MX2014010045A - Metodo biotecnologico para producir butanol y acido butirico. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para producir cuerpos C4, de manera preferida ácido butírico y/o butanol, que comprende los pasos de poner en contacto un medio acuoso que comprende una célula bacteriana acetogénica en un medio acuoso con gas de síntesis, e incubar la mezcla obtenida en el paso a) a una temperatura entre 0 y 100°C durante al menos 30 minutos, en donde el medio acuoso comprende, en el paso b), etanol y/o acetato a una concentración combinada total de al menos 0.1 g L-1.

Description

MÉTODO BIOTECNOLOGICO PARA PRODUCIR BUTANOL Y ÁCIDO BUTÍRICO La presente invención se relaciona con un método para producir cuerpos C , de manera preferida ácido butírico y/o butanol, que comprende los pasos de poner en contacto una célula bacteriana acetogénica en un medio acuoso con gas de síntesis e incubar la mezcla obtenida en el paso a) a una temperatura entre 0 y 100°C durante al menos 30 minutos, en donde el medio acuoso comprende, en el paso b) , etanol y/o acetato a una concentración combinada total de al menos 0.1 g La era de los combustibles fósiles no renovables está llegando a un fin. Aunque los químicos han sido capaces de confiar en el suministro virtualmente ilimitado de carbón, petróleo y gas natural hasta ahora, la disponibilidad de tales recursos, formados por las bacterias, el plancton, la materia de plantas y animales enterrados en los sedimentos oceánicos durante millones de años, está vinculada a ser limitante3 en un futuro muy cercano. Además, la quema de combustibles fósiles se ha relacionado con el incremento en las concentraciones atmosféricas de C02 y los cambios climáticos asociados, de manera más notable, el calentamiento global. Por lo tanto, los procesos de la siguiente generación para la producción de compuestos químicos en volumen granel, tales como butanol, ácido butírico y derivados de los mimos, derivados de manera convencional de los recursos fósiles, tendrán que empezar con recursos renovables, es decir, materiales que son fácilmente reabastecibles y en términos de escalas geológicas, rápidamente reabastecibles.

La biotecnología industrial, es decir, la aplicación de los biocatalizadores tales como enzimas u organismos catalíticamente competentes como catalizadores industriales, ofrece alternativas a muchos procesos convencionales que utilizan recursos fósiles como la alimentación. No sólo los biocatalizadores son capaces de convertir los compuestos hechos de materiales renovables, con frecuencia los desechos agrícolas o de proceso que de otra manera tendrían que desecharse, pero que no requieren el uso de compuestos tóxicos, y por último, aunque no menos importante, reducen las emisiones del gas de invernadero, en comparación con los enfoques convencionales .

Se han reportado en la técnica previa, numerosos métodos para producir butanol (CH3-CH2-CH2-CH2-OH) y ácido butírico (CH3-CH2-CH2-COOH, también referido como butirato) y derivados C4 de los mismos, pero la mayoría de ellos se basan en el fraccionamiento de los combustibles fósiles y la oxidación de los hidrocarburos cortos resultantes. En contraste, se han descrito pocos procesos que empiecen con carbono en la forma de monóxido de carbono o dióxido de carbono, compuestos disponibles de los gases de escape y el gas de síntesis ejemplar.

El gas de síntesis, un término que se refiere a varias mezclas que comprenden al menos uno de agua e hidrógeno y al menos uno de monóxido de carbono y dióxido de carbono, es un fuente renovable de carbono y está fácilmente disponible alrededor del mundo, puesto que se conocen procesos para su producción utilizando varias materias primas, incluyendo reformación a vapor del gas natural o los hidrocarburos líquidos y la gasificación del carbón o la biomasa .

El uso de gas de síntesis para la producción de compuestos que comprenden cadenas de carbono se ha reportado en la técnica previa. Sin embargo, los procesos descritos previamente dependen de la adición de sustratos adicionales, en particular carbohidratos tales como glucosa. Los procesos basados en el consumo microbiano del gas de síntesis como la fuente de carbono conducen a rendimientos bastante insatisfactorios de los compuestos deseados .

Por lo tanto, el problema subyacente de la presente invención, es proporcionar un método para producir cuerpos C4, de manera preferida, butanol y/o ácido butírico, empezando a partir de monóxido de carbono o dióxido de carbono, de manera preferida, en la forma de gas de síntesis.

Otro problema subyacente de la presente invención, es proporcionar un método para producir cuerpos C4 , de manera preferida butanol y/o ácido butírico, empezando a partir de monóxido de carbono o dióxido de carbono, método el cual está mejorado en comparación con los métodos del estado de la técnica, en términos de rendimiento y/o pureza del butanol y/o ácido butírico formados o la proporción de cuerpos C4, de manera preferida butanol y/o ácido butírico, hechos a partir de los átomos de carbono derivados del gas de síntesis, más que de otras fuentes de carbono presentes, en particular carbohidratos tales como glucosa.

Otro problema subyacente de la presente invención, es proporcionar un método para producir cuerpos C4 empezando con gas de síntesis, en donde el rendimiento de los productos C4 con relación a los reactivos que contienen carbono, diferentes al monóxido de carbono y al dióxido de carbono, está mejorado, es decir, la cantidad de compuestos de carbono diferentes al monóxido de carbono y al dióxido de carbono, requeridos para la síntesis, está reducida.

En un primer aspecto, el problema subyacente de la presente invención se soluciona mediante un método para producir cuerpos C4 , de manera preferida ácido butírico y/o butanol , que comprende los pasos : a) poner en contacto una célula bacteriana acetogénica en un medio acuoso con gas de síntesis bajo condiciones anaeróbicas, b) incubar la mezcla obtenida en el paso a) a una temperatura entre 0 y 100 °C durante al menos 30 minutos, en donde el medio acuoso comprende, en el paso b) , etanol y/o acetato a una concentración combinada total que excede de 0.1 g L"1.

