MX2014004875A

MX2014004875A - Peptidos topk y vacunas que incluyen los mismos.

Info

Publication number: MX2014004875A
Application number: MX2014004875A
Authority: MX
Inventors: Takuya Tsunoda; Ryuji Ohsawa; Sachiko Yoshimura; Tomohisa Watanabe; Gaku Nakayama; Yusuke Nakamura
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-09-22
Also published as: JP6349560B2; IL245924B; AU2012329502B2; TWI681973B; CN104066746B; TW201716429A; TW201333044A; CN107759661A; JP6124149B2; BR112014009176A2; EP2771350B1; CN104066746A; HK1251236A1; CA2852633A1; BR112014009176B1; SG10201608552WA; EP2771350A1; AU2017200530A1; UA114298C2; JP2017093442A

Abstract

Como se discute a mayor detalle en la presente, los péptidos de epítopo aislado derivados de TOPK y fragmentos inmunogénicos del mismo tiene una habilidad para inducir linfocitos T citotóxicos (CTLs) y de esta manera son idóneos para su uso en inmunoterapia de cáncer, más particularmente como vacunas de cáncer. Los péptidos de la presente invención abarcan tanto péptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos derivada de TOPK como versiones modificadas de la misma, en las que uno, dos, o muchos aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan y/o agregan, siempre y cuando tales versiones tengan inducción CTL. Además se proporciona los polinucleótidos que codifican cualquiera de los péptidos antes mencionados así como también composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de los péptidos o polinucleótidos antes mencionados. Los péptidos, polinucleótidos, y composiciones farmacéuticas de esta invención encuentran particular utilidad en cualquiera o ambos del tratamiento y prevención de cánceres y tumores, incluyendo, por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico tipo difuso, cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC), linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, cáncer de pulmonar microcítico (SCLC) y tumor de tejido suave.

Description

PÉPTIDOS TOPK Y VACXJNÁS QUE INCLUYEN LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de ciencia biológica, más específicamente al campo de terapia de cáncer. En particular, la presente invención se refiere a péptidos novedosos que son efectivos como vacunas de cáncer, y fármacos para cualquiera o ambos de tratar y prevenir tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los linfocitos T citotóxicos positivos de CD8 (CTLs) han mostrado que reconocen péptidos de epítopo derivados de los antígenos asociados con tumor (TAAs, por sus siglas en inglés) encontrados en la molécula de clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC, por sus siglas en inglés), y entonces eliminan las células de tumor. Desde el descubrimiento de la familia del antígeno de melanoma (MAGE, por sus siglas en inglés) como el primer ejemplo de TAAS, muchos otros TAAs se han descubierto, principalmente a través de enfoques inmunológicos (NPL 1, 2), y algunos de estos TAAs están ahora en proceso de desarrollo clínico como objetivos inmunoterapéuticos .

Son indispensables los TAAs favorables para la proliferación y supervivencia de las células de cáncer. El uso de tales TAAs como objetivos para inmunoterapia puede minimizar el riesgo bien descrito de escape inmunitario de células de cáncer que se atribuye a la eliminación, mutación, y/o sub-regulación de TAAs como una consecuencia de selección inmunitaria conducida terapéuticamente. En consecuencia, la identificación de TAAs nuevos capaces de inducir respuestas inmunitarias anti-tumor especificas y potentes garantiza el desarrollo adicional. De esta manera, la aplicación clínica de estrategias de vacunación con péptido en varios tipos de cáncer está en marcha (NPL 3-10). A la fecha ha habido varios reportes de ensayos clínicos usando estos péptidos derivados de TAAs. Desafortunadamente,' hasta ahora, estos ensayos de vacuna de cáncer sólo han proporcionado una relación de respuesta objetiva (NPL11-13) . En consecuencia, permanece una necesidad en el campo para nuevos TAAs apropiados para usar como objetivos inmunoterapéuticos .

TOPK (proteína cinasa que se origina en la célula T-LAK) es una serina/treónina cinasa que es miembro de la familia MAPKK relacionada con la cinasa MAPK 3/6 (MAPKK) . Esta cinasa fosforila p38 MAPKK y participa en la regulación del punto de revisión del ciclo celular (NPL 14, 15). El análisis de expresión de genes de TOPK usando muestras clínicas indica que TOPK se sobreexpresa en algunos cánceres malignos, tal como cáncer de mama, ¦ colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, leucemia, cáncer colorrectal y melanoma (NPL 16-19). Estudios recientes indican que la actividad de cinasa juega un papel importante en carciogénesis de mama, renovando un interés en la investigación en cinasas ligadas al cáncer tal como TOPK. Para este fin, el análisis Northern blot ha revelado que el transcrito TOPK se expresa .altamente en células de cáncer de. mama pero es apenas detectable en tejidos humanos normales excepto testículos. Además, el silenciamiento génico de la expresión TOPK endógena por siARN en lineas de célula de cáncer de mama se ha mostrado que atenúa la citoquinesis y . lleva a la aopotosis de las células de cáncer (NPL20) .

Lista de Citas Literatura No de Patente [NPL 1] Boon T, Int J 8 mayo 1993, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp ed 1 marzo 1996, 183 (3) : 725-9 [NPL 3] Harris CC, J Nati Cáncer Inst 16 octubre 1996, 88 (20) : 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al., Cáncer Res 1 julio 1999, 59 (13) : 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cáncer Res 1 noviembre 1999, (21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1 mayo 1996, 6(9) : 3308-14 [NPL 7] Tanaka F et al., Cáncer Res 15 octubre 1997, (20) : 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al., Int J Cáncer 18 enero 1999, (2) : 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cáncer 5 mayo 1999, (3) : 459-66 [NPL 10] Oiso M et al. , Int J Cáncer 5 mayo 1999, 81 (3) : 7-94 [NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 15 octubre 2002, (20) : 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev octubre 2002, 8: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med [NPL 14] Abe Y et.al., J Bio Chem. 14 julio 2000 :21525-21531 [NPL 15] Ayllon V and O'connor R. , Oncogen, 24. mayo 7; 26 (24) : 3451-61 [NPL 15] He F et al., Hum Pathol. Marzo 2010; 41(3) :415- [NPL 17] Li G et al., Ann Hematol, septiembre 2006; (9) :583-90 [NPL 18] Minoo P et al . , Int J Oncol . Septiembre .2010 ; 37 (3) :707-18 [NPL 19] Zykova TA et.al., Clin Cáncer Res. 1 diciembre 2006; 12 (23) : 6884-93 [NPL 20] Park.JH et.al., Cáncer Res. 15 septiembre 2006; 66 (18) : 9186-95 : ' ' SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de péptidos novedosos que pueden servir como objetivos adecuados de inmunoterapia . Debido a que los TAAs se perciben generalmente por el sistema inmunitario como "propios" y por lo tanto a menudo no tienen inmunogenicidad . innata, el descubrimiento de objetivos apropiados es de extrema importancia. A través de la presente invención, TOPK (SEQ ID NO: 86) , codificada por el gen del No. de Acceso al GenBank NM_018492 (SEQ ID NO: 85)) se demuestra que se sobre-expresa específicamente en células de cáncer, en particular leucemia mieloide aguda (AML) , cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular , cáncer colorrectal, cáncer gástrico tipo difuso, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) , linfoma, osteosarcoma , cáncer de próstata, carcinoma renal, cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC), y tumor de tejido suave, pero no limitado a estos. De esta manera, la presente invención se enfoca en TOPK como un objetivo candidato de inmunoterapia de cáncer/tumo .

Para este fin, la presente invención se dirige, al menos en parte, a la identificación de péptidos de epítopo específicos entre los productos del gen de TOPK que poseen la capacidad de inducir linfocitos T citotóxícos (CTLs) específicos para TOPK. Como se discute en mayor detalle a continuación, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un donador saludable se estimularon usando péptidos candidato enlazados a HLA(antígeno de leucocito humano) -A*2402 o HLA-A*0201 derivados de TOPK. Las líneas CTL luego se establecieron con citotoxicidad específica contra las células objetivo positivas HLA-A24 o HLA-A2 pulsadas con cada uno de los péptidos candidatos. Los resultados en la presente demuestran que estos péptidos son péptidos de epítopo restringidos HLA-A24 o HLA-A2 que pueden inducir respuestas inmunitarias específicas y potentes contra células que expresan TOPK. Estos resultados indican además que TOPK es fuertemente inmunogénico y que los epítopos del mismo son objetivos efectivos para inmunoterapia de tumor.

En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proporcionar péptidos aislados que tienen la capacidad de enlazar un antígeno HLA, e incluye la secuencia de TOPK (SEQ ID NO: 86) o un fragmento inmunogénicamente activo del mismo. Estos péptidos se esperan que tengan capacidad de inducción CTL y, de esta manera, puedan usarse para inducir un CTL in vitro, ex vivo o in vivo, o para administrarse directamente a un sujeto de manera que se induzcan respuestas inmunitarias in vivo contra cánceres, los ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave.

Los péptidos preferidos son nonapéptidos y decapéptidos, y más preferiblemente nonapéptidos y decapéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2 hasta 40 y 42 hasta 84. De estos, los péptidos que tienen una secuencia amino seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 son más preferidos.

La presente invención también contempla péptidos modificados que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2 hasta 40 y 42 hasta 84 en la cual uno, dos. o más aminoácidos están sustituidos eliminados, insertados y/o agregados, proporcionando los péptidos modificados resultantes que mantienen la capacidad de inducción CTL requerida del péptido no modificado original.

La presente invención abarca además polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los péptidos de la presente invención. Estos polinucleótidos pueden usarse para inducir o preparar células que presentan antigenos (APCs) que tienen capacidad de inducción CTL. Igual que los péptidos descritos arriba de la presente invención, tales APCs pueden administrarse a un sujeto para inducir respuestas inmunitarias contra cánceres.

Cuando se administran a un sujeto, los péptidos de la presente invención se presentan preferiblemente en la superficie de APCs de manera que inducen a los CTLs dirigidos a los péptidos respectivos. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar agentes o composiciones para inducir un CTL, tales composiciones o agentes incluyen uno o más péptidos de la presente invención, o uno o más polinucleótidos que codifican tales péptidos. Tales agentes, o composiciones pueden usarse para el tratamiento y/o profilaxis de un cáncer primario, una metástasis o recurrencia postoperativa del mismo. Los ejemplos de cánceres dirigidos contemplados por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cérvico, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave.

La presente invención contempla además composiciones o agentes farmacéuticos que incluyen uno o más de los péptidos o uno o más polinucleótidos de la presente invención formulados para el tratamiento y/o profilaxis de un cáncer primario, metástasis o recurrencia de cáncer, postoperativa como se nota anteriormente. En lugar de o además de los péptidos o polinucleótidos actuales, los agentes farmacéuticos actuales o composiciones pueden incluir como ingredientes activos APCs y/o exosomas que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención.

Los péptidos o polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para inducir APCs que presentan en la superficie un complejo de un antigeno HLA y un péptido de la presente invención, por ejemplo, al poner en contacto APCs derivados de un sujeto con el péptido de la presente invención o al introducir- un polinucleótido que codifica el péptido de la presente' invención en APCs. Tales APCs tienen alta capacidad de inducción CTL contra péptidos objetivo y son útiles para inmunoterapia de cáncer. En consecuencia, la presente invención abarca los métodos para inducir APCs con capacidad de inducción CTL asi como los APCs obtenidos por los métodos.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar métodos para inducir CTLs, tales métodos incluyen la etapa de co-cultivar células T positivas CD8 con APCs que presentan e-n su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la presente invención, la etapa de co-cultivar células T positivas CD8 con exosomas que presentan en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la presente invención, o la etapa de introducir un polinucleótido/polinucleótidos que codifican polipéptidos de la subunidad del receptor de célula T (TCR) en donde el TCR formado por los polipéptido de subunidad pueden unirse a un péptido de la presente invención. Los CTLs obtenidos por tales métodos encuentran uso en el tratamiento y/o prevención de cánceres, más particularmente AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cérvico, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave. En consecuencia, la presente invención abarca los métodos para inducir CTLs asi como los CTLs obtenidos por los métodos. Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar APCs aislados que presentan en la superficie un complejo de un antigeno HLA y un péptido de la presente invención.. La presente invención proporciona además CTLs aislados que dirigen péptidos de la presente invención. Estos APCs y CTLs pueden usarse para inmunoterapia de cáncer.

Aún es otro objetivo de la invención actual proporcionar métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer en un sujeto que necesita del mismo, tales métodos incluyen la etapa de administrar al sujeto una composición que incluye al menos un componente seleccionado de entre un péptido de la presente invención, un polinucleótido que codifica tal péptido, exosomas o APCs que presentan tales péptidos, y CTLs que pueden reconocer células que presentan tales péptidos en su superficie.

La capacidad de aplicación de la presente invención se extiende a cualquiera de un número de enfermedades relacionadas con o que resultan de la sobre-expresión de TOPK, tal como cánceres que expresan TOPK, ejemplos de las cuales incluyen, pero no se limitan a, A L, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cérvico, carcinoma colangiocelular , cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave. Objetivos y características de la invención serán más completamente aparentes cuando se lee la siguiente descripción detallada en conjunto con las figuras y ejemplos acompañantes. Se entiende que tanto el precedente sumario de la presente invención como la siguiente descripción detallada son de modalidades ejemplificadas, y no restrictivas de la invención o modalidades alternas de la presente invención.

En particular, aunque la invención se describe en la presente con referencia a un número de modalidades especificas, se apreciará que la descripción es ilustrativa de la invención y no se construye como limitante de la invención. Pueden presentarse varias modificaciones y aplicaciones para aquellos quienes son expertos en la técnica, sin salirse del. espíritu y alcance de la invención, como se describe por las reivindicaciones adjuntas. Similarmente, serán aparentes otros objetivos, características, beneficios y ventajas de la presente invención a partir de este, resumen y ciertas modalidades descritas enseguida, y serán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la técnica. Tales objetivos, características, beneficios y ventajas serán aparentes a partir de lo anterior en conjunto con los ejemplos, datos, figuras acompañantes y todas las deducciones razonables a resultar de los mismos, solo o con consideración de las referencias incorporadas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Varios aspectos y aplicaciones de la presente invención se volverán aparentes para el técnico experimentado en consideración de la breve descripción de las figuras y la descripción detallada' de la presente invención y sus modalidades preferidas que sigue.

Las Figuras 1(a) -1(f) están compuestas de una serie de fotografías, que describen los resultados del ensayo de inmunotinción ligado a la enzima del interferón gamma (IFN) (ELISPOT) en CTLs que se indujeron con péptidos derivados de TOPK. Los CTLs en el pozo número #8 inducidos con TOPK-A24-9-230 (SEQ ID NO: 2) Fig. 1(a), en #3 inducidos con TOPK-A24-9-232 (SEQ ID NO: 6) Fig. 1(c), en #2 inducidos con TOPK-A24-10-288. (SEQ ID NO: 27) Fig. 1(d) y en #4 inducidos con TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO:' 28) Fig. 1(e) mostró producción IFN-gamma potente como se compara con el control respectivamente. El cuadro en el pozo de estas fotografías indica que las células del pozo correspondiente se expandieron para establecer líneas CTL. En contraste, como es típico de los datos negativos, no se observó producción IFN-gamma específica del CTL estimulado con TOPK-A24-9-289 (SEQ ID NO: 1) Fig. 1(f). El cuadro en el pozo de estas fotos indica que las células del pozo correspondiente se expandieron para establecer líneas CTL. . En las Figuras, indica la producción IFN-gamma contra células objetivo pulsadas con el péptido apropiado, y "-" indica la producción IFN-gamma contra células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos.

Las Figuras 2 (a) -2 (o) están compuestas de una serie de fotografías, que describen los resultados del ensayo ELISPOT de inmunotinción ligado a enzima IFN-gamma en CTLs que se indujeron con péptidos derivados de TOPK. Los CTLs en el pozo número #7 inducidos con TOPK-A02-9240 (SEQ ID NO: 2) Fig. 2(a) y en #4 inducidos con TOPK-A02-919 (SEQ ID NO: 45) Fig. 2(b), en #2 inducidos con TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO: 47) Fig. 2(c), en #8 inducidos con TOPK-A-02-235 (SEQ ID NO: 50) Fig. 2(d), en #4 inducidos con TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51) Fig. 2(e), en #3 inducidos con TOPK-A02-9-285 (SEQ NO: 53) Fig. 2(f), en #3 inducidos con TOPK A02-9-47 (SEQ ID NO:54) Fig. 2(g), en #5 inducidos con TOPK-A-02-102-36 (SEQ ID NO: 62) Fig. 2(h), en #3 inducidos con TOPK-A-02-102-31 (SEQ ID NO: 63) Fig. 2 (i), en #8 inducidos con TOPK-A-02-10-47 (SEQ ID NO: 64) Fig. 2(j), en #1 inducidos con TOPK-A-02-10-239 (SEQ ID NO: 66) Fig. 2(k), y en #1 inducidos con TOPK-A-02-10-272 (SEQ ID NO: 70) Fig. 2(1) mostró producción IFN-gamma como se compara con el control, respectivamente. El cuadrado en el pozo de estas imágenes indica qüe las células del pozo correspondiente se expandieron para establecer las líneas CTL. En contraste, como es el caso típico con . datos negativos, no se observó producción IFN-gamma específica del CTL estimulado con TOPK-A02-9-55 (SEQ ID N0:41) Fig. 2 (o) . En las Figuras, "+" indica la producción IFN-gamma contra células objetivo pulsadas con el péptido apropiado, y indica la producción IFN-gamma contra células objetivo no pulsadas con ninguno de- los péptidos. Continuando con la figura se representan los resultados del ensayo ELISPOT inmunotinción ligado a enzima IFN-gamma en CTLs que son inducidos con TOPK-A02-3-10-88 (SEQ ID NO: 72) Fig. 2 (m) y en #4 inducidos con TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) Fig. 2 (n) mostró producción gamma IFN potente como se compara con el control, respectivamente. El cuadro en el pozo de estas fotos indica que las células del pozo correspondiente se expandieron para establecer líneas CTL. En contraste, como es típico de los datos negativos, no se observó producción específica de IFN-gamma del CTL estimulado con TOPK-A02-9-55 (SEQ ID NO: 41) Fig.'; 2 (o). En las figuras, "+" indica que la producción IFN-gamma contra las células objetivo pulsadas con el péptido apropiado, y "-" indica la producción IFN-gamma contra las células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos.

Las Fig.3 (a) - Fig.3(e) están compuestas de una serie de gráficas en línea, que describen la producción de las líneas CTL IFN-gamma estimuladas con TOPK-A24-9-230 (SEQ ID NO:2) Fig. 3(a), TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3) Fig. 3(b), TOPK-A24-9-232 (SEQ ID NO:6) Fig. 3(c), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO:27) Fig. 3(d) y TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) Fig. 3(e). La cantidad de IFN-gamma que los CTLs produjeron se midió por ensayo inmunoabsorbente ligado de enzima IFN-gamma (ELISA) . Los resultados demuestran que los clones CTL establecidos por estimulación con cada péptido muestran producción IFN-gamma potente en comparación con el control. En las figuras, indica la producción IFN-gamma contra, células objetivo pulsadas con el péptido apropiado y "-" indica la producción IFN-gamma contra células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos. La relación R/S indica la relación del número de células respondedoras (linea CTL) y células estimuladoras.

Las Figuras 4 (a) - 4 (c) están compuestas de una serie de gráficas en linea, representando la producción IFN-gamma de los colones CTL establecidos limitando la dilución de las lineas CTL estimuladas con TOP-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3) Fig. 4(a)., TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO:27) Fig. 4(b) y TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) Fig. 4(c). Los resultados demuestran que los clones CTL establecidos por estimulación con cada péptido muestran producción IFN-gamma potente como se compara con el control. En la figura, indica la producción IFN-gamma contra las células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos, la relación R/S indica la relación del número de células respondedoras (clon CTL) y células estimuladoras.

Las Figuras 5(a) -¦ 5(k) están compuestas de una serie de gráficas en línea, que representa la producción de IFN-gamma de las líneas CTL estimuladas con TOP -A02-9-240 (SEQ ID NO:42) Fig. 5(a), TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO:45) Fig. 5(b), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50) Fig. 5(c), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: .51) Fig. 5(d), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO:53) Fig. 5(e), y TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO:54) Fig. 5(f). La cantidad de IFN-gamma que ACTL produjo se midió por ensayo inmunoabsorbente ligado de enzima gamma IFN (ELISA) . Los resultados demuestran que las líneas CTL establecidas por estimulación con cada 'péptido muestran producción IFN-gamma potente como se compara con el control. En las. figuras, "+" indica la producción IFN-gamma contra las células objetivo pulsadas con el péptido apropiado, y "-" indica la producción gamma IFN contra las células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos, la relación R/S indica la relación del número de las células respondedoras, (línea CTL) y las células estimuladoras. Continuando con la figura, se representa la producción IFN-gamma de las líneas CTL estimuladas con TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62) Fig. 5(g), TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63) Fig. 5(h), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64) Fig. 5 (i), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66) Fig. 5(j) y TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) Fig. 5(k)'. La cantidad de IFN-gamma que CTL produjo se midió por ensayo inmunoabsorbente ligado de enzima gamma IFN (ELISA) . Los resultados demuestran que las lineas CTL establecidas por estimulación con cada péptido muestran la producción IFN-gamma potente como se compara con el control. En las Figuras, indica la producción IFN-gamma contra células objetivo pulsadas con el péptido apropiado, y "-" indica la producción IFN-gamma contra células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos. La relación R/S indica la relación del número de las células respondedoras (linea CTL) y las células estimuladoras.

Las Figuras 6(a) y 6(b) están compuestas de un par de gráficas en linea, que describen la producción IFN-gamma de los clones CTL establecidos limitando la dilución de las lineas CTL estimuladas -con TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO:42) Fig. 6(a) y TOPK-A02-285 (SEQ ID NO:53) Fig. 6(b). Los resultados demuestran que los clones de las lineas CTL establecidas por estimulación con cada péptido muestran producción IFN-gamma potente en comparación con el control. En la Figura, "+" indica la producción IFN-gamma contra células objetivo pulsadas con el péptido apropiado, y indica la producción IFN-gamma contra células objetivo no pulsadas con ninguno de los péptidos. La relación R/S indica la relación del número de las células respondedoras (linea CTL) y las células estimuladoras.

La Figura 7 está compuesta de una gráfica de linea, representando la actividad especifica CTL de los clones CTL contra las células objetivo que expresa TOPK y HLA-A*2402. Las células C0S7 transíectadas con HLA-A*2402 o el gen TOPK de longitud completa se prepararon como los controles. El clon CTL establecido con TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO:28) . Mostró la actividad CTL especifica contra las células C0S7 transfectadas tanto con TOPK como con HLA-A*2402 (pastilla)-. Por otro lado, no se detectó actividad CTL especifica contra las células objetivo expresando ya sea HLA-A*2402 (triángulo) o TOPK (circulo) .

