MX2014015519A - Produccion de enzimas para biomasa ligno-celulosica. - Google Patents

Produccion de enzimas para biomasa ligno-celulosica.

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Abstract

Un proceso produce al menos una primera enzima a partir de una célula huésped, en donde la primera enzima es capaz de hidrolizar una primera biomasa ligno-celulósica pre-tratada. El proceso comprende la etapa de cultivar la célula huésped para producir al menos la primera enzima durante un tiempo de cultivo, en donde el cultivo de la célula huésped se presenta en un ambiente de cultivo desprovisto de azúcar que comprende la célula huésped, agua y una composición sólida que comprende un azúcar complejo de la composición sólida y una lignina de la composición sólida. En tal proceso, la composición sólida se obtiene a partir de una segunda biomasa ligno-celulósica pre-tratada, que comprende un azúcar complejo de la segunda biomasa ligno-celulósica pre-tratada y una lignina de la segunda biomasa ligno-celulósica pre-tratada; y la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos de la composición sólida a la cantidad total de la lignina de la composición sólida es mayor a cero y menor que la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos de la segunda biomasa ligno-celulósica pre-tratada a la cantidad total de la lignina de la segunda biomasa ligno-celulósica pre-tratada.

Description

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PARA BIOMASA LIGNO-CELULÓSICA ANTECEDENTES Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones bioquímicas. Las enzimas se producen por casi todas las células huésped vivas. Algunas enzimas producidas por microorganismos de las clases de hongos son útiles en los procesos de conversión de la materia prima ligno-celulósica a productos químicos. En estos procesos de conversión, las enzimas se utilizan como catalizador en la reacción de hidrólisis de azúcares complejos, tales como celulosa y hemicelulosa, en azúcares con un peso molecular más bajo.
Se sabe que la hidrólisis de la celulosa y la hemicelulosa proveniente de materias primas ligno-celulósicas requiere una mezcla bien balanceada de enzimas que consiste de endoglucanasas, celobiohidrolasas, b-glucosidasas, xilanasas, mananasas y diversas enzimas que actúan sobre las cadenas laterales de xilenos y mananos. La producción de enzimas es una etapa importante en el proceso de biomasa a etanol debido a que la producción y la aplicación de enzimas o mezcla de enzimas se encuentran actualmente entre las etapas de procesamiento más costosas por rutas con base biológica para la utilización de la biomasa ligno-celulósica.
Los sistemas de enzimas del hongo degradador de plantas Trichoderma reesei son los más extensamente investigados y se consideran ser el organismo más ampliamente utilizado para obtener mezclas de enzimas comerciales. El T. reesei produce numerosas enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa incluso si la secreción de b-glucosidasa extracelular es baja. Como es bien sabido que el contenido de actividad de b-glucosidasa es crítico para obtener una alta conversión de celulosa, la solución de la enzima de T. reesei se complementa comúnmente con b-glucosidasas para obtener una solución de enzimas bien balanceada y además adelantar la hidrólisis de la celulosa. En otros casos también pueden obtenerse soluciones comerciales de enzimas o mezcla de enzimas utilizando las enzimas producidas por otros hongos buenos productores de b-glucosidasa.
Las enzimas para procesos de conversión de materias primas ligno-celulósicas se producen cultivando las células huésped en medios complejos que comprenden celulosa pura y/o fuentes de carbono incluso más caras.
Para reducir el costo final de la producción de enzimas, se han realizado muchos intentos para utilizar sustratos menos costosos que la celulosa pura. Se han utilizado como sustrato materias primas ligno-celulósicas pretratadas. Muchos grupos de investigación habían tratado de producir la enzima o mezcla de enzimas utilizando de alguna manera la misma materia prima utilizada para la producción de bio-etanol para reducir los costos finales de la mezcla de enzimas.
Sin embargo, no se ha reportado una clara relación entre el sustrato utilizado para el cultivo y el desempeño hidrolítico de las enzimas resultantes sobre los sustratos particulares en estudios previos en T-reesei Rut C30 o Penicillium brasilianum. Una revisión de los resultados obtenidos en el cultivo de enzimas sobre diferentes fuentes de carbono puede encontrarse en Juhasz, T., Szengyel, Z., Reczcy, K., Siika-Aho, M., Viikari, L. "Characterization of enzyme o enzyme mixtures and hemienzyme or enzyme mixtures produced by Trichoderma reesei on various carbón sources" (Caracterización de enzimas o mezclas de enzimas y hemienzimas o mezclas de enzimas producidas mediante Trichoderma reesei sobre varias fuentes de carbono), (Process Biochem, 40, 35219-3525) y en Jorgensen, H., Olsson, L., "Production of enzyme or enzyme mixtures by Penicillium brasilianum IBT 20888: Effect of substrate on hydrolitic performance" (Producción de enzimas o mezclas de enzimas mediante Penicillium brasilianum IBT 20888: Efecto del sustrato en el desempeño hidrolítico) (Enzyme Microb Technol., 38, 381-390). Un proceso tal se describe en la WO 2007005918. Este proceso agrega el sustrato ligno-celulósico pretratado descrito como un inductor del crecimiento enzimático, mientras utiliza la adición constante de glucosa como alimentación para el crecimiento del organismo. El propósito definido de esta teenología es remplazar la alimentación de glucosa y celulosa pura utilizada actualmente para la producción de enzimas o mezclas de enzimas en una célula huésped, con un material que pueda utilizarse ya sea como la fuente de carbono principal o como el inductor para la producción de enzimas. La ventaja de esto es que se reduce el costo de producción debido al uso de un inductor (biomasa ligno-celulósica) fácilmente disponible y por tanto más barato que la celulosa pura- Como inductor, la WO 2007005918 utiliza una pequeña cantidad de biomasa y agrega continuamente glucosa para alimentar al organismo.
La US 7,494,792 describe un proceso para producir enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas que utiliza el residuo de la fermentación etanólica de hidrolizados enzimáticos de biomasa celulósica o ligno-celulósica. El proceso puede integrarse en un proceso para la producción de etanol a partir de biomasa celulósica o ligno-celulósica, en el cual el residuo sirve para la producción de las enzimas utilizadas en la hidrólisis enzimática del sustrato pretratado. La solución de azúcar obtenida para la producción de etanol a partir de hidrólisis se separa de la fracción sólida no hidrolizada esencialmente constituida por lignina y se utiliza para la fermentación etanólica. La glucosa es el azúcar principal extraído en esta etapa. El residuo de la fermentación etanólica, después de separar el etanol, se utiliza como fuente de carbono inductor o como una fuente principal de carbono para la producción de enzimas.
Como consideración general, existe interés en convertir toda o la fracción más relevante de la materia prima ligno-celulósica pretratada en valiosos productos. El uso de una fracción de la materia prima ligno-celulósica pretratada como sustrato para la producción de enzimas puede reducir la producción de una planta para el proceso de conversión de la materia prima ligno-celulósica en productos útiles.
En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar un proceso que utilice mejor una materia prima ligno-celulósica pretratada para producir enzimas.
SUMARIO En esta especificación se describe un proceso para producir al menos una enzima a partir de una célula huésped para la hidrólisis de una primera biomasa ligno-celulósica pretratada, comprendiendo dicho proceso las etapas de cultivar la célula huésped que tiene la capacidad de producir la al menos una enzima en un ambiente de cultivo desprovisto de azúcar que comprende la célula huésped, agua y una composición sólida, comprendiendo además dicha composición sólida un azúcar complejo de la composición sólida y una lignina de la composición sólida. La composición sólida se obtiene a partir de una segunda biomasa ligno-celulósica pretratada que comprende un azúcar complejo de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada y una lignina de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada, y la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos a la cantidad total de la lignina en la composición sólida es menor que la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos a la cantidad total de la lignina en la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada. Después del cultivo, la composición sólida se convierte en un residuo sólido.
También se describe que el cultivo puede realizarse bajo condiciones simples bajas en azúcar que tienen una cantidad de azúcar simple agregada en el rango de 0 a 10% por peso del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar sobre una base seca durante una porción del tiempo de cultivo que es al menos el 50% del tiempo de cultivo.
Se describe además que la composición sólida puede obtenerse a partir de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada mediante un proceso que comprende las etapas de hidrolizar al menos una fracción de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada en presencia de un catalizador de hidrólisis, para producir una composición hidrolizada que comprende la composición sólida y una solución de agua y azúcares solubles en agua; y retirar al menos el 50% de la solución de agua y azúcares solubles en agua de la composición hidrolizada.
También se describe que el retiro de una fracción de la composición hidrolizada puede realizarse por medio de al menos un método comprendido en el grupo de decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, filtración por presión, y lavado.
Se describe además que la composición sólida puede obtenerse a partir de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada mediante un proceso que comprende las etapas de hidrolizar al menos una fracción de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada en presencia de un catalizador de hidrólisis para producir una composición hidrolizada que comprende azúcares solubles en agua, azúcares complejos y lignina; convertir al menos una fracción de los azúcares solubles en agua en la composición hidrolizada para producir una composición convertida que comprende al menos un producto derivado del azúcar, y la composición sólida; y retirar una fracción de la composición convertida, comprendiendo dicha fracción al menos una fracción del al menos un producto derivado del azúcar.
También se describe que el retiro de una fracción de la composición convertida puede realizarse por medio de al menos un método comprendido en el grupo de decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, filtración por presión, lavado, evaporación y destilación.
Se describe además que el catalizador de hidrólisis puede comprender una segunda enzima o mezcla de enzimas y que puede seleccionarse del grupo que consiste de iones de hidrógeno, ácidos orgánicos y ácidos inorgánicos.
También se describe que la conversión de la composición hidrolizada puede comprender una fermentación.
Se describe además que el al menos un producto derivado del azúcar puede comprender etanol.
Se describe además que la porción del tiempo de cultivo bajo condiciones simples bajas en azúcar puede seleccionarse del grupo que consiste de al menos 75% del tiempo de cultivo, al menos 85% del tiempo de cultivo, al menos 90% del tiempo de cultivo, al menos 95% del tiempo de cultivo y al menos 98% del tiempo de cultivo.
También se describe que la porción del tiempo de cultivo bajo condiciones simples bajas en azúcar puede ser igual al tiempo de cultivo.
Se describe además que la cantidad de azúcar o azúcares simples agregada se encuentra en el rango de entre 0 y 5%, de 0 a 2.5%, de 0 a 2.0%, de 0 a 1.0% por peso del ambiente de cultivo sobre una base seca. También se describe que puede no agregarse un azúcar simple en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar.
Se describe además que al menos la primera enzima se cosecha separando el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar en al menos una composición cosechada, que comprende al menos una fracción de la primera enzima, y una composición agotada, que comprende al menos una fracción del residuo sólido de la composición sólida.
También se describe que la enzima o mezcla de enzimas puede utilizarse además para hidrolizar la primera biomasa ligno-celulósica y la primera biomasa ligno-celulósica y la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada comprenden ambas biomasa ligno-celulósica derivada del grupo que consiste del mismo género de pasto o más preferentemente de la misma especie de pasto.
También se describe la enzima o mezcla de enzimas producida de acuerdo con el proceso descrito y una biomasa ligno-celulósica hidrolizada que se ha hidrolizado por medio de la mezcla de enzimas.
Se describe además que la cantidad total de azúcares complejos en la composición agotada puede estar presente en un rango seleccionado del grupo que consiste de 9 a 30%, de 0 a 20%, de 0 a 15%, de 0 a 10%, de 0 a 7.5%, de 0 a 2.5% por peso sobre una base seca.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura la es una gráfica del rendimiento de la hidrólisis de glucosa de acuerdo con los ejemplos comparativos y operativos.