En una primera modalidad del primer aspecto de la presente invención, el problema se soluciona mediante un método, en donde el etanol y/o el acetato son etanol y/o acetato producidos de manera exógena.

En una segunda modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde la concentración combinada total de etanol y/o acetato es 0.5 g L"1 a 20 g L"1.

En una tercera modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a segunda modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el gas de síntesis comprende 40 a 100, de manera preferida 40 a 95% de CO.

En una cuarta modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la tercera modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el gas de síntesis comprende menos que 10% de C02.

En una quinta modalidad del primer aspecto, que es ß también una modalidad de la primera a la cuarta modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el gas de síntesis comprende menos que 10% de CO.

En una sexta modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la quinta modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el método comprende el paso c) separar y opcionalmente, reciclar el etanol y/o acetato de la mezcla después del paso b) .

En una séptima modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la sexta modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde la célula bacteriana acetogénica se selecciona del grupo que comprende Clostridium, Moorella y Carboxythermus y es de manera preferida Clostridium carboxidivorans .

En una octava modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la séptima modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el pH en los pasos a) y b) se mantiene entre 3 y 7, de manera preferida 4 a 6, de manera más preferida 5 a 5.5.

En una novena modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la octava modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el paso b) se lleva a cabo a una temperatura entre 15°C y 45°C, de manera preferida, 30°C a 40°C.

En una décima modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la novena modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el gas de síntesis proporciona más que 80, de manera preferida más que 90% del carbono presente inicialmente en el paso a) .

En una onceava modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la décima modalidades del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un método, en donde el proceso se corre en un modo continuo.

En una doceava modalidad del primer aspecto, que es también una modalidad de la primera a la onceava modalidad del primer aspecto, en donde el paso b) se lleva a cabo en la ausencia de carbohidratos.

El problema subyacente de la presente invención se soluciona, en un segundo aspecto, mediante el uso de etanol y/o acetato para incrementar la proporción de gas de síntesis convertido por una célula bacteriana acetogénica a cuerpos C4 , de manera preferida, ácido butírico y/o butanol.

En una primera modalidad del segundo aspecto, el problema se soluciona mediante un uso, en donde el etanol y/o el acetato es etanol y/o acetato producido de manera exógena y se agrega de manera preferida a un medio acuoso que comprende la célula bacteriana acetogénica, antes de la acumulación de cantidades detectables de etanol y/o acetato producidos de manera endógena por la célula.

En una segunda modalidad del segundo aspecto, que es también una modalidad de la primera modalidad del segundo aspecto, el problema se soluciona mediante un uso, en donde el acetato y/o etanol está presente en un medio acuoso que comprende la célula bacteriana acetogénica a una concentración combinada total de etanol y/o acetato que excede 0.5 g L"1, pero no 20 g L"1.

En una tercera modalidad del segundo aspecto, que es también una modalidad de la primera a la segunda modalidades del segundo aspecto, el problema se soluciona mediante un uso, en donde la célula bacteriana acetogénica se selecciona del grupo que comprende Clostridíum, Moorella y Carboxythermus y es de manera preferida, Clostridíum carboxidivorans .

Sin desear apegarse a alguna teoría, los presentes inventores tienen la teoría de que la presencia de etanol o acetato induce la expresión de genes esenciales para la conversión del gas de síntesis a cuerpos C4, de manera preferida butanol y/o ácido butírico, incrementado así una capacidad acetogénica de la célula bacteriana para metabolizar monóxido de carbono y dióxido de carbono del gas de síntesis.

La presente invención se centra alrededor de la producción de cuerpos C4, de manera preferida butanol y/o ácido butírico, utilizando una célula bacteriana acetogénica. En una modalidad preferida, el término "célula bacteriana acetogénica" , como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula bacteriana o arquea, que es capaz de producir acetato bajo condiciones anaeróbicas, de manera preferida utilizando hidrógeno como un donador de electrones y dióxido de carbono como un aceptor de electrones o monóxido de carbono en lugar de dióxido de carbono. Se ha descrito una multitud de bacterias acetogénicas en la técnica previa, incluyendo, de manera no exclusiva, Clostridium aceticum (Wieringa, K. T. (1936), J. Microbiol. Serol. 3, 263-273), Acetobacterium woodi (Balch, W. E. , Schobert, S., Tanner, R. S. y Wolfe, R. S. (1977), Int. J. Sys . Bacteriol. 27, 335-361) , Clostridium thermaceticum (Fontaine, F. E, Peterson, . H., McCoy, E. y Johnson, . J. (1942), J. Bact. 43, 701-715), Clostridium lungdahlii (WO0068407) , Clostridium autoethanogenum (Aribini et al., Archives of Microbiology 161, 345-351), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et al., Biotechnology Letters 29, 1697-1612) y aquéllas del género Carboxydothermus (Svetlichny et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14, 254-260) . Éstas y otras células bacterianas acetogénicas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de la Colección Americana de Tejidos y Cultivos (ATTC) , de los Estados Unidos, o de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania. Dentro del alcance de la presente invención, también está un cultivo mezclado que comprende dos células bacterianas acetogénicas .

En una modalidad preferida, el término "cuerpo C4" , como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto orgánico que comprenda un total de cuatro átomos de carbono, en cualquier combinación con grupos funcionales que comprendan átomos diferentes al carbono. En una modalidad más preferida, el término "cuerpo C4" , como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier derivado hecho de butanol o butirato. En una modalidad más preferida, el derivado se obtiene mediante una derivatización que involucra cualquier reacción diferente a aquéllas que involucran una "adición o eliminación neta de átomos de carbono" al butanol o butirato o derivados de los mismos, incluyendo, de manera no exclusiva, oxidación, en particular hidroxilación, reducción y desplazamientos del metilo, en donde la "adición o eliminación neta de átomos de carbono" no excluye una adición o eliminación temporal de átomos de carbono, por ejemplo, uniendo temporalmente el cuerpo C4 o el derivado a una enzima o un cofactor de la misma. Los ejemplos de cuerpos C4 comprenden 1-butanol (referido en esta solicitud como "butanol" ) , 2-butanol, butirato, 1,4-butandiol, 2 , 3-butandiol, amino butano, tiobutanol, isobutenol e isobutanol.

