MX2014006689A - Derivados de 6-difluorometil-5,6-dihidro-2h-[1,4]oxazin-3-amina. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a derivados novedosos de 6-difluorometil-5,6-dihidro-2H-[1,4]oxazin-3-amina como inhibidores de beta-secretasa, conocida también como la enzima que escinde la proteína precursora de amiloide por el sitio beta, BACE, BACE1, Asp2 o memapsina 2; la invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos, a procesos para preparar tales compuestos y composiciones, y al uso de tales compuestos y composiciones para prevenir y tratar trastornos en los que interviene la beta-secretasa, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, angiopatía amiloide cerebral, demencia multiinfarto, síndrome de Down, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides.

Description

DERIVADOS DE 6-DIFLUOROMETIL-5,6-DlHIDRO-2H-ri,41QXAZIN-3- AMINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a derivados novedosos de 6-difluorometil-5,6-dihidro-2/-/-[1 ,4]oxazin-3-amina como inhibidores de beta-secretasa, conocida también como la enzima que escinde la proteína precursora de amiloide por el sitio beta, BACE, BACE1, Asp2 o memapsina 2. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos, a procesos para preparar tales compuestos y composiciones, y al uso de tales compuestos y composiciones para prevenir y tratar trastornos en los que participa la beta-secretasa, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), el deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa asociada con el envejecimiento. Los pacientes con EA padecen deficiencias cognitivas y pérdidas de memoria, así como también problemas conductuales tales como la ansiedad. Más del 90% de las personas que padecen EA presentan una forma esporádica del trastorno mientras que menos del 10% de los casos son hereditarios o familiares. En los Estados Unidos, aproximadamente 1 de cada 10 personas con una edad de 65 años padece EA mientras que con 85 años, 1 de cada 2 individuos padece EA. La esperanza de vida media desde el diagnóstico inicial es de 7-10 años, y los pacientes con EA requieren asistencia continua ya sea en una residencia con asistencia especializada, lo cual tiene un costo muy elevado, o por miembros de la familia. Debido a que cada vez hay más ancianos en la población, la EA es cada vez un problema médico más importante. Las terapias disponibles en la actualidad para la EA simplemente tratan los síntomas de la enfermedad e incluyen inhibidores de acetilcolinesterasa para mejorar las propiedades cognitivas, así como también ansiolíticos y antipsicóticos para controlar los problemas conductuales asociados con esta enfermedad.

Las características patológicas distintivas en el cerebro de los pacientes con EA son ovillos neurofibrilares que se generan por hiperfosforilación de la proteína tau y placas amiloides que se forman por agregación del péptido beta-amiloide 1-42 (Abeta 1-42). El Abeta 1-42 forma oligómeros y después fibrillas y, en último lugar, placas amiloides. Se cree que los oligómeros y las fibrillas son especialmente neurotóxicos y pueden provocar la mayor parte del daño neurológico asociado con la EA. Los agentes que previenen la formación de Abeta 1-42 presentan el potencial de ser agentes modificadores de la enfermedad para tratar la EA. El Abeta 1-42 se genera a partir de la proteína precursora de amiloide (APP), constituida por 770 aminoácidos. El extremo /V-terminal de Abeta 1-42 es escindido por la beta-secretasa (BACE), y a continuación la gamma-secretasa escinde el extremo C-terminal. Además de Abeta 1-42, la gamma-secretasa también libera Abeta 1-40 que es el producto de escisión predominante así como también Abeta 1-38 y Abeta 1-43. Estas formas de Abeta también se pueden agregar para formar oligómeros y fibrillas. Por lo tanto, cabría esperar que los inhibidores de BACE prevengan la formación de Abeta 1-42 así como también Abeta 1-40, Abeta 1-38 y Abeta 1-43, y podrían ser agentes terapéuticos potenciales en el tratamiento de la EA.

El documento WO-2011/009943 (Novartis) describe derivados de oxazina no sustituidos y sustituidos en la posición 2 y su uso como inhibidores de BACE para el tratamiento de trastornos neurológicos. El documento WO-2011/020806 (Hoffmann-LaRoche) describe derivados no sustituidos en las posiciones 2 y 6 de 3-amino-5-fen¡l-5,6-dihidro-2H-[1 ,4]oxazina que tienen propiedades inhibitorias sobre BACE1 y/o BACE2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a derivados de 5,6-dihidro-2H- [1 ,4]oxazin-3-amina de fórmula (I) y los tautómeros y las formas estereoisoméricas de estos, en donde R1 es alquilo C-i^; R2 es hidrógeno o fluoro; L es un enlace o -NHCO-; Ar se selecciona a partir del grupo constituido por piridinilo, pirimidinilo y pirazinilo, cada uno opcionalmente sustituido con halo o alcoxi C1-3; y las sales de adición farmacéuticamente aceptables de estos.

Una composición farmacéutica que comprenda un portador farmacéuticamente aceptable y cualquiera de los compuestos descritos anteriormente son ilustrativos de la invención. Una ilustración de la invención es una composición farmacéutica preparada mezclando cualquiera de los compuestos descritos anteriormente con un portador farmacéuticamente aceptable. Como ilustración de la invención se encuentra un proceso para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar cualquiera de los compuestos descritos anteriormente con un portador farmacéuticamente aceptable.

Como ejemplo de la invención se encuentran métodos para tratar un trastorno mediado por la enzima beta-secretasa, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos o composiciones farmacéuticas descritos en la presente.

Como ejemplo adicional de la invención se encuentran métodos para inhibir la enzima beta-secretasa, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos o composiciones farmacéuticas descritos en la presente.

Un ejemplo de la invención es un método para tratar un trastorno seleccionado a partir del grupo constituido por la enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, angiopatía amiloide cerebral, demencia multiinfarto, síndrome de Down, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides, preferentemente la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos o composiciones farmacéuticas descritos anteriormente.

Otro ejemplo de la invención es cualquiera de los compuestos descritos anteriormente para utilizar en el tratamiento de: (a) enfermedad de Alzheimer, (b) deterioro cognitivo leve, (c) senilidad, (d) demencia, (e) demencia con cuerpos de Lewy, (f) síndrome de Down, (g) demencia asociada con el accidente cerebrovascular, (h) demencia asociada con la enfermedad de Parkinson e (i) demencia asociada con beta-amiloides, en un sujeto que lo necesite.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I) como los definidos anteriormente en la presente y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de estos. Los compuestos de fórmula (I) son inhibidores de la enzima beta-secretasa (conocida también como la enzima que escinde por el sitio beta, BACE, BACE1 , Asp2 o memapsina 2), y son útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides, preferentemente la enfermedad de Alzheimer, el deterioro cognitivo leve o la demencia, más preferentemente la enfermedad de Alzheimer.

En una realización de la invención, R1 es metilo o etilo.

En una realización de la invención Ar se selecciona entre 5-metoxipiridinilo, 5-pirimidinilo y 5-fluoropirazinilo.

En otra realización de la invención, R2 es hidrógeno o fluoro.

En otra realización, el átomo de carbono cuaternario sustituido con R1 tiene la configuración R.

Definiciones "Halo" denota fluoro, cloro y bromo; "alquiloxi C1.3" denota un radical de tipo éter donde el alquilo Ci-3 es un grupo alquilo saturado lineal o ramificado que tiene 1 , 2 o 3 átomos de carbono, p. ej., metilo, etilo, 1-propilo y 2-propilo.

El término "sujeto", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que es o que ha sido objeto de tratamiento, observación o experimentación.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de compuesto o agente farmacéutico activo que estimula la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o humano, la cual un investigador, veterinario, médico u otro profesional sanitario desea obtener, que incluye aliviar los síntomas de la enfermedad o trastorno que se esté tratando.

Se pretende que el término "composición", tal como se utiliza en la presente, abarque un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como también cualquier producto que sea el resultado, directo o indirecto, de combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.

Anteriormente y en lo sucesivo en la presente, se pretende que la expresión "compuesto de fórmula (I)" incluya las sales de adición, los solvatos y los estereoisómeros de este.

Las expresiones "estereoisómeros" o "formas estereoquímicamente isoméricas" se utilizan de forma indistinta anteriormente y en lo sucesivo en la presente.

La invención incluye todos los estereoisómeros del compuesto de fórmula (I) ya sea como un estereoisómero puro o como una mezcla de dos o más estereoisómeros.

Los enantiómeros son estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una mezcla 1 :1 de un par de enantiómeros es un racemato o mezcla racémica. Los diastereómeros (o diastereoisómeros) son estereoisómeros que no son enantiómeros, es decir, que no están relacionados como imágenes especulares. Por lo tanto, la invención incluye enantiómeros, diastereómeros y racematos.

La configuración absoluta se especifica de acuerdo con el sistema de Cahn-Ingold-Prelog. La configuración en un átomo asimétrico se especifica como R o S. Los compuestos resueltos cuya configuración absoluta se desconoce se pueden designar como (+) o (-) dependiendo de la dirección en la que hagan rotar el plano de la luz polarizada.

Cuando se identifica un estereoisómero específico, esto quiere decir que dicho estereoisómero está sustancialmente exento, es decir, asociado con menos de un 50%, preferentemente menos de un 20%, más preferentemente menos de un 10%, aún más preferentemente menos de un 5%, en particular menos de un 2% y aún más preferentemente menos de un 1%, de los otros isómeros. Por lo tanto, cuando un compuesto de fórmula (I) se especifica por ejemplo como (R), esto significa que el compuesto está sustancialmente exento del isómero (S).

Los compuestos de fórmula (I) coexisten en un equilibrio dinámico con los tautómeros de fórmula (l-a).

