenadante o filtrado o extracto, metabolito y/o compuesto, solo o en combinación con otra sustancia plaguicida, en un control de plaga eficaz o cantidad plaguicida. Una cantidad eficaz se define como la cantidad de células de microorganismo, sobrenadante, filtrado o extracto, metabolito y/o compuesto solo o en combinación con otra sustancia plaguicida que es suficiente para modular la infestación por plaga. La tasa eficaz puede ser afectada por especies de plagas presentes, estadios de crecimiento de la plaga, densidad de población de la plaga, y factores ambientales tales como temperatura, velocidad del viento, lluvia, tiempo del día y estación del año. La cantidad que estará en un rango eficaz en una instancia particular puede determinarse por pruebas de laboratorio o campo.

Promoción del crecimiento vegetal Las composiciones descritas en la presente, en particular, Bacillus megaterium y/o un sobrenadante, filtrado, extracto, compuesto, metabolito o fracción celular obtenido de un cultivo de B. megaterium, puede usarse para modular o más particularmente promover el crecimiento de plantas, por ejemplo cultivos tales como frutas (por ejemplo, frutillas), vegetales (por ejemplo, tomate, zapallo, pimienta, palta), o cultivos de grano (por ejemplo, soja, trigo, arroz, maíz), árbol, flores, plantas ornamentales, arbustos (por ejemplo, algodón, rosas, planta de bulbo (por ejemplo, cebolla, ajo) o vid (por ejemplo, vid de uva). Las composiciones también pueden usarse para modular la germinación de una o más semillas en una o más plantas.

Las composiciones descritas en la presente, o producto formulado, pueden usarse solas o en combinación con uno o más de otros componentes como se describe más adelante, tal como agentes promotores del crecimiento y/o agentes antifitopatógenos en una mezcla en tanque o en un programa (aplicación en secuencia llamada rotación) con orden predeterminado e intervalo de aplicación durante la temporada de crecimiento. Cuando se usa en combinación con los productos mencionados anteriormente, a una concentración menor que la recomendada en la etiqueta del producto, la eficacia combinada de los dos o más productos (uno de los cuales es la mencionada composición descrita en la presente) es, en ciertas formas de realización, mayor que la suma del efecto de cada componente individual. Por lo tanto, el efecto es potenciado por el sinergismo entre estos dos (o más) productos, y se reduce el riesgo del desarrollo de resistencia a plaguicida entre las cepas patogénicas de plantas.

La composición puede aplicarse sumergiendo la raíz en el trasplante, específicamente por tratamiento de una fruta o vegetal vegetable con la composición hundiendo las raíces de la fruta o vegetal en una suspensión de dicha composición (aproximadamente 0,25 y aproximadamente 1,5 % y más particularmente aproximadamente 0,5% y aproximadamente 1,0% en volumen) antes del trasplante de la fruta o vegetal al suelo.

Como alternativa, la composición puede aplicarse por goteo u otro sistema de irrigación. Específicamente, la composición puede inyectarse en un sistema de irrigación por goteo. En una forma de realización particular, la composición se aplica a una concentración of lxlO8 UFC/ml en un volumen de entre aproximadamente 11 y aproximadamente 4 cuartos por acre.

En aún otra forma de realización, la composición puede agregarse como una aplicación en surcos. Específicamente, la composición puede agregarse como una aspersión en surcos durante el plantado usando boquillas calibradas para administrar una salida total de entre 2 y 6 galones/acre. Las boquillas se colocan en el abridor de surcos sobre la surcadora de forma que la aplicación de plaguicida y caída de la semilla en el surco sean simultáneas.

Las mezclas de las composiciones descritas con, por ejemplo, un adyuvante sólido o líquido se preparan de una forma conocida. Por ejemplo, las mezclas pueden prepararse por mezclado homogéneo y/o molienda de los ingredientes activos con extendedores tales como solventes, transportadores sólidos y, cuando resulta apropiado, compuestos con acción en superficie (tensioactivos). Las composiciones también pueden contener ingredientes adicionales tales como estabilizantes, reguladores de la viscosidad, aglutinantes, adyuvantes asi como fertilizantes u otros ingredientes activos con el objetivo de obtener efectos especiales.

Combinaciones con agentes promotores del crecimiento vegetal Las composiciones descritas en la presente pueden usarse en combinación con otros agentes promotores del crecimiento tales como fertilizantes sintéticos u orgánicos (por ejemplo, fosfato de diamonio, en forma granular o liquida), tés de cómpost, extractos de alga marina, hormonas de crecimiento vegetal tal como IAA (ácido indolacético) usadas en un tratamiento con hormonas para enraizamiento para trasplantes solas o en combinación con reguladores del crecimiento vegetal tal como IBA (ácido indolbutirico) y NAA (ácido naftalenacético), y microbios promotores del crecimiento, tal como, por ejemplo, Bacillus spp., Pseudomonads, Rhizobia, y Trichoderma .

Tratamiento de semillas Los tratamientos de semillas incluyen la aplicación de una composición plaguicida opcionalmente en combinación con otros agentes bioactivos, antagonistas o simbióticos a la superficie de una semilla antes de siembra. Pueden aplicarse toxinas, proteínas, y/o compuestos plaguicidas descritos en la presente a semillas como polvos secos, polvos en lechada o rociados sobre la semilla antes de plantarlas.

Las composiciones descritas en la presente pueden formularse para los tratamientos de semillas en cualquiera de los siguientes modos: polvo seco, polvo en lechada con agua, solución líquida, concentrado fluido o emulsión, emulsión, microcápsulas, gel, o gránulos que pueden dispersarse en agua.

En el caso de un polvo seco, el ingrediente activo se formula similarmente a un polvo humectable, pero con el agregado de un agente adhesivo, tal como aceite mineral, en lugar de un agente humectante. Por ejemplo, un kg de polvo de talco purificado (esterilizado durante 12 h), 15 g de carbonato de calcio, y 10 g de carboximetilcelulosa se mezclan bajo condiciones asépticas siguiendo el método descrito por Nandakumar y col (2001). El o los ingredientes activos se mezclan en una relación 1:2,5 (suspensión a mezcla seca) y el producto se seca a la sombra para reducir el contenido de humedad a entre 20 y 35%.

Las composiciones descritas en la presente también pueden usarse en combinación con agentes para recubrir semillas. Dichos agentes para recubrir semillas incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, etilenglicol, polietilenglicol, quitosano, carboximetilquitosano, musgo de pantano, resinas y ceras o fungicidas o bactericidas químicos con un modo de acción de sitio único, multisitio o desconocido.

En formas de realización adicionales, las composiciones descritas pueden aplicarse a semillas por imbibición de semillas o como un inoculo en polvo.

Agentes antifitopatógenos Las composiciones descritas en la presente también pueden usarse en combinación con otros agentes antifitopatógenos, tal como extractos vegetales, bioplaguicidas, protectores de cultivo inorgánicos (tal como cobre), tensioactivos (tal como ramnolípidos; Gandhi y col., 2007) o aceites naturales tales como aceite parafínico y aceite de árbol de té que poseen propiedades plaguicida o fungicidas químicas o bactericidas con un modo de acción de sitio simple, multisitio o desconocido. Como se define en la presente, un "agente antifitopatógeno" es un agente que modula el crecimiento de un patógeno vegetal, particularmente un patógeno que produce enfermedad transmitida por el suelo en una planta, o como alternativa previene la infección de una planta por un patógeno vegetal. Un patógeno vegetal incluye a título enunciativo no taxativo un hongo, bacteria, actinomiceto o virus.

Como se indica precedentemente, el agente antifitopatógeno puede ser un agente antifúngico de sitio simple que puede incluir a titulo enunciativo no taxativo bencimidazol, un inhibidor de desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolino, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato’ inhibidor externo de quinona, quinolina, dicarboximida, carboxi ida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarbono aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, bencenoide (xililalanina). En una forma de realización más particular, el agente antifúngico es un inhibidor de desmetilación seleccionado del grupo que consiste en imidazol, piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo, bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol). En una forma de realización más particular, el agente antifúngico es miclobutanilo. En aún otra forma de realización particular, el agente antifúngico es un inhibidor externo de quinona (por ejemplo, estrobilurina). La estrobilurina puede incluir a titulo enunciativo no taxativo azoxistrobina, kresoxim-metilo o trifloxistrobina. En aún otra forma de realización particular, el agente antifúngico es una quinona, por ejemplo, quinoxifeno (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenil éter).

En aún otra forma de realización, el fungicida es un fungicida químico multisitio no inorgánico seleccionado del grupo que consiste en cloronitrilo, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridina-amina, y ciano-acetamida oxi a.

En aún otra forma de realización adicional, el agente antifitopatógeno puede ser estreptomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, cobre, o kasugamicina.

EJEMPLOS La composición y los métodos que se describieron con anterioridad se ilustran con mayor detalle a través de los siguientes ejemplos no limitativos. Estos ejemplos solamente se proveen para ilustrar diversas reivindicaciones, y no para la limitar la invención reivindicada a los materiales, las condiciones, las proporciones en peso, los parámetros de procesamiento y los otros aspectos que se describen.

Ejemplo 1. Aislamiento e identificación de los microbios La cepa H491 fue aislada a partir de tierra que había sido recolectada en Kwadaso, Ghana, África. Las cepas M018 y J142 de Bacillus megaterium fueron obtenidas a partir de tierra que había sido recolectada en California. Las bacterias se obtuvieron a partir de las muestras con métodos de dilución en placa tradicionales, de acuerdo con la descripción de Lorch y col., 1995. En resumen, las muestras se suspendieron en agua desionizada estéril. Se prepararon series de diluciones de las muestras suspendidas en agua estéril. Algunas de estas diluciones se aplicaron sobre placas con agar (por ejemplo, agar de dextrosa de papa) y se incubaron en la oscuridad y a temperatura ambiente. Después de incubarlas durante varios dias, las colonias se recolectaron a partir de la superficie de las placas con agar.

Los aislados crecieron como colonias densas, planas y de color crema. Las bacterias aisladas eran gram-positivas.

Ejemplo 2. Identificación de las cepas H491, J142 y M018 de Bacillus megaterium. por medio de la secuenciación de los genes del ARNr y recA Los aislados (H491, J142 y M018) se identificaron como Bacillus megaterium a través de la amplificación del ARNr 16S y la secuenciación adicional del gen recA, mediante el uso de cebadores universales para bacterias (Cerritos y col., 2008).

El producto cultivado en una placa con dextrosa de papa durante 24 horas se raspó con un asa estéril y se suspendió nuevamente en un amortiguador apropiado para extraer el ADN. El ADN se extrajo usando el conjunto de elementos para extraer el ADN MoBio Ultra Clean. La calidad el ADN extraído y su cantidad se comprobaron por medio de una electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 ml.

Secuencias de ARNr Las reacciones de PCR con las que se amplificó el gen del ARNr 16S se llevaron a cabo combinando 2 mi del extracto de ADN depurado con 25 i de la mezcla maestra GoTaq, 1,5 mi del cebador directo (el cebador 27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID N° 10)) y 1,5 mi del cebador inverso (el cebador 1525R, 5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3' (SEQ ID N° 11)). El volumen de la reacción se completó hasta 50 mi con agua estéril libre de nucleasas. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termocielador, bajo las condiciones que se detallan a continuación: 10 minutos a 95°C (la desnaturalización inicial) y 30 ciclos de 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 55°C y 2 minutos a 72°C, seguidos por 5 minutos a 72°C (la extensión final), con una temperatura de mantenimiento final de 10°C.

El tamaño del producto de la PCR, su calidad y su cantidad se evaluaron por medio de una electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 ml, que fue seguida por la comparación de la banda correspondiente con una escala de la masa.

El exceso de los cebadores, de los nucleótidos, de las enzimas y del molde se eliminó del producto de la PCR mediante el uso del conjunto de elementos de depuración para PCR MoBio. El producto de la PCR depurado se sometió a una secuenciación directa con los cebadores que se describieron con anterioridad.

Se alinearon las secuencias directas (27F, SEQ ID N° 1) y las secuencias inversas (1525R, SEQ ID N° 2) mediante el uso del software BioEdit y se creó una secuencia de consenso de 1451 pb (véase SEQ ID N° 3 más adelante). La secuencia del gen 16S ARNr de consenso para la cepa H491 se comparó con secuencias del ARNr 16S representativas disponibles a través de un procedimiento BLAST. En el caso de la cepa H491, la coincidencia más cercana fue con Bacillus megaterium (número de acceso GenBank CP001983.1), con una similitud de 99%.

