ES2565161T3

ES2565161T3 - Método biotecnológico para producir butanol y ácido butírico

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Publication number: ES2565161T3
Application number: ES13705480.5T
Authority: ES
Inventors: Yvonne Schiemann; Liv Reinecke; Thomas Haas; Dirk Weuster-Botz; Monika Johanna KRISPIN; Wilhelm KRISPIN
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2016-03-31
Anticipated expiration: 2033-02-22
Also published as: US20150284747A1; RU2620982C2; AU2013224116A1; MX2014010045A; EP2817411A1; CN104302778A; EP2631298A1; WO2013124401A1; BR112014020636A2; EP2817411B1; US9765366B2; CA2864443A1; RU2014137950A; JP2015508659A

Abstract

Un método para la preparación de unas entidades químicas de C4 escogidos entre el conjunto formado por ácido butírico, butanol y unos derivados de éstos, en el que el derivado es 2-butanol, 1,4-butanodiol, 2,3-butanodiol, aminobutano, tiobutanol, isobutenol o isobutanol, que comprende las etapas de a) poner en contacto una célula bacteriana acetogénica en un medio acuoso con un gas de síntesis en condiciones anaeróbicas, b) incubar la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperatura comprendida entre 0 y 100 °C durante por lo menos 30 minutos, en donde el medio acuoso comprende, en la etapa b), etanol y/o acetato en una concentración combinada total de por lo menos 0,1 g l-1, en donde el etanol y/o el acetato es/son un etanol y/o un acetato que se ha(n) producido exógenamente.

Description

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DESCRIPCION

Metodo biotecnologico para producir butanol y acido butmco

El presente invento se refiere a un metodo para producir unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida acido butmco y/o butanol, que comprende las etapas de poner en contacto una celula bacteriana acetogenica en un medio acuoso con un gas de smtesis, y de incubar la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperatura comprendida entre 0 y 100 °C durante por lo menos 30 minutos, en donde el medio acuoso comprende, en la etapa b), etanol y/o acetato en una concentracion combinada total de por lo menos 0,1 g l-1.

La era de los combustibles fosiles no renovables esta llegando a su fin. Mientras que los profesionales qmmicos han sido capaces hasta ahora de confiar en un suministro virtualmente ilimitado de carbon, petroleo y gas natural, la disponibilidad de tales recursos, formados por bacterias, plancton, plantas y materia animal, que se han enterrado en sedimentos oceanicos a lo largo de millones de anos, esta sentenciada a ser limitada en un futuro muy cercano. Ademas de esto, el hecho de quemar combustibles fosiles ha estado vinculado con el aumento de las concentraciones de CO2 en la atmosfera y con unos cambios climaticos asociados, de manera sumamente notable con el calentamiento global. Por lo tanto, la proxima generacion de procedimientos para la produccion de productos qmmicos a granel tales como butanol, acido butmco y derivados de estos, que se derivan convencionalmente de los recursos fosiles, tendra que partir de unos recursos renovables, es decir de unos materiales que sean renovables de una manera facil y, en el marco de unas escalas de tiempo geologicas, rapida.

La biotecnologfa industrial, es decir la aplicacion de unos biocatalizadores tales como unas enzimas o unos organismos que son catalfticamente competentes como catalizadores industriales, ofrece unas alternativas a muchos procedimientos convencionales que usan unos recursos fosiles como materiales de partida. Los biocatalizadores no solamente son capaces de convertir a unos compuestos preparados a partir de unos materiales renovables, que son frecuentemente unos productos de desecho agncolas o de procesos, que de otro modo tendnan que ser desechados, sino que ellos no requieren el uso de unos compuestos toxicos y, no en ultimo termino, reducen las emisiones de gases con un efecto de invernadero, en comparacion con los enfoques convencionales.

En la tecnica anterior se ha informado acerca de numerosos metodos para producir butanol (CH3-CH2-CH2-CH2-OH) y acido butmco (CH3-CH2-CH2-COOH, al que tambien se hace referencia como butirato), y unos derivados de C4 (es decir con 4 atomos de carbono) de estos, pero la mayor parte de estos conffan en craquear a los combustibles fosiles y en oxidar a los resultantes hidrocarburos de cadena corta. En contraste con esto, se han descrito pocos procedimientos que partan del carbono en la forma de monoxido de carbono o de dioxido de carbono, unos compuestos que estan disponibles a partir de gases de escape y, por ejemplo, de un gas de smtesis. Chen y colaboradores (1999) divulgan el uso de glucosa para la produccion de disolventes.

Un gas de smtesis, que es un concepto que se refiere a diversas mezclas que comprenden por lo menos un producto escogido entre agua e hidrogeno, y por lo menos un producto escogido entre monoxido de carbono y dioxido de carbono, es una fuente renovable de carbono, y esta facilmente disponible a lo largo de todo el mundo, puesto que se conocen unos procedimientos para su produccion que usan diversos materiales de partida, que incluyen reformar con vapor de agua un gas natural o unos hidrocarburos lfquidos, y la gasificacion de carbon o de una biomasa.

El uso de un gas de smtesis para la produccion de unos compuestos que comprenden cadenas de carbono, ha sido informado en la tecnica anterior. Sin embargo, los procedimientos que se han descrito con anterioridad dependen de la adicion de unos substratos adicionales, en particular de unos hidratos de carbono tales como glucosa. Unos procedimientos que estan basados en el consumo microbiano de un gas de smtesis como una fuente de carbono conducen a unos rendimientos bastante insatisfactorios de los compuestos deseados.

Por lo tanto, el problema que constituye el fundamento del presente invento consiste en proporcionar un metodo para producir unas entidades qmmicas de C4, que se escogen entre butanol y/o acido butmco, partiendo de un gas de smtesis.

Otro problema que constituye el fundamento del presente invento consiste en proporcionar un metodo para producir unas entidades qmmicas de C4 partiendo de un gas de smtesis, en el que se mejore el rendimiento de estos productos de C4, en relacion con los reaccionantes que contienen carbono, distintos del monoxido de carbono y del dioxido de carbono, es decir que se reduzca la cantidad de compuestos de carbono distintos del monoxido de carbono y del dioxido de carbono, requerida para la smtesis .

En un primer aspecto, el problema que constituye el fundamento del presento invento se resuelve mediante un metodo para producir unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida acido butmco y/o butanol, que comprende las siguientes etapas:

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a) poner en contacto una celula bacteriana acetogenica en un medio acuoso con un gas de smtesis en condiciones anaerobicas,

b) incubar la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperature comprendida entre 0 y 100 °C durante por lo menos 30 minutos,

en donde el medio acuoso comprende, en la etapa b), etanol y/o acetato en una concentracion combinada total que excede de 0,1 g l-1, en donde el etanol y/o el acetato es o son un etanol y/o un acetato que se han producido exogenamente.

