MX2014007336A - Sistema que provee una reaccion catalizada por perhidrolasas. - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen paquetes para almacenar y dispensar formulaciones de múltiples partes para el blanqueamiento de los dientes que incluyen un material deformable configurado para formar dos o más cámaras selladas, por ejemplo, donde la primera cámara contiene una solución líquida de baja viscosidad que incluye una enzima con actividad perhidrolítica, y la segunda cámara contiene una fuente de peróxido y al menos un donante de sustrato de acilo. De igual forma Se proporcionan las formulaciones particulares de múltiples partes para el blanqueamiento de los dientes utilizando este principio y los métodos de uso de los mismos.

Description

SISTEMA QUE PROVEE UNA REACCIÓN CATALIZADA POR PERHIDROLASAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Con frecuencia se desea mantener separados los componentes de una formulación antes de utilizarlos, por ejemplo, en cuanto, a que ios componentes pueden se muy inestables para su almacenamiento a largo plazo si se combinan. En estos casos, se desea la capacidad de combinar los componentes de la · formulación en el momento de utilizarlos de una manera eficaz y sencilla.

Un ejemplo de una formulación donde puede desearse mantener los componentes de la formulación separados son las formulaciones de blanqueamiento dental que incluyen ingredientes reactivos tales como peróxidos o peroxiácidos o sus precursores. Por ejemplo, se puede desear combinar A+B o A+B+C para obtener un blanquead r inestable X, pero mantener A y B separados hasta ese momento. La dificultad surge en que, durante su uso, la combinación debe ser rápida, y la difusión del agente blanqueador, X, sobre la superficie dental debe ser eficaz. Desafortunadamente, la combinación de múltiples geles u otros materiales moderadamente viscosos por lo general no es una manera eficaz de rápidamente combinar agentes químicos; si un consumidor típico fuese a combinarlos manualmente, esto conllevaría a regiones de la muestra bien combinadas y poco combinadas. Tan solo hay que mezclar manualmente dos pinturas viscosas de uso doméstico entre si para visualizar el problema con facilidad: en lugar de una combinación eficaz de los dos colores, el flujo laminar hace que los colores existan en franjas adyacentes. El superar este problema directamente requiere de más tiempo y de un mayor esfuerzo de mezclado del que el usuario típico estaría dispuesto a dedicar a la tarea y, cuando la especie reactiva X comienza a descomponerse en minutos, este método es inútil. Por consiguiente, existe una necesidad de productos que permitan combinar los ingredientes eficaz y efectivamente al momento de utilizarlos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un sistema de múltiples cámaras, donde una cámara contiene una solución líquida de baja viscosidad y otra contiene un líquido, un polvo o una mezcla de polvos, donde una barrera frágil o rompible separa las cámaras de forma tal que al comprimir una cámara, la barrera se rompe y se pueden combinar los componentes de las cámaras para formar una solución, una emulsión, una suspensión o un gel moldeable, que pueda dispensarse a través de una descarga en la segunda cámara, donde la solución líquida de baja viscosidad incluye una proteína que tiene actividad perhidrolasa que contiene la porción distintivo de la familia 7 de carbohidrato esterases, y la otra cámara o cámaras contienen un donante de acilo, por ejemplo, un éster de ácido carboxilico y una fuente de peróxido, de forma tal que al combinarse el contenido de las cámaras, la proteina que tiene actividad perhidrolasa catalice una reacción entre el peróxido liberado por la fuente de peróxido y el donante de acilo para formar un perácido. Aplicado a los dientes, este perácido os sumamente eficaz, para blanquear los dientes, de forma tal que se puede locjrar una acción blanqueadora eficaz en un periodo más corto y con niveles inferiores de peróxido .

En una modalidad particular, una cámara contiene una solución acuosa de baja viscosidad que. incluye una proteina que tiene actividad ' perhidrolitica (es decir, una carbohidrato esterasa de la familia 7) y la otra cámara contiene un qelante, un peróxido y un compuesto de éster de ácido carboxilico, todos en forma de polvos, de forma tal que cuando la barrera se rompe y se permite combinar el contenido de las cámaras, el peróxido y el éster de ácido carboxilico pueden reaccionar, . donde la reacción la cataliza la perhidrolasa, para formar un perácido, en un gel moldeable formado por el liquido y el gelante, gel moldeable éste que puede luego moldearse y aplicarse a los dientes, por ejemplo, utilizando un molde o una cinta, durante un tiempo suficiente, por ejemplo, de 10-30 minutos, para permitir que los dientes : : blanqueen.

Otras áreas de aplicación de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada incluida más adelante en la presente. Se entenderá que, aunque indican la modalidad preferente .de la invención, se prevé que la descripción detallada y los ejemplos específicos tengan fines meramente ilustrativos y que no se prevé limiten el alcance de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS BIOLÓGICAS Las sigui entes secuencias cumplen con 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825 ("Requisitos para Solicitudes de Patente que Contienen Secuencias de Nucleótidos y/o de Aminoácidos - Las Normas de las Secuencias") y son consistentes con la Norma ST.25 (2009) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (WIPO, por sus siglas en inglés) y con los requisitos para listados de secuencias . del Convenio Europeo de Patentes (EPC, por sus siglas en inglés) y con las Reglas 5.2 y 49.5(a-bis) del Tratado de Cooperación en Materia de Patentes (PCT, por sus siglas en inglés) , y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas. Los símbolos y el formato utilizados en los datos de secuencias de nucleotidos y aminoácidos cumplen con las reglas expuestas en 37 C.F.R. § 1.822.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la perhidrolasa de variante Thermotoga marítima C277S.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión que incluye la perhidrolasa de variante Thermotoga m. -i r i t ima C277S acoplada a un dominio de unión dental (también conocido como "EZ-7" en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO2012/087970A2 otorgada a Butterick et al.).

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cefalosporina C deacetilasa de Bacillus subtilis ATCC® 31954™.

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de Bacillus subtilis ATCC® 31954™.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de la cepa 168 Bacillus subtilis subespecie subtilis.

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de B . subtilis ATCC® 6633™.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de B . licheniformis ATCC® 14580™.

La SEQ ID NO; 8 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de B. pumilus PS213.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de Clostrídium thermocellum ATCC® 27405™.

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de Thermotoga neapolitana .

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de Thermotoga marítima MSB8.

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de Thermoanaerobacterium sp. J /SL YS485.

La SEQ ID NO: 13 es .la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de Bacillus halodurans C-125.

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de Bacillus clausii KSM-K16.

La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la acetil xilano esterasa de Thermotoga neapolitana de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2010-0087529 (incorporada en la presente a titulo de referencia en su totalidad) , donde el residuo Xaa en la posición 277 es Ala, Val, Ser, o Thr.

La SEQ ID NO: 16 es .la secuencia de aminoácidos de una variante de la acetil xilano esterasa de Thermotoga marítima MSB8 de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2010-0087529, donde el residuo Xaa en la posición 277 es Ala, Val, Ser, o Thr.

La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos deducida de una variante de la acetil x Llano esterasa de Thermotoga lettingae de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2010-0087529, donde el residuo Xaa en la posición 277 es Ala, Val, Ser, o hr.

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la acetil xilano esterasa de Thermotoga petrophila de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2010-0087529, donde el residuo Xaa en la posición 277 es Ala, Val, Ser, o Thr.

La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la acetil xilano esterasa de Thermotoga especie RQ2 derivada de "RQ2 (a) " de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2010-0087529, donde el residuo Xaa en la posición 277 es Ala, Val, Ser, o Thr.

La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos de una variante de la acetil xilano esterasa de Thermotoga especie RQ2 derivada de "RQ2 (b) " de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2010-0087529, donde el residuo Xaa en la posición 278 es Ala, Val, Ser, o Thr.

La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de Thermotoga lettingae.

La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de una acetil xilano esterasa de Thermotoga petrophila , La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de una primera acetil xilano esterasa de Thermotoga especie RQ2 descrita como "RQ2 (a) " .

La SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de una segunda acetil xilano esterasa de Thermotoga especie RQ2 descrita como "RQ2 (b) " .

La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de una cefalosporina C deacetilasa de Thermoanearoba.cterium saccharolyticum.

La SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos de la acetil xilano esterasa de Lactococcus lactis (número de acceso GENBANK® ABX75634.1 ) .

La SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos de la acetil xilano esterasa de Mesorhi zobium loti (número de acceso GENBANK® BAB53179.1).

La SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de la acetil xilano esterasa de Geobacillus stearothermophilus (número de acceso GENBANK® AAF70202.1).

Las SEQ ID NO 29-163 son las secuencias de aminoácidos de los péptidos que tienen afinidad hacia una superficie de la cavidad oral.

Las SEQ ID NO: 164-177 son las secuencias de aminoácidos de los enlazadores/espaciadores de péptidos.

Las SEQ ID NO: 178-197 son las secuencias de aminoácidos de diversos constructos de fusión de perhidrolasas diana que incluyen una enzima perhidrolitica acoplada a través de un enlazador peptidico a un dominio de unión que tiene afinidad hacia una superficie oral (véase la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO2012/087970A2 otorgada a Butterick et al.) .' BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor claridad a partir de la descripción detallada y las figuras adjuntas, donde: La Figura 1 ilustra una modalidad de la invención que es un envase de dos cámaras de acuerdo con la invención, donde el envase se sella con calor alrededor del perímetro (1), y tiene una primera cámara (2) que contiene un componente líquido y una segunda cámara (4) que incluye un componente en polvo, separadas por un sello frágil (3) , de forma tal que cuando se comprime la primera cámara (2), se rompe el sello frágil (3) y el líquido fluye hacia el interior de la segunda cámara (4) y se combina con el polvo, donde la mezcla resultante puede luego dispensarse rompiendo el borde ranurado (5) para permitir que la mezcla fluya o se exprima por la boquilla (6).

La Figura 2 ilustra otra modalidad de la invención, que permite combinar los componentes justo antes de utilizarlos, conforme se describe en la Figura 1, pero utilizando una envase de tres cámaras que tiene una boquilla que puede abrir el consumidor para dispensar el producto. En esta modalidad, el envase incluye una primera cámara (7), una segunda cámara (8), una tercera cámara (9), donde las cámaras las separa sellos frágiles (3), y una boquilla con una punta rompible (6) para dispensar los materiales luego de combinarlos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción de la o las modalidades preferentes es de naturaleza meramente ilustrativa y no se prevé que de manera alguna limite la invención, su aplicación, o usos.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "sustrato", "sustrato adecuado", "donante de acilo", y "sustrato de éster de ácido carboxilico" de forma intercambiable se refieren específicamente a: (a) uno o más ésteres que tienen la estructura • [X]mR5 donde: X es un grupo éster de la fórmula R6C(0)0; R6 es un grupo hidrocarbilo Cl a C 7 lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C 4 , donde Re opcionalmente incluye uno o más enlaces éter cuando R6'es C2 a C7 ; R5 es un grupo hidrocarbilo Cl a C 6 lineal, ramificado, o cíclico o un grupo heteroaromático cíclico de cinco miembros o un grupo aromático o heteroaromático cíclico de seis miembros opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo; donde cada átomo de carbono en R5 individualmente incluye no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster, y donde R5 opcionalmente incluye uno o más enlaces éter; m es un número entero que oscila entre 1 y el. número de átomos de carbono en R5, dónde: uno o más ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 2 5 ° C ; o (b) uno o más glicéridos que tienen la estructura O R-i—— C O CH2 CH CH2 OR4 OR3 donde Rx es un alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R3 y R4 individualmente son H o RiC ( O ) ; o (c) uno o más ésteres de la fórmula donde Ri es un alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R2 es un alquilo Cl a CIO de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -0) nH y n es 1 a 10; o (d) uno o más monosacáridos acetilados, disacáridos acetilados, o polisacáridos acetilados; o (e) cualquier combinación de (a) a (d) .

Conforme se utiliza en la presente, el término "perácido" es sinónimo de peroxiácido, ácido peroxicarboxilico, ácido peroxi, acido percarboxílico y ácido peroxoico.

Conforme se utiliza en la presente, el término "ácido peracético" se abrevia como "PAA" y es sinónimo de ácido peroxiacético, ácido etanoperoxoico y todos los demás sinónimos del Número de Registro CAS .79-21-0.

Conforme se utiliza en la presente, el término "monoacetina" es sinónimo de monoacetato de glicerol, monoacetato de glicerina y monoacetato de glicerilo.

Conforme se utiliza .en la presente, el término "diacetina" es sinónimo de diacetato de glicerol, diacetato de glicerina, diacetato, de glicerilo., y todos los demás sinónimos del Número de Registro CAS 25395-31-7.

Conforme se utiliza en la presente, el término "triacetina" es sinónimo de triacetato de glicerina, triacetato de glicerol, triacetato de glicerilo, 1,2,3-triacetoxipropano, triacetato de 1, 2, 3-propanotriol y todos los demás sinónimos del Número de Registro CAS 102-76-1.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "azúcar acetilado" y "sacárido acetilado" se refieren a mono, di- y polisacáridos que incluyen al menos un grupo acetilo. Algunos ejemplos de modo no taxativo incluyen pentaacetato de glucosa, tetraacetato de xilosa, xilano acetilado, fragmentos de xilano acetilado, 1, 2, 3, 5-tetraacetato de ß-D-ribofuranosa; tri-O-acetil-D-galactal ; y tri-O-acetil-glucal .

