CN104640995A - 用于木质纤维素类生物质的酶的生产 - Google Patents

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Abstract

一种从宿主细胞产生至少第一酶的工艺，其中所述第一酶能水解第一经预处理的木质纤维素类生物质。所述工艺含培养所述宿主细胞一段培养时间以产生至少所述第一酶的步骤，其中所述宿主细胞的培养发生在含宿主细胞、水和固体组合物的糖耗尽的培养环境中，所述固体组合物包含所述固体组合物的复合糖和所述固体组合物的木质素。在该工艺中，所述固体组合物由第二经预处理的木质纤维素类生物质获得，所述第二经预处理的木质纤维素类生物质包含所述第二经预处理的木质纤维素类生物质的复合糖和所述第二经预处理的木质纤维素类生物质的木质素；且所述固体组合物的复合糖的总量与所述固体组合物的木质素的总量的比值大于0且小于所述第二经预处理的木质纤维素类生物质的复合糖的总量与所述第二经预处理的木质纤维素类生物质的木质素的总量的比值。

Description

用于木质纤维素类生物质的酶的生产
技术背景
酶是催化生化反应的蛋白质。酶由几乎所有的活的宿主细胞产生。由真菌类微生物产生的一些酶在木质纤维素原料转化为化学品的过程中是有用的。在这些转化过程中，酶用作复合糖，如纤维素或半纤维素，水解反应转化为低分子量糖类的催化剂。
已知来自木质纤维素原料的纤维素和半纤维素的水解要求均衡的酶的混合物，所述酶的混合物由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和作用于木聚糖和甘露聚糖的侧链的各种酶组成。酶的生产是在生物质转化为乙醇过程中的一个重要步骤，因为酶和酶的混合物的生产和应用是目前用于木质纤维素类生物质利用的生物基础的路线中较昂贵的工艺步骤之一。
植物降解真菌里氏木霉的酶系统是最广泛研究的并被认为是最广泛的用于获得商业酶混合物的有机体。里氏木霉产生大量的纤维素和半纤维素降解酶，即使细胞外的β-葡糖苷酶分泌物较低。众所周知，为得到高的纤维素转化，β-葡糖苷酶的活性含量是关键的，里氏木霉酶溶液通常用β-葡糖苷酶增补以得到均衡的酶溶液并进一步推进纤维素的水解。在其它情况下，使用由其它良好的产生β-葡糖苷酶的真菌产生的酶也可得到商业的酶或酶混合物溶液。
通过在含纯纤维素和/或甚至更昂贵的碳源的复合培养基上培养宿主细胞产生用于木质纤维素原料转化过程的酶。
为减少酶产生的最终成本，已进行多种尝试使用比纯纤维素便宜的基质。经预处理的木质纤维素原料已被用于基质。许多研究组曾尝试使用在某些方式中用于生物乙醇生产的相同的原料产生酶或酶混合物以降低最终酶混合物成本。
然而，对于里氏木霉Rut C30或巴西青霉(Penicillium brasilianum)的先前的研究中没有报道用于培养的基质和所产生的酶在特定的基质上的水解性能之间的明确关系。在不同碳源的酶的培养中得到的结果的综述可发现于Juhasz,T.,Szengyel,Z.,Reczey,K.,Siika-Aho,M.,Viikari,L."Characterization of enzyme orenzyme mixtures and hemienzyme or enzyme mixtures produced by Trichodermareesei on various carbon sources",(Process Biochem,40,3519-3525)和Jorgensen,H.,Olsson,L.,"Production of enzyme or enzyme mixtures by Penicillium brasilianumIBT 20888:Effect of substrate on hydrolytic performance"(Enzyme Microb Technol,38,381-390).WO 2007005918中描述了一种这样的工艺。该工艺增加了经预处理的木质纤维素基质作为酶生长的诱导物，同时使用恒定添加量的葡萄糖作为有机体生长的养料(feed)的描述。该技术所陈述的目的是用可作为主要碳源或酶生产诱导物的材料代替葡萄糖养料和目前用于在宿主细胞中酶或酶混合物生产的纯纤维素。该技术的优势是由于使用容易得到的并因此比纯的纤维素便宜的诱导物(木质纤维素类生物质)而降低生产成本。作为诱导物，WO 2007005918使用少量的生物质并连续加入葡萄糖以供养所述有机体。
US7,494,792公开了一种用于生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的工艺，所述工艺使用来自纤维素或木质纤维素类生物质的酶水解产物的乙醇发酵的残留物。所述工艺可集成为从纤维素或木质纤维素类生物质生产乙醇的过程，其中所述残留物用于产生在预处理的基质的酶水解中使用的酶。将由来自水解作用的乙醇生产得到的糖溶液从未水解的基本上由木质素组成的固体部分中分离，并用于乙醇发酵。葡萄糖是在该步骤中提取的主要的糖。在分离所述乙醇后，来自乙醇发酵的残留物用作用于酶产生的诱导碳的源或主要的碳源。
作为一般考虑，有将经预处理的木质纤维素原料的全部或最相关部分转化为有价值的产品的兴趣。使用部分经预处理的木质纤维素原料作为用于酶生产的基质可降低用于将木质纤维素原料转化为有用产品的转化过程的设备的产率。
因此，需要开发更好使用木质纤维素预处理原料的用于生产酶的工艺。
发明内容
本说明书中公开的是从宿主细胞生产用于水解第一经预处理的木质纤维素类生物质的至少一种酶的工艺，所述工艺包含在糖耗尽的培养环境中培养能产生所述至少一种酶的宿主细胞的步骤，所述糖耗尽的培养环境包含所述宿主细胞、水和固体组合物，所述固体组合物进一步包含所述固体组合物的复合糖(complexsugar)和所述固体组合物的木质素。所述固体组合物从第二经预处理的木质纤维素类生物质中得到，所述第二经预处理的木质纤维素类生物质包含第二经预处理的木质纤维素类生物质的复合糖和第二经预处理的木质纤维素类生物质的木质素，且所述固体组合物中所述复合糖的总量和所述木质素的总量的比值小于所述第二经预处理的木质纤维素类生物质中所述复合糖的总量和所述木质素的总量的比值。培养后，所述固体组合物转化为固体残留物。
也公开了可在单糖(simple sugar)耗尽的条件下实施所述培养以部分培养时间，所述单糖耗尽的条件具有以干态计所述糖耗尽的培养环境的0-10wt％的量的添加的单糖或糖类，所述部分培养时间为至少50％的培养时间。
进一步公开了所述固体组合物可通过包含以下步骤的过程从第二经预处理的木质纤维素类生物质中得到：在水解催化剂存在下水解至少部分第二经预处理的木质纤维素类生物质，以产生含所述固体组合物和水及水溶性糖的溶液的经水解的组合物；并从所述经水解的组合物中去除至少50％的水及水溶性糖的溶液。
也公开了可通过至少一种包含在倾析、沉降、离心、过滤、压滤和洗涤的组中的方法实施部分所述经水解的组合物的去除。
进一步公开了所述固体组合物可通过包含以下步骤的过程由第二经预处理的木质纤维素类生物质中得到：在水解催化剂存在下水解至少部分第二经预处理的木质纤维素类生物质，以产生含复合糖和木质素的水溶性糖类的经水解的组合物；转化所述经水解的组合物中的至少部分水溶性糖以产生含至少一种糖衍生产物的经转化的组合物，和所述固体组合物；并去除部分所述经转化的组合物，该部分包含至少部分所述至少一种糖衍生产物。
也公开了可通过包含在倾析、沉降、离心、过滤、压滤、洗涤、蒸发和蒸馏的组中的至少一种方法实施去除部分所述经转化的组合物。
进一步公开了所述水解催化剂可包含第二酶或酶混合物，且其可选自由氢离子、有机酸和无机酸组成的组。
也公开了所述经水解的组合物的转化可包括发酵。
进一步公开了所述至少一种糖衍生产物可包括乙醇。
进一步公开了在单糖耗尽的条件下所述部分培养时间可选自由至少75％的培养时间、至少85％的培养时间、至少90％的培养时间、至少95％的培养时间、至少98％的培养时间组成的组。
进一步公开了在单糖耗尽的条件下所述部分培养时间可与所述培养时间相同。
进一步公开了添加的单糖或糖类的量以干态计在培养环境的0-5wt％、0-2.5wt％、0-2.0wt％、0–1.0wt％的范围内。也公开了可在糖耗尽的培养环境中不添加单糖。
进一步公开了至少第一酶可通过将所述糖耗尽的培养环境分离为含至少部分量的第一酶的至少一种收获的组合物和含至少部分量的所述固体组合物的固体残留物的耗尽的组合物而得到。
也公开了所述酶或酶混合物可进一步用于水解所述第一木质纤维素类生物质，且所述第一木质纤维素类生物质和所述第二经预处理的木质纤维素类生物质均包含来源于由相同禾本植物属(grass genus)或更优选地相同禾本植物物种(grass species)组成的组的木质纤维素类生物质。
也公开了根据公开的工艺产生的酶或酶混合物和已被所述酶混合物水解的经水解的木质纤维素类生物质。
进一步公开了在耗尽的组合物中复合糖的总量以干态计可以选自由0-30wt％、0-20wt％、0-15wt％、0-10wt％、0-7.5wt％、0-5wt％、0-2.5wt％组成的组的范围存在。
附图说明
图1a是示出根据对比实施例和操作实施例的葡萄糖水解产率的图。
图1b是示出根据对比实施例和操作实施例的木糖水解产率的图。
具体实施方式
已发现用于生产酶的工艺，特征在于，产生所述酶的宿主细胞在糖耗尽的培养环境中培养的事实。所述糖耗尽的培养环境包含所述宿主细胞、水和由经预处理的木质纤维素类生物质制得的固体组合物；所述固体组合物包含复合糖和木质素，且其特征在于，所述复合糖的总量和所述木质素的总量的比值小于其来源的第二预处理木质纤维素类生物质中的所述复合糖的总量和所述木质素的总量的比值。换句话说，通过去除部分但不是全部的含在所述经预处理的木质纤维素类生物质中的所述复合糖，从经预处理的木质纤维素中得到所述糖耗尽的培养环境中的所述固体组合物。所述糖耗尽的培养环境中的所述固体组合物以干态计具有相对于所述经预处理的木质纤维素类生物质较低量的复合糖，但仍然包含复合糖。