La Figura 8 es una gráfica de linea representando la actividad CTL especifica de las lineas CTL contra las células objetivo que expresan TOPK y HLA-A*0201. Las células C0S7 transfectadas con HLA-A*0201 o el gen TOPK de longitud completa se prepararon, como los controles. La linea de CTL establecida con TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) mostró actividad CTL especifica contra las células C0S7 transfectadas con tanto TOPK como HLA-A*0201 (pastilla) . Por otro lado, no se detectó actividad CTL especifica importante contra células objetivo que expresan ya sea HLA-A*0201 (triángulo) o TOPK (circulo) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Además del sumarlo anterior, es un objetivo de la presente invención proporcionar: [1] Un péptido aislado que tiene capacidad de inducción CTL, en donde el péptido consiste de la secuencia de aminoácidos de TOPK o un fragmento inmünológicamente activo de la misma . [2] El péptido aislado de [L], en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos se l cc Lona.ia del giupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76. [3] Un péptido aislado seleccionado del grupo que consiste de (i) y (ii) a continuación: (i) un péptido aislado de (a) o (b) a continuación: (a) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: (b) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28, en la que 1, 2, o muchos aminoácidos se sustituyen, insertan, eliminan y/o agregan, en donde el péptido tiene la inducción CTL, (ii) un péptido aislado de (c) o (d) a continuación: (c) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72, y 76 (d) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 en las que 1, 2 o muchos aminoácidos se sustituyen, insertan, eliminan y/o agregan, en donde el polipéptido tiene inducción CTL, [4] El péptido aislado de [3], en donde el péptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal N de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27 y 28 se sustituye para ser un aminoácido seleccionado ' del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, metionina, o triptofano, y (b) el aminoácido de terminal C de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27 y 28 se sustituye para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, leucina, isoleucina, t rip ofano, y meticnina. [5] El péptido aislado de [3], en donde el péptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal N de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 45, 47, 50, 51, 5>, 54, 61, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 se sustituye para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de leucina y metionina; y (b) el aminoácido de terminal C de la secuencia de aminoácidos seleccionada .del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 se sustituye para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de valina y leucina. [6] El péptido aislado de cualquiera de [1] hasta [5], en donde dicho péptido tiene la habilidad de enlazar a un antigeno HLA. [7] El péptido aislado de [6], en donde dicho antigeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2. [8] El péptido aislado de cualquiera de [1] a [7], en donde el péptido es un nonapéptido o un decapéptido. [9] Un polinucleótido aislado que codifica el péptido aislado de cualquiera de [1] hasta [8] . [10] Una composición para inducir CTL, en donde la composición comprende uno o más de los péptidos de cualquiera de [1] hasta [8], o uno o más de los polinucleótidos de [9] . [11] Una composición farmacéutica que conpie: de: (a) uno o más péptido (s) de cualquiera de [1] a [8] (b) uno o más polinucleótido ( s ) de [9] (c) uno o más APC(s) que presentan un complejo del péptido de cualquiera de [1] a [8] y un antigeno HLA en su superficie; (d) uno o más exosomas que presentan un' complejo del péptido de cualquiera de [1] a [8] y antigeno HLA <;n su superficie; (e) uno o más CTLs que reconozcan que una célula presenta un complejo del péptido. de cualquiera de [1] a [8] y un antigeno HLA en su superficie, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica se formula para el tratamiento y/profilaxis de cáncer, y/o la inducción de una respuesta inmunitaria contra el cáncer. [12] La composición farmacéutica de [11], en donde la composición farmacéutica se formula paca la administración a un sujeto cuyo antigeno HLA es HLA-A24 o Ai'. [13] Un método para inducir una célula que presenta el antigeno (APC) con capacidad de inducción CTL, dicho método comprende la etapa de seleccionar del grupo que consiste de: (a) poner en contacto un APC con un péptido de cualquiera de [1] hasta [8] in vitro, ex vivo o in vivo, y (b) introducir un polinucleótido que codifica el péptido de cualquiera de [i] hasta [8] en un APC . [14] Un método para inducir CTL, dicho método comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste de: (a) co-cultivar una célula T positiva CD3 con un AFC que presenta en la superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de cualquiera de [1] hasta [8], (b) co-cultivar una célula T positiva CD8 con un exosoma que presenta en la superficie un complejo de un antiqeno HLA y el péptido de cualquiera de [1] hasta [ ?i , y (c) introducir dentro de una célula T positiva CD8, un polinucleótido/polinucleótidos que codifican polipéptidos de subunidad receptor de célula T (TCR), en donde el TCR formado por dichos polipépetidos de subunidad TCR es capaz de enlazar a un complejo de un antigeno HLA y el péptido de cualquiera de [1] hasta [8] en una superficie celular. [15] Un APC aislado que presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de cualquiera de [1] hasta [8] . [16] El APC de [15], que se induce por e¡ método de [13]. [17] Un CTL aislado que dirige el péptido de cualquiera de [1] hasta [8] . ... [18] El CTL de [17] que es inducido por el método de [14] . [19] Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra cáncer en un sujeto que necesita del mismo, el método comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que comprende el péptido de cualquiera de [1] hasta [8], un fragmento inmunológicamente activo del mismo, o un polinucleótido que codifica el péptido o el fragmento. [20] Un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo contra el péptido de cualquiera de [1] hasta [8]. [21] Un vector que comprende la secuencia de nucleótido que codifica el péptido de cualquiera oe [I] ha?.t¿> [8]. [22] Una célula hospedera transíormada o transfectada con el vector de [21]. [23] Un kit de diagnóstico que comprende un . péptido de cualquiera de [1] hasta [8], el polinucleótido de [9] o el anticuerpo de [20] . [24] Un método de selección de un péptido que tiene la habilidad para inducir un CTL que tiene actividad citotóxica especifica contra una célula que presenta un fragmento derivado de TOPK, en donde el método comprende las etapas de: (i) proporcionar una secuencia candidato que consiste de secuencia de aminoácido modificada por sustitución, eliminación, inserción y/o adición de uno, dos o muchos residuos de aminoácidos a una secuencia de aminoácido original, en donde la secuencia de aminoácido original se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76; (ii) seleccionar una secuencia candidato que no tenga homología importante sustancial con los péptidos derivados de cualquiera de los productos de gen humano conocidos que no son TOPK; (iii) contactar un péptido que consiste de la secuencia candidato seleccionada en la etapa (ii) con una célula presentando antigeno; iv) contactar la célula presentando antigeno seleccionada en la etapa (ii) con una célula presentando antigeno; (iv) contactar la célula presentando antigeno de la etapa © con una célula T CD8-positiva; y (v) identificar el péptido del cual la inducción CTL es la misma o más alta . que un péptido que consiste de la secuencia de aminoácido original.

Aunque pueden usarse cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente en la práctica o prueba de las modalidades de la presente invención, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Sin embargo, antes de que se describan los materiales y métodos actuales, debe entenderse que estas descripciones son meramente ilustrativas y no se pretenden que sean limitantes. También debe entenderse que la presente invención no se limita a tamaños, formas, dimensiones, materiales, metodologías, protocolos, etc., particulares descritos en la presente, ya que estos pueden variar de acuerdo ' con la experimentación y optimización de rutina. Adícionalmente, la terminología usada en la' descripción es sólo para el propósito de describir las versiones o modalidades particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que sólo se limitará por las reivindicaciones adjuntas.

La descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente mencionada en osta especificación se incorpora específicamente para referencia en la presente en su totalidad. Sin embargo, nada en la presente se construye como una admisión de que la invención no tiene derecho a prefechar tal descripción en virtud de la invención previa.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece la presente invención. En el caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

I. Definiciones Las palabras "un", "una", y "el" como se usan en la presente significan "al menos uno" a menos que se indique específicamente de otra manera.

Los términos "aislado" y "purificado" usados en relación con una sustancia (por ejemplo, péptido, anticuerpo, polinucleótido, etc.) indica que la sustancia está sustancialmente libre de al menos una sustancia que también puede incluirse en la fuente natural. De esta manera, un péptido aislado o purificado se refiere al péptido que está sustancialmente libre de material celular tal como carbohidrato, lipido, u otras proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido de la cual se deriva e.i péptido, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente.

El término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un péptido en el cual el péptido se separa de los componentes celulares de las células de las cuales se aisla o produce recombinantemente . De esta manera, el péptido que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones ' de polipéptido que tiene menos de alrededor de 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también referida en la presente como una "proteína contaminante"). Cuando el péptido se produce recombinantemente, también está preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, que incluye preparaciones de péptido con medio de cultivo de menos de alrededor de 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparación de péptido. Cuando se produce el péptido por síntesis química, está preferiblemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, que incluye preparaciones de péptido con precursores químicos u otros químicos involucrados en la síntesis del péptido de menos de alrededor de 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) del volumen de la preparación de péptido. Tal preparación ; de péptido particular que contiene un péptido aislado o purificado puede mostrar, por ejemplo, por la aparición de una banda sencilla seguida por electroforesis en gel de poliacr i lamida-dodecil sulfato de sodio (SDS) de la preparación de proteína y tinción con azul brillante Coomassie o similares del gel. En una modalidad preferida, los péptidos y polinucleótidos de la presente invención se aislan o purifican.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácido ( s ) son un residuo modificado, o residuo (s) que no se presentan naturalmente, tal como un mim t ico químico artificial de aminoácido (s) que se presenta naturalmente correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se presentan naturalmente. El término "oligopéptido" algunas veces usado en la presente especificación se usa para referirse a péptidos que son 20 residuos de aminoácidos o menos, típicamente 15 residuos o menos en longitud , y típicamente está compuesta de entre alrededor de 8 y alrededor de 11 residuos de aminoácidos, a menudo 9 o 10 residuos de aminoácidos. Los últimos se refieren en ]a presente como "nonapéptido" y "decapéptido" , respectivamente.

El término "aminoácido" como se usa en la presente se refiere a aminoácidos que se presentan naturalmente y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan similarmente a los aminoácidos que se presentan naturalmente. Los aminoácidos pueden ser ya sea aminoácidos L o aminoácidos D. Los aminoácidos que se presentan naturalmente 'son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos modificados después de la transición en células (por ejemplo, hidroxipr o 1 ina , ganuna-carboxiglutamato, y O-fosforoserina ) . La frase "análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un carbono alfa unido a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino, y un grupo R) como un aminoácido que se presenta naturalmente . pero que tiene un grupo R modificado o columnas modificadas (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, metil sulfonio de metionina) . La frase "miméticos de aminoácidos" se refiere a compuestos químicos que tienen estructuras diferentes pero funciones similares a los aminoácidos generales.

Los aminoácidos pueden referirse en la presente por su símbolo de tres letras comúnmente conocido o los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.

Los términos "gen", "polinucleótido" , "oligonucleótido" , "nucleótido" y "ácido nucleico" se usan intercambiablemente en la presente y, a menos que se indique específicamente de otra manera, son referidos por sus códigos de letra sencilla comúnmente aceptados .

El término "agente" y "composición" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un producto que incluye los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directamente o indi rectamente, do combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas. Tales términos, cuando se usan en relación al modificador "farmacéutico" (como en "agente farmacéutico" y "composición farmacéutica"), se pretende que abarquen un producto que incluye los ingredientes activos, y los ingredientes inertes que hacen el vehículo, así como cualquier producto que resulte, directamente o indirectamente, de la combinación, formación de complejo o agregación de cualquiera de dos o más de los ingredientes, o de disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. En consecuencia, en el contexto de la presente invención, los términos "agente farmacéutico" y "composición, farmacéutica" se refieren a cualquiera de los productos hechos al mezclar un compuesto de la presente invención y un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable.

El término "ingrediente activo" se refiere en la presente a una sustancia en un agente o composición que es biológicamente o fisiológicamente activo. Particularmente, en el contexto de agente o composición farmacéutica, el término "ingrediente activo" se refiere a una sustancia componente que muestra un efecto farmacológico objetivo. Por ejemplo, en el caso de agentes o composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento o prevención de cáncer, los ingredientes activos en los agentes o composiciones puede llevar a al menos una acción biológica o fisiológica en células y/o tejidos de cáncer directamente o indirectamente. Preferiblemente, tal acción puede incluir reducir o inhibir el crecimiento de células de cáncer, dañar o eliminar células y/o tejidos de cáncer,, etc. Típicamente, el efecto indirecto de ingredientes activos in las inducciones de CTLs reconoce o elimina células de cáncer. Antes de formularse, el "ingrediente activo" también puede referirse como "volumen", "sustancia de fármaco", o "producto técnico".

La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable", como se usa en la presente, significa un material, composición, sustancia , o vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, incluyendo pero no limitados a, un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulado.

Algunos agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención encuentran uso particular como vacunas. En el contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (también referida en la presente como "composición inmunogénica" ) se refiere a un agente o composición que tiene la función de mejorar, aumentar e/o inducir inmunidad antitumor durante la inoculación en animales.

A menos que se defina de otra manera, el término "cáncer" se refiere a los cánceres o tumores que sobre expresan el gen TOPK, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide aguda (AML) , cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC) , linfoma. Osteosarcoma, cáncer de próstata,¦ carcinoma renal, cáncer pulmonar microcítico (SCLC) y tumor de tejido suave.

A menos que se defina de otra manera, los términos "linfocito T citotóxi.co", "célula T citotóxica" y "C.TL" se usan intercambiablemente en la presente y a menos que se indique específicamente de otra manera, se refieren a un subgrupo de linfocitos T que son capaces de reconocer células no propias (por ejemplo, células de tumor/cáncer, células infectadas con virus) e inducir la muerte de tales células.

A menos que se defina de otra manera, los términos "HLA-A24" se refieren al tipo HLA-A24 que contiene los subtipos, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, HLA-A*2401, HLA-A*2402, . HLA-A*2403, HLA-A*2404, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2425 y HLA-A*2488.

A menos que se defina de otra manera, el término "HLA-A2" como se usa en la- presente, representativamente se refiere a los subtipos, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 y HLA-A*0250.

A menos que se defina de otra manera, el término "kiL" como se usa en la. presente, se usa en referencia a una combinación de reactivos y otros materiales. Se contempla en la presente que el kit puede incluir microconfiguración, chip, marcador, etc. No se pretende que el término "kit" se limite a una combinación particular de reactivos y/o materiales .

Como se usa en la presente, en el contexto de un sujeto o paciente, la frase "antigeno HLA del sujeto o paciente es HLA A24 o HLA-A2" se refiere a gue el sujeto o paciente posee en forma de homocigoto o heterocigoto un gen del antigeno HLA-A24 o HLA-A2 como la molécula de Clase I HC (siglas en inglés de complejo histocompatible mayor), y el antigeno HLA-A24 o HLA-A2 se expresa en células del sujeto o. paciente como un antigeno HLA.

En la medida en que los métodos y composiciones de la presente invención encuentran utilidad en el contexto del "tratamiento" de cáncer, un tratamiento se considera "eficaz" si lleva a un beneficio clínico tal como, reducción en expresión del gen TOPK, o una disminución en tamaño, prevalencia, o potencial metastático del cáncer en un sujeto, retrasando el progreso del cáncer, alivio de un síntoma clínico de cáncer propagación de tiempo de supervivencia, supresión de la recurrencia postoperatoria y así sucesivamente. Cuando el tratamiento se aplica profilácticamente, "eficaz" significa que retarda o previene la formación de cánceres o previene o alivia un síntoma clínico de cáncer. La eficacia se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el tipo de tumor particular.

En la medida en que los métodos y composiciones de la presente invención encuentran utilidad en el contexto de la "prevención" y "profilaxis" de cáncer, tales términos se usan intercambiablemente en la presente para referir a cualquier actividad que reduce la carga de mortalidad o morbilidad de la enfermedad. La prevención y profilaxis puede ocurrir "en niveles de prevención primario, secundario y terciario". Aunque la prevención y profilaxis primaria evitan el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención y profilaxis abarcan actividades dirigidas a la prevención y profilaxis del progreso de una enfermedad y la emergencia de los síntomas así como reducir el impacto negativo de una enfermedad ya establecida al restaurar la función y reducir las complicaciones relacionadas con la enfermedad. Alternativamente, la prevención y profilaxis pueden incluir un intervalo amplio de terapias profilácticas dirigidas a aliviar la severidad de un trastorno particular, por ejemplo reduciendo la proliferación y metástasis de tumores.

En el contexto de la presente invención, el tratamiento y/o profilaxis de cáncer y/o la prevención de recurrencia postoperativa del mismo incluye cualquiera de las siguientes etapas, tales como la eliminación quirúrgica de células de cáncer, la inhibición del crecimiento de células cancerosas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de remisión y supresión de ocurrencia de cáncer, . la regresión del tumor, y la reducción o inhibición de metástasis. Eli tratamiento efectivo y/o la profilaxis de cáncer disminuyen la mortalidad y mejora el pronóstico de los individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de los marcadores de tumor en la sangre, y ' alivia síntomas detectables que acompañan al cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejora de síntomas que constituye efectivamente el tratamiento y/o la profilaxis incluye 10%, 20%, 30% o más reducción, o enfermedad estable.

En el contexto de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que son específicamente reactivas para una proteína o péptido designado del mismo. Un anticuerpo puede incluir anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecífieos , anticuerpos humanizados, anticuerpos fusionados a otras proteínas o radioetiquetas , y fragmentos de anticuerpo. Adicionalmente, un anticuerpo en la presente se usa en el sentido más amplio y 'específicamente cubre los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecí fieos ) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada. Un "anticuerpo" indica todas las clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) .

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece.

II. Péptidos Los péptidos de la presente invención descritos en detalle enseguida pueden referirse como "péptidos TOPK" o "polipéptidos TOPK"..

Para demostrar que los péptidos derivados de TOPK funcionan como un antígeno reconocido por CTLs, los péptidos derivados de TOPK (SEQ ID NO: 80) se analizaron para determinar si fueron epítopos de antígeno restringidos por HLA-A2 que son alelos HLA comúnmente encontrados (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994) .

Los candidatos de .péptidos enlazados a HLA-A24 derivados de TOPK se identificaron usando la información en sus afinidades de enlace a HLA-A24 incluyen: TOPK-A24-9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOPK-A24-9-237 (SEQ ID NO: 4), TOPK-A24-9-155 (SEQ ID NO: 5), TOPK-A24-9-232 (SEQ ID. NO: 6), TOPK-A24-9-174 (SEQ ID NO: 7), ????-?24-9-73 (SEQ ID NO: 8), TOPK-A24-9-235 (SEQ ID NO: 9), TOPK-A24-9-19 (SEQ ID NO: 10), TOPK-A24-9-205 (SEQ ID NO: 11), TOPK-A24-9-77 (SEQ ID NO: 12), ????-?2 - 9-270 (SEQ ID NO: 13), TOPK-A24-9-58 (SEQ ID NO: 14), TOPK-A24-9-81 (SEQ ID NO: 15), TOPK-A24-9-278 (SEQ ID NO: 16), TOPK-A24-9-183 (SEQ ID NO: 17), TOPK-A24-9-227 (SEQ ID NO: 18), TOPK-A24-9-13 (SEQ ID NO: 19), TOPK-A24-9-146 (SEQ ID NO: 20), TOPK-A24-9-140 (SEQ ID NO: 21), TOPK-A24-9-103 (SEQ ID NO: 22), TOPK-A24-9-105 (SEQ ID NO: 23), TOPK-A24-9-118 (SEQ ID NO: 24), TOPK-A24-10-31 (SEQ ID NO: 25), TOPK-A24-10-155 (SEQ ID NO: 26), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27 ), TOPK-A24-10-1289 (SEQ ID NO:.28), TOPK-A24-10-130 (SEQ ID NO: 29), TOPK-A24-10-47 (SEQ ID NO: 30), TOPK-A24-10-73 (SEQ ID NO: 31), TOPK-A24-10-102 (SEQ ID NO: 32), TOPK-A24 -10-39 (SEQ ID NO: 33), TOPK-A24-10-4 (SEQ ID NO: 34), TOPK-A24-10-77 (SEQ ID NO: 35), TOPK-A24-10-241 (SEQ ID NO: 36), TCPK-A24-10-12 (SEQ ID NO: 37), TOPK-A24-10-148 (SEQ ID NO: 38), TOPK-A24-10-145 (SEQ ID NO: 39) y TOPK-A24 -10-114 (SEQ ID NO: 40).

De lo anterior, los siguientes péptidos resultaron en el establecimiento exitoso dé CTLs después de la estimulación in vitro de las células T por células dendriticas cargadas con estos péptidos, TOPK-A24-230 (SEQ ID NO:2), TOPK-A24-9-130 (SEA ID NO:3), TOPK-A24-9-232 (SEQ ID NO:6), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) y TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28).

Los candidatos de péptidos de enlace HLA-A2 derivados de TOPK se identificaron basándose en sus afinidades de enlace a HLA-A incluyen: TOPK-A2-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-A2-9-34 (SEQ ID NO: 43) TOPK-A2-9-236 (SEQ ID NO: 44), TOPK-A2-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK- A2-9-134 (SEQ ID NO: 46), TOPK-A2-9-183 (SEQ ID NO: 47), TOPK-A2-9-81 (SEQ ID NO: 48), TOPK-A2-9-149 (SEQ ID NO: 49), TOPK-A2-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A2-9-12 (SEQ ID NO.-51), TOPK-A2-9-227 (SEQ ID NO: 52) , TOPK-A2-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A2-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A2-9-310 (SEQ ID NO: 55) TOPK-A2-9-132 (SEQ ID NO: 56), TOPK-A2-9-242 (SEQ ID NO: 57), TOPK-A2-9-156 ' (SEQ ID NO: 58), TOPK-A2-9-138 (SEQ ID NO: 59), TOPK-A2-9-142 (SEQ ID NO: 60), TOPK-A2-10-190 (SEQ ID NO: 61), TOPK-A2-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A2-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A2-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A2-10-234 (SEQ ID NO: 65), TOPK-A2-10-239 ( SEQ ID MO: 66), TOPK-A2-10-290 (SEQ ID NO: 67), TOPK-A2-10-37 (SEQ ID NO: 68), TOPK-A2-10-20 (SEQ ID NO: 69) , OPK-A2-10-241 (SEQ ID NO: 70 ) , ????-?2-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A2-10-88 (SEQ ID NO: 72), TOPK-A2-10-81 (SEQ ID NO: 73), TOPK-A2-10313 (SEQ ID NO: 74), TOPK-A2-10-54 (SEQ ID NO: 75), TOPK-A2-10-142 (SEQ ID NO: 76), TOPK-A2-10-35 (SEQ ID NO: -77), TOPK-A2-10-110 (SEQ ID NO: 78), TOPK-A2-10-223 (SEQ ID NO: 79), TOPK-A2-10-274 (SEQ ID NO: 80), TOPK-A2-10-173 (SEQ ID NO: 81), TOPK-A2-10-141 (SEQ ID NO: 82), TOPK-A2-10-292 (SEQ ID NO: 83) y TOPK-A2-10-180 (SEQ ID NO: 84) .

De lo anterior, los siguientes péptidos resultaron en establecimiento exitoso de CTLs después de la estimulación in vitro de células T por las células dendriticas (DCs) (cargadas) con estos péptidos: TOPK-A02-9-240 (SEQ Iü' NO:42), TOP -A02-9-19 (SEQ ID NO:45), TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO:47), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO:. 71), TOPKA02-10-88 (SEQ ID NO: 72) y TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO:76).

Estos CTLs establecidos observados anteriormente muestran actividad CTL especifica potente contra células objetivo pulsadas con péptidos respectivos. Estos resultados demuestran que TOPK es un antigeno reconocido por CTL y que los péptidos probados son péptidos de epitopo de TOPK restringidos por HLA-A24 o HLA-A2; por lo tanto, tales péptidos pueden ser efectivos como antigenos objetivos para citotoxicidad por CTLs .

Ya que el gen TOPK se sobre-expresa en células de cáncer y tejidos, incluyendo aquellos de AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular , cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido suave, y no se expresa en la mayoría de los órganos normales, representa un buen objetivo para inmunoterapia . De esta manera, . la presente invención proporciona nonapéptidos (péptidos que consisten de nueve residuos de aminoácidos) y decapéptidos (péptidos que consisten de diez residuos de aminoácidos) correspondientes a epítopos que reconocen el CTL de TOPK. Los ejemplos particularmente preferidos de nonapéptidos y decapéptidos de la presente invención incluyen aquellos péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2 hasta 40 y 42 hasta 84.