La presente invención contempla tanto el uso de células bacterianas acetogénicas del tipo silvestre como células bacterianas acetogénicas modificadas genéticamente. En una modalidad preferida, una célula bacteriana acetogénica modificada genéticamente es una célula bacteriana acetogénica que se ha modificado de manera que la actividad de al menos una enzima involucrada en la trayectoria de Wood-Ljungdahl , es decir, la trayectoria que convierte el monóxido de carbono, dióxido de carbono e hidrógeno a acetato. En una modalidad preferida, el término "enzima involucrada en la trayectoria de Wood-Ljungdahl", como se utiliza en el presente documento, comprende cualquier enzima que se une a, o de manera preferida, acepta como un sustrato, uno de los sustratos de las trayectorias, de manera preferida monóxido de carbono, dióxido de carbono o hidrógeno, o cualquiera de los intermediarios formados dentro de la trayectoria que empieza de cualquiera de estos sustratos, puesto que los sustratos son convertidos a acetato o derivados del mismo. En otra modalidad preferida, el término "enzima involucrada en la trayectoria de Wood-Ljungdahl", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una enzima del grupo que comprende CO deshidrogenasa y acetil-CoA sintetasa (Diekert y Wohlfahrt, (1994) Antonie van Leeuwenhoek 66 (1-3), 209-221). Las técnicas que pueden utilizarse para modificar genéticamente células bacterianas se describen en la técnica previa, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular cloning -A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) , así como los métodos para incrementar la actividad de una enzima en una célula bacteriana, por ejemplo, incrementando la expresión del gen que codifica la enzima que tiene la actividad de interés por medio de amplificación del gen cromosomal (WO 03/014330 y WO 03/040373) . En una modalidad preferida, la célula bacteriana acetogénica se elige del grupo que consiste de Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei y Clostridium ljungdahlii .

Es esencial que el proceso se lleve a cabo bajo condiciones anaeróbicas . En una modalidad preferida, el término "condiciones anaeróbicas" , como se utiliza en el presente documento, significa que la saturación de oxígeno en una solución de interés es, en orden de preferencia creciente, menos que 30, 20, 10, 5, 2.5 ó 1 por ciento de saturación, en donde 100% de saturación representa la concentración de oxígeno presente si la solución se burbujea de manera extensa con gas oxígeno puro bajo condiciones comparables, por ejemplo, a 20°C bajo presión atmosférica. Con respecto a un gas, el término "condiciones anaeróbicas", como se utiliza en el presente documento, significa, en una modalidad preferida, que el gas comprende, en orden de preferencia incrementada y con referencia al volumen total, menos que 30, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.1, 0.01% de oxígeno. En otra modalidad preferida, el término "condiciones anaeróbicas" , como se utiliza en el presente documento, significa que la concentración of oxígeno, ya sea en una mezcla de gases o una solución, es tal, que no inhibe el crecimiento de las bacterias acetogénicas anaeróbicas, de manera preferida, Clostridium carboxidivorans . La persona con experiencia en la técnica está familiarizada con las técnicas que pueden utilizarse para volver anaeróbicos los recipientes de reacción y las soluciones, por ejemplo, lavando el recipiente hermético al aire y las soluciones con nitrógeno, argón o lo similar, o complementando las soluciones acuosas con sistemas enzimáticos que consumen oxígeno, por ejemplo, 0.6% (peso/volumen) de ß-d-glucosa, 0.5 unidades mi-1 de glucosa oxidasa (Sigma) y 200 unidades mi-1 de catalasa (Sigma) , como se describe por Richter, C. D. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277 (5), 3094-3100.

El gas de síntesis es la fuente principal de carbono para la producción inventiva de cuerpos C4 , de manera preferida, butanol y/o ácido butírico. En una modalidad preferida, el término "gas de síntesis", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mezcla que comprende al menos uno de agua e hidrógeno (H2) y al menos uno de monóxido de carbono (CO) y dióxido de carbono (C02), en donde el volumen total combinado de agua, hidrógeno, monóxido de carbono y dióxido de carbono es al menos 80, de manera preferida 90 por ciento del volumen total de la mezcla. Los componentes adicionales comprenden nitrógeno, gases nobles y lo similar. En una modalidad preferida, el gas de síntesis comprende 40 a 95% de monóxido de carbono. En una modalidad preferida, el gas de síntesis comprende 40 a 100, de manera preferida 40 a 95% de dióxido de carbono y 0.5 a 20% de H2. En otra modalidad preferida, el gas de síntesis comprende menos que 10% de dióxido de carbono. En otra modalidad preferida, el gas de síntesis comprende menos que 10% de monóxido de carbono. En otra modalidad preferida, el gas de síntesis comprende al menos 5, de manera preferida 10% de monóxido de carbono. En otra modalidad preferida, el volumen total combinado de hidrógeno y dióxido de carbono es, en orden de preferencia incrementada, más que 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del volumen total de la mezcla. En una modalidad preferida, el término "poner en contacto" un microorganismo con un "gas de síntesis" de cualquier composición especificada, en esta solicitud, como se utiliza en el presente documento, significa que el microorganismo está presente en una atmósfera que consiste de gas de síntesis de la composición especificada.