En una primera forma de realizacion del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que la concentracion combinada total de etanol y/o acetato es de 0,5 g l-1 a 20 g l-1.

En una segunda forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de la primera forma de realizacion del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el gas de smtesis comprende de 40 a 100 %, de manera preferida de 40 a 95 % de CO.

En una tercera forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta segunda del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el gas de smtesis comprende menos que 10 % de CO2.

En una cuarta forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta tercera del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el gas de smtesis comprende menos que 10 % de CO.

En una quinta forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta cuarta del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el metodo comprende la etapa de

c) separar y, opcionalmente, reciclar etanol y/o acetato a partir de la mezcla que se ha obtenido despues de la etapa b).

En una sexta forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta quinta del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo, en el que la celula bacteriana acetogenica se escoge entre el conjunto que se compone de Clostridium, Moorella y Carboxythermus y de manera preferida es la Clostridium carboxidivorans.

En una septima forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta sexta del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el valor del pH en las etapas a) y b) se mantiene entre 3 y 7, de manera preferida es de 4 a 6, y de manera mas preferida es de 5 a 5,5.

En una octava forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta septima del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que la etapa b) se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 15 °C y 45 °C, de manera preferida de 30 °C hasta 40 °C.

En una novena forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta octava del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el gas de smtesis proporciona mas de un 80 %, de manera preferida mas de un 90 %, del carbono que esta presente inicialmente en la etapa a).

En una decima forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta novena del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo en el que el procedimiento se realiza de un modo continuo.

En una undecima forma de realizacion del primer aspecto, que es tambien una forma de realizacion de las formas de realizacion primera hasta decima del primer aspecto, en la que la etapa b) se lleva a cabo en la ausencia de hidratos de carbono.

El problema que constituye el fundamento del presente invento se resuelve, en un segundo aspecto, mediante una el uso de etanol y/o acetato para aumentar la proporcion del gas de smtesis que ha sido convertido por una celula bacteriana acetogenica en unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida acido butmco y/o butanol, en el que el etanol y/o el acetato es, o son, un etanol y/o un acetato que se ha(n) producido exogenamente, y de manera preferida se anade(n) a un medio acuoso que comprende la celula bacteriana acetogenica, antes de la acumulacion de unas cantidades detectables del etanol y/o del acetato que se ha(n) producido endogenamente por dicha celula.

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En una primera forma de realizacion del segundo aspecto, el problema se resuelve mediante un metodo, en el que el acetato y/o el etanol esta(n) presente(s) en un medio acuoso que comprende la celula bacteriana acetogenica en una concentracion combinada total de etanol y/o de acetato que excede de 0,5 g l-1, pero no de 20 g l-1.

En una segunda forma de realizacion del segundo aspecto, que es tambien una forma de realizacion de la primera forma de realizacion del segundo aspecto, el problema se resuelve mediante un uso, en el que la celula bacteriana acetogenica se escoge entre el conjunto que se compone de Clostridium, Moorella y Carboxythermus y de manera preferida es la Clostridium carboxidivorans.

Sin querer estar vinculados a ninguna teona, los autores del presente invento han establecido la teona de que la presencia de etanol o acetato induce una expresion de unos genes que son esenciales para la conversion de un gas de smtesis en unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida en butanol y/o acido butmco, aumentando de esta manera la capacidad de una celula bacteriana acetogenica para metabolizar al monoxido de carbono y al dioxido de carbono procedentes de un gas de smtesis.

El presente invento se centra en torno a la produccion de unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida de butanol y/o acido butmco, usando una celula bacteriana acetogenica. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "celula bacteriana acetogenica", tal como se usa en el presente contexto, se refiere a una celula de bacteria o arquea, que es capaz de producir el acetato en unas condiciones anaerobicas, de manera preferida usando hidrogeno como un donante de electrones y dioxido de carbono como un aceptor de electrones o monoxido de carbono en lugar de dioxido de carbono. En la tecnica anterior se ha divulgado una multitud de bacterias acetogenicas, que incluyen, pero no se restringen a, Clostridium aceticum (Wieringa, K. T. (1936), J. Microbiol. Serol. 3, 263-273), Acetobacterium woodi (Balch, W. E., Schobert, S., Tanner, R. S., y Wolfe, R. S. (1977), Int. J. Sys. Bacteriol. 27, 335-361), Clostridium thermaceticum (Fontaine, F. E, Peterson, W. H., McCoy, E. y Johnson, M. J. (1942), J. Bact. 43, 701-715), Clostridium lungdahlii (documento de solicitud de patente internacional WO0068407), Clostridium autoethanogenum (Aribini y colaboradores, Archives of Microbiology 161, 345-351), Moorella sp. HUC22- 1 (Sakai y colaboradores, Biotechnology Letters 29, 1697-1612) y las del genero Carboxydothermus (Svetlichny y colaboradores (1991), Systematic and Applied Microbiology 14, 254-260). Estas y otras celulas bacterianas acetogenicas estan disponibles comercialmente, por ejemplo, a partir de la American Tissue and Culture Collection (ATTC) ((Coleccion norteamericana de tejidos y cultivos), EE.UU., o de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares) GmbH), Braunschweig, Alemania. Por lo tanto, dentro del alcance del presente invento se encuentra el uso de un cultivo mixto que comprende por lo menos dos celulas bacterianas acetogenicas.

El concepto de "entidad qmmica de C4", tal como se usa en el presente contexto, se refiere a butanol o butirato o a un derivado que se ha obtenido mediante una derivatizacion que implica cualquier reaccion distinta de las reacciones que implican una "adicion o retirada neta" de atomos de carbono, para dar butanol o butirato, que incluyen, pero no estan restringidas a, una oxidacion, en particular a una hidroxilacion, a una reduccion, y a unos desplazamientos de grupos metilo, en donde el concepto de "adicion o retirada neta de atomos de carbono" no excluye a una adicion o retirada provisional de atomos de carbono, por ejemplo, atar a la entidad qmmica de C4 o de su derivado, de una manera provisional, a una enzima o a un cofactor de esta. Unas entidades qmmicas de C4 son 1-butanol (al que se hace referencia en esta solicitud como "butanol"), 2-butanol, el ion butirato (o acido butmco), 1,4-butanodiol, 2,3-butanodiol, aminobutano, tiobutanol, isobutenol e isobutanol.