.Generalmente, los programas de software ahora disponibles, por ejemplo, en la Internet, tales como aquellos descritos en Parker KC et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75 y Nielsen M. et al., Protein Sci 2003, 12:1007-17 pueden usarse para calcular las afinidades de enlace entre varios péptidos y antígenos HLA in silico. La afinidad de enlace con antigenos HLA puede medirse como se describe, por ejemplo, en Parker KC et al., J Immunol 1994, 152 ( 1 ) : 163-75 , uzushima K et al., Blood 2001, 98 ( 6) : 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics . 2007; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, y Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796, que se resumen en, por ejemplo, Lafuente EM et al., Gurrent Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220. Los métodos para determinar la afinidad de enlace se describen., por ejemplo, en el Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190) y Protein Science (2000, 9: 1838-1846) . Por lo tanto, se pueden utilizar fácilmente tales programas de software para seleccionar aquellos fragmentos derivados de TOPK que tienen alta afinidad de enlace con antigenos HLA usando tales programas de software. De esta manera, la presente invención abarca péptidos compuestos de cualquiera de los fragmentos derivados de TOPK, que deben determinarse para enlazar con antigenos HLA por tales programas conocidos. Adicionalmente, tales péptidos pueden incluir el péptido que está compuesto de la longitud completa de TOPK.

Los péptidos de la presente invención, particularmente los nonapéptidos y decapéptidos de la presente invención, pueden flanquearse con residuos de aminoácidos adicionales, de manera que el péptido resultante mantiene su capacidad de inducción de CTL. Los residuos de aminoácidos adicionales particulares pueden estar compuestos de cualquier tipo de aminoácidos, en la medida en que no impidan la capacidad de inducción de CTL del péptido original. De esta manera, la presente invención abarca péptidos que tienen inducción CTL, en particular péptidos derivados de TOPK (por ejemplo, péptidos que incluyen una . secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 O 76). Tales péptidos son, por ejemplo, de menos de alrededor de 40 aminoácidos, a menudo menos de alrededor de 20 aminoácidos, y . usualmente menos de alrededor de 15 aminoácidos .

Generalmente se sabe que, la modificación de uno, dos o más aminoácidos en un péptido no tendrá influencia en la función del péptido, y en algunos casos aún aumentará la función deseada de la proteína original. De hecho, los péptidos modificados (es decir, péptidos compuestos de una secuencia de aminoácidos en los cuales 1, 2 o varios residuos de aminoácidos se han modificado (es decir, sustituido, agregado, eliminado o insertado) en comparación con una secuencia de referencia original) se han conocido para mantener la actividad biológica del péptido original (Mark et al., Proc Nati Acad Sci EUA 1984, 81: 5662-6; Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500/ Dalbadie-McFarland et al., Proc Nati Acad Sci EUA 1982, 79: 6409-13). De esta manera, en una modalidad, los péptidos de la presente invención tienen tanto capacidad de inducción de CTL como una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs : 2 hasta 40 y 42 hasta 84, en la cual uno, dos o aún más aminoácidos se agregan, eliminan, insertan y/o sustituyen. En otras palabras, los péptidos de la presente invención tiene tanto inducción CTL como secuencia de aminoácidos en la que dos o muchos aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan y/o agregan en la secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 a 40 y 42 a 84, siempre y cuando los péptidos modificados retengan, la inducción CTL del péptido original.

Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que modificaciones (es decir, eliminaciones, inserciones, adiciones y/o sustituciones) individuales a una secuencia de aminoácidos que altera un aminoácido sencillo o un porcentaje pequeño de la secuencia de aminoácidos general tiende a resultar en la conservación de las propiedades de la cadena lateral. Como tal, a menudo se refieren como "sustituciones conservadoras" o "modificaciones conservadoras", en donde la alteración de una proteina resulta en una proteina modificada que tiene una funció análoga a la proteina original. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de características de las cadenas laterales de aminoácidos que son deseables para conservar incluyen, por ejemplo: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) , aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) , y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P) ; una cadena lateral que contiene grupo hidroxilo (S, T, Y) ; una cadena lateral que contiene átomo de azufre (C, M) ; una cadena lateral que contiene ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q) ; una cadena lateral que contiene base- (R, K, H) ; y una cadena lateral que contiene aromático (?, F,. Y, ) . Además, los siguientes ocho grupos cada uno contiene aminoácidos que se aceptan en la técnica como sustituciones conservadoras una para la otra: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , etionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins 1.984) .

Tales péptidos conservadoramente modificados también se consideran que son péptidos de la presente invención. Sin embargo, los péptidos de la presente invención no se restringen a esto y pueden incluir modificaciones no conservadoras, de manera que el péptido modificado resultante mantiene la capacidad de inducción de CTL del péptido no modificado original. Adicionalmente, los péptidos modificados no deberían excluir péptidos inducibles por CTL derivados de variantes polimórficas, homólogos interespecies , y alelos de TOPK.

Los residuos de aminoácidos se pueden insertar, sustituir o agregar a los péptidos de la presente invención, o alternativamente, se pueden eliminar residuos de aminoácidos de ahí para lograr una afinidad de enlace superior. Para . mantener el requisito de capacidad de inducción de CTL, preferiblemente modifica (es decir, elimina, inserta, agrega y/o sustituye) solamente un número pequeño (por ejemplo, 1, 2 o varios) o un porcentaje pequeño de aminoácidos. En la presente, el término "varios" significa 5 o menos aminoácidos, por ejemplo, 4 o 3 o menos. El porcentaje de aminoácidos a modificarse es preferiblemente 20% o menos, más preferiblemente 15% por lo menos, y aún más preferiblemente 10% o menos, por ejemplo 1 hasta 5%.

Cuando se usa en el contexto de inmunoterapia, los péptidos de la presente invención deben presentarse en la superficie de una célula o exosoma, preferiblemente como un complejo con un antigeno HLA. Por lo tanto, es preferible seleccionar péptidos que no sólo inducen CTLs sino también poseen alta afinidad de enlace para el antigeno HLA. Para tal fin, los péptidos pueden modificarse por sustitución, inserción, eliminación y/o adición de los residuos de aminoácido para proporcionar un péptido modificado que tiene afinidad de enlace mejorada. Además de los péptidos que se muestran naturalmente, ya ¦ que la regularidad de las secuencias de péptidos mostrada por el enlace a antigenos HLA ya se conoce (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), las modificaciones basadas en tal regularidad pueden introducirse en los péptidos inmunogénicos de la invención.

Por ejemplo, los péptidos que poseen alta afinidad de enlace a HLA-A2 tienden a tener el segundo aminoácido de la terminal N sustituido con feni lalanina , tirosina, metionina, o triptófano. Similarmente, los péptidos en los cuales el aminoácido de terminal C se sustituye con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano, o metionina tienden a tener afinidad de enlace HLA-A24 alta. En consecuencia, puede ser deseable sustituir el segundo aminoácido de la terminal N con fenilalanina, tirosina, metionina, o triptófano, y/o el aminoácido en la terminal C con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, o metionina con objeto de incrementar la afinidad de enlace a HLA-A24. De esta manera, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 hasta 40, (especialmente SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28) en donde el segundo aminoácido de la terminal N de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO se sustituye con fenilalanina, tirosina, metionina, o triptofano, y/o en la cual la terminal C de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO se sustituye con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano o metionina se abarcan por la presente invención.

También, la presente invención abarca los péptidos incluyendo una secuencia de aminoácido en la que uno, dos, o más aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan y/o agregan en la secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 a 40 (especialmente SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28), tal como péptidos que tiene una o ambas de las siguientes características de (a) .el segundo aminoácido del término N es fenilalanina, tirosina, metioninao triptofano, y (b) el aminoácido de la terminal C es fenilalanina , leucina, isoleucina, triptofano o metionina. En modalidades preferidas, los péptidos de la presente invención incluyen una secuencia de aminoácido en la que el segundo aminoácido de la terminal N es sustituido con fenilalanina, tirosina, metionina o triptofano, y/o el aminoácido de terminal C es sustituido con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano o metionina en la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID Nos: 2 a 40 (especialmente SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28) .

Similarmente , los peptidos que muestran alta afinidad de enlace HLA-A2 tienden a tener el segundo aminoácido de la terminal N sustituido con leucina o metionina y/o el aminoácido en la terminal C sustituido con valina o leucina. Alternativamente, ; puede ser deseable sustituir el segundo aminoácido de la terminal N con leucina o metionina, y/o el aminoácido en la terminal C con valina o leucina con objeto de incrementar la afinidad de enlace a HLA-A2. De esta manera, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 hasta 84 (especialmente SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76), en las que el segundo aminoácido de la terminal N de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO está sustituido con leucina o metionina, y/o en donde la terminal C de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO está sustituida con valina o leucina se abarcan por la presente invención. También, la presente invención abarca los péptidos incluyendo una secuencia de aminoácido . en la que uno, dos o muchos aminoácidos se sustituyen, eliminan, insertan y/o agregan en la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a. 84 (especialmente SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76), tales péptidos teniendo una o ambas de las siguientes características (a) el segundo amino ácido de la terminal N es leucina o metionina, y (b) el aminoácido de terminal C es valina o leucina. En modalidades preferidas, los péptidos de la presente invención incluyen una secuencia de aminoácido en la que el segundo aminoácido de la terminal N es sustituido con leucina o metionina, y/o el aminoácido de terminal C es sustituido con valina o leucina en la secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a 84 (especialmente SEQ ID Nos: 42, 45, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76).

Las sustituciones pueden introducirse no sólo en los aminoácidos de terminal sino también en la posición del reconocimiento de péptidos del receptor de célula T potencial (TCR, por sus siglas en inglés). Varios estudios han demostrado que un péptido con sustituciones de aminoácidos pueden ser igual a o mejor que el original, por ejemplo CAPI, p53 (264-272) , Her-2/neu(369-377) o gpl00(209-2i7) (Zaremba et al. Cáncer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002); 168 (3) : 1338-47. , S. O. Dionne et al. Cáncer Immunol Immunother. (2003) 52: 199-206 y S. O. Dionne et al. Cáncer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

La presente invención también contempla la adición de 1, 2 o varios aminoácidos que también pueden agregarse a las terminales N y/o C de los péptidos actuales. Tales péptidos modificados que tienen inducción de CTL mantenida también se incluyen en la presente invención.

Por ejemplo, la- presente invención proporciona un péptido aislado de menos de 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos de longitud, que tiene capacidad de inducción CTL y comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 a 24 y 42 a 60, (ii) una secuencia de aminoácidos en la cual 1, 2, o varios aminoácidos se modifican en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2 hasta 24 y 42 hasta 60, en donde el péptido tiene una habilidad de inducir un linfocito T citotóxico, (iii) la secuencia de aminoácidos de (ii), en donde, en el contexto de HLA-A24, la secuencia de aminoácidos tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal N de las SEQ ID NOs es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, metionina, y triptofano, y (b) el aminoácido de terminal C de las SEQ ID NOs es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, leucina, isoléucina, triptofano, y metionina, y (iv) la secuencia de aminoácido de (ii), en donde, en el contexto de HLA-A2, la secuencia de aminoácidos tiene una o ambas de las siguientes características : (c) el segundo aminoácido de la terminal N de la SEQ ID NO es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de leucina y metionina; y (d) el aminoácido de terminal C de la SEQ. ID NO es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de valina y leucina.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un péptido aislado de menos de 15, 14, 13, 12, u 11 aminoácidos de longitud, que tienen capacidad de inducción CTL y comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (i') una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 25 a 40 y 61 a 84, (ii') una secuencia de aminoácidos en la cual 1, 2, o varios aminoácidos se modifican en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 25 hasta 40 y 61 hasta 84, en donde el péptido tiene una habilidad para inducir un linfocito T citotóxico, (iii') la secuencia de aminoácidos de (i'), en donde, en el contexto de HLA-A24, la secuencia de aminoácidos tiene una o ambas de las siguientes características: (a' ) el segundo aminoácido de la terminal N de la SEQ ID NOs es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, metionina, y triptofano, y (b' ) el aminoácido de terminal C de las SEQ ID NOs es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, y metionina. (iii' ) la secuencia de aminoácidos de (i' ) , en donde, en el contexto de HLA-A2, la secuencia de aminoácidos tiene una o ambas de las siguientes características: (c' ) el segundo aminoácido de la terminal N de las SEQ ID NOs es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de leucina y metionina; y (d' ) el aminoácido de terminal C de las SEQ ID NOs es o se modifica para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de valina y leucina.

Estos péptidos . enlazan con antígenos HLA en APCs para presentarse en APCs tan complejos con un antígeno HLA cuando aquellos péptidos son APCs contactados. Alternativamente, aquellos péptidos se introducen en APCs y se procesan para fragmentos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre (i)- (iv) y (i')-(iv') en APCs para presentarse en APCs' como complejos con antígenos HLA cuando aquellos péptidos son contactados con APCs. Consecuentemente, los CTLs específicos para tales péptidos se inducen.

Sin embargo, cuando la secuencia de péptidos es idéntica a una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína endógena o exógena que . tiene una función diferente, los efectos colaterales negativos tales como trastornos autoinmunitaríos y/o 'síntomas alérgicos contra sustancias específicas pueden inducirse. Por lo tanto, puede ser deseable realizar primero búsquedas de homología usando bases de datos disponibles para evitar situaciones en las cuales la secuencia del péptido coincida con la secuencia de aminoácidos de otra proteína. Cuando se vuelve claro de las búsquedas de homología que no existe péptido idéntico o que tenga 1 o 2 aminoácidos de diferencia en comparación con el péptido objetivo que existe en naturaleza, el péptido objetivo puede modificarse con objeto de incrementar su afinidad de enlace con antígenos HLA, y/o incrementar su capacidad de inducción de CTL sin ningún peligro de tales efectos colaterales.

Aunque los péptidos que tienen alta afinidad de enlace a los antígenos HLA como se describe arriba se espera que sean altamente efectivos, los péptidos candidato, que son seleccionados de acuerdo con la presencia de alta afinidad de enlace como un indicador, se examinan además por la presencia de capacidad de inducción de CTL. En la presente, la frase "capacidad de inducción de CTL" indica la capacidad del péptido para inducir linfocitos T citotóxicos (CTLs) cuando se presenta en células que presentan el antigeno (APCs) . Además, "capacidad de inducción de CTL" incluye la capacidad del péptido para inducir activación de CTL, proliferación de CTL, promover lisis de células objetivo por CTL, e incrementar producción de IFN-gamma por CTL.

La confirmación de capacidad de inducción de CTL se alcanza al inducir APCs que transportan antigenos MHC humanos (por ejemplo, linfocitos B, macrófagos, y células dendriticas (DCs) ) , o más específicamente DCs derivados de leucocitos mononucleares de sangre periférica humanos, y después de estimulación de APCs con péptidos de prueba, mezclar APCs con células CD8 positivas para inducir CTLs, y luego medición del IFN-gamma producido y liberado por CTL contra las células objetivo. Como el sistema de reacción, los animales transgénicos que se han producido para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, aquellos descritos en BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000, 61(8):' 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of : CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response) pueden usarse. Alternativamente, las células objetivo puede ser radioetiquetadas con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica de CTL puede calcularse a partir de la radioactividad liberada de las células objetivo. Alternativamente, la capacidad de inducción CTL puede evaluarse al medir la IFN-gamma producida y liberada por CTL en la presencia de APCs que transporta péptidos inmovilizados, y visualizarse la zona de inhibición en el medio usando anticuerpos monoclonales anti-IFN-gamma.

Como un resultado de examinar la capacidad de inducción de CTL de los péptidos' como se describe arriba, se descubrió que los nonapéptidos o decapéptidos seleccionados de entre las secuencias de aminoácidos indicadas por SEQ ID NOs : 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 mostraron capacidad de inducción de CTL particularmente alta asi como alta afinidad de enlace a un antigeno HLA. De esta manera, tales péptidos son una modalidad ejemplificada preferida de la presente invención.

Adicionalmente, los resultados del análisis de homología demuestran que tales péptidos no tienen homología importante con péptidos derivados de cualquiera de otros productos de gen humano conocidos. En consecuencia, se reduce la posibilidad de respuestas inmunitarias desconocidas o indeseadas que surgen cuando se usa para inmunoterapia . Por lo tanto, también a partir de este aspecto, estos péptidos son útiles para producir inmunidad contra TOPK en pacientes con cáncer. De esta manera, los péptidos preferidos de la presente invención, preferiblemente, incluyen pero no se limitan a, péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs : 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 y péptidos modificados del mismo.

Como se observa anteriormente, los péptidos de la presente invención tiene una habilidad para inducir un CTL especifico para TOPK. Por- ejemplo, los péptidos que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28, o péptidos modificados del mismo tiene una habilidad para inducir un CTL que puede mostrar actividad citotóxica especifica contra una célula presentando un péptido derivado de TOPK por medio de HLA-A24 (por ejemplo, células que expresan TOPK y HLA-A24). Los ejemplos de tales células incluyen células positivas de cáncer HLA-A24. Igualmente, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76, o péptidos modificados de las mismas tiene una habilidad de inducir un CTL que puede mostrar actividad citotóxica especifica contra una célula presentando un péptido derivado de TOPK por medio de HLA-A2 (por ejemplo, células que expresan TOPK y HLA-A2). Los ejemplos de tales .células incluyen células positivas de cáncer HLA-A2.

Además de las modificaciones antes descritas, los péptidos de la presente invención también pueden ligarse a otros péptidos, de manera que el péptido ligado resultante mantiene la capacidad de inducción de CTL requerida del péptido original y, más preferiblemente, también mantiene el enlace HLA requerido. Los · ejemplos de "otros" péptidos apropiados incluyen: los péptidos de la presente invención o los péptidos que se inducen por CTL derivados de otros TAAs . El péptido de la presente invención puede ligarse a "otro" péptido por medio de un ligador directamente o indirectamente. Los ligadores inter-péptido apropiados son bien conocidos en el campo e incluyen, por ejemplo, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) o K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 57?9-5715) .

Por ejemplo, los péptidos de antigeno asociados al tumor que no son TOPK también pueden usarse subsecuentemente de forma simultánea para incrementar respuesta inmunitaria por medio de HLA clase I y/o clase II. Está bien establecido que las células de cáncer pueden expresar más de un gen asociado al tumor. De esta manera, está dentro del alcance de la experimentación de rutina para alguien de experiencia en la técnica determinar si un sujeto particular expresa genes asociados al tumor adicionales, y entonces incluir péptidos de enlace a HLA clase I y/o HLA clase II derivados de productos de expresión de tales productos de gen en las composiciones farmacéuticas o vacunas de TOPK de la presente invención.

Algunos de los péptidos enlazados a HLA clase I y HLA clase II se conocen para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica (por ejemplo, ver Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995) , y pueden usarse en la presente invención en una manera similar como aquellos descritos en la presente. De esta manera, alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede preparar fácilmente polipéptidos que incluyen uno o más péptidos TOPK y uno o más de los péptidos no TOPK, o ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, usando procedimientos estándar de biología molecular.

Los péptidos ligados antes descritos se refieren en la presente como "politopos", esto es, grupos de dos o más péptidos que estimulan la respuesta inmunitaria o potencialmente inmunogénica que pueden unirse en conjunto en varias configuraciones (por ejemplo, concatenados, traslapados). El politopo (o ácido nucleico que codifica el politopo) puede administrarse en un protocolo de inmunización estándar, por ejemplo, a animales, para probar la efectividad del politopo en estimular, potenciar y/o provocar una respuesta inmunitaria.

Los péptidos pueden unirse en conjunto directamente o por medio del uso de secuencias de flanqueo para formar politopos, y el uso de' politopos. como vacunas es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Thomson et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 92 (13) : 5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15 ( 12 ): 1280-1284 , 1997; Thomson et al., J Immunol. 157 (2 ): 822-826, 1996; Tarn et al., J Exp. Med. 171 (1) : 299-306, 1990). Los politopos que contienen varios números y combinaciones de epitopos pueden prepararse y probarse para reconocimiento por CTLs y para eficacia en incrementar una respuesta inmunitaria.

Los péptidos de la presente invención también pueden ligarse a otras sustancias, de manera que el péptido ligado resultante mantiene la capacidad de inducción de CTL requerida del péptido original. Los ejemplos de sustancias apropiadas incluyen, por ejemplo: péptidos, lipidos, azúcar y cadenas de azúcar, . grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etc. Los péptidos pueden contener modificaciones tales como glicosilación, oxidación de cadena lateral, o fosforilación, etc, con la condición de que las modificaciones no destruyan la actividad biológica de los péptidos originales. Estos tipos de modificaciones pueden realizarse para conferir funciones adicionales (por ejemplo, función de dirección,. y función de suministro) o para estabilizar el péptido.

Por ejemplo, para incrementar la estabilidad in vivo de un péptido, se conoce en la técnica la introducción de D-aminoácidos, miméticos de aminoácidos o aminoácidos no naturales; este concepto también puede adaptarse para los péptidos actuales. La estabilidad de un péptido puede evaluarse en un número de maneras. Por ejemplo, peptidasas y varios medios biológicos, tales como plasma y suero humano, pueden usarse para estabilidad de prueba (ver, por ejemplo, Verhoef et al., Eur J-Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302) .

Por otra parte, como se nota arriba, entre los péptidos modificados que se sustituyen, eliminan, insertan o agregan por 1, 2 o varios residuos de aminoácidos, aquellos que tienen la misma actividad o superior en comparación con péptidos originales pueden separarse por exclusión o seleccionarse. La presente invención, por lo tanto, también proporciona el método de separación por exclusión o selección de péptidos modificados que tienen la misma actividad o superior en comparación con los originales. Un método ilustrativo incluye las etapas de: a: sustituir, eliminar, insertar o agregar al menos un residuo de aminoácido de un péptido de la presente invención, b: determinar la actividad del péptido, y c: seleccionar el péptido que tiene la misma actividad o superior en comparación con el original.

En las modalidades preferidas, la presente invención proporciona un método de selección de un péptido teniendo la habilidad para inducir un CTL que tiene una actividad citotóxica especifica contra una célula que presenta un fragmento derivado de TOPK, en donde el método comprende las etapas de: (i) proporcionar una secuencia candidato que consiste de una secuencia de aminoácido modificada por sustitución, eliminación, inserción y/o adición de uno, dos o muchos residuos de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos original, en donde la' secuencia de aminoácidos original se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76; (ii) seleccionar una secuencia candidato que no tiene homología importante sustancial (o identidad de secuencia) con los péptidos derivados de cualquiera de los productos de genes humanos otros que no son TOPK; (iii) contactar un péptido que consiste de la secuencia candidato seleccionada en la etapa (ii) con una célula presentando antigeno; (iv) contactar a la célula presentando un antígeno de la etapa (c) con una célula T positiva CD8; y (v) identificar el péptido de cuya inducción CTL es la misma o más alta que un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos original.

En la presente, la actividad a evaluarse puede incluir actividad enlazada a MHC, APC o capacidad de inducción de CTL y actividad citotóxica. Preferiblemente, la actividad del péptido para ensayarse es inducción CTL.

III. Preparación de péptidos TOPK Los péptidos de la presente invención pueden prepararse usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden prepararse sintéticamente, usando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse indi idualmente o como polipéptidos más largos que incluyen dos o más péptidos. Los péptidos pueden entonces aislarse, es decir, purificados o aislados de manera que estén sustancialmente libres de otras proteínas de célula hospedera que se presentan naturalmente y fragmentos de las mismas,, o cualquiera de otras sustancias químicas.

Los péptidos de la presente invención pueden contener modificaciones, tales como glicosilación, oxidación de cadena lateral, o fosforilación; de manera que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Otras modificaciones ilustrativas incluyen incorporación de D-aminoácidos u otros miméticos de aminoácidos que pueden usarse, por ejemplo, para incrementar la vida media en suero de los péptidos.

Los péptidos de la presente invención pueden obtenerse a través de síntesis química basada en la secuencia de aminoácidos seleccionada. Los ejemplos de métodos de síntesis de péptido convencionales que pueden adoptarse por la síntesis incluyen:. (i) Peptide Synthesis, Interscience , New York, 1966; (ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976; (iii) Peptide Synthesis (en Japonés) , Maruzen Co., 1975; (iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (en Japonés), Maruzen Co., 198.5; (v) Development of Pharmaceuticais (segundo volumen) (en Japonés), Vol. 14 (síntesis del péptido) , Hirokawa, 1991; (vi) W099/67288; y (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Alternativamente, los péptidos actuales pueden obtenerse al adaptar cualquiera de los métodos de ingeniería genética conocidos para producir péptidos (por ejemplo, orrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, primero, ' un vector apropiado que alberga un polinucleotido que codifica el péptido objetivo en una forma que se puede expresar (por ejemplo, cadena abajo de una secuencia reguladora que corresponde a una secuencia promotora) se prepara y transforma en una célula hospedera apropiada. La célula hospedera se cultiva entonces para producir el péptido de interés. El péptido también puede producirse in vitro adoptando un sistema de traducción in vitro.