已从所述经预处理的木质纤维素类生物质中去除的糖可转化为有用的化学品，例如乙醇。
然后由宿主细胞产生的酶可用于木质纤维素类生物质和经预处理的木质纤维素类生物质的水解。纤维素、半纤维素和木质素是三种主要的构成木质纤维素类生物质的聚合物。纤维素和半纤维素为聚合糖。
在本发明的语境中，单糖为单体糖，且可选自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和果糖组成的组。应该注意的是，可有其它的单糖不在前述的列表中。单糖属于水溶性糖的组。可溶性糖为当存在特定溶剂时，例如水，在所述溶剂中形成均相溶液的糖。
单糖可直接供养宿主细胞，即所述宿主细胞不需要使用酶以代谢单糖。
低聚糖是水溶性的聚合糖。低聚糖由不止一个单体糖组成。低聚糖可仅在一种或多种通常由宿主细胞产生的酶存在时由宿主细胞代谢。
复合糖为不溶于水的聚合糖，例如水不溶性的葡聚糖和木聚糖。葡聚糖为一类包含具有不同聚合度的葡萄糖聚合物分子的复合糖。木聚糖为一类包含具有不同聚合度的木糖聚合物分子的复合糖。
许多木质纤维素类生物质至化学产品的转化过程仅转化部分复合糖，并产生主要含木质素和作为副产物的未转化的复合糖的剩余部分的组合物。在一些情况下，即使能够进一步转化所述经预处理的木质纤维素类生物质中的复合糖，仍停止所述转化过程，因为这在经济上是不适当的。仍然含剩余部分的复合糖的所述组合物经常被燃烧以产生热量，这是木质纤维素类生物质中包含的糖的低价值的应用。
本发明人已惊奇地发现宿主细胞可在糖耗尽的培养环境中培养，所述糖耗尽的培养环境包含通过从经预处理的木质纤维素类生物质中去除至少部分复合糖得到的固体组合物，且所述宿主细胞可利用剩余部分的复合糖作为碳源。本发明人也已发现，相对于使用更昂贵的基质作为碳源获得的酶生产，从所述宿主细胞中生产的酶可与之相当或比之增加。
用于传统地供养宿主细胞的单糖如葡萄糖和木糖可被比较便宜的所述固体组合物部分或全部取代。
优选地，所述糖耗尽的培养环境不含或几乎不含单糖。
本领域中已知的和有待发明的任何方法或方法的组合可用于从第二经预处理的木质纤维素类生物质中得到所述固体组合物。所述方法可涉及化学、物理、生物过程或过程组合的使用。
优选地，复合糖从所述经预处理的木质纤维素类生物质中去除且转化为糖衍生的产品，其是有价值的化学产品。可在单个步骤中或多个步骤中实现所述转化过程，即可通过将去除的复合糖转化为中间产物得到所述糖衍生的产品。
在一个优选的实施方案中，可通过水解所述经预处理的木质纤维素类生物质中的至少部分复合糖得到所述固体组合物。
水解是将复合糖转化为水溶性糖和将低聚糖转化为较低分子量糖的过程。
在有助于水解有效发生的或水解有效发生必需的水解催化剂和最终其它添加剂存在时实施所述经预处理的生物质的水解。在本发明的语境中，所述水解催化剂和所述添加剂可被称为“水解催化剂组合物”。
在一个优选的实施方案中，所述水解催化剂组合物包含酶或酶混合物且所述水解为酶法水解。
在另一个优选的实施方案中，根据WO2010113130公开的过程实施所述酶法水解，其教导全部并入本文。
在另一个实施方案中，所述水解催化剂可包含酸且所述水解为加酸水解。可使用能实施所述第二经预处理的木质纤维素类生物质水解的所有有机和无机酸。酸也可存在于稀释的溶液中。氢离子也可用于水解过程中。
所述经预处理的木质纤维素类生物质的水解可发生在液体环境中。可通过将一些液体，优选为水或含水的液体，加入到所述经预处理的木质纤维素类生物质中得到所述液体环境。也可在木质纤维素类生物质预处理中添加液体。例如，在一个优选的实施方案中，通过在含水的液体中浸泡木质纤维素类生物质然后蒸汽爆破经浸泡的木质纤维素类生物质来预处理所述木质纤维素类生物质。液体也可在水解步骤中添加或添加至所述水解催化剂组合物中。在酶法水解的情况下，液体可存在于酶混合物中。在加酸水解的情况下，液体可存在于稀释的酸溶液中。
由于所述经预处理的木质纤维素类生物质的水解发生在液体环境优选含水的液体环境中，从所述木质纤维素类生物质得到的经水解的组合物将包含水和水溶性糖的溶液，和含未被水解为水溶性糖的复合糖的固体组合物。经水解的组合物中的固体组合物也包含所述经预处理的木质纤维素类生物质中含有的木质素。由于预处理和水解过程的影响，所述木质素也可能已被修饰和/或部分转化为其它成分。
即使所述经水解的组合物可包括其它成分，对于本发明的范围，所述经水解的组合物至少包含水和水溶性糖的溶液和进一步包含复合糖的固体组合物和所述固体组合物的木质素。
可通过从所述经水解的组合物中去除至少50％的水和水溶性糖的溶液得到所述固体组合物。请注意，当尽可能去除最大量的水和水溶性糖的溶液为优选的实施方案时，一些水溶性糖仍可能存在于所述固体组合物中。在另一个实施方案中，所述固体组合物不包含水溶性糖。
从所述经水解的组合物中去除的部分，包含水和水溶性糖，可进一步包含所述经水解的组合物的其它成分，例如至少部分所述水解催化剂和添加剂或在预处理或水解过程中形成的化合物。所述去除的部分可进一步包含含木质素和复合糖的部分固体组合物。在一个优选的实施方案中，所述糖耗尽的环境基本上包含经水解的组合物中的所有固体组合物且基本上所有水和水溶性糖的溶液被去除。
在另一个实施方案中，所述糖耗尽的环境包含经水解的组合物中的所有固体组合物且所有水和单糖的溶液被去除。
本领域中已知的和仍然有待发明的任何方法和方法组合可被用于从所述经水解的组合物中去除至少50％的水和水溶性糖的溶液。这些方法包含所述经水解的组合物的化学和物理处理。可连续地或同时实施所述化学和物理处理。
用于去除至少部分所述经水解的组合物的优选方法包含倾析、沉降、离心、过滤(包括膜滤和压滤)，和洗涤。
至少部分所述经预处理的木质纤维素类生物质的水解和至少50％的水和水溶性糖的溶液的去除可连续发生或至少部分同时发生。在一个实施方案中，当水解作用进行时，可去除至少部分的单糖，例如通过膜滤。
在加入用于生产酶的宿主细胞的糖耗尽的培养环境中前，所述固体组合物可被进一步处理。所述固体组合物也可被洗涤，优选使用水，以进一步去除水溶性糖或可影响或降低所述酶生产的其它成分。培养宿主细胞需要的其它成分可被添加至所述固体组合物中或添加至所述糖耗尽的培养环境中。
从所述经水解的组合物中去除的所述水和水溶性糖的部分溶液可转化为有用的化学产品。
在另一个优选的实施方案中，可通过在水解催化剂存在时水解经预处理的木质纤维素类生物质中的至少部分复合糖得到所述固体组合物，以产生含复合糖和木质素和水和水溶性糖的溶液的经水解的组合物；然后，将所述经水解的组合物中的至少部分水溶性糖转化为含至少一种糖衍生产物的经转化的组合物和含复合糖和木质素的固体组合物；并从所述经转化的组合物中去除至少部分所述糖衍生产物。
对在本说明书中先前陈述的水解的所有注意事项也可用在该实施方案中。所述经水解的组合物可在本发明的范围内进行进一步的加工。例如，所述工艺可提升水溶性糖至产品的转化并可包括物理和化学处理，例如，分离、纯化、pH校正、稀释和浓缩。经水解的组合物中的水溶性糖部分或全部转化为经转化的组合物，所述经转化的组合物包含至少一种糖衍生产物。在单糖转化的过程中也可发生所述经水解的组合物的其它任何成分的转化或修饰。特别地，所述经水解的组合物中的复合糖和木质素可受转化过程的影响以产生含复合糖和木质素的固体组合物；用另一种方式陈述，所述固体组合物可为所述经水解的组合物中的复合糖和木质素或所述经水解的组合物中的复合糖和木质素的修饰物。所述经转化的组合物可进一步包含不止一种来源于水溶性糖的产物。
所述水溶性糖的转化可在存在催化剂时发生。所述催化剂可最终包含有助于有效发生转化的或有效发生转化必需的其它添加剂。在本发明的语境中，所述催化剂和所述添加剂可被称为“催化剂组合物”。
所述催化剂可为促进水溶性糖转化为至少一种糖衍生产物的任何试剂。所述催化剂可为无机的、有机的或生物试剂。
虽然可使用任何工艺转化至少部分所述经水解的组合物，然而发酵是优选的工艺且所述糖衍生产物为发酵产物。发酵是在微生物或微生物混合物存在时将单糖转化为发酵产物的任何工艺。
用于转化至少部分所述经水解的组合物的优选微生物为酵母菌。
酵母菌通常指主要为单细胞的子囊菌，其通常几乎没有或没有菌丝体，其通常通过通常保持依附的子细胞的发芽进行无性繁殖且能够将糖类发酵为醇和二氧化碳。优选地，所述酵母菌属于酵母属类。酵母属的物种如由Kurtzman(2003)FEMS Yeast Research 3:417-432演化史上定义的，且包括啤酒酵母(S.cerevisiae)、奇异酵母(S.paradoxus)、S.ikatae、S.cariocanus、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、巴斯德酵母(S.pastorianus)和贝酵母(S.bayanus)。
根据所述催化剂或微生物，可产生不同的糖衍生产物。虽然可产生任何其它糖衍生产物，然而在一个优选的实施方案中所述糖衍生产物为乙醇。
复合糖水解为经水解的组合物的水解和所述经水解的组合物中的至少部分水溶性糖转化为至少一种糖衍生物的转化可连续或同时发生。在一个优选的实施方案中，同时发生酶法水解和发酵为乙醇且所述过程在本领域中被称为同步糖化和发酵。
所述经水解的组合物中的至少部分水溶性糖的转化可发生在液体环境中。可通过添加一些液体，优选水或含水的液体，至所述经水解的组合物中得到所述液体环境。液体也可存在于所述经水解的组合物中或所述催化剂组合物中。