Secuencia 27F (SEQ ID N° 1) NNNNNNNNNGNNNGCTATAATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGA CGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACT TCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAG ATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA CGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTT GTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAA GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGG AATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGG CTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAA TTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC TTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAG TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACNGGTCGCAAGACTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCNCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAAC GCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTNNGATAGAGCGTTCCCCT TNNGGGACAGAGTGACAGGTGGNGCATGGGTTGTCGTCAGCTCNTGTCGTGAGATNNTG GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCNTTGATCTANNNCAGCATTCANNNGGNANTCTN NNNGACTGCNGNTGANNACCGNAGAAAGNTGGGGATGACNN Secuencia 1525R (SEQ ID N° 2) NNNNNNNNNNNNNNNCGACTTCaCCCCAATCATCTGTCCCACCTTAGGCGGCTAGCTCC TTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTG TACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCA GCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGG CTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAG GTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCA GTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGC GGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACT CTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGT AAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGT TAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGT GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTT ACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCG CTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCC TCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCANACTTAANAAACCGCCTGCGCGCGCTTTA CGCCCAATAATTNCNGATAACGCTTGNCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTA NNTAGCCGNGGNTTTCTGGTTAGGTACNGTCNNGGTACAAGCANNTACTCTNNACTNNN NTTNCNTAACANANANTTTACGACCCGAANNCNTCNTCACTCANGCGCNTNGCTCNNNC AGANTNTNNNNN Secuencia de consenso (SEQ ID N° 3) ATAATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGG GTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCT AATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCA CTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA CGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA CGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG TACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAA GCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGT CATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACT GACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC CGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACNGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC AGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGT GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCA ATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGG AATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC ACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGA GCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTG En el caso de la cepa M018, la coincidencia más cercana fue con la cepa PSB55 de Bacillus megaterium (número de acceso GenBan HQ242768), con una coincidencia de 99%. La identificación se llevó a cabo según se describió con anterioridad para la cepa H491.

Secuencia M018 FDl (SEQ ID N° 4) GCTATAcTGCAAGTCGAGCGAACTGATAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTGCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGC TAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATC ACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCC ACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA GTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAA AGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGG TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAAC TGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGC ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA GGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTG ACAGGTGGTGCATGGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTGGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAACGAGAAGGTGGGGATGACGTCGAATCATCATGCCCCTTAKGACCTGGGGC TWCACAMCGKTGCYWACAAKGGAATTGGTTAC Secuencia M018 RD1 (SEQ ID N° 5) TGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTAGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTAC TCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCC GGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACYAGCGATTCCTGCTTCATGTA GGCKAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCG CGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGG GCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAG AGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC CCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACMACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCG AAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTC GCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTT TGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGC ACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAA AAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGG AAATCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTG AGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAA TTCAGATAACGCTCGCCACCTACGTATTACCGCGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGC TTTCTGGTTAGTACCGTCAGTACAGCAGTACTCTGTACTTGTTCTTCCTAACAACAGAG TTTACGACCCGAAAGCCTTCATCATTC Secuencia de consenso M018 (SEQ ID N° 6) GCTATACTGCAAGTCGAGCGAACTGATAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTGCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGC TAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATC ACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCC ACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCA ACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA GTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCRAGCGTTATCYGGAATTATTGGGCGTAA AGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGG TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAWTTCCACGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAAC TGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACG CATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC AGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGT GACAGGTGGTGCATGGTKGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCA ATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTMGCCTACATGAAGCAGG AATCGCTRGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC ACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGA GCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACA En el caso de la cepa J142, la coincidencia más cercana fue con la cepa ZFJ-14 de Bacillus megaterium. La identificación se llevó a cabo según se describió con anterioridad para la cepa H491.

Secuencia J142 FD1 (SEQ ID N° 7) TGCTATAATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGA CGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAA GCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGGGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTA TCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CMACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAG CAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTACRAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT AAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAG GGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTA ACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAA CGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAGAACCTTAC CAGGTCTTGACATCCTCTGACACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGT GACAGTGTGCATGGTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTGGGTAGTCCCGCACGAGCG CACCTGATCTAGTGCAGCATTAGTGGCACTCTAGTGACTGCGTGACACGAGGAGGTGGG ATGACGTCATCATCATGCCCCTATGACTGGGCTACCACGTGCTACATGGATGTCAAGGC TGCAGACCGAAGTCAGCAATCATAAACATTCTCAGTCGAATGTAAGTCA Secuencia J142 RD1 (SEQ ID N° 8) CTTGTTCGACTTCCCCCAATCATCTGTCCCACCTTAGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTAC TCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCC GGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTA GGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCG CGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGG GCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAG AGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC CCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCG AAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTC GCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTT TGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGC ACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAA AAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGG AATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTG AGCCGTGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATA ATTCCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCG TGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCGAGGTACAAGCAGTTACTCTCGTACTTGTCTTCCCT AACACAGAGTTTTACGACCCGAAGCTCATCACTCAGCGCGTGCTCGTCGACTTCGTCAT TGCGAGATCCCTACTGCTGCTTCCGTAGGAGTCTGGACCTGTCTCAGTCAGGTGTGACG GATCACCCTCTTCAGTCGCCTATGTGCCACTCTCGTGGGTCCCG Secuencia de consenso J142 (SEQ ID N° 9) TGCTATAATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGA CGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAA GCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGGGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTA TCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CMACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAG CAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTACGAGAGTAACTGCTTGTACCTYGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGGAATTATTGGGCG TAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCACGGCTCAACCGTGG AGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTG TAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC CACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCT AACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCT TACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGA CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGA CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAA GCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAG CTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTA AGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGGAAGTCGAACAAG Secuencias recA Las reacciones de PCR para la amplificación del gen recA se llevaron a cabo combinando 2 ml del extracto de ADN depurado con 25 ml de la mezcla maestra GoTaq, 1,5 m? del cebador directo (recAf, 5'-GATCGTCARGCAGSCYT GAT-3', SEQ ID N° 12) y 1,5 m? del cebador inverso (recAr, 5'-TTWCCRACCATAACSCCRAC-3', SEQ ID N° 13). El volumen de la reacción se llevó hasta 50 m? con agua estéril libre de nucleasas. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termocielador, bajo las condiciones que se detallan a continuación: 5 minutos a 95°C (la desnaturalización inicial) y 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 45°C y 1 minuto a 72°C, seguidos por 5 minutos a 72°C (la extensión final), con una temperatura de mantenimiento final de 4°C.

El tamaño del producto de la PCR, su calidad y su cantidad se evaluaron por medio de un procedimiento en un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 m?, que fue seguida por la comparación de la banda correspondiente con una escala de la masa.

El exceso de los cebadores, de los nucleótidos, de las enzimas y del molde se eliminó del producto de la PCR mediante el uso del conjunto de elementos de depuración para PCR MoBio. El producto de la PCR depurado se sometió a una secuenciación directa con los cebadores que se describieron con anterioridad.

Se alinearon las secuencias directas y las secuencias inversas mediante el uso del software BioEdit y se creó una secuencia de consenso de 505 pb.