Conforme se utilizan en la presente, los términos "hidrocarbilo", "grupo hidrocarbilo" y "fracción hidrocarbilo" significan una configuración de cadena recta, de cadena ramificada o cíclica de átomos de carbono conectados por enlaces simples, dobles o triples carbono a carbono y/o por enlaces éter y sustituidos en conformidad con átomos de hidrógeno. Estos grupos hidrocarbilo pueden ser alifáticos y/o aromáticos. Algunos ejemplos de grupos hidrocarbilo incluyen metilo, etilo, .propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, pentilo, ciclopentilo, metileiclopentilo, hexilo, ciclohexilo, bencilo y fenilo. En una modalidad preferente, el grupo hidrocarbilo es una configuración de cadena recta, de cadena ramificada o cíclica de átomos de carbono conectados por enlaces simples carbono a carbono y/o por enlaces éter, y sustituidos en conformidad con átomos de hidrógeno.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "monoésteres" y "diésterés" de 1 , 2-etanodiol 1,2-propanodiol; 1 , 3-propanodiol ; 1, 2-butanodiol; 1 , 3-butanodiol ; 2 , 3-butanodiol; 1, -butanodiol; 1 , 2-pentanodiol ; 2,5-pentanodiol; 1, 5-pentanodiol; 1, 6-pentanodiol; 1,2-hexanodiol; 2 , 5-hexanodiol; 1 , 6-hexanodiol ; y sus combinaciones, se refieren a los compuestos que incluyen al menos un grupo éster de la fórmula RC(0)0, donde R es un grupo hidrocarbilo Cl a C7 lineal. En una modalidad, el sustrato de éster de ácido carboxilico se selecciona del grupo que consiste en diacetato de propilenglicol (PGDA), diacetato de etilenglicol (EDGA) , y sus combinaciones.

Conforme se utiliza en . la presente, el término "diacetato de propilenglicol" es sinónimo de 1,2-diacetoxipropano, diacetato de propileno, diacetato de 1,2-propanodiol, y todos los demás sinónimos del Número de Registro CAS 623-84-7.

Conforme se utiliza et la presente, el término "diacetato de etilenglicol" es sinónimo de 1,2-diacetoxietano, diacetato de etileno, diacetato de glicol y todos los demás sinónimos del Número de Registro CAS 111-55-7.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "mezcla de reacción enzimática adecuada", "componentes de reacción adecuados", ^mezcla de reacción acuosa adecuada", "mezcla de reacción" y "componentes que generan perácidos" se refieren a los materiales y el agua en la que se ponen en contacto los reactivos y el catalizador de la enzima perhidrolitica . Los componentes que generan perácidos incluyen al menos una enzima que tiene actividad perhidrolitica, donde la enzima perhidrolitica es al menos una perhidrolasa CE-7 (opcionalmente en la forma de una proteina de fusión dirigida a una superficie corporal), al menos un sustrato de éster de ácido carboxilico adecuado, una fuente de peroxigeno y agua.

Conforme se utiliza en la presente, el término "perhidrólisis" se define como la reacción de un determinado sustrato con peróxido para formar un perácido. Por lo general, se lleva a cabo la reacción de un peróxido inorgánico con el sustrato elegido en la presencia de un catalizador para producir el ácido peroxicarboxilico .

Conforme se utiliza en la presente, el término "perhidrólisis química" incluye las reacciones de perhidrólisis en las que se combina un sustrato (un precursor del ácido peroxicarboxilico) con una fuente de peróxido de hidrógeno, donde el ácido peroxicarboxilico se forma en la ausencia de un catalizador enzimático. Conforme se utiliza en la presente, el término "perhidrólisis enzimática" incluye las reacciones de perhidrólisis en las que se combina un sustrato de éster de ácido carboxílico (un precursor del perácido; el "donante de acilo") con una fuente de peróxido de hidrógeno y agua, donde el catalizador enzimático cataliza la formación del perácido.

Conforme se utiliza en la presente, el término "actividad perhidrolasa" se refiere a la actividad del catalizador por unidad de masa (por ejemplo, miligramo) de proteína, peso celular seco o peso del catalizador inmovilizado.

Conforme se utiliza en la presente, "una unidad de actividad enzimática" o "una unidad de actividad" o "U" se define como la cantidad de actividad perhidrolasa necesaria para producir 1 µ???? del producto ácido peroxicarboxilico por minuto a una temperatura específica.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "catalizador enzimático" y "catalizador de perhidrolasa" se refieren a un catalizador que incluye una enzima que tiene actividad de perhidrólisis y puede asumir la forma de una célula microbiana completa, una o más células microbianas permeables, una o más componentes celulares de un extracto de células microbianas, una enzima parcialmente purificada, o una enzima purificada. El catalizador enzimático también puede modificarse químicamente (tal como por pegilación o por medio de su reacción con reactivos de reticulación) . El catalizador de perhidrolasa puede también inmovilizarse sobre un soporte soluble o insoluble utilizando métodos ampliamente conocidos por aquellos con experiencia en la técnica; véase, por ejemplo, Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997.

Conforme se utiliza en la presente, "acetil xilano esterasas" se refiere a una enzima (E.C. 3.1.1.72; AXEs) que cataliza la desacetilación de los xilanos acetilados y otros sacáridos acetilados.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "cefalosporina C deacetilasa" y "cefalosporina C acetil hidrolasa" se refieren a una enzima (E.C. 3.1.1.41) que cataliza la desacetilación de cefalosporinas tales como cefalosporina C y ácido 7-aminocefalosporánico (Mitsushima et al., (1995) Appl. Env. Microbiol. 61 ( 6): 2224-2229) . En la presente se proporcionan las secuencias de aminoácidos de diversas cefalosporina C deacetilasas que tienen una actividad perhidrolitica considerable.

Conforme se utiliza en la presente, el término "Bacillus subtilis ATCC® 31954™" se refiere a una célula bacteriana depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) que tiene el número de . acceso de depósito internacional ATCC® 31954™. Conforme se describe en la presente, se proporciona üna enzima que tiene una actividad perhidrolasa considerable de B. subtilis ATCC® 31954™ como SEQ ID NO: 4 (véase la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2010-0041752) .

Conforme se utiliza en la presente, el término "Thermotoga marítima MSB8" se refiere a una célula bacteriana que se informa tiene actividad acetil xilano esterasa (GENBANK® NP_227893.1; véase la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2008-0176299) . Se proporciona la secuencia de aminoácidos de la enzima que tiene actividad perhidrolasa de Thermotoga marítima MSB8 como la SEQ ID NO: 11. Se proporcionan variantes de la perhidrolasa de Thermotoga marítima MSB8 como las SEQ ID NO: 1 y 16.

Conforme se utilizan en la presente, una "molécula de ácido nucleico aislada", un "polinucleótido aislado" y un "fragmento de ácido nucleico aislado" son utilizados de forma intercambiable y se refieren a un polímero de ARN o ADN que es mono- o bicatenario y que opcionalmente contiene . bases nucleotidicas sintéticas,' no naturales o alteradas. Una molécula de ácido nucleico aislada en la forma de un polímero de ADN puede consistir de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término "aminoácido" se refiere a la unidad estructural química básica de una proteína o un polipéptido. En la presente se utilizan las siguientes abreviaturas para identificar aminoácidos específicos : Conforme se utilizan en la presente, una "molécula de ácido nucleico aisladá", un "polinucleótido aislado" y un "fragmento de ácido nucleico aislado" se utilizan de forma intercambiable y se refieren a un polímero de ARN. Conforme se utilizan en la presente, los términos "motivo distintivo" y "motivo de diagnóstico" se refieren a estructuras conservadas que comparten una familia de enzimas que tienen una actividad definida. Se puede utilizar el aspecto distintivo para definir y/o identificar la familia de enzimas estructuralmente relacionadas que tienen una actividad enzimática similar hacia una familia definida de sustratos. La porción distintivo' puede ser una única secuencia de aminoácidos contiguos o una agrupación de motivos conservados no contiguos que juntos forman la porción distintivo. Por lo general, el o los motivos conservados se representan con una secuencia de aminoácidos. En una modalidad, las enzimas perhidrolíticas utilizadas en las presentes composiciones y métodos incluyen una porción distintivo del carbohidrato esterasa CE-7.

Conforme se utiliza en la presente, el término "software de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo informático o programa de software que sea de utilidad en el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "software de análisis de secuencias" puede estar disponible a nivel comercial o puede desarrollarse de manera independiente. El software típico de análisis, secuencias de modo no taxativo incluye la suite GCG de programas ( isconsin Package Versión 9.0, Accelrys Software Corp., San Diego, CA) , BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-410 (1990)), y DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA), CLUSTAL (por ejemplo, versión 1.83; Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22 (22) : 673-4680 (1994)), y el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith- aterman ( . R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp. ] (1994), Fecha de Reunión 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, ' Sandor. Editor: Plenum, New York, NY) , Vector NTI (Informax, Bethesda, MD) y Sequencher v. 4.05. Dentro del contexto de la presente solicitud, se entenderá que cuando se utiliza el software de análisis de secuencias en el análisis, los resultados del análisis se basan en los "valores por defecto" del programa en cuestión, a no ser que se especifique algo diferente. Conforme se utilizan en la presente, "valores por defecto" significan cualquier conjunto de valores o parámetros fijados por el fabricante del software que originalmente se cargan con el software cuando se inicializa por primera vez.

El término "superficie corporal" se refiere a cualquier superficie del cuerpo humano que pueda fungir como diana de un agente beneficioso, tal como un agente beneficio perácido. Los presentes métodos y composiciones se dirigen a aplicaciones y productos para el cuidado oral. Como tal, la superficie corporal incluye un material/superficie de la cavidad oral. En una modalidad, el material de la cavidad oral incluye el esmalte dental.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "blanqueamiento dental" y "blanqueamiento de los dientes" se utilizan de forma intercambiable para referirse a mejorar el brillo (por ejemplo, blanquear) de uno o más dientes.

Conforme se utilizan en la presente, "manchas intrínsecas" en los dientes se refieren al color resultante de los cromógenos dentro del esmalte y que yacen bajo la dentina. El color intrínseco de los dientes humanos tiende a tornarse más amarillo con la edad, debido al adelgazamiento del esmalte y al oscurecimiento de la dentina amarilla subyacente. La eliminación de una mancha intrínseca usualmente requiere el uso de peróxidos u otros agentes químicos oxidantes, que penetran el esmalte y decoloran los cromógenos internos.

A diferencia de las manchas intrínsecas, se forman "manchas extrínsecas" sobre la superficie de los dientes cuando se adhieren materiales cromogénicos exógenos al esmalte, usualmente dentro de la película natural que recubre los dientes. La mayoría de las personas acumulan cierto grado de manchas extrínsecas desagradables sobre sus dientes con el tiempo. Este proceso de. coloración lo promueven factores tales como: (1) la ingesta de alimentos y bebidas que contienen taninos tales como café, té, o vino tinto; (2) el uso de productos de tabaco; y/o (3) la exposición a ciertas sustancias catiónicas; (por ejemplo, estaño, hierro, y clorhexidina ) . Estas sustancias tienden a adherirse a la estructura de hidroxiapatita del esmalte, lo que conlleva a decoloración de los dientes y una reducción concomitante en la blancura de los dientes. Durante un período de años, las manchas extrínsecas pueden penetrar la capa de esmalte y tener como resultado manchas intrínsecas.

Conforme se utiliza en la presente, el término "desmanchar" o "desmanchado" se refiere al proceso de eliminación de una mancha de una superficie de la cavidad oral. La o las manchas pueden ser manchas intrínsecas, manchas extrínsecas, o una combinación de ambas.

Conforme se utiliza en la presente, "cantidad eficaz de la enzima perhidrolasa" se refiere a la cantidad de la enzima perhidrolasa necesaria para lograr la actividad enzimática necesaria en la aplicación específica. Estas cantidades eficaces son determinadas con facilidad por una persona con conocimientos básicos en la técnica y se basa en numerosos factores, tales como la variante particular de la enzima utilizada.

Conforme se utiliza en -la presente, el término "fuente de peroxígeno" se refiere a los compuestos capaces de proporcionar peróxido de hidrógeno a una concentración de alrededor de 1 mM o más cuando se encuentran en una solución acuosa, lo que de modo no taxativo incluye peróxido de hidrógeno, aductos de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, un aducto de urea-peróxido de hidrógeno (peróxido de carbamida)), perboratos, y percarbonatos . Conforme se describe en la presente, la fuente de peroxígeno en las presentes cintas blanqueadoras asume la forma de partículas granulares, donde el usuario hidrata las partículas granulares de peróxido para liberar una cantidad eficaz de peróxido de hidrógeno. Conforme se describe en la presente, la concentración de peróxido de hidrógeno proporcionada por el compuesto de peroxígeno en la formulación de reacción acuosa inicialmente es al menos 0.1 mM o más luego de combinar los componentes de reacción. En una modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es al menos 0.5 mM. En una modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es al menos 1 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es al menos 10 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es al menos 100 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es al menos .200 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es 500 mM o más. En incluso otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de reacción acuosa es 1000 mM o más. La relación molar de peróxido de hidrógeno a sustrato enzimático, por ejemplo, triglicérido, (H202: sustrato) en la formulación puede ser de alrededor de 0.002 a 20, preferentemente de alrededor de 0.1 a 10 y más preferentemente de alrededor de 0.1 a 1.

