MX2014000748A - Extracto proteolitico a partir de bromelaina para el tratamiento de transtornos del tejido conectivo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaina para el tratamiento de enfermedades del tejido conectivo; en particular, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un extracto proteolitico obtenido a partir de bromelaína para el tratamiento de enfermedades tale como la enfermedad de Dupuytren y enfermedad de Peyronie.

Description

EXTRACTO PROTEOLÍTICO A PARTIR DE BROMELAÍNA PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DEL TEJIDO CONECTIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína para el tratamiento de enfermedades del tejido conectivo. En particular, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína para el tratamiento de enfermedades tale como la enfermedad de Dupuytren y enfermedad de Peyronie.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El colágeno es el principal componente del tejido conectivo y se encuentra principalmente en tejidos fibrosos tales como un tendón, un ligamento y en la piel. Varias enfermedades y condiciones están asociadas con el exceso de deposición de colágeno, las más comunes son la enfermedad de Dupuytren y la enfermedad de Peyronie.

La enfermedad de Dupuytren (DD) es un trastorno del tejido conectivo de producción anormal de colágeno y la deposición en la mano se caracteriza normalmente por la contractura de articulaciones metacarpofalángicas (MCPJ) y articulaciones próximas interfalángícas (PIPJ) en los dedos anular y meñique. La proliferación y diferenciación del fibrablasto en miofibroblastos con exceso de deposición de colágeno en el nivel de la fascia palmar causa formación de nodulos y cordón fibroso en la palma y/o en los dígitos. Los cordones fibrosos o nodulos pueden tener varios grosores, desde 1 milímetro de diámetro para los cordones fibrosos a casi 10 milímetros de diámetro para los nodulos fibrosos. Conforme la enfermedad avanza, los cordones comienzan a contraerse, lo que ocasiona deformidades de flexión del dedo (contracturas de flexión) que interfieren con y disminuyen la función de la mano.

El predominio de la DD aumenta con la edad y los hombres son, por lo general, los más afectados. Se cree que la susceptibilidad genética, el cigarro, el alcohol, la diabetes mellitus, la epilepsia y las el trabajo manual repetitivo son factores comunes de riesgo para la DD. La severidad y el progreso de la DD se pueden clasificar por el grado afectado de la contractura de flexión digital.

Actualmente, la fasciectomía es el tratamiento más ampliamente usado para el DD lo cual proporciona resultados positivos aunque temporales para la mayoría de los pacientes. Sin embargo, la fasciectomía quirúrgica involucra normalmente complicaciones quirúrgicas comunes (por ejemplo, infección, hematoma, pérdida de tejido) al igual que complicaciones específicas tales como daño del nervio digital, pérdida de dedos, pérdida de colgajo cutáneo, problemas de sanación de herida y rigor posoperatorio. Además, la fasciectomía involucra una larga recuperación y no ofrece una cura definitiva ya que la DD tiene una tasa de recurrencia extremadamente alta. Se han intentando procedimientos mínimamente invansivos que utilizan agujas o cuchillas delgadas, aunque tales procedimientos provocan menos complicaciones, aumentan la tasa de recurrencia. También se han desarrollado intervenciones no quirúrgicas e incluyen radioterapia, utrasonido, inyección de vitamina A, vitamina E, esferoides e interferón-?.

Los estudios in vitro han demostrado la capacidad de la colagenasa de disminuir el módulo de tensión y la fuerza necesaria para romper el tejido del cordón de Dupuytren, lo que indica que la colagenasa puede ser eficaz en la fasciotomía enzimática. Recientemente, los estudios clínicos han demostrado que el tratamiento con colagenasa Clostrídium histolytcum liberó contracturas de DD y mejoró la amplitud de movimiento en las articulaciones afectadas. Un seguimiento de 8 años a la inyección de colagenasa en pacientes con DD mostró que la contractura de MCPJ fue menos severa después de la recurrencia de la enfermedad, en comparación con la contractura inicial antes de aplicar el tratamiento de colagenasa. También se ha demostrado que el colágeno de Tipo III, el cual está normalmente ausente en la fascia palmar adulta, es abundante en el tejido de pacientes con DD.

La enfermedad de Peyronie es un trastorno del tejido conectivo que involucra el crecimiento de placas fibrosas ricas en colágeno en el tejido suave del pene que afecta hasta a 10% de los hombres. Específicamente, las placas fibrosas están formadas en la túnica albugínea, la capa gruesa de tejido que rodea los cuerpos cavernosos, ocasionan una curvatura anormal que a menudo está relacionada con dolor.

La cirugía es el único enfoque para tratar la enfermedad de Peyronie, el cual parece tener una eficacia predeciblemente repetible. La cirugía se indica solo en casos a largo plazo en los que la enfermedad se estabiliza y la deformidad evita el coito y/u ocasiona dolor extremo. Sin embargo, pueden surgir complicaciones a partir de la cirugía, incluido un acortamiento permanente del pene.

También están disponibles los enfoques no quirúrgicos para el tratamiento de la enfermedad de Peyronie, aunque en su mayoría todos son ineficaces. Se han realizado intentos de disolver las placas mediante inyecciones directas intralesional. De las metodologías de inyección, aquellas que involucran colagenasa clostridial parecen mostrar la eficacia más consistente, aunque siguen estando un poco limitadas de efecto y de duración. Además, se han intentado la terapia con radiación y tecnología con láser.

La Patente de E.U.A No. 5,589,171 y 6,086,872 y la Patente de E.U.A. Republicada No. RE39.941 describen métodos para tratar a un individuo que sufre la enfermedad de Dupuytren, tales métodos comprenden aplicar colagenasa a una fascia palmar fibrosa.

La Patente de E.U.A. No. 6,022,539 describe métodos para tratar a un individuo que sufre la Enfermedad de Peyronie, tales métodos comprenden inyectar colagenasa a una placa de Peyronie fibrosa en el pene del individuo.

La Patente de E.U.A. 6,353,028 describe un medicamento tópico que comprende agentes bloqueadores de los canales de calcio y agentes portadores que facilitan el suministro transdérmico del bloqueador de los canales de calcio para el tratamiento de los trastornos del tejido conectivo: enfermedad de Peyronie, enfermedad de Dupuytren y Fibrosis de Ledderhose.

La Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A No. 2008/0206228 describe un medicamento que contiene ácido hialurónico o derivados del mismo en relación con colagenasa para el tratamiento de varios tipos de heridas, quemadas, úlceras por presión, úlceras vasculares y úlceras de pie diabético al igual que para el tratamiento de cicatrices hipertróficas y queloides. El tratamiento de la enfermedad de Dupuytren se describe explícitamente.

La Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 2004/037183 describe métodos y composiciones para tratamiento de condiciones que involucran fibrosis, entre las que se describen la enfermedad de Peyronie y la enfermedad de Dupuytren. Las composiciones comprenden un inhibidor de fosfodiesterasa (PDE)~4, un inhibidor de PDE-5 o un compuesto que eleva el cGMP, por mencionar algunos.

El uso de inhibidores del cíelo de células, incluidos los agentes antimicrotúbulos, antimetabolitos, agentes alquilantes, alcaloides de la vinca, inhibidores de PDE, metaloproteinasa de matriz que incluye colagenasas, para tratar una contractura tal como la contractura de Dupuytren o contractura de Peyronie, se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2005/074913.

En ninguna parte de los antecedentes de la técnica se describe o sugiere que las enzimas proteolíticas de fuentes vegetales sean útiles para tratar trastornos del tejido conectivo que involucran la deposición en exceso de colágeno.

Se ha descubierto que los extractos derivados del tallo de la planta de piña {Ananas comosus) remueven de manera selectiva el tejido desvitalizado. Tales extractos, también llamados bromelaína, contienen varias enzimas proteolítica e hidrolíticas.

La Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 2006/054309 para el solicitante de la presente invención, describe una composición de desbridamiento obtenida a partir de bromelaína que comprende la mayoría de las enzimas proteolíticas presentes en la bromelaína, las enzimas proteolíticas tienen un peso molecular promedio de 23 kDa. La publicación WO 2006/054309 describe además usos de dicha composición de desbridamiento para el desbridamiento de tejidos no viables.

Esto sigue siendo una necesidad no lograda por los métodos no invasivos mejorados para tratar enfermedades del tejido conectivo que involucran la deposición en exceso de colágeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína para el tratamiento de enfermedades del tejido conectivo. En particular, la presente invención proporciona un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína para el tratamiento de enfermedades del tejido conectivo que se relacionan con la deposición en exceso de colágeno, incluida la enfermedad de Dupuytren y la enfermedad de Peyronie.

Ahora se describe por primera vez que un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína que comprende una o más de las proteasas de cisteína presentes en la bromelaína, por ejemplo, bromelaína o ananaína del tallo, es capas de degradar el colágeno nativo no desnaturalizado. Inesperadamente, la inyección del extracto proteolítico en un cordón de Dupuytren dio como resultado una ruptura del cordón mientras que mantuvo intacto el tejido conectivo saludable normal.

La presente invención además describe que la eficacia del extracto proteolítico para romper o disolver cordones de Dupuytren, es similar o incluso mayor que la de la colagenasa. Sin embargo, aunque la colagenasa puede ocasionar daño a ligamentos o tendones no enfermos debido a su afinidad por varios tipos de colágeno, el extracto proteolítico de la presente invención muestra la especificidad para los cordones enfermos. Así, el extracto proteolítico de la presente invención proporciona una medicación mejorada y segura para enfermedades del tejido conectivo que involucran deposición en exceso de colágeno, en particular, para el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren y de la enfermedad de Peyronie.

Debido al hecho de que altas concentraciones del extracto proteolítico se pueden preparar en volúmenes pequeños, tales volúmenes pequeños se pueden inyectar en los cordones o placas fibrosos enfermos, y así, evitar la extravasación y daño a tejidos alrededor, lo que simplifica el procedimiento clínico y por ello, aumentar la conformidad del paciente.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad del tejido conectivo que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento, una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un extracto proteolítico obtenido a partir de la bromelaína y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el extracto proteolítico comprende por lo menos una proteasa de cisteína seleccionada del grupo que consiste en bromelaína y ananaína del tallo, y en donde la enfermedad del tejido conectivo está relacionada con la deposición en exceso de colágeno.

De acuerdo con modalidades adicionales, la enfermedad de tejido conectivo se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Dupuytren, enfermedad de Peyronie, periartritis escapulohumeral y enfermedad de Ledderhose. De acuerdo con cierta modalidad, la enfermedad del tejido conectivo es la enfermedad de Dupuytren. De acuerdo con otra modalidad, la enfermedad del tejido conectivo es la enfermedad de Peyrionie.

De acuerdo con una modalidad, el extracto proteolítico comprende bromelaína y ananaína del tallo. De acuerdo con otra modalidad, el extracto proteolítico además comprende un precursor de proteasa de cisteína. De acuerdo con una modalidad adicional, el extracto proteolítico comprende además un fragmento de proteasa de cisteína. De acuerdo con una modalidad ejemplar, el extracto proteolítico comprende bromelaína y ananaína del tallo y un precursor de proteasa de cisteína.

De acuerdo con modalidades adicionales, la composición farmacéutica comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste de un agente anestésico, un agente antibacterial y un agente antiinflamatorio.

De acuerdo con aún otras modalidades, el agente anestésico se selecciona del grupo que consiste en ametocaína (tetracaína), lignocaína (lidocaína), xilocaína, bupivacaína, prilocaína, ropivacaína, benzocaína, mepivocaína, cocaína y combinaciones de las mismas. Cada posibilidad es una modalidad separada de la invención.