由于至少部分水溶性糖的转化发生在液体环境中，优选含水的液体环境中，经转化的组合物将通常包含至少一种糖衍生产物、水和包含复合糖和木质素的固体组合物。由于所述水解和转化过程的影响，在所述经水解的组合物中的木质素和复合糖也可被修饰和/或部分转化为其它成分。所述经转化的组合物中也可包含未被转化为产物的水溶性糖。
对于本发明的范围，所述经转化的组合物包含至少一种糖衍生产物和含复合糖和木质素的固体组合物。所述至少一种糖衍生产物可溶于或不溶于所述经转化的组合物中。在一个优选的实施方案中，所述糖衍生产物可溶于经转化的组合物中。例如，乙醇可溶于经发酵的组合物中。通过移除含至少部分所述糖衍生产物的一部分所述经转化的组合物得到所述固体组合物。值得注意的是，当尽可能移除最大量的糖衍生产物为优选的实施方案时，一些糖衍生产物仍可能存在于所述固体组合物中。在另一个实施方案中，固体组合物不包含糖衍生产物。
从所述经转化的组合物中移除的部分可进一步包含所述经转化的组合物的其它组分，例如未被转化的水溶性糖、水、至少部分所述催化剂和添加剂。也可进一步包含含所述经转化的组合物的木质素和复合糖的部分固体组合物。在一个优选的实施方案中，所述糖耗尽的环境基本上包括所述经转化的组合物中的所有固体组合物且从所述经转化的组合物中移除的部分基本上包括所述经转化的组合物中的所有液体。
在另一个实施方案中，所述糖耗尽的环境包含所述经转化的组合物中的所有固体组合物且从所述经转化的组合物中移除的部分包括所述经转化的组合物中的所有液体。
本领域已知的和将要被发明的任何方法和方法组合可用于移除含至少一种糖衍生产物的部分经转化的组合物。这些方法包含所述经转化的组合物的化学和物理处理。所述化学和物理处理可连续或同时实施。
用于移除至少部分所述经转化的组合物的优选的方法包括倾析、沉淀、离心、过滤(包括膜滤和压滤)、洗涤、蒸发和蒸馏。
在一个优选的实施方案中，所述经转化的产物为乙醇且所述固体组合物通过蒸发或蒸馏乙醇和通过倾析、沉淀、离心、过滤(包括膜滤和压滤)和洗涤中的至少一种方法去除所述经转化的组合物中的大部分液体而从所述经转化的组合物中得到。
所述经水解的组合物中的水溶性糖转化为至少一种糖衍生产物和含至少部分转化产物的经转化的组合物的去除可至少部分同时发生。在一个实施方案中，所述转化产物为乙醇且当所述经水解的组合物中的单糖发酵为乙醇时可被移除，例如通过蒸发或蒸馏。
在另一个实施方案中，所述经预处理的木质纤维素类生物质的水解、至少部分所述水溶性糖的转化和部分所述经转化的组合物的去除至少部分同时发生。在一个优选的实施方案中，所述转化产物为乙醇且在同步糖化和发酵过程中可被移除，例如通过蒸发或蒸馏。
在加入用于生产酶的宿主细胞的糖耗尽的培养环境中之前，所述固体组合物可被进一步处理。所述固体组合物也可被洗涤，优选使用水，以进一步去除水溶性糖或可能影响或降低酶的生产的其它成分。
生产酶的工艺
本领域中众所周知如何在真菌源，例如丝状真菌，或细菌源的宿主细胞中生产酶或酶混合物。本发明的生长工艺可为众所周知的工艺，只是所述养料包含从经预处理的木质纤维素得到的固体组合物，且所述固体组合物中的复合糖的总量低于所述经预处理的木质纤维素类生物质中复合糖的总量。在一个优选的实施方案中，所述单糖的供给限于培养过程中。
酶生产程序为本领域中众所周知的。在本发明的语境中，所述酶或酶混合物优选为通过宿主细胞分泌到培养环境中的细胞外酶或酶混合物。或者，所述酶或酶混合物为细胞内的。
能产生酶或酶混合物的宿主细胞在严格的培养条件下以特定的生长速率生长。当将宿主细胞培养物引入培养环境时，经接种的培养物经过数个阶段。最初细胞不发生生长。该阶段被称为滞后期，也可被称为适应期。在被称为“对数期”的下一阶段中，所述宿主细胞培养物的生长速率逐渐增加。在最大生长速率的时期之后，所述速率停止且所述培养进入稳定期。在经过一段时间后，所述培养进入衰亡期且活细胞的数量下降。在生长期，感兴趣的酶或酶混合物被表达，这种表达取决于感兴趣的酶和宿主细胞。在一个实施方案中，所述酶或酶混合物可在对数期表达。在另一个实施方案中，可在对数期和稳定期之间的过渡期产生所述酶或酶混合物。在另一个实施方案中，也可在稳定期和/或就在孢子形成之前表达所述酶或酶混合物。根据本发明，在不止一个上述阶段内产生所述酶或酶混合物。
换句话说，根据本发明，在合适的环境中和在允许至少一种酶或酶混合物表达，优选地分泌和任选地重新获得的条件下培养所述宿主细胞。当如上所述时，宿主细胞生长具有多个技术阶段，为了本说明书的目的，这些阶段集于术语培养。宿主细胞培养发生在糖耗尽的培养环境中，所述糖耗尽的培养环境包含通过去除至少部分复合糖从经预处理的木质纤维素类生物质得到的固体组合物。所述糖耗尽的培养环境可进一步包含附加的碳源、氮源和微生物新陈代谢所需的附加的盐。
根据一个优选的实施方案，已通过浸泡/洗涤然后蒸汽爆破预处理所述经预处理的木质纤维素类生物质，正如WO 2010113129中所述，其教导通过引用并入本文。
在培养后，可使用本领域中周知的方法任选地重获所述酶或酶混合物。例如，可通过常规程序从糖耗尽的培养环境中重获细胞外酶或酶混合物，所述常规程序包括，但不限于，离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。用于重获细胞内酶或酶混合物的程序也是本领域内周知的。
至少在本发明的语境中，术语“培养”指使用由一种或多种宿主细胞组成的大量培养产生酶或酶混合物的任何过程。本发明对于特别是工业规模的生产是有用的，例如具有至少50升，优选至少5升，更优选至少1升的培养环境。
所述酶或酶混合物可包括，但不限于，任何属于含内切葡聚糖酶(内切-1,4-β-D-葡聚糖酶)、纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶(外切-1,4-β-D-葡聚糖酶)、β-葡糖苷酶(1,4-β-D-葡糖苷酶)、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切-1,4-β-甘露聚糖酶、1,4-β-木糖苷酶和1,4-β-甘露糖苷酶的酶的组或酶混合物的那些。
本发明的工艺可以分批、分批补料、重复分批补料或连续工艺进行。
本发明的工艺可以好氧或厌氧方式实施。一些酶通过浸沉培养(submergedcultivation)产生，一些酶通过表面培养产生。根据本发明优选浸沉培养。
因此，根据一个方面，本发明涉及在宿主细胞中产生酶或酶混合物的工艺，所述工艺包括在有助于生产酶或酶混合物，例如酶或酶混合物，的条件下培养能产生酶或酶混合物的所述宿主细胞，其中从经预处理的木质纤维素类生物质得到的固体组合物用于在单糖耗尽的条件下使所述宿主细胞生长部分培养时间，所述单糖耗尽的条件添加的单糖或糖类的量以干态计在所述糖耗尽的培养环境的0-10wt％的范围内，所述部分培养时间为培养时间的至少50％。
所述培养时间为从将宿主细胞预培养体积添加至所述糖耗尽的培养环境中直至从所述糖耗尽的培养环境中收获、移除或分离所述酶或酶混合物所测定的时间量。在多步移除的情况下，所述培养时间结束于最后一次移除所述第一酶或酶混合物的时间。
从经预处理的木质纤维素类生物质得到的存在于糖耗尽的培养环境中的固体组合物的量应足够宿主细胞生长以产生所述酶或酶混合物。
习语单糖耗尽的条件通常指多于50wt％的宿主细胞养料来自从第二经预处理的木质纤维素类生物质得到的固体组合物且不来自添加的单糖。一个示例性的单糖耗尽的条件是当添加至所述工艺的可选单糖的量(如果有添加的话)以干态计为所述糖耗尽的培养环境的0-10wt％时。更优选地，添加的可选单糖的量以干态计为所述糖耗尽的培养环境的0-5wt％，甚至更优选为0-2.5wt％，最优选0-2wt％(如果添加有单糖)。在最好的情况下，无单糖的添加，这是完美的单糖耗尽的条件。此外，短语单糖添加指可添加一种或多种单糖。在一个实施方案中，所述可选的单糖存在，但低于指示的百分率。
所述单糖耗尽的条件应保持至少部分培养时间。定量地表示，所述单糖耗尽的条件应保持至少50％的培养时间，更优选75％，甚至更优选85％，还甚至更优选95％，最优选99％和100％的培养时间。100％的培养时间是当所述至少部分培养时间等于所述培养时间时。
基质
通常用作酶或酶混合物生产的养料的碳源基质包括葡萄糖或相似的糖，假设它们的消耗相对于所述复合糖的消耗在指定的范围内。可添加氮源基质、生长刺激物等以增进培养和酶或酶混合物的生产。氮源包括尿素、氨盐(例如NH4Cl或NH4SO4)和肽类。蛋白酶也可用于，例如，消化蛋白质以产生游离氨基氮(FAN)。这样的游离氨基酸可作为宿主细胞的营养物，从而增强生长和酶或酶混合物的生产。优选的用于生长的培养刺激物包括维生素和矿物。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、维生素B6、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D、E。矿物的实例包括能提供包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu的营养物的矿物或矿物盐类。
用从经预处理的木质纤维素类生物质得到的固体组合物代替通常在酶或酶混合物生产工艺中用作诱导物(和碳源)的纯纤维素；如果是酸预处理的，优选给所述组合物去毒，例如通过洗涤。