Es más, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de la presente invención pueden existir como polimorfos y, como tales, se pretende que queden incluidas en la presente invención. Además, algunos de los compuestos de la presente invención pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o disolventes orgánicos comunes, y también se pretende que tales solvatos queden incluidos dentro del alcance de esta invención.

Para el uso en medicina, las sales de los compuestos de esta invención se refieren a "sales farmacéuticamente aceptables" atóxicas. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles en la preparación de compuestos de acuerdo con esta invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos incluyen las sales de adición de ácido que se pueden formar, por ejemplo, mezclando una solución del compuesto con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico. Además, cuando los compuestos de la invención contienen un resto ácido, las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de estos pueden incluir sales de metales alcalinos, p. ej., sales de sodio o potasio; sales de metales alcalinotérreos, p. ej., sales de calcio o magnesio; y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados, p. ej., sales de amonio cuaternario.

Los ácidos representativos que se pueden utilizar en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, sin carácter limitante, los siguientes: ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, aminoácidos adiados, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido L-aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido (+)-camfórico, ácido camforsulfónico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido D-glucónico, ácido D-glucurónico, ácido L-glutámico, ácido beta-oxoglutárico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico ácido (+)-L-láctico, ácido (±)-DL-láctico, ácido lactobiónico, ácido maleico, ácido (-)-L-málico, ácido malónico, ácido (±)-DL-mandélico, ácido metanosulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido naftaleno-1 ,5-disulfónico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido oleico, ácido orático, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido fosfórico, ácido L-piroglutámico, ácido salicílico, ácido 4-aminosal¡cílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tánico, ácido (+)-L-tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluorometilsulfónico y ácido undecilénico. Las bases representativas que se pueden utilizar en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, sin carácter limitante, las siguientes: amoníaco, L-arginina, benetamina, benzatina, hidróxido de calcio, colina, dimetiletanolamina, dietanolamina, dietilamina, 2-(dietilamino)etanol, etanolamina, etilenodiamina, /V-metilglucamina, hidrabamina, 1H-imidazol, L-lisina, hidróxido de magnesio, 4-(2-hidroxietil)morfolina, piperazina, hidróxido de potasio, 1-(2-hidroxietil)pirrolidina, amina secundaria, hidróxido de sodio, trietanolamina, trometamina e hidróxido de zinc.

Los nombres de los compuestos de la presente invención se generaron de acuerdo con las reglas de nomenclatura acordada por el Chemical Abstracts Service (CAS) utilizando el software Advanced Chemical Development, Inc. (ACD/Name product, versión 10.01 ; Build 15494, 1 de diciembre de 2006) o de acuerdo con las reglas de nomenclatura acordadas por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) utilizando el software Advanced Chemical Development, Inc. (ACD/Name product, versión 10.01.0.14105, octubre de 2006). En el caso de las formas tautoméricas, se generó el nombre de la forma tautomérica de la estructura mostrada. La otra forma tautomérica no representada también se incluye dentro del alcance de la presente invención.

Preparación de los compuestos Procedimiento experimental 1 Los compuestos finales de acuerdo con la fórmula (I) se pueden preparar por hidrogenación catalítica de un compuesto intermedio de fórmula (ll-a) de acuerdo con el esquema de reacción (1). Dicha conversión se puede llevar a cabo mediante el tratamiento del compuesto intermedio de fórmula (II-a) con hidrógeno en presencia de un catalizador adecuado tal como, por ejemplo, paladio o carbono, un veneno catalítico adecuado tal como, por ejemplo, tiofeno, en un disolvente inerte en la reacción adecuado tal como, por ejemplo, acetato de etilo o metanol. La mezcla se agita en una atmósfera de hidrógeno, a una temperatura adecuada, normalmente a temperatura ambiente, a una presión adecuada tal como, por ejemplo, presión atmosférica durante, por ejemplo, 16 horas. En el esquema de reacción (1), todas las variables se definen como en la fórmula (I).

ESQUEMA DE REACCIÓN 1 Procedimiento experimental 2 Los compuestos intermedios de fórmula (ll-b) se pueden preparar generalmente haciendo reaccionar un compuesto intermedio de fórmula (III) con un compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con el esquema de reacción (2), una reacción que se lleva a cabo en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, diclorometano o metanol, en presencia de una base adecuada tal como, por ejemplo, trietilamina, en presencia de un agente de condensación tal como, por ejemplo, hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1 - \)-N,N,N',N -tetrametiluronio [HATU, CAS 148893-10-1] o cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio [DMTMM, CAS 3945-69-5] en condiciones térmicas tales como, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 25 °C durante el tiempo requerido para lograr que la reacción finalice, por ejemplo, 1-16 horas. En el esquema de reacción (2), todas las variables se definen como en la fórmula (I).

ESQUEMA DE REACCIÓN 2 Procedimiento experimental 3 Los compuestos intermedios de fórmula (ll-c) se pueden preparar generalmente mediante la reacción de compuestos intermedios de fórmula (VI) con un arilboronato o ácido arilborónico adecuado en una reacción de tipo Suzuki. Por lo tanto, los compuestos intermedios de fórmula (VI) pueden reaccionar con un arilboronato o ácido arilborónico en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, 1 ,4-dioxano, etanol, o mezclas de disolventes inertes tales como, por ejemplo, 1 ,2-dimetoxietano/agua/etanol, en presencia de una base adecuada tal como, por ejemplo, K3PO4, Na2C03 o CS2CO3 acuoso, un complejo de Pd como catalizador tal como, por ejemplo, [1 ,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) [CAS 72287-26-4] o diacetato de frans-bis(diciclohex¡lamina)paladio [DAPCy, CAS 628339-96-8] o tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0)[CAS14221-01-3] en condiciones térmicas tales como, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 80 °C, por ejemplo, durante un periodo de tiempo de 2-20 horas o, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 130 °C, por ejemplo, durante 10 minutos con irradiación de microondas. En el esquema de reacción (3), todas las variables se definen como en la fórmula (I) y W es halo. R3 y R4 pueden ser hidrógeno o alquilo, o se pueden juntar para formar, por ejemplo, un radical bivalente de fórmula -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- o -C(CH3)2C(CH3)2-.

Procedimiento experimental 4 Los compuestos intermedios de fórmula (III) se pueden preparar por lo general mediante los pasos de reacción que se muestran en el siguiente esquema de reacción (4).

ESQUEMA DE REACCIÓN 4 A: conversión de bromo en amina B: conversión de tioamida en amidina C: conversión de amida en tioamida (tionación) Los compuestos intermedios de fórmula (III) del esquema de reacción (4) anterior se pueden preparar a partir de los correspondientes compuestos intermedios de fórmula (VI) mediante procedimientos de acoplamiento catalizados por cobre conocidos en la técnica (paso de reacción A) . Dicho acoplamiento se puede llevar a cabo por tratamiento de dichos compuestos intermedios de fórmula (VI) con azida de sodio en un disolvente inerte para la reacción adecuado, tal como, por ejemplo, DMSO, en presencia de una mezcla de bases adecuada, tal como, por ejemplo, dimetiletilendiamina y Na2C03, un catalizador de cobre tal como Cul, en condiciones térmicas, tales como, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 110 °C hasta que finalice la reacción, por ejemplo, durante 1 hora.

Los compuestos intermedios de fórmula (VI) del esquema de reacción (4) anterior se pueden preparar a partir de los correspondientes compuestos intermedios de fórmula (VII) mediante procedimientos de conversión de tioamida en amidina conocidos en la técnica (paso de reacción B) . Dicha conversión se puede llevar a cabo convenientemente por tratamiento de los compuestos intermedios de fórmula (VII) con una fuente de amoníaco tal como, por ejemplo, cloruro de amonio o amoníaco acuoso, en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, agua o metanol y similares, en condiciones térmicas tales como, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 60 °C, por ejemplo, durante 6 horas.

Los compuestos intermedios de fórmula (VII) del esquema de reacción (4) anterior se pueden preparar a partir de los correspondientes compuestos intermedios de fórmula (VIII) mediante procedimientos de tionación conocidos en la técnica (paso de reacción C). Dicha conversión se puede llevar a cabo convenientemente por tratamiento de los compuestos intermedios de fórmula (VIII) con un agente de tionación tal como, por ejemplo, pentasulfuro de fósforo o 2,4-disulfuro de 2,4-bis-(4-metoxifenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetano [reactivo de Lawesson, CAS 19172-47-5], en un disolvente inerte para la reacción tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano o 1,4-dioxano y similares, en condiciones térmicas tales como, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 50 °C durante, por ejemplo, 50 minutos.

Procedimiento experimental 5 Los compuestos intermedios de fórmula (VIII) y (IX) se pueden preparar por lo general a partir de compuestos intermedios de fórmula (X) mediante los procedimientos de deshalogenación reductora conocidos en la técnica (paso de reacción D). Dicha conversión se puede llevar a cabo por tratamiento del intermedio de fórmula (X) con un reactivo de zinc adecuado, tal como, por ejemplo, polvo de zinc o el par zinc-cobre, en un disolvente adecuado tal como ácido acético, a una temperatura adecuada, normalmente de temperatura ambiente a 80 °C, durante el tiempo requerido para lograr que la reacción finalice, por ejemplo, 1- 6 horas. Esta conversión proporciona una mezcla de los compuestos intermedios de fórmula (VIII) y (IX) en diferente proporción dependiendo de las condiciones de reacción y de los reactivos.

Procedimiento experimental 6 Los compuestos intermedios de fórmula (X) se pueden preparar por lo general mediante los pasos de reacción que se muestran en el siguiente esquema de reacción (6).