De acuerdo con modalidades adicionales, el agente antibacterial se selecciona del grupo que consiste en clorhidrato de amanfadina, sulfato de amanfadina, amikacina, sulfato de amikacina, amoglicósidos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, bacitracina, beta-lactanos, candicidina, capreomicina, carbenicilina, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, cefradina, cefaloglicina, quilón fenicoles, clorohexidina, gluconato de clorhexidina, cloridrato de clorhexidina, cloroxina, cloroquiraldol, clortetraciclina, clorhidrato de clortetraciclina, ciprofloxacina, circulina, clindamicina, clorhidrato de clindamicina, clotrimazol, cloxacilina, demeclociclina, diclosaxilina, diyodohidrixiquina, doxiciclina, clorhidrato de etambutol, eritromicina, estolato de eritromicina, estearato de erimicina, farnesol, floxacilina, gentamicina, sulfato de gentamicina, gramicidina, griseofulvina, haloprogina, haloquinol, hexaclorofeno, iminociclina, yodoclorhidroxiquina, kanamicina, sulfato de canamicinta, lincomicina, lineomicina, clorhidrato de lineomicina, macrólidos, meclociclina, metaciclina, clorhidrato de metaciclina, metanina, hipurato de metanamina, mandelato de metanamina, meticilina, metonidazol, miconazol, clorhidrato de miconazol, minocilina, clorhidrato de minocilina, mupirocina, nafcilina, neomicina, sulfato de neomicina, netilmicina, sulfato de netilmicina, nitrofurozano, norfloxacina, nistatina, octopirox, oleandomicina, orcefalosporinas, oxacilina, oxitetraciclina, clorhidrato de oxitetraciclina, paraclorometaxilenol, paramomicina, sulfato de paramomicina, penicilinas, penicilina G, penicilina V, pentamidina, clorhidrato de pentamidina, feneticilina, polimisinas, quinolonas, sulfato de estreptomicina, tetraciclina, tobramicina, tolnaftato, triclosán, trifampina, rifamicina, rolitetraciclina, sales de plata, espectinomicina, espiramicina, estruptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, tetraciclina, tobramicina, sulfato de tobramicina, triclocarbano, triclosán, trimetoprim sufametoxazol, tilosina, vancomicina e irotricina. Cada posibilidad es una modalidad separada de la invención.

De acuerdo con modalidades adicionales, el agente antünfrlamatorio se selecciona del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios no esteroideos y agentes antiinflamatorios esteroideos.

De acuerdo con modalidades todavía adicionales, la composición farmacéutica comprende además un componente seleccionado del grupo que consiste en un agente estabilizante, un antioxidante, un conservador, un agente regulador de pH, un agente quelante y un agente de tonicidad.

De acuerdo con modalidades todavía adicionales, la composición farmacéutica está formulada en una forma seleccionada del grupo que consiste en una formulación sólida, una formulación semi sólida, una formulación líquida y una formulación de espuma. De acuerdo con cierta modalidad, la formulación sólida es un polvo. De acuerdo con otra modalidad, la formulación líquida es una solución inyectable con un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.

De acuerdo con una modalidad ejemplar, la composición farmacéutica se administra por inyección al tejido fibroso enfermo. La composición farmacéutica se puede inyectar como una sola dosis o en alícuotas en dos o más ubicaciones en el tejido fibroso enfermo.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un extracto proteolítico para usarse en el tratamiento de una enfermedad de tejido conectivo, en donde el extracto proteolítico comprende por lo menos una proteasa de cisteína seleccionada del grupo que consiste en bromelaína y ananaína del tallo y en donde la enfermedad del tejido conectivo está relacionado con la deposición en exceso de colágeno.

Estas y otras modalidades de la presente invención serán mejor entendidas en relación con las figuras, descripción, ejemplos y reivindicaciones a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra la actividad colagenolítica de dos lotes del extracto proteolítico. Se incubaron concentraciones de incremento de los extractos proteolíticos (designadas como MD2 H-05-27 y MD5 H-10-46) durante 20 minutos en presencia de colágeno marcado de manera fluorescente de tipo IV. Al final de la incubación, se midió la fluorescencia. Los resultados se presentan en unidades de fluorescencia relativa (RFU).

La figura 2 es una gráfica que muestra la actividad colagenolítica del extracto proteolítico en colágeno de tipo I y de tipo IV. El extracto proteolítico se incubó en presencia de colágeno marcado de manera fluorescente de tipo I o colágeno de tipo IV durante varios periodos. Al final de la incubación, se midió la fluorescencia. Los resultados se presentan en unidades de fluorescencia relativa (RFU).

La figura 3 es una gráfica que muestra la actividad colagenolítica del extracto proteolítico en comparación con la de la colagenasa. La colagenasa Clostrídium histoliticum se incubó con colágeno marcado de manera fluorescente de tipo IV o gelatina marcada de manera fluorescente y la fluorescencia se midió al final de 20 minutos de incubación. El extracto proteolítico se incubó con colágeno marcado de manera fluorescente de tipo IV durante 20 minutos y, después de ello, se midió la fluorescencia.

La figura 4 es una gráfica que muestra la actividad gelatinasa del extracto proteolítico. Se incubaron concentraciones de incremento de dos lotes del extracto proteolítico (designadas como J-01-19 y J-14-45) durante 20 minutos en presencia de gelatina marcada de manera fluorescente y, después de ello, se midió la fluorescencia.

Las figuras 5A-5C son fotografías que muestran la remoción por escisión quirúrgica del cordón de Dupuytren de un paciente. La figura 5A es una fotografía que muestra la contractura anormal del dedo anular en un paciente con la enfermedad de Dupuytren. La figura 5B es una fotografía que muestra la remoción quirúrgica del cordón patológico. La figura 5C es una fotografía que muestra el cordón después de haberlo retirado de la cama palmar.

La figura 6 es una fotografía que muestra la disección del cordón de Dupuytren en dos.

La figura 7 es una fotografía que muestra el anclaje del cordón.

La figura 8 es una fotografía que muestra el paso de inyectar una solución al cordón de Dupuytren.

La figura 9 es una fotografía que muestra la máquina de estiramiento tensor.

Las figuras 10A-10B son fotografías que muestran el cordón antes y después de aplicar fuerza tensora. La figura 10A muestra el cordón antes de aplicar fuerza tensora. La figura 10B muestra el cordón después de aplicar fuerza tensora y antes de la ruptura del cordón.