La Figura Ib es una gráfica del rendimiento de la hidrólisis de xilosa de acuerdo con los ejemplos comparativos y operativos DESCRIPCIÓN DETALLADA Se ha descubierto un proceso para la producción de enzimas, caracterizado por el hecho de que las células huésped que producen las enzimas se cultivan en un ambiente de cultivo desprovisto de azúcar. El ambiente de cultivo desprovisto de azúcar comprende las células huésped, agua y una composición sólida obtenida de una biomasa ligno-celulósica pretratada; la composición sólida comprende azúcares complejos y lignina y se caracteriza por una proporción de la cantidad total de los azúcares complejos a la cantidad total de la lignina menor que la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos a la cantidad total de la lignina de la biomasa ligno-celulósica pretratada de la cual se deriva. En otras palabras, la composición sólida en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar se obtiene de una biomasa ligno-celulósica pretratada retirando una fracción de, pero no todos, los azúcares complejos contenidos en la biomasa ligno-celulósica pretratada. La composición sólida en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar tiene una cantidad más baja de azúcares complejos sobre una base seca con respecto a la biomasa ligno-celulósica pretratada, pero comprende aun azúcares complejos.
Los azúcares que se han retirado de la biomasa ligno-celulósica pretratada pueden convertirse en productos químicos útiles, tales como etanol.
Las enzimas producidas por las células huésped pueden utilizarse después en la hidrólisis de biomasa ligno-celulósica y biomasa ligno-celulósica pretratada. La celulosa, la hemicelulosa y la lignina son los polímeros principales que constituyen la biomasa ligno-celulósica. La celulosa y la hemicelulosa son azúcares poliméricos.
En el contexto de la presente descripción, los azúcares simples son azúcares monoméricos y pueden seleccionarse del grupo que consiste de glucosa, xilosa, arabinosa, mañosa, galactosa y fructosa. Debe notarse que puede haber otros azúcares simples que no se encuentran en la lista precedente. Los azúcares simples pertenecen al grupo de azúcares solubles en agua. Los azúcares solubles son azúcares que, cuando se encuentran en presencia de un solvente especificado, tal como agua, forman una solución homogénea en el solvente.
Los azúcares simples pueden alimentar la célula huésped directamente, es decir que la célula huésped no necesita utilizar enzimas para metabolizar los azúcares simples.
Los azúcares oligoméricos son azúcares poliméricos que son solubles en agua. Los azúcares oligoméricos se constituyen por más de un azúcar monomérico. Los azúcares oligoméricos pueden metabolizarse por la célula huésped solamente en presencia de una o más enzimas que se producen comúnmente por la célula huésped.
Los azúcares complejos son azúcares poliméricos que no son solubles en agua, tales como los glucanos y xilenos insolubles en agua. Los glucanos son una clase de azúcares complejos que comprenden moléculas de polímero de glucosa que tienen diferentes grados de polimerización. Los xilenos son una clase de azúcares complejos que comprenden moléculas de polímero de xilosa que tienen diferentes grados de polimerización.
Muchos procesos de conversión de biomasa ligno-celulósica en productos químicos convierten solamente una fracción de los azúcares complejos y producen una composición que contiene principalmente lignina y la fracción restante de los azúcares complejos no convertidos como un subproducto. En algunos casos, incluso si es posible convertir además los azúcares complejos en la biomasa ligno-celulósica pretratada, el proceso de conversión se detiene debido a que no sería económicamente conveniente. La composición que contiene aun la fracción restante de los azúcares complejos se quema frecuentemente para producir calor, es decir es una aplicación de bajo valor de los azúcares contenidos en la biomasa ligno-celulósica.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que las células huésped pueden cultivarse en un ambiente de cultivo desprovisto de azúcar que comprende una composición sólida obtenida mediante el retiro de al menos una fracción de los azúcares complejos de la biomasa ligno-celulósica pretratada y que las células huésped pueden utilizar la fracción restante de los azúcares complejos como una fuente de carbono. Los inventores han descubierto también que la producción de enzimas a partir de la célula huésped puede ser comparable o incrementarse con respecto a la producción de enzimas obtenidas utilizando un sustrato más caro como fuente de carbono.
Los azúcares simples tales como glucosa y xilosa utilizados tradicionalmente para alimentar a las células huésped pueden remplazarse parcial o totalmente por la composición sólida más barata.
Preferentemente, el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar contiene ninguno, o pocos, azúcares simples.
Puede utilizarse cualquier método o combinación de métodos conocidos en la téenica y aun por inventarse para obtener la composición sólida a partir de una segunda biomasa ligno—celulósica pretratada. Los métodos pueden implicar el uso de procesos químicos, físicos, biológicos o una combinación de procesos.
Preferentemente, los azúcares complejos se retiran de la biomasa ligno-celulósica pretratada y se convierten en productos derivados del azúcar que son valiosos productos químicos. El proceso de conversión puede realizarse en una etapa única o en múltiples etapas, es decir, los productos derivados del azúcar pueden obtenerse convirtiendo los azúcares complejos retirados en productos intermedios.
En una modalidad preferida, la composición sólida puede obtenerse hidrolizando al menos una fracción de los azúcares complejos en la biomasa ligno-celulósica pretratada.
La hidrólisis es un proceso que convierte los azúcares complejos en azúcares solubles en agua y los azúcares oligoméricos en azúcares que tienen un peso molecular más bajo.
La hidrólisis de la biomasa pretratada se conduce en presencia de un catalizador de hidrólisis y eventualmente otros aditivos que pueden ser de ayuda o necesarios para que ocurra efectivamente la hidrólisis. En el contexto de la presente invención, el catalizador de hidrólisis y los aditivos pueden referirse como una "composición catalizadora de hidrólisis".
En una modalidad preferida la composición catalizadora de hidrólisis comprende una enzima o mezcla de enzimas y la hidrólisis es una hidrólisis enzimática.
En otra modalidad preferida, la hidrólisis enzimática se conduce de acuerdo con el proceso descrito en la WO 2010113130, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente en su totalidad.
En otra modalidad, el catalizador de hidrólisis puede comprender un ácido y la hidrólisis es una hidrólisis ácida. Pueden utilizarse todos los ácidos orgánicos e inorgánicos con capacidad para llevar a cabo la hidrólisis de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada. El ácido tambien puede estar presente en soluciones diluidas. También pueden utilizarse iones de hidrógeno en el proceso de hidrólisis.
La hidrólisis de la biomasa ligno-celulósica pretratada puede presentarse en un ambiente líquido. El ambiente líquido puede obtenerse agregando algún líquido, preferentemente agua o que comprenda agua, a la biomasa ligno-celulósica pretratada. También pueden agregarse líquidos en el pretratamiento de la biomasa ligno-celulósica. Por ejemplo, en una modalidad preferida la biomasa ligno-celulósica es pretratada embebiendo la biomasa ligno-celulósica en un líquido que comprende agua, y después explotar por vapor la biomasa ligno-celulósica embebida. También puede agregarse el líquido en la etapa de hidrólisis o a la composición catalizadora de hidrólisis. En el caso de hidrólisis enzimática, el líquido puede estar presente en la mezcla enzimática. En el caso de hidrólisis ácida, el líquido puede estar presente en la solución ácida diluida.
Debido a que la hidrólisis de la biomasa ligno-celulósica pretratada se presenta en un ambiente líquido, que comprende preferentemente agua, la composición hidrolizada obtenida a partir de la biomasa ligno-celulósica comprenderá una solución de agua y azúcares solubles en agua, y una composición sólida, que comprende azúcares complejos que no se han hidrolizado en azúcares solubles en agua. La composición sólida de la composición hidrolizada comprende también la lignina contenida en la biomasa ligno-celulósica pretratada. La lignina también puede haberse modificado y/o convertido parcialmente en otros componentes como efecto de los procesos de pretratamiento e hidrólisis.
Incluso si la composición hidrolizada pudiera incluir otros componentes, para el alcance de la presente invención, la composición hidrolizada comprende al menos una solución de agua y azúcares solubles en agua y una composición sólida que comprende además azúcares complejos y lignina de la composición sólida.
La composición sólida puede obtenerse retirando al menos el 50% de la solución de agua y azúcares solubles en agua de la composición hidrolizada. Se anota que, aunque el retiro de la mayor cantidad posible de la solución de agua y azúcares solubles en agua es una modalidad preferida, algunos azúcares solubles en agua pueden estar presentes aun en la composición sólida. En otra modalidad, la composición sólida no comprende azúcares solubles en agua.
La fracción retirada de la composición hidrolizada, que comprende agua y azúcares solubles en agua, puede comprender además otros componentes de la composición hidrolizada, tales como al menos una fracción del catalizador de hidrólisis y aditivos de los compuestos formados durante el pretratamiento o la hidrólisis. La fracción retirada puede comprender además una fracción de la composición sólida que comprende lignina y azúcares complejos. En una modalidad preferida, el ambiente bajo en azúcar comprende sustancialmente toda la composición sólida en la composición hidrolizada y se retira sustancialmente toda la solución de agua y azúcares solubles en agua.
En otra modalidad, el ambiente bajo en azúcar comprende toda la composición sólida en la composición hidrolizada y se retira toda la solución de agua y azúcares simples.
Cualquier método y combinación de métodos conocidos en la téenica e incluso por inventarse puede utilizarse para retirar al menos el 50% de la solución de agua y azúcares solubles en agua de la composición hidrolizada. Estos métodos comprenden tratamientos químicos y físicos de la composición hidrolizada. Los tratamientos químicos y físicos pueden llevarse a cabo de manera secuencial o simultánea.
Los métodos preferidos para retirar al menos una fracción de la composición hidrolizada comprenden decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, incluyendo filtración por membrana y filtración por presión y lavado.
La hidrólisis de al menos una fracción de la biomasa ligno-celulósica pretratada y el retiro de al menos el 50% de la solución de agua y azúcares solubles en agua pueden presentarse secuencialmente o al menos parcialmente de manera simultánea. En una modalidad, al menos una fracción de los azúcares simples puede retirarse, por ejemplo, mediante filtración por membrana, mientras procede la hidrólisis.
La composición sólida puede procesarse además antes de insertarse en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar de las células huésped para la producción de enzimas. La composición sólida también puede lacarse, preferentemente con agua, para el retiro adicional de los azúcares solubles en agua u otros componentes que puedan afectar o reducir la producción de las enzimas. Pueden agregarse otros componentes necesarios para cultivar las células huésped a la composición sólida o al ambiente de cultivo desprovisto de azúcar.
La fracción de la solución de agua y azúcares solubles en agua retirada de la composición hidrolizada puede convertirse en productos químicos útiles.
En otra modalidad preferida, la composición sólida puede obtenerse hidrolizando al menos una fracción de los azúcares complejos en la biomasa ligno-celulósica pretratada en presencia de un catalizador de hidrólisis para producir una composición hidrolizada que comprende azúcares complejos y lignina y la solución de agua y azúcares solubles en agua; después, convirtiendo al menos una fracción de los azúcares solubles en agua en la composición hidrolizada en una composición convertida que comprende al menos un producto derivado del azúcar y una composición sólida que comprende azúcares complejos y lignina; y retirar al menos una fracción del producto derivado del azúcar de la composición convertida.
Todas las consideraciones acerca de la hidrólisis previamente definidas en la presente especificación se aplican también para esta modalidad. La composición hidrolizada puede someterse a procesamiento adicional dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, el proceso puede mejorar la conversión de los azúcares solubles en agua en productos y puede incluir tratamientos físicos y químicos, por ejemplo, separación, purificación, corrección del pH, dilución y concentración. Los azúcares solubles en agua en la composición hidrolizada se convierten, parcial o totalmente, en una composición convertida que comprende al menos un producto derivado del azúcar. La conversión o la modificación de cualquier otro componente de la composición hidrolizada pueden presentarse también durante la conversión de los azúcares simples. En particular, los azúcares complejos y la lignina en la composición hidrolizada pueden afectarse por el proceso de conversión para generar una composición sólida que comprende azúcares complejos y lignina; definido de otra manera, la composición sólida puede ser los azúcares complejos y la lignina en la composición hidrolizada o una modificación de los azúcares complejos y la lignina en la composición hidrolizada. La composición convertida puede comprender además más de un producto derivado de azúcares solubles en agua.
La conversión de los azúcares solubles en agua puede presentarse en presencia de un catalizador. El catalizador puede comprender eventualmente otros aditivos que pueden ser de ayuda o necesarios para que ocurra efectivamente la conversión. En el contexto de la presente invención, el catalizador y los aditivos pueden referirse como una "composición catalizadora".