La secuencia del gen recA de consenso de cada una de las cepas (H491, J142 y M018) se comparó con secuencias bacterianas representativas a través de un procedimiento BLAST. La especie con la que hubo la coincidencia más cercana fue el genoma completo de Bacillus megaterium (número de acceso CP001982.1), con una similitud de 99%. Secuencia directa de recA para H491 (SEQ ID N° 14) TGAAAGCATTTGGTAAGGTTCAATTATGAAATTAGGTGAACAAACGGAAAAAAGAATTT CTACAATTCCAAGTGGTTCATTGGCGTTAGATATAGCCTTAGGTGTAGGTGGATATCCA CGTGGACGTGTAGTTGAAGTATATGGTCCAGAAAGCTCAGGTAAAACAACAGTTGCTCT TCATGCGATTGCAGAAGTTCAACAGCAGGGCGGACAGGCTGCATTTATCGATGCGGAGC ACGCGTTAGATCCTGTATATGCTCAAAAATTAGGTGTGAATATTGATGAGCTATTATTA TCTCAGCCTGATACGGGAGAACAAGCTTTAGAAATCGCTGAAGCTTTAGTTCGAAGCGG TGCAGTAGATATTATCGTTGTTGACTCAGTAGCAGCATTAGTGCCAAAAGCGGAAATTG AAGGAGAAATGGGAGACTCTCACGTGGGTCTACAAGCTCGTTTAATGTCTCAAGCATTG CGTAAACTATCTGGAGCTATCAATAAGTCTAAAACAATCGCTATCTTTATTAACCAAAT TCGTGAAAAAGTCGGCGTTnGGGTCGGAAAA Secuencia inversa de recA para H491 (SEQ ID N° 15) GWAGCGATTGTTTTAGACTTATTGATAGCTCCAGATAGTTTACGCAATGCTTGAGACAT TAAACKAGCTTGTAGACCCACGTGAGAGTCTCCCATTTCTCCTTCAATTTCCGCTTTTG GCACTAATGCTGCTACTGAGTCAACAACGATAATATCTACTGCACCGCTTCGAACTAAA GCTTCAGCGATTTCTAAAGCTTGTTCTCCCGTATCAGGCTGAGATAATAATAGCTCATC AATATTCACACCTAATTTTTGAGCATATACAGGATCTAACGCGTGCTCCGCATCGATAA ATGCAGCCTGTCCGCCCTGCTGTTGAACTTCTGCAATCGCATGAAGAGCAACTGTTGTT TTACCTGAGCTTTCTGGACCATATACTTCAACTACACGTCCACGTGGATATCCACCTAC ACCTAAGGCTATATCTAACGCCAATGAACCACTTGGAATTGTAGAAATTCTTTTTTCCG TTTGTTCACCTAATTTCATAATTGAACCTTTACCAAATTGCTTTTCAATTTGTTTTAAA GCCATATCWAAGCCTGCWWWGACGATC Secuencia de consenso para H491 (SEQ ID N° 16) AAGGTTCAATTATGAAATTAGGTGAACAAACGGAAAAAAGAATTTCTACAATTCCAAGT GGTTCATTGGCGTTAGATATAGCCTTAGGTGTAGGTGGATATCCACGTGGACGTGTAGT TGAAGTATATGGTCCAGAAAGCTCAGGTAAAACAACAGTTGCTCTTCATGCGATTGCAG AAGTTCAACAGCAGGGCGGACAGGCTGCATTTATCGATGCGGAGCACGCGTTAGATCCT GTATATGCTCAAAAATTAGGTGTGAATATTGATGAGCTATTATTATCTCAGCCTGATAC GGGAGAACAAGCTTTAGAAATCGCTGAAGCTTTAGTTCGAAGCGGTGCAGTAGATATTA TCGTTGTTGACTCAGTAGCAGCATTAGTGCCAAAAGCGGAAATTGAAGGAGAAATGGGA GACTCTCACGTGGGTCTACAAGCTCGTTTAATGTCTCAAGCATTGCGTAAACTATCTGG AGCTATCAATAAGTCTAAAACAATCGCT M018: secuenciación del gen recA Secuencia directa de recA para M018 (SEQ ID N° 17) TTGAAGCATTTGGTAAAGGTTCAATTATGAAATTAGGTGAACAAACGGAAAAAAGAATT TCTACAATTCCAAGTGGTTCATTAGCGTTAGATATAGCTTTAGGTGTAGGTGGATATCC ACGTGGACGCGTAGTTGAAGTATATGGTCCAGAAAGCTCAGGTAAAACAACAGTTGCTC TTCATGCGATTGCAGAAGTTCAACAGCAGGGCGGACAGGCTGCATTTATCGATGCGGAG CACGCGTTAGATCCTGTATATGCTCAAAAATTAGGTGTGAATATTGATGAGCTATTATT ATCTCAGCCTGATACGGGAGAACAAGCTTTAGAAATCGCTGAAGCTTTAGTTCGAAGCG GTGCAGTAGATATTATCGTTGTTGACTCAGTAGCAGCATTAGTGCCAAAAGCGGAAATT GAAGGAGAAATGGGAGACTCTCACGTGGGTCTACAAGCTCGTTTAATGTCTCAAGCATT GCGTAAACTATCTGGAGCTATCAACAAGTCTAAAACAATCGCTATCTTTATTAACCAAA TTCGTGAAAAAGTCGGCGTTnGGGTTCGGAAAA Secuencia inversa de recA para M018 (SEQ ID N° 18) GGTATAAAGATAGGCGATTGTTTTAGACTTGTTGATAGCTCCAGATAGTTTACGCAATG CTTGAGACATTAAAcgAGCTTGTAGACCCACGTGAGAGTCTCCCATTTCTCCTTCAATT TCCGCTTTTGGCACTAATGCTGCTACTGAGTCAACAACGATAATATCTACTGCACCGCT TCGAACTAAAGCTTCAGCGATTTCTAAAGCTTGTTCTCCCGTATCAGGCTGAGATAATA ATAGCTCATCAATATTCACACCTAATTTTTGAGCATATACAGGATCTAACGCGTGCTCC GCATCGATAAATGCAGCCTGTCCGCCCTGCTGTTGAACTTCTGCAATCGCATGAAGAGC AACTGTTGTTTTACCTGAGCTTTCTGGACCATATACTTCAACTACGCGTCCACGTGGAT ATCCACCTACACCTAAAGCTATATCTAACGCTAATGAACCACTTGGAATTGTAGAAATT CTTTTTTCCGTTTGTTCACCTAATTTCATAATTGAACCTTTACCAAATTGCTTTTCAAT TTGTTTTAAAGCCATATCWAAGCCTAAWWRGACGATCYA Secuencia de consenso (SEQ ID N° 19) AAGGTTCAATTATGAAATTAGGTGAACAAACGGAAAAAAGAATTTCTACAATTCCAAGT GGTTCATTAGCGTTAGATATAGCTTTAGGTGTAGGTGGATATCCACGTGGACGCGTAGT TGAAGTATATGGTCCAGAAAGCTCAGGTAAAACAACAGTTGCTCTTCATGCGATTGCAG AAGTTCAACAGCAGGGCGGACAGGCTGCATTTATCGATGCGGAGCACGCGTTAGATCCT GTATATGCTCAAAAATTAGGTGTGAATATTGATGAGCTATTATTATCTCAGCCTGATAC GGGAGAACAAGCTTTAGAAATCGCTGAAGCTTTAGTTCGAAGCGGTGCAGTAGATATTA TCGTTGTTGACTCAGTAGCAGCATTAGTGCCAAAAGCGGAAATTGAAGGAGAAATGGGA GACTCTCACGTGGGTCTACAAGCTCGTTTAATGTCTCAAGCATTGCGTAAACTATCTGG AGCTATCAACAAGTCTAAAACAATCG J142 : secuencia del gen recA Secuencia directa de recA para J142 (SEQ ID N° 20) GAAAGCATTTGGTAAGGTTCAATTATGAAATTAGGTGAACAAACGGAAAAAAGAATTTC TACAATTCCAAGTGGTTCATTAGCGTTAGATATAGCCTTAGGTGTAGGTGGATATCCAC GTGGACGTGTAGTTGAAGTATATGGTCCAGAAAGCTCAGGTAAAACAACAGTTGCTCTT CATGCGATTGCAGAAGTTCAACAGCAGGGCGGACAGGCTGCATTTATCGATGCGGAGCA CGCGTTAGATCCTGTATATGCTCAAAAATTAGGTGTGAATATTGATGAGCTATTATTAT CTCAGCCTGATACGGGAGAACAAGCTTTAGAAATCGCTGAAGCTTTAGTTCGAAGCGGT GCAGTAGATATTATCGTTGTTGACTCAGTAGCAGCATTAGTGCCAAAAGCGGAAATTGA AGGAGAAATGGGAGACTCTCACGTGGGTCTACAAGCTCGTTTAATGTCTCAAGCATTGC GTAAACTATCTGGAGCTATCAATAAGTCTAAAACAATCGCTATCTTTATTAACCAAATT CGTGAAAAAGTCGGCGTTnGGGTCGGAAAA Secuencia inversa de recA para J142 (SEQ ID N° 21) AGCGATTGTTTTAGACTTATTGATAGCTCCAGATAGTTTACGCAATGCTTGAGACATTA AACGAGCTTGTAGACCCACGTGAGAGTCTCCCATTTCTCCTTCAATTTCCGCTTTTGGC ACTAATGCTGCTACTGAGTCAACAACGATAATATCTACTGCACCGCTTCGAACTAAAGC TTCAGCGATTTCTAAAGCTTGTTCTCCCGTATCAGGCTGAGATAATAATAGCTCATCAA TATTCACACCTAATTTTTGAGCATATACAGGATCTAACGCGTGCTCCGCATCGATAAAT GCAGCCTGTCCGCCCTGCTGTTGAACTTCTGCAATCGCATGAAGAGCAACTGTTGTTTT ACCTGAGCTTTCTGGACCATATACTTCAACTACACGTCCACGTGGATATCCACCTACAC CTAAGGCTATATCTAACGCTAATGAACCACTTGGAATTGTAGAAATTCTTTTTTCCGTT TGTTCACCTAATTTCATAATTGAACCTTTACCAAATTGCTTTTCAATTTGTTTTAAAGC CATATCAAAGCCTGCTRAACRATCAA Secuencia de consenso (SEQ ID N° 22) AAGGTTCAATTATGAAATTAGGTGAACAAACGGAAAAAAGAATTTCTACAATTCCAAGT GGTTCATTAGCGTTAGATATAGCCTTAGGTGTAGGTGGATATCCACGTGGACGTGTAGT TGAAGTATATGGTCCAGAAAGCTCAGGTAAAACAACAGTTGCTCTTCATGCGATTGCAG AAGTTCAACAGCAGGGCGGACAGGCTGCATTTATCGATGCGGAGCACGCGTTAGATCCT GTATATGCTCAAAAATTAGGTGTGAATATTGATGAGCTATTATTATCTCAGCCTGATAC GGGAGAACAAGCTTTAGAAATCGCTGAAGCTTTAGTTCGAAGCGGTGCAGTAGATATTA TCGTTGTTGACTCAGTAGCAGCATTAGTGCCAAAAGCGGAAATTGAAGGAGAAATGGGA GACTCTCACGTGGGTCTACAAGCTCGTTTAATGTCTCAAGCATTGCGTAAACTATCTGG AGCTATCAATAAGTCTAAAACAATCGCT Todos los aislados presentaron una coincidencia de 99-100% con Bacillus megaterium DSM319 y con otras cepas de Bacillus megaterium. Con estos resultados, puede confirmarse la identidad de los tres aislados como Bacillus megaterium.

Ejemplo 3. Caracterización bioquímica de B. megaterium H491 Se determinó que la cepa H491 de Bacillus megaterium era gram-positiva, positiva para la ureasa, positiva para la catalasa, negativa para la oxidasa y positiva para la lipasa. La caracterización bioquímica extensa del aislado se realizó con microseries fenotipicas de Biolog. La microserie fenotipica completa de Biolog consiste en veinte placas con 96 cavidades, donde cada cavidad contiene una fuente diferente de carbono, de nitrógeno, de fósforo o de otros nutrientes. Algunas de las placas también contienen una variedad de antibióticos, de metales o de otros componentes para evaluar la susceptibilidad de la cepa aislada. Las lecturas de la absorbancia correspondientes a las cavidades en cada placa se compararon con una cavidad de control negativo. Las lecturas de la absorbancia que superan el umbral del control negativo son indicativas del crecimiento de la cepa aislada bajo las condiciones establecidas en la cavidad en cuestión, mientras que las lecturas idénticas o inferiores al control negativo reflejan que el aislado no prospera bajo las condiciones especificas en la cavidad. El análisis de H491 se llevó a cabo a 25°C, con placas duplicadas para cada análisis del fenotipo.

La cepa H491 de B. megaterium fue capaz de utilizar los hidratos de carbono, los ácidos orgánicos y los péptidos que se enumeran a continuación como fuentes de carbono: L-arabinosa, N-acetil-D-glucosamina, D-galactosa, L-ácido aspártico, L-prolina, D-trehalosa, dulcitol, glicerol, D-ácido glucurónico, D-ácido glucónico, D-xilosa, L-ácido láctico, D-manitol, L-ácido glutámico, D-glucosa-6-fosfato, D-ácido galactónico-g-lactona, D,L-ácido málico, D-ribosa, D-fructosa, a-D-glucosa, maltosa, D-melibiosa, timidina, L-asparragina, D-ácido aspártico, ácido a- cetoglutárico, sacarosa, L-glutamina, maltotriosa, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido bromosuccínico, L-alanina, Ala-Gly, metilpiruvato, L-ácido málico, L-lixosa, ácido pirúvico, dextrina, glucógeno, D-arabinosa, arbutina, 2-desoxi-D-ribosa, 3-O-b-D-galactopiranosil-D-arabinosa, gentiobiosa, palatinosa, D-rafinosa, salicina, estaquiosa, D-tagatosa, turanosa, ácido g-amino-N-butírico, D-glucosamina, ácido b-hidroxibutírico, ácido 5-ceto-D-glucónico, ácido quínico, D-ácido tartárico, L-ácido tartárico, L-ornitina, ácido L-piroglutámico y dihidroxiacetona.

Los sustratos que se enumeran a continuación no fueron usados como fuentes de carbono, lo cual se vio reflejado en lecturas de la absorbancia que fueron inferiores al umbral de control negativo: D-ácido sacárico, D-serina, D-sorbitol, L-fucosa, D,L-a-glicerol fosfato, L-ramnosa, D-ácido glucosamínico, 1,2-propanodiol, ácido a-cetobutírico, a-D-lactosa, D-glucosa-1-fosfato, ácido a-hidroxiglutárico-g-lactona, ácido a-hidroxibutírico, adonitol, 2'-desoxiadenosina, adenosina, D-treonina, ácido propiónico, ácido múcico, ácido glucólico, ácido tricarbalílico, L-treonina, N-acetil-D-manosamina, ácido D-málico, Gly-Pro, L-ácido galactónico-g-lactona, sulfato de condroitina C, a-ciclodextrina, inulina, laminarina, manano, N-acetil-D-galactosamina, ácido N-acetil-neuramínico, b-D-alosa, amigdalina, D-arabitol, L-arabitol, i-eritritol, D-fucosa, L-Glucosa, D-lactitol, b-metil-D-galactósido, 3-metilglucosa, b-metil-D-ácido glucurónico, a-metil-D-manósido, sedoheptulosano, L-sorbosa, xilitol, N-acetil-D-glucosaminitol, ácido d-amino valérico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido citracónico, ácido citramálico, ácido 2-hidroxibenzoico, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido a-ceto-valérico, ácido itacónico, áster metílico de ácido D-láctico, ácido malónico, ácido melibiónico, ácido oxálico, D-ribono-1,4-lactona, ácido sebácico, ácido sórbico, ácido succinámico, acetamida, L-alaninamida, ácido N-acetil-L-glutámico, glicina, L-homoserina, hidroxi-L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-fenilalanina, L-valina, D,L-carnitina, sec-butila ina, D,L-octopamina, 2,3-butanodiol, 2,3-butanodiona y 3 hidroxi-2-butanona.

H491 fue capaz de utilizar los aminoácidos que se enumeran a continuación como fuentes de nitrógeno: L-glutamina, L-ácido piroglutámico, L-ácido glutámico, L-asparragina, L-ornitina, D-asparragina, L-prolina, L-ácido aspártico, D-alanina, L-arginina, L-alanina, L-serina, D-ácido aspártico, L-triptófano y L-tirosina. También fue capaz de utilizar la urea, la putrescina, la agmatina, la N-acetil-D-glucosamina, la citidina, la guanosina, la inosina, la xantina, el ácido úrico, la alantoina, el ácido g-amino-N-butírico y el ácido a-amino-N-valérico como fuentes de nitrógeno orgánicas. H491 también podría utilizar el amoníaco, el nitrito y el nitrato como fuentes de nitrógeno inorgánicas.

H491 fue capaz de utilizar una variedad de sustratos como fuentes de fósforo, incluyendo el fosfato, el tiofosfato, el ditiofosfato, la D-glucosamina-6-fosfato, la cisteamina-S-fosfato, el 2',3'-monofosfato cíclico de uridina y el 5'-monofosfato de timidina.

El metabolismo de H491 se vio inhibido a un pH inferior a 5, pero fue restaurado a un pH de 4,5 en presencia de L-arginina, L-metionina y 5-hidroxi-lisina. Se observó su crecimiento a un pH de entre 5 y 10. La cepa no fue capaz de tolerar el NaCl en una proporción superior a 5%, y solamente presentó un crecimiento leve en presencia de 4% de NaCl. En el manual de bacteriología sistemática de Bergcy, se indica que los aislados de Bacillus megaterium pueden utilizar el citrato como única fuente de carbono, que la mayoría de ellos puede crecer en presencia de 7% de NaCl, aunque ninguno de ellos puede crecer en presencia de 10% de NaCl, y que la mayoría de las cepas no puede reducir el nitrato. En contraste, H491 no fue capaz de tolerar el NaCl en una proporción superior a 5% y fue capaz de utilizar tanto el nitrato como el nitrito como fuentes de nitrógeno.