Conforme se utiliza en la presente, el término "oligosacárido" se refiere a .compuestos que contienen entre 2 y al menos 24 unidades monosacárido unidas por enlaces glicosidicos . El término "monosacárido" se refiere a un compuesto de la fórmula empírica (CH20)n, donde n=3, el esqueleto de carbono no es ramificado, cada átomo de carbono salvo uno contiene un grupo hidroxilo y el átomo de carbono restante es un aldehido o cetona en el átomo de carbono 1. El término "monosacárido" también se refiere a las formas hemiacetal o hemicetal intracelulares cíclicas.

Conforme se utiliza en la presente, el término "adhesivo hidratable" se refiere a un material adhesivo capaz de hidratarse. El adhesivo hidratable se mantiene esencialmente seco y no adherente hasta hidratarse. Luego de su hidratación, el adhesivo hidratable se torna lo suficientemente adhesivo como para unirse a la superficie de un diente.

Conforme se utiliza en la presente, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de material necesaria para lograr el efecto deseado.

Conforme se utiliza en la presente, el término "esencialmente no adhesivo hasta hidratarse" se refiere a la falta de fuerza adhesiva suficiente para adherirse a la superficie de los dientes antes de hidratarse.

La "identidad, de secuencia" significa la identidad de los aminoácidos utilizando un programa de alineación de secuencias, por ejemplo, ClustalW o BLAST, por ejemplo, generalmente como se describe en Altschul SF, Gish W, iller W, Myers EW, Lipman DJ, "Basic local alignment search tool", J Mol Biol (1990) 215 (3) : 403-410, y Goujon M, McWilliam H, Li W, Valentín F, Squizzato S, Paern J, López R, Nucleic Acids Research (2010) 38 Suppl : W695-9.

Los donantes de acilo utilizados en la presente invención, por ejemplo, para formar perácidos luego de su reacción con peróxido, se seleccionan de uno o más de (i) ácidos carboxílicos C2-ier por ejemplo, ácidos carboxílicos C26 (por ejemplo, ácido acético), lo que incluye los ácidos carboxílicos de alquilos inferiores lineales o ramificados, opcionalmente sustituidos con hidroxi y/o alcoxi Ci_4; (ii) sus ásteres hidrolizables y aceptables (por ejemplo, mono-, di- y tri-glicéridos y sacáridos acilados) y (iii) sus combinaciones. Por ejemplo, los donantes de acilo incluyen 1 , 2 , 3-triacetoxipropano (a veces denominado en la presente triacetina o triacetato de glicerina) y sacáridos acilados, por ejemplo, sacáridos acetilados. En una modalidad particular, los ásteres con este uso pueden, por ejemplo, ser ásteres que tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C.

Es opcional que los donantes de acilo y/o enzimas puedan encapsularse . Existe una variedad de opciones de encapsulación ampliamente conocidas en la técnica, tanto naturales como sintéticas. Los almidones modificados y la goma arábiga son particularmente ideales por cuanto son de grado alimenticio, son relativamente poco costosos, son rápidos de disolver y pueden adsorber niveles bastante altos de aceites líquidos. Se debe considerar cualquier impacto sobre la viscosidad final.

En algunas modalidades, los gránulos incluyen un agente antisensibilidad capaz, de desensibilizar los nervios o de ocluir los túbulos de la dentina. En algunas modalidades, el agente antisensibilidad se selecciona de una fuente de iones de potasio, un silicato, una fuente de iones de estaño, un aminoácido básico, una arcilla y una combinación de ellos. En algunas modalidades, la fuente de iones de potasio es una sal de potasio oralmente aceptable y está presente en una cantidad eficaz para reducir la sensibilidad de la dentina. En algunas modalidades, la fuente de iones de potasio se selecciona de cloruro de potasio, nitrato de potasio y una combinación de ellos. ¦ En algunas modalidades, el aminoácido básico es arginina. En algunas modalidades, el aminoácido básico se selecciona de fosfato de arginina, bicarbonato de arginina, y clorhidrato de arginina. En algunas modalidades, el silicato es silicato de calcio.

Perhidrolasas CE-7 Las presentes composiciones y el presente método incluyen enzimas que tienen actividad perhidrolitica que estructuralmente se clasifican como miembros de la familia 7 de carbohidrato esterasas (familia CE-7) de enzimas (véase Coutinho, P.M., Henrissat, B. "Carbohydrate-active enzymes: an integrated datábase approach" en Recent Advances in Carbohydrate Bioengineerinq, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson editores, (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12.)· Se demostró que la familia CE-7 de enzimas es particularmente eficaz para producir ácidos peroxicarboxilicos a partir de una variedad de sustratos de ésteres de ácidos carboxilicos cuando se combinan con una fuente de peroxigeno (Patentes de los EE.UU. 7.794.378; 7.951.566; 7.723.083; y 7.964.378 y Publicación de las Solicitudes de Patente de los EE.UU. No. 2008-0176299, 2010-0087529, 2011-0081693, y 2011-0236335 otorgadas a DiCosimo et al.; cada una incorporada en la presente a titulo de referencia) .

Los miembros de la familia CE-7 incluyen las cefalosporina C deacetilasas (CAHs, por sus siglas en inglés; E.C. 3.1.1.41) y las acetil xilano esterasas (AXEs, por sus siglas en inglés; E.C. 3.1.1.72). Los miembros de la familia de las esterasas CE-7 comparten una porción distintivo conservado (Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606 (2003)). Las perhidrolasas que incluyen la porción distintivo de CE-7 ( "perhidrolasas CE-7") y/o una estructura esencialmente similar se pueden utilizar en las composiciones y métodos descritos en la presente. Los medios para identificar moléculas biológicas esencialmente similares son ampliamente conocidos en la técnica (por ejemplo, protocolos de alineación de secuencias, hibridizaciones de ácidos nucleicos y/o la presencia de una porción distintivo conservado) . En un aspecto, la perhidrolasa incluye una enzima que incluye la porción distintivo de CE-7 y al menos 20%, preferentemente al menos 30%, más preferentemente al menos 33%, más preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 42%, más preferentemente al menos 50%, más preferentemente al menos 60%, más preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90%, y más preferentemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de aminoácidos con una de las secuencias proporcionadas en la presente.

Conforme se utiliza en la presente, la frase "enzima que estructuralmente se clasifica . como una enzima CE-7", "perhidrolasa CE-7" o "que estructuralmente se clasifica como una enzima de la familia 7 de carbohidrato esterasas" se utiliza para referirse a las enzimas que tienen actividad perhidrolitica y que se clasifican estructuralmente como una carbohidrato esterasa CE-7. Esta familia de enzimas puede definirse mediante la presencia' de una porción distintivo (Vincent et al., supra)-. La porción distintivo de las esterasas CE-7 incluye tres motivos conservados (numeración de la posición del residuo con respecto a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1; una variante C277S de la perhídrolasa de Thermot,oga marítima) .

Argll8-Glyll9-Glnl20; Glyl86-Xaal87-Serl88-Glnl89-Glyl90; e His303-Glu304.

Típicamente, el Xaa en la posición del residuo de aminoácidos 187 es glicina, alahina, prolina, triptófano o treonina. Dos de los · tres residuos de aminoácidos pertenecientes a la tríada catalítica están en negrillas. En una modalidad, el Xaa en la posición del residuo de aminoácidos 187 se selecciona del grupo que consiste en glicina, alanina, prolina, triptófano y treonina.

Un análisis adicional de los motivos conservados dentro de la familia CE-7 de carbohidrato esterasas indica la presencia de una porción conservado adicional (LXD en las posiciones de aminoácidos 272-274 de la SEQ ID NO: 1) que se puede utilizar para definir' mejor una perhídrolasa perteneciente a la familia CE-7 de carbohidrato esterasas. En otra modalidad, la porción distintivo antes definido puede incluir un (cuarto) porción conservado adicional definido como : Leu272-Xaa273-Asp274.

El Xaa en la posición del residuo de aminoácidos 273 típicamente es isoleucina, valina, o metionina. El cuarto porción incluye el residuo de ácido aspártico (negrilla) que pertenece a la tríada catalítica (Serl88-Asp274-His303 ) .

Las perhidrolasas CE-7 pueden asumir la forma de proteínas de fusión 'que tienen al menos un componente peptídico que tiene afinidad hacia al menos una superficie corporal. En una modalidad, todas las alineaciones utilizadas para determinar si una perhidrolasa diana (proteína de fusión) incluye la porción distintivo de CE-7 se basan en la secuencia de aminoácidos de la enzima perhidrolítica sin el componente peptídico que tiene la afinidad hacia una superficie corporal.

Se puede utilizar un número de algoritmos de alineación global ampliamente conocidos (es decir, software de análisis de secuencias) para ' alinear dos o más secuencias de aminoácidos que representan las enzimas que tienen actividad perhidrolasa para determinar si la enzima consiste en el presente aspecto distintivo. Se comparan la o las secuencias alineadas con la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 1) para determinar la existencia día porción distintivo. En una modalidad, se utiliza una alineación CLUSTAL (tal como CLUSTALW) utilizando una secuencia de aminoácidos de referencia (como se utiliza en la presente, la secuencia de perhidrolasas (SEQ ID NO.: 1)) para identificar las perhidrolasas que pertenecen a la familia de las esterasas CE-7. La numeración relativa de los residuos de aminoácidos conservados se basa en la numeración de residuos de la secuencia de aminoácidos de referencia para dar razón de las pequeñas inserciones o eliminaciones (por ejemplo, típicamente cinco aminoácidos de menos) dentro de la secuencia alineada.

Algunos ejemplos de otros algoritmos adecuados que se pueden utilizar para identificar las secuencias que incluyen el presente porción distintivo (cuando se comparan con la secuencia de referencia) incluyen, de modo no taxativo, Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970),· una herramienta de alineación global) y Smith-Waterman (J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981); una herramienta de alineación local) . En una modalidad, se aplica una alineación de Smith- aterman utilizando los parámetros por defecto. Un ejemplo de parámetros por defecto adecuados incluye el uso de una matriz de evaluación BLOSU 62 con penalizacion de la apertura de GAP = 10 y una penalizacion de la extensión de GAP = 0.5.

En una modalidad, las perhidrolasas adecuadas incluyen las enzimas que incluyen la porción distintivo de CE-7 y al menos 20%, preferentemente al menos 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% dé identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1.

Algunos ejemplos de las carbohidrato esterasas CE-7 adecuadas que tienen actividad perhidrolitica incluyen, de modo no taxativo, las enzimas que tienen una secuencia de aminoácidos tal como las SEQ ID NO: 1, y 4-28. En una modalidad, la enzima incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que. consiste en 1, 10, 11, 15, y 16.

Conforme se utiliza en la presente, el término "variante de CE-7", "variante de perhidrolasa" o "variante" se refiere a las perhidrolasas CE-7 que tienen una modificación genética que tiene como resultado al menos una adición, eliminación, y/o sustitución de aminoácidos cuando se comparan con la enzima correspondiente (típicamente la enzima de tipo silvestre) de la que se deriva la variante; siempre que se conserven la porción, distintivo de CE-7 y la actividad perhidrolitica asociada. También se pueden utilizar perhidrolasas de la variante CE-7 en las presentes composiciones y métodos. Se incluyen ejemplos de las variantes CE-7 como las SEQ ID NO: 1, 15, 16, 17, 18, 19, y 20. En una modalidad, las variantes pueden incluir las SEQ ID NO: 1 y 16. .

Un experto en la técnica reconocerá que también se pueden utilizar secuencias de perhidrolasas CE-7 esencialmente similares (conservando los motivos distintivos) en las presentes composiciones y métodos . En una modalidad, se definen secuencias esencialmente similares por su capacidad de hibridización, bajo condiciones sumamente rigurosas, con las moléculas de ácido nucleico asociadas con las secuencias ilustradas en la presente. En otra modalidad, se pueden utilizar algoritmos de alineación de secuencias para definir enzimas esencialmente similares en función de la identidad porcentual con las secuencias de ADN o aminoácidos proporcionadas en la presente.