El catalizador puede ser cualquier agente que promueva la conversión de los azúcares solubles en agua en al menos un producto derivado del azúcar. El catalizador puede ser un agente inorgánico, orgánico o biológico.
Incluso si puede utilizarse cualquier proceso para convertir al menos una fracción de la composición hidrolizada, la fermentación es un proceso preferido y el producto derivado del azúcar es un producto fermentado. La fermentación es cualquier proceso para convertir azúcares simples en productos fermentados en presencia de un microorganismo o mezcla de microorganismos.
Un microorganismo preferido para convertir al menos una fracción de la composición hidrolizada es una levadura.
La levadura indica comúnmente un hongo unicelular principalmente ascomicetoso que comúnmente tiene poco o ningún micelio, que típicamente se reproduce de manera asexual brotando con las células hijas que permanecen frecuentemente unidas y que tienen la capacidad de fermentar carbohidratos en alcohol y bióxido de carbono. Preferentemente, la levadura pertenece al género Saccharomyces. Las especies de Saccharomyces son como se definen de manera filogenética por Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3:417-432 e incluyen S. cerevisiae, S. paradoxus, S. ikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. pastorianus y S. bayanus.
Dependiendo del catalizador o microorganismo, pueden producirse diferentes productos derivados del azúcar. Incluso si pudiera producirse cualquier otro producto derivado del azúcar, en una modalidad preferida, el producto derivado del azúcar es etanol.
La hidrólisis de azúcares complejos a una composición hidrolizada y la conversión de al menos una fracción de los azúcares solubles en agua en la composición hidrolizada en al menos un producto derivado del azúcar pueden presentarse de manera secuencial o simultánea. En una modalidad preferida, la hidrólisis enzimática y la fermentación a etanol se presentan de manera simultánea y el proceso se conoce en la téenica como sacarificación y fermentación simultáneas.
La conversión de al menos una fracción de los azúcares solubles en agua en la composición hidrolizada puede presentarse en un ambiente líquido. El ambiente líquido puede obtenerse agregando algún líquido, preferentemente agua o que comprende agua, a la composición hidrolizada. Los líquidos también pueden estar presentes en la composición hidrolizada o en la composición catalizadora.
Debido a que la conversión de al menos una fracción de los azúcares solubles en agua se presenta en un ambiente líquido, que preferentemente comprende agua, la composición convertida comprenderá comúnmente el al menos un producto derivado del azúcar, agua y una composición sólida que comprende azúcares complejos y lignina. La lignina y los azúcares complejos en la composición hidrolizada también pueden modificarse y/o convertirse parcialmente en otros componentes como un efecto del proceso de hidrólisis y conversión. Los azúcares solubles en agua que no se han convertido en productos también pueden estar comprendidos en la composición convertida.
Para el alcance de la presente invención, la composición convertida comprende al menos un producto derivado del azúcar y una composición sólida que comprende azúcares complejos y lignina. El al menos un producto derivado del azúcar puede ser soluble o insoluble en la composición convertida. En una modalidad preferida, el producto derivado del azúcar es soluble en la composición convertida. Por ejemplo, el etanol es soluble en la composición fermentada. La composición sólida se obtiene retirando una fracción de la composición convertida que comprende al menos una fracción del producto derivado del azúcar. Se anota que, aunque el retiro de la mayor cantidad posible del producto derivado del azúcar es una modalidad preferida, parte del producto derivado del azúcar puede estar presente aun en la composición sólida. En otra modalidad, la composición sólida no comprende producto(s) derivado(s) del azúcar.
La fracción retirada de la composición convertida puede comprender además otros componentes de la composición convertida, tales como los azúcares solubles en agua que no se han convertido, agua, al menos una fracción del catalizador y aditivos. Puede comprender además una fracción de la composición sólida que comprende lignina y los azúcares complejos de la composición convertida. En una modalidad preferida, el ambiente bajo en azúcar comprende sustancialmente toda la composición sólida en la composición convertida y la fracción retirada de la composición convertida comprende sustancialmente todos los líquidos en la composición convertida.
En otra modalidad, el ambiente bajo en azúcar comprende toda la composición sólida en la composición convertida y la fracción retirada de la composición convertida comprende todos los líquidos en la composición convertida.
Cualquier metodo y combinación de métodos conocidos en la téenica e incluso por inventarse puede utilizarse para retirar una fracción de la composición convertida que comprende al menos un producto derivado del azúcar. Estos métodos comprenden tratamientos químicos y físicos de la composición convertida. Los tratamientos químicos y físicos pueden llevarse a cabo de manera secuencial o simultánea.
Los métodos preferidos para retirar al menos una fracción de la composición convertida comprenden decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, incluyendo filtración por membrana y filtración por presión, lavado, evaporación y destilación.
En una modalidad preferida, el producto convertido es etanol y la composición sólida se obtiene a partir de la composición convertida evaporando o destilando el etanol y retirando la mayor fracción de los líquidos en la composición convertida por medio de al menos un método en el grupo de decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, incluyendo filtración por membrana y filtración por presión y lavado.
La conversión de los azúcares solubles en agua en la composición hidrolizada en al menos un producto derivado del azúcar y el retiro de una fracción de la composición convertida que comprende al menos una fracción del producto convertido pueden presentarse al menos parcialmente de manera simultánea. En una modalidad, el producto convertido es etanol y puede retirarse por ejemplo, mediante evaporación o destilación, mientras los azúcares simples en la composición hidrolizada se fermentan a etanol.
En otra modalidad, la hidrólisis de la biomasa ligno-celulósica pretratada, la conversión de al menos una fracción de los azúcares solubles en agua y el retiro de una fracción de la composición convertida se presentan al menos parcialmente de manera simultánea. En una modalidad preferida, el producto convertido es etanol y puede ser retirado, por ejemplo, por evaporación y destilación durante la sacarificación y la fermentación simultáneas.
La composición sólida puede procesarse además antes de insertarse en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar de las células huésped para la producción de enzimas. La composición sólida también puede lavarse, preferentemente con agua, para retirar los azúcares solubles en agua u otros componentes que puedan afectar o reducir la producción de las enzimas.
Proceso para Producir Enzimas Es muy conocido en la téenica cómo producir enzimas o mezclas de enzimas en una célula huésped de origen fúngico tal como de hongos filamentosos, o de origen bacteriano. El proceso de crecimiento de la invención puede ser un proceso muy conocido, excepto que la alimentación comprende una composición sólida obtenida de una biomasa ligno-celulósica pretratada y que tiene una cantidad total de azúcares complejos menor que la cantidad total de azúcares complejos en la biomasa ligno-celulósica pretratada. En una modalidad preferida, la alimentación de azúcares simples se limita durante el cultivo.
Los procedimientos de producción de enzimas son muy conocidos en la técnica. En el contexto de la presente invención la enzima o mezcla de enzimas es preferentemente una enzima o mezcla de enzimas extra celular secretada en el ambiente de cultivo por la célula huésped. Alternativamente, la enzima o mezcla de enzimas es intracelular.
Una célula huésped con capacidad para producir enzimas o mezclas de enzimas se cultiva bajo condiciones precisas de cultivo a una tasa de crecimiento particular. Cuando el cultivo de la célula huésped se introduce en el ambiente de cultivo el cultivo inoculado pasa a través de un número de etapas. Inicialmente no se presenta crecimiento. Este período se refiere como la fase de demora y puede considerarse un período de adaptación. Durante la siguiente fase referida como la "fase exponencial" la tasa de crecimiento del cultivo de la célula huésped se incrementa gradualmente. Después de un período de crecimiento máximo la tasa cesa y el cultivo entra a una fase estacionaria.
Después de un período de tiempo adicional el cultivo entra a la fase muerta y el número de células viables declina. Cuándo, en la fase de crecimiento, la enzima o mezcla de enzimas de interés se expresa, depende de la enzima de interés y de la célula huésped. La enzima o mezcla de enzimas, en una modalidad, puede expresarse en la fase exponencial. En otra modalidad, la enzima o mezcla de enzimas puede producirse en la fase transitoria entre la fase exponencial y la fase estacionaria. La enzima o mezcla de enzimas, en otra modalidad, también puede expresarse en la fase estacionaria y/o justo antes de la esporulación. La enzima o mezcla de enzimas, de acuerdo con la invención, también puede producirse en más de una de las fases antes mencionadas.
En otras palabras, de acuerdo con la invención, la célula huésped se cultiva en un ambiente adecuado y bajo condiciones que permiten que al menos una enzima o mezcla de enzimas se exprese, preferentemente se secrete y opcionalmente se recupere. Aunque como se anotó anteriormente, el crecimiento de la célula huésped tiene muchas fases téenicas, para los propósitos de esta especificación, estas fases se agrupan juntas en el término cultivo. El cultivo de la célula huésped tiene lugar en un ambiente de cultivo desprovisto de azúcar que comprende una composición sólida obtenida de una biomasa ligno-celulósica pretratada retirando al menos una fracción de los azúcares complejos. El ambiente de cultivo desprovisto de azúcar puede comprender además una fuente de carbono adicional, una fuente de nitrógeno y las sales adicionales requeridas para el metabolismo del microorganismo.
De acuerdo con una modalidad preferida la biomasa ligno-celulósica pretratada se ha pretratado embebiéndola/lavándola y después explotándola por vapor como se describe en la WO 2010113129, cuyas enseñanzas se incorporan mediante la referencia.
Después del cultivo la enzima o mezcla de enzimas puede recuperarse opcionalmente utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, la recuperación de la enzima o mezcla de enzimas extracelulares del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar puede realizarse utilizando procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los procedimientos para recuperar una enzima o mezcla de enzimas también son muy conocidos en la téenica.
Al menos en el contexto de la presente invención el término "cultivo" significa cualquier proceso para producir una enzima o mezcla de enzimas utilizando un cultivo de masa que consiste de una o más células huésped. La presente invención es útil especialmente para la producción a escala industrial, e.g., que tiene un ambiente de cultivo de al menos 50 litros, preferentemente de al menos 5 litros, más preferentemente de al menos 1 litro.
La enzima o mezcla de enzimas puede incluir, pero no se limita a, cualquiera de las pertenecientes al grupo de enzimas o mezclas de enzimas que comprenden endoglucanasas (endo-1, 4^ -D-glucanasa), celobiohidrolasas o exoglucanasas (exo-1. 4-p-D-glucanasa), b-glucosidasa (1,4-b-?-glucosidasa), endo-1,-b-xilanasa, endo-1,4-b-mananasa, 1,4-b-xilosidasa y 1,4^ -manosidasa.
Un proceso de la invención puede llevarse a cabo como un lote, un lote de alimentación, un lote de alimentación repetido o un proceso continuo.
Un proceso de la invención puede llevarse a cabo de manera aeróbica o anaeróbica. Algunas enzimas se producen mediante cultivo sumergido y algunas por cultivo superficial. De acuerdo con la invención se prefiere el cultivo sumergido.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto, la invención se refiere a procesos para producir una enzima o mezcla de enzimas en una célula huésped que comprenden cultivar dicha célula huésped con capacidad de producir enzimas o mezclas de enzimas bajo condiciones conductivas para la producción de una enzima o mezcla de enzimas, tal como una enzima o mezcla de enzimas, en donde la composición sólida obtenida a partir de una biomasa ligno-celulósica pretratada se utiliza para hacer crecer la célula huésped bajo condiciones bajas en azúcar simple teniendo una cantidad de azúcar o azúcares simples agregada en el rango de 0 a 10% por peso del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar sobre una base seca durante una porción del tiempo de cultivo que es al menos el 50% del tiempo de cultivo.
El tiempo de cultivo es la cantidad de tiempo medida desde la adición del volumen del pre-cultivo de la célula huésped al ambiente de cultivo desprovisto de azúcar hasta la cosecha, retiro o separación de la enzima o mezcla de enzimas del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar. En el caso de retiros múltiples, el tiempo de cultivo termina al momento de terminar el último retiro de la primera enzima o mezcla de enzimas.
La cantidad de la composición sólida obtenida a partir de la biomasa ligno-celulósica pretratada presente en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar debe ser suficiente para el crecimiento de la célula huésped para producir la enzima o mezcla de enzimas.
