MX2014008100A - Lactobacillus reuteri dsm 17938, para el desarrollo del sistema nervioso enterico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a Lactobacillus reuteri DSM 17938, y a composiciones que comprenden Lactobacillus reuteri DSM 17938, para promover el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en mamíferos. Los seres humanos o los animales, y en particular, un feto, un lactante prematuro o nacido a término, un bebé, o un niño, pueden beneficiarse de la invención. La invención puede ser especialmente benéfica para los lactantes que hayan experimentado un retardo en el crecimiento intrauterino (IUGR), o que tengan un peso bajo o muy bajo al nacer, y/o que hayan padecido de un retardo en el crecimiento del sistema nervioso entérico ya sea en el útero, o durante o después del nacimiento. La administración del Lactobacillus reuteri DSM 17938 promueve el desarrollo neuronal y glial normal y saludable. También asegura una diferenciación neuronal saludable en el sistema nervioso periférico.

Description

LA CTOBA CILLUS REUTERI DSM 1 7938. PARA E L DESA RROLLO DEL SISTE MA N E RVIOSO E NTÉRICO Cam po de la Invención La presente invención, se refiere, en términos generales, al campo de la salud neuronal , la protección neuronal, y el desarrollo neuronal . La invención específicamente se refiere a la administración de bacterias probióticas capaces de promover el desarrollo neuronal entérico en los lactantes, en especial en los lactantes prematuros y de bajo peso al nacer.

A ntecedentes a la I nvención El sistema nervioso es una red altamente compleja de células neuronales y gliales. Está presente in todas las especies de mamíferos y se compone del sistema nervioso central (cerebro y médula espinal) y el sistema nervioso periférico (sistema nervioso somático, autónomo y entérico) .

El sistema nervioso central dirige las funciones cognitivas (memoria, atención, percepción , acción , etc.). Junto con el sistema nervioso periférico, tiene una función fundamental en el control del comportamiento . El sistema nervioso somático es responsable de coordinar los movimientos del cuerpo (bajo un control consciente) . El sistema nervioso autónomo mantiene la homeostasia en las actividades corporales sin un control consciente (frecuencia card íaca , etc. ). Finalmente, y como parte de éste último sistema, el sistema nervioso entérico controla directamente las funciones del tracto gastrointestinal . Éstas incluyen la barrera gastrointestinal y la función in m u nológica, m ovilidad , absorción , d igestión y secreciones exocrinas / endocrinas, las cuales contribuyen a la protección del intestino de cualquier tipo de lesión , y al bienestar digestivo [Neunlist, M . y colaboradores (2008) ; Neuro-g lial crosstalk in inflamm atory bowel disease , J Intern. Med, 263: 577-583], [Burns, A. J. y colaboradores (2009); Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility during fetal and early postnatal stages, Semin. Pediatr. Surg. , 1 8: 1 96-205], [Tapper E.J . (1983); Local modulation of intestinal ion transport by enteric neurons, Am J Physiol. , 244: G457-68].

El sistema nervioso se desarrolla durante la gestación, y luego se reafina hasta una red funcional madura durante el período post-natal .

La inmadurez o la maduración retardada del sistema nervioso conduce al establecimiento y funcionamiento adecuado retardado de las funciones biológicas importantes que regula. En particular, conduce a disfunciones intestinales después del nacimiento, incluyendo una capacidad digestiva/absortiva reducida, reflujo gastrointestinal, un tránsito intestinal más lento/heces más duras que podrían conducir a estreñimiento, una colonización deteriorada del intestino, una función de barrera intestinal débil que aumenta los riesgos de infecciones y alergias, conduciendo todo esto a intolerancia al alimento (y por consiguiente, a la necesidad de soporte nutricional parenteral) y a una enterocolitis necrotizante en los casos más graves, y a malestar gastrointestinal.

Esto se puede observar en los lactantes, tales como: Lactantes prematuros, lactantes de bajo peso al nacer (<2,500 gramos), y lactantes de muy bajo peso al nacer (<1,500 gramos); New J. Gastrointestinal development and meeting the nutritional needs of premature infants Am J Clin Nutr 2007; 85(2): 629S-634S Lactantes prematuros y nacidos a término que han experimentado un retardo en el crecimiento intrauterino (IUGR) que se haya presentado en seguida de cualquier evento adverso durante la gestación (tabaquismo de la madre, medicación de la madre, baja calidad de la placenta, colocación anormal de la placenta, mala nutrición de la madre y del feto, estrés/ansiedad excesiva de la madre, etc.); - [Shanklin D.R. y Cooke R.J. (1993); Effects of intrauterine growth on intestinal length in the human foetus, Biol Neonate, 64: 76-81], [Neu, J. (2007); Gastrointestinal development and meeting the nutritional needs of premature infants, Am. J. Clin. Nutr., 85(2): 629S-634S], [Brandaoa, M.C.S. y colaboradores, (2003); Effects of pre- and postnatal protein energy deprivation on the myenteric plexus of the small intestine: a morphometric study in weanling rats, Nutr. Res., 23: 215-223].

Cualquier neonato y lactante joven que muestre un retardo en el crecimiento del sistema nervioso en seguida, por ejemplo, de hipoxemia-isquemia al nacimiento, o cualquier otro evento adverso [Taylor, C .T. y Colgan S . P . (2007); Hypoxia and gastrointestinal d isease, J. Mol. Med. (Berl.), 85: 1295-300], [Barrett R. D. y colaboradores (2007) ; Destruction and reconstruction: hypoxia and the developing brain, Birth Defects Res C Embryo Today, 81 : 1 63-76].

Cualquier neonato y lactante que muestre disfunciones gastrointestinales (trastornos digestivos, trastornos de movilidad , reflujo gastrointesti nal , tránsito gastrointestinal lento, intolerancia a la alimentación oral), enfermedad de Hirschsprung, e inflamación que afecte al tracto gastrointestinal (tal como Necrotisis enterocolitis), y patolog ías de obstrucción [Burns A.J . y colaboradores (2009); Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility during fetal and early postnatal stages, Semin. Pediatr Surg. , 1 8(4) : 1 96-205].

Se sabe que, en los seres humanos, las células de la cresta neural, a partir de las cuales se deriva el sistema nervioso entérico, se desarrollan en el útero en el feto muy temprano en seguida de la concepción (desde las 7.5 semanas de desarrollo) [Burns, A. J . y Thapar, N . (2006) ; Advances in ontogeny of the enteric nervous system, Neurogastroenterol. Motil. , 1 8, 876-887]. Se ha demostrado que el sistema nervioso entérico experimenta importantes cambios después del naci miento y hasta la edad de 6 años, y se continúan presentando más cambios menores hasta la edad de 1 0 años [Wester, T. y colaboradores (1 999); Notable postnatal alterations in the myenteric plexus of normal human bowel , Gut, 44: 666-674]. Por consiguiente, si el feto, el neonato o el lactante ha experimentado retardo en el crecimiento del sistema nervioso, es recomendable que este retardo se revierta rápidamente, de tal manera que el desarrollo del sistema nervioso "se ponga al día" hasta un nivel normal. Es deseable que se repare cualquier daño ocasionado al sistema nervioso entérico tan rápido como sea posible, de tal manera que el feto en crecimiento o el lactante experimente tan poco como sea posible cualesquiera disfunciones gastrointestinales u otras patologías asociadas con un sistema nervioso entérico inmaduro o dañado.

Por consiguiente, el desarrollo saludable del sistema nervioso entérico en el feto, en el neonato, y en el niño en crecimiento, ayuda a controlar el establecimiento y mantenimiento correcto de la función de barrera del intestino, previniendo de esta manera los estados patológicos inflamatorios asociados con la disfunción intestinal, así como disminuyendo el riesgo de infecciones y alergias (Neulist y colaboradores, 2008).

Por lo tanto, las intervenciones peri- y/o post-natales corresponden a un planteamiento prometedor para asegurar el desarrollo saludable del sistema nervioso entérico. Las intervenciones durante el embarazo/la lactancia, pueden tener ventajas considerables en términos de conveniencia y cumplimiento, comparándose con las intervenciones dirigidas al niño.