所述固体组合物为碳源且可与碳源一起被添加至所述糖耗尽的培养环境中，但也可与碳源分开添加。根据本发明，所述固体组合物可在宿主细胞培养物接种前、与接种同时或在接种后添加至所述糖耗尽的培养环境中，添加的量至少相当于所述宿主细胞生长所需的有效的复合糖的量。当在培养时间内添加所述固体组合物时，重新计算添加的任选的单糖的量或任选的单糖与木质纤维素类生物质的比例。当在培养时间的初始部分单糖的量可能没有足够低时，通过添加所述固体组合物至所述糖耗尽的培养环境中，在至少所述培养时间的剩余时间内，添加的任选的单糖的量将落入指定的范围内。
根据本发明，本领域技术人员可容易地确定何时添加所述固体组合物和所述固体组合物的量。在培养的时间跨度内，所述固体组合物通常被宿主细胞消耗并保持在先前指定的范围内。
如上所述，以与在周知的酶或酶混合物生产工艺中使用葡萄糖的相同的方式使用所述固体组合物。
酶收获
在公开的工艺中，所述固体组合物在酶生产工艺中用于供养宿主细胞。所述固体组合物从经预处理的木质纤维素得到，所述固体组合物包含复合糖和木质素。当由固体组合物中的复合糖供养宿主细胞时，由所述糖耗尽的培养环境中的至少部分所述固体组合物形成所述固体组合物的固体残留物。所述固体残留物包含所述固体组合物中的至少部分木质素且可包含所述固体组合物中的部分复合糖。所述木质素可在宿主细胞的培养步骤中进行修饰。
通过在糖耗尽的培养环境中培养所述宿主细胞产生的酶可通过将所述糖耗尽的培养环境分离为至少两部分得到，所述两部分为含至少部分酶的收获的组合物和含所述固体组合物的至少部分固体残留物的耗尽的组合物。所述固体残留物可包含大多数的宿主细胞。
“至少两部分”指所述糖耗尽的培养环境可被分为多于两个的部分，该实施方案在本发明的范围内。
所述收获的组合物可进一步包含所述糖耗尽的培养环境的其它成分，例如水和含在所述固体组合物中的添加剂和/或糖耗尽的培养环境的添加剂和/或在宿主细胞培养中添加的添加剂。其可进一步包含一些所述固体组合物和一些所述固体残留物。在一个优选的实施方案中，所述收获的组合物不含或含极少的固体化合物。在另一个优选的实施方案中，所述收获的组合物含所有的或几乎所有的产生的酶。
所述耗尽的组合物包含所述固体组合物的至少部分固体残留物且可进一步包含所述糖耗尽的培养环境的其它成分，例如水和含在所述糖耗尽的培养环境的添加剂和/或在宿主细胞培养步骤中添加的添加剂。其可进一步包含一些酶。在一个优选的实施方案中，所述耗尽的组合物不含或含极少的酶。在另一个优选的实施方案中，所述耗尽的组合物含所有或几乎所有的所述固体组合物的固体残留物。
本领域已知的和仍在发明的任何方法和方法的组合可用于将所述糖耗尽的培养环境分离为至少所述收获的组合物和所述耗尽的组合物。这些方法包括所述经水解的组合物的化学和物理处理。可连续或同时实施所述化学和物理处理。
用于将所述糖耗尽的培养环境分离为至少所述收获的组合物和所述耗尽的组合物的方法包括离心、过滤、透析、洗涤和压滤中的至少一种方法。
所述收获的组合物和所述耗尽的组合物可在本发明的范围内经受任何进一步工艺，例如，分离、纯化、pH校正、稀释、浓缩。
木质纤维素类生物质
一般来说，天然的或天然存在的木质纤维素类生物质可描述如下。
除了淀粉，植物生物质中三种主要的成分是纤维素、半纤维素和木质素，这些被称为通用术语木质纤维素。作为通用术语的含多糖生物质包括淀粉和木质纤维素类生物质二者。因此，原料的一些类型可为植物生物质、含多糖的生物质和木质纤维素类生物质。
根据本发明，含多糖的生物质包括含例如以淀粉和精制淀粉、纤维素和半纤维素的形式的聚合糖的任何材料。
用于衍生本发明的天然存在的生物质的相关类型可包括源自农作物的生物质，所述生物质选自由含淀粉的谷物，精制淀粉；玉米秸，甘蔗渣，稻草例如来自水稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、油菜、高粱；软木材例如樟子松、辐射松；硬木材例如柳属类、桉属类；块茎如甜菜、马铃薯；来自例如水稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、油菜、高粱和玉米的禾谷类；废纸，来自沼气加工、粪肥、油棕加工的残留物城市固体废弃物等的纤维部分组成的组。虽然实验限于上面列举的几个实施例，然而仍然认为本发明适用于所有，因为所述特征主要是木质素和表面积的独特特征。
用于衍生所述组合物的木质纤维素类生物质原料优选来自通常称为禾本植物(grasses)的科。专有名称是开花植物中百合纲(单子叶植物)中被称为禾本科(Poaceae)或禾本科(Gramineae)的科。该科的植物通常被称为禾本植物，或者，为了将它们与其他禾草类(graminoids)区分开，称为真禾本植物(truegrasses)。也包括竹子。约有600个属和约9,000-10,000或更多种类的禾本植物(世界草类丘园索引(Kew Index of World Grass Species))。
禾本科(Poaceae)包括在世界各地种植的主食类谷物和禾谷类作物、草坪草和饲草，和竹子。禾本科通常具有称为杆(culm)的中空茎，其以一定的间隔被堵塞(实心)处称为节(node)，在沿着杆的节点处长出叶片。禾本植物的叶子通常是互生的(alternate)、二列的(在一个平面上)或很少为螺旋的，和平行脉的。每片叶子分化成环绕该茎持续一段距离的下部叶鞘和边缘通常完整的叶片。许多禾本植物的叶片被二氧化硅植物岩(silica phytoliths)硬化，这有助于阻止食草动物。在一些禾本植物(如剑状叶草)中，这使得禾本植物叶片的边缘足够锐利以割伤人类皮肤。被称作叶舌的膜状的附属物或毛状物的边缘(fringe ofhairs)，位于叶鞘和叶片的连接处，以阻止水或昆虫深入到所述叶鞘中。
禾本科叶片在叶片的基部长出，并不是从细长的茎尖生长。这种低生长点是为适应食草动物而进化的，并使得禾本植物能够被定期啃食或割除而不会对植物造成严重损害。
禾本科的花的特征为按照小穗状花序排布，每个小穗具有一个或多个小花(这些小穗状花序进一步分为圆锥花序或穗状花序)。小穗由基部的两个(或有时更少)苞叶(bract)构成，所述苞叶称为颖片(glume)，其紧接着是一个或多个小花。小花由称为外稃(lemma)(外部的)和内稃(palea)(内部)的两个苞叶包围的花构成。这些花通常是雌雄同体的(hermaphroditic)(玉蜀黍，雌雄同株(monoecious)，是一个例外)而授粉几乎都是风媒授粉。花被(perianth)减少到两个鳞苞，称为浆片，其通过扩张和收缩传播外稃和内稃；这些一般被解释为变形萼片。
禾本科的果实是颖果，其中种皮融合到果皮中并因此不与其分离(如玉蜀黍粒中的那样)。
存在禾本植物中的生长习性有三个一般的分类：丛生型(bunch-tupe)(也称作簇生的(caespitose))、匍匐茎型(stoloniferous)和根茎型(rhizomatous)。
所述禾本植物的演替(success)部分在于其形态和生长过程，并且部分在于它们的生理多样性。大部分禾本植物分为两种生理类群，采用C3和C4光合作用途径进行碳固定。所述C4禾本植物具有与专门的克兰兹叶解剖学(Kranz leafanatomy)关联的光合途径，使它们特别适应炎热的气候和低二氧化碳的气氛。
C3禾本植物被称为“冷季禾本植物”而C4禾本植物被称为“暖季禾本植物”。禾本植物可为一年生植物或多年生植物。一年生冷季型的实例为小麦、黑麦、一年生莓系属的牧草(一年生早熟禾属(annual meadowgrass)、早熟禾(Poaannua)和燕麦)。多年生冷季型的例子为果园草(orchard grass)(鸭茅(cocksfoot)，鸭茅草(Dactylis glomerata))、牛毛草(fescue)(羊茅属(Festuca spp))、草地早熟禾(Kentucky Bluegrass)和多年生黑麦草(perennial ryegrass)(黑麦草(Loliumperenne))。一年生暖季型的实例为玉米、苏丹草和狼尾草(pearl millet)。多年生暖季型的实例为大须芒草(big bluestem)、印第安草(indiangrass)、百慕达草(bermudagrass)和柳枝稷(switch grass)。
禾本科植物的一个分类识别出十二个亚科，这些是：1)三芒草亚科(anomochlooideae)，其是包括两个属(三芒草属(Anomochloa),Streptochaeta)的小谱系阔叶禾本植物；2)Pharoideae,一种小谱系的禾本植物，包括三个属，包括毛幢(Pharus)和囊稃竹属(Leptaspis)；3)Puelioideae,包括非洲巨菌草(Puelia)属的小谱系；4)早熟禾亚科(Pooideae)，其包括小麦、大麦、燕麦、雀麦(brome-grass)(Bronnus)和拂子茅(reed-grasses)(拂子茅属(Calamagrostis))；5)竹亚科(Bambusoideae)，其包括竹子；6)稻亚科(Ehrhartoideae)，包括水稻和野生稻；7)芦竹亚科(Arundinoideae)，包括芦竹(giant reed)和芦苇(commonreed)；8)假淡竹叶亚科(Centothecoideae),11个属的小亚科，有时包括于黍亚科(Panicoideae)中；9)虎尾草亚科(Chloridoideae)，包括画眉草(lovegrass)(画眉草属(Eragrostis)，约350种，包括埃塞俄比亚画眉草(teff))、鼠尾粟(dropseed)(鼠尾粟属(Sporobolus)，约160种)、龙爪稷(finger millet)(糁子(Eleusinecoracana(L.)Gaertn.))和乱子草(muhly grass)(乱子草属(Muhlenbergia)，约175种)；10)黍亚科(Panicoideae)，包括黍(panic grass)、玉蜀黍、高粱、甘蔗、大部分稷、福尼奥米(fonio)和须芒草(bluestem grass)；11)小草亚科(Micrairoideae)；12)扁芒草亚科(Danthoniodieae)，包括蒲华草(pampas grass)；它属于早熟禾属(Poa)，大约有500种禾本植物，原产于两个半球的温带气候区。