La frase condiciones bajas en azúcar simple significa generalmente que más del 50% por peso de la alimentación de la célula huésped proviene de la composición sólida obtenida de una segunda biomasa ligno-celulósica pretratada y no de los azúcares simples agregados. Una condición baja en azúcar simple ejemplar es cuando la cantidad de azúcares simples agregada al proceso, si acaso se agrega alguna, se encuentra en el rango de 0 a 10% por peso del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar sobre una base seca. Más preferentemente, los azúcares simples opcionales agregados deben estar en el rango de 0 a 5% por peso del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar sobre una base seca, siendo aún más preferido de 0 a 2.5% por peso, siendo el más preferido de 0 a 2.0% (si acaso se agregan azúcares simples). En el mejor de los casos, no se agregan azúcares simples lo cual es la condición perfecta baja en azúcar simple. Adicionalmente, la frase azúcares simples agregados significa que podría haber uno o más azúcares simples agregados. En una modalidad el azúcar simple opcional se encuentra presente, pero a menos del porcentaje indicado.
Las condiciones bajas en azúcar simple deben mantenerse durante al menos una porción del tiempo de cultivo. Expresado cuantitativamente, las condiciones bajas en azúcar simple deben mantenerse durante al menos el 50% del tiempo de cultivo, siendo más preferido 75%, siendo aún más preferido 85%, siendo aún más preferido 95%, siendo el 99 y el 100% del tiempo de cultivo el más preferido. El 100% del tiempo de cultivo es cuando la al menos una porción del tiempo de cultivo es igual al tiempo de cultivo.
El Sustrato Los sustratos de fuente de carbono comúnmente utilizados como alimentación para la producción de enzimas o mezclas de enzimas incluyen glucosa o azúcares similares, siempre que su consumo relativo al consumo de los azúcares complejos se encuentre dentro de los límites especificados. Pueden agregarse sustratos de fuente de nitrógeno, estimuladores de crecimiento y lo similar para mejorar el cultivo y la producción de enzimas o mezclas de enzimas. Las fuentes de nitrógeno incluyen urea, sales de amoniaco (por ejemplo, NH4C1 o NH4SO4) y péptidos. Puede utilizarse proteasa, e.g., para digerir las proteínas, para producir nitrógeno de amino libre (FAN). Tales aminoácidos libres pueden funcionar como nutrientes para la célula huésped, mejorando así el crecimiento y la producción de enzimas o mezclas de enzimas. Los estimuladores de cultivo preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, y Vitaminas A, B, C, D y E. Ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes que comprenden P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn y Cu.
La celulosa pura, comúnmente utilizada como inductor (y fuente de carbono) en procesos de producción de enzimas o mezclas de enzimas, se remplaza con una composición sólida obtenida a partir de una biomasa ligno-celulósica pretratada; la composición se destoxifica preferentemente si se pretrata con ácido, por ejemplo, mediante lavado.
La composición sólida es una fuente de carbono y puede agregarse al ambiente de cultivo desprovisto de azúcar junto con una fuente de carbono, pero también puede agregarse separada de la fuente de carbono. De acuerdo con la invención la composición sólida puede agregarse al ambiente de cultivo desprovisto de azúcar ya sea antes de la inoculación, simultáneamente con la inoculación o después de la inoculación del cultivo de la célula huésped en una cantidad al menos correspondiente a la cantidad de los azúcares complejos disponibles necesarios para hacer crecer la célula huésped. Cuando la composición sólida se agrega durante el tiempo de cultivo, se realiza un nuevo cálculo de la cantidad de azúcares simples opcionales agregada o de la relación de los azúcares simples opcionales a la biomasa ligno-celulósica. Aunque la cantidad de azúcares simples puede no haber sido suficientemente baja durante la parte inicial del tiempo de cultivo, al agregar la composición sólida al ambiente de cultivo desprovisto de azúcar, la cantidad de azúcares simples opcionales agregada caería dentro de los rangos especificados, al menos durante el tiempo restante en el tiempo de cultivo.
La persona experta en la téenica puede determinar fácilmente cuándo y qué cantidad agregar de la composición sólida de acuerdo con la invención. Durante la extensión del tiempo de cultivo la composición sólida se consume normalmente por la célula huésped y se mantiene dentro de los límites previamente especificados.
Como se mencionó anteriormente la composición sólida se utiliza de la misma manera en que se utiliza normalmente la glucosa en procesos de producción de enzimas o mezclas de enzimas muy conocidos.
Cosecha de Enzima(s) En el proceso descrito, la composición sólida se utiliza para alimentar células huésped en el proceso de producción de enzimas. La composición sólida se obtiene de una biomasa ligno-celulósica pretratada, comprendiendo dicha composición sólida azúcares complejos y lignina. A medida que las células huésped se alimentan por los azúcares complejos en la composición sólida, se forma un residuo sólido de la composición sólida a partir de al menos una fracción de la composición sólida en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar. El residuo sólido comprende al menos una fracción de la lignina de la composición sólida y puede comprender una fracción de los azúcares complejos de la composición sólida. La lignina puede haberse modificado en la etapa de cultivo de las células huésped.
Las enzimas producidas cultivando las células huésped en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar pueden cosecharse separando el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar en al menos dos fracciones, la composición cosechada que comprende al menos una fracción de las enzimas, y la composición agotada que comprende al menos una fracción del residuo sólido de la composición sólida. El residuo sólido puede comprender la mayor parte de las células huésped.
Por "al menos dos fracciones" se entiende que el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar puede separarse en más de dos fracciones, estando esta modalidad dentro del alcance de la invención.
La composición cosechada puede comprender además otros componentes del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar, tales como por ejemplo agua y aditivos contenidos en la composición sólida y/o en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar y/o agregados en el cultivo de las células huésped. Además puede comprender parte de la composición sólida y parte del residuo sólido. En una modalidad preferida, la composición cosechada no contiene ninguno, o muy pocos compuestos sólidos. En otra modalidad preferida, la composición cosechada contiene todas, o casi todas, las enzimas producidas.
La composición agotada comprende al menos una fracción del residuo sólido de la composición sólida y puede comprender además otros componentes del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar, tales como por ejemplo agua y aditivos contenidos en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar y/o agregados en la etapa de cultivo de las células huésped. Además puede comprender parte de las enzimas. En una modalidad preferida, la composición agotada no contiene ninguna, o muy pocas, enzimas. En otra modalidad preferida, la composición agotada contiene todo, o casi todo, el residuo sólido de la composición sólida.
Puede utilizarse cualquier método y combinación de métodos conocidos en la téenica e incluso aún por inventarse para separar el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar al menos en la composición cosechada y en la composición agotada. Estos métodos comprenden tratamientos químicos y físicos de la composición hidrolizada. Los tratamientos químicos y físicos pueden llevarse a cabo de manera secuencial o simultánea.
Los métodos preferidos para separar el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar al menos en la composición cosechada y la composición agotada comprenden al menos un metodo en el grupo de centrifugación, filtración, diálisis, lavado y filtración por presión.
La composición cosechada y la composición agotada pueden someterse a cualquier proceso adicional dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, como ejemplos, separación, purificación, corrección del pH, dilución, concentración.
La Biomasa Ligno-celulósica En general, la biomasa ligno-celulósica natural o de origen natural puede describirse como sigue.
Además del almidón, tres constituyentes principales en la biomasa vegetal son la celulosa, la hemicelulosa y la lignina, que se refieren comúnmente por el término genérico lignocelulosa. Las biomasas que contienen polisacárido como término genérico incluyen biomasas tanto de almidón como ligno-celulósicas. En consecuencia, algunos tipos de materias primas pueden ser biomasa vegetal, biomasa que contiene polisacárido y biomasa ligno-celulósica.
Las biomasas que contienen polisacárido de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier material que contiene azúcares poliméricos, e.g., en forma de almidón así como de almidón refinado, celulosa y hemicelulosa.
Los tipos relevantes de biomasas de origen natural para derivar la invención reivindicada pueden incluir biomasas derivadas de cultivos agrícolas seleccionados del grupo que consiste de granos que contienen almidón, almidón refinado; forraje de maíz, bagazo, paja, e.g., de arroz, trigo, centeno, avena, cebada, colza, sorgo;: coniferas, e.g., Pinus sylvestris, Pinus radíate; madera dura, e.g., Salix spp. Eucalyptus spp.; tubérculos, e.g., betabel, patata; cereales e.g., de arroz, trigo, centeno, avena, cebada, colza, sorgo y maíz; papel de desecho, fracciones fibrosas del procesamiento del biogás, estiércol, residuos del procesamiento de aceite de palma, desechos sólidos municipales o lo similar. Aunque los experimentos se limitan a algunos ejemplos de la lista enumerada anteriormente, la invención se considera aplicable a todos debido a que la caracterización es principalmente para las características únicas de la lignina y el área superficial.
La materia prima de biomasa ligno-celulósica utilizada para derivar la composición proviene preferentemente de la familia llamada comúnmente pastos. El nombre apropiado es la familia conocida como Poaceae o Gramineae en la clase Liliopsida (las onocotiledóneas) de las plantas que florecen. Las plantas de esta familia se denominan comúnmente pastos o, para distinguirlas de otros graminoides, pastos verdaderos. También se incluye el bambú. Existen aproximadamente 600 géneros y algunas 9,000 a 10,000 o más especies de pastos (Kew Index of Wood Grass Species).
La Poaceae incluye granos alimenticios básicos y cultivos de cereales que crecen en todo el mundo, césped y pastos forrajeros y bambú. La Poaceae tiene generalmente tallos huecos llamados carrizos que se conectan (sólido) en intervalos llamados nodulos, los puntos a lo largo del carrizo en los cuales surgen las hojas. Las hojas de pasto son comúnmente alternadas, dísticas (en un plano) o poco frecuentemente en espiral, y de venas paralelas. Cada hoja se diferencia en una vaina inferior que abraza el tallo por una distancia y un filo con márgenes comúnmente completos. Los filos de las hojas de muchos pastos están reforzados con fitolitos de sílice, lo cual ayuda a disuadir a los animales de pastoreo. En algunos pastos (tales como el pasto filoso) esto hace los bordes de los filos de las hojas suficientemente agudos para cortar la piel humana. Un apéndice o margen de vellos, llamados la lígula, reside en la unión entre la vaina y la hoja, evitando la penetración de agua o insectos en la vaina.
Los filos de pasto crecen en la base del filo y no desde las puntas alargadas del tallo. Este punto bajo de crecimiento evolucionó en respuesta a los animales de pastoreo y permite pastar o podar los pastos regularmente sin daño severo a la planta.
Las flores de la Poaceae se disponen característicamente en puntas, teniendo cada punta uno o más cogollos (las puntas se agrupan además en panículos o puntas). Una punta consiste de dos (o algunas veces menos) brácteas en la base, llamadas glumes, seguidas por uno o más cogollos. Un cogollo consiste de la flor rodeada por dos brácteas llamadas la lema (la externa) y la palea (la interna). Las flores son comúnmente hermafroditas (maíz, monoecious, es una excepción) y la polinización es casi siempre anemófila. El perianto se reduce a dos escalas, llamadas lodículos, que se expanden y se contraen para esparcir la lema y la palea; éstas se interpretan generalmente como sépalos modificados.
El fruto de la Poaceae es un cariopsis en el cual el revestimiento de la semilla está fusionado a la pared del fruto y por tanto, no puede separarse del mismo (como en el grano de maíz).
Existen tres clasificaciones generales de hábitos de crecimiento presentes en los pastos: tipo racimo (también llamado caespitoso), estolonífero, y rizomatoso.
El éxito de los pasos reside en parte en su morfología y procesos de crecimiento y, en parte, en su diversidad fisiológica. La mayoría de los pastos se dividen en dos grupos fisiológicos, que utilizan las trayectorias fotosintéticas C3 y C4 para la fijación del carbono. Los pastos C4 tienen una trayectoria fotosintética vinculada a la anatomía de hoja Krantz especializada que los adapta particularmente a climas calurosos y a una atmosfera baja en bióxido de carbono.