La figura 11 muestra el efecto de la solución salina en el alargamiento del cordón de Dupuytren como una función de aplicar fuerza tensora. El cordón de Dupuytren se inyectó con solución salina y se incubó en solución salina durante 24 horas. Después de eso, el cordón se sometió a presión tensora y se evaluó el alargamiento y la ruptura del cordón.

La figura 12 muestra el efecto del extracto proteolíctico sobre el alargamiento del cordón de Dupuytren como una función de aplicar fuerza tensora. El cordón de Dupuytren se inyectó con el extracto proteolítico y se incubó en presencia del extracto proteolítico durante 24 horas. Después de eso, el cordón se sometió a presión tensora y se evaluó el alargamiento y la ruptura del cordón.

La figura 13 muestra el efecto de una sola inyección del extracto proteolítico sobre el alargamiento del cordón de Dupuytren como una función de aplicar fuerza tensora. Los cordones de Dupuytren se inyectaron con el extracto proteolítico y se incubaron en solución salina durante 24 horas. Después de eso, los cordones se sometieron a presión tensora y se evaluó el alargamiento y la ruptura del cordón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades del tejido conectivo que involucran deposición en exceso de colágeno, que comprenden administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento un extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína.

Una composición de desbridamiento obtenida para bromelaína (también denominada Debrase®) fue primero descrita en el documento WO 2006/054309 para el solicitante de la presente invención, el contenido del cual se incorpora como referencia como si se estableciera completamente en la presente descripción. La composición de desbridamiento descrita en WO 2006/054309 comprende proteasas de cisteína tal como bromelaína y ananaína del tallo. WO 2006/054309 además describe que la composición de desbridamiento desbridó piel quemada, es decir, tejido desvitalizado, de manera más eficiente que la bromelaína. Sin embargo, se descubrió que la composición de desbridamiento .es inactiva al desbridar piel o dermis saludable o vital (véase, por ejemplo Singer et al., 2010 J. Burn Care Res.: 31 304-309). Por lo tanto, la composición de desbridamiento, mostró ser activa contra tejidos desvitalizados, no contra tejidos viables.

Inesperadamente, la presente invención describe que un extracto proteolítico obtenido de bromelaína ejerció actividad colagenolítica in vitro y fue capaz de disolver los cordones fibróticos palmares obtenidos a partir de sujetos que sufrían la enfermedad de Dupuytren. Ya que el extracto proteolítico de la presente invención no degrada tejido conectivo saludable, la presente invención provee entonces un medicamento enzimático seguro y eficiente para disolver tejido fibroso rico en colágeno, específicamente en sujetos que sufren la enfermedad de Dupuytren o la enfermedad de Peyronie.

Los términos "extracto proteolítico obtenido a partir de bromelaína" y "extracto proteolítico" se usan de manera intercambiable a través de la especificación y de las reivindicaciones, y se refieren a una preparación enzimática parcialmente purificada de bromelaína.

El término "bromelaína" se refiere a cualquier número de las preparaciones en polvo de bromelaína comerclalmente disponibles. Ejemplos de fabricantes de bromelaína incluyen, pero no se limitan a, Sigma and Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan. La bromelaína se prepara a partir del tallo de la planta de la piña. Un procedimiento convencional para obtener bromelaína es el siguiente: el jugo del tallo de la planta de la piña se ajusta primero a un pH de aproximadamente 3 o 4 con ácido fosfórico y se agrega hidruro de sodio o hidrosulfuro de sodio para protegerlo contra la oxidación del sulfhidrilo. El material inerte se precipita en acetona aproximadamente a 30%, después de la filtración, el fluido clarificado es precipitado con acetona a 70%. Este precipitado se recolecta mediante centrifugación y se vuelve a disolver en agua que contiene hidruro de sodio o hidrosulfuro de sodio que ha sido acidificado con ácido fosfórico y reprecipitado, o secado directamente en un homo de vacío. Si el material se vuelve a precipitar, se utiliza acetona a 70%. El material seco de cualquier procedimiento es conveniente como un material de inicio para obtener la composición de desbridamiento de la presente invención.

El extracto proteolitico de la presente invención puede comprender una o más de las proteasas de cisteína presentes en la bromelaína. De acuerdo con una modalidad ejemplar, el extracto proteolitico (también denominado Debrase ® o Nexobrid®) comprende proteasas del tallo de bromelaína (EC 3.4.22.32) y ananaína (EC 3.4.22.31). El extracto proteolitico puede además comprender uno o más de los precursores de proteasa de cisteína de bromelaína tal como, por ejemplo, precursor de ananaína (EC 3.4.22.31), precursor de bromelaína de fruta (EC 3.4.22.33) y precursor de bromelaína de tallo (EC 3.4.22.31) El extracto proteolitico además puede comprender fragmentos de proteasa de cisteína (véase por ejemplo, WO 2006/054309), una lectina similar a jacalina (véase, por ejemplo, Rava, et al., Glycobioloby, 2004, 14(12): 1247-1263), y/o inhibidores de bromelaína.

El extracto proteolitico se puede preparar mediante un método que comprende los siguientes pasos: (a) suspender bromelaína con una solución acídica que opcionalmente comprende un antioxidante, la solución acídica tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 4; (b) ajustar la suspensión de (a) a un pH en el intervalo de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 4: (c) agregar una ayuda de filtro a la suspensión de (b); (d) filtrar la suspensión de (c) para remover los componentes insolubles; (e) agregar a la solución filtrada de (d) sal de sulfato de amoniaco para proporcionar saturación de sulfato de amoniaco en el intervalo de aproximadamente 40% a aproximadamente 50%; (f) ajustar la suspensión de (e) a un pH de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 4, (g) incubar la suspensión de (f) a 3°C a 10°C; (h) centrifugar la suspensión de (g) para proporcionar un precipitado de sulfato de amoniaco; (i) disolver el precipitado de sulfato de amoniaco en una solución acídica que opcionalmente comprende un antioxidante que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 4; (j) filtrar la solución de (i) a través de un ultra filtro de 10kDa; y (k) liofilizar la solución retenida de (j).