因可食用种子而种植的农业禾本植物称为禾谷类。常见的三种禾谷类是水稻、小麦和玉蜀黍(玉米)。在所有作物中，有70％是禾本植物。
甘蔗是生产糖的主要来源。禾本植物用于建筑。由竹子制成的脚手架能够经受会破坏钢制脚手架的台风强风吹袭。更大的竹子和芦竹(Arundo donax)具有结实的茎杆，可以以类似于木材的方式使用，且禾本植物的根使草泥墙房屋的草皮稳固。芦竹属(Arundo)用于生产用于木管乐器的簧片，而竹子用于许多器具。
所述木质纤维素类生物质原料也可来自木本植物(woody plant)或木材(wood)。木本植物是使用木材(wood)作为其结构组织的植物。这些通常是多年生植物，其茎杆和较大的根都采用邻近维管组织产生的木材强化。这些植物的主茎杆、较大的枝和根通常覆盖一层增厚的树皮。木本植物通常是乔木、灌木或藤本植物。木质化(wood)是一种结构细胞适应(structural cellular adaptation)，其使木本植物年复一年地由地上生长茎，从而使一些木本植物成为最大和最高的植物。
这些植物需要维管系统从根部到叶(木质部)输送水分和养分，并将糖从叶输送到植物其余部分(韧皮部)。有两种类型的木质部：初级生长期间从原形成层形成的原生木质部和二次生长期间从维管形成层形成的次生木质部。
通常被称为“木材”的是此类植物的次生木质部。
可发现次生木质部的两个主要的组是：
1)针叶树(松柏科(Coniferae))：有约六百种针叶树。所有种类都具有次生木质部，其在整个组群中结构上相对均一。许多针叶树都长成乔木：这些树木的次生木质部作为软木市售。
2)被子植物(被子植物门(Angiospermae))：有约25万到40万种被子植物。在这一组群中次生木质部尚未发现于单子叶植物(例如，禾本科)中。许多非单子叶被子植物成为树，且这些植物的次生木质部作为硬木市售。
术语软木用于描述来自属于裸子植物的树木的木材。所述裸子植物是具有未被包被在子房中的裸子的植物。这些种子“果实”被认为比硬木更原始。软木树通常是常绿的，结球果，并具有针状或磷片状叶。它们包括针叶树种，例如松树、云杉、冷杉和雪松。这些针叶树种的木材硬度各不相同。
术语硬木用于描述来自属于被子植物科的树木的木材。被子植物是具有被包在子房中以进行保护的胚珠的植物。当受精时，这些胚珠发育成种子。所述硬木树通常是阔叶的；在温带和寒带纬度它们大多是落叶性的，但在热带和亚热带地区大多常绿的。这些叶子可以是简单的(单叶片)，或它们可以是复杂的，小叶附着于叶茎。虽然形状可变，但所有的硬木叶子具有独特的细脉网络。所述硬木植物包括，例如山杨、桦树、樱桃树、枫树、橡树和柚木树。
因此，优选的天然存在的木质纤维素类生物质可以选自禾本科和木本科植物(the grasses and woods)组成的组。另一种优选的天然存在的木质纤维素类生物质可以选自由属于针叶树、被子植物、禾本科(Poaceae)和科的植物组成的组。另一种优选的天然存在的木质纤维素类生物质也可以是含至少10％干物质重量，或更优选含至少5％干物质重量的纤维素的生物质。
预处理
根据本发明，木质纤维素类生物质是经预处理的。术语“经预处理的”可被取代为术语“经处理的”。然而，预期的优选的技术为用于木质纤维素类生物质的“预处理”周知的技术，将在下面进一步描述。
可使用本领域中已知的常规方法实施上述处理或预处理，其促进了纤维素的分离和/或释放并增加了从木质纤维素类生物质得到纤维素的可及性。预处理技术是本领域中周知的且包括物理、化学和生物预处理，或其任何组合。在优选的实施方案中，用分批或连续工艺实施所述木质纤维素类生物质的预处理。
物理预处理技术包括各种类型的研磨/粉碎(粒度的下降)、辐射、汽蒸(steaming)/蒸汽(steam)爆破和加氢热解(hydrothermolysis)，在优选的实施方案中，浸泡、从液体中去除固体、蒸汽爆破固体以产生所述经预处理的木素纤维素类生物质。
粉碎包括干、湿和振动球磨。优选地，物理预处理包括使用高压和/或高温(蒸汽爆破)。在本发明的语境中，高压包括3-6MPa范围内的压力，优选3.1MPa。在本发明的语境中，高温包括从约100至300℃范围内的温度，优选从约160至235℃。在一个具体的实施方案中，在约3.1MPa的压力下和约235℃的温度下实施浸渍。在一个优选的实施方案中，根据WO 2010/113129中描述的工艺实施物理预处理，其全部教导通过引用并入本文。
虽然不需要或不优选，化学预处理技术包括酸、稀酸、碱、有机溶剂、石灰、氨、二氧化硫、二氧化碳、控制pH的加氢热解、湿式氧化和溶剂处理。
如果化学处理过程为酸处理过程，更优选连续的稀酸或弱酸处理，如用硫酸，或另一种有机酸，例如醋酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其任何混合物，进行处理。也可使用其它酸。至少在本发明的语境中弱酸处理指处理的pH在1-5范围内，优选1-3。
在一个具体的实施方案中，酸浓度在0.1-2.0wt％酸的范围内，优选硫酸。所述酸与木质纤维素类生物质混合或接触且在约160-220℃的范围内的温度下保持所述混合物从数分钟到数秒钟的时间。具体的预处理条件可如下所示：165-183℃，3-12分钟，0.5-1.4％(w/w)酸浓度，15-25，优选约20％(w/w)总的固体浓度。其它预期的方法在美国专利号4,880,473、5,366,558、5,188,673,5,705,369和6,228,177的专利中描述。
湿法氧化技术包括氧化剂如基于亚硫酸盐的氧化剂等的使用。溶剂处理的实例包括用DMSO(二甲基亚砜)等处理。化学处理过程一般实施约5至约10分钟，但可实施更短或更长的时间。
生物预处理技术包括应用木质素增溶的微生物(参见，例如Hsu,T.-A.,1996,Pre-treatment of biomass,in Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,D.C.,179-212；Ghosh,P.,和Singh,A.,1993,Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbialconversion of ligno-cellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating ligno-cellulosic biomass:a review,in Enzymatic Conversionof Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,eds.,ACS Symposium Series 566,American Chemical Society,Washington,D.C.,chapter 15；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol productionfrom renewable resources,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,ed.,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson,L.,和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentation of ligno-cellulosic hydrolysates forethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander,L.,和Eriksson,K.-E.L.,1990,Production of ethanol from ligno-cellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
在一个实施方案中，实施化学和物理预处理两者，包括，例如，实施弱酸处理和高温高压处理两者。可连续或同时实施所述化学和物理处理。
在一个优选的实施方案中，所述预处理实施如下：在大于1℃下用水浸泡的步骤，从水中去除所述木质纤维素类生物质，接着是蒸汽爆破步骤。
在一个优选的实施方案中，所述经预处理的木质纤维素类生物质由复合糖(也称为葡聚糖和木聚糖(纤维素和半纤维素))和木质素组成。
酶或酶混合物
酶或酶混合物指水解纤维素的酶或能降解木质纤维素类生物质的酶的混合物。根据所描述的工艺产生的酶或酶混合物可为包括细菌或真菌源的任何源。也包括化学改性的或蛋白质工程变体。合适的酶或酶混合物包括来自一般的纤维菌属、芽孢杆菌、假单胞菌、腐质霉属、镰胞菌、梭孢壳属、支顶孢属、金孢子菌属、青霉属、嗜热裂孢菌(Themobifida)和木霉属(Trichoderma)的酶或酶混合物，例如由特异腐质霉、褐色嗜热裂孢菌、粪碱纤维单胞菌、嗜热毁丝菌、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、Chrysosporium lucknowense、斜卧青霉菌(Penicillium decumbens)和木霉(Trichoderma reesei)产生的真菌酶或酶混合物。