E: cloración F: trifluorometilación G: ciclación Los compuestos intermedios de fórmula (X) del esquema de reacción (6) anterior se pueden preparar a partir de los compuestos intermedios de fórmula (XI) mediante procedimientos de cloración conocidos en la técnica (paso de reacción E). Dicha conversión se puede llevar a cabo por tratamiento del compuesto intermedio de fórmula (XI) con un agente de cloración adecuado tal como, por ejemplo, cloruro de tionilo, en presencia de una base tal como, por ejemplo, piridina, en un disolvente inerte para la reacción tal como, por ejemplo, diclorometano. La mezcla de reacción se agita a una temperatura adecuada, por ejemplo, 0 °C durante el tiempo requerido para lograr que finalice la reacción, por ejemplo, 30-60 minutos.

Los compuestos intermedios de fórmula (XI) del esquema de reacción (6) anterior se pueden preparar a partir de los compuestos intermedios de fórmula (XII) mediante procedimientos de trifluorometilación conocidos en la técnica (paso de reacción F). Dicha conversión se puede llevar a cabo por tratamiento del compuesto intermedio de fórmula (XII) en presencia de fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) o trifenildifluorosilicato de tetrabutilamonio (TBAT), con un agente trifluorometilante tal como, por ejemplo, (trifluorometil)trimetilsilano, en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se agita a una temperatura adecuada, por ejemplo, temperatura ambiente durante el tiempo requerido para lograr que finalice la reacción, por ejemplo, dos horas.

Los compuestos intermedios de fórmula (XII) del esquema de reacción (6) anterior se pueden preparar a partir de los compuestos intermedios de fórmula (XIV) mediante procedimientos de delación de dos pasos conocidos en la técnica (paso de reacción G). Dicha conversión se puede llevar a cabo primero por tratamiento de los compuestos intermedios de fórmula (XIV) con un compuesto intermedio de fórmula (XIII) tal como, por ejemplo, cloruro de cloroacetilo en presencia de una base tal como, por ejemplo, NaOH o DIPEA en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, diclorometano o mezclas de disolventes inertes tales como, por ejemplo, agua y 1 ,4-dioxano o agua y THF. El pH de la mezcla de reacción se puede ajustar a un valor de pH adecuado, por ejemplo, 10-1 1 , añadiendo una base adecuada tal como, por ejemplo, NaOH. La mezcla de reacción se agita a una temperatura adecuada, por ejemplo, de 0 °C a 25 °C durante el tiempo requerido para lograr que finalice la reacción, por ejemplo, 1-4 horas. El residuo crudo obtenido se puede ciclar posteriormente para proporcionar el intermedio (XII) por adición de una base adecuada tal como, por ejemplo, K2CO3, CS2CO3, /V,/V-diisopropiletilamina o NaHCO3, en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, acetonitrilo o DMF. La mezcla de reacción se agita en condiciones térmicas tales como, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a una temperatura de 25 °C a 80 °C durante 2-24 horas o, por ejemplo, calentando la mezcla de reacción a 140 °C durante 15-30 minutos con irradiación de microondas. Esta conversión también se puede llevar a cabo en ausencia de una base en un disolvente inerte para la reacción adecuado tal como, por ejemplo, acetonitrilo o DMF, a una temperatura adecuada, normalmente de 40 °C a 110 °C, durante un periodo de tiempo de, por ejemplo, 24-48 horas.

Farmacología Los compuestos de la presente invención y las composiciones farmacéuticamente aceptables de estos inhiben BACE y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve (DCL), senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, angiopatía amiloide cerebral, demencia multiinfarto, síndrome de Down, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides.

La invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula general (I), una forma estereoisomérica de este o una sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable de este, para su uso como medicamento.

La invención también se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula general (I), una forma estereoisomérica de este o una sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable de este, para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades o afecciones seleccionadas del grupo constituido por EA, DCL, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, angiopatía amiloide cerebral, demencia multiinfarto, síndrome de Down, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides.

La invención también se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la fórmula general (I), una forma estereoisomérica de este o una sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable de este, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de cualquiera de los estados patológicos mencionados anteriormente en la presente.

En vista de la utilidad del compuesto de Fórmula (I), se proporciona un método para tratar sujetos tales como animales de sangre caliente, incluidos los seres humanos, que padezcan cualquiera de las enfermedades mencionadas anteriormente en la presente, o un método para prevenir que los sujetos tales como animales de sangre caliente, incluidos los seres humanos, padezcan cualquiera de tales enfermedades.

Dichos métodos comprenden la administración, es decir, la administración sistémica o tópica, preferentemente la administración oral, de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I), una forma estereoisomérica de este, una sal de adición farmacéuticamente aceptable o solvato de este, a un sujeto tal como un animal de sangre caliente, incluido un ser humano.

Un método de tratamiento también puede incluir administrar el principio activo en un régimen comprendido entre una y cuatro tomas al día.

En estos métodos de tratamiento, los compuestos de acuerdo con la invención se formulan preferentemente antes de la administración. Tal como se describe a continuación en la presente, las formulaciones farmacéuticas adecuadas se preparan mediante procedimientos conocidos utilizando ingredientes conocidos y de los que se puede disponer fácilmente.

Los compuestos de la presente invención que pueden ser adecuados para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer o los síntomas de esta, se pueden administrar solos o combinados con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La terapia combinada incluye la administración de una única formulación farmacéutica que contenga un compuesto de fórmula (I) y uno o más agentes terapéuticos adicionales, así como también la administración del compuesto de fórmula (I) y cada agente terapéutico adicional en su propia formulación farmacéutica independiente. Por ejemplo, un compuesto de Fórmula (I) y un agente terapéutico se pueden administrar al paciente juntos en una única composición posológica oral, tal como un comprimido o una cápsula, o cada agente se puede administrar en formulaciones farmacéuticas orales independientes.

Composiciones farmacéuticas La presente invención también proporciona composiciones para prevenir o tratar enfermedades en las que la inhibición de la beta-secretasa es beneficiosa, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, síndrome de Down, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la fórmula (I) y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables.

Aunque es posible administrar el principio activo solo, es preferible presentarlo como una composición farmacéutica. Por consiguiente, la presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la presente invención, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables. El portador o diluyente deben ser "aceptables" en el sentido de que han de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y no han de ser perjudiciales para los receptores de estos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden preparar mediante cualesquiera métodos conocidos en el campo de la farmacia. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto particular, en forma de base o en forma de sal de adición, como principio activo se combina en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, que puede tomar una gran variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para su administración. Estas composiciones farmacéuticas se encuentran convenientemente en formas farmacéuticas unitarias adecuadas, preferentemente, para la administración sistémica tal como la administración oral, percutánea o parenteral; o la administración tópica tal como por inhalación, un spray nasal, colirio o mediante una crema, gel, champú o similar. Por ejemplo, en la preparación de composiciones en una forma farmacéutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparados líquidos orales tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o portadores sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a su fácil administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma farmacéutica unitaria oral más conveniente, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. Para las composiciones parenterales, el portador normalmente comprenderá agua esterilizada, al menos en gran parte, aunque puede incluir otros ingredientes, por ejemplo, para incrementar la solubilidad. Se pueden preparar soluciones inyectables, por ejemplo, en las que el portador comprenda solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y de glucosa. También se pueden preparar suspensiones inyectables, en cuyo caso se pueden emplear portadores líquidos, agentes de suspensión y similares que sean adecuados. En las composiciones adecuadas para la administración percutánea, el portador comprende opcionalmente un agente potenciador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinados con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones minoritarias, donde los aditivos no provocan ningún efecto perjudicial significativo en la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración a la piel y/o pueden ser útiles para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones se pueden administrar de varias formas, p. ej., como un parche transdérmico, como una unción dorsal puntual o como una pomada.

Es especialmente conveniente formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas farmacéuticas unitarias debido a su fácil administración y a la uniformidad de la dosis. La expresión "forma farmacéutica unitaria", tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de principio activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, asociada con el portador farmacéutico requerido. Los ejemplos de tales formas farmacéuticas unitarias son comprimidos (incluidos los comprimidos recubiertos y ranurados), cápsulas, pastillas, sobres de polvos, obleas, soluciones o suspensiones inyectables, cucharaditas, cucharadas y similares, y múltiplos segregados de estos.

La dosis exacta y la frecuencia de administración dependen del compuesto particular de fórmula (I) utilizado, la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, la edad, el peso, el sexo, el alcance del trastorno y el estado físico general del paciente particular, así como también de otra medicación que el individuo pueda estar tomando, como bien sabrán los expertos en la técnica. Además, es obvio que dicha cantidad diaria eficaz se puede reducir o incrementar dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescriba los compuestos de la presente invención.

Dependiendo del modo de administración, la composición farmacéutica comprenderá entre un 0.05 y un 99% en peso, preferentemente entre un 0.1 y un 70% en peso, más preferentemente entre un 0.1 y un 50% en peso del principio activo, y entre un 1 y un 99.95% en peso, preferentemente entre un 30 y un 99.9% en peso, más preferentemente entre un 50 y un 99.9% en peso de un portador farmacéuticamente aceptable, estando todos los porcentajes basados en el peso total de la composición.

Los presentes compuestos se pueden utilizar para la administración sistémica tal como la administración oral, percutánea o parenteral; o la administración tópica tal como por inhalación, un spray nasal, colirio o mediante una crema, gel, champú o similar. Los compuestos se administran preferentemente por vía oral. La dosis exacta y la frecuencia de administración dependen del compuesto particular de acuerdo con la fórmula (I) utilizado, la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, la edad, el peso, el sexo, el alcance del trastorno y el estado físico general del paciente particular, así como también de otra medicación que el individuo pueda estar tomando, como bien sabrán los expertos en la técnica. Además, es obvio que dicha cantidad diaria eficaz se puede reducir o incrementar dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescriba los compuestos de la presente invención.