De acuerdo con el método inventivo, la célula bacteriana acetogénica se pone en contacto con el gas de síntesis en la ausencia de oxígeno en un medio acuoso. En una modalidad preferida, el término "medio acuoso" comprende cualquier solución acuosa que comprenda la cantidad de sales y amortiguadores necesarios para cultivar o sustentar una célula bacteriana acetogénica y para sustentar la acetogénesis . Por ejemplo, un medio acuoso de acuerdo con Hurst, K. M. , y Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165 puede utilizarse para llevar a cabo las enseñanzas inventivas. En una modalidad preferida, el medio acuoso comprende extracto de levadura.

Un aspecto crucial de la presente invención es que el etanol (CH3-CH2-OH) y/o acetato (CH3-COO-) estén presentes en el medio acuoso desde el inicio de la reacción a una concentración combinada total, es decir, la suma de la concentración del catión acetato y la concentración de etanol, es al menos 0.1 g IT1. En otras modalidades preferidas, la concentración de etanol y/o etanol es 0.1 a 50, 0.2 a 40, 0.25 a 20 ó 0.5 a 20 g L"1.

Más que esperar que la célula produzca acetato endógeno, el acetato y/o etanol producido de manera exógena está presente inicialmente en el paso a) en el medio acuoso. En una modalidad preferida, el término acetato y/o etanol "producido de manera exógena" , como se utiliza en el presente documento, se refiere a acetato o etanol producido o purificado en un recipiente de reacción separado, antes de poner en contacto la célula bacteriana acetogénica, en contraste al acetato y/o etanol producido en el paso b) , es decir, después del paso a) . En una modalidad preferida, el término acetato y/o etanol "producido de manera exógena" comprende acetato y/o etanol producido por una célula bacteriana acetogénica o de hecho, la misma célula bacteriana acetogénica como la utilizada en el paso a) , pero retirado del recipiente de reacción, separado de cualquier cuerpo C4 producido y reciclado. En una modalidad preferida, la concentración del acetato y/o etanol producido de manera exógena se mantiene en el medio acuoso al valor o intervalo de valores presente inicialmente, siempre que la reacción catalizada por la célula bacteriana acetogénica en el paso b) continúe. En una modalidad preferida, el acetato y/o etanol en el medio acuoso como un todo, se considera como exógeno, siempre que más que 80, de manera preferida más que 90% del acetato y/o etanol total presente en el medio acuoso se tome en cuenta para el acetato y/o etanol producido de manera exógena.

La mezcla obtenida en el paso a) puede incubarse durante al menos 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 12, 16, 24, 36, 48, 120 ó 160 horas. En una modalidad preferida, un agente reductor está presente en el paso b) . La persona con experiencia en la técnica está familiarizada con los agentes reductores, por ejemplo, agentes que contienen tiol, tales como cisteína o ditionita. La concentración inicial puede ser al menos 0.1, 0.5, 1, 2, 5 o 10 mM.

Se prefiere que el método comprenda reciclar el etanol y/o acetato de la mezcla después del paso b) . En una modalidad preferida, esto significa que algo de la mezcla de reacción del paso b) se elimina y el acetato y/o etanol en la misma se separe de cualquier cuerpo C4 formado, seguido por la transferencia del acetato y/o etanol obtenido de esta manera, nuevamente a la mezcla de reacción. Algo de la mezcla de reacción puede retirarse en el paso b) en un modo por lotes o, de manera preferida, en un modo continuo. En el último caso, la mezcla de reacción retirada de manera continua puede recolectarse antes del paso de separación.

La persona con experiencia en la técnica está familiarizada con los métodos que pueden utilizarse para separar el acetato y/o etanol de cualquier butanol y/o ácido butírico presente en una solución acuosa, por ejemplo, extracción utilizando un solvente orgánico hidrofóbico, destilación o lo similar.

Cualquier compuesto orgánico referido en esta solicitud, por ejemplo, cuerpos C4 , acetato, etanol, butirato y butanol, comprende tanto las formas protonadas del compuesto de interés como las varias sales del compuesto. Por ejemplo, el acetato puede comprender ácido acético (CH3- COOH) , pero también las varias sales del ácido acético, por ejemplo, acetato de sodio (CH3-COO-Na+) , acetato de potasio (CH3-C00-K+) , acetato de amonio (CH3-COO-NH4+) o lo similar.

En una modalidad preferida de la presente invención, la invención se lleva a cabo de un modo continuo, en donde las soluciones acuosas del recipiente utilizado para llevar a cabo los pasos a) y b) se retira de manera continua, separada en una fracción enriquecida en cuerpos C4 , de manera preferida, butanol y/o ácido butírico, y otra fracción enriquecida en acetato y/o etanol, y la última fracción se agrega al recipiente utilizado para llevar a cabo los pasos a) y b) .

La temperatura en los pasos a) y b) necesita elegirse teniendo en mente las necesidades de la célula bacteriana acetogénica por una parte y los parámetros termodinámicos por otra parte. El estado de la técnica enseña los intervalos de temperaturas, así como las temperaturas óptimas para una vasta gama de bacterias acetogénicas . Por ejemplo, Clostridium thermoaceticum puede incubarse a temperaturas de hasta 60°C (Fontaine et al., 1942) . Véase también los libros de texto estándar de microbiología, para las temperaturas que pueden utilizarse para cultivar bacterias acetogénicas y células arquea, por ejemplo, Dworkin et al. (2006) The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria, Volume 2. En una modalidad preferida, la temperatura aplicada en el paso b) es 0 a 100°C, 10 a 80°C, 20 a 60°C y 30 a 45°C. La presión del gas de síntesis aplicada es en una modalidad preferida, 0.5 a 10 bar, de manera más preferida 0.8 a 8, aún de manera más preferida, 1.5 a 6 bar. En otra modalidad preferida, la presión es más que 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 bar. En una modalidad preferida, la presión aplicada excede la presión atmosférica. En una modalidad preferida, la unidad de "sobrepresion", como se refiere en el presente documento, se refiere a la presión con respecto a la presión atmosférica o ambiental local. Por ejemplo, si la presión atmosférica local es 1 bar y la presión dentro de un recipiente es 1.8 bar, entonces la sobrepresion es 0.8 bar (sobrepresion).