在一个实施方案中，所产生的酶或酶混合物是与宿主细胞同源的酶或酶混合物的复合体。在一个实施方案中，所产生的酶或酶混合物是与青霉菌属宿主细胞，优选斜卧青霉菌菌株同源的酶或酶混合物的复合体。
应明白所产生的酶或酶混合物也可为单组份酶或酶混合物，例如，包括在合适的宿主细胞中重组产生的内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、葡糖水解酶或β-葡糖苷酶。所述酶或酶混合物也可包括在重组细胞中产生的其它的酶或酶种类，所述重组细胞利用先前列出的酶的至少部分编码区，包括本领域已知的调控区和/或启动子区。合适的宿主细胞将在下面进一步描述。
所产生的酶或酶混合物可为酶或酶混合物制品，其中一种或多种同源的酶或酶混合物组分从天然产生所述酶或酶混合物的宿主细胞中缺失或失活。
能产生酶或酶混合物的宿主细胞
所述宿主细胞可为任何来源。如上所述，所述酶或酶混合物可同源或异源于所述能产生酶或酶混合物的宿主细胞。
如本文所用，术语“重组的宿主细胞”指其中含编码酶或酶混合物的基因且能够表达所述基因以产生酶或酶混合物的宿主细胞，其中所述酶或酶混合物编码基因已被转化、转染、转导等至所述宿主细胞。所使用的转化、转染、转导等技术可为本领域中周知的。在一个优选的实施方案中，所述基因以一个或多个副本被整合至所述重组宿主细胞的基因组中。
当所述酶或酶混合物为异源时，所述能产生酶或酶混合物的重组宿主细胞优选为真菌或细菌源。重组宿主细胞的选择将很大程度上取决于编码酶和酶混合物的基因和所述酶和酶混合物的本源。
如本文所用，术语“野生型宿主细胞”指天然具有编码酶或酶混合物的基因并能表达所述基因的宿主细胞。当所述酶或酶混合物为同源制备品时或酶或酶混合物复合体时，能产生所述酶或酶混合物的所述野生型宿主细胞或其突变体优选为真菌或细菌源。
“其突变体”可为其中一种或多种基因已缺失或失活的野生型宿主细胞，例如，为了以一定分量富集所述酶或酶混合物制品。突变的宿主细胞也可为用一个或多个编码额外的酶或蛋白质的基因转化的野生型宿主细胞，以将一种或多种额外的酶活性或其它活性引入由所述野生型宿主细胞天然产生的所述酶或酶混合物复合体或制品中。所述额外的酶可具有相同的活性(例如，酶或酶混合活性)或仅为具有不同性质的另一种酶分子。所述突变的野生型宿主细胞也可具有额外的同源的酶编码基因，所述酶编码基因被转化、转染、转导，或类似技术，优选整合至基因组中，以增加所述基因的表达以产生更多的酶。
在一个优选的实施方案中，所述重组的或野生的宿主细胞为丝状真菌源。宿主细胞的实例包括选自包含支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌、Filobasidium、镰刀菌属、腐质霉属、稻瘟菌(Magnaporthe)、毛霉菌、毁丝霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌、拟青霉属、青霉菌属、革菌属、静脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属或木霉属细胞的组的那些。
在一个更为优选的实施方案中，所述丝状真菌宿主细胞选自包括泡盛曲霉、烟曲霉菌、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉菌株的组。在一个更为优选的实施方案中，所述菌株为斜卧青霉。
在另一个优选的实施方案中，所述述丝状真菌宿主细胞为杆抱状键抱(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、类(拟)丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)或Fusariumvenenatum细胞的菌株。在另一个优选的实施方案中，所述述丝状真菌宿主细胞选自包括烟管菌(Bjerkandera adusta)、乾拟蜡孔菌(Ceriporiopsis aneirina)、乾拟蜡孔菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、或虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium lucknowense、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginose)、黑米毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、杏鲍菇(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)的菌株的组。
在另一个优选的实施方案中，所述重组的或野生的宿主细胞为细菌源。宿主细胞的实例包括选自包含革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌菌株，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌的菌株；或链霉菌菌株，例如，变铅青链霉菌或鼠灰链霉菌；或来自革兰氏阴性细菌，例如，大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas sp)的组的那些。
水解
所述生物质将包含可水解为由所述生物质水解得到的水溶性物种的一些化合物。在纤维素的水溶性水解物种的情况下，纤维素可水解为葡萄糖、纤维二糖和更高的葡萄糖聚合物且包括二聚物和低聚物。因此，纤维素的一些水溶性的经水解的物质种类为葡萄糖、纤维二糖和更高的葡萄糖聚合物且包括它们各自的二聚物和低聚物。通过糖水解纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖。因此，所述糖水解纤维素酶为纤维素水解催化剂的实例。
水解纤维素体系的普遍理解将纤维素酶分为三类：外切-l,4-β-D-葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.91)，其从纤维素链的末端切割纤维二糖单元；内切-l,4-β-D-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)，其随机地水解纤维素链中的内β-1,4-糖苷键；l,4-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)，其将纤维二糖水解为葡萄糖，也从纤维低聚糖中切割葡萄糖单元。因此，如果所述生物质包含纤维素，那么葡萄糖为由所述生物质水解得到的水溶性的经水解的物种，且先前提到的和实验部分提到的纤维素酶为纤维素水解催化剂的具体实例。
通过相似的分析，半纤维素的水解产物为由所述生物质水解得到的水溶性物种，当然假定所述生物质含半纤维素。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿糖基木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。半纤维素中的不同的糖由所述半纤维素酶释放。由于半纤维素的异源性质，所述半纤维素分解体系比所述纤维素分解系统更复杂。所述体系其中可包括：内切-l,4-β-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，其水解木聚糖链中的内键；l,4-β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，其从非还原的末端攻击低聚木糖并释放木糖；内切-l,4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，其切割内部键；l,4-β-D-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)，其将甘露低聚糖切割为甘露糖。通过多种酶移除侧基，例如α-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、α-D-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、肉桂酰酯酶(EC 3.1.1.-)、乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。因此，如果所述生物质含半纤维素，则木糖和甘露糖为由含半纤维素的生物质的水解得到的水溶性经水解的物种的实例且前述的和实验部分提到的半纤维素酶为用于水解半纤维素的催化剂的具体例子。
所述工艺包括水解催化剂。所述水解催化剂组合物由催化剂、载体和用于将所述催化剂引入到所述工艺中的其它添加剂/成分组成。如上所讨论的，所述催化剂可包含将所述生物质中的至少一种化合物转化为更低分子量的一种或多种化合物的至少一种酶或微生物，所述更低分子量的一种或多种化合物低至并包括用于制造生物质中的化合物的基础糖或碳水化合物。能够对多种多糖例如纤维素、半纤维素和淀粉做这些的酶是本领域中周知的，且将包括还未发明的那些。
所述水解催化剂组合物也可包括无机酸，所述无机酸优选选自由硫酸、盐酸、磷酸，以及诸如此类，或其混合物组成的组。认为所述无机酸可用于大于100℃的温度下的处理工艺。特别地，所述工艺也可在不添加无机酸的情况下运行。