IV. Polinucleótidos La presente invención. también proporciona un polinucleotido que codifica cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados de la presente invención. Estos incluyen polinucleótidos derivados del gen que se presenta de forma natural TOPK (por ejemplo, No. de Acceso al GenBank NM_018 92 (SEQ ID NO: 85)) asi como aquellos que tienen una secuencia de nucleótido conservadoramente modificada del mismo. En la presente, la frase "secuencia de nucleótido conservadoramente modificada" se refiere a secuencias que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG, y GCU todos codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en cada posición donde se especifica una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas," que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presenté que codifica un péptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptofano) puede modificarse para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un péptido se describe implícitamente en cada secuencia descrita.

El polinucleótido de' la presente invención puede estar compuesto de ADN, ARN, y derivados de los mismos. Como es bien conocido en la técnica, un ADN está adecuadamente compuesto de bases tales como A, T, C, y G, y T se reemplaza por U en un ARN. Alguien de experiencia reconocerá que las bases que no se presentan naturalmente también pueden incluirse en los polinucleotidos.

El polinucleótido de la presente invención puede codificar péptidos múltiples de la presente invención con o sin la intervención entre secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que interviene puede proporcionar un sitio de escisión (por ejemplo, secuencia de reconocimiento de enzimas) del polinucleótido o los péptidos traducidos. Adicionalmente, el polinucleótido puede incluir cualquiera de las secuencias adicionales para la secuencia de codificación que codifican el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión del péptido o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores y similares. En general, tales polinucleotidos recombinantes pueden prepararse por la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales usando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas .

Pueden usarse técnicas de síntesis tanto recombinantes como químicas para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleotido puede producirse por inserción en un vector apropiado, que puede expresarse cuando se transfecta en una célula competente. Alternativamente, un polinucleotido puede amplificarse usando técnicas PCR o expresión' en hospederos apropiados (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: . A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) . Alternativamente, un polinucleotido puede sintetizarse usando las técnicas de fase sólida, como se describe en Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

V. Exosomas La presente invención proporciona además vesículas intracelulares llamadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos . de la presente invención y antígenos HLA en su superficie. Los exosomas pueden prepararse, por ejemplo, usando los métodos detallados en las Publicaciones Kohyo de Solicitud de Patente Japonesa Nos. Hei 11-510507 y WO99/03499, y pueden prepararse usando APCs obtenidos de pacientes quienes se han sometido a tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención pueden inocularse como vacunas, en una manera similar a los péptidos de la presente invención.

El tipo de antigenos HLA incluidos en los complejos debiera alinearse con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población Japonesa, HLA-A24 y HLA-A2, particularmente HLA-A*2402 y HLA-A*0201 y HLA-A*0206, son prevalentes y por lo tanto debieran ser apropiados para el tratamiento de pacientes Japoneses. El uso del tipo HLA-A24 que se expresan altamente entre los japoneses y caucásicos es favorable para obtener resultados efectivos, y los subtipos tales como HLA-A*2402, HLA-A*0201 y también encuentran uso. Típicamente, en la tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga por adelantado, lo que permite la selección apropiada de péptidos que tienen altos niveles de afinidad de enlace al antigeno particular, o que tienen capacidad de inducción de CTL por la presentación del antígeno. Adicionalmente, con objeto de obtener péptidos que tienen tanto alta afinidad de enlace como capacidad de inducción de CTL, sustitución, inserción, eliminación y/o adición de 1, 2, o varios aminoácidos puede realizarse con base en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial TOPK que se presenta naturalmente.

Cuando el exosoma de la presente invención posee el tipo HLA-A24 como un antigeno, los péptidos que tienen una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2 a 40 (especialmente SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28) tienen utilidad particular.

Alternativamente, cuando el exosoma de la presente invención posee tipo HLA-A2 como un antígeno, los péptidos incluyendo la secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos 2 a 8 (específicamente SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62,· 63, 64, 66, 71, 72 y 73) tiene utilidad particular.

En algunas modalidades, los exosomas de la presente invención son exosomas que presentan un complejo del péptido de la presente invención y antígeno HLA-A24 o HLA-A2 en su superficie. En modalidades típicas, el exosoma de la presente invención presentan un complejo de un péptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, o 28 (o péptido modificado de las mismas) y HLA-A24 en su superficie. En otras modalidades, el exosoma de la presente invención presenta un complejo de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 o 76 (o péptido modificado de las mismas) HLA-A2 en su superficie VI. Células que presentan el antigeno (APCs) La presente . invención también proporciona células que presentan el antigeno (APCs) aisladas que presentan complejos formados entre antigenos HLA y los péptidos de la presente invención en su superficie. Las APCs pueden ser derivadas de pacientes quienes se han sometido a tratamiento y/o prevención, y pueden administrarse como vacunas por si mismos o en combinación con otros fármacos que incluyen los péptidos de la presente invención, exosomas, o CTLs de la presente invención. · Las APCs no se limitan a un tipo particular de células, los Ejemplos de APCs incluyen pero no se limitan a, células dendriticas (DCs), células Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, que son conocidas por presentar antigenos proteinicos en su superficie celular de manera que se reconocen por linfocitos. Ya que los DCs son APCs representativos que tienen la actividad de inducción de CTL más fuerte entre las APCs, DCs pueden preferiblemente usarse como las APCs de la presente invención.

Por ejemplo, las APCs de la presente invención pueden obtenerse al inducir DCs.de monocitos de sangre periférica y luego ponerlos en contacto (estimularlos) con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente invención se administran a los sujetos, las APCs que presentan los péptidos de la presente invención se inducen en el cuerpo del sujeto. En la presente, la frase "inducir una APC" incluye poner en contacto (estimular) una célula presentando antigeno con los péptidos de la presente invención, o introduciendo un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención en una célula presentando un antigeno para tener un complejo de APC presente formado entre un antigeno HLA y el péptido de la presente invención en la superficie. Por ejemplo, las APCs de la presente invención pueden obtenerse colectando APCs del sujeto después de administrar uno o más péptidos de la presente invención al .sujeto. Alternativamente, las APCs de la presente invención pueden obtenerse al poner en contacto APCs, que han sido recolectadas de un sujeto con el péptido de la presente invención.

Las APCs de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para inducir respuesta inmunitaria contra cáncer en el sujeto por si mismos o en combinación con otros fármacos que incluyen los péptidos, exosomas o CTLs de la presente invención. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de: a: recolectar APCs. de un primer sujeto, b: poner en contacto las APCs de la etapa a, con el péptido, y c: administrar las APCs de la etapa b a un segundo sujeto.

El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser diferentes individuos. Las APGs obtenidas por la etapa b pueden formularse y administrar una vacuna para tratar y/o prevenir cáncer, tales como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer esofagal, cáncer gástrico, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLS, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, SCLC, tumor de tejido suave y tumor testicular, pero no se limitan a estos.

En el contexto de la presente invención, uno puede utilizar uno o más péptidos dé la presente invención para la fabricación de una composición farmacéutica para inducir una célula presentando un antigeno. Un método o proceso para la fabricación de una composición farmacéutica para inducir una célula presentando antigeno se proporciona en la presente y preferiblemente incluye la etapa de mezclar o formular el péptido de la invención con un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona para el uso del péptido de la presenté invención para inducir una célula presentando antigeno.

De acuerdo a un aspecto de la presente invención, las APCs de la presente invención tienen una capacidad de inducción de CTL. En - el contexto de las APCs, la frase "inducción de CTL" se refiere a la habilidad de una APC de inducir CTL cuando se pone en contacto con una célula T positiva CD8. Además, "inducción de CTL" incluye la habilidad de una APC para inducir activación de CTL, proliferación de CTL, promover lisis de una célula objetivo por un CTL, e incrementar la producción IFN-gamma por un CTL. En particular, las APCs de la presente invención tienen una habilidad para inducir CTLs específicos para TOPK.

Tales APCs que tienen un alto nivel de capacidad de inducción de CTL pueden prepararse por un método que incluye la etapa de transferir un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención a APCs in vitro así como ¦ el método mencionado arriba. Los polinucleótidos introducidos pueden estar en la forma de ADNs o ARNs. Pueden usarse ejemplos de métodos para introducción incluyen, sin limitaciones particulares, varios métodos realizados convencí onalmente en este campo, tales como método de . lipofección, electroporación, y fosfato de calcio. Más específicamente, pueden realizarse como se describe en Cáncer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional No. 2000-509281. Al transferir el gen en APCs, el gen experimenta transcripción, traducción, y similares en la célula, y luego la proteina obtenida se procesa por MHC Clase l o Clase II, y procede a través de una trayectoria de presentación para presentar los péptidos de la presente invención. Alternativamente, las APCs de la presente invención pueden prepararse por un método que induce la etapa de contactar APCs con el péptido de la presente invención.

En algunas modalidades, las APCs de la presente invención son APCs que presentan complejos de antigeno HLA-A24 o HLA-A2 y el péptido de la presente invención en su superficie. En modalidades típicas, la APC de la presente invención presenta un complejo de un péptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27, o 28 (o péptido modificado del mismo) y HLA-A24 en su superficie. En otras modalidades, la APC de la presente invención presenta un complejo de un péptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 o 76 ·,? péptido modificado de las mismas) y hí..h-A en r.u supéríicie .

VII. Linfocitos T citotóxicos (CTLs) Un CTL inducido contra uno cualquiera de los péptidos de la presente invención refuerza la respuesta inmunitaria atacando células de cáncer in vivo .y de esta manera puede usarse como vacunas, en una manera similar a los péptidos per se. De esta manera, la presente invención proporciona CTLs aislados que se inducen o activan específicamente por uno cualquiera de los péptidos de la presente invención.

Tales CTLs pueden obtenerse por ; (1) administrar los péptidos de la presente invención a un sujeto o (2) poner en contacto (estimular) APCs derivados del sujeto, y células CD8 positivas, o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con los péptidos de la presente invención o (3) poner en contacto células T CD8 positivas o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con las APCs o exosomas que presentan un- complejo de un antigeno HLA y el péptido en su superficie o (4) introducir un polinucleótido/polinucleótidos que codifica subunidades del receptor de célula T (TCR) que puede formar un TCR que tiene la habilidad para enlazar a un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la presente invención en una superficie celular. Tales APCs o exosomas pueden prepararse para el método de (3) por los métodos descritos arriba. Los detalles del método de (4) se describen enseguida en la sección "VIII.

Receptor de célula T (TCR) " .

Los CTLs de la presente invención pueden ser derivados de pacientes quienes se han sometido a tratamiento . y/o prevención, y pueden administrarse por si mismos o en combinación con otros fármacos que incluyen los péptidos, APC, o exosomas para el propósito de efectos reguladores. Los CTLs obtenidos actúan específicamente contra células objetivo que presentan los péptidos de la presente invención, por ejemplo, los mismos péptidos usados para inducción. Las células objetivo pueden ser células que expresan endógenamente TOPK, tales como células de cáncer, o células que son transfectadas con el gen TOPK; y células que presentan un péptido de la presente invención en la superficie celular debido a que la estimulación por el péptido también puede servir como objetivos del ataque CTL activado.

En algunas modalidades, los CTLs de la presente invención son CTLs que ¦ reconocen células que presentan complejos de antígeno HLA-A24 o HLA-A2 y el péptido de la presente invención en su superficie. En el contexto de CTLs, la frase "reconoce una célula" se refiere a enlazar un complejo de un antígeno HLA-A24 o HLA-A2 y el péptido de la presente invención en la superficie celular por medio de su TCR y mostrar actividad citotóxica específica contra la célula. En la presente "actividad citotóxica especifica" se refiere a mostrar actividad citotóxica contra la célula que presenta un complejo de antigeno HLA-A24 o HLA-A2 y eL péptido de la presente invención pero no otras células. Por consiguiente, los CTL que. muestran actividad citotóxica especifica contra una célula presentando péptido de la presente invención se incluyen en la presente invención.

En modalidades típicas, . el CTL de la presente invención puede reconocer una célula presentando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27 o 28 (o péptido modificado de las mismas) por medio de un HLA-A24. En modalidades preferidas, tal CTL de la presente invención puede reconocer una célula expresando TOPK y un HLA-A24 (por ejemplo, HLA-A24 célula positiva de cáncer) .

En otras modalidades, el CTL de la presente invención puede reconocer una célula presentando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 o 76 (o péptido modificado de las mismas) por medio de un HLA A2. En modalidades preferidas, tal CTL de la presente invención puede reconocer una célula expresando TOPK y un HLA-A2 (por ejemplo, HLA-A2 célula positiva de cáncer) .

VIII. Receptor de células T (TCR) La presente invención también proporciona una composición que incluye uno o más polinucleótidos que codifican polipéptidos que son capaces de formar una subunidad de un receptor- de célula T (TCR) , y métodos para usar la misma. Tales subunidades TCR tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a células T contra células de tumor que expresan TOPK. Al usar los métodos conocidos en la técnica, el polinucleótido que codifica cada una de las cadenas alfa y beta como las subunidades TCR del CTL inducido con los péptidos de la presente invención puede identificarse ( O2007/032255 y Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Por ejemplo, los métodos PCR se prefieren para analizar las secuencias de nucleótidos que codifican las subunidades TCR. Los cebadores PCR para el análisis pueden ser, por ejemplo, cebadores 5'-R (5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3') (SEQ ID NO: 87) como un cebador lateral 5' y cebadores 3-TRa-C (5' -tcagctggaccacagccgcagcgt-3' ) (SEQ ID NO: 89) específicos para región C de cadena alfa TCR (SEQ ID NO: 82) , cebadores 3-TRb-Cl (5' -tcagaaatcc.tttctcttgac-3' ) específicos para región Cl de cadena beta TCR o cebadores 3-TRbeta-C2 (5' -ctagcctctggaatcctttctctt-3' ) (SEQ ID NO: 90) específicos para región C2 de cadena beta TCR como cebadores laterales 3', pero no se limita a estos. Los TCRs derivados pueden enlazar células objetivo representando el péptido TOPK con alta avidez, y opcionalmente median de forma eficiente la eliminación de células objetivo que presentan el péptido TOPK de la presente invención in vivo e in vitro.

El polinucleótido/polinucleótidos que codifican las subunidades TCR (esto es, el polinucleótido que codifica tanto subunidades TCR como polinucleótidos que codifica cada una de las subunidades TCR) pueden ser incorporados en vectores apropiados, 'por ejemplo, vectores retroviricos . Estos vectores son bien conocidos en la técnica. Los polinucleótidos o los vectores que los incluyen pueden transferirse de forma útil en una célula T (por ejemplo, célula T CD8-positiva) , por ejemplo, una célula T de un paciente. Ventajosamente, la presente invención proporciona una composición genérica que permite la modificación rápida de las células propias del paciente (o aquellas de otro mamífero) para producir .rápidamente y fácilmente células T modificadas que tienen propiedades excelentes de eliminación de células de cáncer.

El TCR específico contra los péptidos de la presente invención debe de ser capaz de reconocer específicamente un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA, dando una actividad específica de célula T contra la célula objetivo presentando un complejo del péptido de la presente invención y un antigeno HLA cuando el TCR se expresa en la superficie de la célula T. La actividad requisito puede confirmarse por cualquiera de los métodos conocidos, que CTL preparó introduciendo los polipéptido ( s ) que codifica tales subunidades TCR pueden específicamente reconocer tales células objetivo. Los ejemplos preferidos de tal método incluyen, por ejemplo, análisis de tetrámero usando moléculas HLA y los péptidos de la presente invención, y ensayo ELISPOT. Realizando el ensayo ELISPOT, se puede confirmar que CTLs preparados por el- método como se describe arriba pueden específicamente reconocer las células objetivo, y que las señales generadas por tal reconocimiento transmitidas intracelularmente . Además, puede confirmarse mediante un método conocido que los CTLs preparados por el método descrito anteriormente tiene actividad citotóxica contra las células objetivo. Los ejemplos de tales métodos incluyen, por ejemplo ensayo de liberación de cromo al usar células que expresan ambos de TOPK y HLA-A24 o HLA-A2.

En un aspecto, la presente invención proporciona CTLs que son preparadas por transducción con el polipéptido/polipéptidos que codifica los polipéptidos de subunidad TCR (esto es, el polinucleótido que codifica tanto las subunidades TCR como los polinucleótidos que codifica cada una de las subunidades TCR) , en donde el TCR formado por tales subunidades puede enlazar a un complejo del péptido TOPK teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 a 40 y un antígeno HLA-A24 en la superficie celular, o puede enlazar a un complejo del péptido TOPK que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a 84 y un antigeno HLA-A2 en la superficie celular.

Los CTLs transducidos son capaces de alojar a las células de cáncer in vivo, y pueden expandirse por métodos de cultivo bien conocidos in vitro (por ejemplo, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Los CTLs de la presente invención pueden usarse para formar una composición inmunogénica útil en tratamiento y/o prevención de cáncer en un paciente que necesita de terapia o protección (Ver WO2006/031221 los contenidos de la cual se incorporan para referencia en la presente) .

IX. Agentes o composiciones farmacéuticas Ya que la expresión de TOPK se eleva específicamente en cánceres, ejemplos de los cuales incluyen, pero no necesariamente se limitan .a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLS, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC y tumor de tejido suave, como se compara con el tejido normal, los péptidos o polinucleótidos · de la presente invención pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer y asi servir para tratar y/o prevenir el cáncer y/o para prevenir una recurrencia metastática o postoperativa del mismo. Asi, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas o agentes formulados para el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia postoperativa de la misma, tales composiciones o agentes incluyen uno o más de los péptidos, o polinucleótidos de la presente invención como uno o más ingredientes activos. Alternativamente, los péptidos ' de la presente invención pueden expresarse en la · superficie de cualquiera de los exosomas anteriores o ' células, tal como APCs, para el uso como composiciones farmacéuticas o agentes. Además, los CTLs antes mencionados que tiene como objetivo cualquiera de los péptidos de la presente invención también pueden usarse como el ingrediente activo de las composiciones o agentes farmacéuticos presentes.

En consecuencia, la presente invención proporciona agentes o composiciones que incluyen al menos un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) uno o más péptidos de la presente invención; (b) uno o más polinucleótidos que codifican tal péptido como se describe en la presente invención en una forma que se puede expresar; (c) una o más APCs o un exosomas de la presente invención; y (d) uno o más CTLs de. la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas o agentes de la presente invención también encuentran uso como una vacuna. En el contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (también referida como una "composición inmunogénica") se refiere a un agente o composición que tiene la función de mejorar, aumentar e/o inducir inmunidad anti-tumor durante la inoculación en un animal. En otras palabras, la presente invención proporciona los agentes o composiciones farmacéuticas para, inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer en un sujeto.

Las composiciones farmacéuticas o agentes de la presente invención pueden usarse para tratar y/o prevenir cáncer, y/o prevenir la recurrencia postoperativa* o metastática del mismo en sujetos o pacientes. Los ejemplos de tales sujetos incluyen humanos asi como también otros mamíferos incluyendo, pero no limitado a ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, gatos, perros, ovejas, cabra, cerdos, ganado, caballos, monos, babuinos, y chimpancés, particularmente animales comercialmente importantes o animales domesticados.

En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para la administración a un sujeto cuyo antigeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona el uso de un ingrediente activo en la manufactura de una composición farmacéutica o agente para el tratamiento y/o prevención del cáncer o tumor, y/o prevenir una recurrencia post-operativa del mismo, dicho ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que codifica tal péptido de la presente invención en una forma que se puede expresar; (c) un APC presentando un péptido de la presente invención en su superficie; (d) un exosoma presentando- un péptido de la presente invención en su superficie.; (e) una célula T citotóxica de la presente invención Alternativamente, la presente invención además proporciona un ingrediente activo para su uso en cualquiera o ambos del tratamiento y/o prevención de cánceres o tumores, y/o prevención de una recurrencia post-operatoria de los mismos, dicho ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que codifica tal péptido de la presente invención en una forma que se puede expresar; (c) un APC presentando un péptido de la presente invención en su superficie; (d) un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) una célula T citotóxica de la presente invención.

Alternativamente, la presente invención proporciona además un método o proceso para fabricar una sustancia o composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cáncer o tumor, y/o prevención de una recurrencia post-operativa del mismo, en donde el método o proceso incluye la etapa de formular un vehículo farmacéuticamente o fisiolóqicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que codifica tal péptido de la presente invención en una forma que se puede expresar; (c) un APC presentando un péptido de la presente invención en su superficie; (d) un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; (e) una célula T citotóxica de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método o proceso para fabricar una composición o agente farmacéutico para tratar o prevenir un cáncer o tumor, y/o prevención de una recurrencia post-operat iva del mismo, en donde el método o proceso incluye las etapas de mezclar un ingrediente activo con un portador farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo es seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que codifica tal péptido de la presente invención en una forma que se puede expresar; (c) un APC presentando un péptido de la presente invención en su superficie; (d) un exosoma presentando un péptido de la presente invención en su superficie; y (e) una célula T citotóxica de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método para tratar y/o prevenir cáncer de tumor, y/o prevención de una recurrencia post-operativa de los mismos, en donde el método comprende la etapa de administrar a un sujeto al menos un ingrediente activo seleccionado de entre; (a) un péptido de la presente invención; (b) un polipéptido que codifica un tal péptido de la presente invención en una forma que se puede expresar; (c) un APC presentando un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) un exosoma presentando un péptido de la presente invención en su superficie; y (e) una célula T citotóxica de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, los péptidos que tienen la secuencia de. aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2 a 40 pueden ser péptidos de epitopo restringido HLA-A24. Entre estos péptidos, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionados de entre SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28 pueden potencialmente inducir respuesta inmunitaria especifica y potente contra cáncer expresando HA-A24 y TOPK en un sujeto. Similarmente, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a 84 pueden ser péptidos de epitopo restringido HLA-A2. Entre estos péptidos, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 Y 76 pueden efectivamente inducir respuesta inmunitaria especifica y potente contra cáncer expresando HLA-A2 y TOPK en un sujeto. Por lo tanto, las composiciones o agentes farmacéuticos que incluyen cualquiera de estos péptidos con la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 a 40 (especialmente SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27 y 28) y péptidos modificados de los mismos son particularmente idóneos para la administración a sujetos cuyo antigeno HLA es HLA-A24. Similarmente, las composiciones o agentes farmacéuticos que incluyen cualquiera de los péptidos con la secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a 84 (especialmente SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76) los péptidos modificados.de los mismos son particularmente idóneos para la administración a sujetos cuyo antigeno · HLA es HLA-A2. Lo mismo aplica a composiciones o agentes farmacéuticos que contienen polinucleótidos que codifican cualquiera de estos péptidos (es decir, los polinucleótidos de la presente invención) .

Los cánceres a tratarse por las composiciones o agentes farmacéuticos de la presente invención incluyen todos los tipos de cánceres en donde TOPK está involucrado, incluyendo, pero no limitado a AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave.

Las composiciones o agentes farmacéuticos de la presente invención pueden contener además de los ingredientes activos anteriormente mencionados, otros péptidos que tienen la capacidad para inducir CTLs contra células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, y similares. Los ejemplos de "otros" péptidos que tienen la capacidad para inducir CTLs contra células cancerosas incluyen, pero no se limitan a, cánceres por antigenos específicos de cáncer (por ejemplo, TAAs identificados) .