La cantidad de un compuesto de fórmula (I) que se puede combinar con un material portador para producir una única forma farmacéutica variará dependiendo de la enfermedad tratada, la especie de mamífero y el modo particular de administración. Sin embargo, como norma general, las dosis unitarias adecuadas para los compuestos de la presente invención pueden contener, por ejemplo, preferentemente entre 0.1 mg y aproximadamente 1000 mg del compuesto activo. Una dosis unitaria preferida es aquella comprendida entre 1 mg y aproximadamente 500 mg. Una dosis unitaria más preferida es aquella comprendida entre 1 mg y aproximadamente 300 mg. Una dosis unitaria incluso más preferida es aquella comprendida entre 1 mg y aproximadamente 100 mg. Tales dosis unitarias se pueden administrar más de una vez al día, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 veces al día, pero preferentemente 1 o 2 veces al día, de modo que la dosis total para un adulto de 70 kg está comprendida en el rango de 0.001 a aproximadamente 15 mg por kilogramo de peso del sujeto por administración. Una dosis preferida es aquella comprendida entre 0.01 y aproximadamente 1.5 mg por kg de peso del sujeto por administración, y dicha terapia se puede prolongar durante varias semanas o meses y, en algunos casos, años. Sin embargo, se sobreentenderá que el nivel posológico específico para cualquier paciente particular dependerá de varios factores incluidos la actividad del compuesto específico empleado; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del individuo que esté siendo tratado; el tiempo y la vía de administración; la tasa de excreción; otros fármacos que hayan sido administrados previamente; y la gravedad de la enfermedad particular que se esté tratando, como bien sabrán los expertos en la técnica.

Una dosis típica puede ser aquella comprendida entre 1 mg y aproximadamente 100 mg, o entre 1 mg y aproximadamente 300 mg tomada una vez al día o varias veces al día, o una cápsula o un comprimido de liberación lenta tomado una vez al día y que contenga un contenido proporcionalmente superior de principio activo. El efecto de liberación lenta se puede obtener con materiales capsulares que se disuelven a valores de pH diferentes, con cápsulas que se liberan lentamente por acción de la presión osmótica, o mediante cualquier otro método conocido de liberación controlada.

Puede ser necesario emplear dosis que no estén comprendidas en estos rangos en algunos casos como será evidente para los expertos en la técnica. Además, cabe destacar que el médico o profesional sanitario responsable del tratamiento sabrá cómo y cuándo comenzar, interrumpir, ajustar o finalizar la terapia teniendo en cuenta la respuesta del paciente individual.

Un experto en la técnica comprenderá que los compuestos preferidos para utilizar en cada una de las composiciones y métodos proporcionados anteriormente son aquellos compuestos que se han señalado como preferidos anteriormente. Otros compuestos preferidos adicionales para las composiciones y métodos son aquellos compuestos que se proporcionan en los siguientes ejemplos.

Sección experimental En adelante en la presente, el término "p.f." significa punto de fusión, "ac." significa acuoso, "m.r." significa mezcla de reacción, "t.amb." significa temperatura ambiente, "DI PEA" significa N,N-diisopropiletilamina, "DIPE" significa éter diisopropílico, THF' significa tetrahidrofurano, 'DMF' significa dimetilformamida, 'DCM' significa diclorometano, "EtOH" significa etanol, 'AcOEt' significa acetato de etilo, "AcOH" significa ácido acético, '"PrOH" significa isopropanol, "¡PrNH2" significa isopropilamina, "MeCN" significa acetonitrilo, "MeOH" significa metanol, "Pd(OAc)2" significa diacetato de paladio (II), "rae" significa racémico, 'sat.' significa saturado, 'SFC significa cromatografía de fluidos supercríticos, 'SFC-MS' significa cromatografía de fluidos supercríticos/espectrometría de masas, "LC-MS" significa cromatografía líquida/espectrometría de masas, "GCMS" significa cromatografía de gases/espectrometría de masas, "HPLC" significa cromatografía líquida de alta resolución, "RP" significa fase inversa, "UPLC" significa cromatografía líquida de ultrarresolución, "TR" significa tiempo de retención (en minutos), "[M+H]+" significa masa protonada de la base libre del compuesto, "DAST" significa trifluoruro de dietilaminoazufre, "DMTMM" significa cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio, "HATU" significa hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/V,/V',A/-tetrametiluronio, Xantphos" significa (9,9-dimetil-9H-xanteno-4,5-diil)bis[difenilfosfina], "TBAT" significa trifenildifluorosilicato de tetrabutilamonio, "TFA" significa ácido trifluoracético, "Et.20" significa éter dietílico, "DMSO" significa sulfóxido de dimetilo, "MeCN" significa acetonitrilo.

Para los principales intermedios, así como también para algunos compuestos finales, la configuración absoluta de los centros quirales (indicada como R y/o S) se estableció por comparación con muestras de configuración conocida o empleando técnicas analíticas adecuadas para la determinación de la configuración absoluta tales como DCV (dicroísmo circular vibracional) o cristalografía de rayos X. Cuando se desconoce la configuración absoluta de un centro quiral, se designa arbitrariamente R*.

A. Preparación de los intermedios EJEMPLO A1 Preparación del intermedio 1 Se añadió cianuro de trimetilsililo (30.7 ml_, 230 mmol) a una solución agitada de 5-bromo-2-fluoroacetofenona (25 g, 115 mmol) y NH4CI (18.5 g, 345 mmol) en ??^?ß?? (150 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. A continuación, el disolvente se evaporó al vacío y se añadió AcOEt (80 mL) al residuo. El sólido se filtró y el filtrado se evaporó al vacío para obtener el intermedio 1 (27.9 g, rendimiento cuant.), que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional.

EJEMPLO A2 Preparación del intermedio 2 El intermedio 1 (27 g, 111 mmol) se disolvió en HCI (37% H20) (130 mL) y ácido acético (130 mL) y la mezcla se calentó a reflujo durante 16 horas. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se concentró al vacío. Se añadió agua y la fase acuosa se extrajo con AcOEt. La fase acuosa se basificó con una solución ac. de NaOH (25%) hasta un pH de 7. La fase acuosa se concentró parcialmente al vacío. Se enfrió la mezcla en un baño de hielo y el precipitado se separó por filtración, se lavó con agua y a continuación con Et.2O y se secó al vacío para proporcionar el intermedio 2 (18 g, 62% de rendimiento) como un sólido blanco.

EJEMPLO A3 Preparación del intermedio 3 El intermedio 2 (15 g, 57.2 mmol) se disolvió en MeOH (300 mL). Se añadió H2SO4 (330 mL) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 48 h. La m.r. se concentró al vacío. Se añadió agua y la solución se basificó hasta un pH de 8 con una solución ac. sat. de NHCO3. A continuación la fase acuosa se extrajo con AcOEt. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y se concentró al vacío para obtener el intermedio 3 (15 g, 95% de rendimiento).

EJEMPLO A4 Preparación del intermedio 4 Se separó el intermedio 3 (10 g) en los correspondientes enantiómeros mediante SFC preparativa en una columna Chiralpak® Daicel AD (30 x 250 mm); fase móvil = (C02, MeOH con un 0.2% de 'PrNH2) para obtener el intermedio 4 (4.2 g, 42% de rendimiento). aD: -10.1° (365 nm, c 0.762% p/v, MeOH, 20 EJEMPLO A5 Preparación del intermedio 5 Se añadió THF (150 mL) a una solución del intermedio 4 (40 g, 145 mmol) en NaOH (1 M en H2O, 360 mL). La mezcla se agitó a t. amb. durante 4 horas. La mezcla se concentró al vacío para obtener el intermedio 5 (42 g) como un sólido blanco, que se utilizó tal cual en el siguiente paso de reacción.

EJEMPLO A6 Preparación del intermedio 6 A una solución enfriada del intermedio 5 (41.3 g, 145 mmol) en H20 (150 mL), se añadió gota a gota una solución de cloruro de cloroacetilo (24 ml_, 304.5 mmol) en 1 ,4-dioxano (75 mL). Simultáneamente, se añadió NaOH (5M en H20, 29 mL) para ajustar el pH a 10-11. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con Et20. A continuación se acidificó la fase acuosa con HCI (6 M en H20) hasta pH 2. El sólido blanco precipitado se recogió por filtración, se lavó con H20 y se secó para obtener el intermedio 6 (42 g, 86% de rendimiento).

EJEMPLO A7 Preparación del intermedio 7 El intermedio 6 (42 g, 124 mmol) y NaHC03 (20.8 g, 248 mmol) se disolvieron en DMF (1000 mL) y la mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 3 horas. La mezcla se concentró parcialmente a presión reducida, se enfrió hasta t. amb. y después se filtró a través de diatomita. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en columna (gel de sílice; eluyente: MeOH/DCM de 0/100 a 5/95). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 7 (36 g, 96% de rendimiento).

EJEMPLO A8 Preparación del intermedio 8 A una solución del intermedio 7 (11.6 g, 38.5 mmol) en THF (117 ml_) se añadió TBAT (2.08 g, 3.85 mmol). A continuación, (trifluorometil)trimetilsilano (12.5 ml_, 84.6 mmol) se añadió gota a gota y la m.r. se agitó a t. amb. durante 20 minutos. La mezcla se desactivó con NaCI acuosa y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 8 (14 g, 98% de rendimiento) como una mezcla de isómeros cis y trans, que se utilizó tal cual en el siguiente paso.