Los pastos C3 se refieren como "pastos de temporada fría" mientras que las plantas C4 se consideran "pastos de temporada cálida". Los pastos pueden ser ya sea anuales o perennes. Ejemplos de temporada cálida anual son el trigo, el centeno, el pasto azul anual (poa de los prados anual, Poa annua y avena). Ejemplos de temporada fría anual son el pasto de huertos frutales (pata de gallo, Dactylis glomerata), fleo (Festuca spp.), pasto azul de Kentucky y centeno perenne (lolium perenne). Ejemplos de temporada cálida anual son maíz, pasto sundan y mijo perla. Ejemplos de temporada cálida perenne son tallo azul grande, pasto indio, pasto de bermuda y pasto aguja.
Una clasificación de la familia de los pastos reconoce doce subfamilias: Estas son 1) annomochlooideae, un pequeño linaje de pastos de hojas anchas que incluye dos géneros (Animochloa, Streptochaeta); 2) Pharoideae, un pequeño linaje de pastos que incluye tres géneros, incluyendo Pharus y Leptaspis; 3) Puelioideae, un pequeño linaje que incluye el género africano Puelia; 4) Pooideae que incluye trigo, cebada, avenas, pasto brome (Bronnus) y pastos de junco (Calamagrostis); 5) Bambusoideae que incluye bambú; 6) Ehrhartoideae, que incluye arroz y arroz silvestre; 7) Arundinoideae, que incluye el junco gigante y el junco común; 8) Centothecoideae, una pequeña subfamilia de 11 géneros que se incluye algunas veces en Panicoideae; 9) Chloridoideae, incluyendo los pastos love (Eragrostis, ca. 350 especies, incluyendo semillas de gota (sporobolus, algunas 160 especies), mijo finger (Eleusine coracana (L.) Gaertn.), y los pastos muhly (Muhlenbergia, ca. 175 especies); 10) Panicoideae incluyendo pasto pánico, maíz, sorgo, caña de azúcar, la mayoría de los mijos, fonio y pastos de tallo azul; 11) Micrairoideae y 12) Danthoniodieae incluyendo pasto de las pampas; con Poa que es un género de aproximadamente 500 especies de pastos, nativos de las regiones templadas de ambos hemisferios.
Los pastos agrícolas crecidos por sus semillas comestibles se denominan cereales. Tres cereales comunes son arroz, trigo y maíz (maíz). De todos los cultivos, el 70% son pastos.
La caña de azúcar es la fuente principal de producción de azúcar. Los pastos se utilizan para construcción. Los andamios hechos de bambú tienen la capacidad de soportar vientos de fuerza de tifón que romperían los andamios de acero. Los bambúes más grandes y Arundo donax tienen carrizos robustos que pueden utilizarse de manera similar a la madera, y las raíces del pasto estabilizan el pasto de las casas de paja. El Arundo se utiliza para producir lengüetas para instrumentos de viento madera y el bambú se utiliza para innumerables implementos.
Otra materia prima de biomasa ligno-celulósica de origen natural puede ser las plantas madereras o maderas. Una planta maderera es una planta que utiliza madera como su tejido estructural. Estas son típicamente plantas perenes cuyos tallos y raíces más grandes están reforzados con la madera producida adyacente a los tejidos vasculares. El tallo principal, las ramas más grandes y las raíces de estas plantas están cubiertos comúnmente por una capa de corteza engrosada. Las plantas madereras son comúnmente ya sea árboles, matorrales o lianas. La madera es una adaptación celular estructural que permite que las plantas madereras crezcan por arriba de los tallos a tierra año tras año, lo que hace a algunas plantas madereras las plantas más grandes y más altas.
Estas plantas necesitan un sistema vascular para mover el agua y los nutrientes desde las raíces hasta las hojas (xilema) y para mover los azúcares desde las hojas hacia el resto de la planta (floema). Existen dos tipos de xilema: primaria que se forma durante el crecimiento primario del procambium y la xilema secundaria que se forma durante el crecimiento secundario del cambium vascular.
Lo que se denomina comúnmente "madera" es la xilema secundaria de tales plantas.
Los dos grupos principales en los cuales puede encontrarse la xilema secundaria son: 1) las coniferas (Coniferae): existen unas seiscientas especies de coniferas. Todas las especies tienen xilema secundaria, que es relativamente uniforme en estructura a través de todo este grupo. Muchas coniferas se convierten en árboles altos: la xilema secundaria de tales árboles se comercializa como madera de coniferas. 2) las angiospermas (Angiospermae): existen de un cuarto de millón a cuatrocientas mil especies de angiospermas. Dentro de este grupo la xilema secundaria no se ha encontrado en las monocotiledóneas (e.g., Poaceae). Muchas angiospermas no cotiledóneas se convierten en árboles, y la xilema secundaria de éstas se comercializa como madera dura.
El término madera de coniferas se utiliza para describir la madera de árboles que pertenecen a las gimnospermas. Las gimnospermas son plantas con semillas desprotegidas no encerradas en un ovario. Estos "frutos" de semilla se consideran más primitivos que las maderas duras. Los árboles de madera de coniferas son comúnmente perennes, tienen conos y tienen agujas u hojas tipo escama. Incluyen especies coniferas, e.g., pinos, piceas, abetos y cedros. La dureza de la madera varía entre las especies coniferas.
El término madera dura se utiliza para describir la madera de árboles que pertenecen a la familia de las angiospermas. Las angiospermas son plantas con óvulos encerrados por protección en un ovario. Cuando se fertilizan, estos óvulos se desarrollan en semillas. Los árboles de madera dura son comúnmente de hojas anchas; en latitudes templadas y boreales son principalmente de hoja caduca, pero en tropicales y subtropicales son principalmente perennes. Estas hojas pueden ser ya sea simples (de filo único) o pueden ser compuestas con hojas pequeñas unidas a un tallo de hoja. Aunque son variables en forma todas las hojas de madera dura tienen una red distinta de finas venas. Las plantas de madera dura incluyen, e.g., álamo, abedul, cerezo, maple, roble y teca.
En consecuencia una biomasa ligno-celulósica de origen natural preferida puede seleccionarse del grupo que consiste de pastos y maderas. Otra biomasa ligno-celulósica de origen natural preferida puede seleccionarse del grupo que consiste de plantas que pertenecen a las coniferas, angiospermas, Poaceae y familias. Otra biomasa ligno-celulósica de origen natural preferida puede ser esa biomasa que tiene al menos 10% por peso de su materia seca como celulosa, o más preferentemente al menos 5% por peso de su materia seca como celulosa.
Pretratamiento De acuerdo con la invención la biomasa ligno- celulósica es pretratada. El término "pretratada" puede remplazarse con el término "tratada". Sin embargo, las téenicas preferidas contempladas son aquellas muy conocidas para el "pretratamiento" de biomasa ligno-celulósica como se describirá adicionalmente más adelante.
Como se mencionó anteriormente el tratamiento o pretratamiento puede llevarse a cabo utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica, lo cual promueve la separación y/o la liberación de la celulosa y una accesibilidad incrementada de la celulosa proveniente de la biomasa ligno-celulósica. Las técnicas de pretratamiento son muy conocidas en la técnica e incluyen pretratamiento físico, químico y biológico, o sus combinaciones. En modalidades preferidas el pretratamiento de la biomasa ligno-celulósica se lleva a cabo como un proceso por lotes o continuo.
Las técnicas físicas de pretratamiento incluyen varios tipos de molido/trituración (reducción del tamaño de partícula), irradiación, vaporización/explosión por vapor, e hidrotermolisis, en la modalidad preferida, embebido, retiro de los sólidos del líquido, explosión por vapor de los sólidos para crear la biomasa ligno-celulósica pretratada.
La trituración incluye molido en seco, en húmedo y de bola vibradora. Preferentemente, el pretratamiento físico implica el uso de alta presión y/o alta temperatura (explosión por vapor). En el contexto de la invención, alta presión incluye una presión en el rango de 3 a 6 MPa preferentemente 3.1 MPa. En el contexto de la invención alta temperatura incluye temperaturas en el rango de aproximadamente 100 a 300°C, preferentemente de aproximadamente 160 a 235°C. En una modalidad específica la impregnación se lleva a cabo a una presión de aproximadamente 3.1 MPa y a una temperatura de aproximadamente 235°C. En una modalidad preferida el pretratamiento físico se realiza de acuerdo con el proceso descrito en la WO 2010/113129, cuyas enseñanzas completas se incorporan mediante la referencia.
Aunque no es necesario o preferido, las téenicas de pretratamiento químico incluyen tratamiento de ácido, ácido diluido, base, solvente orgánico, cal, amoniaco, bióxido de azufre, bióxido de carbono, hidrotermolisis de pH controlado, oxidación en húmedo y solvente.
Si el proceso del tratamiento químico es un proceso de tratamiento de ácido, es más preferente un tratamiento de ácido diluido o suave continuo, tal como un tratamiento con ácido sulfúrico, u otro ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, o cualquier mezcla de los mismos. También pueden utilizarse otros ácidos. Tratamiento con ácido suave significa al menos en el contexto de la invención que el pH del tratamiento cae en el rango de 1 a 5, preferentemente de 1 a 3.
En una modalidad específica la concentración del ácido se encuentra en el rango de 0.1 a 2.0% por peso de ácido, preferentemente ácido sulfúrico. El ácido se mezcla o se pone en contacto con la biomasa ligno-celulósica y la mezcla se mantiene a una temperatura en el rango de aproximadamente 160 a 220°C durante un período que varía de minutos a segundos. Específicamente las condiciones de pretratamiento pueden ser las siguientes: de 165 a 183°C, de 3 a 12 minutos, de 0.5 a 1.4% (peso/peso) de concentración de ácido, de 15 a 25, preferentemente aproximadamente 20% (peso/peso) de concentración de sólidos totales. Otros métodos contemplados se describen en las Patentes de E.U. Nos. 4,880,473, 5,366,558, 5,188,673, 5,705,369 y 6,228,177.
Las téenicas de oxidación en húmedo implican el uso de agentes oxidantes, tales como agentes oxidantes a base de sulfito y lo similar. Ejemplos de tratamientos por solvente incluyen el tratamiento con DMSO (dimetil sulfóxido) y lo similar. Los procesos de tratamiento químico se llevan a cabo generalmente durante aproximadamente 5 a aproximadamente 10 minutos pero pueden llevarse a cabo durante períodos de tiempo más cortos o más largos.
Las técnicas de pretratamiento biológico incluyen aplicar microorganismos solubilizadores de lignina (ver, por ejemplo, Hsu, T., A., 1996, Pre-treatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization (Pretratamiento de biomasa, en manual de bioetanol: producción y utilización) Wyman, C., E., ed. Taylor & Francis, Washington, D.C., 179-212; Ghosh, P., y Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversión of ligno-cellulosic biomass (Tratamientos físico-químicos y biológicos para la conversión enzimática/microbiana de biomasa ligno-celulósica) Adv. Appl. Microbiol., 39: 295-333; McMillan, J., D., 1994, Pretreating ligno-cellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversión of Biomass for Fuels Production (Pretratamiento de biomasa ligno-celulósica: un resumen, en Conversión enzimática de biomasa para la producción de combustibles), Himmel, M., E., Baker, J. O., y Overend, R., P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, D.C., capítulo 15; Gong C. S., Cao, N. J., Du, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Producción de etanol a partir de recursos renovables, en Avances en Ingeniería bioquímica/bioteenología), Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Olsson, L., y Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of ligno-cellulosic hydrolysates for etanol production )Fermentación de hidrolisados ligno-celulósicos para la producción de etanol), Enz. Microb. Tech.18: 312-331; y Vallander, L., y Eriksson, K. E., L., 1990, Production of etanol from ligno-cellulosic materials: State of the art (Producción de etanol a partir de materiales ligno-celulósicos: Estado de la téenica) Adv.
Biochem. Eng/Biotechnol.42: 63-95).
En una modalidad, el pretratamiento tanto químico como físico se lleva a cabo incluyendo, por ejemplo, tanto el tratamiento con ácido suave como el tratamiento a alta temperatura y presión. El tratamiento químico y físico puede llevarse a cabo de manera secuencial o simultánea.