El presente invento considera el uso tanto de unas celulas bacterianas acetogenicas de tipo silvestre como de unas celulas bacterianas acetogenicas modificadas geneticamente. En una forma preferida de realizacion, una celula bacteriana acetogenica modificada geneticamente es una celula bacteriana acetogenica que ha sido modificada de tal manera que la actividad de por lo menos una enzima que esta implicada en la ruta metabolica de Wood- Ljungdahl, es decir la ruta metabolica que transforma en acetato al monoxido de carbono, al dioxido de carbono y al hidrogeno. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "una enzima que participa en la ruta metabolica de Wood-Ljungdahl", tal como se usa en el presente contexto, comprende cualquier enzima que se fija o que, de manera preferida, acepta como un substrato, a uno de los substratos de dicha ruta metabolica, de manera preferida monoxido de carbono, dioxido de carbono o hidrogeno, o a uno cualquiera de los compuestos intermedios que se han formado en esta ruta metabolica a partir de uno cualquiera de estos substratos, cuando los substratos se convierten en acetato o en unos derivados de este. En otra forma preferida de realizacion, el concepto de "una enzima que participa en la ruta metabolica de Wood-Ljungdahl", tal como se usa en el presente contexto, se refiere a una enzima tomada del conjunto que se compone de CO deshidrogenasa y de acetil-CoA sintetasa (Diekert y Wohlfahrt (1994), Antonie van Leeuwenhoek 66 (1-3), 209-221). Unas tecnicas que se pueden usar para modificar geneticamente a las celulas bacterianas se han descrito en la tecnica anterior, por ejemplo, en la obra de Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), asf como unos metodos para aumentar la actividad de una enzima en una celula bacteriana, por ejemplo, aumentando la expresion del gen que codifica la enzima que tiene la actividad interesante, por intermedio de una amplificacion del gen cromosomico (veanse los documentos WO 03/014330 y WO 03/040373). En una forma preferida de realizacion, la celula bacteriana acetogenica se escoge entre el conjunto que se compone de Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei y Clostridium ljungdahlii.

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Es esencial que el procedimiento se lleve a cabo en condiciones anaerobicas. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "condiciones anaerobicas", tal como se usa en el presente contexto, significa que la saturacion con oxfgeno en una solucion interesante es, en un orden de preferencia creciente, una saturacion de menos que 30, 20, 10, 5, 2,5 o 1 por ciento, en donde una saturacion de 100 % representa a la concentracion de oxfgeno que esta presente si la solucion es rociada extensamente con oxfgeno gaseoso puro en unas condiciones comparables, por ejemplo a 20 °C bajo la presion atmosferica. Con respecto a un gas, el concepto de "condiciones anaerobicas", tal como se usa en el presente contexto, significa que, en una forma preferida de realizacion, el gas comprende, en un orden de preferencia creciente y con referencia al volumen total, menos que 30, 20, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 0,1, 0,01 % de oxfgeno. En otra forma preferida de realizacion, el concepto de "condiciones anaerobicas", tal como se usa en el presente contexto, significa que la concentracion de oxfgeno, bien sea en una mezcla gaseosa o en una solucion, es tan alta que no inhibe al crecimiento de unas bacterias acetogenicas anaerobicas, de manera preferida a la Clostridium carboxidivorans. Un experto en la especialidad esta familiarizado con unas tecnicas que se pueden usar para hacer anaerobicos/as a los recipientes de reaccion y a las soluciones, por ejemplo barriendo con nitrogeno, argon o similares a un recipiente estanco a los gases y a unas soluciones, o complementando unas soluciones acuosas con unos sistemas enzimaticos que consumen oxfgeno, por ejemplo 0,6 % (p/v = peso/volumen) de p-D- glucosa, 0,5 unidades ml-1 de glucosa oxidasa (de Sigma) y 200 unidades ml-1 de catalasa (de Sigma) tal como ha sido descrito por Richter, C. D. y colaboradores (2002), J. Biol. Chem. 277 (5), 3.094-3.100.

Un gas de smtesis es la fuente principal de carbono para producir de acuerdo con el invento unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida butanol y/o acido butmco. El concepto de "gas de smtesis", tal como se usa en el presente contexto, se refiere a una mezcla que comprende por lo menos un producto qmmico escogido entre agua e hidrogeno (H2) y por lo menos monoxido de carbono (CO) y opcionalmente dioxido de carbono (CO2), en la que el volumen combinado total de agua, hidrogeno, monoxido de carbono y dioxido de carbono es por lo menos de 80, de manera preferida por lo menos de 90 por ciento del volumen total de la mezcla. Otros componentes comprenden nitrogeno, gases nobles y similares. En una forma preferida de realizacion, el gas de smtesis comprende de 40 a 95% de monoxido de carbono. En una forma preferida de realizacion el gas de smtesis comprende de 40 a 100, de manera preferida de 40 a 95 % de dioxido de carbono y de 0,5 a 20 % de H2. En otra forma preferida de realizacion, el gas de smtesis comprende menos que 10 % de dioxido de carbono. En otra forma preferida de realizacion, el gas de smtesis comprende menos que 10 % de monoxido de carbono. En otra forma preferida de realizacion, el gas de smtesis comprende por lo menos 5, preferiblemente 10 % de monoxido de carbono. En otra forma preferida de realizacion, el volumen combinado total de hidrogeno y de dioxido de carbono es, en un orden de preferencia creciente, de mas que 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del volumen total de la mezcla. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "poner en contacto" a un microorganismo con un "gas de smtesis" que tiene cualquier composicion especificada en este invento, tal como se usa en el presente contexto, significa que el microorganismo esta presente en una atmosfera que se compone de un gas de smtesis con la composicion especificada.

De acuerdo con el metodo del invento, la celula bacteriana acetogenica se pone en contacto con un gas de smtesis en un medio acuoso, en la ausencia de oxfgeno. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "medio acuoso" comprende cualquier solucion acuosa que comprenda las cantidades de sales y tampones que se necesitan para hacer crecer o mantener viva a una celula bacteriana acetogenica, y para mantener la acetogenesis. Por ejemplo, un medio acuoso de acuerdo con Hurst, K. M., y Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165 se puede usar para llevar a cabo las ensenanzas del invento. En una forma preferida de realizacion, el medio acuoso comprende un extracto de levadura.

Un aspecto crucial del presente invento es que el etanol (CH3-CH2-OH) y/o el acetato (CH3-COO') esta(n) presente(s) en el medio acuoso desde el comienzo de la reaccion en una concentracion combinada total, es decir, que la suma de la concentracion del cation de acetato y de la concentracion de etanol, es de por lo menos 0,1 g l-1. En otras formas preferidas de realizacion, la concentracion de etanol y/o etanol es de 0,1 a 50, de 0,2 a 40, de 0,25 a 20 o de 0,5 a 20 g l-1.