EJEMPLO A9 Preparación del intermedio 9 El intermedio 8 (14 g, 37.6 mmol) se disolvió en DCM (600 mL) y se enfrió hasta O °C. A continuación se añadió cloruro de tionilo (11.2 mL, 150 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min a 0 °C y a continuación se añadió piridina (18.2 mL, 225.7 mmol). Después de 30 minutos, la reacción se hidrolizó con una solución de HCI acuoso 1N y a continuación se extrajo con DCM. Las fases orgánicas se separaron, se secaron (MgS04), se filtraron y se evaporaron al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco en metanol 7 M/DCM de 0/100 a 2/98). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 9 (6 g, 41% de rendimiento, mezcla de diasteroisómeros).

EJEMPLO A10 Preparación del intermedio 10 El intermedio 9 (7 g, 17.9 mmol) y el par zinc-cobre (8.55 g, 66.3 mmol) se agitaron en ácido acético (420 mL) a t. amb. durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtró, se lavó con DCM y se concentró al vacío. Se añadieron una solución de hidróxido amónico (al 28% en agua) y DCM y la mezcla se agitó a t. amb. durante 1 h. Se separó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgS04), se filtraron y se evaporaron al vacío para obtener el intermedio 10 (6 g, 99% de rendimiento) como un polvo blanco.

EJEMPLO A11 Preparación del intermedio 11 Se añadió P2S5 (5.95 g, 26.8 mmol) a una solución del intermedio 10 (6 g, 17.9 mmol) en THF (145 mL) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 90 minutos. A continuación se enfrió la mezcla hasta t. amb., se separó por filtración y los disolventes orgánicos se evaporaron al vacío para obtener el intermedio 11 (5.9 g), que se empleó tal cual en el siguiente paso.

EJEMPLO A12 Preparación del intermedio 12 El intermedio 11 (5.9 g, 16.8 mmol) se disolvió en amoníaco 7N en MeOH (390 rmL) y la mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 2 horas. El disolvente se evaporó y el producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco 7M en metanol/DCM de 0/100 a 5/95). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 12 (4.04 g, 72% de rendimiento).

EJEMPLO A13 Preparación del intermedio 13 El intermedio 12 (3.6 g, 10.7 mmol) se combinó con NaN3 (1.75 g, 26.9 mmol), Cul (2.56 g, 13.4 mmol) y Na2C03 (2.28 g, 21.5 mmol) en DMSO (153 ml_), y la reacción se desgasificó. Después de eso, se añadió ?/,?/'-dimetiletilendiamina (2 mL, 18.8 mmol) y la mezcla se calentó a 110 °C hasta el final de la reacción, aproximadamente 3 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío. Se añadió amoníaco 7N en MeOH y la mezcla se agitó durante toda la noche. El precipitado formado se filtró y el filtrado se concentró al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco en metanol 7 M/DCM de 0/100 a 30/70). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 13 (1.52 g, 52% de rendimiento).

EJEMPLO A14 Preparación del intermedio 14 Se disolvió el ácido 5-metoxipirazin-2-carboxílico (0.218 g, 1.42 mmol) en MeOH (30 mL) y se añadió DMTMM (0.456 g, 1.548 mmol). Después de agitar la mezcla durante 5 minutos, se añadió una solución del intermedio 13 (0.35 g, 1.29 mmol) en MeOH (20 mL) a 0 °C y la mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó al vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco en metanol 7 M/DCM de 0/100 a 5/95). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío. Se suspendió el residuo en DIPE/heptanos, se filtró y se secó a alto vacío para obtener el intermedio 14 (0.266 g, 51% de rendimiento) como un sólido blanco.

EJEMPLO A15 Preparación del intermedio 15 Se sintetizó el intermedio 15 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo A14. A partir del intermedio 13 (0.35 g, 1.29 mmol) se obtuvo el intermedio 15 como un sólido blanco (0.362 g, 71% de rendimiento).

EJEMPLO A16 Preparación del intermedio 16 Se disolvieron 1-(5-bromo-2-fluorofenil)etanona [(CAS 198477-89-3), 70 g, 322 mmol) y óxido de selenio (71.6 g, 645 mmol) en piridina (520 ml_). La mezcla de reacción se agitó a 100 °C durante 2 horas. Se evaporó el disolvente y se añadió una solución acuosa de HCI 1N. La fase acuosa se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas combinadas se secaron (Mg2SO4), se filtraron y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 16 (62 g, 78% de rendimiento) que se utilizó tal cual en la siguiente reacción.

EJEMPLO A17 Preparación del intermedio 17 Se añadió gota a gota cloruro de tionilo (37 mL, 510 mmol) a una solución agitada del intermedio 16 (42 g, 170 mmol) en MeOH (456 mL) a 0 °C. La mezcla se calentó a reflujo durante 18 horas. Se evaporaron los disolventes al vacío y se repartió el residuo entre Na2C03 saturado y DCM. La fase orgánica se separó, se secó (Mg2SC>4), se filtró y se concentró al vacío para obtener el intermedio 17 (30 g, 68% de rendimiento) como un aceite amarillo.

EJEMPLO A18 Preparación del intermedio 8 Se añadió isopropóxido de titanio (IV) (153 mL, 522 mmol) a una mezcla agitada del intermedio 17 (68 g, 261 mmol) y (S)-2-metil-2-propanosulfinamida (37.9 g, 313 mmol) en n-heptano (1000 mL). La mezcla se agitó a 80 °C durante 1.5 horas. La mezcla se enfrió hasta t. amb. y se añadió agua-hielo. La mezcla resultante se filtró a través de un lecho de diatomita y se lavó con n-heptano. La fase acuosa se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO- , se filtraron y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 18 (87.9 g, 86% de rendimiento) que se utilizó tal cual en la siguiente reacción.

EJEMPLO A19 Preparación del intermedio 19 Se añadió bromuro de etilmagnesio (3 M, 86 mL, 259 mmol) gota a gota a una solución agitada del intermedio 18 (72.6 g, 185 mmol) en DCM (1154 mL) a -78 °C en nitrógeno. La mezcla se agitó a esta temperatura durante 30 min y después la reacción se detuvo mediante la adición de una solución de NH4CI ac. sat., seguida de agua. La mezcla se extrajo con DCM y se lavó con agua. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y los disolventes se evaporaron al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; eluyente: heptanos/AcOEt de 90/10 a 70/30). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 19 (25.56 g, 33% de rendimiento, mezcla de diasterómeros) como un aceite amarillo.

EJEMPLO A20 Preparación del intermedio 20 Se añadió una solución de NaOH ac. 2M (91 mL, 181.8 mmol) a una solución del intermedio 19 crudo (25.6 g, 60.6 mmol) en MeOH (68 mL). La mezcla resultante se agitó a reflujo durante 5 horas. La mezcla se enfrió hasta t. amb., y a continuación se repartió entre agua y AcOEt. Se separó la fase acuosa y se neutralizó añadiendo una solución de HCI ac. 1 M y a continuación se extrajo con DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO- , se filtró y los disolventes se evaporaron al vacío. El residuo se suspendió en DIPE y el precipitado se separó por filtración, se secó al vacío para obtener el intermedio 20 (17.5 g, 76% de rendimiento, mezcla de diastereómeros) como un sólido blanco.

EJEMPLO A21 Preparación del intermedio 21 Sal del ácido clorhídrico El Intermedio 20 (17.5 g, 46 mmol) se agitó en una solución de HCI 4M en dioxano (46 mL) a temperatura ambiente durante 15 minutos. A la suspensión resultante se añadió DIPE, y el precipitado se separó por filtración y se secó al vacío para obtener el intermedio 21 (15.1 g, rendimiento cuant., racemato) como un sólido blanco.

EJEMPLO A22 Preparación del intermedio 22 A una solución enfriada del intermedio 21 (15.1 g, 43.2 mmol) y DIPEA (35 mL, 203.7 mmol) en DCM (350 mL), se añadió gota a gota cloruro de cloroacetilo (5.6 mL, 70.6 mmol) a 0 °C. Después de agitar a 0 °C durante 15 minutos, se calentó la mezcla de reacción hasta t. amb. y se acidificó con HCI (2M en H20, 10 ml_). La mezcla se extrajo con AcOEt y se lavó con salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (MgS04), se filtró y los disolventes se evaporaron al vacío. El producto crudo se purificó suspendiéndolo en DIPE y el precipitado se separó por filtración, se secó al vacío para obtener el intermedio 22 (8.04 g, 53% de rendimiento) como un sólido marrón.

EJEMPLO A23 Preparación del intermedio 23 Se sintetizó el intermedio 23 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 7. A partir del intermedio 22 (8 g, 22.69 mmol) se obtuvo el intermedio 23 como un sólido blanco (4.5 g, 63% de rendimiento).

EJEMPLO A24 Preparación del intermedio 24 Se sintetizó el intermedio 24 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 8. A partir del intermedio 23 (2.34 g, 7.4 mmol) se obtuvo el intermedio 24 como un aceite (1.9 g, 66% de rendimiento).

EJEMPLO A25 Preparación del intermedio 25 Se sintetizó el intermedio 25 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 9. A partir del intermedio 24 (1.9 g, 4.92 mmol) se obtuvo el intermedio 25 como un sólido amarillo pálido (1.58 g, 79% de rendimiento).

EJEMPLO A26 Preparación del intermedio 26 El intermedio 25 (1.4 g, 3.46 mmol) se agitó en ácido acético (42 ml_) a 00 °C durante 5 minutos. Se añadió zinc (0.91 g, 13.8 mmol) y la mezcla se agitó a 100 °C durante 1 h. Se añadió más zinc (0.452 g, 6.9 mmol) y la mezcla se agitó adicionalmente a 100 °C. Después de otra hora, se añadió zinc nuevo (0.226 g, 3.46 mmol) y la mezcla se agitó a 100 °C durante 2 h. Finalmente, se añadió más zinc (0.91 g, 13.8 mmol) y la mezcla se agitó a 100 °C durante 1 h. Después de enfriar, se filtró la mezcla de reacción, se lavó con DCM y se concentró al vacío. Se añadieron una solución de hidróxido amónico (28% en agua), una solución ac. sat. de NaHC03 y agua. La fase acuosa se extrajo con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgS0 ), se filtraron y se evaporaron al vacío para obtener el intermedio 26 (1.26 g, 98% de rendimiento) como un sólido blanco.