En una modalidad preferida, el pretratamiento se lleva a cabo como una etapa de embebido con agua a más de 1°C, retiro de la biomasa ligno-celulósica del agua, seguido por una etapa de explosión por vapor.
En una modalidad preferida la biomasa ligno-celulósica pretratada se comprende de azúcares complejos, también conocidos como glucanos y xilanos (celulosa y hemicelulosa) y lignina.
Enzimas o mezclas de enzimas Una enzima o mezcla de enzimas significa una enzima o mezcla de enzimas celulolíticas con la capacidad de degradarse en biomasa ligno-celulósica. Una enzima o mezcla de enzimas producida de acuerdo con el proceso descrito puede ser de cualquier origen incluyendo de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen variantes químicamente modificadas o fabricadas por proteínas. Las enzimas o mezclas de enzimas adecuadas incluyen enzimas o mezclas de enzimas de las generales Cellulomonas, Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, Chrysosporium, Penicillium, Themobifida y Trichoderma, e.g., enzima o mezcla de enzimas de hongos producida por Humicola insolens, Themobifida fusca, Cellulomonas fimi, Myceliophthora thermophila, Thielavia terrestres, Fusarium oxysporum, Chrysosporium lucknowense, Penicillium decumbens, y Trichoderma reesei.
En una modalidad la enzima o mezcla de enzimas producida es un compuesto de enzimas o mezcla de enzimas, homólogo a la célula huésped. En una modalidad la enzima o mezcla de enzimas producida es un compuesto de enzimas o mezcla de enzimas, homólogo a una célula huésped del género Penicillium, preferentemente una cepa de Penicillium decumbens.
Debe entenderse que la enzima o mezcla de enzimas producida también puede ser una enzima o mezcla de enzimas mono-componente, e.g., comprende una endoglucanasa, exocelobiohidrolas , glucohidrolasa o beta-glucosidasa producida recombinantemente en una célula huésped adecuada. La enzima o mezcla de enzimas también puede incluir otras enzimas o clases de enzimas producidas en células recombinantes que explotan al menos una parte de la región de codificación de las enzimas previamente listadas incluyendo las regiones reguladoras y/o promotoras como se conoce en la téenica. Las células huésped adecuadas se describen adicionalmente más adelante.
La enzima o mezcla de enzimas producida también puede ser una preparación de enzimas o mezcla de enzimas en donde uno o más de los componentes homólogos de la enzima o mezcla de enzimas se suprimen o se inactivan de la célula huésped que produce naturalmente la enzima o mezcla de enzimas.
Célula Huésped con Capacidad para Producir una Enzima o Mezcla de Enzimas La célula huésped puede ser de cualquier origen. Como se mencionó anteriormente la enzima o mezcla de enzimas puede ser homologa o heteróloga a la célula huésped con la capacidad de producir la enzima o mezcla de enzimas.
El término "célula huésped recombinante", como se utiliza en la presente, significa una célula huésped que aloja gen(es) que codifica(n) para la enzima o mezcla de enzimas y con capacidad de expresar dicho(s) gen(es) para producir la enzima o mezcla de enzimas, en donde la enzima o mezcla de enzimas que codifica para el(los) gen(es) se ha transformado, transíectado, traducido, o lo similar, en la célula huésped. La transformación, transíección, traducción o téenica similar utilizada puede ser muy conocida en la técnica. En una modalidad preferida el gen se integra en el genoma de la célula huésped recombinante en una o más copias.
Cuando la enzima o mezcla de enzimas es heteróloga la célula huésped recombinante con capacidad para producir la enzima o mezcla de enzimas es preferentemente de origen fúngico o bacteriano. La selección de la célula huésped recombinante dependerá en gran medida de el(los) gen(es) que codifica(n) para la enzima o mezcla de enzimas y del origen de la enzima o mezcla de enzimas.
El término "célula huésped de tipo silvestre" como se utiliza en la presente, se refiere a una célula huésped que aloja de manera natural el(los) gen(es) que codifica(n) para la enzima o mezcla de enzimas y con la capacidad de expresar dicho(s) gen(es). Cuando la enzima o mezcla de enzimas es una preparación homologa o un compuesto de enzimas o mezclas de enzimas la célula huésped de tipo silvestre o un mutante de la misma con capacidad para producir la enzima o mezcla de enzimas es preferentemente de origen fúngico o bacteriano.
Un "mutante de la misma" puede ser una célula huésped de tipo silvestre en la cual uno o más genes se han suprimido o inactivado, e.g., a fin de enriquecer la preparación de enzimas o mezclas de enzimas en cierto componente. Una célula huésped mutante también puede ser una célula huésped de tipo silvestre transformada con uno o más genes adicionales que codifican para enzimas o proteínas adicionales a fin de introducir una o más actividades enzimáticas adicionales u otras actividades en el compuesto o preparación de enzimas o mezclas de enzimas naturalmente producido por la célula huésped de tipo silvestre. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) tener la misma actividad (e.g., actividad de la enzima o mezcla de enzimas) o simplemente ser otra molécula enzimática, e.g., con diferentes propiedades. La célula huésped de tipo silvestre también puede tener genes que codifican para la enzima homologa transformados, transíectados, traducidos o lo similar, preferentemente integrados en el genoma, a fin de incrementar la expresión de ese gen para producir más enzimas.
En una modalidad preferida la célula huésped recombinante o de tipo silvestre es de origen fúngico filamentoso. Ejemplos de células huésped incluyen las seleccionadas del grupo que comprende una célula Acremonium, Aspergillus, Aureobasiduim, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.
En una modalidad más preferida la célula huésped fúngica filamentosa se selecciona del grupo que comprende una cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En una modalidad incluso más preferida, la cepa es Penicillium decumbens.
En otra modalidad preferida la célula huésped fúngica filamentosa es una cepa de célula Fusarium bactridioides, Fusarium cereales, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinu , Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecoides o Fusarium venenatum. En otra modalidad preferida, la célula huésped fúngica filamentosa se selecciona del grupo que comprende una cepa de Bjerkandera adusta, Cerioporiopsis aneirina, Cerioporiopsis aneirina, Cerioporiopsis caregiea, Cerioporiopsis glivescens, Cerioporiopsis pannocinta, Cerioporiopsis rivulosa, Cerioporiopsis subrufa o Cerioporiopsis subvermispora, Chrysosporium lucknowense, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Penicillium decumbens, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestres, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
En otra modalidad preferida la célula huésped recombinante o de tipo silvestre es de origen bacteriano. Ejemplos de células huésped incluyen las seleccionadas del grupo que comprende bacterias gram positivas tales como una cepa de Bacillus, e.g. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus Thuringiensis; o una cepa de Streptomyces, e.g., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o de una bacteria gram negativa, e.g., E. coli o Pseudomonas sp.
Hidrólisis La biomasa contendrá algunos compuestos que son hidrolizables en una especie soluble en agua obtenible de la hidrólisis de la biomasa. En el caso de especies hidrolizadas solubles en agua de celulosa, la celulosa puede hidrolizarse en glucosa, celobiosa y polímeros de glucosa más altos e incluye dímeros y oligómeros. Por tanto algunas de las especies hidrolizadas solubles en agua de celulosa son glucosa, celobiosa y polímeros de glucosa más altos e incluyen sus respectivos dímeros y oligómeros. La celulosa se hidroliza en glucosa por medio de las celulasas carbohidrolíticas. Por tanto las celulasas carbohidrolíticas son ejemplos de catalizadores para la hidrólisis de celulosa.
El entendimiento prevalente del sistema celulolítico divide las celulasas en tres clases: exo-1,4- [beta]-D-glucanasas o celobiohidrolasas (CBH) (EC 3.2.1.91), que dividen unidades de celobiosa desde los extremos de las cadenas de celulosa; endo-1,4-[beta]-D-glucanasas (EG) (EC 3.2.1.4) que hidrolizan los enlaces [beta]-1,4-glucosídicos internos aleatoriamente en la cadena de celulosa; 1,4-[beta]-D-glucosidasa (EC 3.2.1.21) que hidroliza la celulosa a glucosa y también divide las unidades de glucosa a partir de celooligosacáridos. En consecuencia, si la biomasa contiene celulosa, entonces la glucosa es una especie hidrolizada soluble en agua obtenible de la hidrólisis de la biomasa y las celulasas antes mencionadas son ejemplos específicos, así como las mencionadas en la sección experimental, de catalizadores para la hidrólisis de celulosa.
Mediante un análisis similar, los productos de la hidrólisis de hemicelulosa son especies solubles en agua obtenibles de la hidrólisis de la biomasa, asumiendo por supuesto que la biomasa contiene hemicelulosa. La hemicelulosa incluye xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Los diferentes azúcares en la hemicelulosa se liberan por medio de las hemicelulasas. El sistema hemicelulítico es más complejo que el sistema celulolítico debido a la naturaleza heteróloga de la hemicelulosa. Los sistemas pueden implicar entre otras, endo-1|,4-[beta]-D-xilanasas (EC 3.2.1.8), que hidrolizan los enlaces internos en la cadena de xilano; 1,4-[beta]-D-xilosidasas (EC 3.2.1.37) que atacan los xilooligosacáridos desde el extremo no reductor y liberan xilosa; endo-1,4- [beta]-D-mananasas (EC 3.2.1.78), que divide los enlaces internos; 1,4-[beta]-D-manosidasas (EC 3.2.1.25) que dividen los manooligosacáridos en mañosa. Los grupos laterales se retiran por medio de un número de enzimas; tales como [alfa]-D-galactosidasas (EC 3.2.1.22), [alfa]-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55), [alfa]-D-glucuronidasas (EC 3.2.1.139), cinamoil esterasas (EC 3.1.1.-), acetil xilano esterasas (EC 3.1.1.6) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73). En consecuencia, si la biomasa contiene hemicelulosa, entonces la xilosa y la mañosa son ejemplos de una especie hidrolizable soluble en agua obtenible de la hidrólisis de la biomasa que contiene hemicelulosa y las hemicelulasas antes mencionadas son ejemplos específicos, así como los mencionados en la sección experimental, de catalizadores para la hidrólisis de hemicelulosa.
En el proceso se incluye un catalizador de hidrólisis. La composición del catalizador de hidrólisis consiste del catalizador, el vehículo, y otros aditivos/ingredientes utilizados para introducir el catalizador al proceso. Como se trató anteriormente, el catalizador puede comprender al menos una enzima o microorganismo que convierte al menos uno de los compuestos en la biomasa en un compuesto o compuestos de menor peso molecular, hasta, e incluyendo, el azúcar básico o el carbohidrato utilizado para producir el compuesto en la biomasa. Las enzimas capaces de hacer esto para los diversos polisacáridos tales como celulosa, hemicelulosa y almidón son muy conocidas en la téenica e incluirían aquellas aun no inventadas.
La composición de catalizador de hidrólisis puede comprender también un ácido inorgánico seleccionado preferentemente del grupo que consiste de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico y lo similar o mezclas de los mismos. El ácido inorgánico se considera útil para para el procesamiento a temperaturas mayores que 100°C. El proceso también puede operarse específicamente sin la adición de un ácido inorgánico.
Es típico agregar el catalizador de hidrólisis al proceso con un vehículo, tal como agua o una biomasa de base orgánica. Para propósitos de balance de masa, el término composición de catalizador incluye en consecuencia el(los) catalizador(es) más el(los) vehículo(s) utilizado(s) para agregar el(los) catalizador(es) al proceso. Si se agrega un amortiguador de pH con el catalizador, entonces éste es también parte de la composición de catalizador.