De acuerdo con algunas modalidades, suspender la bromelaina se puede realizar en cualquier solución acídica que tiene un pH entre aproximadamente 2.4 a 4. Los ejemplos de soluciones acidicas de soluciones reguladoras de pH que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a; ácido acético en agua, solución reguladora de pH de acetato y solución reguladora de pH de acetato que contiene ácido tioglicólico a 1%, pH 2.4-4. De acuerdo con ciertas modalidades ejemplares, la solución acídica se selecciona de soluciones reguladoras de pH y soluciones descritas en la Patente de E.U.A No. 5,830,739 y 4,197,291 , contenido de las cuales se incorpora como referencia como si se estableciera por completo aquí.

La solución acídica puede comprender opcionalmente un antioxidante. Los ejemplos de antioxidantes pueden incluir, pero no se limitan a, ácido ascórbico, dihidroquinona, hidroxitolueno butilado y ditiotreitol. El antioxidante se puede agregar a una concentración de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 2%, de preferencia a 1%.

La solución acídica puede comprender opcionalmente un agente humectante. Los ejemplos de los agentes humectantes incluyen, pero no se limitan a n-octanol.

El pH de la solución acídica, que opcionalmente comprende un antioxidante, puede estar en el intervalo de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 4. De acuerdo con cierta modalidad preferida, el pH de la solución acídica, que opcionalmente comprende un antioxidante, varía de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 2.6.

De acuerdo con modalidades adicionales, una ayuda de filtro se agrega a la suspensión de (a). De acuerdo con una modalidad, la ayuda de filtro comprende sílice. De preferencia, la ayuda de filtro es diatomita natural que es calcinada de manera que se logran velocidades de flujo más rápidas.

Precipitar las proteínas deseadas de realiza al agregar sal de sulfato de amonio a la solución filtrada del paso (d). La sal de sulfato de amoniaco se puede agregar para proporcionar saturación del sulfato de amonio en un intervalo de entre aproximadamente 40% a aproximadamente 50%. De preferencia, la sal de sulfato de amoniaco se puede agregar para proporcionar saturación a 40% de sulfato de amoniaco.

La suspensión del paso (f) se incuba entonces a una temperatura de entre 3°C a 10°C. De preferencia, la suspensión del paso (f) se incuba durante por lo menos 10 horas a temperaturas de entre 3°C a 10°C. Más preferiblemente, la suspensión del paso (f) se incuba durante 12-24 horas a 4°C.

Al final de la incubación, ia suspensión del paso (g) es centrifugada para precipitar las proteínas deseadas, es decir, las enzimas proteolíticas. El precipitado se disuelve entonces en solución acídica que opcionalmente comprende un antioxidante. De acuerdo con una modalidad ejemplar, la suspensión se incuba durante por lo menos 10 horas a 4°C.

La solución del paso (i) se somete a un paso de filtración para retener enzimas proteolíticas jque tienen pesos moleculares en exceso de aproximadamente 10 kDa. De acuerdo con una modalidad preferida, la solución del paso (i) se filtra a través de un filtro de membrana que tiene un peso molecular de corte de aproximadamente 10kDa.

El extracto proteolítico se puede liofilizar después de la filtración, se puede lavar con agua destilada y después liofilizar o se puede filtrar y después liofilizar. De acuerdo con la modalidad actualmente preferida, el extracto proteolítico se filtra a través de una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0.5 Dm para obtener una solución estéril, la cual es entonces liofilizada y almacenada. De preferencia, el extracto proteolítico se almacena como un polvo liofilizado ya que su estabilidad es prolongada en ausencia de humedad. Antes de usarlo, el extracto proteolítico se disuelve en una solución de manera que se obtiene una solución con un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.

De acuerdo con una modalidad ejemplar, el extracto proteolítico se puede preparar mediante el método que comprende los siguientes pasos: (a) suspender bromelaína con ácido acético de 0.3 M que comprende 1% de ácido ascórbico y n-octanol que tiene un pH de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 2.6; (b) ajusfar la suspensión de (a) a un pH en el intervalo de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 3.5: (c) agregar una ayuda de filtro que comprende sílice, a la suspensión de (b); (d) filtrar la suspensión de (c) a través de un filtro presa para remover los componentes insolubles; (e) agregar a la solución filtrada de (d), sal de sulfato de amoniaco (285 g/L) para proporcionar saturación a 40% de sulfato de amoniaco; (f) ajustar la suspensión de (e) a un pH de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 3.5, (g) incubar la suspensión de (f) durante aproximadamente 12-24 horas a 4°C. (h) centrifugar la suspensión de (g) para proporcionar un precipitado de sulfato de amoniaco; (i) disolver el precipitado de sulfato de amoniaco en ácido acético de 0.3 M que comprende 1% de ácido ascórbico que tiene un pH de aproximadamente 2.4 a aproximadamente 2.6; (j) filtrar la solución de (i) a través de un ultra filtro de 10kDa; (k) filtrar la solución retenida (j) Para proporcionar una solución estéril; y (I) liofilizar la solución retenida de (k).

Los términos "enfermedad de Dupuytren" y "DD" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una enfermedad en la que los dedos no se pueden extender por completo y normalmente están flexionados hacia la palma de la mano. Específicamente, la enfermedad de Dupuytren comienza con la formación de nodulos fibromatosos en la fascia palmar, normalmente en el lado ulnar. Los nodulos progresan y forman una banda o cordón fibroso que yace desde la palma hacia los dedos. Eventualmente esto da lugar a contracturas de flexión de los dedos. El dedo anular es el más comúnmente afectado, seguido por el dedo meñique.

Los términos "cordón de Dupuytren" y "el cordón enfermo" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a las bandas de las fibras faciales que corren de manera longitudinal por debajo de la piel palmar. Estas bandas dan lugar a contracturas de la piel de superposición y dígitos distales que están unidos a las bandas y eventualemente progresan a contractura de flexión permanente de los dígitos afectados. Normalmente, el cordón de Dupuytren comprende altos números de fibroblastos, deposición aumentada de proteínas de matriz extracelular (ECM), en particular colágeno, y miofibroblastos.