Existe una necesidad de promover y soportar el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en la etapa más temprana posible durante la gestación, así como durante las fases tempranas de la vida del recién nacido, cuando el sistema nervioso está madurando rápidamente. Debido a que el sistema nervioso continúa desarrollándose durante los primeros años de la niñez (hasta la edad de aproximadamente 10 años), existe esta necesidad de un soporte continuo a través de todo este período.

La literatura científica reporta sobre el uso de probióticos para impactar positivamente a la salud de los neonatos y los lactantes, en particular con respecto a reducir la inflamación, proteger contra la infección, e impactar positivamente sobre los hábitos intestinales y la movilidad gastrointestinal. Para una revisión general reciente, véase [Dobrogosz, W. J., Peacock, T. J. y Hassan, H. M. (2010); Evolution of the probiotic Concept: From Conception to Validation and acceptance in Medical Science, Advances in Applied microbiology, 72: 1 -41].

El Lactobacillus reuteri derivado del ser humano, se considera como un organismo endógeno del tracto gastrointestinal humano, y está presente en la mucosa del cuerpo gástrico y del antro, duodeno e íleo [Reuter, G. (2001); The lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: composition and succession, Curr. Issues Intest. Microbiol, 2: 43-53] y [Valeur, N. y colaboradores (2004); Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract, Appl. Environ. Microbio/., 70: 1176-1181]. Existen reportes de L. reuteri como una terapia prometedora para muchas condiciones diferentes, incluyendo la enfermedad diarreica [Saavedra, J. (2000); Am. J. Gastroenterol, 95: S16-S18], cólico infantil [Savino, F. y colaboradores (2007); Lactobacillus reuteri (American Type Culture Collection Strain 55730) versus simethicone in the treatment of infantile colic: a prospective randomized study, Pediatrics, 119: e124-e130], eczema [Abrahamsson, T. R. y colaboradores (2007); Probiotics in prevention of IgE-asociated eczema: a double-blind, randomized, placebo-controlled trial, J Allergy Clin. Immunol., 119: 1174-1180] e infección de H. pylori [Imase, K. y colaboradores (2007); Lactobacillus reuteri tablets suppress Helicobacter pylori infection - a double-blind randomised placebo-controlled crossover clinical study, Kansenshogaku Zasshi, 81: 387-393]. Un estudio reciente sobre cuatro cepas de L. reuteri, DSM 17938, ATCC PTA4659, ATCC PTA5289 y ATCC PTA6475, demostró que las cepas modulaban diferencialmente la inflamación inducida por lipopolisacárido en las células epiteliales del intestino delgado y en el íleo de las ratas recién nacidas.

En un estudio doble-ciego de selección aleatoria llevado a cabo en treinta recién nacidos prematuros, reportado en 2008 [Indrio, F. y colaboradores (2008); The effects of probiotics on feeding tolerance, bowel habits, and gastrointestinal motility in preterm newborns, J. Pediatr., 152(6): 801-6], los recién nacidos que recibieron Lactobacillus reuteri ATCC 55730 mostraron una disminución significativa en la regurgitación y en el tiempo diario medio de llorar, y un mayor número de heces, comparándose con aquéllos a los que se administró el placebo.

Hasta la fecha, no ha habido reporte alguno sobre el efecto de los probióticos sobre el desarrollo neuronal en los neonatos.

Por consiguiente, a la luz de estos documentos de la técnica anterior citados, existe una necesidad de un progreso adicional en el área de la administración de probióticos como una forma de mejorar la salud de los bebés recién nacidos, de los lactantes jóvenes, de los bebés que empiezan a caminar, y de los niños.

En particular, existe una necesidad de soportar el desarrollo saludable del sistema nervioso entérico en los neonatos, en los lactantes, y en los niños jóvenes, con el objeto de prepararlos mejor para los desafíos gastrointestinales, tales como los cambios de dieta, las lesiones químicas (por ejemplo, por medicación) o físicas (por abrasión), las infecciones, las reacciones inflamatorias/ inmunitarias, etc., así como para mejorar la maduración futura de su sistema nervioso entérico durante su vida posterior.

La presente invención se aplica a todos los mamíferos, incluyendo animales y seres humanos.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a Lactobacillus reuteri DSM 17938, para promover el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en los neonatos. Los seres humanos y los animales, y en particular, un feto, un lactante prematuro o nacido a término, un lactante que empieza a caminar, o un niño, pueden g beneficiarse de la invención. La invención puede ser especialmente benéfica para los lactantes que hayan experimentado un retardo en el crecimiento intrauterino (IUGR), o que tengan un peso al nacer bajo o muy bajo, y/o que hayan sufrido de un retardo en el crecimiento del sistema nervioso entérico, ya sea en el útero o bien durante o después del nacimiento.

La administración de Lactobacillus reuteri DSM 17938 promueve el desarrollo neuronal y glial normal y saludable. También asegura una diferenciación neuronal saludable en el sistema nervioso periférico.

El Lactobacillus reuteri DSM 17938 se administra directamente al lactante o al bebé en su forma pura, o diluido en agua o en la leche materna, en un suplemento alimenticio, o en un fortificante de leche, o en cualquier soporte de leche utilizado durante la alimentación trófica, en una fórmula para lactantes, o en una bebida basada en leche. El Lactobacillus reuteri DSM 17938 se administra al lactante, al bebé, o ai niño, como una dosis diaria de 1 x 103 a 1 x 1012, de preferencia, de 1 x 107 a 1 x 1011 cfu (cfu = unidades formadoras de colonias).

La invención se refiere a una composición que comprende Lactobacillus reuteri DSM 17938, para promover el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en los neonatos.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1A: Estimulación de campo eléctrico de la respuesta contráctil ex-vivo A: Yeyuno Las tensiones (área debajo de la curva (AUC)) obtenidas por las contracciones isométricas del yeyuno en respuesta a la estimulación de campo eléctrico a 10 Hz en cachorros CTRL-w, PR-w y PR-L.reuteri (DSM 17938) en el sacrificio (post-natal día 14). Los resultados son las medias ± SEMedia, n = 5 (CTRL-w y PR-w) o 6 (PR-L.reuteri). Las medias sin una letra en común son diferentes, P<0.05.

Figura 1B: Estimulación de campo eléctrico de la respuesta contráctil ex-vivo B: Colon Las tensiones (área debajo de la curva (AUC)) obtenidas por las contracciones isométricas del colon en respuesta a las estimulaciones de campo eléctrico a 5 Hz en cachorros CTRL-w, PR-w y PR-L.reuteri (DSM 17938) en el sacrificio (post-natal día 14). Los resultados son las medias ± SEMedia, n = 5 (CTRL-w y PR-w) o 6 (PR-L.reuren). Las medias sin una letra en común son diferentes, P<0.05.

Figura 2A: Estimulación con acetil-colina de la respuesta contráctil ex-vivo A: Yeyuno Las tensiones (área debajo de la curva (AUC)) obtenidas por las contracciones isométricas del yeyuno en respuesta a acetil-colina en una concentración de 10"5 M en cachorros CTRL-w, PR-w y PR-L.reuteri (DSM 17938) en el sacrificio (post-natal día 14). Los resultados son las medias ± SEMedia, n = 5 (PR-w) o 6 (CTRL-w y PR-L.reuteri). Las medias sin una letra en común son diferentes, P<0.05.

Figura 2B: Estimulación con acetil-colina de la respuesta contráctil ex-vivo B: Colon Las tensiones (área debajo de la curva (AUC)) obtenidas por las contracciones isométricas del colon en respuesta a acetil-colina en una concentración de 10"5 M en cachorros CTRL-w, PR-w y PR-L.reuteri (DSM 17938) en el sacrificio (post-natal día 14). Los resultados son las medias ± SEMedia, n = 5 (PR-w) o 7 (PR-L.reuteri), y 9 (CTRL-w). Las medias sin una letra en común son diferentes, P<0.05.