使用载体例如水或有机基生物质将所述水解催化剂添加至所述工艺中是典型的。出于物料平衡目的，所述术语催化剂组合物因此包括所述催化剂和用于将所述催化剂添加至所述工艺中的载体。如果pH缓冲剂和所述催化剂一起添加，则其也是所述催化剂组合物的一部分。通常所述木质纤维素类生物质将包含淀粉。用于淀粉水解的更为重要的酶为α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，(EC 3.2.1.1))。有使1,4-α-D-糖苷键断裂且可绕开但不可水解1,6-α-D-糖苷分支点的内作用水解酶。然而，外作用的葡糖淀粉酶(glycoamylase)例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)也可用于淀粉水解。淀粉水解的产物主要是葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精和不同量的低聚糖。当所述淀粉基水解产物被用于发酵时，添加蛋白水解酶可能是有利的。该酶可阻止微生物的发酵且可产生微生物可用的氨基酸。因此，如果所述生物质包含淀粉，则葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精和低聚糖为可从含淀粉的生物质水解得到的水溶性经水解的物种的例子，且前述α-淀粉酶和实验部分提到的那些为用于淀粉水解的具体的例子。
用途
在另一方面，所述工艺涉及由经预处理的木质纤维素生物质得到的固体组合物作为碳源养料用于在宿主细胞中生产酶或酶混合物的用途。
本文所描述和要求保护的工艺不受本文公开的具体实施方案的限制，因为这些实施方案目的是作为本发明的数个方面的例证。任何等价的实施方案旨在在本发明的范围内。确实，除这里显示和描述的外，本发明的各种修改将从前文的描述中对本领域技术人员是明显的。所述修改也旨在落入所附加的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将控制本公开内容，包括定义。
所述工艺可具有附加的步骤，其中从所述工艺得到的酶进一步用于水解第一木质纤维素类生物质。优选地，第一木质纤维素类生物质和第二木质纤维素类生物质应来源于相同的禾本植物(grass)属，且更优选地来自相同的禾本植物(grass)物种。也优选在酶法水解之前对要进行酶法水解的第一木质纤维素类生物质实施预处理。
还发现了由所描述工艺制得的酶或酶混合物和经由根据所描述工艺制得的酶或酶混合物水解的木质纤维素类生物质。
具体实施方式
制备固体组合物
可从芦竹(Arundo donax)和麦秸制备不同的固体组合物。所述生物质经受预处理、酶法水解、发酵和压滤，用于制备在培养实验中使用的不同的固体组合物。
预处理
木质纤维素类生物质被引入连续的反应器并经受浸泡处理。通过按压将经浸泡的混合物分离为浸泡液和含经浸泡的固体原料部分。含所述经浸泡的固体原料的部分经受蒸汽爆破。两种生物质的预处理参数如表1所示。
表1预处理中使用的工艺参数
蒸汽爆破产物被分离为蒸汽爆破液体和蒸汽爆破固体。
蒸汽爆破固体为所述培养实验中使用的芦竹预处理的生物质(AR)和麦秸预处理的生物质(WS)。
酶法水解
将经预处理的生物质与水混合得到具有7.5％干物质含量的混合物并将所述混合物放入酶反应器中。添加酶混合物(an enzyme cocktail)，以每克含在所述经预处理的生物质中的木聚糖对应蛋白质的指定浓度。在搅拌下实施酶法水解72h。
从麦秸预处理的生物质开始制备两种不同的水解产物；通过离心(20分钟,8000rpm,4℃)将各水解产物分离为含所述水溶性糖的液体部分和所述固体组合物。固体组合物，表示为HWl和HW2，被用在所述培养实验中。在制备HWl和HW2中使用的水解参数如表2中所示且选择水解参数以得到两种不同的复合糖消耗水平；特别地，用较高的酶浓度制备HW2，从而得到更多消耗的组合物。
表2用于制备HWl和HW2固体组合物的酶法水解中使用的参数
发酵和压滤
将根据组合物HW2的条件制备的麦秸水解产物和3g/L的尿素和0.5g/L的发酵酵母放入生物反应器中。将pH设置为5且温度设置为30℃并实施发酵48h。酶混合物(enzyme cocktail)不从水解产物中移除，以这样的方式使在发酵过程中酶法水解继续。通过压滤在80℃温度下和15bar下按压含固体、乙醇和其他液体部分的发酵液，以从所述富含固体的部分中分离乙醇和液体成分。从所述按压中提取的含木质素的富含固体的部分，表示为HFW，并用在所述培养实验中。
根据对应于HW2的参数制备芦竹水解产物，并根据麦秸使用的程序发酵所述芦竹水解产物。从所述按压中提取的所述富含固体的部分，表示为HFA，并用在所述培养实验中。
组合物
根据在实验部分的最后列出的标准分析方法确定经预处理的生物质组合物和固体组合物的水溶性糖、复合糖、木质素和其它化合物。
表3示出了经预处理的生物质组合物AR和WS、来自WS水解产物的固体组合物HWl和HW2，和来自AR和WS水解产物发酵的固体组合物(HFW和HFA)。所述表也含在下面实验中使用的且在下面实验部分中描述的组合物LS1和LS2。
列出了所述组合物中的C6复合糖、C5复合糖、全部水溶性糖(C5和C6)和其它成分(含木质素和水)。C6复合糖以葡萄糖为基础，C5复合糖主要以木糖为基础。
表3所报道的实验中使用的组合物
WS AR HW1 HW2 HFW HFA LS1 LS2
水溶性糖 1.6％ 2.4％ 0.0％ 0.0％ 0.0％ 0.0％ 0.0％ 0.0％
C6复合糖 17.4％ 18.3％ 10.7％ 9.6％ 8.05％ 14.0％ 0.51％ 0.23％
C5复合糖 3.4％ 2.4％ 1.6％ 1.4％ 1.3％ 2.0％ 0.04％ 0.02％
其它* 77.6％ 76.9％ 87.7％ 89.0％ 90.6％ 84.0％ 99.4％ 99.8％
复合糖/木质素比例 1.831 1.815 1.574 0.886 0.723 0.786 0.19 0.18
*包括木质素和水
对于本公开内容的范围，所述组合物可方便地通过复合糖与木质素的比例进行表征。复合糖相当于C6复合糖和C5复合糖的总和。考虑到从WS中得到的组合物，即HWl、HW2和HFW，应注意：
-HWl和HW2中复合糖：木质素的比例低于WS中复合糖：木质素的比例，反映了在水解中发生了复合糖的消耗；
-HW2中复合糖：木质素的比例低于HWl中复合糖：木质素的比例，反映了在较高的酶浓度下HW2中发生更有效的水解；
-HFW中复合糖：木质素的比例低于HW2中复合糖：木质素的比例，归因于发酵过程中酶没有失活和移除且水解继续。
培养实验
用于生产酶的宿主细胞的培养按下面实施例进行。各宿主细胞的培养，在报道的实施例中使用里氏木霉和斜卧青霉作为宿主细胞，由从PDA-板中重获的孢子溶液开始，所述PDA-板在重获前七天接种新鲜孢子。
实验分为两步:
1)预培养，这不是所要求保护的培养过程的一部分，和
2)宿主细胞培养，其中所述宿主细胞生长且产生酶。
预培养
接种PDA板：
1.将500μL预先收集的孢子溶液分配在按本领域已知方法制备的PDA板中(3.9％马铃薯葡萄糖琼脂培养基)。
2.将500μL无菌的0.9％NaCl溶液(对于斜卧青霉)或1％Triton X-100溶液(对于里氏木霉)分配在所述孢子上并轻轻旋转培养瓶直至表面全部被液体覆盖。
3.所述培养瓶用铝箔包装的棉塞封闭，并在30℃下(对于斜卧青霉)或28℃下(对于里氏木霉)孵育7天。
重获孢子溶液:
4.7天后，将10mL对于斜卧青霉和里氏木霉合适的无菌溶液(分别为0.9％NaCl和1％Triton X-100)分配在所述培养瓶中。
5.轻轻旋转所述培养瓶直至所述液体变浑浊。
6.收回尽可能多体积的经分配的溶液，将所述孢子悬浮液移至无菌管中。
7.在4℃下存储所述孢子溶液。
预培养设置步骤
在开始宿主细胞培养前，有必要设置预培养。
按表4中所报道的内容制备预培养基(pre-culture medium)，相对于宿主细胞培养阶段的体积选择合适的体积(对于斜卧青霉和里氏木霉分别为十分之一或二十分之一)。
表4预培养基组合物
1.在灭菌后添加葡萄糖和孢子溶液。选择孢子溶液体积以得到如下最终浓度：对于斜卧青霉5000CFU/mL，对于里氏木霉50000CFU/mL。
2.斜卧青霉预培养物在30℃、170rpm下孵育30h，而里氏木霉预培养物在28℃、170rpm下孵育64h。
宿主细胞培养和酶生产
如表5中报道的内容制备宿主细胞培养环境。
表5培养基(cultivation medium)组合物
所述生物质选自为说明本发明制备的组合物组(表示为WS、AR、HW1、HW2、HFW、HFA)。1.在灭菌后将pH调至5.3(对于斜卧青霉)和6.0(对于里氏木霉)并添加预培养体积。使用不同类型的缓冲溶液(例如0.1M磷酸盐缓冲剂)在烧瓶中控制pH。
2.在对各微生物适当的温度和搅拌下实施宿主细胞培养和酶生产(对于斜卧青霉，30℃，170rpm；对于里氏木霉，28℃，170rpm)。
实验1
表6不同培养基中里氏木霉的酶活性
                                      169h后的活性含量，U/mL
CE1 WS 1.65 3.02 0.96 0.30 231
WE1 HW1 1.67 2.63 1.92 0.45 113
WE2 HW2 1.72 1.52 1.74 0.46 138
WE3 HFW 1.89 1.35 2.01 0.91 360
                                      对CE1的相对性能，％
表6比较了对用于供养宿主细胞里氏木霉的不同木质纤维类生物质上的活性。在该表中，“使用的组合物”指用于所述培养基中作为碳原子源的生物质。计算培养基含量以在各培养环境中提供约相同量的木质素。由于使用的每个生物质的特点是减少复合糖与木质素的比例，各培养基中使用的复合糖的量从CE1至WE3减少。这建立了用于不同类型宿主细胞的方法。选择CE1活性作为参照在该表的第二部分以相对比例表达实验结果。WE1、WE2和WE3实验使用仅有的碳源为由水解的(HW1和HW2)和发酵的(HFW)预处理的生物质得到的组合物的培养基。培养时间与所有实验相同(169h)。