Frecuentemente, la biomasa ligno-celulósica contendrá almidón. Las enzimas más importantes para uso en la hidrólisis del almidón son alfa-amilasas (1,4-[alfa]-D-glucan glucanohidrolasas, (EC 3.2.1.1)). Estas son hidrolasas endo-activas que dividen los enlaces 1,4-[alfa]-D-glucosídicos y pueden rodear pero no hidrolizar los puntos de ramificación 1,6-[alfa]-D-glucosídicos. Sin embargo, también pueden utilizarse glicoamilasas exo-activas tales como beta-amilasa (EC 3.2.1.2) y pulilanasa (EC 3.2.1.41) para la hidrólisis del almidón. El resultado de la hidrólisis del almidón es principalmente glucosa, maltosa, maltotriosa, [alfa]-dextrina y cantidades variables de oligosacáridos. Cuando se utiliza un hidrolizado a base de almidón para la fermentación puede ser ventajoso agregar enzimas proteolíticas. Tales enzimas pueden evitar la floculación del microorganismo y pueden generar aminoácidos disponibles para al microorganismo. En consecuencia, si la biomasa contiene almidón, entonces la glucosa, maltosa, maltotriosa, [alfa]-dextrina y oligosacáridos son ejemplos de una especie hidrolizada soluble en agua obtenible de la hidrólisis de la biomasa que contiene almidón y las alfa-amilasas antes mencionadas son ejemplos específicos, así como los mencionados en la sección experimental, de catalizadores para la hidrólisis del almidón.
Uso En otro aspecto el proceso se refiere al uso de una composición sólida obtenida de una biomasa ligno-celulósica pretratada como una alimentación de fuente de carbono para producir una enzima o mezcla de enzimas en una célula huésped.
El proceso descrito y reivindicado en la presente no debe limitarse en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, debido a que estas modalidades pretenden ser ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente pretende estar dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente se harán aparentes para los expertos en la téenica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones también pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, dominará la presente descripción, incluyendo las definiciones.
El proceso puede tener también etapas adicionales en donde las enzimas cosechadas del proceso se utilizan posteriormente para hidrolizar una primera biomasa ligno-celulósica. Preferentemente la primera biomasa ligno-celulósica y la segunda biomasa ligno-celulósica deben derivarse del mismo género de pastos y más preferentemente derivarse de la misma especie de pastos. También es preferible que la primera biomasa ligno-celulósica en la cual va a conducirse la hidrólisis enzimática sea pretratada antes de la hidrólisis enzimática.
También se descubre la enzima o mezcla de enzimas producida mediante el proceso descrito así como la biomasa ligno-celulósica que se ha hidrolizado por medio de una enzima o mezcla de enzimas producida de acuerdo con el proceso descrito.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Preparación de Composiciones Sólidas Se prepararon diferentes composiciones sólidas a partir de Arundo donax y paja de trigo. Las biomasas se sometieron a pretratamiento, hidrólisis enzimática, fermentación y filtración por presión para preparar diferentes composiciones sólidas utilizadas en los experimentos de cultivo.
Pretratamiento La biomasa ligno-celulósica se introdujo en un reactor continuo y se sometió a un tratamiento de embebido. La mezcla embebida se separó en un líquido embebido y una fracción conteniendo la materia prima sólida embebida por medio de una prensa. La fracción conteniendo la materia prima sólida embebida se sometió a explosión por vapor. Los parámetros de pretratamiento para las dos biomasas se reportan en la Tabla 1.
TABLA 1: Parámetros de proceso utilizados en el pretratamiento Tabla Los productos de la explosión por vapor se separaron en un líquido de explosión por vapor y un sólido de explosión por vapor.
El sólido de explosión por vapor es la biomasa pretratada de Arundo donax (AR) y la biomasa pretratada de paja de trigo (WS) utilizada en los experimentos de cultivo.
Hidrólisis enzimática La biomasa pretratada se mezcló con agua para obtener una mezcla que tiene 7.5% de contenido de materia seca y la mezcla se insertó en un reactor enzimático. Se agregó un cóctel de enzimas correspondiente a la concentración especificada de proteína por gramo de glucanos contenidos en la biomasa pretratada. La hidrólisis enzimática se llevó a cabo durante 72 horas bajo agitación.
Se prepararon dos hidrolizados diferentes comenzando a partir de la biomasa pretratada de paja de trigo; cada hidrolizado se separó mediante centrifugación (20 minutos, 8000 rpm, 4°C) en una fracción líquida, conteniendo los azúcares solubles en agua, y la composición sólida. Las composiciones sólidas, indicadas como HW1 y HW2, se utilizaron en los experimentos de cultivo. Los parámetros de hidrólisis utilizados en la preparación de HW1 y HW2 se reportan en la Tabla 2 y se seleccionaron para obtener dos niveles diferentes bajos en azúcar complejo; en particular la HW2 se preparó con una concentración de enzimas más alta, correspondiendo así a una composición más disminuida.
TABLA 2: Parámetros utilizados en la hidrólisis enzimática para producir las composiciones sólidas HW1 y HW2 Tabla Fermentación y filtración por presión El hidrolizado de paja de trigo preparado de acuerdo con las condiciones de la composición HW2, se insertó en un biorreactor con 3 g/1 de urea y 0.5 g/1 de una levadura de fermentación. El pH se ajustó a 5 y la temperatura a 30°C y la fermentación se llevó a cabo durante 48 horas. No se retiró el cóctel enzimático del hidrolizado, de tal manera que la hidrólisis enzimática continuó durante la fermentación. El caldo de fermentación, comprendiendo sólidos, etanol y otras fracciones líquidas, se presionó por un filtrado por presión a una temperatura de 80°C a 15 bar, para separar el etanol y los componentes líquidos de la fracción rica en sólidos. La fracción rica en sólidos comprendiendo la lignina extraída de la prensa, indicada como HFW, se utilizó en los experimentos de cultivo.
El hidrolizado de Arundo donax se preparó de acuerdo con los parámetros correspondientes a la H 2 y se fermentó de acuerdo con el procedimiento utilizado para la paja de trigo. La fracción rica en sólidos extraída de la prensa, indicada como HFA, se utilizó en los experimentos de cultivo.
Composición La composición de la biomasa pretratada y las composiciones sólidas en términos de azúcares solubles en agua, lignina y otros compuestos se determinó de acuerdo con los métodos analíticos estándar listados al final de la sección experimental.
La Tabla 3 reporta la composición de la biomasa pretratada de AR y WS, las composiciones sólidas derivadas de los hidrolizados de WS HW1 y HW2 y las composiciones sólidas derivadas de la fermentación de los hidrolizados de AR y WS (HFW y HFA). La tabla contiene también las composiciones de LSI y LS2, que se utilizaron en los siguientes experimentos y se describen en una sección experimental siguiente.
Las composiciones se expresan en términos de azúcares complejos C6, azúcares complejos C5, azúcares totales solubles en agua (C5 y C6) y otros componentes (que comprenden lignina y agua). Los azúcares complejos C6 se basan en glucosa, los azúcares complejos C5 se basan principalmente en xilosa.
TABLA 3 . Composiciones utilizadas en los experimentos reportados Tabla Incluyendo lignina y agua Para el alcance de la presente descripción, las composiciones se caracterizan convenientemente por la relación de azúcares complejos a lignina. Los azúcares complejos corresponden a la suma de los azúcares complejos C6 y los azúcares complejos C5. Considerando las composiciones obtenidas de WS, es decir HW1, HW2 y HFW, se anota que: la relación de azúcares complejos a lignina en HW1 y HW2 es menor que la relación de azúcares complejos a lignina en WS, reflejando la disminución del azúcar complejo ocurrida en la hidrólisis; la relación de azúcares complejos a lignina en HW2 es menor que la relación de azúcares complejos a lignina en HW1, reflejando la hidrólisis más efectiva en HW2 llevada a cabo a una concentración de enzimas más alta; la relación de azúcares complejos a lignina en HFW es menor que la relación de azúcares complejos a lignina en HW2, debido al hecho de que las enzimas no se desactivaron ni se retiraron y la hidrólisis continuó durante la fermentación.
Experimentos de Cultivo El cultivo de la célula huésped para la producción de enzimas procedió como en los siguientes ejemplos. Cada cultivo de célula huésped, que en los ejemplos reportados utilizó Trichoderma reesei y Penicillium decumbens como la célula huésped, comenzó desde una solución de esporas recuperadas de una placa PDA sembrada con esporas frescas siete días antes de la recuperación.
Los experimentos se dividen en dos etapas: 1) pre-cultivo que no es parte del proceso de cultivo reivindicado, y 2) cultivo de la célula huésped, en donde la célula huésped se hace crecer y se produce(n) la(s) enzima(s).
Pre-cultivo Sembrado de la placa PDA: 1. 500 ml de una solución de esporas previamente recolectada se suministraron en una placa PDA (medio de agar de dextrosa de patata al 3.9%) preparada como se conoce en la téenica. 2. 500 ml de solución estéril de NaCl al 0.9% para P. decumbens o solución de Tritón X-100 al 1% para T. reesei, se suministraron sobre las esporas y el matraz se hizo girar suavemente hasta que la superficie se cubrió completamente por el líquido. 3. El matraz se cerró con un tapón de algodón cubierto con hoja de aluminio y se incubó a 30°C para P. decumbens o a 28°C para T. reesei durante 7 días.
Recuperación de la Solución de Esporas: 4. Después de 7 días, 10 mi de la solución estéril apropiada para P. decumbens y T. reesei (NaCl al 0.9% y Tritón X-100 al 1%, respectivamente) se suministraron en el matraz. 5. El matraz se hizo girar suavemente hasta que el líquido se volvió nebuloso. 6. Se extrajo tanto volumen como fue posible de la solución suministrada retirando la suspensión de esporas hacia un tubo estéril. 7. La solución de esporas se almacenó a 4°C.
Etapa de Configuración del Pre-cultivo Antes de comenzar el cultivo de la célula huésped fue necesario configurar el pre-cultivo.
El medio de pre-cultivo se preparó como se reporta en la tabla 4, seleccionando el volumen apropiado con respecto al de la fase de cultivo de la célula huésped (un décimo y un veinteavo para P. decumbens y T. reesei, respectivamente).
TABLA 4: Composición del medio de pre-cultivo Tabla 1. La glucosa y la solución de esporas se agregaron después de la esterilización. El volumen de la solución de esporas se seleccionó para obtener una concentración final de 5000 CFU/ml para P. decumbens y de 50000 CFU/ml para T-reesei. 2. El pre-cultivo de P. decumbens se incubó a 30°C, 170 rpm durante 30 horas mientras el pre-cultivo de T-reesei se incubó a 28°C, 170 rpm durante 64 horas.
Cultivo de Célula Huésped y Producción de Enzimas El ambiente de cultivo de la célula huésped se prepara como se reporta en la tabla 5.
TABLA 5: Composición del medio de cultivo Tabla La biomasa se selecciona del grupo de composiciones preparadas para demostrar la invención (indicadas como WS, AR, HW1, HW2, HFW, HFA). 1. Después de la esterilización el pH se corrigió a 5.3 para P. decumbens y a 6.0 para T. reesei y se agregaron los volúmenes de pre-cultivo. El pH se controla en matraces utilizando diferentes tipos de soluciones amortiguadoras (por ejemplo 0.1 M de amortiguador de fosfato). 2. El cultivo de la célula huésped y la producción de enzimas se llevaron a cabo a la temperatura y agitación apropiadas para cada microorganismo (30°C, 170 rp para P. decumbens y 28°C, 170 rpm para T. reesei).
EXPERIMENTO 1 TABLA 6: Actividad enzimática de T. reesei en presencia de diferentes medios de cultivo Tabla La Tabla 6 compara la actividad sobre diferentes biomasas ligno-celulósicas utilizadas para alimentar la célula huésped, Trichoderma reesei. En la tabla, "composición utilizada" indica la biomasa utilizada en el medio de cultivo como fuente de átomos de carbono. El contenido del medio se calculó para proporcionar aproximadamente la misma cantidad de lignina en cada ambiente de cultivo. Debido a que cada biomasa utilizada se caracteriza por la relación del azúcar complejo disminuido a lignina, la cantidad del azúcar complejo utilizado en cada medio de cultivo disminuye de CE1 a WE3. Esto establece el método para varios tipos de células huésped. Las actividades de CE1 se seleccionaron como referencia para expresar los resultados experimentales en una escala relativa en la segunda sección de la tabla. Los experimentos WE1, WE2 y WE3 utilizaron un medio de cultivo en donde la única fuente de carbono fue la composición obtenida de la biomasa pretratada hidrolizada (HW1 y HW2) y fermentada (HFW). El tiempo de cultivo fue el mismo en todos los experimentos (169 horas).