En vez de esperar a que la celula produzca un acetato endogeno, en la etapa a), en el medio acuoso esta(n) presente(s) inicialmente un acetato y/o un etanol producido(s) exogenamente. En una forma preferida de realizacion, el concepto de “un acetato y/o un etanol producido(s) exogenamente", tal como se usa en el presente contexto, se refiere a un acetato o a un etanol producido o purificado en un recipiente de reaccion separado antes de entrar en contacto con una celula bacteriana acetogenica, en contraste con el acetato y/o el etanol que se produce(n) en la etapa b), es decir despues de la etapa a). En una forma preferida de realizacion, el concepto de un acetato y/o un etanol “producido(s) exogenamente", comprende un acetato y/o un etanol producido(s) por una celula bacteriana acetogenica o, de hecho, por la misma celula bacteriana acetogenica que se ha usado en la etapa a), pero retirada desde el recipiente de reaccion, separada de cualquier entidad qmmica de C4 producida y reciclada. En una forma preferida de realizacion, la concentracion del acetato y/o del etanol producido(s) exogenamente se mantiene en el medio acuoso en el valor o en el intervalo de valores que esta presente inicialmente, siempre y cuando que continue la reaccion catalizada por la celula bacteriana acetogenica en la etapa b). En una forma preferida de realizacion, el acetato y/o el etanol en el medio acuoso global se considera(n) como exogeno(s) siempre y cuando que mas de un 80, de manera preferida mas de un 90 %, del acetato y/o del etanol total(es) presente(s) en el medio acuoso proceda del acetato y/o del etanol producido(s) exogenamente.

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La mezcla obtenida en la etapa a) puede ser incubada durante por lo menos 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 12, 16, 24, 36, 48, 120 o 160 horas. En una forma preferida de realizacion, en la etapa b) esta presente un agente reductor. Un experto en la especialidad esta familiarizado con unos agentes reductores, por ejemplo con unos agentes que contienen grupos de tiol, tales como cistema o ditionito. La concentracion inicial puede ser de por lo menos 0,1, 0,5, 1, 2, 5 o 10 mM.

Se prefiere que el metodo comprenda reciclar etanol y/o acetato a partir de la mezcla resultante despues de la etapa b). En una forma preferida de realizacion, esto significa que alguna cantidad de la mezcla de reaccion procedente de la etapa b) se retira y que el acetato y/o el etanol allf presente(s) se separa(n) respecto de cualquier entidad qmmica de C4 que se haya formado, seguido por transferir de retorno a la mezcla de reaccion el acetato y/o el etanol obtenido(s) de esta manera. Alguna cantidad de la mezcla de reaccion puede ser retirada en la etapa b) de un modo discontinuo (por tandas) o, de manera preferida, de un modo continuo. En el ultimo caso, la mezcla de reaccion que se ha retirado continuamente puede ser recogida antes de la etapa de separacion.

Un experto en la especialidad esta familiarizado con unos metodos que se pueden usar para separar el acetato y/o el etanol con respecto de cualquier cantidad de butanol y/o acido butmco que esta presente en una solucion acuosa, por ejemplo una extraccion usando un disolvente organico hidrofobo, una destilacion o algo similar.

Cualquier compuesto organico al que se hace referencia en este invento, por ejemplo, unas entidades qmmicas de C4, acetato, etanol, butirato y butanol, comprende tanto las formas protonadas del compuesto interesante asf como tambien las diversas sales del compuesto. Por ejemplo, el concepto de acetato puede comprender tanto acido acetico (CH3-COOH), asf como tambien las diversas sales de acido acetico, por ejemplo, acetato de sodio (CH3- COO" Na+), acetato de potasio (CH3-COO" K+), acetato de amonio (CH3-COO" NH4+) o unas sales similares.

En una forma preferida de realizacion del presente invento, este invento se lleva a cabo de un modo continuo, en el que las soluciones acuosas se retiran continuamente desde el recipiente que se ha usado para llevar a cabo las etapas a) y b), se separan en una fraccion enriquecida con entidades qmmicas de C4, de manera preferida con butanol y/o acido butmco, y otra fraccion enriquecida con acetato y/o etanol, y esta ultima fraccion se anade al recipiente que se ha usado para llevar a cabo las etapas a) y b).

La temperatura en las etapas a) y b) se tiene que escoger tomando en cuenta las necesidades de la celula bacteriana acetogenica, por una parte, y los parametros termodinamicos, por otra parte. El estado de la tecnica ensena unos intervalos de temperaturas asf como unas temperaturas optimas para una enorme gama de bacterias acetogenicas. Por ejemplo, la Clostridium thermoaceticum puede ser incubada a unas temperaturas de hasta 60 °C (Fontaine y colaboradores, 1942). Veanse tambien los libros de texto clasicos de microbiologfa, en lo referente a las temperaturas que se pueden usar para hacer crecer celulas de bacterias acetogenicas y arqueas, por ejemplo Dworkin y colaboradores (2006) The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria [Los procariotas, un manual sobre la biologfa de las bacterias], tomo 2. En una forma preferida de realizacion, la temperatura aplicada en la etapa b) es de 0 a 100 °C, de 10 a 80 °C, de 20 a 60 °C y de 30 a 45 °C. En una forma preferida de realizacion, la presion aplicada del gas de smtesis es de 0,5 a 10 bares, de manera mas preferida de 0,8 a 8, de manera todavfa mas preferida de 1,5 a 6 bares. En otra forma preferida de realizacion, la presion aplicada es superior a la presion atmosferica. En otra forma preferida de realizacion, la presion es de mas que 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 bares. En una forma preferida de realizacion, la presion aplicada es superior a la presion atmosferica. En una forma preferida de realizacion, la unidad de "presion manometrica" (en ingles "gauge pressure"), tal como se menciona en el presente contexto, se refiere a la presion relativa a la presion atmosferica local o del medio ambiente. Por ejemplo, si la presion atmosferica local es de 1 bar y la presion en el interior de un recipiente es de 1,8 bares, luego la presion manometrica es de 0,8 bares (de presion manometrica).

Constituye un punto fuerte del presente invento el hecho de que la formacion de unas entidades qmmicas de C4, de manera preferida butanol y/o acido butmco, no depende de la presencia de unas cantidades significativas de unos compuestos organicos que comprenden cadenas de carbonos con mas de dos atomos de carbono. En una forma preferida de realizacion, las etapas a) y b) pueden, pero no tienen forzosamente que, llevarse a cabo en la ausencia de hidratos de carbono. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "en la ausencia de hidratos de carbono" significa que la concentracion de hidratos de carbono es, en un orden de preferencia creciente, menor que 5, 1, 0,5, 0,1 o 0,05 % (en peso por volumen). En una forma preferida de realizacion, el concepto de "hidratos de carbono" comprende cualquier compuesto organico que tiene por lo menos dos grupos funcionales que se escogen entre el conjunto que comprende grupos hidroxilo, aldehudo o ceto, y que comprende una cadena lineal de carbonos con cinco o mas atomos de carbono. Unos hidratos de carbono ejemplificativos comprenden unas hexosas tales como glucosa o fructosa, unas pentosas tales como ribulosa, y unos azucares complejos que comprenden dos o mas monomeros de hidratos de carbono, por ejemplo sacarosa.