Descripción Detallada Definiciones: En esta memoria descriptiva, los siguientes términos tienen los siguientes significados: "Probiótico" significa las preparaciones de células microbianas o los componentes de células microbianas con un efecto benéfico sobre la salud o el bienestar del huésped. [Salminen, S. y colaboradores (1999); Probiotics: how should they be defined, Trends Food Sci. Technol., 10 107-10]. La definición de probiótico está en general admitida y en línea con la definición de la Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés). El probiótico puede comprender una cepa única de microorganismo, una mezcla de diversas cepas y/o una mezcla de diversas especies bacterianas y géneros. En el caso de las mezclas, el término singular "probiótico" todavía se puede utilizar para designar la mezcla o preparación probiótica. Para el propósito de la presente invención, los microorganismos del género Lactobacillus se consideran como probióticos.

"Prebiótico" en términos generales significa un ingrediente alimenticio no digerible que afecta de una manera benéfica al huésped mediante la estimulación selectiva del crecimiento y/o de la actividad de los microorganismos presentes en el intestino del huésped y, por consiguiente, pretende mejorar la salud del huésped.

"Lactante prematuro" significa un lactante nacido antes de las 37 semanas de gestación.

"Lactante nacido a término" significa un lactante nacido después de las 37 semanas de gestación.

"Bebé" significa un niño a partir de cuando puede caminar hasta los tres años de edad.

"Niño joven" significa un niño a partir de los tres hasta los diez años de edad.

Lactobacillus reuteri DSM 17938, referido como L. reuteri a través de todo el texto, es la cepa de L. reuteri propiedad de Biogaia AB, Suecia, que tiene la designación científica de la cepa DSM 17938, anteriormente L. reuteri ATCC 55730. La identificación DSM se refiere al DSMZ Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Inhoffenstr. 7b, D - 38124 Braunschweig, Alemania. DSM 17938. Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Inhoffenstr. 7b D - 38124 Braunschweig -Alemania.

La presente invención proporciona un probiótico, Lactobacillus reuteri DSM 17938, para usarse mediante su administración para la promoción del desarrollo saludable del sistema nervioso entérico de mamíferos.

La administración del probiótico puede ser a un feto por medio de la madre. También puede ser a un lactante prematuro o nacido a término ya sea directamente o bien por medio de la leche materna. La administración puede ser también a un niño joven, en términos generales hasta los diez años de edad, o la edad equivalente en un animal.

La administración del L. reuteri al mamífero joven, el cual puede ser un humano (feto, lactante, bebé o niño joven) o animal, tiene un efecto positivo sobre el desarrollo de su sistema nervioso entérico, permitiendo que el sistema madure y se desarrolle normalmente. Este efecto es especialmente benéfico para aquéllos que han experimentado, por ejemplo, retardo del crecimiento intrauterino (IUG ) que puede haber ocurrido en seguida de cualquier evento adverso durante la gestación (por ejemplo, tabaquismo activo o pasivo de la madre, medicación de la madre, baja calidad de la placenta, posición anormal de la placenta, mala nutrición de la madre y/o del feto, etc.).

Los presentes inventores han encontrada que L. reuteri y/o las composiciones que contienen L. reuteri de la presente invención, se pueden utilizar para promover el desarrollo de las células neuronales, la funcionalidad, la sobrevivencia, plasticidad y diferenciación y para proteger a las células neuronales contra la degeneración, como se muestra por la promoción de la expresión de las proteínas asociadas con estas actividades biológicas. Dicha degeneración puede seguir, por ejemplo, a cualesquiera situaciones de estrés, tales como aquéllas que afecten al feto (en el útero), tales como el retardo del crecimiento intrauterino (IUGR), mencionado anteriormente, o a los recién nacidos (hipoxia-isquemia al nacimiento, terapia de oxígeno e hiperoxia, inflamación, necesidad de soporte parenteral, etc.), o a cualquier causa que conduzca a estrés oxidativo. Se encontró que L. reuteri promueve la sobrevivencia neuronal y/o limita o impide la muerte neuronal de las células neuronales entéricas, y promueve el crecimiento neuronal, el cual es importante, por ejemplo, en los procesos del desarrollo.

En los lactantes, el L. reuteri y/o las composiciones que contienen L. reuteri de la presente invención se pueden utilizar para proteger al sistema nervioso entérico de cualquier estrés, por ejemplo, que se presente durante el período del desarrollo neuronal, y - en consecuencia - para limitar y/o impedir el retardo del crecimiento neuronal inducido por estrés, y las disfunciones intestinales asociadas.

Por consiguiente, el L. reuteri se puede administrar, en el contexto de la presente invención, cuando ya se haya observado un retardo en el desarrollo del sistema nervioso entérico o, profilácticamente, cuando todavía no se haya observado dicho retardo.

Mediante la administración del L. reuteri de acuerdo con la presente invención, la microbiota intestinal del mamífero joven es afectada propiciamente, y el sistema nervioso entérico del sujeto tratado se desarrolla saludablemente. Se reduce el riesgo del lactante, o del bebé, o del niño joven así tratado, que experimenta patologías asociadas con las disfunción intestinal después del nacimiento. Estas patologías incluyen una capacidad digestiva/ absortiva reducida, reflujo gastrointestinal, un tránsito intestinal más lento / heces más duras y estreñimiento, una colonización intestinal deteriorada, y una función de barrera intestinal débil. Estos últimos estados aumentan el riesgo de infecciones y alergias, conduciendo de esta manera a intolerancia al alimento (y por consiguiente, a la necesidad de soporte nutricional parenteral). Otras patologías asociadas con la disfunción intestinal después del nacimiento son enterocolitis necrotizante, y malestar gastrointestinal. El efecto benéfico de L. reuteri sobre el desarrollo saludable del sistema nervioso entérico del mamífero se elabora en los párrafos que se encuentran a continuación.

Dosis de probiótico: El probiótico se puede administrar como una dosis diaria y en la forma de una composición. Las dosis diarias de L. reuteri administradas a la madre embarazada o lactando son de 1 x 106 a 1 x 1012 cfu, de preferencia de 1 x 108 a 1 x 1011 cfu (cfu = unidades formadoras de colonias). La dosis diaria adecuada para los bebés recién nacidos está en el intervalo de 1 x 103 a 1 x 1012, de preferencia, de 1 x 107 a 1 x 1011 cfu.

Por consiguiente, el L. reuteri puede estar presente en la composición en un amplio intervalo de porcentajes, en el entendido de que proporcione el efecto benéfico descrito. Sin embargo, de preferencia, el L. reuteri está presente en la composición en una cantidad equivalente a entre 1 x 103 y 1 x 1012 cfu/gramo de la composición seca. De preferencia, para su administración a la madre embarazada o lactando, el probiótico está presente en una cantidad equivalente a entre 1 x 104 y 1 x 1011 cfu/gramos de la composición seca. La cantidad de probiótico presente por gramo de la composición seca para su administración a los neonatos, bebés y niños puede ser más baja, de preferencia, de 1 x 106 a 1 x 109 y, desde luego, se deben respetar las dosis diarias descritas anteriormente.

Las dosis anteriores incluyen las posibilidades de que las bacterias estén vivas, inactivadas o muertas, o incluso que estén presentes como fragmentos, tales como ADN o materiales de la pared celular. En otras palabras, la cantidad de bacterias que contenga la fórm ula se expresa en térm inos de la capacidad form adora de colonias de esa cantidad de bacterias, como si todas las bacterias estuvieran vivas sin im portar si de hecho están vivas, inactivadas o m uertas, fragm entadas, o una mezcla de cualquiera o todos estos estados.

Método de adm inistración: (i) Administración a madres embarazadas: La composición se puede administrar a las madres embarazadas por diversas vías, siempre que induzcan un contacto entre la composición y el tracto gastrointestinal de las hembras. De preferencia, la composición se administra oralmente como parte del alimento, las bebidas, o de suplementos dietéticos de las madres embarazadas. La composición también se puede administrar en una composición farmacéutica . De preferencia, la administración es oral . Sin embargo, en condiciones patológicas o cuando se utiliza de otra manera una alimentación enteral , la ad ministración de la composición se puede agregar a la ali mentación enteral.