Ejemplo 4. Producción de B. megaterium H491, M018 y J142 por medio de una fermentación Se produjo un sobrenadante con actividad nematicida a través de una fermentación sumergida con la cepa H491, bajo condiciones aeróbicas en un medio liquido V8. Otros medios apropiados incluyen el caldo de soja tríptico y cualquier otro medio nutritivo que contiene fuentes de carbono y de nitrógeno apropiadas.

Se inició una placa de siembra rayando una placa con agar de dextrosa de papa fresco con una pequeña cantidad de la cepa H491, mediante el uso de un asa estéril. La placa se incubó a 25°C durante 2-3 dias o hasta que se observó una biomasa suficiente en la superficie de la placa.

Se inoculó un matraz de siembra V8 de 50 i con un asa de siembra que contenia material que había sido recolectado a partir de la superficie de la placa con agar. La siembra se incubó en un agitador a 200 rpm durante 2 días.

Se inoculó un matraz Fernbach de 2,8 1 y sin separadores que contenía 500 mi del medio V8 con 2% de la siembra bajo condiciones asépticas. Se permitió que la fermentación procediera a 25°C durante 5 días, con agitación constante a 150-200 rpm.

El sobrenadante se obtuvo separando las células del caldo de fermentación agotado por medio de una centrifugación o por otros medios. La actividad del sobrenadante se verificó con el bioensayo que se describe a continuación.

Ejemplo 5. Caracterización adicional de B. megaterium H491, J142 y M018 Resistencia a los antibióticos La sensibilidad de las cepas H491, J142 y M018 de Bacillus megaterium a los antibióticos fue analizada mediante el uso de discos con antibióticos, en un medio de Muller-Hinton, según se describe en la ficha téenica microbiológica de PL N° 535. Los resultados que se obtuvieron después de una incubación a 25°C durante 48 horas se proveen en la tabla 1.

Tabla 1. Susceptibilidad de Bacillus megaterium H491, J142 y M018 a diversos antibióticos. El grado de susceptibilidad se indica como +++ (elevado), ++ (moderado) o + (marginal), y la resistencia se indica como (-).

Concentración H491 J142 M018 (mg) Tetracielina 30 +++ +++ +++ Kanamicina 30 +++ +++ +++ Eritromicina 15 +++ +++ +++ Estreptomicina 10 +++ +++ + Penicilina 10 +++ ++ Ampicilina 10 +++ +++ ++ Oxitetraciclina 30 +++ +++ +++ Cloranfenicol 30 +++ +++ ++ Ciprofloxacina 5 +++ +++ +++ Gentamicina 10 +++ +++ +++ Piperacilina 100 +++ + ++ Cefuroxima 30 +++ +++ +++ Imipenem 10 +++ +++ +++ Sulfametoxazol- 23,75/25 +++ +++ +++ trimetoprim Sensibilidad química La información relacionada con la sensibilidad química se obtuvo a partir de las microseries fenotípicas de Biolog. H491 resultó ser susceptible a los siguientes compuestos: clortetracielina, lincomicina, amoxicilina, cloxacilina, minociclina, capreomicina, demeclociclina, nafcilina, cefazolina, enoxacina, ácido nalidíxico, cloranfenicol, eritromicina, neomicina, cefalotina, kanamicina, penicilina G, tetraciclina, carbenicilina, oxacilina, penimepiciclina, paromomicina, vancomicina, sisomicina, novobiocina, 2,4-diamino-6,7-diisopropilpteridina, sulfadiazina, cloruro de bencetonio, tobramicina, sulfatiazol, ácido 5-fluoroorótico, sulfametoxazol, L-aspártico-b-hidroxamato, espiramicina, rifampicina, bromuro de dodeciltri etilamonio, azlocilina, 2,2'-dipiridilo, monohidrato de 6-mercaptopurina, doxiciclina, cromato de potasio, cefuroxima, 5- fluorouracilo, rolitetracielina, cloruro de cesio, acetato de talio (I), cloruro de cobalto (II), trifluoperazina, tilosina, acriflavina, furaltadona, cloruro de sanguinarina, ácido fusárico, ácido bórico, 1-hidroxipiridina-2-tiona (piritiona), cianato de sodio, cloruro de cadmio, ácido iodoacético, dicromato de sodio, cefoxitina, metaborato de sodio, cloranfenicol, metavanadato de sodio, cloruro de queleritrina, carbenicilina, nitrito de sodio, ácido etilenglicol-bis(éter b-aminoetililico)-N,N,N',N'-tetraacético, prometazina, ortovanadato de sodio, clorhidrato de guanidina, D-cicloserina, EDTA, 5,7-dicloro-8-hidroxiquinaldina, 5,7-dicloro-8-hidroxiquinolina, ácido fusidico sal de sodio, monohidrato de 1,10-fenantrolina, fleomicina, bromuro de domifeno, alexidina, 5-nitro-2-furaldehído de semicarbazona (nitrofurazona), metil viológeno, oleandomicina, sal de fosfato, puromicina, carbonil-cianuro de m-clorofenilhidrazona (CCCP), azida de sodio, menadiona, bisulfito de sodio, 2-nitroimidazol, hidroxiurea, 5-cloro-7-iodo-8-hidroxi-quinolina, sulfanilamida, trimetoprim, diclofluanida, sulfato de protamina, clorodinitrobenceno, diamida, cinoxacina, estreptomicina, rifamicina SV, telurito de potasio, selenito de sodio, hidroxamato de glicina, 4-cloro-3,5-dimetil-fenol, D-serina, tiosalicilato, salicilato de sodio, sulfacloropiridazina, oxicarboxina, 3-amino-l,2,4-triazol, clorpromazina, Niaproof, compuesto 48/80, tungstato de sodio, cloruro de litio, clorambucil, naftato de cefamandol, cefsulodina, cafeína, ketoprofeno, tianfenicol, trifluorotimidina, poli-L-lisina, pentaclorofenol, arsenito de sodio, lidocaína, periodato de sodio, cloruro de antimonio (III), clorhidrato de semicarbazida, tinidazol, 5-fluoro-5'-desoxiuridina, 2-fenilfenol, plumbagina, josamicina, ácido gálico, cloruro de metiltrioctilamonio, 2,4-dintrofenol, diacetato de clorhexidina, ácido trans-cinámico, disulfuro de tetraetiltiuram, FCCP, D,L-ácido tióctico, feneticilina, caprilato de sodio, lauril sulfobetaína (1-propanosulfonato de N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio), cloruro de cobalto (III) de hexamina, polimixina B, amitriptilina, apramicina, orfenadrina, D,L-propanolol, violeta de tetrazolio, tioridazina, atropina, ornidazol, proflavina, éter de 18-corona-6, violeta cristalino, dodina (n-dodecilguanidina), hexaclorofeno, 4-hidroxicumarina, oxitetracielina, pridinol, captano, ácido 3,5-dinitrobenzoico, 8-hidroxiquinoleína, patulina, tolilfluanida y troleandomicina.

Se observó resistencia en las cavidades que contenían los siguientes compuestos, que presentan una actividad antibacteriana conocida (en una concentración máxima de 4 gg) : amikacina, lomefloxacina, bleomicina, colistina, gentamicina, ofloxacina, polimixina B, sulfametazina, espectinomicina, ampicilina y ácido oxolinico.

Ejemplo 6. Composición de los ácidos grasos Después de llevar a cabo una incubación a 28°C durante 24 horas, se recolectaron células para la siembra con un asa, se las preparó y se separaron y se identificaron ésteres metílicos de los ácidos grasos usando el sistema de identificación microbiana de Sherlock (MIDI), según se ha descripto (véase Vandamme y col., 1992). Los ácidos grasos predominantes presentes en las cepas de Bacillus megaterium se detallan en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición (%) de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) en las diversas cepas de Bacillus megaterium con actividad nematicida FAME M018 J142 H491 14:0i 4,77 6,05 6,36 14:0 1,33 1,65 1,52 15:0i 41,89 32,97 32.03 15:Oai 36,7 42,93 44,41 16:0107cOH 1,32 1,39 1.03 16:0i 0,97 1,41 2,11 16:lcollc 3,56 4,03 3,16 16:0 2,06 2,96 3,47 17:liol0c 1,38 0,56 1,95 Suma en 4 1,08 0,71 3,97 17:0i 2,22 1,89 1,95 17:0ai 2,73 3,43 3,97 índice de similitud con B. 0,949 0,948 0,991 megaterium Todos los indices de similitud con los perfiles de los FAME en la base de datos se encontraron dentro del umbral de confianza para la especie (0,948-0,991). Se construyó un dendograma de acuerdo con procedimientos de análisis en conjunto para producir un apareamiento no ponderado sobre la base de la composición de los ácidos grasos. En función de los resultados que se obtuvieron, fue posible concluir que H491 (que se denomina MBI-303) es más similar a J142, y que M018 es más diferente de las otras dos cepas.

Ejemplo 7. Identificación de los aislados H491, M018 y J142 por medio de un procedimiento MALDI-TOF Las muestras fueron sometidas a un procedimiento espectrométrico de perfilamento e identificación de MALDI-TOF (desorción en una matriz asistida con rayos láser/ionización en el tiempo de vuelo) en MIDI Labs, Inc. (Newark, DE), con el fin de generar un perfil de las proteínas ribosomales de los aislados. El perfil fue comparado con una base de datos propia, de modo tal de identificar los aislados en función de las calificaciones obtenidas en el procedimiento de MALDI-TOF.

Las calificaciones obtenidas en el procedimiento de MALDI-TOF que tuvieron un valor superior a 2000 posibilitan una identificación confiable de la especie, las puntuaciones de entre 1700 y 1999 posibilitan una identificación a nivel del género, y las puntuaciones inferiores a 1700 son indicativas de la ausencia de coincidencias con la base de datos. En el procedimiento de MALDI-TOF, tanto H491 como M018 presentaron calificaciones superiores a 2000 (2163 y 2291, respectivamente), mientras que J142 presentó una calificación de 1972. En función de estos resultados, puede concluirse que el perfil de las proteínas ribosomales de J142 puede ser único dentro de la especie Bacillus megaterium.

Ejemplo 8. Eficacia de los aislados de Bacillus meqa.texrium sobre los nematodos ( Meloidogyne inc gnita) - análisis con agar A. Análisis con agua y agar N° 1 Para determinar y comparar el efecto de las diversas cepas de Bacillus megaterium sobre los nematodos ( Meloidogyne inc gnita VW6), se realizó un análisis con agar y agua. Se transfirieron retoños de pepino "White Wonder" con una edad de siete dias a placas de Petri de 60 mm de diámetro con agua y agar, a razón de una siembra/placa. Posteriormente, los pepinos fueron sometidos a un tratamiento con 300 mi del sobrenadante de la fermentación de B. megaterium H491 y 700 M. inc gnita/placa, con seis réplicas para cada tratamiento. Después de realizar una incubación durante 11 dias, se registró la cantidad de agallas en las raíces del pepino. En función de los resultados que se obtuvieron, que se detallan en la tabla 3, puede concluirse que todas las cepas dieron como resultado una disminución significativa en la cantidad de agallas en las raíces del pepino, en comparación con el control con agua.

Tabla 3. Efecto de los aislados provenientes del sobrenadante de la fermentación de Bacillus megaterium sobre la formación de agallas por parte del nematodo de los nudos de las raíces en el pepino Tratamiento Cantidad de % de disminución agallas en las agallas H491 3,3 + 1,4 66,7 + 13,7 J142 3,7 + 1,2 63,3 + 12,1 M018 5,8 + 1,5 41,7 + 14,7 Avid (1%) 1 + 0,5 95 + 5,5 Medio en 7 + 1,2 33,3 + 12,1 blanco Agua 10 + 2,6 0 + 26 B. Análisis con agar y retoños N° 2: efecto de B. megaterium H491 sobre las infestaciones de M. incógnita en el pepino Para evaluar el efecto de la porción superior del sobrenadante de B. megaterium H491 sobre nematodos de los nudos de las raíces ( Meloidogyne incógnita VW6) juveniles (J2), se llevó a cabo el análisis que se detalla a continuación en placas de Petri con un diámetro de 60 mm.

Se hicieron germinar semillas de pepino cv. "White Wonder" sobre papel de seda húmedo, en placas de Petri a temperatura ambiente. Una semana después, los retoños germinados fueron transferidos a placas de Petri con agar y agua, a razón de un retoño/placa. Se colocó una alícuota de 300 mi del sobrenadante de la fermentación de B. megaterium H491 en cada placa y se agregaron 300 J2 de M. inc gnita en 150 mi de agua desionizada. Las placas de Petri se recubrieron y se incubaron a 25°C durante 7 días. Se usó agua, papel vacio y Avid (al 0,1%) como controles negativos, negativos y positivos, respectivamente.7 dias después, se evaluó el efecto de cada una de las sustancias sobre la supervivencia de los nematodos, para lo cual se determinó la cantidad de agallas en las raíces del pepino y se expresó el resultado como un porcentaje del control con agua. Los experimentos se realizaron por duplicado.