实验结果清楚地显示，可用通过移除部分复合糖由经预处理的木质纤维素类生物质得到的固体组合物替代所述经预处理的木质纤维素类生物质。此外，从糖耗尽的木质纤维素类生物质中得到的转化产率(定义为产生的总活性与复合糖的比例)出人意料地高于从经预处理的木质纤维素类生物质中得到的转化产率，转化产率的增加如表7中报道的结果说明。
表7从使用具有减少的复合糖含量的不同组合物制备的不同培养基中得到的总活性
实验2
在进一步的实验中，在培养基中使用不具有或具有非常低复合糖含量的不同组合物作为碳源。
CE2和CE3使用两种不同的商业化木质素样品产生。CE2含8％木质素低磺化碱(Lignin alkali low sulphonate)含量(Sigma，代码471003)且CE3含8％木质素碱(Sigma，代码370959)。所使用的商业的木质素具有低于5％的复合糖含量。
酶生产工艺后，将在两种不同WE3实验中使用的培养基的残留物在8000rpm和4℃下离心20分钟并收集到两种富含固体的部分，分别表示为LS1和LS2。
实验1的CE1报道为对照实验。
表3中含LS1和LS2的组合物。对于木质素含量，WE4和WE5培养基中含比CE1多5倍的材料，且比LS1和LS2分别多2.5-2.8倍的材料。如在表3中所证实的，LS1和LS2中复合糖的含量少于8％，在该表中也报道了添加到所述培养基中的对应的复合糖的量。
培养时间是169h。
表8对于CEl、CE2、CE3、WE4和WE5实验的里氏木霉的酶活性
                                     169h后的活性含量，U/mL
报道的数据清楚地显示，在WE4和WE5的情况下，复合糖的量，相当于CEl情况下复合糖的20％，不足以提升酶生产，而发现在CE1中使用45％的复合糖增加了酶的生产(WE3实验)。
实验3
用斜卧青霉作为宿主细胞继续进一步的实验以产生酶。使用AR预处理的生物质作为碳源实施对比实施例(CE4)，而添加足够量的HFA组合物以提供约与CE4中使用的相同的木质素的量来进行WE6。培养时间与所有实验的培养时间相同(138h)。
表9报道了酶生产138h后得到的活性。实验表明，当斜卧青霉在经预处理的或糖耗尽的木质纤维素类生物质存在下培养时可产生至少相同总量的酶。
表9使用斜卧青霉作为宿主细胞产生的酶活性
                                    138h后的活性含量，U/mL
                                    对CE4的相对性能，％
从表9中明显看出，来源于由木质纤维素生物质水解或发酵得到的糖耗尽的固体组合物供养的宿主细胞的酶与来源于使用经预处理的材料得到的对比实施例的酶非常接近。
实验4
在WE3中用麦秸固体组合物HFW产生的酶进一步用于水解麦秸经预处理的生物质WS。
将经预处理的生物质与水混合得到具有7.5％干物质含量的混合物，并将该混合物放入100mL烧瓶中。将WE3中产生的酶混合物在WE7和WE8实验中分别以60和90mg蛋白质/g所述经预处理的生物质的葡聚糖加载，且在pH 5.0和50℃下实施水解72h。使用商业化酶溶液根据厂商提供的说明实施CE5实验。
在6、24、48和72h测量葡萄糖和木糖的浓度，结果如表10中所示。释放的葡萄糖和木糖报道为WS预处理的生物质中的木聚糖和葡聚糖的初始量，以量化葡聚糖水解产率和木聚糖水解产率。图1报道了葡聚糖水解产率图(图1a)和木聚糖水解产率图(图1b)。这些实验强调了根据本发明公开内容产生的酶可用于有效地水解经预处理的木质纤维素类生物质。
表10 CE5、WE7和WE8实验的水解结果
分析方法
活性测定
使用工业上已知的测定酶活性的方法测定FPU(滤纸活性)、β-葡糖苷酶和木聚糖酶的活性。不同的是滤纸为FPU的基底且下面描述的水杨苷和木聚糖混合物用作β-葡糖苷酶和木聚糖酶活性测定。
组合物测定
根据下面NREL标准实施组合物测定
NREL分析方法
生物质中结构性碳水化合物和木质素的测定
实验室分析程序(LAP)发行日期：4/25/2008
2008年4月修订的技术报告NREL/TP-510-42618
生物质中提取物的测定
实验室分析程序(LAP)发行日期：7/17/2005
2008年1月修订的技术报告NREL/TP-510-42619
用于组成分析的样品的制备
实验室分析程序(LAP)发行日期：9/28/2005
2008年1月修订的技术报告NREL/TP-510-42620
生物质中总固体和液体工艺样品中溶解的总固体的测定
实验室分析程序(LAP)发行日期：3/31/2008
2008年3月修订的技术报告NREL/TP-510-42621
生物质中灰分的测定
实验室分析程序(LAP)发行日期：7/17/2005
2008年1月修订的技术报告NREL/TP-510-42622
液体部分工艺样品中的糖类、副产物和降解产物的测定
实验室分析程序(LAP)发行日期：12/08/2006
2008年1月修订的技术报告NREL/TP-510-42623
经预处理的生物质材料中不溶固体的测定
实验室分析程序(LAP)发行日期：03/21/2008
2008年3月NREL/TP-510-42627

Claims (19)

1.一种从宿主细胞产生至少第一酶的工艺，其中所述第一酶能水解第一经预处理的木质纤维素类生物质，
所述工艺包含培养所述宿主细胞一段培养时间，以产生至少所述第一酶的步骤，其中
所述宿主细胞的培养发生在含宿主细胞、水和固体组合物的糖耗尽的培养环境中，所述固体组合物包含所述固体组合物的复合糖和所述固体组合物的木质素，其中
a)所述固体组合物由第二经预处理的木质纤维素类生物质获得，包含所述第二经预处理的木质纤维素类生物质的复合糖和所述第二经预处理的木质纤维素类生物质的木质素；
和
b)所述固体组合物中所述复合糖的总量与所述木质素的总量的比值小于所述第二经预处理的木质纤维素类生物质中所述复合糖的总量与所述木质素的总量的比值。
2.根据权利要求1所述工艺，其中所述培养在单糖耗尽的条件下进行部分培养时间，所述单糖耗尽的条件具有以干态计所述糖耗尽的培养环境的0-10wt％的量的添加的单糖或单糖类，所述部分培养时间为至少50％的所述培养时间。
3.根据权利要求1或2所述工艺，其中所述固体组合物通过含下面步骤的过程由所述第二经预处理的木质纤维素类生物质得到：
a)在水解催化剂存在下水解至少部分第二经预处理的木质纤维素类生物质，以产生含所述固体组合物和水及水溶性糖的溶液的经水解的组合物；和
b)从所述经水解的组合物中去除至少50％的水及水溶性糖的溶液。
4.根据权利要求3所述工艺，其中通过至少一种包含在由倾析、沉降、离心、过滤、压滤和洗涤的组成的组中的方法实施所述水及水溶性糖的溶液的去除。
5.根据权利要求1或2所述工艺，其中所述固体组合物通过含下面步骤的过程由所述第二经预处理的木质纤维素类生物质得到：
a)在水解催化剂存在下水解至少部分第二经预处理的木质纤维素类生物质，以产生含复合糖和木质素和水及水溶性糖的溶液的经水解的组合物；和
b)转化所述经水解的组合物中的至少部分水溶性糖以产生含至少一种糖衍生产物的经转化的组合物，和所述固体组合物；
c)去除部分所述至少一种糖衍生产物。
6.根据权利要求5所述工艺，其中通过选自由倾析、沉降、离心、过滤、压滤、洗涤、蒸发和蒸馏组成的组的至少一种方法实施部分所述至少一种糖衍生产物的去除。
7.根据权利要求3-6任一项所述工艺，其中所述水解催化剂含第二酶或酶混合物。
8.根据权利要求3-6任一项所述工艺，其中所述水解催化剂选自由氢离子、有机酸和无机酸组成的组。
9.根据权利要求5-8任一项所述工艺，其中所述经水解的组合物的转化包含发酵。
10.根据权利要求9所述工艺，其中所述至少一种糖衍生产物包含乙醇。
11.根据权利要求2-10任一项所述工艺，其中在单糖耗尽的条件下的所述部分培养时间选自由至少75％的培养时间、至少85％的培养时间、至少90％的培养时间、至少95％的培养时间、至少98％的培养时间组成的组。
12.根据权利要求2-10任一项所述工艺，其中在糖饥饿的条件下的所述部分培养时间与所述培养时间相同。
13.根据权利要求2-12任一项所述工艺，其中添加的单糖或糖类的量以干态计在所述糖耗尽的培养环境的0-5wt％、0-2.5wt％、0-2.0wt％、0–1.0wt％的范围内。
14.根据权利要求2-12任一项所述工艺，其中在所述糖耗尽的培养环境中无添加的单糖。
15.根据权利要求1-14任一项所述工艺，其中至少第一酶通过将所述糖耗尽的培养环境分离为含至少部分量的第一酶的至少一种收获的组合物和含至少部分量的固体组合物的固体残留物的耗尽的组合物而得到。
16.根据权利要求15所述工艺，其中耗尽的组合物中的复合糖的总量以干态计以选自由0–30wt％、0-20wt％、0-15wt％、0-10wt％、0-7.5wt％、0-5wt％、0-2.5wt％组成的组的范围存在。
17.根据权利要求1-16任一项所述工艺，所述第一酶进一步用于水解所述第一木质纤维素类生物质，且所述第一木质纤维素类生物质和所述第二经预处理的木质纤维素类生物质均包含来源于由相同禾本植物属和相同禾本植物种组成的组的木质纤维素类生物质。
18.通过权利要求1-17任一项所述工艺可得到的酶或酶混合物。
19.已被权利要求18所述的酶混合物水解的经水解的木质纤维素类生物质。
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