(M) Administración a la progenie recién nacida: El L. reuteri también se puede administrar oralmente solo d irectamente a la progenie (puro o diluido en agua o en la leche materna, por ejemplo) , como un suplemento (por ejemplo, como un suplemento fortificante de la leche humana) , o como una composición farmacéutica o nutricéutica, o como un ingrediente en una fórmula de leche para lactantes. Esta fórmula puede ser una "fórmula para lactantes prematuros" si la progenie nació entes del término o tiene un peso bajo al nacer, una "fórmula de inicio" o una "fórmula de seguimiento". La fórmula también puede ser una fórmula hipoalergénica (HA) en donde se hidrolicen las proteínas de la leche de vaca. Un ejemplo de esta fórmula de inicio se da en el Ejemplo 2. (iii) Administración a bebés y a niños jóvenes: El L. reuteri también se puede administrar oralmente a bebés y a niños jóvenes en la forma de una composición farmacéutica o nutricéutica, leche para el crecimiento, bebidas basadas en leche, suplementos alimenticios, yogurts basados en leche, postres y budines, bizcochos y barras de cereal, cereales y bebidas basadas en frutas. (iv) Administración a animales: El L. reuteri también se puede administrar oralmente a animales solo o en agua, o en la forma de un suplemento alimenticio, una composición farmacéutica o nutricéutica, o leche o alimento para mascotas.

Administración con otros compuestos: El L. reuteri se puede administrar solo (puro, o diluido en agua o leche, incluyendo leche materna, por ejemplo), o en una mezcla con otros compuestos (tales como suplementos dietéticos, suplementos nutricionales, medicinas, vehículos, saborizantes, ingredientes digeribles o no digeribles). Los ejemplos de los suplementos dietéticos típicos son las vitaminas y los minerales. En una modalidad preferida, L. reuteri se administra en una com posición, por ejem plo, una fórm ula para lactantes, junto con otros com puestos que mejoren el efecto benéfico descrito en los mam íferos jóvenes . Estos com puestos sinérg icos pueden ser veh ículos o una matriz que facilite el suministro del L. reuteri al tracto intestinal o que puedan mejorar de otra manera el efecto de la composición sobre el sistema nervioso entérico de la progenie. Estos compuestos pueden ser otros compuestos activos que tengan una influencia, sinérgicamente o por separado, sobre el desarrollo del sistema nervioso entérico en el lactante y/o que potencien el efecto del probiótico. U n ejemplo de estos compuestos sinérgicos es la maltodextrina. Uno de los efectos de la maltodextrina es para proporcionar un vehículo para el probiótico, para mejorar su efecto, y para prevenir la aglomeración .

Otros ejemplos de los compuestos sinérgicos que se pueden incluir en las composiciones, en especial en la fórmula para lactantes, de la invención, son los compuestos prebióticos. U n prebiótico es un ingrediente alimenticio no digerible que afecta benéficamente al huésped mediante la estimulación selectiva del crecimiento y/o de la actividad de una o de un número limitado de bacterias en el colon y, por consiguiente, que mejora la salud del huésped. Estos ingredientes son no digeribles en el sentido de que no se descomponen ni son absorbidos en el estómago o en el intestino delgado y, por consiguiente, pasan intactos al colon, en donde son selectivamente fermentados por las bacterias benéficas. Los ejemplos de los prebióticos incluyen ciertos oligosacáridos, tales como los fructo-oligosacáridos (FOS), los oligosacáridos de leche de vaca (CMOS), y los galacto-oligosacáridos (GOS). Se puede utilizar una combinación de prebióticos, tal como el 90 por ciento de GOS con el 10 por ciento de fructo-oligosacáridos de cadena corta, tal como el producto vendido bajo la marca comercial registrada Raftilose®, o el 10 por ciento de inulina, tal como el producto vendido bajo la marca comercial registrada Raftiline®. Otros ejemplos de prebióticos que se puede utilizar en el contexto de la presente invención incluyen el grupo de oligosacáridos obtenidos a partir de la leche o de otras fuentes, que opcionalmente contienen ácido siálico, fructosa, fucosa, galactosa o mañosa. Los prebióticos preferidos son los sialo-oligosacáridos (SOS), fructo-oligosacáridos (FOS), galacto-oligosacáridos (GOS), isomalto-oligosacáridos (IMO), xilo-oligosacáridos (XOS), arabino-xilo-oligosacáridos (AXOS), oligosacáridos de mañano (MOS), oligosacáridos de soya, glicosil-sacarosa (GS), lacto-sacarosa (LS), sialil-lactosa (SL), fucosil-lactosa (FL), lacto-N-neotetraosa (LN NT), lactulosa (LA), oligosacáridos de palatinosa (PAO), malto-oligosacáridos, gomas y/o hidrolizados de las mismas, pectinas, almidones, y/o hidrolizados de los mismos. Una fórmula para lactantes de acuerdo con la invención de preferencia contiene además cuando menos un prebiótico en una cantidad del 0.3 al 10 por ciento del peso total de la composición seca.

La dosis diaria de carbohidratos, y de todos los otros compuestos administrados con el L. reuteri, siempre debe cumplir con los lineamientos de seguridad publicados y con los requerimientos reguladores. Esto es particularmente importante con respecto a la administración a bebés recién nacidos, en especial a aquéllos nacidos con un peso bajo al nacer o con un peso muy bajo al nacer.

La composición, por ejemplo, la fórmula para lactantes, que contiene el L. reuteri, puede contener una fuente de proteínas en una cantidad de no más de 4.0, 3.0 o 2.0 gramos/100 kcal, de preferencia de 1.8 a 2.0 gramos/100 kcal. No se cree que el tipo de proteína sea crítico para la presente invención, en el entendido de que se satisfagan los requerimientos mínimos del contenido de aminoácidos esenciales, y de que se asegure un crecimiento satisfactorio, aunque se prefiere que más del 50 por ciento en peso de la fuente de proteínas sea suero de leche. En una modalidad, el contenido de proteínas es de entre el 30 por ciento y el 80 por ciento de proteínas de suero de leche. Por consiguiente, se pueden utilizar fuentes de proteínas basadas en suero de leche, caseína y mezclas de los mismos, así como fuentes de proteínas basadas en soya. Hasta donde se refiera a las proteínas de suero de leche, la fuente de proteínas puede basarse en suero de leche ácida o suero de leche dulce, o mezclas de los mismos, y puede incluir alfa-lactalbúmina y beta-lactoglobulina en cualesquiera proporciones deseadas.

Las proteínas pueden estar intactas o hidrolizadas, o pueden ser una mezcla de proteínas intactas e hidrolizadas. Puede ser recomendable suministrar proteínas parcialmente hidrolizadas (grado de hidrólisis de entre el 2 y el 20 por ciento), por ejemplo, para los lactantes que se crea que están en riesgo de desarrollar alergia a la leche de vaca. Si se requieren proteínas hidrolizadas, el proceso de hidrólisis se puede llevar a cabo como sea deseado y como sea conocido en la materia. Por ejemplo, se puede preparar un hidrolizado de proteína de suero de leche mediante la hidrólisis enzimática de la fracción de suero de leche en uno o más pasos. Si la fracción de suero de leche utilizada como el material de partida está sustancialmente libre de lactosa, se encuentra que la proteína experimenta mucho menos bloqueo de Usina durante el proceso de hidrólisis. Esto hace posible que se reduzca el grado de bloqueo de Usina desde aproximadamente el 15 por ciento en peso de la Usina total hasta menos de aproximadamente el 10 por ciento en peso de Usina; por ejemplo, aproximadamente el 7 por ciento en peso de Usina, lo cual mejora mucho la calidad nutricional de la fuente de proteínas.