Si fuera necesario, las composiciones o agentes farmacéuticos de la presente invención pueden opcionalmente incluir otras sustancias terapéuticas como un ingrediente activo adicional, de manera que la sustancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, por ejemplo, cualquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir sustancias antiinflamatorias, eliminadores de dolor, quimioterapéuticos, y similares. Además de incluir otras sustancias terapéuticas en el medicamento mismo, los medicamentos de la presente invención también pueden administrarse secuencialmente o concurrentemente con uno o más de otras composiciones farmacológicas. Las cantidades de medicamento y composición farmacológica dependen, por ejemplo, de qué tipo de composiciones farmacológicas se usan, la enfermedad a tratarse, y el programa y vías de administración.

Las personas expertas en la técnica reconocerán, además de los ingredientes particularmente mencionados en la presente, las composiciones o agentes farmacéuticos de la presente invención pueden incluir otras sustancias convencionales en la técnica que tienen referencia al tipo de formulación en cuestión, (por ejemplo, rellenos, aglutinantes, diluyentes, excipientes, etc. ) .

En una modalidad de la presente invención, las composiciones o agentes farmacéuticos de la presente invención pueden incluirse en articulos de fabricación y kits que contienen materiales útiles para tratar las condiciones patológicas de la enfermedad a tratarse, por ejemplo, cáncer. El articulo de fabricación puede incluir un recipiente de cualquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas actuales con una etiqueta. Los recipientes apropiados incluyen botellas, viales, y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el recipiente debiera indicar que la composición o agente se usa para el tratamiento o prevención de una o más condiciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar instrucciones para administración etc.

Además del recipiente descrito arriba, un kit que incluye un agente o composición farmacéutica de la presente invención puede además opcionalmente incluir un segundo recipiente que aloja un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede además incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque con instrucciones para uso. Las composiciones o agentes farmacéuticos pueden, si se desea, presentarse en un empaque o dispositivo dispensador que puede contener uno o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El empaque puede, por ejemplo, incluir laminado de metal o plástico, tales como un empaque en blister (tipo burbuja). El empaque o dispositivo dispensador puede acompañarse con instrucciones para administración. (1) Agentes o composiciones que contienen péptidos como el ingrediente activo: Los péptidos de esta invención pueden administrarse directamente como un agente o composición farmacéutica, o si es necesario, pueden formularse por métodos de formulación convencionales. En el último caso, además de los péptidos de esta invención, pueden incluirse vehículos, excipientes, y demás que son usados ordinariamente por fármacos como sea apropiado sin limitaciones particulares. Los ejemplos de tales . vehículos incluyen pero no se limitan a, agua esterilizada, solución salina fisiológica, solución amortiguada en fosfato, fluido de cultivo y demás. Adicionalmente, las composiciones o agentes farmacéuticos pueden contener como sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservadores, tensoactivos y demás. Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para propósitos anticáncer.

Los péptidos de la presente invención pueden prepararse como una combinación compuesta de dos o más de los péptidos de la presente invención, para inducir CTLs in vivo. La combinación de péptido puede tomar la forma de un cóctel o pueden conjugarse uno al otro usando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos pueden ligarse químicamente o expresarse como una secuencia de polipéptido de fusión sencilla. Los péptidos en la combinación pueden ser los mismos o diferentes. Al administrar los péptidos de la presente invención, los péptidos se presentan en una alta densidad por los antígenos HLA en APCs, entonces se inducen CTLs que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido exhibido y el antígeno HLA. Alternativamente, APCs (por ejemplo, DCs) se remueven de sujetos y luego se estimulan por los péptidos de la presente invención para obtener APCs que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención en su superficie celular. Estos APCs se vuelven a administrar a los sujetos para inducir CTLs en los sujetos, y como un resultado, puede incrementarse la agresividad hacia el endotelio asociado con tumor.

Las composiciones o agentes farmacéuticos para el tratamiento y/o prevención de cáncer, que contienen cualquier péptido de la presente invención como el ingrediente activo también pueden incluir un adyuvante conocido para establecer efectivamente inmunidad celular. Alternativamente, las composiciones o agentes farmacéuticos pueden administrarse con otros ingredientes activos, o administrarse por formulación en gránulos . Un adyuvante se refiere a un compuesto que aumenta la respuesta inmunitaria contra la proteina cuando se administra en conjunto (o sucesivamente) con la proteina que tiene actividad inmunológica . Los adyuvantes contemplados en ·. la presente incluyen aquellos descritos en la literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Los ejemplos de adyuvantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, fosfato, de aluminio, hidróxido de aluminio, alumbre, toxina de cólera, toxina de salmonella, IFA (adyuvante de Freund incompleto) , ISCOMatriz, GM-CSF, CpG, emulsión 0/W y similares. Adicionalmente, pueden usarse convenientemente las formulaciones de liposoma, formulaciones granulares en las cuales el péptido está enlazado a perlas de pocos micrómetros de diámetro, y formulaciones en las cuales el lípido está enlazado al péptido.

En otra modalidad de la presente invención, los péptidos de la presente invención también pueden administrarse en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de sales incluyen sales con un metal alcalino, sales con un metal, sales con una base orgánica, sales con un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido propinico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metasulfónico y sucesivamente) y sales con un ácido inorgánico (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico y sucesivamente) . Como se usa en la presente, la frase "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que mantienen la efectividad y propiedades del compuesto y que se obtienen por reacción con ácidos o bases inorgánicas tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, . ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares.

En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden además incluir un componente que ceba CTLs. Los lípidos se han identificado como sustancias capaces de cebar CTLs in vivo contra antígenos víricos. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico pueden unirse a los grupos amino épsilon y alfa de un residuo de lisina y luego ligarse al péptido de la invención. El péptido lipidado puede entonces administrarse ya sea directamente en una micela o partícula, incorporarse en una liposoma, o emulsionarse en un adyuvante. Como otro ejemplo de cebado de lípido de respuesta CTL, las lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS) pueden usarse para cebar CTLs cuando se enlazan covalentemente a un péptido apropiado (ver, por ejemplo, Deres et al., Nature 1989, 342:561-4) . .

Los ejemplos de métodos idóneos de administración pueden incluir, pero no necesariamente limitarse a, ser oral, intradérmico, subcutáneo, intramuscular, intraóseo, peritoneal, e inyección intravenosa, o tal, y administración sistémica o administración local a la vecindad de los sitios objetivo (por ejemplo, inyección directa). La administración puede realizarse por administración sencilla o estimulada por administraciones múltiples. La dosis de los péptidos de la presente invención puede ajustarse apropiadamente de acuerdo con la enfermedad a tratarse, edad del paciente, peso, método de administración, y demás, y ordinariamente es 0.001 mg hasta 1000 mg, por ejemplo, 0.01 mg hasta 100 mg, por ejemplo, 0.1 mg hasta 10 mg-, por ejemplo, 0.5 mg a 5 mg y puede administrarse una vez en unos pocos días hasta algunos meses. Alguien experto en la técnica puede fácilmente determinar una dosis idónea y dosis óptimas. (2) Los agentes o composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo Las composiciones o agentes farmacéuticos de la presente invención también pueden contener ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la presente invención en una forma que se puede expresar. En la presente, la frase "en una forma que se puede expresar" significa que el polinucleótido, cuando se introduce en una célula, se expresará in vivo como un polipéptido que induce inmunidad anti-tumor. En una modalidad ilustrativa, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye elementos reguladores necesarios para expresión del polinucleótido. Los polinucleótidos pueden equiparse de manera que alcancen inserción estable en el genoma de la célula objetivo (ver, por ejemplo, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 para una descripción de vectores de cásete de recombinación homólogos. Ver, por ejemplo, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; Patente de E.U.A. Nos. 5,580,859; 5, 589, 466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; y O 98/04720.

Los ejemplos de tecnologías de suministro basada en ADN incluyen "ADN desnudo", suministro facilitado (mediado por bupivacaína, polímeros, péptido) , complejos lípido catiónicos, y suministro mediado por presión o mediado por partícula ("pistola de genes") (ver, por ejemplo, Patente E.U.A. No. 5, 922, 687) . ' Los péptidos de la presente invención también pueden expresarse por vectores víricos o bacterianos. Los ejemplos de vectores de . expresión incluyen hospederos víricos atenuados, tales como vacuna o viruela aviar. Este enfoque involucra el uso de virus de vacuna, por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. Durante la introducción en un hospedero, el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y · por ello produce una respuesta inmunitaria. Los vectores de vacuna y métodos útiles en protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, Patente E.U.A. No. 4,722,848. Otro vector es BCG (Bacilo de Calmette Guerin) . Los. vectores BCG se describen en Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización, por ejemplo, vectores de virus adeno y asociados con adeno,. vectores retroviricos, vectores de Salmonella typhi, vectores ' de toxina de ántrax destoxificada, y similares, serán aparentes. Ver, por ejemplo, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

El suministro de un polinucleotido en un paciente puede ser ya sea directo, en cuyo caso el paciente se expone directamente a un vector que transporta el polinucleotido, o indirectamente, en cuyo caso, las células se transforman primero con el polinucleotido de interés in vitro, luego las células se trasplantan en el paciente. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapias de genes in vivo y ex vivo.

Para revisiones generales de los métodos de terapia de genes, ver Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; u y u, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33:573-96; Mulligan, Science 1993, 260:926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62:191-217; Trends in Biotechnology .1993, 11 ( 5 ): 155-215 ) . Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que son aplicables a la presente invención se describen por Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, 1993); y Krieger en Gene Transfer y Expression, A Laboratory Manual, (Stockton Press, NY, 1990) .

La administración similar de polinucleótidos puede realizarse oral, intradérmica, subcutánea, inyección intravenosa, intramuscular, intraósea, y/o inyección peritoneal, o tal, y por medio de administración sistémica o administración local a la vecindad de los sitios objetivo encuentra uso. La- administración puede realizarse por administración sencilla o estimulada por administraciones múltiples. La dosis del polinucleótido en el portador apropiado o células transformadas con el polinucleótido que codifican los péptidos de la presente invención pueden ajustarse apropiadamente, de acuerdo con la enfermedad a tratarse, edad del paciente, peso, método de administración, y demás, y ordinariamente es 0.001 mg hasta 1000 mg, por ejemplo, 0.01 mg hasta 100 mg, por ejemplo, 0.1 mg hasta 10 mg, por ejemplo, 0.5 mg a 5 mg y puede administrarse una vez cada algunos días hasta una vez cada algunos meses. Una persona experta en la técnica puede fácilmente determinar las dosis óptimas e idóneas.

X. Métodos de uso de los péptidos, polinucleótidos, exosomas APCs y CTLs Los péptidos y polinucleótidos de la. presente invención pueden usarse para preparar o inducir APCs y CTLs. Los exosomas y APCs de la presente invención también pueden usarse para preparar ó inducir CTLs. Los péptidos, polinucleotidos, exosomas y APCs pueden usarse en combinación con cualquier otro de los compuestos de manera que los compuestos no inhiben su capacidad de inducción de CTL. De esta manera, cualquiera de las composiciones o agentes farmacéuticos anteriormente mencionados de . la presente invención pueden usarse para preparar o inducir CTLs. Además de esto, aquellas que incluyen los péptidos o polinucleotidos también pueden usarse para preparar o inducir APCs como se discute enseguida. (1) Método para inducir células que presentan el antigeno (APCs) La presente invención proporciona métodos para inducir APCs con alta capacidad de inducción de CTL usando los péptidos o polinucleotidos de la presente invención.

Los métodos de la presente invención incluyen la etapa de poner en contacto APCs con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, el método de inducir APCs ex vivo puede incluir etapas de: a: recolectar APCs de un sujeto, y b: poner en contacto las APCs de la etapa a con el péptido de la presente invención.

Las APCs no se limitan a un tipo particular de células, Ejemplos de APCs incluyen, pero no se limitan a, DCs, células de Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, que se conocen por presentar antigenos proteinicos en su superficie celular de manera que pueden reconocerse por los linfocitos. Preferiblemente, pueden usarse DCs ya que tienen la capacidad de inducción de CTL más fuerte entre APCs. Cualquiera de los péptidos de la presente invención puede usarse por si mismo o en combinación con otros péptidos de la presente invención o péptidos que inducen CTLs derivados de TAAs diferente a TOPK.

Por otro lado, cuando los péptidos de la presente invención se administran a un sujeto, las APCs se ponen en contacto con los péptidos in vivo, y en consecuencia, las APCs con alta capacidad de inducción de CTL se inducen en el cuerpo del sujeto. De esta manera, el método de la presente invención puede incluir la etapa de administrar un péptido de la presente invención a un sujeto para inducir un APC con capacidad de inducción CTL en el cuerpo del sujeto. Similarmente, cuando los polinucieótidos de esta invención se administran a un sujeto en una forma que se puede expresar, los péptidos de la presente invención se expresan y ponen en contacto con APCs in vivo, y en consecuencia, las APCs con alta capacidad de inducción de CTL se inducen en el cuerpo del sujeto. De esta manera, los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de administrar un polinucleótido de la presente invención a un sujeto para inducir un APC con capacidad de inducción CTL en el cuerpo del sujeto. La frase "forma que se puede expresar" se describió arriba en la sección "IX". Los agentes o composiciones farmacéuticas (2).

"Agentes o composiciones que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo".

Alternativamente, los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de introducir un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención en un APC para inducir un APC con inducción CTL. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de: a: recolectar APCs de un sujeto, e b: introducir un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención en el APC de la etapa a.

La etapa b puede realizarse como se describe arriba en la sección "VI. Células que presentan el antigeno".

Alternativamente, los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de preparar una célula que presenta antigeno (APC) que induce específicamente la actividad CTL contra TOPK, en donde el método puede incluir una de las siguientes etapas: . (a) poner en contacto un APC con un péptido de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo, y (b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención en un APC.

Alternativamente, los métodos, de la presente invención pueden servir para inducir un APC que tiene capacidad de inducción CTL, tales métodos incluyen una etapa seleccionada de entre: (a) poner en contacto un APC con el péptido de la presente invención; (b) introducir el polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención en un APC.

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona el método de inducir o preparar un APC que tiene inducción CTL, tal método incluyendo una de las siguientes etapas: (a) contactar un APC expresando HLA-A24 con un péptido que tiene una secuencia de' aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 1 a 40 (específicamente SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27, y 28) o péptido modificado del mismo in vitro, ex vivo o in vivo; y (b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 2 a 40 (especialmente SEQ ID Nos: 2, 3, 6, 27 y 28) o péptido modificado del mismo en un APC expresando HLA-A2.

Los APCs inducidos por el método anterior presentan tales péptidos por medio de HLA-A24 en sus superficies; y pueden inducir CTLs que tiene citotoxicidad especifica contra células que expresan HLA-A24 y TOPK.

En otra modalidad, la presente invención proporciona el método de inducir o preparar un APC que tiene inducción CTL, tal método incluyendo una de las siguientes etapas: (a) contactar un APC expresando HLA-A2 con un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a 84 (especialmente, SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76) o péptido modificado del mismo in vitro, ex vico o in vivo; y (b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42 a 84 (especialmente SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76) o péptido modificado del mismo en un APC expresando HLA-A2.

Los APC inducidos por el método anterior presentan tales péptidos por medio de HLA-A2 en su superficie, y pueden inducir CTLs que tiene actividad citotóxica especifica contra las células que expresan HLA-A2 y TOPK.

Los métodos de la. presente invención pueden llevarse a cabo in vitro, ex vivo o in vivo. Preferiblemente, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo in vitro o ex vivo. Los APCs usados para inducción de APCs que tienen capacidad de inducción CTL pueden ser preferiblemente APCs que expresan antigeno HLA-A24 o HLA-A2. Tales APCs pueden prepararse por. los métodos bien conocidos en las técnicas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un sujeto cuyo antigeno HLA es JLA-A24 o HLA-A2.. Los APC inducidos por el método de la presente invención pueden ser APCs que presentan un complejo del péptido de la presente invención y antigeno HLA (antigeno HLA-A24 o HLA-A2) en su superficie. Cuando los APCs inducidos por el método de la presente invención se administran a un sujeto con objeto de inducir respuestas inmunitarias contra cáncer en el sujeto, el sujeto preferiblemente es el mismo del cual se derivan los APCs. Sin embargo, el sujeto puede ser uno diferente del donador APC en la medida en que el sujeto tenga el mismo tipo de HLA con el donador APC.

En otra modalidad, la presente invención proporciona agentes o composiciones para uso en inducir un APC que tiene capacidad de inducción CTL, y tales agentes o composiciones incluyen uno o más péptidós o polinucleótidos de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso del péptido de la presente invención o el polinucleótido que codifica el péptido en la fabricación de un agente o composición formulado para inducir APCs.

Alternativamente, la presente invención proporciona además el péptido de la presente invención o el polipéptido que codifica el péptido para usar en inducir un APC que tiene capacidad de inducción CTL. (2) Método para inducir CTLs La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs usando los péptidos, pclinucleótidos, o exosomas o APCs de la presente invención.

La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs usando un polinucleótido/polinucleótidos que codifica polipéptidos (esto es, subunidades) que son capaces de formar un receptor de células T (TCR) que es capaz de reconocer un complejo del péptido de la presente invención y un antigeno HLA. Preferiblemente, los métodos para inducir CTLs incluyen al menos una etapa seleccionada . el grupo que consiste de: a: poner en contacto una célula T CD8 positiva con una célula que presente el antigeno que presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y un péptido de la presente invención; b: contactar una célula T CD8-positiva con un exosoma que presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y un péptido de la presente invención; y c: introducir, un polinucleótido/polinucleótidos que codifica polipéptidos que son capaces de formar un TCR que es capaz de reconocer un complejo de un péptido de la presente invención y un antigeno HLA en una célula T CD8 positiva.

Cuando los péptidos, polinucleótidos, APCs, o exosomas de la presente invención se administran a un sujeto, se inducen los CTL en el cuerpo del sujeto, y la fuerza de la respuesta inmunitaria dirigida a las células de cáncer que expresa TOPK se aumenta. De esta manera, en lugar de la etapa anteriormente mencionada, los métodos de la presente invención incluyen la etapa de administrar los péptidos, los polinucleótidos, las APCs o exosomas de la presente invención a un suj eto .

Alternativamente, CTLs también pueden inducirse al usarlos ex vivo o in vivo, y después de inducir CTLs, los CTLs activados se regresan al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de: a: recolectar APCs del sujeto; b: poner en contacto las APCs de la etapa a, con el péptido de la presente invención; y c: co-cultivar las APCs de la etapa b con células T CD8 positivas.

Las APCs a co-cultivarse con las células T CD8. positivas en la etapa c anterior también pueden prepararse al transferir un polinucleotido de la presente invención en APCs como se describe arriba en la sección "VI. Células que presentan el antigeno"; aunque la presente invención no se limita a esto, y de esta manera abarca cualquiera de los APCs que efectivamente presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la presente invención.

Uno puede utilizar opcionalmente un exosoma que presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la presente invención en lugar de los APCs antes mencionados. Especialmente, la presente invención puede incluir la etapa de co-cultivar exosomas que presentan en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la presente invención. Tales exosomas pueden prepararse por los métodos descritos arriba en la sección "V. Exosomas". Los APCs idóneos y exosomas para el método de la presente invención presentan un complejo del péptido de la presente invención y HLA-A24 o HLA-A2 en su superficie. Por ejemplo, un APC o exosoma que presenta un complejo de un HLA-A24 y un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos.: 2, 3> 6, 27 y 28 (o péptido modificado del mismo) en su superficie preferiblemente se utiliza para inducir un CTL que tiene una actividad citotóxica especifica contra una célula que expresa HLA-A24 y TOPK. Similarmente, un APC o exosoma que presenta un complejo de un HLA-A2 y un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID Nos: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 (o péptido modificado del mismo) en su superficie puede preferiblemente utilizarse para inducir un CTL que tiene actividad citotóxica especifica contra una célula que expresa HLA-A2 y TOPK.

Además, el CTL de la presente invención puede inducirse introduciendo en una célula T CD8-positiva un polinucleótido/polinucleótidos que codifica las subunidades TCR, en donde el TCR formado por tales subunidades TCR es capaz de enlazar a un complejo de un antigeno HLA y el péptido de la invención en una superficie celular. Tal transducción puede realizarse como se describe anteriormente en la sección "VIH. Receptor celular (TCR)".

Los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo in vitro, ex vivo o in vivo. Preferiblemente, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo in vitro o ex vivo. Las células T CD8 positivas usadas para inducción de CTLs pueden prepararse por los métodos bien conocidos en la técnica a partir de PBMCs obtenidos de un sujeto. En modalidades preferidas, el donador para células T CD8 positivas puede ser un sujeto cuyo antigeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2. Los CTLs inducidos por los métodos de la presente invención pueden ser CTLs que pueden reconocer células que presentan un complejo del péptido de la presente invención y antigeno HLA en su superficie. Tales CTLs pueden mostrar actividad citotóxica especifica contra células que presentan el péptido de la presente invención en su superficie, y por lo tanto, pueden mostrar actividad citotóxica especifica contra células que expresan TOPK (por ejemplo, células de cáncer). Cuando los CTLs inducidos por el método de la presente invención se administran a un sujeto con objeto de inducir respuestas inmunitarias contra el cáncer en el sujeto, el sujeto preferiblemente es el mismo del cual se derivan las células T CD8 positivas. Sin embargo, el sujeto puede ser uno diferente del donador de célula T CD8 positiva en tanto el sujeto tenga el mismo tipo HLA con el donador de célula T CD8 positivo.

Además, la presente invención proporciona un método o proceso para fabricar un agente o composición farmacéutica que induce CTLs, en donde el método incluye la etapa de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un agente o composición para inducir CTL, en donde el agente o composición comprende uno o más péptidos, uno o más polinucleótidos, o uno o más APCs o exosomas de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso del péptido, el polinucleótido, o APC o exosoma de la presente invención en la fabricación de un agente o composición formulado para inducir un CTL.

Alternativamente, la presente invención proporciona además el péptido, el polinucleótido, o APC o exosoma de la presente invención para uso en inducir un CTL.

XI. Métodos para inducir, respuesta inmunitaria Por otra parte, la presente invención proporciona métodos para inducir respuesta inmunitaria contra enfermedades relacionadas con TOPK. Las enfermedades contempladas incluyen cáncer, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave.

Los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de administrar sustancias o composiciones que contienen cualquiera de los péptidos de la presente invención o polinucleótidos que los codifican. Alternativamente, el método de la presente invención también incluye la etapa de administrar exosomas o APCs que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención. Para detalles, ve el articulo de "IX. Composiciones farmacéuticas", particularmente la parte que describe el uso de las composiciones farmacéuticas de la presente invención como vacunas. Además, los exosomas y APCs que pueden emplearse para los métodos actuales para inducir respuesta inmunitaria se describen en detalle bajo los artículos de "V. Exosomas", "VI. Células que presentan antígeno (APCs)", y (1) y (2) de "X. Métodos que usan los péptidos, exosomas, APCs y CTLs", supra.

La presente invención también proporciona un método o proceso para fabricar un agente o composición farmacéutica que induce una respuesta inmunitaria contra el cáncer, en donde el método puede incluir la etapa de mezclar o formular el péptido o polinucleótido de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Alternativamente, el método para la presente invención puede incluir la etapa de administrar una vacuna o agente o composición farmacéutica de la presente invención que contiene : (a) un péptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que codifica el péptido de la presente en una forma que se puede expresar; (c) un APC presentando un péptido de la presente invención en su superficie; (d) un exosoma presentando un péptido de la , presente invención en su superficie; o (e) una célula T citotóxica de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, un cáncer que sobre-expresa TOPK puede tratarse con estos ingredientes activos. Los ejemplos de tal cáncer incluye, pero no se limita a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma ' colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave. En consecuencia, antes de la administración de las vacunas o agentes o composiciones farmacéuticas que incluyen los ingredientes activos antes mencionados, es preferible confirmar si el nivel de expresión de TOPK en el sujeto a tratarse está potenciado. De esta manera, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar el TOPK (sobre) expresado en¦ cáncer en un paciente que necesita del mismo, tal método incluye las etapas de: i) determinar el nivel de expresión de TOPK en muestras biológicas obtenidas de un sujeto con el cáncer a tratarse; ii) comparar el nivel de expresión de TOPK con nivel de control normal; y iii) administrar al menos un componente seleccionado del grupo que consiste de' (a) hasta, (d) descrito arriba a un sujeto con la sobreexpresion de TOPK en cáncer comparado con el control normal.