Es una fortaleza particular de la presente invención, que la formación de cuerpos C4 , de manera preferida butanol y/o ácido butírico, no depende de la presencia de cantidades significativas de compuestos orgánicos que comprendan cadenas de carbono de más que dos átomos de carbono. En una modalidad preferida, los pasos a) y b) pueden, pero no tienen que llevarse a cabo en la ausencia de carbohidratos. En una modalidad preferida, el término "en la ausencia de carbohidratos" , significa que la concentración de carbohidratos es, en orden de preferencia incrementada, menor que 5, 1, 0.5, 0.1 ó 0.05% (peso por volumen) . En una modalidad preferida, el término "carbohidratos" comprende cualquier compuesto orgánico que tenga al menos dos grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende grupos hidroxilo, aldehido o ceto y comprende una cadena de carbono lineal de cinco o más átomos de carbono. Los carbohidratos ejemplares comprenden hexosas tales como glucosa o fructosa, pentosas tales como ribulosa y azúcares complejos que comprenden dos o más monómeros de carbohidratos, por ejemplo, sacarosa.

De igual manera, se prefiere que el gas de síntesis, en orden de preferencia incrementada, proporciones más que 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% del carbono presente inicialmente en el paso a) . En una modalidad preferida, el término "el gas de síntesis proporciona más que X% del carbono presente inicialmente en el paso a) " , como se utiliza en el presente documento, significa que más que X% de los átomos de carbono presentes en el recipiente de reacción son átomos de carbono en las moléculas de monóxido de carbono o dióxido de carbono. Por ejemplo, el gas de síntesis proporciona más que 90% del carbono presente si 9 moles de dióxido de carbono, menos que 1 mol de metano y algo de hidrógeno están presentes, pero ningún otro compuesto que comprenda al menos un átomo de carbono.

El proceso puede llevarse a cabo en un modo por lotes. Si este caso, el término "incubar la mezcla ... durante al menos X minutos" significa, como se utiliza en el presente documento, en una modalidad preferida, que un lote de las células bacterianas acetogénicas se mantiene durante X minutos bajo las condiciones especificadas, por ejemplo, en la presencia de un medio acuoso, la presencia del gas de síntesis en contacto con la célula bacteriana acetogénica, la temperatura fija, la presencia de etanol y/o acetato y así sucesivamente. De manera alterna, el proceso puede llevarse a cabo en un modo continuo. Si este es el caso, el término "incubar la mezcla ... durante al menos X minutos", significa, como se utiliza en el presente documento, en una modalidad preferida, que el tiempo promedio pasado por una molécula de reactivo, por ejemplo de hidrógeno, en el recipiente o las condiciones especificadas es X minutos. Por ejemplo, si un recipiente hermético al gas comprende 10 litros de hidrógeno, el hidrógeno es agregado a una velocidad de flujo de 1 litro por minuto y la construcción del recipiente es tal que puede suponerse que las moléculas de hidrógeno dejan el recipiente en el orden de entrada, entonces, el tiempo promedio pasado, en otras palabras, el tiempo que la molécula de hidrógeno pasa incubada bajo las condiciones fijas en el recipiente, es de 10 minutos.

Si se considera un proceso a gran escala, puede ser ventajoso llevar a cabo las enseñanzas inventivas en un modo continuo. En una modalidad preferida, el término "modo continuo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un método que comprende la alimentación continua del sustrato en el biorreactor y la eliminación del medio que comprende los productos del biorreactor. El modo continuo puede, además comprender una alimentación constante de los nutrientes. Las células en el biorreactor pueden crecer, de manera alterna, los nutrientes pueden limitarse de manera que el efecto sea que las células alcancen una fase estacionaria, es decir, el crecimiento está limitado por la falta de nutrientes, pero las células permanecen metabólicamente activas y siguen convirtiendo los sustratos tales como el gas de síntesis. En una modalidad preferida, el término "fase estacionaria", como se utiliza en el presente documento, significa que las células que se someten a tal fase son metabólicamente activas, pero esencialmente no se multiplican.

La invención puede llevarse a cabo utilizando cualquier clase de recipiente que permita el mantenimiento de las condiciones anaeróbicas . Si se lleva a cabo a una escala pequeña, puede utilizarse un guante hermético al gas que proporcione un medio con bajo contenido de oxígeno o libre de oxígeno. A una escala grande, un termentador del gas de síntesis de alto volumen parece ser más práctico. En una modalidad preferida, la mezcla de reacción se somete a agitación constante para verificar que las células, nutrientes, sustratos y productos se distribuyen de manera uniforme a través del medio acuoso.

Las herramientas analíticas del estado de la técnica permiten la verificación constante de numerosos compuestos en un biorreactor, por ejemplo, tomando muestras de la mezcla de reacción de manera regular y sometiéndolas a análisis con HPLC. Los parámetros clave tales como el pH y la concentración de los sustratos y productos pueden ajustarse en línea, si se necesita. En una modalidad preferida, la concentración de al menos uno del etanol y el butanol bajo vigilancia constante y los niveles son ajustados a concentraciones compatibles con el crecimiento y la actividad catalítica de la célula bacteriana acetogénica utilizada.

La invención se ilustra además por las siguientes Figuras y los ejemplos no limitantes, de los cuales pueden tomarse las características, modalidades, aspectos y ventajas adicionales de la presente invención.

La Figura 1 muestra la diferencia entre las concentraciones del producto al inicio y al final del cultivo, con respecto al contenido de carbono, como se obtiene en el Ejemplo 1. La unidad "mmolC/l" se refiere a la cantidad de carbono en mmol por litro.