La composición también puede comprender una fuente de carbohidratos y/o una fuente de grasa. La fórmula para lactantes puede contener una fuente de lípidos. La fuente de lípidos puede ser cualquier lípido o grasa que sea adecuada para usarse en fórmulas para lactantes. Las fuentes de grasa preferidas incluyen oleína de palmera, aceite de girasol alto en oleico, y aceite de azafrán alto en oleico. También se pueden agregar los ácidos grasos esenciales, ácido linoleico y a-linolénico, como pequeñas cantidades de aceites que contengan altas cantidades de ácido araquidónico y ácido docosahexaenoico preformados, tales como los aceites de pescado o los aceites microbianos. En total, el contenido de grasa de preferencia es tal que contribuya entre el 30 y el 55 por ciento de la energía total de la fórmula. La fuente de grasa de preferencia tiene una proporción de ácidos grasos n-6 a n-3 de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1; por ejemplo, de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 10:1.

También se puede agregar una fuente adicional de carbohidratos a la composición nutricional. De preferencia proporciona de aproximadamente el 40 por ciento a aproximadamente el 80 por ciento de la energía de la composición nutricional. Se puede utilizar cualquier carbohidrato adecuado, por ejemplo, sacarosa, lactosa, glucosa, fructosa, sólidos de jarabe de maíz, maltodextrina, o una mezcla de los mismos.

Si se desea, también se puede agregar fibra dietética adicional. Si se agrega, de preferencia comprende hasta aproximadamente el 5 por ciento de la energía de la composición nutricional. La fibra dietética puede ser a partir de cualquier origen adecuado, incluyendo, por ejemplo, soya, chícharo, avena, pectina, goma guar, goma de acacia, fructo-oligosacárido, o una mezcla de los mismos. Se pueden incluir vitaminas y minerales adecuados en la composición nutricional, en una cantidad para cumplir con los lineamientos apropiados.

Los ejemplos de minerales, vitaminas y otros nutrientes opcionalmente presentes en la fórmula para lactantes incluyen vitamina A, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12, vitamina E, vitamina K, vitamina C, vitamina D, ácido fólico, inositol, niacina, biotina, ácido pantoténico, colina, calcio, fósforo, yodo, hierro, magnesio, cobre, zinc, manganeso, cloruro, potasio, sodio, selenio, cromo, molibdeno, taurina, y L-carnitina. Los minerales usualmente se agregan en forma de sal. La presencia y las cantidades de los minerales específicos y de otras vitaminas variarán dependiendo de la población de lactantes destinada.

La fórmula para lactantes puede contener opcionalmente otras sustancias que puedan tener un efecto benéfico, tales como fibras, lacto ferina, nucleótidos, nucleósidos, y similares.

Se pueden incluir uno o más ácidos grasos esenciales de cadena larga (LC-PUFAs) en la composición. Los ejemplos de los ácidos grasos esenciales de cadena larga (LC-PUFAs) que se pueden agregar son ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido araquidónico (AA). Los ácidos grasos esenciales de cadena larga (LC-PUFAs) se pueden agregar en concentraciones tales que constituyan más del 0.01 por ciento de los ácidos grasos presentes en la composición.

Si se desea, se pueden incluir uno o más emulsionantes de grado de alimento en la composición nutricional; por ejemplo, ésteres de ácido diacetil-tartárico de mono- y di-glicéridos, lecitina y mono- o di-glicéridos, o una mezcla de los mismos. De una manera similar, se pueden incluir las sales y/o estabilizantes adecuados. Se pueden agregar saborizantes a la composición.

Período de adm inistración: La duración de ia administración puede variar. Aunque se esperan efectos positivos con una duración de administración relativamente corta (por ejemplo, una administración diaria durante una a dos semanas para los recién nacidos) , se cree que las duraciones más largas proporcionan un efecto mejorado o, cuando menos, mantienen el efecto en los lactantes más grandes (por ejemplo, una duración de tres, cinco, ocho, o 12 meses), o en los niños jóvenes (por ejemplo, una d uración hasta la edad de 4, 6 o incluso 10 años) . Para su administración a animales se aplican las duraciones correspondientes.

La madre embarazada puede empezar a tomar el L. reuteri tan pronto como esté consciente de su embarazo. Sin embargo, el período de administración también puede empezar antes de que se inicie el embarazo, por ejemplo, si la mujer está tratando de embarazarse. La administración puede empezar en cualquier tiempo después de que se inicie el embarazo. Puede empezar relativamente tarde en el embarazo, de preferencia en el mes 3, 4, 5, 6, 7 u 8 del embarazo, en el caso de un embarazo humano, o en los períodos correspondientes para otros mam íferos, o hasta dos semanas antes de la fecha esperada del parto.

El período de administración puede ser continuo (por ejemplo, hasta e incluyendo la lactación hasta el destete) , o discontinuo. Se prefiere la administración continua para obtener un efecto más sostenido. Sin embargo, se especula que un patrón discontinuo (por ejemplo, la administración diaria durante una semana por mes, o durante semanas alternadas) puede inducir efectos positivos en la progenie.

La administración puede cubrir cuando menos parte del período de gestación y cuando menos parte del período de lactación, o el período equivalente si el recién nacido no se alimenta mediante lactancia materna. De preferencia, el período de administración a la madre embarazada cubre sustancialmente la duración completa del período de gestación, aunque puede ser menor. De una manera similar, el período de administración para la madre lactando de preferencia cubre sustancialmente la duración completo del período de lactación, aunque, nuevamente, este período puede ser menor.

De preferencia, la administración a la madre es mediante ingestión diaria (para tomarse una o dos veces al día), o una ingestión semanal (para tomarse una o dos veces por semana).

El L. reuteri se puede administrar al lactante directamente. Éste es el caso en particular si la madre no da lactancia o después de que interrumpa la lactancia. Sin embargo, un lactante que esté siendo alimentado con leche materna también puede recibir el L. reuteri mediante su administración directa.

De preferencia, la administración al lactante es mediante ingestión diaria. Por ejemplo, si el L. reuteri se administra como una fórmula para lactantes, la administración es con cada alimento, es decir, de aproximadamente cuatro a aproximadamente seis veces diariamente para los lactantes menores de un año de edad, reduciéndose el número de alimentos con la edad. Para los lactantes mayores de un año de edad, la administración puede ser menor, una o dos veces al día. Para los bebés y niños jóvenes, la administración puede ser diariamente o semanalmente (para tomarse una o dos veces por semana).

La administración al lactante, ya sea por medio de lactancia materna, o bien mediante administración directa, o mediante ambos métodos, se puede continuar hasta la edad de seis meses o incluso de un año o más. Por consiguiente, el L. reuteri se puede administrar durante la lactación, si tiene lugar la lactación, o después del destete parcial o completo. La administración al lactante puede continuar a través de la etapa de bebé, e incluso hasta los diez años de edad. Se sabe que el sistema nervioso entérico continúa desarrollándose en los niños hasta esta edad [Wester, T. y colaboradores (1999); Notable postnatal alterations in the myenteric plexus of normal human bowel, Gut, 44: 666-674]. Por consiguiente, los presentes inventores especulan que la administración de L. reuteri puede continuar teniendo un efecto positivo hasta esta edad.

Efecto de la administración de L. reuteri.

El L. reuteri administrado a neonatos promueve el desarrollo saludable del sistema nervioso entérico. En un experimento de un modelo de rata detallado en el Ejemplo 1, se evaluó el efecto de la administración de L. reuteri sobre el desarrollo neuronal.

En este experimento, los cachorros que habían experimentado retardo del crecimiento intrauterino inducido por la dieta materna (grupo PR), y los cachorros que no habían experimentado retardo del crecimiento intrauterino (IUGR) (CTRL), se suplementaron, desde 2 días después del nacimiento, con agua (controles; es decir, CTRL-w y PR-w) o con L. reuteri (PR-L. reuteri). 2 semanas después del nacimiento, en el sacrificio, se evaluó el desarrollo neuronal empleando dos métodos: (i) un planteamiento de perfilación de expresión genética dirigida en el yeyuno, y (ii) mediante la medición de la respuesta contráctil ex-vivo del yeyuno y el colon a una estimulación de campo eléctrico (EFS). El último método mide la respuesta contráctil inducida por el sistema nervioso entérico y, por consiguiente, la maduración y el grado funcional del sistema nervioso entérico.