Conforme se utiliza en la presente, una molécula de ácido nucleico se "híbrida" en otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, un ADN genómico o un ARN, cuando una cadena única de la primera molécula puede hibridar con la otra molécula bajo condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son ampliamente conocidas y se ilustran en Sambrook, j. y Russell, D., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001) . Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Se pueden ajusfar las condiciones de severidad para identificar moléculas moderadamente similares, tales como las secuencias homologas de organismos lejanamente relacionados, a moléculas de alta similitud, tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Los lavados Post-hibridación típicamente determinan las condiciones de severidad. Un conjunto de condiciones preferentes utili a una serie de lavados partiendo de SSC 6X, SDS al 0.5% a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se repite con SSC 2X, SDS al 0.5% a 45°C durante 30 minutos, y luego se repite dos veces con SSC 0.2X, SDS al 0.5% a 50°C durante 30 minutos. Un conjunto más preferente de condiciones utiliza temperaturas superiores en las que los lavados son idénticos a los que anteceden, excepto que se incrementa la temperatura de los últimos dos lavados de 30 minutos en SSC 0.2X, SDS al 0.5% a 60°C. Otro conjunto preferente de condiciones de hibridación de alta severidad es SSC 0.1X, SDS al 0.1%, 65°C y lavado con SSC 2X, SDS al 0.1% seguido de un lavado final de SSC 0. IX, SDS al 0.1%, 65°C.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias aunque, dependiendo de la severidad de la hibridación, son posibles incompatibilidades entre bases. La severidad apropiada de la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación , variables ampliamente conocidas en la técnica. Mientras mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm de los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a un Tm superior) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN: ARN, ADN : ARN, ADN: AD . En los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para el cálculo de Tm (Sambrook y Russell, supra) . En las hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos , la posición de las incompatibilidades asume más importancia, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (Sambrook y Russell, supra) . En un aspecto, la longitud de un ácido nucleico hibridable es al menos alrededor de 10 nucleótidos. Preferentemente, una longitud mínima de un ácido nucleico hibridable es de al menos alrededor de 15 nucleótidos en longitud, más preferentemente al menos alrededor de 20 nucleótidos en longitud, incluso más preferentemente al menos 30 nucleótidos en longitud, incluso más preferentemente al menos 300 nucleótidos en longitud, y más preferentemente al menos 800 nucleótidos en longitud. Además, una persona con experiencia en la técnica apreciará que, de ser necesario, se pueden ajustar la temperatura y la concentración de sales de la solución de lavado de acuerdo con factores tal como 'la longitud de la sonda.

Conforme se utiliza en la presente, el término "identidad porcentual" es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleót idos , que se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relevancia de secuencias entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos , según sea el caso, determinado por la. correspondencia entre las cadenas de estas secuencias. Se pueden calcular la "identidad" y la "similitud" con facilidad mediante métodos conocidos, lo que de modo no taxativo incluye los descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., editores) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing : Informatics y Genome Projects (Smith, D. W., editor) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M . , y Griffin, H. G., editores) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., editor) Academic Press ( 1987 ) ; y Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J. , editores) Stockton Press, NY (1991) . Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informáticos a la disposición del público. Se pueden llevar a cabo alineaciones de secuencias y cálculos de la identidad porcentual utilizando el programa Megalign de la suite de cálculo bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) , el programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) , o la Suite de Software Abierto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)) . Se puede llevar a cabo la alineación múltiple de las secuencias utilizando el método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por ejemplo, versión 1.83) de alineación (Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); y Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 ( 13 ): 3497-500 (2003)), a la disposición en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular a través del Instituto Europeo de Bioinformática ) con 'los parámetros por defecto. Los parámetros adecuados en las alineaciones de proteínas CLUSTALW incluyen una penalización de Existencia de GAP=15, una extensión de GAP = 0.2, una matriz = Gonnet (por ejemplo, Gonnet250), un ENDGAP de la proteína = -1, un GAPDIST de la proteína =4, y un KTUPLE=1. En una modalidad, se utiliza una alineación rápida o lenta con los ajustes por defecto y se prefiere utilizar una alineación lenta. Alternativamente, los parámetros que utilizan el método CLUSTALW (por ejemplo, versión 1.83) se pueden modificar para también usar KTUPLE = 1, PENALI ZACIÓN DE GAP =10, extensión de GAP =1, matriz = BLOSU (por ejemplo, BLOSUM64), VENTANA=5 , y PRINCIPALES DIAGONALES GUARDADAS=5.

En un aspecto, las moléculas de ácido nucleico aisladas adecuadas codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 20%, preferentemente al menos 30%, 33%, 40%, .50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a las secuencias de aminoácidos documentadas en la presente. En otro aspecto, las moléculas de ácido nucleico aisladas adecuadas codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 20%, preferentemente al menos 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a las secuencias de aminoácidos documentadas en la presente. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas no sólo tienen las homologías que anteceden, sino que también típicamente codifican un polipéptido que tiene alrededor de 210 a 340 aminoácidos de longitud, alrededor de 300 a alrededor de 340 aminoácidos, preferentemente alrededor de 310 a alrededor de 330 aminoácidos y más preferentemente alrededor de 318 a alrededor de 325 . aminoácidos en longitud, donde cada polipéptido se . caracteriza por tener actividad perhidrolitica .

Perhidrolasas Diana Conforme se utilizan en la presente, los términos "perhidrolasa diana" y "enzima diana, que tienen actividad perhidrolitica", se refieren a una proteina de fusión que incluye al menos una enzima perhidrolitica (de tipo silvestre o una variante de la misma) fusionada/acoplada a al menos un componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie diana, preferentemente una superficie corporal diana. La enzima perhidrolitica dentro de la perhidrolasa diana puede ser cualquier carbohidrato esterasa CE-7 que tenga actividad perhidrolitica. La perhidrolasa CE-7 puede identificarse por la presencia día porción distintivo de CE-7 que se alinea con una secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, donde la porción distintivo incluye: i) una porción RGQ en las posiciones correspondientes a las posiciones 118-120 de la SEQ ID NO: 1; ii) una porción GXSQG en las posiciones correspondientes a las posiciones 186-190 de la SEQ ID NO: 1; y iii) una porción HE en las posiciones correspondientes a las posiciones 303-304 de la SEQ ID NO: 1.

Conforme se utiliza en la presente, una molécula de ácido nucleico se "híbrida" en otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, un ADN genómico, o un ARN, cuando una cadena única de la .primera molécula puede hibridar con la otra molécula bajo condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución. En una modalidad, las enzimas perhidrolít icas pueden ser aquellas que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 20%, preferentemente al menos 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos documentadas en la presente (es decir, las SEQ ID NO: 1, y 4-28) .

En otra modalidad, la proteína de fusión incluye una enzima perhidrolítica que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, y 4-28.

Conforme se utilizan en la presente, los términos "componente peptídico", "componente peptídico que tiene afinidad hacia una superficie de la cavidad oral", "dominio de unión a la cavidad oral", y "OCBD" se refieren al componente de la proteína de fusión que no forma parte de la enzima perhidrolítica que incluye al menos un polímero de dos o más aminoácidos unido por un enlace peptídico; donde el componente posee afinidad hacia la superficie diana de la cavidad oral. En un aspecto preferente, el OCBD posee afinidad hacia al esmalte dental.

En una modalidad, el componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie corporal puede ser un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo Fab, un anticuerpo de un fragmento variable de cadena única (scFv) , un anticuerpo de Camelidae (Muyldermans , S., . Rev. Mol. Biotechnol . ( 2001 ) 74 : 277-302 ) , una proteína de despliegue de andamios no anticuerpo (Hosse et al., Prot. Sci. (2006) 15(1): 14-27 y Binz, H. et al. (2005) Nature Biotechnology 23, 1257-1268 para una revisión de diversos enfoques asistidos con andamios) o un polipéptido monocatenario que carece de un pliegue de inmunoglobulina . En otro aspecto, el componente peptidico que tiene afinidad hacia el tejido/superficie de la cavidad oral (tal como el esmalte dental) es un péptido monocatenario que carece de un pliegue de inmunoglobulina.

El componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie de la cavidad oral puede separarse de la enzima perhidrolítica con un enlazador peptidico opcional. Ciertos enlazadores/espaciadores de péptidos tienen una longitud de 1 a 100 o de 1 a 50 aminoácidos. En algunas modalidades, los espaciadores peptídicos tienen una longitud de alrededor de 1 a alrededor de 25, de 3 a alrededor de 40,. o de 3 a alrededor de 30 aminoácidos. En otras modalidades, son espaciadores que tienen una longitud de alrededor de 5 a alrededor de 20 aminoácidos. Se pueden utilizar múltiples enlazadores peptidicos. En una modalidad, al menos un enlazador peptidico está presente y puede repetirse hasta 10 veces.

El componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie de la cavidad oral puede separarse de la enzima perhidrolitica con un enlazador peptidico opcional. Ciertos enlazadores/espaciadores de péptidos tienen una longitud de 1 a 100 o de 1 a 50 aminoácidos. En algunas modalidades, los espaciadores peptidicos tienen una longitud de alrededor de 1 a alrededor de 25, de 3 a alrededor de 40, o de 3 a alrededor de 30 aminoácidos. En otras modalidades, son espaciadores que tienen una longitud de alrededor de 5 a alrededor de 20 aminoácidos. Se pueden utilizar múltiples enlazadores peptidicos. En una modalidad, al menos un enlazador peptidico está presente y puede repetirse hasta 10 veces.

En una modalidad, el péptido de fusión comprende al menos una cavidad oral superficie de unión a péptido seleccionado entre él grupo que consiste en SEQ ID NOs : 178-197.

El componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie de la cavidad oral . puede separarse de la perhidrolasa CE-7 con un enlazador peptidico opcional.

Ciertos enlazadores/espaciadores de péptidos tienen una longitud de 1 a 100 o de 1 a 50 aminoácidos. En algunas modalidades, los espaciadores peptidicos tienen una longitud de alrededor de 1 a alrededor de 25, de 3 a alrededor de 40, o de 3 a alrededor de 30 aminoácidos. En otras modalidades, son espaciadores que tienen una longitud de alrededor de 5 a alrededor de 20 aminoácidos. Se pueden utilizar múltiples enlazadores peptidicos. Se proporcionan algunos ejemplos de enlazadores peptidicos 'como las SEQ ID NO: 164 - 177.

Como tales, los ejemplos de perhidrolasas CE-7 diana pueden incluir, de modo no taxativo, cualquiera de las perhidrolasas CE-7 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1, y 4-28 acoplada a un componente peptidico que posee afinidad hacia una superficie de la cavidad oral. En una modalidad preferente, los ejemplos de perhidrolasas diana pueden, de modo no taxativo, incluir, cualquiera de las perhidrolasas CE-7 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28 acoplada a uno o más péptidos de unión a la superficie corporal ' con afinidad hacia una superficie de la cavidad oral (opcionalmente a través de un espaciador peptidico) . En una modalidad preferente, la perhidrolasa diana incluye una perhidrolasa CE-7 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 y 16.

En una modalidad, la perhidrolasa es una perhidrolasa CE-7 en la forma de una proteina de fusión que tiene la siguiente estructura general: ???- [L] y-OCBD u OCBD- [L] y-PAH donde PAH es la enzima que tiene actividad perhidrolitica, por ejemplo, que tiene una porción distintivo de CE-7, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, y OCBD es un componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie de la cavidad oral; y L es un enlazador opcional; e y es un número entero que oscila entre 0 y 10. En una modalidad, el enlazador (L) está presente .y es un enlazador peptidico que tiene una longitud que oscila entre 1 y 100 aminoácidos.

Por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 es una proteina de fusión que tiene una secuencia de perhidrólasas de la SEQ ID NO: 1 acoplada a un dominio dirigido al extremo C con una afinidad hacia los tejidos orales.' Las perhidrólasas utilizadas en los productos y métodos de la invención pueden asumir la forma de una sal libre protegida (por ejemplo, acetilada) .

En otra modalidad, la superficie diana es un material que forma parte del empaque y o que se libera en la cavidad oral. El componente peptídico se selecciona por su afinidad hacia uno o más de los materiales utilizados tales como polímeros, plásticos y películas. El diseño de la proteína de fusión perhidrolasa diana CE-7 hace posible la liberación controlada y eliminación de la perhidrolasa del usuario manteniéndola sobre un dispositivo removible tal como un molde o cinta dental.

Afinidad de Unión El componente peptídico que tiene afinidad hacia la superficie de la cavidad oral incluye una afinidad de unión a una superficie de la cavidad oral de 10"5 molar (M) o menos.. En ciertas modalidades, el componente peptídico es uno o más péptidos de unión y/o dominios de unión a la superficie de la cavidad oral que tienen una afinidad de unión de 10~5 molar (M) o menos hacia el esmalte dental. En algunas modalidades, los péptidos o dominios de unión tienen un valor de afinidad de unión de 1(G5 M o menos en la presencia de una sal al menos alrededor de 50 - 500 mM. El término "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la interacción de un péptido de unión con su sustrato respectivo. Se puede definir o medir la afinidad de unión en términos de la constante de disociación del péptido de unión ( "), o de "MB50".

"KD" corresponde a la concentración del péptido a la que se ocupa a medias el sitio de unión en la diana, es decir, cuando la concentración de la diana con el péptido unido (material diana unido) es igual a la concentración de la diana sin el péptido unido. Mientras menor sea la constante de disociación, más estrecha será la unión del péptido. Por ejemplo, un péptido con una constante de disociación nanomolar (nM) se une más estrechamente que un péptido con una constante de disociación micromolar (µ?) . Ciertas modalidades de la invención tienen un valor de KD de 10~5 o menos.