De manera similar, se prefiere que el gas de smtesis, en un orden de preferencia creciente, proporcione mas de 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % del carbono que esta presente inicialmente en la etapa a). En una forma preferida de realizacion, el concepto de "el gas de smtesis proporciona mas de X % del carbono presente inicialmente en la etapa a)", tal como se usa en este contexto, significa que mas de X % de los atomos de carbono que estan presentes en el

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recipiente de reaccion son unos atomos de carbono que estan contenidos en unas moleculas de monoxido de carbono o de dioxido de carbono. Por ejemplo, el gas de smtesis proporciona mas de un 90 % del carbono presente si estan presentes 9 moles de dioxido de carbono, menos de 1 mol de metano y alguna cantidad de hidrogeno, pero nada de otros cuerpos que comprenden por lo menos un atomo de carbono.

El procedimiento se puede llevar a cabo en un modo por tandas. En el presente contexto, el concepto de "incubar la mezcla.... durante por lo menos X minutos" significa, tal como se usa en este contexto, en una forma preferida de realizacion, que una tanda de celulas de bacterias acetogenicas se mantiene durante X minutos en las condiciones especificadas, por ejemplo en la presencia de un medio acuoso, en la presencia de un gas de smtesis que esta en contacto con la celula bacteriana acetogenica, la temperatura que se ajuste, en la presencia de etanol y/o acetato, y asf sucesivamente. De manera alternativa, el procedimiento se puede llevar a cabo en un modo continuo. Si este es el caso, el concepto de "incubar la mezcla.... durante por lo menos X minutos" significa, tal como se usa en este contexto, en una forma preferida de realizacion, que el penodo de tiempo promedio consumido por una molecula de un reaccionante, por ejemplo de hidrogeno, en el recipiente o en las condiciones especificadas es de X minutos. Por ejemplo, si un recipiente estanco a los gases comprende 10 litros de hidrogeno, el hidrogeno se anade en un caudal (una velocidad de flujo) de 1 litro por minuto, y si la construccion del recipiente es tal que se pueda presuponer que las moleculas de hidrogeno abandonan el recipiente en el orden de entrada, entonces el penodo de tiempo promedio consumido, en otras palabras el penodo de tiempo que la molecula de hidrogeno consume incubada en las condiciones establecidas en el recipiente, es de 10 minutos.

Si esta previsto realizar un procedimiento a gran escala tecnica, puede ser ventajoso llevar a cabo las ensenanzas del invento en un modo continuo. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "modo continuo", tal como se usa en este contexto, se refiere a un metodo que comprende una alimentacion continua del substrato en el biorreactor y una retirada de un medio que comprende unos productos desde el biorreactor. El modo continuo puede comprender adicionalmente una alimentacion constante de nutrientes. Las celulas en el biorreactor pueden crecer, y alternativamente, los nutrientes pueden ser limitados al efecto de que las celulas alcancen una fase estacionaria, es decir que el crecimiento esta limitado por la carencia de nutrientes, pero las celulas permanecen metabolicamente activas y mantienen en conversion a unos substratos tales como un gas de smtesis. En una forma preferida de realizacion, el concepto de "fase estacionaria", tal como se usa en este contexto, significa que las celulas que estan siendo sometidas a la accion de esa fase son metabolicamente activas pero esencialmente no se multiplican ni reproducen.

El invento se puede llevar a cabo usando cualquier tipo de recipiente que permita el mantenimiento de unas condiciones anaerobicas. Si se lleva a cabo a una pequena escala, entonces se puede usar un guante estanco a los gases que proporciona un entorno bajo en oxfgeno o exento de oxfgeno. A una gran escala, un fermentador de gas de smtesis de alto volumen manifiesta ser mas practico. En una forma preferida de realizacion, la mezcla de reaccion se somete a una agitacion constante para asegurarse de que las celulas, los nutrientes, los substratos y los productos estan siendo distribuidos uniformemente a lo largo del medio acuoso.

Unas herramientas analfticas de acuerdo con el estado de la tecnica permiten la vigilancia constante de los numerosos compuestos en un biorreactor, por ejemplo, tomando regularmente muestras de la mezcla de reaccion y sometiendolas a un analisis por HPLC (= cromatograffa de fase lfquida de alto rendimiento). Unos parametros claves tales como el valor del pH y la concentracion de los substratos y de los productos se pueden ajustar “on line” en caso de ser necesario. En una forma preferida de realizacion, la concentracion de por lo menos un compuesto escogido entre etanol y butanol se mantiene bajo una vigilancia constante y sus niveles son ajustados a unas concentraciones que son compatibles con el crecimiento y con la actividad catalftica de la celula bacteriana acetogenica usada.

El invento se ilustra aun mas mediante las siguientes Figuras y Ejemplos.

La Fig. 1 muestra la diferencia entre las concentraciones de los productos al comienzo y al final de la cultivacion, referidas al contenido de carbono obtenido en el Ejemplo 1. La unidad "mmolC/l" se refiere a la cantidad de carbono en milimoles por litro.

La Fig. 2 muestra la diferencia entre las concentraciones de los productos al comienzo y al final de la cultivacion, referidas al contenido de carbono obtenido en el Ejemplo 2. La unidad "mmolC/l" se refiere a la cantidad de carbono en milimoles por litro.

La Fig. 3 muestra las cantidades de los productos al comienzo y al final del cultivo referidas al contenido de carbono obtenido en el Ejemplo 3 usando la cepa Clostridium drakei.

La Fig. 4 muestra la diferencia entre las concentraciones de los productos al comienzo y al final de la cultivacion referidas al contenido de carbono obtenido en el Ejemplo 3 usando la cepa Clostridiumljungdahlii.