EJEMPLO A27 Preparación del intermedio 27 Se sintetizó el intermedio 27 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 11. A partir del intermedio 26 (1.26 g, 3.4 mmol) se obtuvo el intermedio 27 como un sólido blanco (1.09 g, 83% de rendimiento).

EJEMPLO A28 Preparación del intermedio 28 v del intermedio 29 El intermedio 27 (1 g, 2.59 mmol) se disolvió en amoníaco 7N en MeOH (60 mL) y la mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 15 minutos con radiación de microondas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se añadió amoníaco 7N en MeOH nuevo (30 mL). La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante otros 15 minutos con radiación de microondas. El disolvente se evaporó y el producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco 7M en metanol/DCM de 0/100 a 2/98). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 28 (0.29 g, 30% de rendimiento, racemato cis) como un sólido blanco y el intermedio 29 (0.27 g, 30% rendimiento) como un aceite.

EJEMPLO A29 Preparación del intermedio 30 Se sintetizó el intermedio 30 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 13. A partir del intermedio 29 (0.189 g, 0.542 mmol) se obtuvo el intermedio 30 como un aceite (0.16 g), el cual se utilizó tal cual en la siguiente reacción.

EJEMPLO A30 Preparación del intermedio 31 Se sintetizó el intermedio 31 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo A14. A partir del intermedio 30 (0.09 g, 0.315 mmol) se obtuvo el intermedio 31 como un sólido blancuzco (0.028 g, 21% de rendimiento).

EJEMPLO A31 Preparación del intermedio 32 El intermedio 12 (0.4 g, 1.194 mmol), ácido 5-pirimidinilborónico (0.296 g, 2.387 mmol) y tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0.207 g, 0.179 mmol) se disolvieron en una mezcla de 1 ,4-dioxano (18 mL) y NaHC03 acuoso (sol. sat, (8.5 mL). La mezcla resultante se purgó con N2 y se calentó a continuación a 70 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó a continuación con agua y se extrajo posteriormente con DCM (3x). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó (NaaSO- , se filtró y los disolventes se evaporaron al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; solución de amoníaco 7M en metanol/DCM de 0/100 a 5/95). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 32 (0.3 g, 75% de rendimiento) como una espuma blanca.

EJEMPLO A32 Preparación del intermedio 33 A partir de 3-bromoacetofenona (CAS 2142-63-4), se sintetizó el intermedio 33 siguiendo los mismos procedimientos de reacción descritos para el intermedio 12 en los Ejemplos A1-A12.

EJEMPLO A33 Preparación del intermedio 34 Se sintetizó el intermedio 34 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo A31. A partir del intermedio 33 (0.31 g, 0.978 mmol) se obtuvo el intermedio 34 como un sólido blanco (0.21 g, 68% de rendimiento).

EJEMPLO A34 Preparación del intermedio 35 Se disolvió el intermedio 13 (2.78 g, 10.25 mmol) en AcOEt (70 ml_) y se añadieron paladio sobre carbono (10%) (1.09 g) y tiofeno (solución al 0.4% en THF, 14 ml_). La mezcla se hidrogenó a t. amb. y presión atmosférica durante 16 horas. El catalizador se separó por filtración y los disolventes se evaporaron al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco 7 en metanol/DCM de 0/100 a 10/90). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el intermedio 35 (0.478 g, 17% de rendimiento).

B. Preparación de los compuestos finales EJEMPLO B1 Preparación del compuesto 1: /S/-(3-r(2R*.3R)-5-Amino-2- (difluorometil)-3-metil-3.6-d¡hidro-2H-1 ,4-oxazin-3-ill-4-fluorofenil)-5-metoxipirazin-2-carboxamida Se disolvió el intermedio 14 (0.154 g, 0.378 mmol) en AcOEt (5 ml_) y se añadieron paladio sobre carbono (10%) (0.04 g, 0.038 mmol) y tiofeno (solución al 0.4% en THF, 0.5 ml_, 0.026 mmol). La mezcla se hidrogenó a t. amb. y presión atmosférica durante 16 horas. El catalizador se separó por filtración y los disolventes se evaporaron al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco 7M en metanol/DCM de 0/100 a 2/98). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío. Se suspendió el residuo en DIPE, se filtró y se secó a alto vacío para obtener el compuesto 1 (0.067 g, 43% de rendimiento).

EJEMPLO B2 Preparación del compuesto 2: A/-(3-r(2R*,3R)-5-Amino-2-(difluorometil)-3-metil-3.6-dihidro-2H-1 ,4-oxazin-3-il1-4-fluorofeni))-5-fluoropiridin-2-carboxamida Se sintetizó el compuesto 2 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo B1. A partir del intermedio 15 (0.251 g, 0.637 mmol) se obtuvo el compuesto 2 como un sólido blanco (0.114 g, 45% de rendimiento).

EJEMPLO B3 Preparación del compuesto 3: c/'s-rac-A/-(3-r5-Amino-2-(difluorometil)-3-et¡l-3,6-d¡hidro-2H-1 ,4-oxazin-3-¡n-4-fluorofenil}-5-metoxipirazin-2-carboxamida Se disolvió el intermedio 31 (0.028 g, 0.066 mmol) en MeOH (1.3 ml_) y se hidrogenó en un reactor H-cube (1 mL/min, cartucho de Pd/C al 10%, modo de H2 total), primero a 25 °C, a continuación a 50 °C y finalmente a 80 °C. Se eliminó el disolvente al vacío. Se purificó el producto crudo mediante HPLC preparativa (C18 XBridge 19 x 100 5 pm), fase móvil (gradiente de un 80% y 0.1% de NH4CO3H/NH4OH, solución con un pH 9 en agua, 20% de CH3CN a un 0% y 0.1% de NH4CO3H/NH4OH, solución con un pH 9 en agua, 100% de CH3CN). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío para obtener el compuesto 3 (0.0032 g, 11% de rendimiento).

EJEMPLO B4 Preparación del compuesto 4: (5R.6R*)-6-(Difluorometil)-5-(2-fluoro-5-pirimidin-5-ilfen¡l)-5-metil-5,6-dihidro-2/-/-1.4-oxazin-3-amina Se sintetizó el compuesto 4 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo B1. A partir del intermedio 32 (0.155 g, 0.464 mmol) se obtuvo el compuesto 4 (0.018 g, 12% de rendimiento).

EJEMPLO B5 Preparación del compuesto 5: (5R,6R*)-6-(Difluorometil)-5-metil-5-(3-pirím¡din-5-ilfeniO-5,6-dihidro-2H-1,4-oxazin-3-amina Se sintetizó el compuesto 5 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo B1. A partir del intermedio 34 (0.124 g, 0.392 mmol) se obtuvo el compuesto 5 como un sólido blanco (0.04 g, 32% de rendimiento).

EJEMPLO B6 Preparación del compuesto 6: /V-(3-r(2R*.3R)-5-Amino-2-(difluorometil)-3-metil-3.6-dihidro-2ry-1.4-oxazin-3-in-4-fluorofenil)-5-cloropiridin-2-carboxamida Se disolvió el ácido 5-cloropiridin-2-carboxílico (63 mg, 0.4 mmol) en MeOH (7 mL) y se añadió DMTMM (129 mg, 0.44 mmol). Después de agitar la mezcla durante 5 minutos, se añadió una solución del intermedio 35 (100 mg, 0.366 mmol) en MeOH (8 mL) a 0 °C y la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó al vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice; eluyente: solución de amoníaco en metanol 7M/DCM de 0/100 a 5/95). Se recogieron las fracciones deseadas y se concentraron al vacío. El residuo se purificó suspendiéndolo en DIPE, se filtró y se secó a alto vacío para obtener el compuesto 6 (0.116 g, 74% de rendimiento) como un sólido blanco.

EJEMPLO B7 Preparación del compuesto 7: /V-(3-r(2R*.3R)-5-Amino-2- (difluorometilV3-metil-3.6-dihidro-2H-1.4-oxazin-3-in-4-fluorofenil 5-cianopiridin-2-carboxamida Se sintetizó el compuesto 7 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo B6. A partir del intermedio 35 (100 mg, 0.4 mmol) se obtuvo el compuesto 7 (110 mg, 75% de rendimiento).

Los compuestos de 1 a 7 de la tabla 1 enumeran los compuestos que se prepararon de acuerdo con alguno de los Ejemplos anteriores. "Ej. N°." se refiere al número del Ejemplo de acuerdo con el protocolo con el que se sintetizó el compuesto. 'Comp. N.0' se refiere al número del compuesto. C2(R*) se refiere a que la configuración absoluta en C2 es R o S pero aún desconocida.

TABLA 1 C. Parte analítica LCMS Para la caracterización por (LC)MS de los compuestos de la presente invención, se emplearon los siguientes métodos.

Método 1 La medición por LC se realizó utilizando un sistema Acquity UPLC (Waters) que comprendía una bomba binaria, un organizador de muestras, un calentador para la columna (fijado a 55 °C), un detector de haz de diodos (DAD) y una columna según se especifique más adelante en los métodos respectivos. El flujo procedente de la columna se desvió a un espectrómetro MS. El detector MS se configuró con una fuente de ionización por electronebulización. Los espectros de masas se adquirieron por barrido entre 100 y 1000 en 0.18 segundos con un tiempo de lectura de 0.02 segundos. El voltaje de la aguja capilar fue de 3.5 kV y la temperatura de la fuente se mantuvo a 140 °C. Se empleó nitrógeno como gas nebulizador. La adquisición de datos se realizó con un procesador de datos Micromass MassLynx-Openlynx de Waters.