Alternativamente, .la presente invención proporciona una vacuna o agente o composición farmacéutica que incluyen al menos un componente seleccionado del grupo que consiste de (a) hasta (d) descrito arriba, para administrarse a un sujeto que tiene la sobreexpresion de TOPK en cáncer. En otras palabras, la presente invención proporciona además un método para identificar un sujeto a tratarse con el polipéptido TOPK de la presente invención, tal método incluyen la etapa de determinar un nivel de expresión de TOPK en muestras biológicas derivadas del sujeto, en donde un incremento del nivel comparado con un .nivel de control normal del gen indica que el sujeto puede tener cáncer que puede tratarse con el polipéptido TOPK de la presente invención. Los métodos para tratar cáncer de la. presente invención se describirán en más detalle a continuación.

Cualquier tejido o célula' derivada del sujeto puede usarse para la determinación de expresión TOPK de manera que incluye el producto de transcripción o traducción objetivo de TOPK. Los ejemplos de muestras apropiadas incluyen, pero no se limitan a, tejidos y fluidos corporales, tales como sangre, esputo y orina- Preferiblemente, la muestra de tejido o célula derivada del sujeto contiene una población celular que incluye una célula epitelial, más preferiblemente una célula epitelial cancerosa o una célula epitelial derivada de tejido que se sospecha . que es canceroso. Además, si es necesario, la célula puede purificarse a partir de . los tejidos y fluidos corporales obtenidos, y luego se usa como la muestra derivada del sujeto.

Un sujeto a tratarse por el método actual preferiblemente es un mamífero. Los mamíferos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo, y vaca.

De acuerdo con la presente invención, puede determinarse el nivel de expresión de TOPK en una muestra biológica obtenida de un sujeto.. El nivel de expresión puede determinarse en el nivel de producto de transcripción (ácido nucleico), usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el mARN de TOPK puede cuantificarse usando sondas por métodos de hibridación (por ejemplo, hibridación Northern) . La detección puede llevarse a : cabo en un chip o una configuración. El uso de una configuración es preferible para detectar el nivel de expresión de TOPK. Aquellos experimentados en la técnica pueden preparar tales sondas utilizando la información de secuencia de TOPK. Por ejemplo, el cADN de TOPK puede, usarse como las sondas. Si es necesario, las sondas pueden etiquetarse con una etiqueta adecuada, tal como pigmentos, sustancias fluorescentes e isótopos, y el nivel de expresión del gen puede detectarse como la intensidad de las etiquetas hidridizadas .

Adicionalmente, el producto de transcripción de TOPK puede cuantificarse usando cebadores por métodos de detección basados en amplificación (por ejemplo, RT-PCR) . Tales cebadores pueden prepararse basados en la información de secuencia disponible del gen.

Específicamente, una sonda o cebador usado por el método actual se hibridiza' bajo condiciones severas, moderadamente severas, o de severidad baja para el mARN de TOPK. Como se usa en la presente, la frase "condiciones (hibridación) severas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda o cebador hibridizará a su secuencia objeto, pero no a otras secuencias. Las condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes bajo circunstancias diferentes. La hibridación específica de secuencias más largas se observa a temperaturas superiores que las secuencias más cortas . Generalmente, la temperatura de una condición severa se selecciona para ser alrededor de 5 grados centígrados inferior que el punto de fusión térmico (Tm) para una secuencia específica en una resistencia iónica definida y pH. La Tm es la temperatura (bajo una resistencia iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) en la cual 50% de las sondas complementarias a su secuencia objetivo hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio. Ya que las secuencias objetivo generalmente se presentan en exceso, una Tm, 50% de las sondas se ocupan en equilibrio. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que alrededor de 1.0 M ión de sodio, típicamente alrededor de 0.01 hasta 1.0 M ión de sodio (u otras sales) en pH 7.0 hasta 8.3 y la temperatura es al menos alrededor de 30 grados Centígrados para sondas o cebadores cortos (por ejemplo, 10 hasta 50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 grados Centígrados para sondas o cebadores más largos. Las condiciones severas también pueden alcanzarse con la adición de sustancias desestabilizantes, tal como formamida.

Una sonda o cebador de la presente invención es típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido típicamente incluye una región de secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas para al menos alrededor de 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, o 25, la secuencia de nucleótido de hebra de sentido consecutivo de un ácido nucleico que incluye una secuencia TOPK, o una secuencia de nucleótido de hebra antisentido de un ácido nucleico que incluye una secuencia TOPK, o de un mutante que se presenta naturalmente de estas secuencias. En particúlar, por ejemplo, en una modalidad preferida, puede usarse un oligonucleótido que tiene 5-50 de longitud como un cebador para amplificar los genes, para detectarse. Más preferiblemente, mARN o cADN de un gen TOPK puede detectarse con sonda de oligonucleótido o cebador de un tamaño especifico, generalmente 15-30b de longitud. El tamaño puede estar en el intervalo desde al menos 10 nucleótidos, al menos 12 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos, al menos 30 nucleótidos y las sondas y cebadores pueden estar en el intervalo en tamaño desde 5-10 nucleótidos, 10-15 nucleótidos, 15-20 nucleótidos, 20-25 nucleótidos y 25-30 nucleótidos. En modalidades preferidas, la longitud de la sonda o cebador de oligonucleótido puede seleccionarse desde 15-25. Los procedimientos, dispositivos, o reactivos del ensayo para la detección de gen al usar tal sonda o cebador de oligonucleótido son bien conocidos (por ejemplo microconfiguración de oligonucleótido o PCR) . En estos ensayos, sondas o cebadores también pueden incluir secuencias de ligadura o de etiqueta. Además, las sondas o cebadores pueden modificarse con ligando de afinidad o etiqueta detectable para capturarse. Alternativamente, en procedimientos de detección basados en hibridación, un polinucleótido que tiene unos pocos cientos (por ejemplo, alrededor de 100-200) bases hasta unos pocos kilos (por ejemplo, alrededor de 1000-2000) bases de longitud también pueden usarse para una sonda (por ejemplo, ensayo de tinción northern o análisis de microconfiguración cADN) .

Alternativamente, el producto de traducción puede detectarse para el diagnóstico de la presente invención. Por ejemplo, la cantidad de proteina TOPK (SEQ ID NO: 80) o el fragmento inmunológicamente del mismo puede determinarse. Los métodos para determinar la cantidad de la proteina como el producto de traducción incluyen métodos de inmunoensayo que usan un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína. El anticuerpo puede . ser monoclonal o policlonal. Adicionalmente, cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etc.) del anticuerpo puede usarse para la detección, de manera que el fragmento o anticuerpo modificado mantiene la capacidad de enlace a la proteína TOPK. Tales anticuerpos contra los péptidos de la presente invención y los fragmentos de los mismos también se proporcionan por la . presente invención. Los métodos para preparar estos tipos de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método puede emplearse en la presente invención para preparar tales anticuerpos y equivalentes de los mismos.

Como otro método para detectar el nivel de expresión del gen TOPK basado en su producto de traducción, la intensidad de tinción puede medirse por medio de análisis inmunohistoquímico usando un anticuerpo contra la proteina TOPK. Especialmente, en. esta medición, la tinción fuerte indica presencia/nivel incrementado de la proteina y, al mismo tiempo, alto nivel de expresión del gen TOPK.

El nivel de expresión de un gen objetivo, por ejemplo el gen TOPK, en células de cáncer pueden determinarse para incrementarse si el nivel incrementa del nivel de control (por ejemplo, el nivel en células normales) del gen objetivo por, por ejemplo, 10%, 25%, o 50%; o incrementos para más de 1.1 veces, más de 1.5 veces, más de 2.0 veces, más de 5.0 veces, más de 10.0 veces, o más.

El nivel de control puede determinarse al mismo tiempo como las células cáncer al usar las muestras previamente recolectadas y almacenadas de los sujetos cuyos estados de la enfermedad (canceroso o no canceroso) se conocen. Además, las células normales obtenidas de regiones no cancerosas de un órgano que tiene el cáncer a tratarse pueden usarse como control normal. Alternativamente, el nivel de control puede determinarse por un método estadístico basado en los resultados obtenidos al analizar previamente niveles de expresión determinados del gen TOPK en muestras de sujetos cuyos estados de la enfermedad se conocen. Adicionalmente, el nivel de control puede ser una base de datos de patrones de expresión de células previamente probadas. Por otra parte, de acuerdo a un aspecto de la presente invención, el nivel de expresión del gen TOPK en una muestra biológica puede compararse con niveles de control múltiples, que se determinan de muestras de referencia múltiples. Se prefiere usar un nivel de control determinado de una muestra de referencia derivada de un tejido tipo similar al de la muestra biológica derivada del sujeto. Por otra parte, se prefiere usar el valor estándar de los niveles de expresión del gen TOPK en una población con un estado de enfermedad conocido. El valor estándar puede obtenerse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un intervalo de media +/- 2 D.E. o media +/- 3 D.E. puede usarse como el valor estándar.

En el contexto de la presente invención, un nivel de control que se determina a partir de una muestra biológica que se conoce que no es cancerosa se refiere como un "nivel de control normal". Por otro lado, si el nivel de control se determina de una muestra biológica cancerosa, se refiere como un "nivel de control canceroso". La diferencia entre el nivel de expresión de una muestra y el nivel de control puede normalizarse hasta el nivel de expresión de ácidos nucleicos de control, por ejemplo, genes constitutivos, cuyos niveles de expresión se conocen que no difieren dependiendo del estado canceroso o no canceroso de la célula. Los genes de control ejemplares incluyen, pero no se limitan a, beta-actina, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, y proteina ribosomal Pl .

Cuando el nivel de expresión del gen TOPK se incrementa cuando se compara con el nivel de control normal, o es similar/equivalente al nivel de control canceroso, el sujeto puede diagnosticarse con cáncer a tratarse.

La presente invención proporciona también un método para (i) diagnosticar si un sujeto sospecha que tiene el cáncer a tratarse, y/o (ii) seleccionar un sujeto para tratamiento de cáncer, tal método incluye las etapas de: a) determinar el nivel de expresión de TOPK en muestras biológicas obtenidas de un sujeto que se sospecha que tiene el cáncer a tratarse; b) comparar el nivel de expresión de TOPK con un nivel de control normal; c) diagnosticar al sujeto como que tiene el cáncer a tratarse, si el nivel de expresión de TOPK se incrementa en comparación con el nivel de control normal; y d) seleccionar al sujetó para . tratamiento de cáncer, si el sujeto se diagnostica que tiene el cáncer a tratarse, en la etapa c) .

Alternativamente, tal método puede incluir las etapas de: a) determinar el nivel de expresión de TOPK en muestras biológicas obtenidas de un sujeto que se sospecha que tiene el cáncer a tratarse; b) comparar el nivel de expresión de TOPK con un nivel de control canceroso; c) diagnosticar al sujeto como que tiene el cáncer a tratarse, si el nivel de expresión de TOPK es similar o equivalente al nivel de control canceroso; y d) seleccionar al sujeto para tratamiento de cáncer, si el sujeto se diagnostica como que tiene el cáncer a tratarse, en la etapa c) .

La presente invención también proporciona un kit de diagnóstico para diagnosticar o determinar un sujeto que es o se sospecha que padece o. está en riesgo de desarrollar un cáncer que puede tratarse con el polipéptido TOPK de la presente invención, que también puede ser útil en cualquiera o ambos para evaluar y/o vigilar la eficacia o aplicabilidad de una inmunoterapia de cáncer. Preferiblemente, el cáncer incluye, pero no se limita a AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave. Más particularmente, el kit preferiblemente incluye al menos un reactivo para detectar la expresión del gen TOPK en una célula derivada del sujeto, cuyo reactivo puede seleccionarse del grupo de: (a) un reactivo para detectar mARN del gen TOPK; (b) un reactivo para detectar la proteína TOPK o el fragmento inmunológicamente del mismo; y (c) un reactivo para detectar la actividad biológica de la proteína TOPK, Los ejemplos de reactivos adecuados para detectar mARN del gen TOPK pueden incluir ácidos nucleicos que enlazan específicamente a o identifican el mARN TOPK, tales como oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria para una porción del mARN TOPK. Estos tipos de oligonucleótidos se ejemplifican por cebadores y sondas que son específicas para el mARN TOPK. Estos tipos de oligonucleótidos pueden prepararse basados en métodos bien conocidos en la técnica. Si se necesita, el reactivo para detectar el mARN TOPK puede inmovilizarse en una matriz sólida. Por otra parte, más de un reactivo para detectar el mARN TOPK puede incluirse en el kit.

Por otro lado, los reactivos ejemplos adecuados para detectar la proteína TOPK o el fragmento inmunológicamente de la misma incluyen anticuerpos para la proteina TOPK o el fragmento inmunológicamente de la misma. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Adicionalmente, cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etc.) del anticuerpo puede usarse como el reactivo, de manera que el fragmento o anticuerpo modificado mantiene la capacidad de enlace a la. proteína TOPK o el fragmento inmunológicamente de la misma. Los métodos para preparar estos tipos de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método puede emplearse en .la presente invención para preparar tales anticuerpos y equivalentes de los mismos. Adicionalmente, el anticuerpo puede etiquetarse con moléculas que generan la señal por medio de ligadura directa o una técnica de etiquetado indirecta. Las etiquetas y métodos para etiquetar anticuerpos y detectar el enlace de los anticuerpos a sus objetivos son bien conocidos en la técnica, y cualquiera de las etiquetas y métodos pueden emplearse para la presente invención. Por otra parte, más de un reactivo para detectar la proteína TOPK puede incluirse en el kit .

El kit puede contener más de uno de los reactivos antes mencionados. El kit puede incluir, además una matriz sólida y un reactivo para enlazar una sonda contra un gen TOPK o anticuerpo contra un péptido TOPK, un medio y recipiente para cultivar células, reactivos de control positivo y negativo, y un anticuerpo secundario para detectar un anticuerpo contra un péptido TOPK. Por ejemplo, las muestras de tejido obtenidas de sujetos sin cáncer o que padecen de cáncer, pueden servir como reactivos de control útiles. El kit de la presente invención puede incluir además otros materiales deseables de un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque (por ejemplo, escritos, en cinta, CD-ROM, etc.) con instrucciones para uso. Estos reactivos y tales pueden mantenerse en un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados pueden incluir botellas, viales, y tubos de prueba. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales, tal como vidrio o plástico.

En una modalidad de la presente invención, cuando el reactivo es una sonda contra el mARN TOPK, el reactivo puede inmovilizarse en una matriz sólida, tal como una tira porosa, para formar al menos un sitio de detección. La medición o región de detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios, cada uno contiene un ácido nucleico (sonda) . Una tira de prueba también puede contener sitios para controles negativos y/o positivos. Alternativamente, los sitios de control pueden localizarse en una tira separada de la tira de prueba. Opcionalmente, los sitios de detección diferentes pueden contener cantidades diferentes de ácidos nucleicos inmovilizados, esto es, una cantidad superior en el primer sitio de detección y cantidades menores en los sitios posteriores. En la adición de una muestra de prueba, el número de sitios que exhiben una señal detectable proporciona una indicación cuantitativa de la cantidad de mARN TOPK presente en la muestra. Los sitios de detección pueden configurarse en cualquier forma adecuadamente detectable y están típicamente en la forma de una barra o punto que no abarcan el ancho de la tira de prueba.

El kit de la presente invención puede incluir además una muestra de control positivo o muestra estándar TOPK. La muestra de control positivo de la presente invención puede prepararse al recolectar, muestras positivas TOPK y luego procesar por ensayo sus niveles TOPK. Alternativamente, una proteína o polinucleótido TOPK purificado puede agregarse a células que no expresan TOPK para formar la muestra positiva o la muestra estándar .TOPK. En la presente invención, TOPK purificado puede ser una proteína recombinante . El nivel TOPK de la muestra de control positivo es, por ejemplo, mayor que el valor de corte.

En una modalidad, la presente invención proporciona además un kit de diagnóstico que' incluye, una proteína o una proteína parcial de la misma reconocida específicamente por el anticuerpo de la presente invención o un fragmento inmunogénico del mismo.

Los ejemplos del péptido parcial de las proteínas de la presente invención incluyen polipéptidos que están compuestos de al menos 8, preferiblemente 15, y más preferiblemente 20 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la presente invención. El cáncer puede diagnosticarse al detectar un anticuerpo en una muestra (por ejemplo, sangre, tejido) usando una proteína o un péptido (polipéptido) de la .presente invención. El método para preparar un péptido o proteína de la presente invención es como se describen arriba.

Los métodos de. diagnóstico para cáncer de la presente invención pueden hacerse al determinar la diferencia entre la cantidad.de anticuerpo anti-TOPK y el que está en la muestra de control correspondiente' como se describe arriba. El sujeto se sospecha que padece de cáncer, si las células o tejidos del sujeto contienen anticuerpos contra los productos de expresión (TOPK) del gen y la cantidad del anticuerpo anti-TOPK se determina para ser más del valor de corte en nivel comparado con aquel en control normal.

En otra modalidad, un kit de diagnóstico de la presente invención puede incluir el péptido de la presente invención y una molécula HLA enlazada al mismo. El método apropiado para detectar CTLs específicos de antígeno usando péptidos antigénicos y moléculas HLA ya se ha establecido (por ejemplo, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6). De esta manera, el complejo del péptido de la presente invención y la molécula HLA pueden aplicarse al método de detección para detectar CTLs específicos de antígeno de tumor, por ello se permite la detección temprana, recurrencia y/o metástasis de cáncer. Además,, puede emplearse para la selección de sujetos aplicable con los farmacéuticos que incluyen el péptido de la presente invención como un ingrediente activo, o la evaluación del efecto de tratamiento de los farmacéuticos.

Particularmente, de acuerdo con el método conocido (ver, por ejemplo, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6) , el complejo dé oligómero, tal como tetrámero, de la molécula HLA radioetíquetada y el péptido de la presente invención puede prepararse. El complejo puede usarse para cuantificar los CTLs específicos de antígeno-péptido en los linfocitos de sangre periférica derivados del sujeto que sospecha que padece de cáncer.

La presente invención proporciona además un método y agentes de diagnóstico para evaluar la respuesta inmunológica del sujeto usando epítopos de péptido como se describe en la presente. En una modalidad de la. invención, los péptidos restringidos HLA-A24, o HLA-A2 como se describen en la presente se usan como reactivos para evaluar o predecir una respuesta inmunitaria de un sujeto. La respuesta inmunitaria a evaluarse se induce al poner en contacto un inmunógeno con células inmunocompetentes in vitro o in vivo. En modalidades preferidas, las células inmunocompetentes para evaluar una respuesta inmunológica, pueden seleccionarse de entre sangre periférica, linfocitos de sangre periférica (PBL) , y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . Los métodos para colectar o aislar tales células inmunocompetentes son bien conocidos en las técnicas. En algunas modalidades, cualquier agente que puede resultar en la producción de CTLs específicos de antígeno. que reconocen y enlazan a los epítopos de péptido puede emplearse como el '. reactivo. El reactivo de péptido no necesita usarse como el inmunógeno. Los sistemas de ensayo que se usan para tal análisis incluyen desarrollos técnicos relativamente recientes tales como tetrámeros, tinción para linfocinas intracelulares y ensayos de liberación de interferón, o ensayos ELISPOT. En una modalidad preferida, las células inmunocompetentes a ponerse en contacto con el reactivo de péptido pueden ser células que presentan antígeno que incluyen células dendríticas.

Por ejemplo, los péptidos de la presente invención pueden usarse en ensayos de tinción de tetrámero para evaluar las células mononucleares de sangre periférica para la presencia de CTLs específicos de. antígeno después de la exposición a un antígeno de célula de tumor o un inmunógeno. El complejo tetramérico · HLA puede usarse para visualizar directamente CTLs específicos de antígeno (ver, por ejemplo, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; y Altman et al, Science 174: 94-96, 1996) y determinar la frecuencia de la población CTL específica de antígeno en una muestra de las células mononucleares de sangre periférica. Un reactivo tetrámero usando un péptido de la invención puede generarse como se describe enseguida.

Un péptido gue enlaza a una molécula HLA se repliega en presencia de la cadena pesada HLA correspondiente y beta 2-microglobulina para generar un complejo trimolecular . En el complejo, la terminal carboxilo de la cadena pesada está biotinilada en un sitio que se preparó por ingeniería previamente en la proteína. Luego, se agrega estreptavidina al complejo para formar el tetrámero que consiste del complejo trimolecular y estreptavidina. Por medio de estreptavidina fluorescentemente etiquetada, el tetrámero puede usarse para teñir células específicas de antigeno. Las células luego pueden identificarse, por ejemplo, por citometría de flujo. Tales análisis puede usarse para propósitos de diagnóstico o pronóstico. Las células identificadas por el procedimiento también pueden usarse para propósitos terapéuticos.

La presente invención también proporciona reactivos para evaluar respuesta de llamadas inmunitarias (ver, por ejemplo, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 y Penna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991) incluyendo péptidos de la presente invención.. Por ejemplo, las muestras PBMC del paciente de individuos con cáncer a tratarse se analizan para la presencia de CTLs específicos de antígeno usando péptidos específicos. Una muestra de sangre que contiene células mononucleares puede evaluarse al cultivar los PBMCs y estimular las células con un péptido de la invención. Después de un periodo de cultivo apropiado, la población celular expandida puede analizarse, por ejemplo, para actividad CTL.

Los péptidos también pueden usarse como reactivos para evaluar la eficacia de una vacuna. Los PBMCs obtenidos de un paciente vacunado con un inmunogeno pueden analizarse usando, por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos arriba. El paciente es de tipo HLA, y los reactivos de epítopo de péptido que reconocen las moléculas específicas de alelo presentes en tal paciente se seleccionan para el análisis. La inmunogenicidad de la vacuna puede indicarse por la presencia de CTLs específicas de epítopo en la muestra PBMC.

Los péptidos de la invención también pueden usarse para hacer anticuerpos, usando técnicas bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, CURRENT PROTOCOLS IN I MUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; y Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) , que son útiles como reactivos para diagnosticar o vigilar el cáncer. Tales anticuerpos pueden incluir aquellos que reconocen un péptido en el contexto de una molécula HLA, es decir, anticuerpos que se enlazan a un complejo péptido-MHC.

Los péptidos y composiciones de la presente invención tienen un número de usos adicionales, algunos de los cuales se describen en la presente. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método para diagnosticar o detectar un trastorno caracterizado por expresión de un polipéptido inmunogénico TOPK. Estos métodos involucran determinar la expresión o presentación de un péptido de enlace HLA TOPK, o un complejo de un péptido de enlace HLA TOPK y una molécula clase I HLA en una muestra biológica. La expresión de un péptido o complejo de péptido y molécula clase I HLA puede determinarse o detectarse al colocar en ensayo con un compañero de enlace para el péptido o complejo. En una modalidad preferida, un compañero de enlace para el péptido o complejo es un anticuerpo que reconoce y específicamente enlaza al péptido. La expresión de TOPK en una muestra biológica, tal como una biopsia de tumor, también puede probarse por protocolos de amplificación PCR estándares usando cebadores TOPK. Un ejemplo de la expresión de tumor está presentado en la presente y la descripción adicional de cebadores y condiciones ejemplares para la amplificación de TOPK puede encontrarse en la WO2003/27322.