También se evaluó la respuesta contráctil ex-vivo del yeyuno y el colon a la acetil-colina; ésta mide la respuesta contráctil misma del músculo intestinal, que, por consiguiente, refleja la maduración y el grado funcional del músculo intestinal. El último experimento se llevó a cabo como un control, para permitir a los inventores separar los factores, es decir, sistema nervioso y músculo, controlando las respuestas contráctiles medidas.

Respuesta contráctil ex-vivo a la estimulación de campo eléctrico (EFS) del yeyuno y el colon: Con el objeto de evaluar la maduración neuronal en el modelo de restricción de proteínas y en seguida de la suplementación con L. reuteri, se midió la respuesta contráctil del yeyuno y del colon a la estimulación de campo eléctrico (EFS), que mide la im plicación/capacidad de la red neuronal para estim ular la contractilidad m uscular. Se evaluó la posible im plicación de cualq uier m ad uración m uscular intestinal debido a la restricción de proteínas o en segu ida de la suplementación con L. reuteri, mediante la medición de la respuesta contráctil del yeyuno y el colon a la acetil-colina.

La respuesta contráctil del yeyuno a la estimulación de campo eléctrico (EFS) se redujo en PR-w comparándose con CTRL-w a la frecuencia de 10 Hz (P = 0.055) (Figura 1 A) . La respuesta contráctil del yeyuno a la acetil-colina se redujo ligeramente, pero no de una manera significativa (P = 0.30), en PR-w comparándose con CTRL-w (Figura 2A). Tomados juntos, esto refleja una interacción neuromuscular deteriorada , y en particular una maduración neuronal deteriorada, en el yeyuno de cachorros con proteínas restringidas.

La suplementación con L. reuteri aumentó de una manera significativa (P = 0.01 7) la capacidad de respuesta contráctil del yeyuno a 10 Hz hasta un nivel estadísticamente similar a los controles (Figura 1 A) . Esto indica un efecto promotor de L. reuteri sobre la capacidad estimuladora neuronal en el yeyuno, lo cual refleja una promoción del desarrollo y la función neuronal en el período neonatal. La maduración del compartimiento muscular del yeyuno realmente no se modificó de una manera sig nificativa en seguida de la suplementación con L. reuteri (P = 1 .00), debido a que la capacidad de respuesta contráctil del yeyuno a la acetil-colina permaneció sin cambios comparándose con PR-w (Figura 2A).

La respuesta contráctil colónica a la estimulación de campo eléctrico (EFS) se redujo de una manera significativa en PR-w comparándose con CTRL-w a 5 Hz (Figura 1B). La respuesta contráctil colónica a la acetil-colina se redujo de una manera significativa (P = 0.04) en PR-w comparándose con CTRL-w (Figura 2B). Tomados juntos, esto refleja una interacción neuromuscular deteriorada, con tanto un deterioro de la maduración neuronal como muscular, en el colon de los cachorros con proteínas restringidas.

La suplementación con L. reuteri aumentó la capacidad de respuesta contráctil colónica a una frecuencia de 5 Hz (P = 0.008) (Figura 1B), indicando nuevamente un efecto estimulatorio de L. reuteri sobre el desarrollo y la función neuronal en el colon. La maduración del compartimiento muscular colónico realmente no se modificó de una manera significativa en seguida de la suplementación con L. reuteri (P = 0.43), debido a que la capacidad de respuesta contráctil colónica a la acetil-colina permaneció sin cambios comparándose con PR-w (Figura 2B).

Tomados juntos, estos datos muestran claramente un efecto benéfico del L. reuteri para promover el desarrollo y la función neuronal durante el período post-natal. Basándose en estos datos, L. reuteri constituye una nueva solución nutricional para promover y/o acelerar el desarrollo neuronal intestinal durante el período neonatal.

Expresión de los genes involucrados en el desarrollo neuronal del intestino: En el experimento del modelo de rata del Ejemplo 1, se estudió el efecto de la restricción de proteínas, así como la restricción de proteínas seguida por la suplementación con L. reuteri, sobre la expresión de los genes mayores involucrados en las sendas biológicas del desarrollo neuronal en el yeyuno, utilizando un planteamiento de perfilación de expresión genética. Los genes estudiados se enlistan en la Tabla 2, y los datos se presentan en la Tabla 3.

Se observó una diferencia significativa en el nivel de expresión entre el tratamiento (restricción de proteínas) y la suplementación con L. reuteri para 11 de los genes expresados a un nivel significativo, mientras que 3 mostraron una tendencia a ser diferentes, lo cual no fue estadísticamente significativo. Los genes que se expresaron diferencialmente de una manera significativa son aquéllos principalmente involucrados en la maduración o diferenciación de las neuronas y las células gliales, o son marcadores del crecimiento y la plasticidad neuronal.

Los presentes inventores han demostrado previamente (Cettour y Faure, manuscrito en preparación) que tienen lugar mecanismos compensadores en los cachorros con proteínas restringidas (PR), para ayudar a promover el desarrollo celular y neuronal en el intestino delgado. Los presentes datos confirman estos hallazgos. De una manera específica, la expresión genética de los factores neurotróficos y sus receptores, tales como Gfral (receptor alfa 1 de la familia de GDNF), Ntf4 (Neurotrofina 4), S100B (proteína B de enlace de calcio S100), y GAP43 (proteína asociada con el crecim iento 43) , que es un ma rcador para el desarrollo neuronal , fue significativamente sobre-regulada en el g rupo P R-w com parándose con CTR L-w . Esto probablemente refleja un deseq uilibrio y u na situación de "estrés" en los animales, lo cual, no obstante, sigue siendo insuficiente para promover la maduración neuronal, com o es indicado por nuestros resu ltados en seguida de la estim ulación de cam po eléctrico (E FS) .

La su plem entación con L. reuteri restableció de una manera significativa el nivel de expresión de algunos de estos importantes genes hasta niveles similares a CTRL-w (véase la Tabla 3) . En seguida se describen los genes afectados.

GAP43 es un crecimiento neuronal y un marcador de plasticidad que se expresa altamente en los conos de crecimiento neuronal durante el desarrollo y, por consiguiente, es un marcador para el desarrollo neuronal [Benowitz, L. l . y Routtenberg, A. ( 1997) ; GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity, Trends Neurosci. , 20(2): 84-91 ]. [Capone G.T. y colaboradores (1991 ); Developmental expression of the gene encoding growth-associated protein 43 (Gap43) in the brains of normal and aneuploid mice, J. Neurosci. Res. , 29(4): 449-60].

Ntrk3, también conocida como TrkC, es un receptor que media los múltiples efectos de varios factores neurotróficos, tales como la diferenciación y la sobrevivencia neuronal , y que en particular se enlaza a la neurotrofina-3 que es de una importancia particular durante el desarrollo del sistema nervioso entérico neonatal [M aisonpierre P .C . y colaboradores (1 990) ; N eurotrophin-3 : a factor neu rotroph ic related to N G F and B DN F, Science, 23; 247 (4949 Pt 1 ): 1446-51 ] .

S 100 está presente en las neuronas de pollo en desarrollo y en las células de Schwann, y promueve la sobrevivencia de las neuronas motoras in vivo. [Bhattacharyya , A. y colaboradores (1992) ; S 100B, a potent factor neurotrófico, is also a biomarker for glial cell development, J Neurobiol. , 23(4) : 451 -66].

El restablecimiento de los niveles de expresión genética para estos últimos genes, hasta los niveles de los animales de control, indica que la suplementación con L. reuteri ayuda a restablecer la actividad de desarrollo neuronal y glial normal y saludable en los cachorros. Por consiguiente, el modelo demuestra que la administración de L. reuteri puede ayudar a los animales que hayan padecido de retardo en el crecimiento intrauterino (I UGR), a recuperarse hasta un estado "normal" o "saludable" en términos de desarrollo, funcionalidad, sobrevivencia, plasticidad y diferenciación de las células neuronales.