Los resultados experimentales muestran claramente que la biomasa ligno-celulósica pretratada podría sustituirse con una composición sólida obtenida de la biomasa ligno-celulósica pretratada retirando una fracción de los azúcares complejos. Además, el rendimiento de conversión - definido como la relación de actividad total producida a azúcar complejo - obtenido de biomasa ligno-celulósica baja en azúcar es sorprendentemente más alto que el obtenido de biomasa ligno-celulósica pretratada con un incremento en el rendimiento de conversión como se demuestra por los resultados reportados en la tabla 7.
Tabla 7. Actividad total obtenida de diferentes medios preparados utilizando diferentes composiciones con un contenido bajo en azúcares complejos.
Tabla EXPERIMENTO 2 En un experimento adicional, se utilizaron diferentes composiciones que no tienen o tienen muy bajo contenido de azúcar complejo en el medio de cultivo como fuentes de carbono.
CE2 y CE3 se produjeron utilizando dos muestras comerciales de lignina diferentes. CE2 contenía 8% de contenido de sulfonato inferior de lignina alcalina (Sigma, código 471003) y CE3 contenía 8% de lignina alcalina (Sigma, código 370959). La lignina comercial utilizada tiene un contenido de azúcar complejo menor que 5%.
Después del proceso de producción de la enzima, los residuos del medio de cultivo utilizado en dos diferentes experimentos WE3 se centrifugaron durante 20 minutos a 8000 rpm y a 4°C y se recolectaron dos fracciones ricas en sólidos, indicadas respectivamente como LSI y LS2. El CE1 del Experimento 1 se reporta como experimento de control.
Las composiciones LSI y LS2 están contenidas en la Tabla 3. Los medios de cultivo WE4 y WE5 contenían 5 veces más material que el CE1 con respecto al contenido de lignina y de 2.5 a 2.8 veces más material que LSI y LS2 respectivamente. Como es evidente en la tabla 3, el contenido de azúcar complejo en LSI y LS2 es menor que 8% y la cantidad correspondiente del azúcar complejo agregado al medio se reporta en la tabla.
El tiempo de cultivo fue de 169 horas.
Tabla 8. Actividad enzimática de T. reesei para los experimentos CE1, CE2, CE3, WE4 y WE5 Tabla Como parece claro a partir de los datos reportados, en el caso de WE4 y WE5 la cantidad de azúcar complejo, correspondiente al 20% de los azúcares complejos en el caso DE1, no es suficiente para promover la producción de enzimas, mientras se reportó que la presencia de 45% de los azúcares complejos utilizados en CE1 incrementa la producción de enzimas (experimento WE3).
EXPERIMENTO 3 Se llevaron a cabo experimentos adicionales para producir enzimas utilizando Penicillium decumbens como la celula huésped. El ejemplo comparativo (CE4) se condujo utilizando biomasa pretratada de AR como la fuente de carbono mientras el WE6 se condujo agregando una cantidad suficiente de la composición HFA para proporcionar aproximadamente la misma cantidad de lignina utilizada en el CE4. El tiempo de cultivo fue el mismo para todos los experimentos (138 horas).
La Tabla 9 reporta las actividades obtenidas después de 138 horas de producción de enzimas. Los experimentos muestran que podría producirse al menos la misma cantidad de enzimas totales cuando se cultiva Penicillium decumbens ya sea en presencia de biomasa ligno-celulósica pretratada o baja en azúcar.
Tabla 9: Actividad enzimática producida utilizando Penicillium decumbens como la célula huésped Tabla Es aparente a partir de la Tabla 9, que las enzimas derivadas de la célula huésped alimentada con la composición sólida baja en azúcar obtenidas de la hidrólisis y la fermentación de biomasas ligno-celulósicas se encuentran muy cercanas a las derivadas del ejemplo comparativo obtenido utilizando el material pretratado.
EXPERIMENTO 4 Las enzimas producidas en WE3 sobre la composición sólida de paja de trigo HFW se utilizaron posteriormente para hidrolizar la biomasa pretratada de paja de trigo WS.
La biomasa pretratada se mezcló con agua para obtener una mezcla que tiene un contenido de 7.5% de materia seca y la mezcla se insertó en un matraz de 100 mi. Las mezclas de enzimas crecidas en WE3 se cargaron a 60 y 90 mg de proteína/glucanos de la biomasa pretratada en los experimentos WE7 y E8 respectivamente, y la hidrólisis se llevó a cabo a un pH de 5.0 y a 50°C durante 72 horas. El experimento CE5 se llevó a cabo utilizando una solución enzimática comercial siguiendo las especificaciones del productor.
Se midieron las concentraciones de glucosa y xilosa a 6, 24, 48 y 72 horas y se reportan en la Tabla 10. La glucosa y la xilosa liberadas se reportaron a la cantidad inicial de glucanos y xilanos en la biomasa pretratada WS para cuantificar el rendimiento de la hidrólisis de glucanos y el rendimiento de la hidrólisis de xilanos. La Figura la-lb reporta las gráficas del rendimiento de la hidrólisis de los glucanos (Figura la) y el rendimiento de la hidrólisis de los xilanos (Figura Ib). Estos experimentos destacan que las enzimas producidas de acuerdo con la presente descripción pueden utilizarse para hidrolizar efectivamente las biomasas ligno-celulósicas pretratadas.
Tabla 10. Resultados de la hidrólisis de los experimentos CE5, WE7 y WE8 Tabla MÉTODOS ANALÍTICOS Determinación de actividad La FPU (actividad del papel filtro), la actividad de beta-glucosidasa y de xilanasa se determinaron utilizando métodos industriales conocidos para determinar la actividad enzimática. Siendo la diferencia que el papel filtro fue el sustrato para la FPU y que se utilizaron salicina y la mezcla de xilano descrita más adelante como los análisis de actividad de beta-glucosidasa y xilanasa.
Tabla Determinación de la composición Las composiciones se llevaron a cabo de acuerdo con los siguientes estándares NREL Método Analítico NREL Determinación de los Carbohidratos Estructurales y la Lignina en la Biomasa Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 4/25/2008 Reporte téenico NREL/TP-510-42618 revisado en abril de 2008 Determinación de Extractos en la Biomasa Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 7/17/2005 Reporte técnico NREL/TP-510-42619 enero de 2008 Preparación de Muestras para el Análisis de Composición Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 9/28/2005 Reporte técnico NREL/TP-510-42620 enero de 2008 Determinación del Total de Sólidos en la Biomasa y Sólidos Totales Disueltos en Muestras Líquidas del Proceso Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 3/31/2008 Reporte téenico NREL/TP-510-42621 revisado en marzo de 2008 Determinación de Cenizas en la Biomasa Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 7/17/2005 Reporte técnico NREL/TP-510-42622 enero de 2008 Determinación de Azúcares, Subproductos y Productos de Degradación en Muestras de Fracción Líquidas del Proceso Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 12/08/2006 Reporte técnico NREL/TP-510-42623 enero de 2008 Determinación de Solidos Insolubles en Material de Biomasa Pretratado Fecha de expedición del procedimiento analítico de laboratorio (LAP): 03/21/2008 NREL/TP-510-42627 marzo de 2008

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso que produce al menos una primera enzima a partir de una célula huésped, en donde la primera enzima tiene la capacidad de hidrolizar una primera biomasa ligno-celulósica pretratada, comprendiendo dicho proceso la etapa de cultivar la célula huésped para producir al menos la primera enzima durante un tiempo de cultivo, en donde el cultivo de la célula huésped se presenta en un ambiente de cultivo desprovisto de azúcar que comprende la célula huésped, agua y una composición sólida, comprendiendo dicha composición sólida un azúcar complejo de la composición sólida y una lignina de la composición sólida, en donde a) la composición sólida se obtiene de una segunda biomasa ligno-celulósica pretratada, que comprende un azúcar complejo de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada y una lignina de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada; y b) la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos a la cantidad total de la lignina en la composición sólida es menor que la proporción de la cantidad total de los azúcares complejos a la cantidad total de la lignina en la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada.
2. El proceso de la reivindicación 1, en donde el cultivo se realiza bajo condiciones bajas en azúcares simples teniendo una cantidad de azúcar simple o azúcares simples agregada en el rango de entre 0 y 10% por peso del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar sobre una base seca durante una porción del tiempo de cultivo que es al menos el 50% del tiempo de cultivo.
3. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la composición sólida se obtiene de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada mediante un proceso que comprende las etapas de: a) hidrolizar al menos una fracción de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada en presencia de un catalizador de hidrólisis, para producir una composición hidrolizada que comprende la composición sólida y una solución de agua y azúcares solubles, y; b) retirar al menos el 50% de la solución de agua y azúcares solubles de la composición hidrolizada.
4. El proceso de la reivindicación 3, en donde el retiro de la solución de agua y azúcares solubles se realiza al menos mediante un método comprendido del grupo que consiste de decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, filtración por presión y lavado.
5. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la composición sólida se obtiene de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada mediante un proceso que comprende las etapas de: a) hidrolizar al menos una fracción de la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada en presencia de un catalizador de hidrólisis, para producir una composición hidrolizada que comprende azúcares complejos y lignina y la solución de agua y azúcares solubles; b) convertir al menos una fracción de los azúcares solubles en la composición hidrolizada para producir una composición convertida que comprende al menos un producto derivado del azúcar y la composición sólida; c) retirar una fracción del al menos un producto derivado del azúcar.
6. El proceso de la reivindicación 5, en donde el retiro de la fracción del al menos un producto derivado del azúcar se realiza al menos mediante un método seleccionado del grupo que consiste de decantación, sedimentación, centrifugación, filtración, filtración por presión, lavado, evaporación y destilación.
7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el catalizador de hidrólisis comprende una segunda enzima o mezcla de enzimas.
8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el catalizador de hidrólisis se selecciona del grupo que consiste de iones de hidrógeno, ácidos orgánicos y ácidos inorgánicos.
9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la conversión de la composición hidrolizada comprende una fermentación.
10. El proceso de la reivindicación 9, en donde el al menos un producto derivado del azúcar comprende etanol.
11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la porción del tiempo de cultivo bajo condiciones bajas en azúcares simples se selecciona del grupo que consiste de al menos 75% del tiempo de cultivo, al menos 85% del tiempo de cultivo, al menos 90% del tiempo de cultivo, al menos 95% del tiempo de cultivo, y al menos 98% del tiempo de cultivo.
12. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la porción del tiempo de cultivo bajo condiciones de agotamiento de azúcar es igual al tiempo de cultivo.
13. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde la cantidad de azúcar o azúcares simples agregada se encuentra en el rango de entre 0 y 5%, de 0 a 2.5%, de 0 a 2.0%, de 0 a 1.0% por peso del ambiente de cultivo desprovisto de azúcar sobre una base seca.
14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde no existe azúcar simple agregada en el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar.
15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde al menos la primera enzima se cosecha separando el ambiente de cultivo desprovisto de azúcar en al menos una composición cosechada, que comprende al menos una fracción de la cantidad de la primera enzima, y una composición agotada, que comprende al menos una fracción de una cantidad del residuo sólido de la composición sólida.
16. El proceso de la reivindicación 15, en donde la cantidad total de azúcares complejos en la composición agotada se encuentra presente en un rango seleccionado del grupo que consiste de 0 a 30%, de 0 a 20%, de 0 a 15%, de 0 a 10%, de 0 a 7.5%, de 0 a 5%, de 0 a 2.5% por peso sobre una base seca.
17. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la primera enzima se utiliza además para hidrolizar la primera biomasa ligno-celulósica y la primera biomasa ligno-celulósica y la segunda biomasa ligno-celulósica pretratada comprenden ambas la biomasa ligno-celulósica derivada del grupo que consiste de el mismo género de pastos y la misma especie de pastos.
18. Una enzima o mezcla de enzimas obtenible mediante cualquiera de los procesos de las reivindicaciones 1 a 17.
19. Una biomasa ligno-celulósica hidrolizada que se ha hidrolizado mediante la mezcla de enzimas de la reivindicación 18.
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