En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 9, puede concluirse que el sobrenadante de B. megaterium H491 dio como resultado una disminución significativa en la cantidad de agallas en las raíces del pepino en los dos análisis, en comparación con el control con agua, lo que es una indicación de su eficacia sobre M. inc gnita y de su utilidad en la gestión de este nematodo en el pepino.

Ejemplo 9. Análisis in vi-tro con M. inc gnita y con M. hapla ?. Bioensayo nematicida in vitro con M. incógnita y con M. hapla Con el fin de garantizar un control consistente y apropiado de los nematodos en todas las fermentaciones de B. megaterium H491 que habían sido sometidas a una esterilización por filtración, se determinó la movilidad de nematodos de los nudos de las raíces juveniles (J2) por medio de un bioensayo in vitro, que se llevó a cabo en placas de cultivo de células de plástico con 96 cavidades. Este procedimiento se basa en una clasificación visual de la movilidad de los nematodos en cada cavidad tratada con H491, donde cada tratamiento se analiza en cuatro réplicas: se colocaron 100 mi de las soluciones que comprendían cada una de las muestras de los microbios en la cavidad correspondiente, a lo que siguió la adición de 30 mi de una dilución de 1:100 de una solución de un material conservante para plantas (PPM), útil para suprimir momentáneamente el crecimiento de los microbios y posibilita la visibilidad en cada cavidad. Finalmente, se agregaron 50 mi de la solución de los nematodos, que contenía aproximadamente 15 J2. Se cubrió la placa, se la incubó a 25°C durante 24 horas, se analizó el efecto de cada muestra y se lo registró de manera visual. La actividad nematicida se confirmó en 19 fermentaciones diferentes a pequeña escala, y generalmente fue cercana a 60%, tal como se representa en la figura 5.

B. Recuperación de los nematodos ( M. hapla) después de la exposición al sobrenadante de H491 Para evaluar el efecto del sobrenadante de H491 sobre la movilidad y la posterior recuperación de los nematodos de los nudos de las raíces ( Meloidogyne hapla) juveniles, se llevó a cabo el análisis que se detallará a continuación en placas convencionales de cultivo de células con 96 cavidades. Se aplicó una alícuota de 50 mi de cada una de las soluciones que se deseaba analizar sobre las cavidades apropiadas y luego se colocaron 50 J2 en 30 i de agua desionizada en cada cavidad. Las placas se cerraron con tapas y se incubaron a 25°C durante 72 horas. Se usó agua y el nematicida Avid® (al 1%) como controles positivos y negativos, respectivamente. El efecto de cada una de las sustancias sobre la movilidad de los nematodos se determinó después de 24, 48 y 72 horas, mediante la adición de una gota de NaOH 1 N en cada cavidad, y la proporción de nematodos móviles en cada tratamiento se expresó como un porcentaje de la cantidad inicial. Para evaluar la recuperación de la movilidad en cada tratamiento, se extrajo un volumen de 70 mi de cada cavidad y se diluyó la solución remanente en cada cavidad mediante la adición de 100 mi de agua desionizada. Las placas se incubaron nuevamente durante 24 horas, según se describió con anterioridad, después de lo cual se realizó la segunda evaluación de la movilidad. Se analizaron tres réplicas para cada tratamiento, y el análisis se llevó a cabo en dos ocasiones.

Los resultados se detallan en la tabla 4. Después de 48 horas, las cavidades que contenían los nematodos que fueron expuestos a la mayor cantidad de la solución de tratamiento se encontraban demasiado turbias para poder realizar una lectura sin eliminar los tratamientos por medio de un lavado. Por lo tanto, no se registró el porcentaje de nematodos móviles de manera directa después de 48 ó 72 horas. Se determinó que el porcentaje de nematodos móviles que fueron expuestos al sobrenadante de H491 se redujo al incrementarse la duración de la incubación. La tasa más baja (17,5%) se observó 72 horas después de la incubación. Estos resultados reflejan que el sobrenadante de H491 puede inmovilizar a los nematodos de los nudos de las raíces juveniles, y que este efecto puede durar al menos 72 horas.

Tabla 4. Porcentaje tasa de recuperación de Meloidogyne hapla después de 24, 48 y 72 horas de incubación con el sobrenadante de H491 Tratamiento* Candidato 24 24-24 48-24 72-24 Agua 95 ± 3,2 97,5 ± 95 ± 4,5 90 ± 4,5 2,7 Medio 78,3 ± 82,5 ± 82,5 ± 80 ± 4,5 2,6 2,7 2.7 Avid (1%) 10 ± 4,5 13,3 ± 11.7 ± 10 ± 4,5 2,6 2,6 H491 38 ± 2,7 35 ± 4,5 25 ± 5,5 17,5 ± 2,7 Los resultados que se proveen son los valores medios que se obtuvieron en dos análisis. *"24" denota que la observación se realizó de manera directa, 24 horas después de la incubación de los nematodos con los candidatos; "24-24" denota que la observación se realizó después de una incubación con los candidatos durante 24 horas, que fue seguida por una incubación con agua durante 24 horas; "48-24" denota que la observación se realizó después de una incubación con los candidatos durante 48 horas, que fue seguida por una incubación con agua durante 24 horas; "72-24" denota que la observación se realizó después de una incubación con los candidatos durante 72 horas, que fue seguida por una incubación con agua durante 24 horas.

Ejemplo 10. Análisis de la respuesta a la dosis con nemátodos de vida libre in vitro Para evaluar la eficacia y la estabilidad de un caldo de células completas de B. megaterium H491, se analizó el efecto de diversas soluciones del sobrenadante sobre la movilidad de J2: IX = fuerza completa; 0,75X = 75 i del sobrenadante de H491 más 25 mi de agua; 0,50X = 50 mi del sobrenadante de H491 más 50 mi de agua; 0,25x = 25 mi del sobrenadante de H491 más 75 mi de agua. La movilidad de los nematodos de los nudos de las ralees juveniles (J2) se determinó por medio de un bioensayo en el que se analizó la respuesta a la dosis in vitro, en placas de cultivo de células de plástico con 96 cavidades. Este procedimiento se basó en la clasificación visual de la movilidad de los nematodos en cada cavidad tratada con H491, donde cada tratamiento se analizó en cuatro réplicas: se colocaron 100 mi de las soluciones que comprendían las muestras de cada uno de los microbios en la cavidad correspondiente, a lo que siguió la adición de 30 mi de una dilución de 1:100 de una solución de un material conservante para plantas (PPM), útil para suprimir momentáneamente el crecimiento de los microbios. Finalmente, se agregaron 50 mi de la solución de los nematodos, que contenía aproximadamente 15 nematodos J2 de M. hapla, se cubrió la placa y se la incubó a 25°C durante 24 horas. Se analizó el efecto de cada muestra diluida y se lo registró de manera visual. En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 6, puede concluirse que el efecto sobre la movilidad varió desde aproximadamente 15% de nematodos inmóviles con una dilución al cuarto (0,25X) hasta 100% de nematodos inmóviles con el sobrenadante con una fuerza completa (lx). Ejemplo 11. Análisis en el invernadero A. Análisis con macetas en el invernadero: pepino con Meloidogyne inc gnita.

Para demostrar la actividad nematicida del sobrenadante de H491 sobre los nematodos de los nudos de la raíces (Meloidogyne inc gnita ) , se llevó a cabo un estudio en el invernadero con pepinos ( Cucumis sativus) cv. White Wonder y un sobrenadante como el producto que se deseaba analizar. Se sembró una planta de pepino por maceta, en arena que había sido tratada en una autoclave, y se realizó un cultivo en un invernadero, bajo iluminación natural. Una vez que las plantas alcanzaron una edad de dos semanas, se las trató con una alícuota de 40 mi del producto que se deseaba analizar, después de lo cual se inocularon 2000 J2 de M. inc gnita recientemente eclosionados en cada maceta. Una semana después, se aplicó una segunda porción de 40 mi del producto que se deseaba analizar, según se indicó con anterioridad. Se usó agua, un medio en blanco y Avid (al 0,1%) como controles negativos, negativos y positivos, respectivamente. Se procesaron cinco réplicas para cada uno de los productos que se deseaba analizar, y en el experimento se empleó un diseño de bloques completos al azar. Las plantas fueron cultivadas en un invernadero durante cuatro semanas adicionales, después de lo cual se las recolectó y se determinó el peso fresco de los brotes y de las raíces. Se registró la cantidad de nematodos en cada maceta y la cantidad de agallas en las raíces de cada planta.

En función de los resultados que se proveen en la tabla 5 más adelante, puede determinarse que, aunque el peso fresco de los brotes y las raíces de las plantas de pepino que fueron tratadas con el sobrenadante de H491 no difirió desde el punto de vista estadístico del que se determinó en los controles no tratados, las macetas en las que se aplicó el tratamiento con el sobrenadante de H491 presentaron significativamente menos nematodos que las que se usaron como controles sin tratar. Por otra parte, la cantidad de agallas en las raíces de las plantas de pepino que fueron tratadas con el sobrenadante de H491 fue significativamente menor que en las raíces de las plantas de control que fueron tratadas con agua o con el medio en blanco. Sobre la base de estos resultados, puede concluirse que el sobrenadante de H491 es eficaz para restringir la formación de agallas por parte de M. incógnita en el pepino.

Tabla 5. Efecto del sobrenadante de H491 sobre las infestaciones de Meloidogyne incógnita en el pepino, sobre la base de un análisis con macetas en un invernadero Tratamiento Peso de los Peso de las Cantidad de Cantidad de brotes (g) raíces (g) agallas nematodos Avid 15.2 ± 4,4 5.2 ± 2,1 0 ± 0 d 316 ± 193 Medio 24.3 ± 11,7 4,1 ± 2,5 19,6 ± 3,6 354 ± 195 Agua 21,1 ± 2,6 6.3 ± 1,2 29,0 ± 8,2 510 ± 256 H491 22,9 ± 5,6 5,6 ± 0,7 10,8 ± 2,8 332 ± 161 Los resultados que se proveen son los valores medios que se obtuvieron en dos análisis.

B . Análisis con macetas en el invernadero: efecto del sobrenadante de H491 sobre las infestaciones de Meloidogyne hapla en plantas de pepino y de tomate Se llevaron a cabo estudios en un invernadero con pepinos ( Cucumis sativus) cv. White Wonder y tomates ( Solanum lycopersicum) cv. Roma para demostrar la actividad nematicida del sobrenadante de H491 sobre los nematodos de los nudos de las raíces (M. hapla) . Se sembró una planta de pepino o de tomate por maceta, en arena que había sido tratada en una autoclave, y se realizó un cultivo en un invernadero, bajo iluminación natural. Una vez que las plantas de pepino alcanzaron una edad de dos semanas y las plantas de tomate alcanzaron una edad de tres semanas, se las trató con una alícuota de 40 mi por maceta del producto que se deseaba analizar, después de lo cual se inocularon 2000 individuos juveniles de M. hapla frescos en cada maceta. Una semana después, se aplicó un segundo tratamiento con el producto que se deseaba analizar sobre las macetas, según se indicó con anterioridad. Se usó agua, un medio y Avid (al 0,1%) como controles negativos, negativos y positivos, respectivamente. Se procesaron cinco réplicas para cada uno de los productos que se deseaba analizar, y en el experimento se empleó un diseño de bloques completos al azar. Las plantas de pepino fueron cultivadas en un invernadero durante cuatro semanas adicionales, mientras que las de tomate fueron cultivadas durante seis semanas adicionales, luego se las recolectó y se determinó el peso fresco de los brotes y de las raíces y la altura de los brotes. El vigor de las plantas y la formación de agallas en las raíces se calificaron en con una escala de 0-10. En el caso del vigor de las plantas, 0 representa las plantas muertas y 10 representa las plantas más saludables; en el caso de la formación de agallas en las raíces, 0 representa la ausencia de agallas y 10 representa la presencia de agallas en 100% de las raíces. También se registró la cantidad de nematodos en cada maceta.

Los resultados del primer análisis se proveen en las tablas 6 y 7, que corresponden al pepino y al tomate, respectivamente. El sobrenadante de H491 dio como resultado una disminución significativa en la cantidad de agallas en las raíces del pepino y en la cantidad de nematodos en el pepino y en el tomate, en comparación con el control tratado con agua. En el segundo análisis, la cantidad de agallas en las raíces y la cantidad de nematodos en el pepino se redujeron cuando se aplicó el sobrenadante de H491 sobre el pepino, pero esto no se observó en el tomate (tablas 8 y 9). En función de los resultados que se obtuvieron en estos dos análisis, puede concluirse que el sobrenadante de H491 da como resultado una disminución en la cantidad de agallas generadas por los nematodos de los nudos de las raíces en las plantas y en el daño provocado por ellos.