Se debe entender que el extracto proteolítico de la invención es útil para tratar individuos que tienen otras enfermedades relacionadas con deposición en exceso de colágeno. Otras malformaciones y anormalidades de tejido fibroso que involucran deposición de colágeno incluyen la enfermedad de Peyronie, Fibrosis de Ledderhose y fibrosis de las cápsulas articulares, capas de tendones y ligamentos. Así, el extracto proteolítico también puede ser útil para tratar la periartritis escapulohumeral (capsulitis adhesiva). Estas enfermedades del tejido conectivo que involucran deposición en exceso de colágeno o malformaciones de tejido fibroso no están relacionadas con heridas o quemaduras.

Tal como se usa aquí, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a la mejora o eliminación de por lo menos uno o más síntomas relacionados con una enfermedad del tejido conectivo. Por ejemplo, los síntomas relacionados con la enfermedad de Dupuytren incluyen contractura de articulación, disminución de la amplitud de movimiento de las articulaciones, por mencionar algunos. Los síntomas de la enfermedad de Peyronie incluyen, por ejemplo, dolor, curvatura anormal y disfunción eréctil.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" del extracto proteolítico es la cantidad del extracto proteolítico que es suficiente para proporcionar un efecto benéfico al sujeto al que se administra la composición.

El término "aproximadamente", cuando se refiere a un pH de una solución o de una suspensión pretende indicar que 0.5 unidades de pH por encima o por debajo del pH indicado, se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

La composición farmacéutica de la presente invención comprende el extracto proteolítico y un portador farmacéuticamente aceptable.

El término "farmacéuticamente aceptable" significa que tiene aprobación por parte de una agencia regulatoria del gobierno Federal o de un gobierno estatal o que está mencionado en la Farmacopea de E.U.A u otra farmacopea generalmente reconocida para usarse en animales, y más particularmente, en humanos.

El término "portador" se refiere a un diluyente, excipiente o a un vehículo con el que se administra el extracto proteolítico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, incluidos aquellos de petróleo, animales, vegetales o de origen sintético, tal como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares, glicoles de polietileno, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos. Las soluciones salinas, solución acuosa de NaCI/CaC , dextrosa acuosa, soluciones de glicerol y soluciones de albúmina se pueden emplear como portadores líquidos, en especial para soluciones inyectables. El agua también se puede usar como un portador cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa.

La composición farmacéutica puede comprender además agentes estabilizadores, tales como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, calcio, silicato, polivinil pirrolidona y celulosa. Además, la composición puede incluir agentes lubricantes, tal como, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; conservadores tal como Timerosal, alcohol bencílico, parabenos, metil- o propilhidroxibenzoatos; antioxidantes tal como ácido ascórbico, dihidroquinona, hidroxitolueno butilado y ditiotreitol; y agentes reguladores de pH tal como fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, benzoato de sodio, benzoato de potasio, citrato de sodio, acetato de sodio y tartrato de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiamintetraacético; y agentes para ajustar la tonicidad, tal como cloruro de sodio o dextrosa.

La composición farmacéutica puede comprender además un agente anestésico.

Los agentes anestésicos incluyen, pero no se limitan a ametocaína (tetracaína), lignocaína (lidocaína), xilocaína, bupivacaína, prilocaína, ropivacaína, benzocaína, mepivocaína, cocaína y combinaciones de estos.

La composición farmacéutica puede comprender además un agente antibacterial.

Los agentes antibacteriales incluyen, pero no se limitan a clorhidrato de amanfadina, sulfato de amanfadina, amikacina, sulfato de amikacina, amoglicósidos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, bacitracina, beta-lactanos, candicidina, capreomicina, carbenicilina, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, cefradina, cefaloglicina, quilón fenicoles, clorohexidina, gluconato de clorhexidina, cloridrato de clorhexidina, cloroxina, cloroquiraldol, clortetraciclina, clorhidrato de clortetraciclina, ciprofloxacina, circulina, clindamicina, clorhidrato de clindamicina, clotrimazol, cloxacilina, demeclociclina, diclosaxilina, diyodohidrixiquina, doxiciclina, clorhidrato de etambutol, eritromicina, estolato de eritromicina, estearato de erimicina, farnesol, floxacilina, gentamicina, sulfato de gentamicina, gramicidina, griseofulvina, haloprogina, haloquinol, hexaclorofeno, iminociclina, yodoclorhidroxiquina, kanamicina, sulfato de canamicinta, lincomicina, lineomicina, clorhidrato de lineomicina, macrólidos, meclociclina, metacidina, clorhidrato de metaciclina, metanina, hipurato de metanamina, mandelato de metanamina, meticilina, metonidazol, miconazol, clorhidrato de miconazol, minocilina, clorhidrato de minocilina, mupirocina, nafcilina, neomicina, sulfato de neomicina, netilmicina, sulfato de netilmicina, nitrofurozano, norfloxacina, nistatina, octopirox, oleandomicina, orcefalosporinas, oxacilina, oxitetraciclina, clorhidrato de oxitetraciclina, paraclorometaxilenol, paramomicina, sulfato de paramomicina, penicilinas, penicilina G, penicilina V, pentamidina, clorhidrato de pentamidina, feneticilina, polimisinas, quinolonas, sulfato de estreptomicina, tetraciclina, tobramicina, tolnaftato, triclosán, trifampina, rifamicina, rolitetraciclina, sales de plata, espectinomicina, espiramicina, estruptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, tetraciclina, tobramicina, sulfato de tobramicina, triclocarbano, triclosán, trimetoprim sufametoxazol, tilosina, vancomicina e irotricina.

De acuerdo con incluso otra modalidad, la composición farmacéutica puede comprender además un agente antiinflamatorio.