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Ejemplo 1: Preparacion de acido butirico en la ausencia o presencia de etanol

Un cultivo previo de Clostridium carboxidivorans DSN 15243 se hizo crecer en unas botellas anaerobicas con una capacidad de 1 l cerradas hermeticamente usando un diafragma de caucho butilico, que comprende 200 ml de un medio PETC modificado de acuerdo con Hurst, K. M., y Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165, que se compone de 1 g de un extracto de levadura, 19 g de un MES, 30 ml de una solucion de sales inorganicas, 10 ml de una solucion de elementos traza y 10 ml de una solucion de vitaminas. La solucion de sales inorganicas comprende 80 g de NaCl, 100 g de cloruro de amonio, 10 g de cloruro de potasio, 10 g de monofosfato de potasio, 20 g sulfato de magnesio y 4 g de cloruro de calcio por litro. La solucion de vitaminas se compone de 0,01 g de piridoxina, 0,005 g de tiamina, 0,005 g de riboflavina, 0,005 g de pantotenato de calcio, 0,005 g de acido tioctico, 0,005 g de acido p-aminobenzoico, 0,005 g de acido nicotmico, 0,005 de vitamina B12, 0,002 g de acido folico y 0,01 g de MESNA por litro. La solucion de elementos traza se compone de 2 g de acido nitriloacetico, 1 g de MnSO4, 0,8 g de sulfato de amonio y hierro, 0,2 g de cloruro de cobalto, 0,2 g de sulfato de zinc, 0,02 g de cloruro de cobre(II), 0,02 g de cloruro de mquel, 0,02 g de molibdato de sodio, 0,02 g de Na2SeO4, 0,02 de Na2WO4 por litro. El valor del pH se ajusto a 5,9.

Antes de la inoculacion, el medio se hirvio durante 20 minutos y a continuacion se barrio con nitrogeno puro durante 20 minutos. A continuacion, el se autoclavo a 121 °C durante 20 minutos, seguido por un enfriamiento, luego se relleno usando un gas de proceso que comprendfa 50 % de CO, 45 % de H2 y 5 % de CO2 a una presion manometrica de 1 bar. A continuacion, la presion se ajusto a una presion manometrica de 0,8 bares.

Tambien, antes de la inoculacion, se anadieron 1,5 ml de una solucion que comprendfa en cada caso 4 % de sulfato de sodio e hidrocloruro de cistema como agente reductor en unas condiciones anaerobicas esteriles.

El cultivo se hizo crecer a 37 °C y 100 rpm. El cultivo se transfirio a un medio fresco (de nueva aportacion) una vez cada 72 horas.

Para los experimentos, el medio se preparo de la misma manera usando un gas de proceso que comprendfa 95 % de CO y 5 % de CO2. Adicionalmente, se anadieron 0,6 g por litro de etanol a la mitad de los matraces en condiciones anaerobicas esteriles.

Las soluciones se incubaron en unas condiciones anaerobicas esteriles usando 10 % en volumen de un inoculo procedente de un cultivo realizado durante 48 horas. Los matraces se sacudieron a 37 °C y a 100 rpm durante 160 horas. La biomasa seca y las concentraciones de los productos se determinaron al comienzo y al final del experimento.

Las concentraciones de acido acetico, etanol, acido butmco y butanol se determinaron usando una HPLC. Una columna de Aminex HPX-87H se utilizo como una fase estacionaria. Como un agente eluyente se anadio acido sulfurico 5 mM en un caudal constante de 0,6 ml/min. La temperatura de la columna fue de 40 °C. El etanol y el butanol se detectaron usando un detector del mdice de refraccion. Se utilizo un detector de matriz de diodos en una longitud de onda de 210 nm para detectar el acido acetico y el acido butmco. Las concentraciones de los compuestos se calcularon mediante una integracion del pico usando unos diagramas de calibracion del respectivo compuesto en unas concentraciones definidas.

La Fig. 1 muestra la diferencia entre las concentraciones de los productos al comienzo y al final de la cultivacion, referidas al contenido de carbono.

En la presencia de etanol se formaron 105 nmolC/l de acido acetico en comparacion con los 97,17 mmolC/l formados en la ausencia de etanol. Se formaron 22,06 mmolC/l de acido butmco en la presencia de etanol en comparacion con los 13,57 mmolC/l formados en la ausencia de etanol, cuando se usaron unas cantidades iguales de la biomasa seca, mas espedficamente de 480 mg/l.

En resumen, la adicion de etanol conduce a un aumento significativo de la cantidad formada de acido butmco. Ejemplo 2: Produccion de acido butirico en la ausencia o presencia de un acetato

El protocolo experimental que se siguio fue como se ha descrito en el Ejemplo 1, exceptuando el hecho de que se

anadieron 2 g/l de acido acetico a la mitad del matraz en lugar de 0,6 g/l de etanol y de que la tanda del gas de

smtesis usado contema 50 % de monoxido de carbono y 50 % de hidrogeno.

La Fig. 2 muestra la diferencia entre las concentraciones de los productos al comienzo y al final de la cultivacion,

referidas al contenido de carbono. En la presencia de acetato se formaron 42,13 nmolC/l de acido butmco en

comparacion con los 26,43 mmolC/l que se formaron en la ausencia de acetato.

En resumen, la adicion de acetato da lugar asimismo a un aumento de la cantidad formada de acido butmco.

Ejemplo 3: Produccion de acido butirico en la presencia de acetato o etanol usando unas cepas y unas mezclas gaseosas alternativas

Medios y soluciones que se usaron:

5 ATCC 1754 modificado (medio mmimo PETC)

Sustancia: Cantidad

MES: 10,00 _s/___

Solucion: Cantidad

Elementos traza: 10 ml/l

Vitaminas 141: 10 ml/l

Solucion: Cantidad

Fructosa 250 g/l: 20 ml/l

Agente reductor ATCC: 10 Mil

La sustancia se mezclo con vitaminas y elementos traza, y el volumen se ajusto con el valor del pH y una solucion de NaOH usando agua desmineralizada (agua VE). A continuacion, el valor del pH se ajusto a 6,0 usando una solucion de NaOH, el medio se hirvio y se transfirio a unas botellas de vidrio resistentes a la presion que teman una 10 capacidad de 1 l. A continuacion, el medio se enfrio sobre hielo y se rocio usando N2 con el fin de retirar cualquier cantidad de oxfgeno remanente.

A continuacion, el medio se autoclavo. Luego, el agente reductor se anadio al medio y el volumen se ajusto usando agua VE anaerobica. El agente reductor se esterilizo por separado y se almaceno en condiciones anaerobicas.

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ATCC 1754 modificado (PETC) _________

Sustancia: Cantidad

NH4 Cl: 1,00 g/l

KCl: 0,10 g/l

MgO x 7 H2O2: 0,20 g/l

NaCl: 0,80 g/l

KH2PO4: 0,10 g/l

CaCl2 x 2 H2O: 20,00 mg/l

Resazurina: 1,00 mg/l

Extracto de levadura: 1,00 g/l

MES: 20,00

Solucion: Cantidad

Elementos traza de ATCC 1754: 10 ml/l

Vitaminas 141: 10 ml/l

Solucion: Cantidad

Fructosa 250 g/l: 20 ml/l

Agente reductor de ATCC: 10 ml/l

La sustancia, las vitaminas y los elementos traza se mezclaron y el volumen se ajusto con el valor del pH y con una solucion de NaOH usando agua desmineralizada (agua VE). A continuacion, el valor del pH se ajusto a 6,0 usando 20 una solucion de NaOH, el medio se hirvio y se transfirio a unas botellas de vidrio resistentes a la presion que teman una capacidad de 1 l. A continuacion, el medio se enfrio sobre hielo y se rocio usando N2 con el fin de retirar todo el oxfgeno remanente.