"MB50" se refiere a la concentración del péptido de unión que genera una señal que es 50% de la señal máxima obtenida en un ensayo de unión a base de ELISA. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 de la Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. 2005/022683; aqui incorporado a titulo de referencia. El MB50 proporciona una indicación de la fuerza de la interacción o afinidad de unión de los componentes del complejo. Mientras menor sea el valor de MB50, mayor será, es decir, "mejor" será la interacción del péptido con su sustrato correspondiente. Por ejemplo, un péptido con un MB5o nanomolar (nM) tiene una unión más estrecha que un péptido con un MB50 micromolar (µ?) . Ciertas modalidades de la invención tienen un valor de MB50 de 10~5 M o menos.

En algunas modalidades, el componente peptidico que tiene afinidad hacia una superficie de la cavidad oral puede tener una afinidad de unión, medida mediante los valores de KD o MB50, inferior o igual a alrededor de 1CT5 M, inferior o igual a alrededor de 10"6 M, inferior o igual a alrededor de 10"7 M, inferior o igual a alrededor de 10~8 M, inferior o igual a alrededor de 1CT9 M, o inferior o igual a alrededor de 10"10 M.

En algunas modalidades, los péptidos que se unen a la superficie de la cavidad oral y/o los dominios que se unen a la superficie de la cavidad oral pueden tener una afinidad de unión, medida mediante los valores de KD o B50, inferior o igual a alrededor de 10"5 M, inferior o igual a alrededor de 10~6 M, inferior o igual a alrededor de 10~7 M, inferior o igual a alrededor de 10"8 M, inferior o igual a alrededor de 10~9 M o inferior o igual a alrededor de 10~10 M.

Conforme se utiliza en la presente, el término "afinidad fuerte" se refiere a una afinidad de unión que tiene un valor de KD o MB50 inferior . o igual a alrededor de 10"5 , preferentemente inferior o igual a alrededor de 10"6 M, más preferentemente inferior o igual a alrededor de 10~7 M, más preferentemente inferior o igual a alrededor de 10~8 M, inferior o igual a alrededor de 10~9 M o más preferentemente inferior o igual a alrededor de 10"10 M.

Polvos Enzimáticos En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal pueden utilizar una catalizador enzimático en la forma de un polvo enzimático estable. Los métodos para la elaboración y estabilización de formulaciones que incluyen un polvo enzimático se describen en la Publicación de las Solicitudes de Patente de los EE.UU. No. 2010-0086534 y 2010-0086535.

En una modalidad, la enzima puede estar presente en el polvo enzimático en una cantidad en un intervalo de alrededor de 5 por ciento en peso (% en peso) a alrededor de 75 % en peso en función del 'peso seco del polvo enzimático. Un intervalo preferente porcentaje en peso de la enzima en la mezcla de polvo enzimático/secada por aspersión se ubica alrededor de 10 % en peso a 50 % en peso, y un intervalo más preferente de porcentaje en peso de la enzima en la mezcla de polvo enzimático/secada por aspersión se ubica alrededor de 20 % en peso a 33 % en peso.

En una modalidad, el polvo enzimático puede además incluir un excipiente. .En un aspecto, el excipiente se incluye en una cantidad en un intervalo de entre alrededor de 95 % en peso a alrededor de 25 % en peso en función del peso seco del polvo enzimático. Un intervalo % en peso preferente del excipiente en el polvo enzimático se ubica entre alrededor de 90 % en peso y 50 % en peso, y un intervalo % en peso más preferente del excipiente en el polvo enzimático se ubica entre alrededor de 80 % en peso y 67 % en peso.

En una modalidad, el excipiente utilizado para preparar un polvo enzimático puede ser un excipiente oligosacárido . En una modalidad, el excipiente oligosacárido tiene un peso molecular promedio numérico de al menos alrededor de 1250 y un peso molecular promedio ponderado de al menos alrededor de 9000. En algunas modalidades, el excipiente oligosacárido tiene un peso molecular promedio numérico de al menos alrededor de 1700 y un peso molecular promedio ponderado de al menos alrededor de 15000. Algunos oligosacáridos específicos pueden incluir, . de . modo no taxativo, maltodextrina, xilano, mañano, fucoidano, galactomanano , quitosana, rafinosa, estaquiosa, pectina, insulina, levano, graminano, amilopectina, sacarosa, lactulosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, nigerotriosa , maltotriosa, melezitosa, maltotriosa, rafinosa, cestosa, y sus combinaciones. En una modalidad preferente, el excipiente oligosacárido es maltodextrina. Los excipientes a base de oligosacáridos también pueden incluir, de modo no taxativo, éteres de celulosa no iónicos solubles en agua, tales como . hidroximetilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa y sus combinaciones. En incluso otra modalidad, el excipiente puede seleccionarse de modo no taxativo a partir de uno o más de los siguientes compuestos: trehalosa, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, glucosa, celobiosa, a-ciclodextriña , y carboximetilcelulosa . · Sustratos de Ésteres / Donantes de Acilo Adecuados Los sustratos de ésteres de ácidos carboxilicos adecuados pueden incluir los ésteres que tienen la fórmula: (a) uno o más ésteres que tienen la estructura [X]mR5 donde : X es un grupo éster de la fórmula R6C(0)0; R6 es un grupo hidrocarbilo Cl a C7 lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4, ' donde R6 opcionalmente incluye uno o más enlaces éter cuando R6 es C2 a C7; R5 es un grupo hidrocarbilo Cl a C6 lineal, ramificado, o cíclico o un grupo heteroaromático cíclico de 5 miembros o un grupo aromático o heteroaromático cíclico de seis miembros opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo; donde cada átomo de carbono en R5 individualmente incluye no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico, y donde R5. opcionalmente incluye uno o más enlaces éter; m es un número entero que oscila entre 1 y el número de átomos de carbono en R5r donde uno o más ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; o (b) uno o más glicéridos que tienen la estructura donde Ri es un alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R3 y R4 individualmente son H o RiC(O) ; o (c) uno o más ésteres de la fórmula donde Ri es un -alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R2 es un alquilo Cl a CIO de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n ? (CH2CH (CH3) -0) nH y n es 1 a 10; o (d) uno o más monósacáridos acetilados, disacáridos acetilados, o polisacáridos acetilados; o (e) cualquier combinación de (a) a (d) .

Los sustratos adecuados también pueden incluir uno o más sacáridos acilados seleccionados del grupo que consiste en mono-, di- y polisacáridos acetilados. En otra modalidad, los sacáridos acilados se seleccionan del grupo que consiste en xilano acetilado; fragmentos de xilano acetilado; xilosa acetilada (tal como tetraacetato de xilosa) ; glucosa acetilada (tal como a-D-pentaacetato de glucosa;: ß-D-pentaacetato de glucosa; 2 , 3 , , 6-tetraacetato de l-tio-p-D-glucosa); pentaacetato de ß-D-galactosa; hexaacetato de sórbito-l; octaacetato de sacarosa; 1, 2, 3, 5-tetraacetato de ß-D-ribofuranosa; 1, 2, 3, 4-tetraacetato de ß-D-ribofuranosa ; tri-O-acetil-D-galactal; tri-O-acetil-D-glucal ; tetraacetato de ß-D-xilofuranosa, pentaacetato de ß-D-glucopiranosa ; 1 , 2 , 3 , -tetraacetato de ß-D-glucopiranosa; 2,3,4,6-tetraacetato de ß-D-glucopiranosa; 2-acetamido^2-desoxi-1,3,4, 6-tetraacetil-p-D-glucopiranosa; 2-acetamido-2-desoxi-3, 4 , 6-triacetil-l-cloruro-a-D-glucopiranosa; pentaacetato de ß-D-manopiranosa y celulosa acetilada. En una modalidad preferente, el sacárido acetilado se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 3, 5-tetraacetato de ß-D-ribofuranosa ; tri-O-acetil-D-galactal; tri-O-acetil-D-glucal; octaacetato de sacarosa; y celulosa acetilada.

En otra modalidad, los · sustratos adicionales adecuados pueden también incluir 5-acetoximetil-2-furaldehído; 3,4-diacetoxi-l-buteno; ácido 4-acetoxibenzoico; acetato de vainillina; acetato de éter metílico de propilenglicol ; lactato de metilo; la'ctato de etilo; glicolato de metilo; glicolato de etilo; metoxiacetato de metilo; metoxiacetato de etilo; 3-hidroxibutirato de metilo; 3-hidroxibutirato de etilo; y 2-acetil ci'trato de trietilo.

En otra modalidad, se seleccionan los sustratos adecuados del grupo que consiste en: monoacetina; diacetina; triacetina; monopropionina; dipr.opionina ; tripropionina ; monobutirina; dibutirina; tributirina; pentaacetato de glucosa; tetraacetato de xilosa; xilano acetilado; fragmentos de xilano acetilado; 1, 2, 3, 5-tetraacetato de ß-D-ribofuranosa; tri-O-acétil-D-galactal ; tri-O-acetil-D-glucal ; los monoésteres o diésteres de 1 , 2-etanodiol ; 1,2-propanodiol; 1, 3-propanodiol; 1, 2-butanodiol; 1 , 3-butanodiol ; 2 , 3-butanodiol; 1 , 4-butanodiol ; 1 , 2-pentanodiol ; 2,5-pentanodiol ;¦ 1 , 5-pentanodiol ; 1 , 6-pentanodiol; 1,2-hexanodiol; 2 , 5-hexanodiol ; 1 , 6-hexanodiol ; y sus combinaciones. En otra modalidad, el sustrato es un poliol Cl a C6 que incluye uno o más grupos éster. En una modalidad preferente, uno o más de los grupos hidroxilo del poliol Cl a C6 se sustituyen con uno o más grupos acetoxi (tales como diacetato de 1, 3-propánodiol; diacetato de 1 , 2-propanodiol ; diacetato de 1, 4-butanodiol; diacetato de 1, 5-pentanodiol,. etc.). En otra modalidad, el sustrato es diacetato de propilenglicol (PGDA), diacetato de etilenglicol (EGDA) , o una combinación de ellos.' En otra modalidad, se seleccionan los sustratos adecuados del grupo que consiste en monoacetina, diacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina, tripropionina, monobutirina, dibutirina y tributirina. Incluso en otro aspecto, el sustrato se selecciona del grupo que consiste en diacetina y triacetina. En una modalidad más preferente, el sustrato adecuado incluye triacetina.

El éster de ácido carboxilico está presente a una concentración suficiente para producir la concentración deseada de ácido peroxicarboxilico luego de la perhidrólisis catalizada enzimáticamente . El éster de ácido carboxilico no tiene que ser totalmente soluble en la formulación de reacción, pero tiene una solubilidad suficiente para permitir la conversión del éster con el catalizador de perhidrolasa en el correspondiente ácido peroxicarboxilico. El éster de ácido carboxilico está presente en la formulación de reacción a una concentración de 0.05 % en peso a 40 % en peso de la formulación de reacción, preferentemente a una concentración de 0.1 % en peso a 20 % en peso de la formulación de reacción y más preferentemente a una concentración de 0.5 % en peso a 10 % en peso de la formulación de reacción.

La fuente de peroxigeno se . proporciona en la forma de gránulos y puede incluir aductos de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, un aducto de urea-peróxido de hidrógeno (peróxido de carbamida)) sales de perborato, sales de percarbonato y sales de peróxido. La concentración del compuesto de peroxigeno en la formulación de reacción puede oscilar entre 0.0033 % en peso y alrededor de 50 % en peso, preferentemente entre 0.033 % en peso y alrededor de 40 % en peso, más preferentemente entre 0.1 % en peso y alrededor de 30 % en peso.

Se ha documentado que . muchos catalizadores de perhidrolasas (células completas, células completas permeables, y extractos de células completas parcialmente purificadas) poseen actividad catalasa (EC 1.11.1.6). Las catalasas catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno en oxigeno y agua. En un aspecto, el catalizador de perhidrólisis carece de actividad catalasa. En otro aspecto, se puede agregar un inhibidor de catalasas a la formulación de reacción. De ser necesario, una personal con experiencia en la técnica puede ajustar la concentración del inhibidor de catalasas. La concentración del inhibidor de catalasas típicamente oscila entre 0.1 mM y alrededor de 1 M; preferentemente entre alrededor de 1 mM y alrededor de 50 mM; más preferentemente entre alrededor de 1 mM y alrededor de 20 mM.

En otra modalidad, el catalizador enzimático carece de una actividad catalasa considerable o puede diseñarse para disminuir o erradicar la' actividad catalasa. La actividad catalasa en una célula huésped puede regularse de forma descendente o erradicarse mediante la alteración de la expresión del o de los genes responsables de la actividad catalasa utilizando técnicas ampliamente conocidas, lo que de modo no taxativo incluye la mutagénesis con transposones, la expresión antisentido de ARN, la mutagénesis dirigida y la mutagénesis aleatoria.