La Figura 2 muestra la diferencia entre las concentraciones del producto al inicio y al final del cultivo, con respecto al contenido de carbono, como se obtiene en el Ejemplo 2. La unidad "mmolC/1" se refiere a la cantidad de carbono en mmol por litro.

La Figura 3 muestra las cantidades del producto al inicio y al final del cultivo, con respecto al contenido de carbono, como se obtiene en el Ejemplo 3, utilizando la cepa de Clostridium drakei .

La Figura 4 muestra la diferencia entre las concentraciones del producto al inicio y al final del cultivo, con respecto al contenido de carbono, como se obtiene en el Ejemplo 3, utilizando la cepa de Clostridium ljungdahlii .

E emplo 1 : Producción de ácido butírico en la ausencia o presencia de etanol Un precultivo de Clostridium carboxidivorans DS Z 15243 se cultivó en botella anaeróbicas de 1 L selladas utilizando un tapón de butilo, que comprende 200 mL de PETC modificado de acuerdo con Hurst, K. M. y Lewis, R. (2010) , Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165, que consiste de i g de extracto de levadura, 19 g de MES, 30 mL de solución de sales minerales, 10 mL de solución de elementos en trazas y 10 mL de solución de vitaminas. La solución de sales minerales comprende 80 g de NaCl, 100 g de cloruro de amonio, 10 g de cloruro de potasio, 10 g de monofosfato de potasio, 20 g de sulfato de magnesio y 4 g de cloruro de calcio por litro. La solución de vitaminas consiste de 0.01 g piridoxina, 0.005 g de tiamina, 0.005 g de riboflavina, 0.005 g de pantotenato de calcio, 0.005 g de thioctacid, 0.005 g de ácido p-aminobenzoico, 0.005 g de ácido nicotínico, 0.005 g de vitamina B12, 0.002 g de ácido fólico y 0.01 g de ESNA por litro. La solución de elementos en trazas consiste de 2 g de ácido nitriloacético, 1 g de nS0 , 0.8 g de sulfato de hierro y amonio, 0.2 g de cloruro de cobalto, 0.2 g de sulfato de zinc, 0.02 g de cloruro de cobre (II), 0.02 g de cloruro de níquel, 0.02 g de molibdato de sodio, 0.02 g de Na2Se04, 0.02 de Na2W04 por litro. El pH se ajustó a 5.9.

Antes de la inoculación, el medio ebulló durante 20 minutos y posteriormente se lavó con nitrógeno puro durante 20 minutos. Posteriormente, se sometió a autoclave a 121°C durante 20 minutos, seguido por enfriamiento, a continuación, se llenó utilizando gas de proceso que comprende 50% de CO, 45% de H2 y 5% de C02 a una sobrepresión de 1 bar. Posteriormente, la presión se ajustó a una sobrepresión de 0.8 bar.

También, antes de la inoculación, se agregaron 1.5 mL de una solución que comprende 4% de cada uno de sulfato de sodio y clorhidrato de cisteína como un agente reductor, bajo condiciones anaeróbicas estériles.

El cultivo creció a 37 °C y 100 rpm. El cultivo se transfirió a medio fresco cada 72 horas.

Para los experimentos, el medio se preparó de la misma forma, utilizando gas de proceso que comprende 95% de CO y 5% de C02. Además, se agregaron 0.6 g por litro de etanol a la mitad de los matraces bajo condiciones anaeróbicas estériles .

Las soluciones se inocularon bajo condiciones anaeróbicas estériles utilizando 10% en volumen de inoculo de un cultivo de 48 horas. Los matraces se agitaron a 37 °C a 100 rpm durante 160 horas. La biomasa seca y la concentración del producto se determinaron al inicio y al final del experimento.

Las concentraciones de ácido acético, etanol, ácido butírico y butanol se determinaron utilizando HPLC. Se utilizó una columna A aminex HPX-87H como una fase estacionaria. Se utilizó ácido sulfúrico 5 mM como un eluyente a una velocidad de flujo constante de 0.6 mL/minuto. La temperatura de la columna fue 40°C. El etanol y el butanol se detectaron utilizando un detector del índice de refracción. Se utilizó un arreglo de diodos a una longitud de onda de 210 nm para detectar el ácido acético y el ácido butírico. Las concentraciones de los compuestos se calcularon mediante integración del pico utilizando gráficas de calibración del compuesto respectivo a las concentraciones definidas .

La Figura 1 muestra la diferencia entre las concentraciones del producto al inicio y al final del cultivo, con respecto al contenido de carbono.

En la presencia de etanol, se formaron 105 nmolC/1 de ácido acético, en comparación con 97.17 mmolC/L formadas en la ausencia de etanol. Se formaron 22.06 mmolC/L de ácido butírico en la presencia de etanol, en comparación con 13.57 mmolC/L en la ausencia de etanol, cuando se utilizaron cantidades iguales de biomasa seca, de manera más específica 480 mg/L.

En resumen, la adición de etanol conduje a un incremento significativo en la cantidad de ácido butírico formado .

Ejemplo 2: Producción de ácido butírico en la ausencia o presencia de acetato El protocolo experimental seguido fue como se describió en el Ejemplo 1, excepto por el hecho de que se agregaron 2 g/L de ácido acético a la mitad de los matraces, en lugar de 0.6 g/L de etanol y que el lote del gas de síntesis utilizado comprendió 50% de monóxido de carbono y 50% de hidrógeno.

La Figura 2 muestra la diferencia entre las concentraciones del producto al inicio y al final del cultivo, con respecto al contenido de carbono. En la presencia de acetato, se formaron 42.13 nmolC/1 de ácido butírico, en comparación con 26.43 mmolC/L formadas en la ausencia de acetato.

En resumen, la adición de acetato también conduce a un incremento en la cantidad de ácido butírico formado.