A continuacion, el medio se autoclavo. Luego, el agente reductor se anadio al medio y el volumen se ajusto usando 25 agua VE anaerobica. El agente reductor se esterilizo por separado y se almaceno en condiciones anaerobicas.

ATCC 1754 modificado (PETC modificado)

Sustancia: Cantidad

Extracto de levadura: 1,00 g/l

MES: 10,00 __g/_

Solucion: Cantidad

Elementos traza de ATCC 1754: 10 ml/l

Vitaminas de PETC modificado: 10 ml/l

Solucion inorganica de PETC modificado: 30 ml/l

Solucion: Cantidad

Agente reductor de ATCC: 7,5 ml/l

La sustancia, las vitaminas y los elementos traza se mezclaron y el volumen se ajusto al valor del pH y con una solucion de NaOH usando agua desmineralizada (agua VE). A continuacion, el valor del pH se ajusto a 6,0 usando 5 una solucion de NaOH, el medio se hirvio y se transfirio a unas botellas de vidrio resistentes a la presion que teman una capacidad de 1 l. A continuacion, el medio se enfrio sobre hielo y se rocio usando N2 con el fin de retirar todo el oxfgeno remanente.

A continuacion, el medio se autoclavo. Luego, el agente reductor se anadio al medio y el volumen se ajusto usando 10 agua VE anaerobica. El agente reductor se esterilizo por separado y se almaceno en unas condiciones anaerobicas.

Elementos traza de ATCC 1754

Sustancia: Cantidad

Acido nitrilotriacetico: 2 g/l

MnSO4 x H2O: 1 g/l

(NH4)2Fe(SO4)2X 6 H2O: 0,8 g/l

CoCl2 x 6 H2O: 0,2 g/l

ZnSO4 x 7 H2O: 0,2 g/l

CuCl2X 2 H2O: 0,02 g/l

Na2MoO4 x 2 H2O: 0,02 g/l

NiCl2 x 6 H2O: 0,02 g/l

Na2SeO4: 0,02 g/l

Na2WO4 x 2 H2O: 0,02

Ante todo, acido nitrilotriacetico se disolvio en 1 l de agua desmineralizada (agua VE), y el valor del pH se ajusto a 15 6,0 usando una solucion de KOH. A continuacion, se anadieron todos los otros productos qmmicos. La solucion de

los elementos traza se almaceno a 4 °C en la oscuridad.

Vitaminas 141

Sustancia: Cantidad

Biotina: 2 mg/l

Acido folico: 2 mg/l

Piridoxina-HCl: 10 mg/l

Tiamina-HCl x H2O: 5 mg/l

Riboflavina: 5 mg/l

Acido nicotmico: 5 mg/l

D-Pantotenato de Ca: 5 mg/l

Vitamina B12: 0,1 mg/l

Acido p-amino-benzoico: 5 mg/l

Acido liponico: 5 mg/l

20 Las sustancias se disolvieron en 1 l de agua desmineralizada (agua VE) y se congelaron a -20 °C en unos tubos de Falcon esteriles en porciones de 10 ml hasta su el uso.

Solucion inorganica de PET modificado

Sustancia: Cantidad

NaCl: 80 g/l

NH4Cl: 100 g/l

KCl: 10 g/l

KH2PO4: 10 g/l

MgSO4 x 7 H2O: 20 g/l

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Las sustancias se disolvieron en 1 l de agua desmineralizada (agua VE). La solucion inorganica se almaceno a 4 °C en la oscuridad.

Agente reductor de ^ ATCC 1754

Sustancia: Cantidad

NaOH: 9 g/l

L-cistema x HCl: 40 g/l

Na2S x 9 H2O: 40

Ante todo, se disolvio NaOH en 1 l de agua desmineralizada (agua VE) y se hirvio. A continuacion, la solucion se transfirio a una botella de vidrio resistente a la presion que tema una capacidad de 1 l y se rocio usando N2 mientras que se enfriaba sobre hielo. Las otras sustancias se anadieron a la mezcla de reaccion mientras que la solucion se enfriaba. A continuacion, el agente reductor se autoclavo durante 20 minutos.

Cepas usadas:

COX-Cdr-001 (Clostridium drakei)

COX-Clj-001 (Clostridium Ijungdahlii)

Cultivos previos:

Las cepas usadas se transfirieron a unos cultivos previos usando unos cultivos criogenicos preparados inmediatamente (antes que los cultivos usando 4 ml de un cultivo en la fase exponencial y 1 ml de una solucion de glicerol al 50 % para la conservacion y el almacenamiento a -80 °C). Los cultivos previos consistfan, cada uno de ellos, en 5 ml del medio ATCC 1754 modificado (PETC) y un inoculo fijado de las cepas. La densidad ideal del inoculo fue determinada en unos experimentos piloto para la respectiva cepa.

COX-CD-001: 0,1 % en 5 ml del medio COX-Cluj-001: 10 % en 5 ml del medio

Cultivos:

50 ml de cada uno de cualquiera de los medios usados se transfirieron a unas botellas de vidrio resistentes a la presion, anaerobicas (exentas de oxfgeno) esteriles, que teman una capacidad de 250 ml, y se inocularon usando 10 % (5 ml) de las cepas usadas, que habfan sido tomadas a partir de los cultivos previos recientemente preparados, con una antiguedad de 3 dfas.

Los matraces de cultivo se cerraron usando un tapon de caucho butilico esteril y una tapa de color rojo (que comprende tres conjuntos perforados). Unas agujas huecas (de la entidad Sterican, 0 0,90 x 40 mm) perforaron a traves de todos los tres conjuntos. Un manometro para controlar la presion se conecto con una de las agujas huecas (idealmente la que estaba situada en el centro). Unas valvulas se conectaron con las otras agujas huecas, de tal manera que el gas anadido y el gas retirado desde el matraz de cultivo se pudieran controlar de manera independiente uno de otro.

Cada una de las cepas usadas se cultivo por duplicado para obtener unos resultados directamente reproducibles. Preparacion de los cultivos:

Antes de empezar con las cultivaciones reales, las botellas fueron rociadas, cada una de ellas, usando tres veces un gas de smtesis. Esto se realizo conectando con una de las valvulas un tubo para bombear gas dentro de la botella y con la otra valvula un tubo para dejar salir el gas retirado por debajo de la campana en paralelo con unas disposiciones de regulacion.