La concentración de ácido peroxicarboxilico generada (por ejemplo, ácido peracético) por la perhidrólisis de al menos un éster de ácido carboxilico es de al menos alrededor de 0.1 ppm,, preferentemente al menos 0.5 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 100 ppm, .200 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 700 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 5000 ppm o 10, 000 ppm de perácido a los 10 minutos, preferentemente a los 5 minutos, de iniciar la reacción de perhidrólisis. Evidentemente, una persona con experiencia en la técnica puede ajusfar los componentes de reacción para lograr la concentración deseada de perácido.

En un aspecto, el tiempo de reacción necesario para producir la concentración deseada de perácido no es superior a alrededor de dos horas, preferentemente no es superior a alrededor de 30 minutos, más preferentemente no es superior a alrededor de 10 minutos y más preferentemente es de alrededor de 5 minutos o menos.

Método de Ensayo por HPLC para Determinar la Concentración de Ácido Peroxicarbóxílico y Peróxido de Hidrógeno Se puede utilizar una variedad de métodos analíticos para analizar los reactivos y productos, lo que de modo taxativo incluye titulación, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) , cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) , espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) , electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés), el procedimiento analítico descrito por U. Pinkernell et al., (Anal. Chem. , 69 ( 17 )·: 3623-3627 (1997)), y el ensayo con 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina) -6-sulfonato (ABTS) (U. Pinkernell et. al. Analyst, 122: 567-571 (1997) y Dinu et. al. Adv. Funct. Mater . , 20: 392-398 (2010)) que se describe en los presentes ejemplos.

En una modalidad, la invención proporciona un envase para un producto de cuidado oral que incluye múltiples cámaras y se diseña para mantener los ingredientes en cada cámara separados y no reactivos hasta el momento de utilizarlos. Por ejemplo, la presente invención proporciona un diseño de un envase estructural químicamente estable que permite una enzima que cataliza el producto de blanqueamiento dental alcance una cinética de estado pre-estable en milisegundos luego que los ingredientes se exponen entre sí y se combinan. El contenido del envase se dispensa a través de un medio de apertura, 'por ejemplo, a través de una boquilla con una tapa o tapón removible o que se torna funcional cuando una sección preferentemente ranurada del envase la rompe el consumidor, permitiendo dispensar limpia y convenientemente el producto a través de una boquilla conformada.

Cada cámara tiene la capacidad de almacenar, por ejemplo, 0.1 - 30 gramos de un ingrediente. El producto de cuidado oral es un producto de blanqueamiento dental que aporta una cantidad total del producto que sale de todas las cámaras, por ejemplo, entre 1.0 y 5.0 gramos, por ejemplo, 1-2 gramos, para lograr el beneficio previsto. La capacidad volumétrica de las cámaras se diseña para alojar ingredientes con una gravedad específica de por ejemplo, 1.0 a 1.1 y preferentemente con una gravedad específica en el intervalo de 1.02 a 1.05.

En una modalidad, el envase se fabrica utilizando un proceso de termoformado de al menos dos películas flexibles con un espesor de 50 micrones a 500 micrones y preferentemente un espesor de 300 micrones. Las dos películas pueden ser opacas, traslúcidas o transparentes y pueden ser cualquier combinación cuando se ensamblan en el proceso de termoformado . Ambos materiales confieren características de barrera contra el vapor de agua, por ejemplo, con menos de 3% de pérdida de humedad durante un período de tiempo de tres años, por ejemplo,, menos de 1% de pérdida de humedad durante el mismo período.. Las películas también proporcionan una barrera de sabor. La pérdida de sabor se puede determinar tanto por cromatografía de gases como por evaluación organoléptica.

Las películas son químicamente resistentes a los materiales allí contenidos. Por ejemplo, en una modalidad, son resistentes a una solución al 0.1 % a 10% de peróxido de hidrógeno en peso, por ejemplo, una solución hasta 0.3% de peróxido de hidrógeno en peso.

En una modalidad, uno de los dos materiales flexibles es un laminado polimérico y la capa interna del laminado se selecciona para unirse con el primer material flexible pero separarse cuando se aplica presión manualmente a la cámara con un sello frágil. La fuerza necesaria para romper el sello se aplica manualmente y puede variar entre 2 pulgadas-lbf y 5 pulgadas-lbf .

Luego de romper el sello frágil entre los compartimientos, los ingredientes en cada cámara se ponen en contacto estrecho entre si. Se permite que el consumidor combine los ingredientes individuales durante un periodo de tiempo para superar la tasa cinética de estado pre-estable o la fase de rotura. El tiempo de la cinética de estado pre-estable o fase de rotura puede expresarse en milisegundos . Esto da tiempo suficiente para la formación y consumo de los intermedios enzima-sustrato hasta alcanzar sus concentraciones de estado estable. Luego de alcanzar el estado estable, el consumidor puede romper una sección preferentemente ranurada del envase de múltiples cámaras y dispensar la mezcla sobre un molde dental. El molde se aplica a los dientes durante un periodo de tiempo de 15 minutos a 45 minutos y tiene un beneficio blanqueador eficaz.

Las modalidades ilustrativas de la invención por consiguiente incluyen, por ejemplo, envases, composiciones de cuidado oral, y métodos de blanqueamiento dental, por ejemplo: 1. Envase 1, un envase que incluye un material deformable configurado para formar al menos dos cámaras selladas, que tiene una primera cámara, una segunda cámara, y opcionalmente cámaras adicionales, donde las cámaras se separan entre si con una o más barreras que son frágiles o rompibles, donde ¦ la primera cámara contiene una solución liquida de baja viscosidad que incluye una enzima que tiene actividad perhidrolitica, donde la enzima tiene una porción distintivo de la familia 7 de carbohidrato esterasas (CE-7) que se alinea con una secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, porción distintivo éste que incluye: i) una porción RGQ en las posiciones correspondientes a las posiciones 118-120 de la SEQ ID NO: 1; ü) una porción GXSQG en las posiciones correspondientes a las -posiciones 186-190 de la SEQ ID NO: 1; y iii) una porción HE en las posiciones correspondientes a las posiciones 303-304 de la SEQ ID NO: 1; y la segunda cámara incluye al menos un sustrato donante de acilo, el sustrato seleccionado del grupo que consiste en: i) ésteres que tienen la estructura [XlmRs donde X = un grupo éster de la fórmula ReC(0)0 R6 = grupo hidrocarbilo Cl a C7 lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente' sustituido con grupos hidroxilo o grupos alcoxi Cl a C4, donde R6 opcionalmente incluye uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7; R5 = un grupo hidrocarbilo Cl a C6 lineal, ramificado, o cíclico o un grupo heteroaromático cíclico de 5 miembros o grupo aromático o heteroaromático cíclico de seis miembros opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo; donde cada átomo de carbono en R5' individualmente incluye no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster p grupo ácido carboxílico; donde R5 opcionalmente incluye uno o más enlaces éter; M es un número entero que oscila entre 1 y el número de átomos de carbono en R5; y donde dichos ásteres son solubles en agua con sal en al menos 5 ppm a 25 °C; ii) glicéridos que tienen la estructura donde Rx= alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con' un hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R3 y R4 individualmente . son H o RiC(O); iii) uno o más ésteres de la fórmula donde Ri es un alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R2 es un alquilo Cl a CIO de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -0) nH y r. es 1 a 1 C ; y iv) sacáridos acetilados seleccionados del grupo que consiste en monosacáridos' acetilados, disacáridos acetilados, y polisacárido acetilado; y donde el segundo o opcional additional cámara contiene a fuente de peróxido, cuando una o más barreras entre las cámaras, por ejemplo, aprietan la primera cámara, la solución liquida de baja viscosidad se mezcla con la fuente de peróxido y el sustrato donante de acilo y la enzima que tiene actividad perhidrolítica cataliza la reacción entre el peróxido publicado por la fuente de peróxido y el sustrato donante de acilo que forma un perácido; y el envase tienen una boquilla, por ejemplo, una región de registro, tapa o entrada para permitir que el envase se abra y tener una salida por la que se dispense la mezcla. 1.1 Envase 1 donde la enzima que tiene actividad perhidrolítica incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) SEQ ID NO: 1; y b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% identidad de la secuencia de aminoácidos to SEQ ID NO: 1.

El envase 1 o 1.1 donde la enzima que tiene actividad perhidrolítica además incluye un dominio de unión fusionado con el C-término de la enzima, dicho dominio de unión tiene afinidad con un tejido oral o con la cinta blanqueadora dental. 1.2 Cualquiera de los paquetes anteriores donde el dominio de unión tiene afinidad con un tejido oral que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ D NOs : 178-197. 1.3 Cualquiera de los paquetes anteriores, en donde la enzima que tiene . actividad perhidrolitica tiene afinidad con un tejido oral y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% identidad de secuencia aminoacidica con la SEQ ID NO: 2. 1.4 Cualquiera de los paquetes anteriores en donde el material deformable es de plástico o de aluminio. 1.5 Cualquiera de los paquetes anteriores en donde la viscosidad de la solución liquida bajo tiene una viscosidad suficientemente baja para asegurar una mezcla eficiente con el contenido de la segunda cámara, por ejemplo, por debajo de 5,000 cps, por ejemplo, por debajo de 500 cps . 1.6 Cualquiera de los paquetes anteriores en el que la viscosidad de la. solución líquida bajo comprende un tampón. 1.7. Cualquiera de los paquetes anteriores en donde el sustrato donador de acilo se selecciona entre (i) uno o más C2-18, por ejemplo, ácidos carboxilicos C2-6 ácidos carboxilicos (por ejemplo, ácido acético), incluyendo inferior lineales o ramificados, ácidos carboxilicos de alquilo, opcionalmente sustituido con hidroxi y/o alcoxi Cl-4, (ii) uno o más ésteres hidrolizables y aceptables de los mismos (por ejemplo, mono-, di-, y tri-glicéridos y sacáridos acilados) y (iii) mezclas de los mismos. 1.8 Cualquiera de. los paquetes anteriores en donde el sustrato donador de acilo se selecciona de 1,2,3-triacetoxypropane (a veces denominado en este documento como triacetina o triacetato de glicerina) y sacáridos acilados, por ejemplo, sacáridos acetilado. 1.9 Cualquiera de los paquetes anteriores que comprenden un sustrato donador de acilo que comprende un compuesto éster que tiene una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 ° C. 1.10. Cualquiera de los paquetes precedentes, en donde la fuente de peróxido se selecciona de peróxidos sólidos y los donantes de peróxido de sólidos y mezclas de los mismos, por ejemplo, seleccionado de sales o complejos de peróxido (por ejemplo, tal como peroxyphosphate , peroxicarbonato, perborato, peroxisilicato, o sales de persulfato, por ejemplo calcio peroxyphosphate, . perborato de sodio, peróxido de carbonato de sodio, peroxifosfato de sodio y persulfato de potasio); hipocloritos ;' peróxido de urea; hidrógeno complejos de polímero peróxido tal como peróxido de hidrógeno polivinilpirrolidona complejos de polímero; por ejemplo, peróxidos de metales zinc y peróxido de calcio, por ejemplo un peróxido sólido seleccionado entre el peróxido de urea, polivinilpirrolidona-complej os de peróxido de hidrógeno, percarbonato de sodio, perborato sódico, y peróxidos de metales, por ejemplo, zinc y peróxido de calcio. 1.11 El paquete precedente, en donde la fuente de peróxido es peróxido de urea. 1.12 El paquete ' precedente, en donde la fuente de peróxido comprende un peróxido de hidrógeno-polivinilpirrolidona complejo. 1.13 Cualquiera de los paquetes precedentes, en donde los ingredientes de las cámaras están presentes en cantidades suficientes para proporcionar, tras la mezcla, un agente de blanqueo en una cantidad y concentración eficaz para blanquear los dientes. 1.14 Cualquiera de los paquetes anteriores en dondela segunda cámara contiene un agente gelificante en forma de polvo. 1.15 El paquete anterior en donde el agente gelificante se selecciona de entre los gelificantes de carbómero (por ejemplo, Carbopol 971P) , gomas de polisacáridos , tales como goma de xantano, almidones alimentarios modificados, gelatina animal o a base de pescado y sílices. 1.16 El paquete anterior en el que el agente gelificante es un gelificante carbómero. 1.17 Cualquiera de los paquetes anteriores en donde la segunda cámara contiene un agente gelificante en forma de polvo en una cantidad relativa para proporcionar una viscosidad de 100,000 a 150,000 cps, por ejemplo, alrededor de 125,000 cps, tras la mezcla con el contenido de la primera cámara, por ejemplo, en el que el agente gelificante está presente en cantidades de' 5% a 50% en peso de la mezcla final de los contenidos de las cámaras primera y segunda. 1.18 Cualquiera de los paquetes precedentes, en donde la primera cámara contiene una solución acuosa de baja viscosidad que comprende una enzima que tiene actividad perhidrolítica y un tampón y la segunda cámara contiene un agente gelificante, una fuente de peróxido, y un compuesto que contiene acetil-, todos en forma de polvo, tales que cuando la barrera frangible se rompe y los contenidos de las dos cámaras se dejó mezclar, el peróxido y el compuesto que contiene acetil reaccionar pueden, siendo la reacción catalizada por la actividad de la proteína que tiene perhydrolase, formar un ácido peracético en un gel formado por extruible el liquido y el agente gelificante, que entonces el gel extruible puede ser extruido y aplicado a los dientes, por ejemplo, usando una bandeja o tira, durante un tiempo suficiente, por ejemplo, 10-30 minutos, para permitir que los dientes se blanqueen. 1.19 Cualquiera de los paquetes anteriores, que comprende además un dispositivo aplicador tal como una placa dental o tira para aplicar una mezcla de los contenidos de las cámaras primera y segunda a los dientes. 1.20 El paquete anterior, cuando la mezcla se dispensa, la apertura de la segunda cámara está conectada directamente a una bandeja para que la mezcla se extruye en la bandeja. 2. Composición 2, que es una composición de múltiples partes para el cuidado oral que comprende una primera parte que está físicamente separada de la segunda parte durante el almacenamiento y se combina con la segunda parte justo antes de su uso, por ejemplo, 10 minutos antes de uso, en donde la primera parte comprende una enzima que tiene actividad perhidrolítica como se describe para cualquiera de los paquetes anteriores, y la segunda parte comprende una fuente de peróxido y un donante de carboxi seleccionado de ácidos carboxílicos y compuestos de acilo, en donde la fuente de peróxido y el donante carboxi reaccionan en la presencia de la perhidrolasa para formar una perácido, por ejemplo, una fuente de peróxido y un donante de carboxi como se describe para cualquiera de los paquetes anteriores, por ejemplo: 2.1 La composición anterior en donde el donante de carboxi se selecciona de C2-i8 ácidos carbóxílicos (por ejemplo, ácido acético) y ásteres hidrolizables y aceptables de los mismos (por ejemplo, mono-, di-, y tri-glicéridos ) y mezclas de los mismos 2.2 La composición anterior en donde el donante es 1 , 2 , 3-carboxi triacetoxipropano (a veces denominado en este documento como triacetina o triacetato de glicerina) . 2.3 Cualquiera de las composiciones anteriores en donde la fuente de peróxido es un peróxido sólido seleccionado entre el peróxido de urea, polivinilpirrolidona-complejos de peróxido de hidrógeno, percarbonato de sodio, perborato sódico, y peróxidos' de metales, por ejemplo, zinc, y peróxido de calcio. 2.4 Cualquiera de las composiciones anteriores en donde la fuente de peróxido es peróxido de urea. 2.5 Cualquiera de las composiciones anteriores en donde la fuente de peróxido, comprende un peróxido de hidrógeno-polivinilpirrolidona complejo. 2.6 Cualquiera de las composiciones anteriores, en donde se envasa un paquete como se ha descrito, por ejemplo, Paquete 1 y ss. 2. Un método (Método 3) de blanqueamiento dental que comprende la activación de una composición del cuidado oral de acuerdo con la descripción que anterior, alcombinar las dos partes y aplicar una cantidad eficaz de la mezcla obtenida en los dientes, por ejemplo, usando un aplicador, un molde dental o una cinta, por el tiempo suficiente, por ejemplo, al menos 10 minutos, 10-30 minutos, para blanquear los dientes.