Ejemplo 3: Producción de ácido butírico en la presencia de acético o etanol, utilizando cepas y mezclas de gases alternativas Medio y soluciones utilizados : ATCC 1754 modificado (medio mínimo PETC) La sustancia se mezcló con vitaminas y elementos en trazas y el volumen se ajustó utilizando agua desmineralizada (agua VE) y el valor de pH con solución de NaOH. Posteriormente, el valor del pH se ajustó a 6.0 utilizando una solución de NaOH, el medio ebulló y se transfirió a botellas- de vidrio de 1 L resistentes a la presión. Posteriormente, el medio se enfrió en hiero y se burbujeó utilizando N2, con el fin de eliminar cualquier oxígeno restante.

Posteriormente, el medio se sometió a autoclave. A continuación, se agregó el agente reductor al medio y el volumen se ajustó utilizando agua VE anaeróbica. El agente reductor se esterilizó de manera separada y se almacenó bajo condiciones anaeróbicas.

ATCC 1754 modificado (PETC) La sustancia, las vitaminas y los elementos en trazas se mezclaron y el volumen se ajustó utilizando agua desmineralizada (agua VE) y el valor del pH con una solución de NaOH. Posteriormente, el valor del pH se ajustó a 6.0 utilizando una solución de NaOH, el medio ebulló y se transfirió a botellas de 1 L resistentes a la presión. Posteriormente, el medios se enfrió en hielo y se burbujeó utilizando N2, con el fin de eliminar cualquier oxígeno restante .

Posteriormente, el medio se sometió a autoclave. A continuación, se agregó el agente reductor al medio y el volumen se ajustó utilizando agua VE anaeróbica. El agente reductor se esterilizó de manera separada y se almacenó bajo condiciones anaeróbicas.

ATCC 1754 modificado (PETC modificado) La sustancia, las vitaminas y los elementos en trazas se mezclaron y el volumen se ajustó utilizando agua desmineralizada (agua VE) y el valor del pH con solución de NaOH. Posteriormente, el valor del pH se ajustó a 6.0 utilizando solución de NaOH, el medio ebulló y se transfirió a botellas de vidrio de 1 L resistentes a la presión. Posteriormente, el medio se enfrió en hielo y se burbujeó utilizando N2 con el fin de eliminar cualquier oxígeno restante .

Posteriormente, el medio se sometió a autoclave. A continuación, se agregó el agente reductor al medio y el volumen se ajustó utilizando agua VE anaeróbica. El agente reductor se esterilizó de manera separada y se almacenó bajo condiciones anaeróbicas. elementos en trazas ATCC 1754 Primero que todo, el ácido nitrilotriacético se disolvió en 1 L de agua desmineralizada (agua VE) , y el valor del pH se ajustó a 6.0 utilizando una solución de KOH. Posteriormente, se agregaron todos los otros reactivos químicos . La solución de elementos en trazas se almacenó a 4°C en la oscuridad.

Vitaminas 141 Las sustancias se disolvieron en 1 L de agua desmineralizada (agua VE) y se congelaron a -20°C en tubos falcon estériles en porciones de 10 mi hasta el uso.

Solución de minerales PETC modificado Las sustancias se disolvieron en 1 L de agua desmineralizada (agua VE) . La solución de minerales se almacenó a 4°C en la oscuridad.

Agente reductor ATCC Primero, todo el NaOH se disolvió en 1 L de agua desmineralizada (agua VE) y ebulló. Posteriormente, la solución se transfirió a una botella de vidrio de 1 L resistente a la presión y se burbujeó utilizando N2 mientras se enfriaba con hielo. Las otras sustancias se agregaron mientras la solución se enfriaba. Posteriormente, el agente reductor se sometió a autoclave durante 20 minutos.

Cepas utilizadas : COX-Cdr-001 (Clostridium drakei) COX-Clj-001 (Clostridium ljungdahlii) Precultivos : Las cepas utilizadas se transfirieron a precultivos utilizando criocultivos de trabajo preparados inmediatamente (antes de los cultivos utilizando 4 mi de cultivo en la fase exponencial y 1 mi de solución de glicerol al 50% para la conservación, almacenamiento a -80°C) . Los precultivos consistieron cada uno de 5 mi de medio ATCC 1754 modificado (PETC) y de un inoculo fijo de las cepas. La densidad ideal del inoculo se determinó en experimentos piloto para la cepa respectiva.

COX-Cdr-001: 0.1% en 5 mi de medio COX-Clj-001: 10% en 5 mi de medio Cultivos : 50 mi de cada uno cualquier medio utilizado se transfirieron a botellas de vidrio estériles de 250 mi, resistentes a la presión, anaeróbicas (libres de oxígeno) y se inocularon utilizando 10% (5 mi) de las cepas utilizadas, tomadas de los precultivos de 3 días preparados recientemente .

Los matraces de los cultivos se cerraron utilizando un tapón estéril de butilo y una tapa roja (que comprende tres orificios perforados) . Se colocaron agujas huecas (compañía Sterican, 0 0.90 x 40 mm) a través de los tres orificios. ü manómetro para controlar la presión se unió a una de las agujas huecas (idealmente, la que está en medio) . Se unieron válvulas a las otras agujas huecas, de manera que el gas agregado, y el gas retirado del matraz de cultivo pudieran controlarse de manera independiente uno del otro.

Cada una de las cepas utilizadas se cultivó por duplicado para los resultados reproducibles directos.

Preparación de los cultivos : Antes de empezar los cultivos reales, las botellas se burbujearon tres veces cada una utilizando gas de síntesis. Esto se hizo uniendo a una de las válvulas un tubo para bombear el gas en la botella y a la otra válvula, un tubo para liberar el gas retirado bajo al campana, en línea con las regulaciones .