El nivel de expresión genética de SOX 1 0 se sobre-reguló de una manera significativa en seguida de la suplementación con L. reuteri. SOX10 codifica un factor de transcripción de una importancia crucial para la diferenciación neuronal en el sistema nervioso periférico durante el desarrollo. Es un marcador para las células progenitoras gliales y neuronales altamente presentes en las etapas embrionarias y en el período de desarrollo post-natal temprano [Wegner M. y Stolt, C.C. (2005); From stem cells to neurons and g lia : a Soxist's view of neural development, Trends Neurosci., 25(11): 583-8] y [Young y colaboradores (2003); Acquisition of neuronal and glial markers by neural crest-derived cells ¡n the mouse ¡ntestine, The Journal of Comparative Neurology, 456: 1-11 ]. Dicha estimulación de la expresión de SOX10 mediante la suplementación con L. reuteri, por consiguiente, tiene probabilidades de acelerar y/o promover la diferenciación y la funcionalidad de las neuronas, favoreciendo, por consiguiente, el establecimiento rápido de la red neuronal.

Las modificaciones de la expresión genética observadas en la Tabla 3 probablemente contribuyen a la promoción observada de las respuestas estimuladoras neuronales a la estimulación de campo eléctrico (EFS) de la Figura 1.

La cepa de L. reuteri es un probiótico aislado a partir de la microbiota fecal de un niño alimentado con leche materna. Por consiguiente, con respecto a una estrategia promotora de la salud que trate de imitar tan cercanamente como sea posible la microbiota de niños alimentados con leche materna, la administración del L. reuteri, en particular a niños no alimentados con leche materna, puede proporcionar una ventaja sobre otras cepas que no se encuentran en los niños alimentados con leche materna.

Ejemplo 1 : Estudio con animales (alimentación v sacrificio): Se condujeron experimentos con animales de acuerdo con la autorización número 2120 concedida por la Office Vétérinaire Cantonal, Etat de Vaud. Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley hembras de dos meses de edad después de una semana de gestación en Harían, Barcelona. En el día de su llegada, se colocaron las ratas madres en jaulas individuales, y se asignaron aleatoriamente ya sea a los grupos de control (CTRL) o bien a los grupos con proteínas restringidas (PR). Los animales tuvieron acceso a alimento y agua al gusto, y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad.

Las dietas de las madres CTRL y PR se detallan en la Tabla 1. Las madres CTRL recibieron una dieta de control que contenía el 20 por ciento de proteínas (caseína) que se ajustaba al requerimiento estándar de proteínas para ratas durante la gestación (Reeves y colaboradores, 1993). Las madres PR recibieron una dieta con proteínas restringidas (PR) que contenía el 10 por ciento de las proteínas (caseína). Ambas dietas fueron iso-calóricas, balanceándose el déficit de proteínas mediante la adición de almidón de maíz.

Tabla 1 Composición de las dietas AIN-93G de control (CTRL) y de proteínas restringidas (PR) Dietas Las madres CTRL y PR recibieron sus dietas respectivas durante tanto la gestación como la lactación hasta el día del sacrificio (día post-natal 14 (PND 14)).

En el día post-natal 2 (PND 2), los cachorros se asignaron de una manera aleatoria a las madres del mismo grupo experimental, y el tamaño de la carnada se ajustó a 9 cachorros por madre con un número mínimo de cuatro a cinco machos por carnada.

Desde el día post-natal 2 (PND2) hasta el día post-natal 14 (PND 14), se administró una suplementación de alimentación diaria manual/con pipeta de agua o de solución de L. reuteri a los grupos de control o tratados, respectivamente. El volumen de las suplementaciones se adaptó gradualmente para concordar con el grupo de cachorros de rata (150 microlitros / 100 gramos de peso corporal).

Los grupos y las dietas fueron como sigue: 1) CTRL-w: Cachorros CTRL nacidos de madres CTRL, que recibieron una suplementación de agua. 2) PR-w: Cachorros PR nacidos de madres PR, que recibieron una suplementación de L. reuteri DSM 17938 secado por congelación (1.109 cfu/día).

En el día post-natal 14 (PND 14), se pesaron un máximo de 10 cachorros de los grupos CTRL y PR, y luego se sacrificaron mediante decapitación después de la anestesia con halotano.

Respuesta contráctil ex-vivo de yeyuno v colon a la estimulación del campo eléctrico (EFS): Se colocaron segmentos de aproximadamente 1 centímetro de longitud de yeyuno distal y colon distal en una solución de Krebs fría (CaCI2 (5 mM), MgCI2.6H2 (1.2 mM), NaCI (120 mM), NaH2P04 H20 (1.2 mM), NaHCQ3 (15.5 mM), KCI (5.9 mM), rojo de fenol (0.005 m M) , y glucosa (1 1 .5 m M )) previamente oxigenad a con el 95 por ciento de 02 / 5 por ciento de C02. Los segmentos intestinales se suspendieron a lo largo de su eje longitudinal en un baño de tejido (volumen de 50 mililitros) llenado con la solución de Krebs oxigenada con el 95 por ciento de 02 / 5 por ciento de C02, a 37 °C. Un extremo del músculo se unió a un sujetador estacionario. El otro extremo se unió, por medio de un alambre no elástico, a un transductor de fuerza isométrica. Se permitió un período de estabilización de 30 minutos para obtener contracciones espontáneas. Luego se estiró el tejido hasta una longitud inicial, de tal manera que cualquier estiramiento adicional aumentara la tensión en reposo. Se indujo la contractilidad isométrica en el yeyuno y colon distal mediante acetil-colina (Ach, 10"5 M) o mediante estimulación de campo eléctrico (EFS, de 5 a 1 0 Hz) . Se aplicó acetil-colina durante 1 minuto. Después de completarse la curva de respuesta a la dosis, las tiras se probaron con KCI 80 mM para garantizar que hubieran mantenido su capacidad para contraerse. Las señales se registraron digitalmente en una computadora utilizando Powerlab Chart 3.4. Los resultados se normalizaron mediante el área de corte transversal después de una transferencia cuidadosa y de pesar los fragmentos de tejido. Se realizaron ajustes no lineales utilizando el Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc. , San Diego, EUA). Con el objeto de obtener las frecuencias, se llevó a cabo un análisis de los espectros de densidad de potencia de la señal medida. Se aplicó un filtro de paso alto, con una frecuencia de corte de 2 Hz (mucho más pequeña que la frecuencia de Nyquist de 100 Hz). Se empleó el método de Welch para el cálculo de la densidad del espectro de potencia con 1.3 segundos de traslape, imponiendo una separación de baja frecuencia: se definió una serie de frecuencias de entre 0 y 2 Hz, igualmente separadas por 0.05 Hz. Los cálculos de la densidad del espectro de potencia se hicieron utilizando el algoritmo de Goertzel. Se seleccionaron tres frecuencias correspondientes a los tres valores de potencia más grandes por debajo de 2 Hz.

Perfilación de la expresión genética: Se extrajo el ARN total del yeyuno de los cachorros PR y CTRL, empleando el método de fenol/cloroformo con el reactivo TriPure® (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dicho de una manera breve, las muestras de tejido congeladas (de 50 a 100 miligramos) se homogeneizaron en 1 mililitro de TriPure® utilizando el TissueLyser (Qiagen AG, Basilea, Suiza). Se midió la cantidad y la calidad del ARN aislado utilizando el kit de cuantificación de ARN RiboGreen (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA) y el kit de ARN 6000 Nano LabChip (Agilent Technologies), de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con los kits. La transcripción inversa se llevó a cabo utilizando un cebador de oligonucleótidos (dT15) (Promega, Madison, Wl) y el sistema de transcripción inversa lmProm-llMR (Promega), de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante, con 1 microgramo de ARN total.

Tabla 2 Lista de genes analizados Se evaluaron los niveles de expresión de los genes mayores involucrados en el desarrollo del sistema nervioso entérico (véase la Tabla 2) mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) cuantitativa en tiempo real de 2 pasos, utilizando el RT Profiler PCR Array System by Sybergreen (SABiosciences).