Tabla 6. Efecto del sobrenadante de H491 sobre Meloidogyne hapla en un primer análisis con pepinos en macetas en un invernadero Tratamiento Vigor de Cantidad de Cantidad de las agallas en nematodos plantas7 las raíces2 H491 9 ± 1 2 ± 1 2233 ± 924 Avid (1%¡ 0 + 0 0 + 0 0 + 0 Medio 3 + 1 7 ± 3 5233 ± 1097 Agua 1 ± 1 8 ± 1 5467 ± 611 Los resultados que se proveen son los valores medios que se obtuvieron en dos análisis. yEl vigor de las plantas se representa con una escala de 0-10: 0 representa las plantas muertas, 10 representa las plantas más saludables zLa cantidad de agallas en las raíces se representa con una escala de 0-10: 0 representa la ausencia de agallas, 10 representa la presencia de agallas en 100% de las raíces Tabla 7. Efecto del sobrenadante de H491 sobre Meloidogyne hapla en un primer análisis con tomates en macetas en un invernadero Tratamiento Altura de Peso de Peso de Cantida Cantidad los los las d de de brotes brotes raíces agallas nematodos (cm) (g) (g) H491 26 ± l2 17 ± 3 4,3 ± 2 2 + 1 140 Avid (1%) 8 + 8 1 + 1 0,4 ± 1 0 ± 0 0 Medio 31 ± 5 24 + 4 4,8 + 3 2 + 2 267 Agua 28 ± 6 14 ± 4 4,2 ± 1 2 + 1 325 Los resultados que se proveen son los valores medios que se obtuvieron en dos análisis.

Tabla 8. Efecto del sobrenadante de H491 sobre Meloidogyne hapla en un segundo análisis con pepinos en macetas en un invernadero Nematicida Peso de la Peso de Cantidad Cantidad de candidato porción las raíces de agallas nematodos superior Avid 16,1 ± 4,5 4,9 ± 2,5 0,2 ± 0,4 1180 ± 920 Medio 8.3 ± 2,6 2,1 + 1,5 6,0 + 1,2 3260 + 1590 Agua 5,9 ± 1,2 0,5 ± 0,3 7,2 ± 1,3 2580 ± 934 H491 9.3 ± 2,1 1,4 ± 0,7 2,6 + 1,0 1500 ± 412 Los resultados que se proveen son los valores medios que se obtuvieron en dos análisis.

Tabla 9. Efecto del sobrenadante de H491 sobre Meloidogyne hapla en un segundo análisis con tomates en macetas en un invernadero Nematicida Peso de la Peso de Cantidad Cantidad de candidato porción las raíces de agallas nematodos superior Avid 16,9 ± 4,8 6,2 ± 2,1 0 ± 0 332 ± 385 Medio 21,5 ± 5,9 8,3 ± 1,3 2,2 ± 2,8 342 ± 355 Agua 14,1 ± 1,1 5,7 ± 1,7 4,1 + 3,2 334 ± 241 H491 11,3 ± 4,6 4,4 ± 2,3 2,8 ± 3,8 332 ± 491 Los resultados que se proveen son los valores medios que se obtuvieron en dos análisis.

Ejemplo 12. Inmovilización de los nematodos en tierra infestada En este ejemplo se describe la determinación del efecto del sobrenadante de B. megaterium H491 sobre la movilidad y la viabilidad de los nematodos en tierra infestada. Este análisis se llevó a cabo con tierra de campo que habla sido infestada predominantemente con nematodos picadores o perforadores. Cada procedimiento consistió en 4 tratamientos, donde se empleó el sobrenadante de H491, un medio de cultivo en blanco, un control positivo (es decir, Avid® al 0,1%) y un control negativo (es decir, agua). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con un diseño de bloques completos al azar, con 8 réplicas. Se recolectaron doce litros de la tierra que contenia los nematodos deseados, se separó el césped y las raíces y se realizó una homogenización. Después de mezclar la tierra, se tomaron 5 muestras (de 100 cm3) con un método centrifugación y flotación en azúcar y se determinó la cantidad de nematodos de cada tipo en las muestras individuales, de modo tal de asegurar una distribución uniforme de los principales nematodos de interés (picadores o perforadores) en la tierra. Luego se separaron porciones medidas de 200 cm3 de la tierra que contenía los nematodos y se las colocó en una maceta de plástico de 2 x 2 x 2 pulgadas. Los tratamientos se aplicaron a través del riego (40 ml/maceta). Las macetas se colocaron en un banco de laboratorio, donde se las dejó durante 72 horas para exponer los nematodos a los tratamientos.

Posteriormente, la tierra en cada una de las macetas se lavó en un aparato de Baermann modificado, con el fin de extraer los nematodos. El aparato de Baermann permite que los nematodos vivos salgan de la tierra a través de un filtro e ingresen en el agua, donde pueden ser contados. Los nematodos muertos o inmóviles permanecen en la tierra. Después de incubar los aparatos de Baermann durante 96 horas, se recolectaron y se contaron los nematodos vivos. La cantidad de nematodos determinada para cada tratamiento se comparó mediante el uso de SAS 9.2, con un análisis de la separación entre las medias LSD de Fisher, con P £ 0,05 para todos los nematodos observados.

Se determinó el efecto del sobrenadante de H491 sobre nematodos parásitos de las plantas de cuatro géneros. Los cuatro géneros de nematodos propios de la tierra del campo que se usaron en el análisis fueron los nematodos picadores, los nematodos perforadores, Peltamigratus sp. y Scutellonema sp. La cantidad de nematodos picadores se incrementó 5% en la tierra que fue expuesta al medio de cultivo, en comparación con la tierra que solamente fue tratada con agua. En comparación con el control negativo (la tierra que fue expuesta al agua), en la tierra que fue expuesta a Avid o al sobrenadante H491 se observó una disminución de 14% en la cantidad de nematodos picadores.

La cantidad de Peltamigratus sp. se redujo 7%, 32% y 88% después de tratar la tierra con el medio, con el sobrenadante de H491 y con Avid, respectivamente, en comparación con el control negativo (agua). La cantidad de Scutellonema sp. se mantuvo sin cambios en la tierra que fue tratada con el medio de cultivo, en comparación con el control negativo (agua), y se redujo 17% y 75% en la tierra que fue tratada con H491 y con Avid, respectivamente, en comparación con el control negativo (agua). La cantidad de nematodos perforadores se redujo 9%, 35% y 69% en la tierra que fue tratada con el medio, con el sobrenadante de H491 y con Avid, respectivamente, en comparación con el control (agua).

Ejemplo 13. Extracción y aislamiento de compuestos a partir de un sobrenadante de cultivo de B. megaterium H491 El siguiente procedimiento se usó para purificar compuestos a partir de cultivos de B. megaterium. En resumen, se extrajo un extracto en bruto de un caldo de cultivo de B. megaterium H491 con Amberlite y se fraccionó el extracto en bruto por medio de cromatografía líquida de vacío. Se sometió una de las fracciones activas que se obtuvieron en la VLC a un fraccionamiento adicional por medio de una HPLC y se identificaron los compuestos activos. A partir de la fracción 3 de la VLC, se obtuvo el compuesto con actividad nematicida ácido 4-fenilbutanoico (el compuesto 1) como se describirá a continuación. Cromatografía líquida con el extracto en bruto El caldo de cultivo que obtenido a partir de una fermentación de 10 1 de B. megaterium en un caldo V-8 se extrajo con una resina Amberlite XAD-7 (Asolkar y col., 2006), para lo cual la suspensión que contenía las células se centrifugó con la resina a 225 rpm, a temperatura ambiente durante dos horas. La masa que contenía la resina y las células se recolectó por medio de una filtración a través de un tejido perforado y se lavó con agua desionizada para eliminar las sales. Posteriormente, la resina, la masa que contenía las células y el tejido perforado se sumergieron durante 2 horas en una mezcla de acetona y metanol (50/50), después de lo cual se eliminó la mezcla de acetona y metanol y se realizó un secado al vacio, mediante el uso de un evaporador rotatorio, de modo tal de obtener un extracto en bruto. El extracto en bruto se fraccionó por medio de una cromatografía líquida con una fase inversa C18 al vacío (con una mezcla de ¾0 y CH3OH, en un gradiente de entre 80%/20% y 0%/100%), con lo que fue posible obtener 6 fracciones (figura 1). Se concentraron las fracciones obtenidas hasta secarlas mediante el uso de un evaporador rotatorio y se analizó la actividad biológica de los residuos secos resultantes sobre M. inc gnita y sobre M. hapla .

Análisis para determinar la actividad biológica de las fracciones obtenidas en la VLC sobre un extracto de Bacillus mega terium Las fracciones 1-6 de la VLC se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y se sometieron a un bioensayo in vitro en una placa de cultivo de células de plástico con 96 cavidades, con el propósito de identificar las fracciones que contenían los metabolitos activos deseadas. Para analizar la actividad biológica, se expusieron 15-20 nematodos J2 en 50 mi de agua a 100 mi de una fracción con una concentración de 4 mg/ml, a 25°C durante 24 horas. Cada fracción se analizó por cuadruplicado. El análisis se basó en una clasificación visual de la inmovilidad de los nematodos juveniles (J2) en cada cavidad. Los resultados se representan en la figura 7.

Fraccionamiento de las fracciones de la VLC por medio de una HPLC con una fase inversa Las fracciones activas se sometieron a una HPLC con una fase inversa, en un sistema Spectra P4000 (de Thermo Scientific), de manera tal de obtener los compuestos puros, que luego fueron sometidos a un bioensayo como el que se describió con anterioridad para identificar los que presentaban actividad. Para confirmar la identidad de los compuestos, se realizaron análisis espectroscópicos adicionales, por ejemplo, de LC/MS o de RMN.

La fracción 3 (que se describió con anterioridad) se aplicó sobre una columna de HPLC C-18 (una columna Luna C18 (2), de Phenomenex, de 10 mm, 100 A y 250 m x 30 m), que fue revelada con un gradiente de un sistema de solventes que comprendió agua y acetonitrilo (entre los minutos 0 y 10, se empleó CH3CN acuoso al 80%-70%, entre los minutos 10 y 45, se empleó CH3CN acuoso al 70%-50%, entre los minutos 45 y 55, se empleó CH3CN acuoso al 35%-30%, entre los minutos 55 y 60, se empleó CH3CN acuoso al 30%-20%, entre los minutos 60 y 65, se empleó CH3CN acuoso al 20%-0%, entre los minutos 65 y 75, se empleó CH3CN acuoso al 100% y entre los minutos 75 y 80, se empleó CH3CN acuoso al 0%-80%), con un flujo a una velocidad de 7 ml/minuto y una detección UV a 210 nm. El compuesto activo ácido 4-fenilbutanoico (1) se caracterizó por un tiempo de retención de 47,85 minutos.

Análisis para determinar la actividad biológica de las fracciones obtenidas en la HPLC Cada pico de la HPLC fue sometido a un bioensayo in vitro en una placa de cultivo de células de plástico con 96 cavidades, con el fin de identificar los que contenían los metabolitos activos deseados. En estos experimentos, se expusieron 15-20 nematodos en una solución de 50 mi de agua a 3 mi de un preparación de cada pico con una concentración de 20 mg/ml, a 25°C durante 24 horas. Una vez terminado el período de incubación, se realizó una clasificación visual de la inmovilidad de los nematodos juveniles (J2) en cada cavidad tratada con los picos purificados H1-H38 de H491, y cada tratamiento se analizó por cuadruplicado. En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 8, puede concluirse que en H491 se producen numerosos compuestos con actividad plaguicida. La fracción 29 fue seleccionada para realizar análisis y evaluaciones adicionales.