El agente antiinflamatorio puede ser no esteroideo, esteroideo o una combinación de estos. Los ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios no esteroideo incluyen, oxicams, tal como piroxicam, isoxicam, tenoxicam, dusoxicam; salicilatos, tal como aspirina, disálcido, benorilato, trilisato, safaprin, solprin, diflunisal y fendosal; derivados de ácido acético, tal como diclofenaco, fenclofenaco, indometacina, sulindaco, tolmetina, isoxepac, furofenaco, tiopinaco, zidometacina, acematacina, fentiazaco, zomepiraco, clindanaco, oxepinaco, felbinaco y ketorolaco; fenamatos, tal como ácidos mefenámico, meclofenámico, flufenámico, niflúmico y tolfenámico; derivados de ácido propiónico, tal como ibuprofeno, naproxeno, benoxaprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, indoprofeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno y tiaprofénico; pirazoles, tal como fenilbutazona, oxifenbutazona, feprazona, azapropazona y trimetazona. 'También se pueden usar los extractos de estos agentes antiinflamatorios no esterodeos.

Los ejemplos no limitantes de fármacos antiinflamatorios no esteroideos incluyen corticoesteroides, tales como hidrocortisona, triamicinolona hidroxil, deametasona alfa-metil, fosfato dexametasona, dipropionatos de beclometasona, valerato de clobetasol, , desonida, desoximetasona, acetato de desoxicoricoesterona, dexametasona, diclorisona, diacetato de diflorasona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, acetónido de fluclorolona, fludrocortisona, pivalato de flumetasona, acetónido de fluosinolona, fluocinonida, butilésteres de flucortina, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinonida, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metilprednisolona, acetónido de triamcinolona, cortisona, cortodoxona, flucetónido, fludrocorisona, diacetato de difluorosano, fluradrenolona, fludrocortisona, diacetato de diflurosona, acetónido de fluradrenolona, dedrisona, amcinafelo, amcinafida, betametasona y el balance de sus ésteres, cloroprednisona, acetato de clorprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, diflurprednato, flucloronida, flunisolida, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, valerato de hidrocortisona, ciclopentilpropionato de hidrocortisona, hidrocortamato, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona, triamcinolona, y los extractos de los mismos.

La composición farmacéutica se puede formular como una formulación seca o liofilizada, una formulación semisólida, una formulación líquida o una formulación de espuma. Así, la composición farmacéutica se puede formular en la forma de un polvo, de una solución, de una suspensión, de una emulsión, de un gel, de atomización o de un parche.

La composición farmacéutica se puede administrar en el sitio afectado de manera tópica, subcutánea, intracutánea o intramuscular.

De acuerdo con cierta modalidad, la composición farmacéutica se administra por medio de inyección. De acuerdo con una modalidad ejemplar, la composición farmacéutica se inyecta directamente en los nodulos o cordones fibrosos enfermos o en la placa fibrosa. Alternativamente, la composición farmacéutica se implanta en una incisión quirúrgica. Las preparaciones inyectables estériles se pueden formular como soluciones acuosas o suspensiones oleaginosas, tal como se conoce en la técnica.

Para uso tópico sobre la piel, la composición farmacéutica se puede formular en la forma de un ungüento, una crema, una loción, una pasta, una atomización o un aerosol. Los ejemplos de vehículos convenientes incluyen, pero no se limitan a, petrolato, aquafor, neobase, propilen glicol, glicerina y los similares. También se pueden usar las combinaciones de dos o más de estos vehículos.

La composición farmacéutica se puede formular como formulaciones de liberación controlada o sostenida, lo que permite la liberación extendida de los componentes activos durante un periodo predeterminado. En cierta modalidad, la composición farmacéutica se administra en combinación con un implante polimérico biodegradable y biocompatible, que libera el extracto proteolítico durante un periodo controlado en un sitio seleccionado. Los ejemplos de materiales poliméricos incluyen polianhídridos, poliortoésteres, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, acetato de polietileno vinilo, copolímeros y mezclas de los mismos (véase, Medical applications of controlled reléase, Langer and Wise (eds.) 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Fia.). Alternativamente, la composición farmacéutica se aplica de manera tópica como un gel. Los ejemplos de materiales poliméricos que se pueden usar son polisacáridos, en particular derivados de celulosa, tal como por ejemplo, celulosa de hidroxipropilo, celulosa de carboximetilo y celulosa de hidroxietilo, quitina, quitosan y alginatos. La formulación de gel podría permitir la liberación extendida de componentes activos durante un periodo predeterminado.

La composición farmacéutica se puede formular como una espuma. Los propulsores de gas se usan para generar y administrar una composición espumable como espuma. Los ejemplos de propulsores de gas convenientes incluyen hidrocarburos volátiles, tal como, butano, propano, isobutano o mezclas de los mismos, y gases de fluorocarbono. La composición puede ser acuosa, emulsión de aceite en agua o emulsión de agua en aceite, y que además comprenda un agente estabilizante. El agente estabilizante aumenta la viscosidad de la composición, puede contribuir a la estabilidad de la composición y/o ralentiza la velocidad de colapso de la espuma. Los ejemplos de agentes estabilizantes incluyen, pero no se limitan a, materiales poliméricos de origen natural (por ejemplo, alginato, albúmina, carragenina, goma de xantano, almidón), materiales poliméticos semisintéticos, tales como éteres de celulosa (por ejemplo, celulosa de hidroxietilo, celulosa de metilo, celulosa de carboximetilo, hidroxipropilmetilcelulosa), y materiales poliméricos sintéticos (por ejemplo, aclohol polivinílico, polímeros de carboxivinilo y polivinilpirrolidona).

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, el cual se incorpora aquí como referencia.

La composición farmacéutica se puede administrar como una sola dosis o en alícuotas en dos o más ubicaciones en el tejido fibroso afectado. La cantidad del extracto proteolítico que se debe administrar es una cantidad efectiva que suaviza y/o rompe la placa. Una cantidad efectiva del extracto proteolítico puede variar de aproximadamente 0.2 mg/dia a aproximadamente 40 mg/día. En cierta modalidad, la composición farmacéutica se administra en dos o más alícuotas, cada una comprende alrededor de 0.5 a 1.5 mg, opcionalmente de 0.2 a 0.5 mi de solución o suspensión.

En ciertas modalidades, el órgano en el que se administra la composición farmacéutica que comprende el extracto proteolítico, es inmovilizado durante varias horas, por ejemplo, de 2 a 12 horas.

Cada posibilidad descrita a través de la especificación es una modalidad separada de la invención.