Preferiblemente, los métodos de diagnóstico involucran poner en contacto una muestra biológica aislada de un sujeto con un agente especifico para el péptido de enlace HLA TOPK para detectar la presencia del péptido de enlace HLA TOPK en la muestra biológica. Como se usa en la presente, "poner en contacto" significa colocar la muestra biológica en proximidad suficiente al agente y bajo las condiciones apropiadas de, por ejemplo, concentración, temperatura, tiempo, resistencia iónica, para permitir la interacción especifica entre el agente y el péptido de enlace HLA TOPK que están presentes en la muestra biológica. En general, las condiciones para poner en contacto el agente con la muestra biológica son condiciones conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica para facilitar una interacción especifica entre una molécula y su cognado (por ejemplo, una proteina y su cognado de receptor, un anticuerpo y su cognado de antigeno de proteina, un ácido nucleico y su cognado de secuencia complementaria) en una muestra biológica. Las condiciones ejemplares para facilitar una interacción especifica entre una molécula y su cognado se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,108,921, presentada para Low et al.

El método de diagnóstico de la presente invención puede realizarse en cualquiera o ambos de in vivo e in vitro. En consecuencia, la muestra biológica puede localizarse in vivo o in vitro en la presente invención. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser un tejido in vivo y el agente especifico para el polipéptido inmunogénico TOPK puede usarse para detectar la presencia de tales moléculas en el tejido. Alternativamente, la muestra biológica puede recolectarse o aislarse in vitro (por ejemplo, . una muestra de sangre, biopsia de tumor, extracto de tejido) . En una modalidad particularmente preferida, la muestra biológica puede ser una muestra que contiene célula, más preferiblemente una muestra que contiene células de tumor recolectadas de un sujeto a diagnosticarse o tratarse.

Alternativamente, el diagnóstico puede realizarse usando un método que permite la cuantificación directa de células T especificas de antigeno por tinción con complejos multiméricos HLA etiquetados con fluoresceina (por ejemplo, Altman, J. D. et al., 1996, Science.274: 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10330). La tinción para linfocinas intracelulares, y ensayos de liberación interferón-gamma o ensayos ELISPOT también se ha proporcionado. La tinción del tetrámero, tinción de lin ocina intracelular y ensayos ELISPOT todos parecen ser al menos 10 veces más sensibles que ensayos más convencionales (Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413;). Los pentámeros (por ejemplo, US 2004-209295A) , dextrámeros' (por ejemplo, WO 02/072631), y estreptámeros (por ejemplo, Nature medicine 6. 631-637 (2002)) también pueden usarse.

Por ejemplo, en algunas modalidades, . la presente invención proporciona un método para diagnosticar o evaluar una respuesta inmunológica de un sujeto administrando al menos uno de los péptidos TOPK de la presente invención, el método incluye las etapas de: (a) poner en contacto un inmunógeno con células inmunocompetentes bajo la condición apropiada para inducción de CTL especifico para el inmunógeno; (b) detectar o determinar el nivel de inducción del CTL inducido en la etapa (a) ; y (c) correlacionar la respuesta inmunológica del sujeto con el nivel de inducción CTL.

En el contexto de la presente invención, el inmunógeno incluye preferiblemente al menos uno de (a) un péptido TOPK seleccionado de entre las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs : 2 a 40 y 42 a 84, péptidos que tienen tales secuencias de aminoácidos, y péptidos .que tienen en los cuales tales secuencias de aminoácidos que se han modificado con 1, 2 o más sustituciones de aminoácidos. Entre tanto, las condiciones apropiadas de inducción de CTL especifico de inmunógeno son bien conocidas en la. técnica. Por ejemplo, las células inmunocompetentes' pueden cultivarse in vivo bajo la presencia de inmunógenos para inducir CTL específicos de inmunógeno. Con objeto de inducir CTLs específicos de inmunógenos, cualquiera de los factores de estimulación puede agregarse al cultivo celular. Por ejemplo, IL-2 es factores estimulantes preferidos para la inducción de CTL.

En algunas modalidades, la etapa de vigilar o evaluar la respuesta inmunológica de un sujeto a tratarse con terapia de cáncer con péptido puede realizarse antes, durante y/o después del tratamiento. En general, durante un protocolo de terapia de cáncer, se administran péptidos inmunogénicos repetidamente a un sujeto a tratarse. Por ejemplo, pueden administrarse péptidos inmunogénicos cada semana por 3-10 semanas. En consecuencia, la respuesta inmunológica del sujeto puede evaluarse o vigilarse durante el protocolo de terapia de- cáncer. Alternativamente, las etapas de evaluación- o vigilancia de respuestas inmunológicas a la terapia de cáncer pueden ser al completar el protocolo de terapia.

De acuerdo con la presente invención, la inducción aumentada de CTL especifico de inmunógeno en comparación con un control indica que el sujeto a evaluarse o diagnosticarse responde inmunológicamente a los inmunógenos que se han administrado. Los controles apropiados para evaluar la respuesta inmunológica pueden incluir, por ejemplo, un nivel de inducción de CTL cuando las células inmunocompetentes se ponen en contacto con no péptido, o péptidos de control . que tienen las secuencias de aminoácidos diferentes de cualquiera de los péptidos TOPK (por ejemplo, secuencia de aminoácido aleatoria) . En una modalidad preferida, la respuesta inmunológica del sujeto se evalúa en una manera especifica para la secuencia, en comparación con una respuesta inmunológica entre cada inmunógeno administrado al sujeto. En particular, aun cuando la mezcla de algunos tipos de péptidos TOPK se administra al sujeto, la respuesta inmunológica puede variar dependiendo de los péptidos. En tal caso, en comparación con la respuesta inmunológica entre cada péptido, pueden identificarse los péptidos a los cuales el sujeto muestra mayor respuesta.

XII. Anticuerpos La presente invención proporciona además anticuerpos que enlazan a péptidos de la presente invención. Los anticuerpos preferidos específicamente son enlazados a péptidos de la presente invención y no se enlazarán (o se enlazarán débilmente) a otros péptidos. Alternativamente, los anticuerpos pueden enlazar a péptidos de la presente invención así como los homólogos de los mismos. Los anticuerpos contra péptidos de la presente invención pueden encontrar uso en ensayos de pronóstico y diagnóstico de cáncer así como también metodologías que forman imagen. De manera similar, tales anticuerpos pueden encontrar uso en el tratamiento, diagnóstico, y/o pronóstico de otros cánceres, para el TOPK de extensión también se expresa o sobreexpresa en un paciente con cáncer. Por otra parte, los anticuerpos intracelularmente expresados (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla) pueden encontrar uso terapéuticamente en tratar cánceres en los cuales la expresión de TOPK está involucrada, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave.

La presente invención también proporciona varios ensayos inmunológicos para la detección y/o cuantificación de la proteina TOPK (SEQ ID NO: 86) o fragmentos de la misma, que incluyen polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 2 a 40 y 42 a 84. Tales ensayos pueden incluir uno o más anticuerpos anti-TOPK capaces de reconocer y enlazar una proteina TOPK o fragmentos de la misma, como sea apropiado. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos anti-TOPK enlazados al polipéptido TOPK preferibleménte reconoce un polipéptido que tiene secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2 a 40 y 42 a 84, preferiblemente a la exclusión de otros péptidos. La especificidad enlazada de anticuerpo puede confirmarse por medio de una prueba de inhibición. Es decir, cuando el enlace entre un anticuerpo a analizarse y la longitud completa del polipéptido TOPK se inhibe bajo presencia de cualquiera fragmento de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 a 40 y 42 a 84, se considera que específicamente enlaza al fragmento. En el contexto de la presente invención, tales ensayos inmunológicos se realiza-n dentro de varios formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a varios tipos de radioinmunoensayos , técnica de inmuno-cromatografía, ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima (ELISA) , ensayos inmunofluorescentes ligados a la enzima (ELIFA) , y similares.

Los ensayos inmunológicos ' relacionados pero no de anticuerpo de la invención también pueden incluir ensayos de inmunogenicidad de célula T (inhibidores o estimuladores) así como ensayos enlazados MHC. Además, la presente invención contempla métodos que forman imágenes mmunológicas capaces de detectar cánceres .que expresan TOPK, ejemplos de los cuales incluye, pero no se limitan a, métodos formadores de imágenes radioescintigráficos usando anticuerpos etiquetados de la presente invención. Tales ensayos encuentran uso clínico en la detección, vigilancia, y pronóstico de cánceres que expresan TOPK, ejemplos de los cuales incluyen, pero no limitados a, AML, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, SCLC, y tumor de tejido suave. · La presente invención también proporciona anticuerpos que enlazan a los péptidos de la invención. Un anticuerpo de la presente invención puede usarse en cualquier forma, por ejemplo como un anticuerpo monoclonal o policlonal, y puede incluir además antisuero obtenido al inmunizar un animal tal como un conejo con el péptido de la invención, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales , anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados producidos por recombinación genética.

Un péptido de la presente invención usado como un antigeno para obtener un anticuerpo puede ser derivado de cualquier especie de animal, pero preferiblemente es derivado de un mamífero tal como un humano, ratón, o rata, más preferiblemente de un humano. Un péptido derivado de humano puede obtenerse de las secuencias de aminoácido o nucleótido descritas en la presente.

De acuerdo con la presente invención, los péptidos parciales o completos de una proteína pueden servir como agentes de inmunización. Los ejemplos de péptidos parciales adecuados incluyen, por ejemplo, el fragmento de terminal amino (N) o terminal carboxi (C) de un péptido de la presente invención.

Aquí, un anticuerpo se define como una proteína que reacciona con ya sea la longitud completa o un fragmento de un péptido TOPK. En una modalidad preferida, un anticuerpo de la presente invención puede reconocer los péptidos de fragmento de TOPK que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2 a 40 y 42 a 84. Los métodos para sintetizar el oligopéptido son bien conocidos en las técnicas. Después de la síntesis, los péptidos pueden purificarse opcionalmente antes del uso como inmunógeno . En el contexto de la presente invención, el oligopéptido (por ejemplo 9 o 10 mer) puede conjugarse o ligarse con portadores para potenciar la inmunogenicidad. La hemocianina de una variedad .de lapa (KLH) es bien conocida como el portador. El método para conjugar KLH y péptido también son bien conocidos en las técnicas.

Alternativamente, un gen que codifica un péptido de la invención o fragmento del mismo puede insertarse en un vector de expresión conocido, que luego se usa para transformar una célula hospedera como se describe en la presente. El péptido deseado o fragmento del mismo puede recuperarse del exterior o interior de las células hospederas por cualquier método estándar, y puede posteriormente usarse como un antigeno. Alternativamente, las células completas que expresan el péptido o sus lisados o un péptido químicamente sintetizado pueden usarse como el antígeno.

Cualquier animal mamífero puede inmunizarse con el antígeno, aunque preferiblemente la compatibilidad con células precursoras usada para fusión celular se toma en cuenta. En general, pueden usarse animales de roedores, lagomorfos o primates. Los animales de la familia de roedores incluyen, por ejemplo, ratón, rata y hámster. Los animales de la familia de lagomorfos incluyen, por ejemplo, conejo. Los animales de la familia de primates incluyen, por ejemplo, un mono de Catarrhini (mono del viejo mundo) tales como Macaca fascicularis , mono rhesus, babuino sagrado y chimpancés.

Los métodos para inmunizar animales con antígenos son conocidos en la técnica. La inyección intraperitoneal o inyección subcutánea de antígenos es un método estándar para la inmunización de mamíferos. Más específicamente, los antígenos pueden diluirse y suspenderse en una cantidad apropiada de solución salina amortiguada en fosfato (PBS) , solución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígeno puede mezclarse con una cantidad apropiada de un adyuvante estándar, tal como adyuvante completo de Freund, hecho en emulsión y luego administrarse a animales mamíferos. Preferiblemente, se sigue por varias administraciones de antígeno mezclado con una cantidad apropiadamente de adyuvante incompleto de Freund cada 4 hasta 21 días. Un portador apropiado también puede usarse para inmunización. Después de la inmunización como arriba, el suero puede examinarse por un método estándar para un incremento en la cantidad de anticuerpos deseados.

Los anticuerpos policlonales contra los péptidos de la presente invención pueden prepararse al recolectar sangre del mamífero inmunizado examinado por el incremento de anticuerpos deseados en el suero, y al separar el suero de la sangre por cualquier método convencional. Los anticuerpos policlonales pueden ' incluir suero que contiene los anticuerpos policlonales, asi como la fracción que contiene los anticuerpos policlonales puede aislarse del suero. La inmunoglobulina G. o M puede prepararse a partir de una fracción que reconoce sólo el péptido de la presente invención usando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada con el péptido de la presente invención, y. purificar además esta fracción usando columna de proteina A o proteína G.

Para preparar los anticuerpos monoclonales para uso en el contexto de la presente invención, las células inmunitarias se recolectan del mamífero inmunizado con el antígeno y verificarse para el nivel incrementado de anticuerpos deseados en el suero como se describe arriba, y se someten a fusión celular. Las células inmunitarias usadas para fusión celular pueden preferiblemente obtenerse del bazo. Otras células, precursoras preferidas a fusionarse con el inmunocito de arriba incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamíferos, y más preferiblemente células de mieloma que tienen una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas por fármacos.

Las células de mieloma e inmunocitos de arriba pueden fusionarse de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, el método para Milstein et al. (Galfre y Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981) ) .

Los hibridomas resultantes obtenidos por fusión celular pueden seleccionarse al cultivarlos en un medio de selección estándar, tal como medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) . El cultivo celular típicamente está continuo en el medio .HAT durante varios días hasta varias semanas, el tiempo es suficiente para permitir que todas las otras células, con la excepción del hibridoma deseado (células no fusionadas) , mueran. Luego, la dilución limitante estándar puede realizarse para tamizar y clonar una célula de hibridoma que produce el anticuerpo deseado.

Además del método de arriba, en donde un animal no humano se inmuniza con un antígeno para preparar el hibridoma, los linfocitos humanos tales como aquellos infectados por virus EB pueden inmunizarse con un péptido, células que expresan péptido o sus lisados in vitro. Luego, pueden fusionarse los linfocitos inmunizados con células de mieloma derivadas de humano que son capaces de dividirse indefinidamente, tal como U266, para proporcionar un hibridoma que produce un anticuerpo humano deseado que es capaz de enlazar al péptido (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No examinada No.' Shc 63-17688).

Los hibridomas obtenidos pueden entonces trasplantarse posteriormente en la cavidad abdominal de un ratón y los ascitos se extraen.' Los anticuerpos monoclonales obtenidos pueden purificarse, por ejemplo, por precipitación de sulfato de amonio, una columna de proteina A o proteina G, cromatografía de intercambio de iones DEAE o una columna de afinidad a la cual el péptido de la presente invención se acopla. Un anticuerpo de. la presente invención puede usarse no sólo para purificación y detección de un péptido de la presente invención, s'ino también como un candidato para agonistas y antagonistas de un péptido de la presente invención. Alternativamente, una célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado, que produce anticuerpos puede inmortalizarse por un oncógeno y usarse para preparar anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales de esta manera obtenidos también pueden prepararse recombinantemente usando técnicas preparadas por ingeniería genética (ver, por ejemplo, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, un ADN que codifica un anticuerpo puede clonarse de una célula inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, insertado en un vector apropiado, e introducido en las células hospederas para preparar un anticuerpo recombinante . La presente invención también contempla anticuerpos recombinantes preparados como se describe arriba.

Un anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo modificado, de manera que enlaza a uno o más de los péptidos de la invención. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena sencilla (scFv) , en el cual los fragmentos Fv de las cadenas H y L se ligan por un ligador apropiado (Huston et al., Proc Nati Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Más específicamente, un fragmento de anticuerpo puede generarse al tratar un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina. Alternativamente, un gen que codifica el fragmento de anticuerpo puede construirse, insertarse dentro de un vector de expresión y expresarse en una célula hospedera apropiada (ver, por ejemplo, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird y Walker, Trends BiotechnoL 9: 132-7 (1991)).

Un anticuerpo puede modificarse por conjugación con una variedad de moléculas, tales como polietilenglicol (PEG) . La presente invención se proporciona para tales anticuerpos modificados. El anticuerpo .modificado puede obtenerse al modificar químicamente un anticuerpo. Estos métodos de modificación son convencionales en el campo.

Alternativamente, un anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse como un anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de anticuerpo no humano y la región constante derivada del anticuerpo humano, o como un anticuerpo humanizado, que incluye la región que determina la complementariedad (CDR) derivada del anticuerpo no humano, la región de estructura (FR) y la región constante derivada del anticuerpo humano. Tales anticuerpos pueden prepararse de acuerdo con tecnología conocida. La humanización puede realizarse al sustituir CDRs de roedores o secuencias CDR para las secuencias correspondiente de un anticuerpo humano (ver por ejemplo, Verhoeyen et al., Science . 239 : 1534-1536 (1988)). En consecuencia, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en dónde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana.

Los anticuerpos ¦ completamente humanos que incluyen regiones variables humanas además de regiones constantes y de estructura humana también pueden usarse. Tales anticuerpos pueden producirse usando varias técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los métodos in vitro que involucran el uso de colecciones recombinantes de fragmentos, de anticuerpo humano que exhiben un bacteriófago (por ejemplo, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991). De manera similar, los anticuerpos humanos pueden hacerse por introducción de la ubicación de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos se han parcialmente o completamente inactivado. Este enfoque se describe, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5, 625, 126; 5, 633, 425; 5, 661, 016.

Los anticuerpos obtenidos como arriba pueden purificarse para homogeneidad. Por ejemplo, la separación y purificación del anticuerpo pueden realizarse de acuerdo con métodos de separación y purificación usados para proteínas generales. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse y aislarse por el uso combinado y apropiadamente seleccionado de cromatografías de columna, tales como cromatografía de afinidad, filtro, ultrafiltración, remoción de sales, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y enfoque isoeléctrico (Antibodies: A Laboratory Manual'. Ed Harlow and David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero no se limitan a estos. Una columna de proteína A y columna de proteína G pueden usarse como la columna de afinidad. Las columnas de proteína A ejemplares a usarse incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS and Sepharose .F.F. (Pharmacia).

Los ejemplos de técnicas idóneas de cromatografía, con la excepción de cromatografía de afinidad incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía nidrofóbica, filtración de gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción y similares (Strategies for Protein Purífication and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Los procedimientos cromatográficos pueden llevarse a cabo por cromatografía de fase líquida, tal como HPLC y FPLC.

Por ejemplo, medición de absorbancia, ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) , inmunoensayo de enzima (EIA) , radioinmunoensayo (RIA) e/o inmunofluorescencia pueden usarse para medir la actividad enlazada al antígeno del anticuerpo de la invención. En ELISA, el anticuerpo de la presente invención se inmoviliza en una placa, un péptido de la invención se aplica a la placa, y luego una muestra que contiene un anticuerpo deseado, tal como sobrenadante de cultivo de células- que producen anticuerpo o anticuerpos purificados, se aplica. Luego, un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y se etiqueta con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, se aplica, y la placa se incuba. A continuación, después de lavar, un sustrato de enzima, tal como fosfato de p-nitrof.enilo, se agrega a la placa, y la absorbancia se mide para evaluar la actividad enlazada al antigeno de la muestra. Un fragmento del péptido, tal como un fragmento de terminal C o terminal N, puede usarse como el antigeno para evaluar la actividad de enlace del anticuerpo. BIAcore (Pharmacia) puede usarse para evaluar la actividad del anticuerpo de acuerdo. con la presente invención.

Los métodos de arriba permiten la detección o medición de un péptido de la' presente invención, al exponer un anticuerpo de la presente invención a una muestra que se presume que contiene un péptido de la invención, y detectar o medir el complejo inmunitario formado por el anticuerpo y el péptido.

Debido a que el método para detección o medición del péptido de acuerdo con la presente invención . puede específicamente detectar o medir un péptido, el método puede encontrar uso en una variedad de experimentos en los cuales el péptido se usa.

XIII. Vectores y Células Hospederas La presente invención también proporciona vectores y células hospederas en las que un nucleótido que codifica un péptido de la presente invención se introduce. Un vector de la presente invención encuentra utilidad como un vehículo de nucleótidos, especialmente un ADN, de la presente invención en célula hospedera, para expresar un péptido de la presente invención, o para administrar un nucleótido de la presente invención para terapia de gen.

Cuando E. coli se selecciona como célula hospedera y el vector se amplifica y produce en una cantidad grande en E. coli (por ejemplo, JM109, DH5 alfa, HB101 o XLIBlue) , el vector debe tener un. "ori" para ser idóneo en amplificación en E. coli y un gen marcador adecuado para seleccionar E. coli transformada (por ejemplo, un gen de resistencia al fármaco seleccionado por un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol o similares) . Por ejemplo, los vectores serie M13, vectores serie pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc. pueden usarse. Además, pGEM-T, pDIRECT y pT7 también pueden usarse para subclonar y extraer cADN asi como los vectores descritos arriba. Cuando un vector se usa para producir la proteina de la presente invención, un vector de expresión puede encontrar uso. Por ejemplo, un vector de expresión para expresarse en E. coli debe tener las características de arriba para amplificarse en E. coli. Cuando E. coli, tal como JM109, DH5 alfa, HB101 o XL1 Blue, se usan como una célula hospedera, el vector debe tener un promotor, por ejemplo, promotor lacZ ( ard et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), promotor araB (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), promotor T7 o similares, que pueden expresar eficientemente el gen deseado en E. coli. En tal sentido, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "sistema QIAexpress" (Qiagen) , pEGFP y pET (en este caso, el hospedero es preferiblemente BL21 que expresa polimerasa de ARN T7) , por ejemplo, puede usarse en lugar de los vectores de arriba. Adicionalmente, el vector también puede contener una secuencia de señal para la secreción de péptido. Una secuencia de señal de forma ejemplar que dirige el péptido para secretarse al periplasma en el E. coli es la secuencia de señal pelB (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Los medios para introducción de los vectores en las células hospederas objetivo incluyen, por ejemplo, el método de cloruro de calcio, y el método de electroporación .

Además de E. coli, por ejemplo, los vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo, pcADN3 (Invitrogen) y pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), vectores de expresión derivados de células de insecto (por ejemplo, "sistema de expresión de baculovirus Bac-a-BAC". (GIBCO BRL) , pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo, pMHl, pMH2 ) , vectores de expresión derivados de los virus de animal (por ejemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw) , vectores de expresión derivados de retrovirus (por ejemplo, pZIpneo) , vector de expresión derivado de levadura (por ejemplo, "Kit de Expresión Pichia" (Invitrogen), pNVll, SP-Q01) y vectores de expresión derivados de Bacilas subtilis (por ejemplo, pPL608r pKTH50) pueden usarse para producir el polipéptido de la presente invención. .

Con objeto de expresar el vector en células animales, tales como células CHO, COS o NIH3T3, el vector debe tener un promotor necesario para expresión en tales células, por ejemplo, el promotor SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), el promotor MMLV-LTR, el promotor EF1 alfa (Mizushima et al., Nucleic acids Res 18: 5322 (1990)), el promotor C V y similares, y ' preferiblemente un gen marcador para seleccionar transformantes, (por ejemplo, un gen de resistencia al fármaco seleccionado por un fármaco (por ejemplo, neomicina, -G418)). Los ejemplos de vectores conocidos con estas características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

De aquí en adelante, la presente invención se describe a mayor detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, mientras que los siguientes materiales, métodos y ejemplos pueden servir para ayudar a una persona experta en la fabricación y uso de ciertas modalidades de la presente invención., se pretende únicamente ilustren aspectos de la presente invención y de este modo de ningún manera limiten el enfoque de la presente- invención. Como una persona ordinaria experta en la técnica reconocerá, los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden fácilmente reconocerse pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención. .