La UPLC en fase inversa (cromatografía líquida de ultrarresolución) se llevó a cabo en una columna C18 híbrida con puente de etilsiloxano/sílice (BEH) (1.7 µ??, 2.1 x 50 mm; Waters Acquity) con una velocidad de flujo de 0.8 mL/min. Se utilizaron dos fases móviles (acetato de amonio 10 mM en hbO/acetonitrilo 95/5; fase móvil B: acetonitrilo) para aplicar unas condiciones de gradiente de un 95% de A y un 5% de B a un 5% de A y un 95% de B en 1.3 minutos, y se mantuvieron estas condiciones durante 0.7 minutos. Se empleó un volumen de inyección de 0.75 µ?_.

El voltaje del cono fue de 10 V para el modo de ionización positivo y de 20 V para el modo de ionización negativo.

Método 2 La medición por UPLC (cromatografía líquida de ultrarresolución) se llevó a cabo utilizando un sistema Acquity UPLC (Waters) que comprendía un organizador de muestras, una bomba binaria con un desgasificador, un horno de cuatro columnas, un detector de haz de diodos (DAD) y una columna según se especifica en los respectivos métodos. El detector MS estaba configurado con una fuente de ionización dual ESCI (electronebulización combinada con una ionización química a presión atmosférica). Se empleó nitrógeno como gas nebulizador. La temperatura de la fuente se mantuvo a 140 °C. La adquisición de datos se llevó a cabo con el software MassLynx-Openlynx.

La UPLC (cromatografía líquida de ultrarresolución) en fase inversa se llevó a cabo en una columna RRHD Eclipse Plus-C18 (1.8 µ?t?, 2.1 x 50 mm) de Agilent, con una tasa de flujo de 1.0 mLJmin, a 50 °C, sin desviación al detector MS. Las condiciones de gradiente empleadas son las siguientes: de un 95% de A (0.5 g/L de solución de acetato de amonio + 5% de acetonitrilo) y un 5% de B (acetonitrilo) a un 40% de A y un 60% de B en 3.8 minutos, a un 5% de A y un 95% de B en 4.6 minutos, se mantuvieron estas condiciones hasta pasados 5.0 minutos. Volumen de inyección = 2 µ?_. Los espectros de masas de baja resolución (detector SQD, cuadrupolo único) se adquirieron mediante un barrido de 100 a 1000 en 0.1 segundos con un tiempo mínimo de retraso entre canales de 0.08 segundos. El voltaje de la aguja capilar fue de 3 kV. El voltaje del cono fue de 25 V para el modo de ionización positivo y de 30 V para el modo de ionización negativo.

Método 3 La medición por LC se realizó utilizando un sistema Acquity UPLC (Waters) que comprendía una bomba binaria, un organizador de muestras, un calentador para la columna (fijado a 55 °C), un detector de haz de diodos (DAD) y una columna según se especifica más adelante en los métodos respectivos. El flujo procedente de la columna se desvió a un espectrómetro MS. El detector MS se configuró con una fuente de ionización por electronebulización. Los espectros de masas se adquirieron por barrido entre 100 y 1000 en 0.18 segundos con un tiempo de lectura de 0.02 segundos. El voltaje de la aguja capilar fue de 3.5 kV y la temperatura de la fuente se mantuvo a 140 CC. Se empleó nitrógeno como gas nebulizador. La adquisición de datos se realizó con un sistema procesador de datos Micromass MassLynx-Openlynx de Waters.

La UPLC (cromatografía líquida de ultrarresolución) en fase inversa se llevó a cabo en una columna C18 híbrida con puente de etilsiloxano/sílice (BEH) (1.7 µ??, 2.1 x 50 mm; Waters Acquity) con una velocidad de flujo de 0.8 mL/min. Se utilizaron dos fases móviles (acetato de amonio 10 mM en H20/acetonitrilo 95/5; fase móvil B: acetonitrilo) para aplicar unas condiciones de gradiente de un 95% de A y un 5% de B a un 5% de A y un 95% de B en 1.3 minutos, y se mantuvieron estas condiciones durante 0.3 minutos. Se empleó un volumen de inyección de 0.5 µ?_. El voltaje del cono fue de 10 V para el modo de ionización positivo y de 20 V para el modo de ionización negativo.

Puntos de fusión Los valores son valores máximos o rangos de fusión, y se obtienen con incertidumbres experimentales que están normalmente asociadas con este método analítico.

DSC823e (indicado por DSC en la Tabla 2) Para varios compuestos, los puntos de fusión se determinaron con un DSC823e (Mettler-Toledo). Los puntos de fusión se midieron con un gradiente de temperatura de 30 °C/minuto. La temperatura máxima fue de 400 °C.

TABLA 2 Datos analíticos - ÍR significa tiempo de retención (en min); [M+H]+ significa la masa protonada del compuesto; método se refiere al método empleado para (LC)MS. n.d. significa no determinado Rotaciones ópticas Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro 341 de Perkin-Elmer con una lámpara de sodio y se presentan como se indica a continuación: [a]^0 (c g/100 mi, disolvente).

TABLA 3 Datos analíticos - Valores de rotación óptica para los compuestos enantioméricamente puros RMN Para varios compuestos, los espectros de RMN de H se registraron en un espectrómetro Bruker DPX-360, en un Bruker DPX-400 o en un Bruker Avance 600 con secuencias de pulso estándar, que operaban a 360 MHz, 400 MHz y 600 MHz respectivamente, utilizando CLOROFORMO-d (cloroformo deuterado, CDC ) o DMSO-afe (DMSO deuterado, sulfóxido de dimetilo-de) como disolventes. Los desplazamientos químicos (d) se indican en partes por millón (ppm) respecto al tetrametilsilano (TMS), que se utilizó como patrón interno.

TABLA 4 D. Ejemplos farmacológicos Los compuestos que se proporcionan en la presente invención son inhibidores de la enzima 1 que escinde APP por el sitio beta (BACE1). Se cree que la inhibición de BACE1 , una proteasa aspártica, es relevante para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA). Se cree que la producción y la acumulación de péptidos beta-amiloides (Abeta) a partir de la proteína precursora de beta-amiloides (APP, por sus siglas en inglés) son un factor clave para la aparición y el avance de la EA. Se produce Abeta a partir de la proteína precursora de amiloide (APP) por la escisión secuencial en los extremos N- y C-terminal del dominio Abeta por la beta-secretasa y gamma-secretasa respectivamente.

Cabe esperar que los compuestos de fórmula (I) ejerzan su efecto sustancialmente sobre BACE1 en virtud de su capacidad para inhibir la actividad enzimática. En la Tabla 5 y en la Tabla 6 se muestra el comportamiento de este tipo de inhibidores evaluados en un ensayo bioquímico basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) y un ensayo aLisa celular en células SKNBE2, el cual se describe más adelante, y que son adecuados para identificar este tipo de compuestos y, más particularmente, los compuestos de acuerdo con la fórmula (I).

Ensayo bioquímico basado en FRET Este ensayo es un ensayo basado en el ensayo de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). El sustrato de este ensayo es un péptido de 13 aminoácidos derivado de la APP que contiene la mutación 'sueca' Lys-Met/Asn-Leu del sitio de escisión por acción de la beta-secretasa en la proteína precursora de amiloide (APP). Este sustrato también contiene dos fluoróforos: el ácido (7-metoxicoumarin-4-il)acético (Mea) es un donante fluorescente con longitud de onda de excitación a 320 nm y de emisión a 405 nm, y el 2,4-dinitrofenilo (Dnp) es un aceptor extintor de la fluorescencia patentado. La distancia entre estos dos grupos se ha seleccionado de modo que al someterlos a excitación con luz, la energía fluorescente del donante sea extinguida de forma significativa por el aceptor, mediante la transferencia de energía por resonancia. Tras la escisión por acción de BACE1 , el fluoróforo Mea se separa del grupo extintor de la fluorescencia Dnp, lo cual restaura la producción de fluorescencia total del donante. El incremento de la fluorescencia está relacionado de forma lineal con la tasa de proteolisis.

Resumiendo, en un formato de 384 pocilios, se incuba la proteína BACE1 recombinante en una concentración final de 1 pg/mL durante 120 minutos a temperatura ambiente con sustrato 10 µ?t? en tampón de incubación (tampón citrato 40 mM, pH 5.0, 0.04 % de PEG, 4 % de DMSO) en ausencia o presencia de compuesto. A continuación, la cantidad de proteolisis se mide directamente midiendo la fluorescencia a T=0 y T=120 (excitación a 320 nm y emisión a 405 nm). Los resultados se expresan en RFU (unidades de fluorescencia relativa), como diferencia entre T120 y T0.

Una curva de ajuste óptimo se ajusta mediante un método de mínimos cuadrados a la representación del % de controlmin respecto a la concentración de compuesto. A partir de esta, se puede obtener un valor de Cl50 (concentración inhibitoria que provoca un 50% de inhibición de la actividad).