Los ácidos peroxicarboxilicos ( "perácidos" ) se conocen como agentes antimicrobianos eficaces y blanqueo. La patente de EE.UU. 5,302,375 a Viscio, D., describe composiciones orales para el blanqueamiento de ácido peracético que comprende disolver en un vehículo, en el que el ácido peracético se genera dentro del vehículo in situ mediante la combinación de agua, ácido acetilsalicílico, y una soluble en agua percarbonato de metal alcalino. La patente de EE.UU. 5,279, 816 a Church et al. describe el uso de una composición que comprende ácido peracético para blanquear los dientes manchados o decolorados. Las patentes de EE.UU. 6,221,341 y 7, 189, 385 a Montgomery, R. , revelar peroxi ácidos de blanqueamiento de dientes, composiciones adecuadas para uso en un método para blanquear los dientes. Más específicamente, una composición de ácido peracético puede ser producido mediante la combinación de un precursor de peróxido de hidrógeno, un éster de ácido acético de glicerina, y agua para generar, a través de perhidrólisis química, el ácido peracético.

La perhidrólisis enzimática no se describe en estas referencias. Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. 2009-0311198 a Concar et al. describe una composición oral que comprende una enzima M. smegmatis que tiene actividad perhidrolítica para blanquear los dientes.

Muchas hidrolasas y esterasas, por ejemplo, lipasas, hidrolasas serina esterasas y carbohidratos, catalizar perhidrólisis, la formación reversible de perácidos de ácidos carboxílicos y peróxido de hidrógeno. Las perhidrolasas, esterasas y lipasas generalmente contienen una tríada catalítica que consiste en una serina (Ser), un glutamato (Glu) o aspartato (Asp) y una histidina (His.) . Muchas perhidrolasas (por ejemplo, libres de metales haloperoxidasas ) contienen una tríada catalítica Ser-His-Asp y catalizan la formación reversible de perácido a partir de peróxido de hidrógeno y ácidos carboxílicos. Sin estar limitado por la teoría,, se cree que perhidrólisis tiene lugar con un mecanismo de esterasas como en el que un ácido carboxílico reacciona con la serina del sitio activo para formar una acil enzima intermedio, que luego reacciona con peróxido de hidrógeno para formar un perácido.

Se han descrito numerosas perhidrolasas en la técnica. La inclusión de proteasas especificas de variantes de subtilisina Carlsberg tienen actividad perhidrolitica en un producto para el cuidado del cuerpo que se describe en la patente de EE.UU. 7,510,859 a ieland et al. las enzimas perhidroliticas más allá de las proteasas variantes especificas no se describen ni existen ejemplos de trabajo que demuestran la producción enzimática de perácido como un agente de atención beneficio personal. Solicitud de patente EE.UU. Nos. 2008-0176783 Al; 2008-0176299 Al; Al 2009-0.005.590, y 2010-0041752 Al a DiCosimo et al. Revelar enzimas estructuralmente clasificadas como miembros de la familia CE-7 de esterasas de hidratos de carbono (es decir, la cefalosporina C desacetilasas [CAHS] y acetil xilano esterasas [ejes] ) que se caracteriza por una actividad perhidrolitica significativa para la conversión de éster de ácido carboxilico sustratos (en presencia de una fuente adecuada de peroxigeno, tal como peróxido de hidrógeno) en los ácidos peroxicarboxilicos en concentraciones suficientes para su uso como un desinfectante y/o un agente de blanqueo. Algunos miembros de la familia CE-7 de esterasas de carbohidratos han sido demostrado que tiene actividad perhidrolitica suficiente para producir 4000 a 5000 ppm de ácido peracético. a partir de ésteres de acetilo de alcoholes, dioles y gliceroles en 1 minuto y hasta 9000 ppm entre 5 minutos y 30 minutos una vez que los componentes de reacción se mezclaron (DiCosimo et al., EE.UU. 2009 hasta 0,005,590 Al) . La patente de EE.UU. N ° 2010-0087529 publicación de solicitud de Al describe variantes CE-7 enzimas que tienen actividad perhidrolitica mejorada.

En una modalidad, ' la invención utiliza un perhydrolase que contiene el dominio catalítico de un miembro de la familia de carbohidrato esterasa 7 que tiene actividad perhidrolítica ( "perhidrolasa CE-7"). Aunque las perhidrolasas CE-7 tienen una actividad perhidrolítica excepcional, su uso en productos cosméticos para el cuidado personal no ha sido divulgada antes de la aplicación provisional antes mencionada.

Los donantes de acilo en la presente invención se seleccionan entre (i) uno o más C2-18 ésteres de ácidos carboxílieos , por ejemplo, C2-6 ésteres de ácidos carboxílieos , incluidos inferior lineales o ramificados, ácidos carboxílicos de alquilo, opcionalmente sustituidos con hidroxi y/o Cl 4-alcoxi y (ii) mezclas de los mismos. Por ejemplo, los donantes de acilo incluyen 1,2,3-triacetoxipropano (a veces denominado en este documento como triacetina o triacetato de glicerina) y sacáridos acilados, por ejemplo, sacáridos acetilado. En una modalidad particular, los ásteres de este uso pueden ser, por ejemplo, ésteres que tienen solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25° C.

Los donadores de acilo u otros materiales pueden estar opcionalmente encapsulados . Hay una variedad de opciones de encapsulación bien conocidos en la técnica, tanto naturales como sintéticos. Los almidones modificados y goma arábiga son particularmente adecuados ya que son de grado alimenticio, relativamente barato, rápido para disolver y puede adsorber niveles bastante altos de aceites líquidos. Cualquier impacto sobre la viscosidad final necesita ser considerado.

Como se señaló anteriormente, la invención puede comprender agentes gelificantes, por ejemplo .los gelificantes de carbómero (por ejemplo, Carbopol 971P) , gomas de polisacáridos , tales como goma de xantano, almidones alimentarios modificados, gelatina animal o a base de pescado y sílicés. Las formulaciones de adhesivo de gel para el uso con agentes de blanqueamiento de dientes son conocidas en la técnica, por ejemplo como se describe en las patentes de EE.UU. 7,862,801; 5,746,598; 6,730, 316; 7 , 128 , 899. · El gelificante es útil para espesar soluciones de blanqueamiento a un punto en que no se quedará sin una placa dental en las áreas del tejido blando. Esto permite que el agente de blanqueo permanezca en contacto con los dientes durante periodos prolongados de tiempo y protege a los tejidos blandos. El uso de una placa dental y un' blanqueador viscoso permite un blanqueador de baja concentración para blanquear eficazmente dientes de una persona durante un periodo de 1-2 semanas de tiempo con el mínimo riesgo para el paciente. Gelificantes para este uso deben ser seleccionadas y ajustadas para proporcionar una viscosidad después de la aplicación de 100,000 a 150,000 cps, por ejemplo, aproximadamente 125,000 cps.

En una modalidad particular, el paquete o la composición de varias partes como se ha descrito anteriormente comprende un agente gelificante carbómero, por ejemplo un ácido poliacrílico modificado polímero hidrófilo tal como CARBOPOL® fabricado por Lubrizol. Los carbómeros son capaces de formar geles viscosos a concentraciones superiores a tan poco como 5% en peso.

Todos los ingredientes para su uso en las formulaciones descritas en este documento debe ser aceptable por vía oral. Por "aceptable por vía oral", como el término se usa en este documento se entiende un ingrediente que está presente en la formulación como se describe en una cantidad y forma que no hace que la formulación dea segura para su uso en la cavidad oral .

En algunas modalidades, la enzima gue tiene actividad perhidrolitica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) SEQ ID NO: 1 y b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% identidad de secuencia aminoacídica con la SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades, la enzima gue tiene actividad perhidrolitica comprende además un dominio de unión fusionada al extremo N-o C-terminal de la enzima, dicho dominio de unión que tiene afinidad por un tejido oral.

En algunas modalidades, la enzima que tiene actividad perhidrolitica tiene afinidad por un tejido oral y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) SEQ ID NO: 2 y b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% secuencia de aminoácidos identidad con la SEQ ID NO: 2.

En algunas modalidades, la enzima inmovilizada se adsorbe en el material insoluble, atrapado en perlas insolubles, unido covalentemente al material insoluble a través de una reacción química, unido por dominio de unión del péptido que tiene afinidad por el material insoluble o atrapado en una matriz insoluble.

Algunas modalidades proporcionan un método de blanqueamiento de los dientes o tratamiento para la gingivitis, la placa dental o halitosis, que comprende la preparación de un liquido que comprende un agente de blanqueamiento de acuerdo con el método de la reivindicación anterior y la administración del liquido en la cavidad oral, por ejemplo, al enjuagarse la boca con el liquido durante un periodo de 15 segundos a un minuto y después expulsar el liquido.

En algunas modalidades, el producto suministra un agente de blanqueo en un enjuague bucal, en donde el agente blanqueador es un perácido producido por la reacción catalizada con una. enzima de peróxido de hidrógeno y triacetina. En algunas modalidades, dos composiciones - un peróxido que comprende hidrógeno y el otro que comprende triacetina - se mantienen en la botella de enjuague bucal (primer compartimento) . Algunas modalidades comprenden - en la parte superior de la botella - un segundo compartimiento que está conectado, por ejemplo, usando la inserción o articulaciones de tipo rosca. En algunas modalidades, el segundo compartimento es, por ejemplo, flujo a través de un cartucho que contiene una enzima que tiene actividad perhidrolitica inmovilizada en las superficies de los materiales transportados, tales como hidroxiapatita o partículas de celulosa. En algunas modalidades, el segundo compartimento sirve como el componente de activación de la boca de lavado.

En algunas modalidades, el peróxido de hidrógeno y triacetina se separan de la enzima que tiene actividad perhidrolitica. En algunas modalidades, durante el uso, la mezcla fluye a través del cartucho y entra en contacto con la enzima que tiene actividad perhidrolitica en las superficies, y la reacción se cataliza para rápidamente producir un perácido. En algunas modalidades, - después de su uso - la mezcla se separa de nuevo de la enzima.