Análisis de los compuestos por medio de una espectrometría de masa Se llevó a cabo un análisis de espectrometría de masa de los picos activos que se obtuvieron en la HPLC con un instrumento de electronebulización (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus, usando los modos de ionización positiva y de ionización negativa, con una modalidad de barrido completo (m/z entre 100 y 1500 Da), en un espectrómetro de masa LCQ DECA XPplus (de Thermo Electron Corp., San José, CA). La cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) se llevó a cabo en un instrumento de Thermo, que estuvo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA Plus, un analizador automático de muestras, una bomba MS y una columna Luna C18, de 5 mm, 100 A y 4,6 mm x 100 mm (de Phenomenex). El sistema de solventes consistió en agua (el solvente A) y acetonitrilo (el solvente B). La fase móvil comenzó con 10% del solvente B, que se incrementó de manera lineal hasta 100% en un periodo de 20 minutos, luego se mantuvo durante 4 minutos y finalmente se modificó nuevamente hasta 10% en un periodo de 3 minutos, una proporción que se mantuvo durante 3 minutos. El flujo fue de 0,5 ml/minuto. El volumen inyectado fue de 10 ml, y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un analizador automático de muestras. Los compuestos fueron sometidos a un análisis de LC-MS, a un análisis de LC y a una cromatografía con una fase inversa. El análisis de espectrometría de masa de los compuestos que se han descripto se llevó a cabo bajo las condiciones que se detallan a continuación. La velocidad del flujo del nitrógeno gaseoso se fijó en 30 y 15 arb para el barrido circundante y para el barrido auxiliar, respectivamente. La ionización por electronebulización se aplicó con un voltaje de atomización de 5000 V y una tensión capilar de 35,0 V. La temperatura del capilar se fijó en 400°C. Los resultados se analizaron con el software Xcalibur. El ácido 4-fenilbutanoico (1) presentó una masa molecular de 163,34 en el modo de ionización negativa (véase la figura 2).

Análisis de espectrometría de RMN de los compuestos Los espectros de RMN se adquirieron con un espectrómetro Bruker, con un campo de gradiente a 600 MHz. Como referencia interna, se usó tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm).

Para elucidar la estructura del ácido 4-fenilbutanoico (1) purificado, cuyo peso molecular es de 164, se lo sometió a un análisis de RMN adicional con un instrumento a 600 MHz. En la RMN del 1H, se detectaron los siguientes valores d: 7,28 (2H), 7,19 (2H), 7,17, 2,67, 2,31 y 1,92 (véase la figura 3). En la RMN del 13C, se detectaron los siguientes valores: 177,5, 142,9, 129,5, 129,5, 129,4, 129,4, 126,9, 36,1, 34,4 y 28 (véase la figura 4). El compuesto activo fue aislado como un sólido incoloro, con bandas de absorción UV a 220 y 283 nm. En el espectro de masa con ionización por electronebulización negativa, el pico del ión molecular se encontró en m/z 163,32 [M-H]~ y 327,14 [2M-H], por lo que fue posible concluir que su peso molecular era de 164, lo cual es coherente con su fórmula molecular, CI0HI0O2 (con 5 grados de insaturación). En el espectro de RMN del H, se observaron señales indicativas de la presencia de un anillo aromático monosustituido (d 7,28, 2H, d, J = 7,7 Hz; 7,19, 2H, d, J = 7,7 Hz; 7,171H, t, J = 7,7 Hz). Por otra parte, en el espectro de RMN del 1H se observó la presencia de tres grupos metileno con valores d 2,62, 2H, t, J = 7,92 Hz, 2,30, 2H, t, J = 7,65, y 1,92, 2H, q, J = 7,65 Hz. Cuando el espectro de RMN del 13C del compuesto (1) fue interpretado con la ayuda de un procedimiento de HSQC, fue posible determinar la presencia de 10 átomos de carbono, que incluyeron una unidad de carbonilo (da 177,5), seis átomos de carbono sp2, uno de los cuales no estaba protonado (5C 142,9), cinco átomos de carbono protonados (5C 129,5, 129,5, 129,4, 129,4 y 126,9) y tres unidades de metileno (5C 36,1, 34,4 y 28,1). En el análisis basado en correlaciones COSY y HSQC, se observaron dos sistemas de espines, uno compuesto por tres grupos metileno con una estructura -CH2-CH2-CH2- y otro compuesto por un anillo de benceno monosustituido. Por medio de análisis ACOGEDOR, HMQC y HMBC detallados, se determinó que el compuesto presentaba la estructura propia del ácido 4-fenilbutanoico. Esta estructura fue confirmada por medio de una comparación con una muestra sintetizada. Este compuesto habla sido aislado a partir de la bacteria marina B. pumilus S6-15 e inhibe la formación de biopeliculas en las especies gram-negativas y gram-positivas (Nithya y col., 2011).

Ejemplo 14. Análisis con un cono en un invernadero: efecto de Meloídogyne inc gnita sobre retoños de tomate Se llevaron a cabo análisis con tomates ( Solanum lycopersicum) cv. UC 82 en un invernadero para determinar la actividad nematicida del sobrenadante de H491 sobre nematodos de los nudos de las raíces ( M. incógnita) . En cada cono (de Stuewe & Sons, Inc, Tangent, OR), se colocó un retoño de tomate con una edad de 25 días en una mezcla de arena y tierra (2:1) que había sido tratada en una autoclave y se realizó un cultivo en un invernadero, bajo iluminación natural. 16 días después, cada uno de retoños de tomate (que comprendían 3-4 hojas verdaderas) fue tratado con una alícuota de 10 mi de un caldo de células completas (WCB) de H491 y de otros productos que se deseaba analizar, para lo cual la alícuota fue vertida directamente en la superficie del suelo. Luego se inocularon 4000 huevos de M. inc gnita suspendidos en 1 mi de agua en tres orificios de 6 cm de profundidad alrededor de los tallos en cada cono. Una semana después, se aplicó un segundo tratamiento sobre los conos, en una tasa idéntica a la que se había empleado con anterioridad. Se usó agua y Avid (625 ppm) como controles negativos y positivos, respectivamente. Se analizaron cuatro réplicas, y en el experimento se empleó un diseño de bloques completos al azar. Las plantas fueron cultivadas en un invernadero durante 3 semanas y luego fueron removidas. Posteriormente, se analizó la fitotoxicidad, el peso fresco de la porción superior (o de los brotes), el peso fresco de las raíces y la cantidad de agallas en cada raíz y en total, donde esta última se basó en una escala de 0-10 (donde 0 representó la ausencia de agallas y 10 representó la presencia de agallas en 100% de las raíces). No se observó fitotoxicidad alguna durante la totalidad del período de incubación. El análisis estadístico (ANOVA) se basó en un procedimiento de Fisher, donde se calcularon las diferencias estadísticas entre los medios de tratamiento, con p < 0,05.

Los resultados se detallan en la tabla 10. El WCB de H491 dio como resultado una disminución significativa en la cantidad total de agallas, en la cantidad de agallas por raíz y en la cantidad de agallas por gramo de raíz, en comparación con el control tratado con agua. Las plantas que fueron tratadas con H491 se caracterizaron por partes superiores con pesos frescos más elevados que las que fueron tratadas con agua. No se observó una diferencia significativa en el peso fresco de las raíces entre los tratamientos.

Tabla 10. Efecto del caldo de células completas (CB) de H491 sobre Meloidogyne incógnita en el tomate, determinado en un análisis con conos en un invernadero Tratamie FTW (g)y FRW (g)Y Cantidad Cantidad Cantidad nto total de de de agallas2 agallas agallas por raíz por g de la raíz H491 10,74 ± 6,1 ± 2,3 ± 142,5 ± 22,7 ± 0,34a 0,59a 0 , 96b 69, 70b 9, 28b Agua 7,35 ± 5,43 ± 6,5 ± 271,8 ± 54,1 + 6, 03b 1,37a 1,29a 53, 60a 25,20a Avid 8,43 ± 5,33 ± 0 ± 0 , 00c 1 ,0 ± 0,24 ± 1 , 36ab 1,33a 2 , 00c 0, 48b Valor de 0,038 0,606 0 0 0,003 P xLos resultados son las medias ± las desviaciones estándar (SD) de 4 réplicas. Los valores seguidos por las mismas letras en las mismas columnas no difieren de manera significativa, de acuerdo con la diferencia significativa mínima determinada en el análisis de Fisher, con p < 0,05. yFTW: Peso fresco de la parte superior; FRW: peso fresco de las raíces. zLa cantidad total de raíces se expresa en una escala de 0-10, donde 0 representa la ausencia de agallas y 10 representa la presencia de agallas en 100% de las raíces.

Ejemplo 15. Respuesta a la dosis de un caldo de células completas de H491 basado en un bioensayo con plantas en un tubo de ensayo en miniatura Se llevó a cabo un bioensayo en plantas con un caldo de células completas (WCB) de Bacillus megaterium H491 en 3 diluciones diferentes en agua (IX, 0,7X, y 0,5X v/v) para determinar su potencia sobre Meloidogyne incógnita juveniles. Este experimento fue un análisis en macetas en miniatura en un invernadero, donde se modificaron tubos Falcon estériles cortando las 1,5 pulgadas de la porción superior y perforando orificios en la parte inferior para posibilitar el drenaje. Los tubos fueron llenados con una mezcla de arena y tierra (1:2) y fueron tratados con alícuotas de 2 mi del caldo de células completas de H491 (al 50%, al 70% o al 100%), con Avid (en la tasa indicada en el envase) como control positivo o con agua como control negativo. Después del tratamiento, se sembraron semillas de pepino (cv. SMR58) y se inocularon los tubos con 800 huevos de M. inc gnita. Los tubos se recubrieron con parafilm y se colocaron en una caja con toallas de papel húmedas para asegurar una humedad elevada. Después de 4 días, se determinó que la mayor parte de las semillas habían germinado y se retiró el recubrimiento de parafilm. Una semana más tarde, se aplicó una segunda dosis (1 mi). El análisis se dio por terminado después de dos semanas, momento en el cual se determinó el peso fresco de la porción superior, el peso fresco de las ralees y la cantidad de agallas (con una escala de entre 1, que representó las raíces poco saludables, y 10, que representó las raíces).

En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 10, puede concluirse que la cantidad de raíces se redujo en presencia de todas las concentraciones del caldo de células completas de H491 que se analizaron.

Ejemplo 16. Análisis de la movilidad in vitro Se sometió un WCB de H491 proveniente de cuatro lotes de fermentación separados a un análisis de la movilidad in vitro. En este procedimiento, se expusieron M. inc gnita juveniles (J2) a las muestras que se deseaba analizar en una placa con 96 cavidades de fondo plano. Después de 24 horas, los juveniles fueron colocados en placas de 6 cavidades que contenían agar al 1,5% en agua, con el fin de posibilitar su recuperación potencial. La movilidad se analizó en función de la cantidad de juveniles (J2) que se pudieron desplazarse hacia el exterior de la zona inicial después de otras 24 horas. Los resultados se representan en la figura 11. En función de los resultados obtenidos, puede concluirse que los cuatro lotes del WCB de H491 dieron como resultado una inmovilización de 100% después de 24 horas de exposición.

Ejemplo 17. Capacidad de B. megaterium H491 de promover el crecimiento de las plantas Se analizó la capacidad de B. megaterium H491 de promover el crecimiento de las plantas sobre la base de determinados indicadores, en cinco procedimientos que se llevaron a cabo en sendas placas, y los resultados representativos se detallan en la tabla 11. La bacteria fue capaz de solubilizar el fosfato y de producir la enzima ACC desaminasa. También fue capaz desarrollarse en metanol como fuente de carbono. En función de estos resultados, puede concluirse que B. megaterium H491 puede promover el crecimiento de las plantas y puede conferirles tolerancia al estrés.

Tabla 11 Solución ACC IAA* CAS* AMS* de deaminasa fosfato H491 +++ +++ + ++ *IAA: ácido indol acético; CAS: cromo azurol S; AMS: sales minerales de amonio Ejemplo 18. Actividad de promoción del crecimiento de la soja y del sorgo Para evaluar la capacidad de B. megaterium H491 de promover el crecimiento de las plantas, se analizó el vigor de retoños de soja y de sorgo en dos experimentos. Se cultivó la cepa H491 en una placa con agar, se transfirieron unas pocas colonias a 50 mi de caldo Luria estéril (LB, 25 g/1) y se las incubó a 25°C durante 24 horas, con agitación a 180 rpm. Las bacterias se recolectaron a partir de los cultivos en el LB por medio de una centrifugación a 3220 x G durante 20 minutos. Se descartó el sobrenadante y se lavaron las células con 20 mi de un amortiguador estéril a base de MgSO4, después de lo cual se las centrifugó una segunda vez a 3220 x G durante 20 minutos. Después de descartar el sobrenadante, las células se suspendieron nuevamente en un volumen pequeño del amortiguador estéril. La concentración de las células en la suspensión se determinó sobre la base de la absorbancia a 600 nm, mediante el uso de un espectrofotómetro. Las semillas se embebieron en la suspensión que contenía las células. Se aplicó un inoculo de células (1 x 108 CFU/ml) sobre las semillas en un tubo Falcon de 50 mi, en una concentración de 0,6 mi por gramo de semillas (a razón de 250-300 semillas por g). Se incubaron las semillas y el inoculo a 25°C durante la noche y se secaron las semillas tratadas en una campana estéril durante 30 minutos. El control negativo se preparó de la misma manera, excepto que se reemplazó el inoculo de células por el amortiguador estéril. La promoción del crecimiento se evaluó en función del peso fresco de los retoños, y los resultados se detallan en la tabla 12. En el caso de la soja, el peso de los retoños se duplicó con el tratamiento con H491. En el caso del sorgo, se observó un incremento de 64% en el peso fresco.