Por apertura de la valvula con el tubo para anadir gas, el gas de smtesis fue bombeado dentro del matraz de cultivo hasta que la aguja del manometro mostro un valor de la presion de 0,8 bares. A continuacion, se cerro la valvula para anadir gas y se abrio la valvula para retirar gas hasta que la aguja mostro un valor de la presion de 0 bares. Este proceso se repitio tres veces para cada matraz de cultivo. Cuando se repitio el procedimiento por una cuarta vez, se mantuvo la presion en la botella, es decir que los cultivos fueron cubiertos con el gas de smtesis.

Las muestras de cultivos estaban entonces prestas para la cultivacion a 35 °C y 100 rpm (revoluciones por minuto) en un bano de agua oscilante.

Toma de muestras

Una o dos veces por dfa se retiro aproximadamente 1 ml del cultivo para determinar la densidad optica a 600 nm (registrando el crecimiento de un cultivo).

Al principio y al final de los experimentos, dos muestras de 1,5 ml cada una se transfirieron a unos tubos de Eppendorf que teman una capacidad de 2 ml y se usaron para el analisis por RMN (resonancia magnetica nuclear.

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Adicion de gas:

En intervalos regulares (varias veces por dfa) se comprobo la presion en el interior del matraz de cultivo con el fin de asegurarse de que ella era constante. El crecimiento de los cultivos y su metabolismo consumieron cantidades variables del gas de smtesis. En el caso de que la presion descendiese, se anadio mas cantidad de gas tal como se ha descrito mas arriba. El mismo proceso se llevo a cabo si se retiraba gas desde el matraz de cultivo antes de tomar una muestra.

Final del experimento:

El experimento se termino despues de aproximadamente una semana rociando de una manera continua durante 10 minutos con nitrogeno a traves de cada uno de los matraces de cultivo antes de retirar las agujas huecas para conseguir una seguridad aumentada. Los cultivos se transfirieron a unos tubos de Falcon esteriles con una capacidad de 50 ml bajo una campana esteril y se centrifugaron durante 30 minutos a 4.500 g. Ya no habfa ninguna necesidad mas de trabajar en unas condiciones anaerobicas. Los sedimentos de celulas que se habfan recuperado fueron desechados y los materiales sobrenadantes de los cultivos fueron transferidos a unas jeringas esteriles que teman una capacidad de 50 ml bajo la campana esteril. Ellos se transfirieron a un nuevo tubo de Falcon esteril con una capacidad de 50 ml por intermedio de un filtro esteril de 0,2 pm y se congelaron a -20 °C como unas muestras de respaldo.

Experimento 1: Cultivacion usando un extracto de levadura y 0,6 g/l de etanol (BF-DM-12-COX-038)

Los experimentos se llevaron a cabo usando un medio ATCC 1754 (PETC) modificado que comprendfa 1 g/l de extracto de levadura. Ademas, se usaron 0,6 g/l de etanol como una fuente de carbono. La mezcla gaseosa usada contema 30 % de CO2 y 70 % de H2.

Experimento 2: Cultivacion usando un extracto de levadura y 2 g/l de acido acetico (BF-DM-12-COX-041)

El experimento se llevo a cabo tal como se ha descrito en el experimento 1 exceptuando que al medio se le anadio acido acetico en lugar de etanol.

Experimento 3: Cultivacion usando un extracto de levadura (BF-DM-12-COX-042) (experimento comparativo)

Para realizar una comparacion directa, se utilizo el mismo medio sin la adicion de etanol o de acido acetico.

Los resultados se describen en las Figs. 3 y 4. En resumen, el efecto mostrado en el Ejemplo 1 se pudo reproducir usando unas mezclas gaseosas alternativas y otras cepas de bacterias acetogenicas.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la preparacion de unas entidades qmmicas de C4 escogidos entre el conjunto formado por acido butmico, butanol y unos derivados de estos, en el que el derivado es 2-butanol, 1,4-butanodiol, 2,3-butanodiol, aminobutano, tiobutanol, isobutenol o isobutanol, que comprende las etapas de

a) poner en contacto una celula bacteriana acetogenica en un medio acuoso con un gas de smtesis en condiciones anaerobicas,

b) incubar la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperature comprendida entre 0 y 100 °C durante por lo menos 30 minutos,

en donde el medio acuoso comprende, en la etapa b), etanol y/o acetato en una concentracion combinada total de por lo menos 0,1 g l-1, en donde el etanol y/o el acetato es/son un etanol y/o un acetato que se ha(n) producido exogenamente.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la concentracion combinada total de etanol y/o acetato es de 0,5 a 20 g l-1.
3. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 2, en el que el gas de smtesis comprende de 40 a 100 % de CO.
4. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que el gas de smtesis comprende menos que 10 % de CO2.
5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 2 o 4, en el que el gas de smtesis comprende menos que 10 % de CO.
6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, en el que el metodo comprende la etapa de

c) separar y, opcionalmente, reciclar etanol y/o acetato a partir de la mezcla obtenida despues de la etapa b).
7. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, en el que la celula bacteriana acetogenica se escoge entre el conjunto formado por Clostridium, Moorella y Carboxythermus.
8. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 7, en el que en las etapas a) y b) el valor del pH se mantiene entre 3 y 7.
9. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 8, en el que la etapa b) se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 15 °C y 45 °C.
10. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 9, en el que el gas de smtesis proporciona mas de un 80 % del carbono que estaba presente inicialmente en la etapa a).
11. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 10, en el que el procedimiento se realiza de un modo continuo.
12. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 11, en el que la etapa b) se lleva a cabo en la ausencia de hidratos de carbono.
13. Un uso de etanol y/o acetato para aumentar la proporcion de un gas de smtesis que ha sido convertido por una celula bacteriana acetogenica en un medio acuoso en unas condiciones anaerobicas para dar unas entidades qmmicas de C4 escogidas entre el conjunto formado por acido butmico, butanol y unos derivados de estos, en el que el derivado es 2-butanol, 1,4-butanodiol, 2,3-butanodiol, aminobutano, tiobutanol, isobutenol o isobutanol, y en el que el medio acuoso comprende etanol y/o acetato en una concentracion combinada total de por lo menos 0,1 g l-1 y el etanol y/o el acetato se producen exogenamente.
14. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que el etanol y/o el acetato se anaden al medio acuoso antes de la acumulacion de unas cantidades detectables de etanol y/o acetato producidos endogenamente por dicha celula.
15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 hasta 14, en el que el acetato y/o el etanol se presenta(n) en un medio acuoso que comprende la celula bacteriana acetogenica en una concentracion combinada total de 0,5 a 5 g l-1.
16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 hasta 15, en el que la celula bacteriana acetogenica se escoge entre el conjunto formado por Clostridium, Moorella y Carboxythermus.