Se hicieron mediciones por d uplicado utilizando conjuntos específicos de cebadores y sondas TAM RA fluorescentes durante la fase lineal log de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el Sistema de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Rápida en Tiempo Real Taq an 7600HT (Applied Biosystems), utilizando el Sequence Detection Software (software de detección de secuencias), versión 2.2. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) tuvieron lugar dentro de pozos de 2 microlitros previamente cargados con los cebadores y sondas específicos por el fabricante en cada uno de los 384 pozos de la placa de reacción. La reacción se llevó a cabo utilizando una concentración final de muestra de ADNc de 0.8 nanogramos/microlitro con la TaqMan Universal PCR Master Mix (mezcla maestra de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) universal TaqMan) (Applied Biosystems) que contenía las enzimas de polimerasa de ADN AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), los nucleótidos, y el tinte fluorescente ROX utilizado como una referencia de carga pasiva. Las secuencias de cebadores y sondas utilizadas fueron diseñadas y validadas por Applied Biosystems, y se tomaron de la biblioteca de rata de Assay-on-Demand (ensayo sobre demanda). El nivel de expresión relativo de cada gen se normalizó mediante el promedio geométrico de los genes de control (aquéllos cuya expresión fue estadísticamente estable a través de los grupos experimentales en nuestras condiciones).

Tabla 3 Niveles de expresión de los genes en el yeyuno de los cachorros CTRL-w, PR-w, y PR-L.reuteri en el sacrificio (día post-natai 14).

Los resultados son los promedios + SEM, n = 6 (PR-w) u 8 (CTRL-w, PR-L.reuteri).

Estadísticas: Se evaluó el efecto de la restricción de proteínas mediante la comparación de los grupos PR con CTRL. El efecto de la suplementación con L. reuteri se evaluó mediante la comparación de los g ru pos PR-L. reuteri con los grupos PR, y se evaluó un restablecimiento eventual hasta los niveles de CTRL mediante la comparación de los grupos PR-L. reuteri con los grupos CTRL.

Se emplearon métodos no paramétricos para analizar los datos (con la excepción de la expresión genética, véase más adelante). Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para probar las diferencias entre los tratamientos. También se obtuvo la estimación de Hodges-Lehmann de la diferencia del tratamiento por pares con su intervalo de confianza del 95 por ciento. Para la expresión genética, los análisis estadísticos se llevaron a cabo sobre los recuentos de umbral de ciclo sin procesar (Ct), asumidos como los valores log-2. Se aplicó un análisis de variación de una vía (ANOVA) sobre el cambio: gen - gen de referencia, el valor-p calculado es la probabilidad de que cuando menos uno de los grupos sea diferente de los otros. Los cálculos se hicieron sobre 5 genes de mantenimiento potenciales, o sobre la media de más de uno; solamente los más estables se mantuvieron con los criterios del error residual m ínimo.

Ejem plo 2: A continuación se da un ejemplo de la composición de una fórmula para lactantes, para utilizarse de acuerdo con la presente invención. Esta composición se da a manera de ilustración solamente. La fuente de proteínas es una mezcla convencional de proteína de suero de leche y caseína.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Lactobacillus reuteri DSM 17938, para promover el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en un mamífero joven.

2. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mamífero joven es un animal no humano o una mascota.

3. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mamífero joven es un feto humano, un lactante prematuro o nacido a término, un bebé, o un niño.

4. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el mamífero joven ha experimentado o está experimentando un retardo en el crecimiento intrauterino (IUGR), y/o ha tenido, o se predice que tiene, un peso bajo, muy bajo, o extremadamente bajo al nacer, y/o está padeciendo o ha padecido de retardo del crecimiento del sistema nervioso entérico ya sea en el útero, o durante o después del nacimiento.

5. Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el retardo del crecimiento del sistema nervioso entérico se debe a hipoxemia-isquemia al nacimiento.

6. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la administración al feto es por medio de la madre embarazada.

7. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la administración a la madre embarazada empieza cuando ella tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 meses de embarazo, o un tiempo equivalente para la administración a un animal preñado.

8. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la administración al mamífero joven es directa o indirecta, por medio de la madre lactando.

9- Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el período de administración al feto o lactante tiene una duración de cuando menos una semana, de preferencia dos semanas, más preferiblemente de cuando menos un mes.

10. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el período de administración al bebé o niño joven tiene una duración de cuando menos 4 semanas, de preferencia de 2 a 12 meses, y de una manera muy preferible durante un período de cuando menos 18 meses.

11. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el período de administración para un niño joven es hasta que el niño tiene 4 años de edad, de preferencia, 6 años de edad, y de una manera muy preferible, 10 años de edad.

12. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 se administra directamente al lactante o al bebé en su forma pura, o diluido en agua o leche materna, en un suplemento alimenticio, o en un fortificante de leche, o en cualquier alimentación enteral, incluyendo soporte de leche durante la alimentación trófica, en una fórmula para lactantes, o en una bebida basada en leche.

1 3. Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 de acuerdo con la reivindicación 1 2, en donde la fórmula para lactantes es una fórmula para lactantes prematuros, una fórmula de inicio, o una fórmula de seguimiento, o una leche para el crecimiento.

14. Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la administración a la madre embarazada o lactando, o al niño, es oralmente, de preferencia en alimentos, bebidas, suplementos dietéticos, o composiciones farmacéuticas.

1 5. Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 8 a 12, en donde dicho Lactobacillus reuteri DSM 17938 se administra a un lactante, bebé o niño, como una dosis diaria de 1 x 103 a 1 x 1012, de preferencia , de 1 x 1 07 a 1 x 101 1 cfu (cfu = unidades formadoras de colonias).

16. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 se administra a la madre embarazada o lactando, o al lactante o bebé o niño, como una composición que comprende entre 1 x 103 y 1 x 1012 cfu/gramo de la composición seca.

17. Lactobacillus reuteri DS M 17938 de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la composición mencionada comprende ingredientes o prebióticos adicionales, de preferencia seleccionados a partir de inulina, fructo-oligosacárido (FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta (IOS de cadena corta), galacto-oligosacáridos (GOS), y oligosacáridos de leche de vaca (CMOS).

18. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con la reivindicación 15, 16 o 17, en donde la composición también comprende uno o más probióticos adicionales.

19. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el uno o más probióticos adicionales se seleccionan de preferencia a partir de Bifidobacterium longum BB536 (ATCC BAA-999); Lactobacillus rhamnosus (CGMCC 1.3724), Bifidobacterium lactis (NCC2818), o mezclas de los mismos.

20. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho Lactobacillus reuteri DSM 17938 se ha inactivado, tal como para hacerlo no replicante.

21. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico están correlacionados con un aumento en la capacidad estimulatoria neuronal en el yeyuno y/o el colon, comparándose con aquélla de los sujetos no tratados.

22. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico se manifiestan como un aumento en la expresión de Sox10 comparándose con aquélla de los sujetos no tratados.

23. Lactobacillus reuteri DSM 17938 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico se manifiestan como un nivel normal de expresión genética de GAP43, Ngfrapl, Ntf4 y S100b.

24. Una composición que comprende Lactobacillus reuteri DSM 17938, para promover el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en un mamífero joven.

25. La composición de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la composición es un suplemento alimenticio, un fortificante de leche, una fórmula de inicio para lactantes, una fórmula de seguimiento para lactantes, o una leche para el crecimiento. RESU ME N La invención se refiere a Lactobacillus reuteri DSM 1 7938, y a composiciones que comprenden Lactobacillus reuteri DSM 17938, para promover el desarrollo saludable y/o la reparación del sistema nervioso entérico en mamíferos. Los seres humanos o los animales, y en particular, un feto, un lactante prematuro o nacido a término, un bebé, o un niño, pueden beneficiarse de la invención. La invención puede ser especialmente benéfica para los lactantes que hayan experimentado un retardo en el crecimiento intrauterino (I UGR), o que tengan un peso bajo o muy bajo al nacer, y/o que hayan padecido de un retardo en el crecimiento del sistema nervioso entérico ya sea en el útero, o durante o después del nacimiento. La administración del Lactobacillus reuteri DSM 1 7938 promueve el desarrollo neuronal y glial normal y saludable. También asegura una diferenciación neuronal saludable en el sistema nervioso periférico.