Tabla 12 Control Tratamiento con H491 (amortiguador) Soja 5,46 11,22 Sorgo 0,89 1,46 Ejemplo 19. Actividad de promoción del crecimiento del maiz Se sembraron semillas de maiz y se las trató durante la siembra y una semana después de ella con un caldo de células completas (WCB) de B. megaterium H491. En total, se sembraron 10 plantas por maceta y se analizaron 9 macetas por tratamiento. Se registró el peso fresco 2 semanas después de la siembra y se realizó un análisis estadístico basado en un procedimiento de ANOVA Minitab Tukey.

Los resultados se detallan en la tabla 13. En las plantas de maíz que fueron tratadas con el WCB de H491, se observó un incremento significativo en el peso fresco vegetativo, con un intervalo de confianza simultáneo de 95%, de acuerdo con el análisis de Tukey.

Tabla 13. Tratamiento del maiz con el caldo de células completas Control H491 Promedio 21,48 30,07 Desviación estándar 4,02 2,42 Ejemplo 20. Efecto del compuesto 1 sobre la movilidad de los nematodos Se había determinado que la fracción H29 de la HPLC (ejemplo 13 y figura 8) estaba compuesta por ácido 4-fenilbutanoico. En este ejemplo, se sintetizó ácido 4-fenilbutanoico (el compuesto 1) y se evaluó la respuesta a la dosis sobre la base de un análisis de la movilidad de los nematodos. Se expusieron M. inc gnita juveniles (J2) a diversas concentraciones del ácido 4-fenilbutanoico en una placa con 96 cavidades de fondo plano durante 24 horas. Posteriormente, los nematodos juveniles fueron colocados en placas con 6 cavidades que contenían agar al 1,5% en agua, de modo tal de posibilitar su recuperación. Una vez transcurridas otras 24 horas, se determinó la movilidad sobre la base de la cantidad de nematodos juveniles (J2) que se habían desplazado hasta la zona inicial. Se usó agua y DMSO como controles negativos y Avid como control positivo.

Los resultados se representan en la figura 12. Si se asume que una inmovilidad de 75% es el umbral para la actividad nematicida, puede concluirse que una concentración de al menos 0,017 mg/ml de ácido 4- fenilbutanoico dio como resultado una actividad nematicida sustancial.

Ejemplo 21. Actividad nematicida de tres aislados de B.

Se cultivaron aislados de B. megaterium H491, M018 y J142. Se sometió un caldo de células completas proveniente de cada uno de estos tres cultivos al análisis de la inmovilidad en agar y agua que se describió en el ejemplo 20. En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 13, puede concluirse que el caldo de células completas de las tres de las cepas dio como resultado una inmovilidad de esencialmente el 100% entre los nematodos juveniles.

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO El siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con la Colección de Cultivo para Investigación Agrícola (NRRL), 1815 N.

University Street, Peoría, Illinois 61604 EE.UU., y se le ha dado el siguiente número: Depósito Número de acceso Fecha_ de depósito Cepa H491 de Bacillus megaterium NRRL B-50769 3 de agosto de 2012 Cepa M018 de Bacillus megaterium NRRL B-50770 3 de agosto de 2012 Cepa J142 de Bacillus megaterium NRRL B-50771 3 de agosto de 2012 La cepa se ha depositado bajo las condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible mientras esta solicitud de patente esté pendiente a una determinada por el Comisionado de Patentes y marcas registradas para tener derecho bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según se requiera por las lcyes de patentes extranjeras en países en donde se presentar contrapartes de la presente aplicación, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.

La invención descrita e invocada en la presente no se limita en alcance por los aspectos específicos descritos en la presente, ya que estos aspectos tienen como intención ilustrar varios aspectos de la invención. Se pretende que cualquier aspecto equivalente se encuentre dentro del alcance de esta invención. De hecho, diferentes modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente resultarán evidentes para aquellos con experiencia en el arte a partir de la descripción precedente. Dichas modificaciones tienen como intención caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, prevalecerá la presente divulgación que incluye las definiciones.

En la presente se vitan varias referencias, cuyas divulgaciones se incorporan a modo de referencia en su totalidad.

REFERENCIAS Aksoy, H.M. and Ozman-Sullivan, S.K., 2008, Isolation of Bacillus megaterium from Aphis pomi (Homoptera: aphididae) and assessment of its pathogenicity J. Plant Pathology 90:449-452 Asolkar, R. N., Jensen, P. R., Kauffman, C. A., Fenical, W. 2006. Daryamides A-C, Weakly Cytotoxic Polyketides from a Marine-Derived Actinomycete of the Genus Streptomyces strain CNQ-085 J. Nat . Prod. 69:1756-1759.

Damberg, M., Russ, P., Zeeck, A. (1982). Die constitution der fungistatischen ansamycin-antibiotics ansatrienin A und B. Tetrahedron Lett. 23, 59-62.

Hebeda, R. E., Styrlund, C. R., Teague, W. M. (1988). Benefits of Bacillus megaterium amylase in dextrose production. Starch 40, 33-36.

Hu, X and Bover, G. H. (1995). Isolation and characterization of the siderophore N-deoxyschizokinen from Bacillus megaterium ATCC 19213. BioMetals , 8, 357-64 (Japan. Pat., 83164 561. (1983)).

Izawa, . , Wada, Y. , Kasahara, F. , Asai, M. , Kishi, T . ( 1981. Hydroxylation of ansamitocin P-3. J. Antibit. , 34 1591-1595.

Kittsteiner-Eberle, R. , Ogbomo. I. , Schmidt, H. L. (1989) . Biosensing devices for the semi-automated control of dehydrogenase substrates in fermentations . Biosensors 4, 75-85.

Komatsu, Y., Hayashi, H. (1998). Histone deacetylase inhibitors up-regulate the expression of cell surface MHC class -I molecules in B16/BL6 cells. J. Antibiot. 51, 89-91.

Martin, L., Prieto M. A., Cortes, E., García, J. L. (1995). Cloning and sequencing of the pac gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945. FEMS Microbiol Lett 125, 287-292.

Metz, R. J., Alien, L. N., Cao, T. M., Zeman, N. W. (1988). Nucleotide sequence of an amylase gene from Bacillus megaterium. Nucleic Acids Res. 16, 5203.

Nagao, T., Mitamura, T., Wang, X. H., Negoro, S., Yomo, T., Urabe, I., Okada, H. (1992). Cloning, nucleotide sequences, and enzymatic properties of glucose dehydrogenase isozymes from Bacillus megaterium IAM1030. J. Bacteriol. 174, 5013-5020.

Nakahama, K., Izawa, M., Asai, M, Kida, M., Kishi, T. (1981). Microbial conversión of anamitocin. J. Antibiot. , 34 1581-1586.

Nithya, C., Devi, M. G., Pamdian, S. K.2011. A novel compound from the marine bacterium Bacillus pumilus S6-15 inhibits biofilm formation in gram-positive and gram-negative species. Biofouling, 21, 519-528.

Plowman, J.E., Loehr, T. M., Goldman, S. J., Sanders-Loehr, J., (1984). Structure and siderophore activity of ferric Schizokinen. J. Inorg. Biochem. , 20, 183-186.

Shimada, N., Hasegawa, S., Harada, T., Tomisawa, T., Fujii, A., Takita, T. (1986). Oxetanocin, a novel nucleoside from bacteria, J. Antibiot . , 39, 1623-1625.

Shimada, N., Hasegawa, S., Saito, S., Nishikiori, T., Fujii, A., Takita, T. (1987). Derivatives of oxetanocin: oxetanocins H, X, G and 2-aminooxetanocin A. J. Antibiot. , 40, 1788-1790.

Suga, K., Shiba, Y., Sorai, T., Shioya, S., Ishimura, F. (1990). Reaction kinetics and mechanism of immobilized penicillin acylase from Bacillus megaterium. Ann N Y Acad Sci . 613, 808-815.

Takaichi, S. (1990). Heterogeneous position of the double bonds of unsaturated fatty acids in carotenoid glucoside esters from Rhodococcus rhodochrous RNMS1. Agrie. Biol . Chem. , 54, 2139-2140.

Takasaki, Y. (1989). Novel maltose-producing amylase from Bacillus megaterium G-2. Agrie Biol Chem. 53, 341-347.

Vandamme et al. Polyphasic taxonomic study of the emended genus Arcobacter with Arcobacter butzleri comb. nov. and Arcobacter skirrowii sp. nov., an aerotolerant bacterium isolated from veterinary specimens." Int. J. Syst. Bacteriol.42: 344-356.1992.

Vihinen, M., Mantsala, P. (1989). Microbial amylolytic enzymes. Crit Rev Biochem Mol Biol . 24, 329-418.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende (a) una cepa de Baclllus megaterium que tiene las siguientes características: (i) un gen del ARNm de 16S que comprende por lo menos una de una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:l, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:2 y por lo menos 99% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 3, (ii) un gen recA que comprende por lo menos una de una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:14, una secuencia revertida que tiene por lo menos 99% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:15 y por lo menos 99% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 16; (iii)actividad plaguicida; y (b) por lo menos uno de un transportador, diluyente, tensioactivo, o adyuvante.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un plaguicida seleccionado del grupo que consiste en un nematicida, un fungicida y un insecticida.

3. Un método para modular la infestación por plaga en una planta, en donde el método comprende aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para hacer crecer dicha planta una cantidad de la composición de la reivindicación 1 eficaz para modular dicha infestación por plaga.

4. Un método para aislar un compuesto que comprende ácido 4-fenilbutanoco, en donde el método comprende los pasos de: (a) cultivar la cepa de Bacillus megaterium de la reivindicación 1 durante un tiempo y una temperatura suficiente para producir dicho compuesto; y (b) aislar dicho compuesto producido en (a) a partir de dicho cultivo.

5. Una composición que comprende: (A) ácido 4-fenilbutanoico; y (B) por lo menos uno de (1) una segunda sustancia, en donde dicha segunda sustancia es un plaguicida químico o biológico o (2) por lo menos uno de un transportador, diluyente, tensioactivo, o adyuvante.

6. Un método para modular la infestación por plaga en una planta que comprende aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para hacer crecer dicha planta una cantidad de (a) ácido 4-fenilbutanoico; y (b) opcionalmente otra sustancia, en donde dicha sustancia es un plaguicida, eficaz para modular dicha infestación por plaga y/o emergencia o crecimiento de monocotiledónea, juncias o malezas dicotiledóneas.

7. Una semilla que comprende la composición de la reivindicación 1, la composición de la reivindicación 11 o ácido 4-fenilbutanoico.

8. Un método para modular (i) el crecimiento de la planta, y/o (ii) germinación de una semilla de dicha planta, en donde el método comprende poner en contacto dicha planta y/o su semilla y/o su sustrato de crecimiento con una composición seleccionada del grupo que consiste en: (a) la composición de la reivindicación 1; y (b) un compuesto que comprende ácido 4-fenilbutanoico en una cantidad de dicha composición eficaz para modular dicho crecimiento de dicha planta y/o germinación de dicha semilla.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en frutilla, zapallo, pepino, tomate, rosa, pimienta, palta, vid de uva, algodón, cebolla, ajo, trigo, soja, maíz y arroz.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8, que además comprende trasplantar dicha planta en dicho sustrato de crecimiento.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde antes de trasplantar dicha planta en dicho sustrato de crecimiento, se trata una o más raíces de dicha planta con dicha composición.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha cepa de B. megaterium produce un compuesto plaguicida que comprende ácido 4-fenilbutanoico.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha cepa de B. megaterium es susceptible a uno o más de un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en tetracielina, eritromicina, estreptomicina, Penicilina, Ampicilina, Oxitetraciclina, Cloramfenicol, Ciprofloxacina, Gentamicina, Piperacilina, Imipenem y Sulfametoxazol-Trimethoprim.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha cepa de B. megaterium tienen las características identificadoras de la cepa H491 de B. megaterium (No. de acceso a NRRL B-50769).

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha cepa de B. megaterium está presente en una formulación seleccionada del grupo que consiste en un concentrado emulsificable, polvo que puede humectarse, un líquido soluble, un aerosol, una solución concentrada de volumen ultrabajo, un polvo soluble, un microencapsulado, gránulos dispersados en agua, un fluido, una microemulsión y una nanoe ulsión.