Al abrir la válvula con el tubo para agregar el gas, el gas de síntesis se bombeo en el matraz de cultivo hasta que la aguja del manómetro mostró un valor de la presión de 0.8 bar. Posteriormente, la válvula para agregar el gas se cerró y la válvula para retirar el gas se abrió, hasta que la aguja mostró un valor de la presión de 0 bar. Este procedimiento se repitió tres veces para cada matraz de cultivo. Cuando el procedimiento se repitió para la cuarta vez, la presión en la botella se mantuvo, es decir, los cultivos estaban cubiertos con el gas de síntesis.

Las muestras de cultivo estaban listas entonces para el cultivo a 35°C y a 100 rpm en un baño de agua oscilante.

Toma de las muestras : Una o dos veces al día aproximadamente, se retiró 1 mi del cultivo para determinar la densidad óptica a 600 nm (registrando el crecimiento de un cultivo) .

Inicialmente y al final de los experimentos, dos muestras de 1.5 mi cada una se transfirieron a tubos Eppendorf de 2 mi y se utilizaron para el análisis con RMN.

Adición del gas: A intervalos regulares (varias veces al día) la presión dentro del matraz de cultivo se verificó, con el fin de asegurarse que era constante. El crecimiento de los cultivos y sus metabolismos, consumieron cantidades variables del gas de síntesis. En el caso de que la presión disminuyera, se agregó gas adicional como se describió anteriormente. El mismo procedimiento se llevó a cabo si el gas se retiraba del matraz de cultivo antes de tomar una muestra .

Fin del experimento: El experimento terminó después de aproximadamente una semana, burbujeando nitrógeno de manera continua durante 10 minutos, a través de cada matraz de cultivo, antes de retirar las agujas huecas para incrementar la seguridad. Los cultivos se transfirieron a tubos falcon estériles de 50 mi, bajo una campana estéril y se centrifugaron durante 30 minutos a 4500 g. No hubo ya necesidad de trabajar bajo condiciones anaeróbicas. Las pelotillas celulares recuperadas se desecharon y los sobrenadantes de los cultivos se transfirieron a jeringas estériles de 50 mi bajo la campana estéril. Se transfirieron a un nuevo tubo falcon estéril de 50 mi vía un filtro estéril de 0.2 µp? y se congelaron a -20 °C como muestras de respaldo.

Experimento 1 : Cultivo utilizando extracto de levadura y 0.6 g/1 de etanol (BF-DM-12-COX-038) Los experimentos se llevaron a cabo utilizando medio ATCC 1754 modificado (PETC) que comprende 1 g/1 de extracto de levadura. Además, se utilizaron 0.6 g/1 de etanol como una fuente de carbono. La mezcla de gas utilizada comprendió 30% de C02 y 70% de H2.

Experimento 2 : Cultivo utilizando extracto de levadura y 2 g/1 de ácido acético (BF-DM-12-COX-041) El experimento se llevó a cabo como se describió en el experimento 1, excepto que el ácido acético se agregó al medio más que el etanol.

Experimento 3: Cultivo utilizando extracto de levadura (BF-DM-12-COX-042) (experimento comparativo) Para la comparación directa, se utilizó el mismo medio, pero sin la adición de etanol o ácido acético.

Los resultados se describen en las Figuras 3 y 4. En resumen, el efecto mostrado en el Ejemplo l puede reproducirse utilizando mezclas de gas alternas y otras cepas de bacterias acetogénicas .

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir cuerpos C4 , de manera preferida ácido butírico y/o butanol, que comprende los pasos : a) poner en contacto una célula bacteriana acetogénica en un medio acuoso con gas de síntesis bajo condiciones anaeróbicas, y de manera preferida en la ausencia de carbohidratos, b) incubar la mezcla obtenida en el paso a) a una temperatura entre 0 y 100 °C durante al menos 30 minutos, en donde el medio acuoso comprende, en el paso b) , etanol y/o acetato a una concentración combinada total de al menos 0.1 g IT1.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el etanol y/o el acetato es etanol y/o acetato producido de manera exógena.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la concentración combinada total de etanol y/o acetato es 0.5 g a 20 g L"1.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el gas de síntesis comprende 40 a 100, de manera preferida 40 a 95% de CO.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el gas de síntesis comprende menos que 10% de C02.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el gas de síntesis comprende menos que 10% de CO.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el método comprende el paso c) separar y opcionalmente, reciclar el etanol y/o acetato de la mezcla después del paso b) .

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula bacteriana acetogénica se selecciona del grupo que comprende Clostridium, Moorella y Carboxythermus y es de manera preferida Clostridium carboxidivorans .

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el pH en los pasos a) y b) se mantiene entre 3 y 7, de manera preferida 4 a 6, de manera más preferida 5 a 5.5.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el paso b) se lleva a cabo a una temperatura entre 15°C y 45°C, de manera preferida 30°C a 40°C.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el gas de síntesis proporciona más que 80, de manera preferida más que 90% del carbono presente inicialmente en el paso a) .

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el proceso se corre en un modo continuo .

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el paso b) se lleva a cabo en la ausencia de carbohidratos .

14. Un uso de etanol y/o acetato para incrementar la proporción de gas de síntesis convertido por una célula bacteriana acetogénica en un medio acuoso, bajo condiciones anaeróbicas a cuerpos C4 , de manera preferida ácido butírico y/o butanol .

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el etanol y/o el acetato es etanol y/o acetato producido de manera exógena y se agrega de manera preferida al medio acuoso antes de la acumulación de cantidades detectables de etanol y/o acetato producidos de manera endógena por la célula.

16. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en donde el acetato y/o etanol está presente en un medio acuoso que comprende la célula bacteriana acetogénica, a una concentración combinada total de 0.5 a 5 g L"1.

17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde la célula bacteriana acetogénica se selecciona del grupo que comprende Clostridium, Moorella y Carboxythermus y es de manera preferida Clostridium carboxidivorans .