EJEMPLOS Materiales y Métodos Líneas celulares La línea celular de linfoblastoide B TISI, HLA-A*2402 positiva se adquirió del Banco de Genes y Células IHWG (Seattle, WA) . La línea celular de linfoblastoide B positiva T2, HLA-A*0201, y línea celular de riñon de mono verde africano, C0S7, se adquirieron de ATCC Selección candidata de péptidos derivados de TOPK Los péptidos 9-mer y 10-mer derivados de TOPK (No. de acceso GenBank NM 018492; por ejemplo, SEQ ID No: 85) que enlazan a cualquiera o ambos de la molécula HLA-A*0201 y HLA-A*2402 se predijeron usando predicción de enlace "NetMHC 3.0" servidor (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al. (Tissue Antigens. Nov. 2003, 62(5): 84 Nielsen et al. (Protein Sci. Mayo 2003, 12 ( 5 ) : 1007-17 , Bioinformatics , Jun. 2014 12 : 20 ( 9) : 1388-97 ) . Estos péptidos se sintetizaron por Biosynthesis (Lewisville, Texas) de acuerdo a un método de síntesis de fase sólida estándar y purificaron por cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (HPLC) . La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos se determinaron por HPLC analítica y análisis de espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido en 20 mg/ml y almacenaron a -80 grados C.

Inducción CTL in vitro Se usaron células dendríticas derivadas de monocito (DCs) como células que presentan antígeno para inducir respuestas de linfocito T citotóxico (CTL) contra péptidos presentados en antígeno de leucocito humano (HLA) . DCs se generaron in vitro como se describe en cualquier lugar (Nakahara S et al., Cáncer Res 2003 Jul 15 63(14) : 4112-8) . Específicamente, . las células mononucleares de sangre periférica aisladas de un voluntario normal (HLA-A*2402 positivo o HLA-A*0201 positivo) por solución Ficoll-Paque plus (Pharmacia) se separaron por adherencia a un plato de cultivo de tejido plástico (Becton Dickinson) a fin de enriquecerlas como la fracción de monocito. La población enriquecida por monocito se cultivó en presencia de 1000 U/ml de factor que estimula la colonia de granulocito-macrófago (R&D System) y 1000 U/ml de interleucina (IL)-4 (R&D System) en medio AIM-V (Invitrogen) que contiene suero autólogo inactivado por calor al 2% (AS) . Después de 7 días de cultivo, Los DCs inducidos por citocina se pulsaron con 20 micro-g/ml de cada uno de los péptidos sintetizados en presencia de 3 micro-g/ml de beta 2-microglobulina durante 3 hrs a 37 grados C en Medio AI -V. Las células generadas parecen expresar moléculas asociadas DC, tales como CD80, CD83, CD86 y HLA clase II, sobre sus superficies celulares (datos no mostrados) . Estos DCs pulsados por péptido luego se inactivaron por radiación con rayos X (20 Gy) y mezclaron en una relación 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidos por selecció positiva con Kit de Aislamiento Positivo CD8 (Dynal). Estos cultivos se ajustaron en placas de 48 pozos (Corning); cada pozo contiene 1.5 x 104 DCs pulsados por péptido, 3 x 105 células T CD8+ y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0.5 mi de AIM-V/2% de medio AS. Tres días después, estos cultivos se complementaron IL-2 (CHIRON) a una concentración final de 20 IU/ml. En el día 7 y 14, las células T se estimularon además con los DCs pulsados por péptido autólogo. Los DCs se prepararon cada vez por la misma forma descrita arriba. Los CTLs se probaron contra células TISI o células T2 pulsadas por péptido después de la 3a ronda de estimulación de péptido en el día 21 (Tanaka H et al., Br J Cáncer 2001 Ene 5, 84 (1) : 94-9; Umano Y et al., Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24) : 8577-86; Suda T et al., . Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cáncer Sci 2005 Agosto, 96(8): 498-506) .

Procedimiento de Expansión CTL Los CTLs se expandieron en el cultivo usando el método similar a uno descrito por Riddell et al. ( alter EA et al., N Engl J Med 1995, 1995 Oct 19 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Un total de 5 x 104 CTLs se suspendieron en 25 mi de AIM-V/5% de medio AS con 2 tipos de lineas células de lintoblastoide B humano,- inactivadas por Mitomicina C, en presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 ( Pharmingen) . Un día después de iniciar los cultivos, 120 IU/ml de IL-2 se agregaron a los cultivos. Los cultivos se alimentaron con AIM-V/5% de medio AS fresco que contiene 30 IU/ml de IL-2 en los días 5, 8 y 11 (Tanaka H et al., Br J Cáncer 2001 Abril 20, 84(1) : 94-9; Umano Y et al., Br J Cáncer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10 (24) : 8577-86; Suda T et al., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cáncer Sci 2005 Agosto, 96(8): 498-506).

Establecimiento de clones CTL Las diluciones se hicieron para tener 0.3, 1, y 3 CTLs/pozo en 96 placas de micro titulación de fondo redondo (Nalge Nunc International) . CTLs se cultivaron con 1 X 104 células/pozo de 2 tipos de lineas celulares de linfoblastoide B humano,' 30ng/ml de anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en un total de 150 micro-l/pozo de Medio AIM-V que contiene AS al 5%. 50 micro-l/pozo de IL-2 se agregaron al medio 10 dias después a fin de alcanzar una concentración final de 125 U/ml de IL-2. La actividad CTL se probó en el 14° dia, y los clones CTL se expandieron usando el mismo método como se describe arriba (Uchida N et al., Clin Cáncer Res, 2004 Dic 25 10 (24 ) :' .8577-86; Suda T et al., Cáncer Sci, 2006 Mayo, 97(5) : 411-9; Watanabe T et al., Cáncer Sci ,2005 Agosto, 96(8) : 498-506) .

Actividad CTL especifica Para examinar la actividad CTL especifica, se realizaron el ensayo (ELISPOT) IFN) -gamma y ensayo (ELISA) IFN-gamma. Se prepararon células TISI o células T2 pulsadas por péptido (1 x 104/pozo) como células estimuladoras. Las células, cultivadas en placas de 48 pozos, lineas CTL y clones CTL se usaron como células respondedoras. Se realizaron el ensayo IFN-gamma ELISPOT y IFN-gamma ELISA bajo el procedimiento de fabricación.

Establecimiento de las células que expresan forzadamente cualquiera o tanto el gen objetivo y HLA-A024 o HLA-A02 El cADN que codifica una estructura de lectura abierta de genes objetivo, HLA-A*2402 o HLA-A*0201 se amplificó por PCR. El producto amplificado por PCR se clonó en un vector de expresión. Los plásmidos se transfectaron en C0S7, que es la linea celular nula en genes, nula en HLA-A*0201 y nula en HLA-A*2402, usando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo a los procedimientos del fabricante. Después de 2 días de transfección, las células transfectadas se cosecharon con versene (Invitrogen) y usaron como las células estimuladoras (5 X 104 células/pozo) para ensayo de la actividad CTL.

Habilidad de CTL para reconocer la línea celular objetivo que endógenamente expresó TOPK y HLA-A*2402 o HLA-0201.

El clon CTL se examinó para su habilidad para reconocer la célula objetivo que endógenamente expresó TOPK y HLA-A*2402 O HLA-A*0201. El clon CTL establecido se cultivó con líneas celulares objetivo (5 X 104/pozo) por dos durante toda la noche. Después de la incubación, IFN-gamma en el medio de cultivo se midió por ELISA, IFN-gamma ELISA e realizó bajo el procedimiento del fabricante.

Resultados Expresión TOPK mejorada Los datos de perfil de expresión de gen amplia se obtuvieron de varios cánceres usando microconfiguración cADN revelaron que la expresión TOPK (No. Acceso GenBank NM 018492; por ejemplo, SEQ ID No: 85) se elevó específicamente en tejidos de cáncer como se compara con tejido normal correspondiente. La expresión TOPK se elevó válidamente en 1 de 15 AML, 15 de 19 cánceres de vejiga, 36 de 40 cánceres de mama, 2 de 6 cánceres cervicales, 6 de 6 carcinomas colangiocelulares , 2 de 6 cánceres colorrectales, 1 de 1 cáncer gástrico de tipo difuso, 5 de 5 NSCLC 1 de 2 linfomas, 7 ' de 11 osteosarcomas , 12 de 19 cánceres de próstata, 3 de 12 carcinomas renales, 14 de 14 SCLCs y 15 de 29 tumores de tejido suave (Tabla 1) .

Tabla 1 Relación de casos observados de sobre-regulación de TOPK en tejidos cancerosos como se compara con tejidos correspondientes normales.

Predicción de péptidos de enlace HLA-A24 derivados de TOPK La Tabla 2a y 2b muestra los péptidos 9raer y lOmer de enlace HLA-A24 de TOPK en el orden de afinidad de enlace alta. Un total de 41 péptidos que tienen habilidad potencial de enlace HLA-A24 se seleccionaron y examinaron para determinar los péptidos de epitopo.

Tabla 2a Péptidos 9mer de enlace HLA-A24 derivados de TOPK Tabla 2b Péptidos lOmer de enlace HLA-A24 derivados de TOPK La posición de inicio indica el número de residuos de aminoácido de la terminal N de TOPK. Se derivan la constante de disociación de "NetMHC3.0" .

Predicción de péptidos de enlace HLA-A02 derivados de TOPK La Tabla 3a y 3b muestra los péptidos 9mer y lOmer de enlace a HLA-A02 de TOPK respectivamente en el orden de afinidad alta. Un total de 44 péptidos con habilidad potencial de enlace HLA-A02 se seleccionaron y examinaron para determinar los péptidos de epitopo.

Tabla 3a Péptidos 9mer de enlace HLA-A02 derivados de TOPK Tabla 3b Péptidos lOmer de enlace HLA-A02 derivados de TOP La posición de inicio indica el número de residuos de aminoácido de la terminal N de TOPK. Se derivan la constante de disociación de "NetMHC3.0" .

Inducción CTL con péptidos predichos de TOPK restringidos con HLA-A*2402 Los CTLs para aquellos péptidos derivados de TOPK se generaron de acuerdo con los protocolos como se describe en "Materiales y Métodos". La actividad CTL especifica de péptido se detectó por ensayo IFN-gamma ELISPOT (Figura 1) . El número de pozo #8 con TOPK-A24-9-230 (SEQ ID NO: 2) (a), #3 con TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO:3) (b) , #3 con TOPK-A24-9232 (SEQ ID NO: 6) (c) , #2 con TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (d) y #4 CON TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (e) demuestran producción IFN-gamma potente en comparación con los pozos de control. Por otro lado, no se detectó actividad CTL especifica por estimulación con otros péptidos mostrados en las Tablas 2a y 2b, a pesar de que aquellos péptidos tenían una actividad de enlace posible con HLA-A*2402. Como es típico de los datos negativos, no se observó producción IFN-gamma específica del CTL estimulado con TOPK-A24-9-289 (SEQ ID NO:l) (f ) . Tomándose juntos, estos resultados sugieren que los 5 péptidos derivados de TOPK pordrían inducir CTLs potentes. · La inducción CTL con los péptidos predichos de TOPK restringida con actividad CTL específica de péptido HLA-A*0201 fue detectada por ensayo IFN-gamma ELISPOT (Figura 2), número de pozo # 7 con TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a), #4 con TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45) 0b), #2 con TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO: 47) (c) , #8 con TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50) (d), #4 con TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51) (e) , #3 con TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (f), #3 con TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54) (g), #5 con TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62) (h) , #3 con TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63) (i), #8 con TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64) (j), #1 con ¦ TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66) (k), #1 con TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71) (1), #4 con TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) (m) y #4 con TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) (n) demostró producción IFN-gamma potente como se compara a los pozos de control. Por otro lado, no se detectó actividad CTL .especifica por estimulación con otros péptidos mostrados en la Tabla 3a y 3b, a pesar que estos péptidos tuvieron actividad de enlace posible con HLA-A*0201. Como es típico de los datos negativos, no se observo producción IFN-gamma específica del CTL estimulado con TOPK-A02-9-55 (SEQ ID NO:41) (o). Tomados juntos, estos resultados sugieren que los 14 péptidos seleccionados derivados de TOPK podrían inducir CTLs potentes.

Establecimiento de línea y clon CTL contra péptido derivado de TOPK.

Las células en el. número de pozo #8 con TOPK-A24-9-230 (SEQ ID NO: 2) (a), #3 con TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (b) , #3 con TOPK-A24-9-232 (SEQ ID NO: 6) (c) , #2 con TOPK-A24-10- 288 (SEQ ID NO: 27). (d) y #4 con TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (e) mostraron que la actividad CTL especifica de péptido por ensayo ELISPOT IFN-gamma se expandieron y establecieron las lineas CTL. Las actividades CTL de estas lineas CTL se midieron por ELISA IFN-gamma (Figura 3). Las lineas CTL demostraron producción IFN-gamma potente contra las células objetivo pulsadas . con el péptido correspondiente en comparación con las células objetivo sin pulso de péptido. Adicionalmente, los clones CTL se establecieron por dilución limitada de las lineas CTL como se describe en "Materiales y Métodos", y producción IFN-gamma de clones CTL contra células TISI pulsadas con péptido correspondiente se midieron por IFN-gamma ELISA, la producción IFN-gamma potente se observó de los clones CTL estimulados con células objetivo pulsadas con péptido se determinó por ensayo IFN-gamma ELISA. Se determinaron las producciones IFN-gamma potentes de los clones CTL estimulados con TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3) (a) , TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27) (b) y TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) (c) (Figura 4) .

Las células en el número de pozo #7 con TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a), #4 con TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45) (b) , #8 con TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50) (c) , #4 con TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51) (d) , #3 con TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (e), #3 Con TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54) (f), #5 with ????-?02-10-236 (SEQ ID NO: 62) (g) , #3 con TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63) (h) , #8 con TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64) (i), #1 con TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66) (j) y #4 con ????-?02-10-88 (SEQ ID NO: 72) (k) que mostraron actividad CTL específica de péptido por ensayo IFN-gamma ELISPOT se expandieron y establecieron las líneas CTL. Las actividades de estas líneas CTL se midieron por IFN-gamma ELISA (Figura 5) . Las líneas CTL demostraron producción IFN-gamma potente contra las células objetivo pulsadas con el péptido correspondiente como se compara a las células objetivo, sin el pulso de péptido. Además, los clones CTL se establecieron limitando la dilución de las líneas CTL como se describe en "Materiales y Métodos", y la producción IFN-gamma d los clones CTL contra las · células T2 pulsadas con péptido correspondiente se midió por ELISA IFN-gamma. La producción IFN-gamma potente se observó de clones CTL estimulados con TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) (a) y TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) (b) (Figura 6) .

Actividad CTL específica contra células objetivo que expresa TOPK y HLA-A*2402 o HLA-A* 020.1 El clon CTL establecido formulado contra el péptido TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) se examinó para la habilidad para reconocer las células objetivo que expresan molécula TOPK y HLA-A*2402. Las¦ células COS7 tanto con TOPK de longitud entera como gen HLA-A*2402 (un modelo específico para las células objetivo que expresan TOPK y gen HLA-A*2402) se prepararon como células estimuladoras, y las células C0S7 se transíectaron con ya sea longitud entera de TOPK o HLA-A*2402 se usaron como controles. En la Figura 7, el clon CTL estimulado con TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) mostró actividad CTL potente contra células COS7 expresando tanto TOPK como HLA- A* 2402. Por otro lado, no se detecto actividad CTL específica importante contra los controles. De esta manera, estos datos claramente demuestran que el péptido TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28) es endógenamente procesado y expresado en las células objetivo con molécula HLA-A*2402 y es reconocido por CTLs. La línea CTL establecida formulada contra el péptido TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) se examinó para su habilidad para reconocer las células objetivo que expresan TOPK y molécula HLA-A*0201. Las células COS7 transfectadas tanto con TOPK de longitud alta como con gen HLA-A*0201 (un modelo específico para las células objetivo que expresan TOPK y gen HLA-A*0201) se prepararon como células estimuladoras, y las células COS7 transfectadas con ya sea TOPK de longitud entera o HLA-A*0201 se usaron como los controles. En la Figura 8, la línea CTL estimulada con TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) mostró actividad CTL potente contra las células COS7 expresando tanto TOPK como HLA- A*0201. Por otro lado, no se detectó actividad específica CTL importante contra los controles. De esta manera, estos datos claramente demuestran que el péptido TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42) es endógenamente procesado y expresado en las células objetivo con molécula HLA-A*0201 y es reconocido por los CTLs. Estos resultados indican que estos péptidos derivados de TOPK pueden estar disponibles para aplicar las vacunas de cáncer para pacientes con tumores que expresan TOPK.

Análisis de homología de péptidos de antígeno Los CTLs estimulados con TOPK-A24-9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOPK-A24-9-232 (SEQ ID NO: 6), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27), TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28), TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO: 47) , TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53), TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A02-10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A02-10-88 (SEQ ID NO: 72) o TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) mostraron actividad CTL específica e importante. Este resultado puede ser . debido al hecho de que estas secuencias son homologas al péptido derivado de otras moléculas que se sabe sensibilizan el sistema inmune humano. Para excluir esta posibilidad, los análisis de homología se realizaron para estas secuencias de péptido utilizando como consulta el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) que no reveló secuencias con homología importante. Los resultados del análisis de homología indican que las secuencias de TOPK-A24- 9-230 (SEQ ID NO: 2), TOPK-A24-9-130 (SEQ ID NO: 3), TOP -A24-9-232 (SEQ ID NO: 6), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO: 27), TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO: 28), TOPK-A02-9-240 (SEQ ID NO: 42), TOPK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45), TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO: 47), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO: 50), TOPK-A02-9-12 (SEQ ID NO: 51), TOPK-A02-9-285 (SEQ ID NO: 53) , TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO: 54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO: 62), TOPK-A02- 10-231 (SEQ ID NO: 63), TOPK-A02-10-47 (SEQ ID NO: 64), TOPK-A02-10-239 (SEQ ID NO: 66), TOPK-A02-10-272 (SEQ ID NO: 71), TOPK-A02-10-88 ( SEQ ID NO: 72) and TOPK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) son únicas y de esta manera, hay poca posibilidad, hasta nuestro mejor conocimiento, que estas moléculas eleven respuesta inmunológica no pretendida a alguna molécula no relacionada. En conclusión, los péptidos de epítopo HLA-A24 o HLA-A02 novedosos derivados de TOPK identificados en la presente pueden encontrar utilidad en el campo de inmunoterapia de cáncer.

Aplicabilidad Industrial La presente invención proporciona nuevos TAAs, particularmente aquellos derivados de TOPK que pueden inducir respuestas inmunitarias anti-tumor especificas y potentes y tienen aplicabilidad para una variedad amplia de tipos de cáncer. Tales TAAs pueden encontrar utilidad como vacunas de péptido contra enfermedades asociadas con TOPK, por ejemplo, cáncer, más particularmente, leucemia mieloide aguda (AML) , cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelula , cáncer colorrectal, cáncer gástrico de tipo difuso, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) , linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC) , y tumor de tejido suave.

Aunque la presente invención se describe en la presente en detalle y con referencia a modalidades especificas de la misma, se entenderá que la descripción anterior es ejemplar y explicativa en naturaleza y sé pretende que ilustre la presente invención y sus modalidades preferidas. A través de la experimentación de rutina, alguien experimentado en la técnica reconocerá que pueden hacerse varios cambios y modificaciones en la presente sin salirse del espíritu y alcance de la presente, invención. Las medidas y colindancias que se definan por las reivindicaciones anexas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓ Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de (i) y (ii) a continuación: (i) un péptido aislado de (a) o (b) a continuación: (a) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 2, 3, 6, 27 y 28. (b) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27 y 28, en la que 1, 2, o muchos aminoácido ( s ) se sustituyen, insertan, eliminan, y/o agregan, en donde el péptido tiene inducción CTL. (ii) un péptido aislado de (c) o (d) a continuación: (c) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54,. 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76. (d) un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 45, 47, 50, 51, 53., 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76, en la que 1, 2, o muchos amino ácido (s) se sustituyen, insertan, eliminan, y/o agregan, en donde el péptido tiene inducción CTL .

2. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de término N de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 2, 3, 6, 27 y 28 se sustituye para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, tirosina, metionina, y triptofano, y (b) el aminoácido del C-terminal de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27 y 28 se sustituye para ser un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, y metionina.

3. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo ' aminoácido del C-terminal de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76 se sustituye para ser un aminoácido del grupo que consiste de leucina y metionina; y (b) el aminoácido del C-terminal de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y. 76 se sustituye para ser un aminoácido del grupo que consiste de valina y leucina.

4. El péptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho péptido tiene una habilidad para enlazar a un antigeno HLA.

5. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque dicho antigeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

6. El péptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho péptido es un nonapéptido o un decapéptido.

7. Un polinucleótido . aislado caracterizado porque codifica el péptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una composición para inducir un CTL, caracterizada porque la composición comprende uno o más péptido (s) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o uno o más polinucleótido (.s ) de conformidad con la reivindicación 7.

9. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende: (a) uno o más péptido(s) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, (b) uno o más polinucleótido ( s ) de conformidad con la reivindicación 7. (c) uno o más APC(s) que presentan un complejo de péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un antigeno HLA en su superficie; (d) uno o más exosoma(s) que presentan un complejo de péptido de conformidad con. cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un antigeno HLA en su superficie; o (e) uno o más CTL(s) que pueden reconocer una célula presentando un complejo del péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un antigeno HLA en su superficie, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la composición farmacéutica se formula para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer, la prevención de una recurrencia post-operativa del mismo, y/o la inducción de una respuesta inmunitaria contra el cáncer.

10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque dicha composición farmacéutica se formula para administración a un sujeto cuyo antigeno HLA es HLA-A24 o KLA-A2.

11. Un método para inducir una célula que presenta antigeno (APC) con inducción CTL, dicho método caracterizado porque comprende la etapa del grupo que consiste de: (a) poner en contacto un APC con un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 in vitro, ex vivo o in vivo, y (b) introducir un polinucleótido que codifica el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un APC.

12. Un método para inducir un CTL, dicho método caracterizado porque comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste de: . (a) co-cultivar una célula T CD8-positiva con un APC que presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, (b) co-cultivar una célula T positiva CD8 con un exosoma que presenta en su superficie un complejo de un antigeno HLA y el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y (c) introducir detro de una célula T CD8-positiva un polinucleótido/polinucleótidos que codifica polipéptidos de subunidad (TCR) receptor de célula T, en donde el TCR formado por dichos polipéptidos de subunidad TCR es capaz de enlazar a un complejo de un antigeno. HLA y el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 6 en una superficie celular.

13. Un APC aislado que presenta en su superficie un complejo del antigeno HLA y el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. El APC de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es inducido por el método de conformidad con la reivindicación 11.

15. Un CTL aislado caracterizado porque tiene como objetivo el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. El CTL de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15, caracterizado porque es inducido por el método de conformidad con la reivindicación 12.

17. Un método para inducir una respuesta inmunitaria contra cáncer en un sujeto, dicho método caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que comprende el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un fragmento inmunológicamente activo del mismo, o un polinucleótido que codifica el péptido o el fragmento.

18. Un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo caracterizado porque es contra el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. Un vector caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que codifica el péptido de conformidad con cualquiera de las. reivindicaciones 1 a 6.

20. Una célula hospedera caracterizada porque es transformada o transfectada con el vector de conformidad con la reivindicación 19.

21. Un kit de diagnóstico caracterizado porque comprende un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7 o el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18.

22. Un método para la selección de un péptido que tiene una habilidad para inducir un CTL que tiene una actividad citotóxica especifica contra una célula que presenta un fragmento derivado de · TOPK, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (i) proporcionar una secuencia candidato que consiste de una secuencia de aminoácidos modificada por sustitución, eliminación, inserción y/o adición de uno, dos o muchos residuos de aminoácidos a una secuencia de aminoácido original, en donde la secuencia de aminoácido original se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51, 53, 54, 62, 63, 64, 66, 71, 72 y 76; (ii) seleccionar una secuencia candidato que no tiene una homología importante sustancial con los péptidos derivados de algunos de los productos conocidos de gen humano que no son TOPK; (iii) poner en contacto un péptido que consiste de la secuencia candidato seleccionada en la etapa (ii) con una célula presentando antígeno; (iv) poner en contacto la célula que presenta antígeno de la etapa (c) con una célula T CD8-positiva; y (v) identificar el péptido del cual la inducción CTL es la misma o más alta . que un péptido que consiste de la secuencia de aminoácido original.