Como se usa en todo el documento, los intervalos se usan como abreviatura para describir todos y cada uno de los valores que está dentro del rango. Cualquier valor dentro del rango puede ser seleccionado como la terminal de la gama. Además, todas las referencias citadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad. En el caso de un conflicto en una definición en la presente descripción y que de una referencia citada, los controles presente descripción.

A menos que se especifique lo contrario, todos los porcentajes y las cantidades expresadas en este documento y en otras partes de la especificación deben entenderse que se refieren a porcentajes en- peso. Las cantidades dadas se basan en el peso del material activo.

EJEMPLOS Ejemplo 1 En un empaque de dos cámaras, se almacenaron separadamente 1.0 mL de amortiguador de fosfato pH7, contentivos de 0.04 mg de enzima perhidrolasa de un polvo de múltiples componentes. El polvo de múltiples componentes está ilustrado en las Tablas 1A, IB, y 1C e incluye la triacetina encapsulada & saborizante, peróxido de urea granular y un agente gelificante carbómero. La relación de los polvos bien mezclados, 1A: IB: 1C, en este ejemplo es de 92.3:1.7:6. Las dos cámaras estaban separadas con una barrera sellada por calor impermeable al agua, que es menos fuerte que los sellos exteriores alrededor del empaque (véase por ejemplo la Figura 1. Para ser utilizado, el consumidor presiona en la cámara de amortiguador/enzima, lo que rompe el frágil sello interno y presiona el amortiguador/enzima en la . cámara de polvo. Los polvos se mezclaron rápidamente con el liquido, disolviendo la fuente de peróxido, el almidón con la triacetina adsorbida & el saborizante y, más lentamente, el agente gelificante hidratante. Transcurridos varios segundos de mezclar estos componentes, se formó el gel de manera efectiva y listo para ser aplicado a un molde. Se aplicaron aproximadamente 0.5 gramos del gel recién formado tanto al dispositivo de liberación superior como al inferior, lo que tuvo un rendimiento de una dosis de 4.3 mg de peróxido de urea (equivalente a 1.5 mg de peróxido de hidrógeno), 10 mg de triacetina y 0.01 mg de enzima hidrolasa.

Al abrir la abertura del empaque, . por medio de una abertura pre-ranurada (véase la Figura 1), el usuario puede aplicar molde y luego aplicarse el molde durante 20-30 minutos. Alternativamente, el- gel pudo ser aplicado a una cinta flexible tal como un polietileno flexible no poroso o una película lentamente soluble.

TABLA 1A - Triacetina encapsulada Ejemplo 2 Se inmovilizó . una enzima perhidrolitica ilustrativa sobre una matriz de sólido permeable. La matriz fue cargada en una inyectadora y se presionó una solución que incluía peróxido de hidrógeno y triacetina a través de la matriz para generar y dispensar ácido peracético (PAA) .

Se preparó el prototipo de la matriz enzimática como se indica a continuación: Se incubó 0.1 g de polvo de hidroxiapatita con 150.0 microlitros de enzima 5 micromolar que tenía una región perhidrolitica y un dominio de enlace de hidroxiapatita, en 10 mM del amortiguador de fosfato pH 7.2 durante 1 hora, a 37°C. Después se lavó el polvo 3x con 1 mi de buffer de fosfato 10 mM, moviendo el líquido con la pipeta, suspendiéndolo nuevamente en el amortiguador y repitiendo en cada oportunidad. Después se volvió a suspender el polvo en 500 microlitros de buffer de fosfato 10 mM y se introdujo en una jeringa de 3 mi con una punta de filtro de una jeringa de 25 mi (membrana de 5 micrones) y se dispensó el exceso de líquido a .través del filtro.

Se introdujeron 500 microlitros del amortiguador de reacción que incluían 100 mM de amortiguador de fosfato, 100 mM de triacetán y .100 mM de peróxido de hidrógeno en la jeringa, dispensados y recolectados a través del filtro. Se recolectaron 90 microlitros del producto y entonces la reacción se detuvo con '40 microlitros de H3PO4 1.3 M. La mezcla resultante fue posteriormente diluida 1:10 en el amortiguador de fosfato y añadida al reactivo de detección, incubado por 10 minutos y leído a A405 nm. Se midió la proporción de PAA generada. Entonces, se repitió el procedimiento sin enzima, como un control.

Se generaron aproximadamente 900 ppm de PAA por este método, comparado con 32 ppm sin la enzima perhidrolasa . Los reactivos se pusieron en contacto con la enzima inmovilizada al menos por 60 segundos: Tabla 2A El experimento se repitió tres veces con enzima y tres veces sin la enzima; permitiendo un contacto de no más de 15 segundos con la enzima. Se produjo PAA consistentemente a niveles de ca. 300-350 ppm con enzima y aproximadamente 65 ppm sin enzima. Los resultados se describen a continuación en la Tabla 2B.

Tabla 2B Se obtuvieron resultados similares utilizando una inyectadora más grande (10 mi) : La reacción en la presencia de la enzima inmovilizada es reproducible en consecuencia, rápidamente y eficientemente, para proporcionar niveles de PAA que muchas veces son los niveles que se necesitan para eliminar una bacteria y suficientes para blanquear los dientes.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto sé reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un empaque que incluye un '. material deformable configurado para formar al menos dos cámaras selladas; el paquete caracterizado porque comprende: una primera cámara; una segunda cámara; y opcionalmente cámaras adicionales, en donde las cámaras están separadas por una o más barreras que son frágiles o rompibles, en donde la primera cámara contiene una solución liquida de baja viscosidad que incluye una enzima que tiene actividad perhidrolitica, dicha enzima tiene una porción característico de la familia de carbohidrato esterasas 7 (CE-7) que se alinea con una secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, la porción comprende: i) una porción RGQ en las posiciones correspondientes a las posiciones 118-120 de la SEQ ID NO: 1; ii) una porción GXSQG en las posiciones correspondientes a las posiciones 186-190 de la SEQ ID NO: 1; y iii) una porción HE en las posiciones correspondientes a las posiciones 303-304 de la SEQ ID NO: 1; y la segunda cámara comprende al menos un donante de sustrato de acilo, donde dicho sustrato es seleccionado del grupo consiste de: i) ásteres que tienen la estructura [X]mR5' en donde X = un grupo éster de la fórmula R6C(0)0 RÉ = porción hidrocarbilo Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica, opcionalmente sustituida con grupos hidroxilo o grupos alcoxi Cl a C4, en donde R6 opcionalmente comprende uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7; R5 = una porción hidrocarbilo Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica, o una porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción heteroaromática o aromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende de forma individual no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende opcionalmente uno o más ligaduras éter; M es un entero que oscila entre 1 al número de átomos de carbono en R5; y donde dichos ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; ii) glicéridos que tienen la estructura donde Ri= cadena de alquilo recta o ramificada Cl a C7 sustituida opcionalmente con un grupo hidroxilo o alcoxi Cl a C4 y R3 y R4 son individualmente H o RiC(O); iii) uno o más ésteres de la fórmula en donde Ri es un alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o grupo alcoxi Cl a C4 y R2 es un alquilo Cl a CIO de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -0) nH y n es 1 a 10; y iv) sacáridos acetilados seleccionados del grupo que consiste de monosacáridos acetilados, disacáridos acetilados y polisacáridos acetilados; y en donde la segunda u opcional cámara adicional contiene una fuente de peróxido y un gelante; de forma tal que cuando una o más barreras entre las cámaras se rompen luego de comprimir la primera cámara, la solución liquida de baja viscosidad se mezcla con la fuente de peróxido y el donante de sustrato de acilo, la enzima que tiene actividad perhidrolitica cataliza una reacción entre el peróxido liberado por la fuente de peróxido y el donante de sustrato de acilo para formar un perácido, en donde durante la mezcla y la formación del perácido, se forma un gel extrudable por el liquido y el gelante, que comprende perácido, cuyo gel extrudable es apropiado para la aplicación a una superficie de los dientes, por el tiempo suficiente para blanquearlos, en donde el gelante, el peróxido y el compeusto de éster de ácido carboxilico están en forma de polvo, y en donde el empaque tiene medios de abertura, una región de registro opcional, un tapón o entrada para permitir que se abra el paquete, para proporcionar la salida por la cual se dispense la mezcla.

2. El empaque de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima que tiene actividad perhidrolitica comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de: a) SEQ ID NO: ID NO: 1; y b) una secuencia de .aminoácido que tiene por lo menos 80% de una identidad de secuencia de aminoácido a SEQ ID NO: ID NO:l.

3. El paquete de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la enzima que tiene actividad perhidrolitica comprende además un dominio de enlace fusionado con el extremo C o N de la enzima, dicho dominio de enlace tiene afinidad para un tejido oral.

4. Cualquiera de los empaques anteriores, caracterizados porque el dominio de enlace tiene afinidad por un tejido oral que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 178-197.

5. Cualquiera de los empaques anteriores, caracterizados porque la enzima que tiene actividad perhidrolitica tiene afinidad por un tejido oral y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2.

6. El empaque de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fuente de peróxido es una fuente de peróxido sólido seleccionada de peróxido de urea, un complejo de polivinilpirrolidona-peróxido de hidrógeno, percarbonato de sodio, perborato de sodio y peróxidos metálicos, por ejemplo, peróxido de zinc y el peróxido de calcio.

7. El empaque de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el gelante es seleccionado de un gelante carbómero, una goma de polisacárido, un almidón alimenticio modificado, una gelatina de origen animal o de pescado, una sílice; y una combinación de dos o más de los mismos.

8. El empaque de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución acuosa de baja viscosidad comprende una solución amortiguadora.

9. Una composición para el cuidado oral de múltiples partes que comprende una primera parte que está físicamente separada de una segunda parte durante el almacenamiento y es combinada con una segunda parte inmediatamente antes de su uso, en donde la primera parte incluye una enzima que tiene actividad perhidrolítica, dicha enzima tiene una porción característica de la familia de carbohidrato esterasas 7 (CE-7) que se alinea con una secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, la porción característica caracterizada porque comprende: i) una porción RGQ en- las posiciones correspondientes a las posiciones 118-120 de la SEQ ID NO: 1; ii) una porción GXSQG en las posiciones correspondientes a las posiciones 186-190 de la SEQ ID NO: 1; y iii) una porción HE en las posiciones correspondientes a las posiciones 303-304 de la SEQ ID NO: 1; y la segunda parte incluye una fuente de peróxido, un gelante, y al menos un donante de sustrato de acilo, donde dicho sustrato es seleccionado del grupo consiste de: i) ésteres que tienen la estructura [X]mR5 en donde X = un grupo éster de la fórmula R6C(0)0 R6 = porción hidrocarbilo Cl a Cl, lineal, ramificada o cíclica, opcionalmente sustituida con grupos hidroxilos o grupos alcoxi Cl a C4, en donde R6 opcionalmente comprende uno o más enlaces éter para Re = C2 a C7; R5 = una porción hidrocarbilo Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o una porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción .heteroaromática o aromática cíclica de seis miembros opcionalmente sustituida con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende individualmente no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; donde R5 opcionalmente comprende uno o más ligaduras éter; M es un entero que oscila entre 1 y el número de átomos de carbono en R5; y en donde dichos ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm, a 25 °C; ii) glicéridos que tienen la estructura en donde Ri= alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo o un grupo alcoxi Cl a C4 y R3 y R4 son individualmente H o RiC(O); iii) uno o más ésteres de la fórmula en donde Ri es un alquilo Cl a C7 de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo o alcoxi Cl a C y R2 es un alquilo Cl a CIO de cadena recta o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, hetero'arilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -0) nH y n es l a lO; y iv) sacáridos acetilados seleccionados del grupo conformado por monosacáridos acetilados, disacáridos acetilados y polisacáridos acetilados; y en donde la fuente de peróxido y al menos un donante de sustrato de acilo reaccionan en la presencia de la enzima que tiene actividad perhidrolitica para formar un perácido, y en donde el gelante, peróxido y el compuesto de éster de ácido carboxilico todos están en forma de polvo.

10. La composición para el cuidado oral de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la fuente de peróxido es una fuente de peróxido sólido seleccionada de peróxido de urea, complejos de polivinilpirrolidona-peróxido de hidrógeno, percarbonat-o de sodio, perborato de sodio y peróxidos metálicos.

11. La composición para el cuidado oral de conformidad con la reivindicación 9 o reivindicación 10, caracterizada porque la fuente de .peróxido es peróxido de urea o un complejo de polivinilpirrolidona-peróxido de hidrógeno.

12. Un método para blanquear los dientes, caracterizado porque comprende: a. activar un paquete de conformidad con la reivindicación 1 o una composición de múltiples partes para el cuidado oral de conformidad con la reivindicación 9, combinando los materiales en las diferentes cámaras o partes respectivas; y b. aplicar una cantidad efectiva de la mezcla obtenida a los dientes durante un tiempo suficiente para blanquear los dientes .