LC = mediana de los valores de control bajos = control bajo: reacción sin enzima HC = mediana de los valores de control altos = control alto: reacción con enzima % de efecto = 100-[(muestra-LC) / (HC-LC) *100] % de control = (muestra /HC)*100 % de controlmin = (muestra-LC) / (HC-LC) *100 Los siguientes compuestos ilustrativos se evaluaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente y exhibieron la siguiente actividad: TABLA 5 Ensayo aLisa celular en células SKNBE2 En dos ensayos aLisa, se cuantifican los niveles de Abeta total y Abeta 1-42 producidos y secretados al medio de las células SKNBE2 de neuroblastoma humano. El ensayo se basó en las SKNBE2 de neuroblastoma humano que expresan la proteína precursora de amiloide natural (hAPP695). Los compuestos se diluyeron y añadieron a estas células, se incubaron durante 18 horas y a continuación se realizaron mediciones de Abeta 1-42 y Abeta total. Abeta total y Abeta 1-42 se miden mediante aLisa de tipo sándwich. aLisa es un ensayo de tipo sándwich que emplea un anticuerpo AbN/25 biotinilado adherido a microesferas recubiertas de estreptavidina y microesferas aceptaras conjugadas con el anticuerpo Ab4G8 o cAb42/26 para detectar Abeta total y Abeta 1-42 respectivamente. En presencia de Abeta total o Abeta 1-42, las microesferas llegan a estar muy próximas. La excitación de las microesferas donantes provoca la liberación de moléculas de oxígeno singlete que desencadenan una cascada de transferencia de energía en las microesferas aceptoras, lo que resulta en emisión de luz. La emisión de luz se mide después de incubar durante 1 hora (excitación a 650 nm y emisión a 615 nm).

Una curva de ajuste óptimo se ajusta mediante un método de mínimos cuadrados a la representación del % de controlmin respecto a la concentración de compuesto. A partir de esta, se puede obtener un valor de CI5o (concentración inhibitoria que provoca un 50 % de inhibición de la actividad).

LC = mediana de los valores de control bajos = control bajo: células preincubadas sin compuesto, sin Ab biotinilado en el aLisa HC = mediana de los valores de control altos = control alto: células preincubadas sin compuesto % de efecto = 100-[(muestra-LC) / (HC-LC) *100] % de control = (muestra /HC)*100 % de controlmin = (muestra-LC) / (HC-LC) * 00 Los siguientes compuestos ilustrativos se evaluaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente y exhibieron la siguiente actividad: TABLA 6 Demostración de la eficacia in vivo Se pueden utilizar los agentes que disminuyen los niveles de péptidos ?ß de la invención para tratar la EA en mamíferos, tales como seres humanos, o como alternativa, para demostrar la eficacia en modelos en animales tales como, sin carácter limitante, ratón, rata o cobaya. Puede tratarse de un mamífero al que no se le haya diagnosticado EA o puede que no tenga una predisposición genética a la EA, pero puede ser transgénico de modo que sobreproduzca y con el tiempo acumule ?ß de una forma similar a la observada en los seres humanos que padecen EA.

Los agentes que disminuyen los niveles de péptidos ?ß se pueden administrar de cualquier forma estándar mediante cualquier método estándar. Por ejemplo, pero sin carácter limitante, los agentes que disminuyen los niveles de péptidos ?ß pueden estar en forma de líquido, comprimidos o cápsulas que se administran por vía oral o por inyección. Los agentes que disminuyen los niveles de péptidos se pueden administrar en cualquier dosis que sea suficiente para reducir de forma significativa los niveles de péptidos ?ß en la sangre, el plasma sanguíneo, el suero, el líquido cefalorraquídeo (LCR) o el cerebro.

Para determinar si la administración en una única dosis de un agente que disminuye los niveles del péptido ?ß42 reduciría los niveles de péptidos ?ß in vivo, se utilizaron roedores no transgénicos, p. ej., ratones o ratas. Se examinaron animales tratados con el agente que disminuye los niveles de péptidos ?ß y se compararon con los no tratados o tratados con vehículo, y se cuantificaron los niveles cerebrales de ?ß42 soluble y ?ß total mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante ELISA. Los periodos de tratamiento variaron entre horas (h) y días, y se ajustaron en función de los resultados de la disminución de ?ß42 una vez se pudo establecer un periodo de inicio del efecto.

Se muestra un protocolo típico para medir la disminución de ?ß42 in vivo pero es solo una de muchas variaciones que podrían utilizarse para optimizar los niveles de ?ß detectable. Por ejemplo, los compuestos que disminuyen los niveles del péptido ?ß se formularon en hidroxipropil-ß-ciclodextrina al 20%. Los agentes que disminuyen los niveles de péptidos ?ß se administraron como una única dosis oral (p.o.) o como una única dosis subcutánea (s.c.) a animales sometidos a ayuno durante la noche. Después de un periodo determinado, normalmente 2 o 4 h (según se indique en la Tabla 7), los animales se sacrificaron y se analizaron los niveles de ?ß42.

Se recogieron muestras de sangre mediante decapitación y desangrado en tubos de extracción tratados con EDTA. La sangre se centrifugó a 900 g durante 10 minutos (min) a 4 °C, y el plasma se recogió y se liofilizó para su posterior análisis. Se extirpó el cerebro del cráneo y el rombencéfalo. Se extirpó el cerebelo, y se separaron el hemisferio izquierdo y derecho. El hemisferio izquierdo se almacenó a -18 °C para el análisis cuantitativo de los niveles de compuesto de ensayo. El hemisferio derecho se lavó con tampón salino tamponado con fosfato (PBS), se congeló inmediatamente en hielo seco y se almacenó a -80 °C hasta su homogenización para los análisis bioquímicos.

Los cerebros de ratón de los animales no transgénicos se resuspendieron en 8 volúmenes de DEA (dietilamina) al 0.4 %/NaCI 50 mM que contenían inhibidores de proteasas (Roche-11873580001 o 04693159001) por gramo de tejido, p. ej., para 0.158 g de cerebro, añadir 1.264 mL de DEA al 0.4%. Todas las muestras se homogenizaron en el sistema FastPrep-24 (MP Biomedicals) utilizando matriz de lisis D (MPBio #6913-100) a 6 m/s durante 20 segundos. Los homogeneizados se centrifugaron a 221.300 x g durante 50 min. Los sobrenadantes de alta velocidad resultantes se transfirieron posteriormente a tubos eppendorf nuevos. Se neutralizaron nueve partes de sobrenadante con 1 parte de Tris-HCI 0.5 M a pH 6.8, y se utilizaron para cuantificar el ?ß total y AR42.

Para cuantificar la cantidad de ?ß total y AB42 en la fracción soluble de los homogeneizados cerebrales, se utilizaron ensayos de inmunoadsorción enzimática. Resumiendo, los patrones (una dilución de ?ß1-40 y ?ß1-42 sintéticos, Bachem) se prepararon en tubos Eppendorf de 1.5 mL en Ultraculture, con concentraciones finales comprendidas en el intervalo de 10 000 a 0.3 pg/mL. Las muestras y patrones se incubaron conjuntamente con el anticuerpo N-terminal marcado con HRPO para la detección de AU42 y con el anticuerpo de dominio medio biotinilado 4G8 para la detección de ?ß total. A continuación, se añadieron 50 pL de conjugado/muestra o mezclas de conjugado/patrones a la placa recubierta con anticuerpo (los anticuerpos de captura reconocen selectivamente el extremo C-terminal de AB42, anticuerpo JRF/cAIW2/26, para la detección de AB42 y el extremo N-terminal de AIJ, anticuerpo JRF/rAB/2, para la detección de ABtotal). La placa se dejó incubar durante la noche a 4 °C para permitir la formación del complejo de anticuerpo-amiloide. Después de esta incubación y los pasos de lavado subsecuentes, la ELISA para cuantificar ?ß42 finalizó mediante la adición del sustrato de peroxidasa fluorogénico Quanta Blu de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce Corp., Rockford, II). Se realizó una lectura después de 10 a 15 min (excitación a 320 nm /emisión a 420 nm).

Para la detección de ?ß total, se añadió conjugado de estreptavidina-peroxidasa, y 60 min después se realizó un paso de lavado adicional y se añadió sustrato de peroxidasa fluorogénico Quanta Blu de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce Corp., Rockford, II). Se realizó una lectura después de 10 a 15 min (excitación a 320 nm /emisión a 420 nm).

En este modelo, una inhibición de al menos un 20% de AB42 en comparación con los animales no tratados sería conveniente.

Los siguientes compuestos ilustrativos se evaluaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente y exhibieron la siguiente actividad: TABLA 7 n.t. significa no evaluado; s.c. significa subcutáneo; p.o. significa por vía oral.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (I) o un tautómero o forma estereoisomérica de este, donde R es alquilo C-i-3; R2 es hidrógeno o fluoro; L es un enlace o -NHCO-; Ar se selecciona a partir del grupo constituido por piridinilo, pirimidinilo y pirazinilo, cada uno opcionalmente sustituido con halo o alcoxi Ci-3; o una sal de adición farmacéuticamente aceptable de este.

2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R1 es metilo o etilo.

3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque Ar se selecciona entre 5-metoxipiridinil, 5-pirimidinilo y 5-fluoropirazinilo.

4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R2 es hidrógeno o fluoro.

5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el átomo de carbono cuaternario sustituido con R1 tiene la configuración R.

6. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Un proceso para preparar una composición farmacéutica como la que se define en la reivindicación 6, caracterizado porque se crea una mezcla íntima entre un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usarse en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, angiopatía amiloide cerebral, demencia multiinfarto, síndrome de Down, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson o demencia asociada con beta-amiloides.

9. El uso de un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición farmacéutica como la que se define en la reivindicación 6, para preparar un medicamento para tratar un trastorno seleccionado a partir del grupo constituido por la enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, senilidad, demencia, demencia con cuerpos de Lewy, angiopatía amiloide cerebral, demencia multiinfarto, síndrome de Down, demencia asociada con el accidente cerebrovascular, demencia asociada con la enfermedad de Parkinson y demencia asociada con beta-amiloides, en un sujeto.