Los siguientes ejemplos se presentan para proveer un entendimiento más completo de la invención. Las técnicas, condiciones, materiales, proporciones específicas y los datos reportados, expuestos para ilustrar los principios de la invención, son ejemplares y no se deben considerar como limitantes para el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 La actividad colagenolítica del extracto proteolítico El extracto proteolítico se obtuvo a partir de bromelaína, tal como se describe en WO 2006/054309.

Primero se determinó la capacidad de dos lotes de Debrase para degradar colágeno de tipo IV. El ensayo se basó en un Kit de Ensayo de Gelatinasa/colagenasa de EnzCheck® (Invitrogen), el cual contenía colágeno DQ de tipo IV™ marcado con fluoresceína. Se conoce que este sustrato es eficazmente digerido por colagenasas para proporcionar péptidos altamente fluorescentes. El aumento de fluorescencia es proporcional a la actividad proteolítica.

A cada pocilio, se agregó una solución reguladora de pH de reacción Debrase (Tris-HCI de 0.15 M y EDTA de 10 mM EDTA, pH 7.6) para obtener un volumen final de 100 µL·. Después se agregaron 10 µ? de 0.5 µg/µl de solución de colágeno DQ de tipo IV™, a los pocilios. Después, diferentes volúmenes (10 - 80µ?) de Debrase recién preparada a una concentración de 0.225 - 1 ng/µ? se agregaron a los pocilios en solución reguladora de pH Debrase para lograr concentraciones de 1.5 - 20 ng/pocillo. La solución reguladora de pH Debrase se usó como un control negativo. La placa de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para detener la reacción, se agregaron 20 µ?_ de solución para detener reacciones (ácido yodoacético de 0.324 mM en solución reguladora de pH Debrase). La intensidad de fluorescencia se midió por medio de un lector de microplacas de fluorescencia (Analyst AD, LJL) equipado con filtros estándares de fluorescencia. La fluorescencia de fondo de los pocilios incubados con ausencia de enzima fue sustraída.

La figura 1 muestra la actividad colagenolitica de dos lotes de Debrase. Como se muestra en la figura, los dos lotes de Debrase ejercieron actividad colagenolitica similar que indicó que el procedimiento experimental para obtener el extracto proteolítico de la presente invención proporciona preparaciones consistentes de enzima.

Después se determinó la capacidad del extracto proteolítico para degradar colágeno de tipos I y IV. Para ello, se usó colágeno DQ de tipo IV™ y colágeno DQ de tipo I™ marcados con fluoresceína. El ensayo se realizó tal como se describió anteriormente y continuó durante los periodos que se indican en la figura 2. La reacción se detuvo al agregar 20 µ? de solución para detener reacciones (ácido yodoacético de 0.324 mM en solución reguladora de pH Debrase) y la intensidad de fluorescencia se midió tal como se describe aquí anteriormente.

La colagenasa purificada a partir de Clostridium histolyticum sirvió como un control positivo con actividad predefinida (una unidad se definió como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 micromol de equivalentes de E-leucina a partir de colágeno en 5 horas a 37°C, pH 7.5).

Para el ensayo con colagenasa de Clostridium histolyticum , se agregó una solución reguladora de pH de reacción para colagenasa (Tris-HCI de 0.05 M, NaCI de 0.15 M, CaCI2 de 5 mM, azida de sodio de 0.2 mM, pH 7.6) para obtener un volumen final de 100 µ?_ por cada pocilio. Después, diferentes volúmenes (10 a 80 µ?_) de colagenasa Clostridium, 0.4 - 1 G??)/µ?_, en solución reguladora de pH de colagenasa Clostridium se agregaron a pocilios de referencia para alcanzar concentraciones que varía de 5 to 80 mU/pocillo. Para detener la reacción de colagenasa Clostridium, se agregaron - 20 µL· de 2 mg/ml 1 ,10-fenantrolina en solución reguladora de pH de colagenasa.

Los datos de la colagenasa Clostridium se usaron como un valor de referencia por mUnidad. Los datos de las muestras de extracto proteolítico (también llamado Debrase) se dividieron entre el valor de referencia para determinar mU/ng de Debrase.

La figura 2 muestra que el extracto proteolítico degradó colágeno de tipo I y IV con actividad específica de 1.58 y 1.27 mU/ng, respectivamente.

Después, la actividad del extracto proteolítico se comparó con la actividad de colagenasa Clostridium histolyticum contra la del colágeno. La actividad proteolítica de la colagenasa contra gelatina también se midió al usar el Kit de Ensayo de Gelatinasa/colaginasa EnzChek® (Invitrogen) y gelatina DQ™ (Invitrogen) como un sustrato.

La figura 3 muestra que el extracto proteolítico ejerció actividad colagenolítica contra colágeno de tipo IV, cuya actividad fue más alta que la obtenida por la colagenasa comercialmente disponible contra el colágeno.

La figura 4 muestra que el extracto proteolítico ejerció actividad de gelatinasa. Como se muestra en la figura, la actividad de gelatinasa del extracto proteolítico fue lineal en un intervalo de concentración de 2-8 n/g pocilio.

EJEMPLO 2 El extracto proteolítico facilita la ruptura del cordón de Dupuvtren Los cordones de Dupuytren se obtuvieron de pacientes que se sometieron a una fascioctomía (figuras 5A, 5B y 5C). Todos los sujetos firmaron formatos de consentimiento antes de la cirugía y el estudio fue aprobado por un comité de Helsinki. El experimento examinó la capacidad del extracto proteolítico para realizar la fasciectomía del cordón.

Preparación del tejido Los cordones obtenidos del os pacientes se dividieron en dos o tres pieza, dependiendo de su longitud (figura 6). Los cordones se conectaron, mediante la técnica Krackov, a un dispositivo de prueba mecánica vía una sutura de prolene 1 (Ethicon, Somerville, NJ) (figura 7). Uno de los dos cordones se inyectó con el extracto proteolítico (0.3 a 0.5 mi del extracto proteolítico, según el tamaño del cordón) y el segundo cordón de control se inyectó con solución salina (figura 8). Los cordones del grupo del extracto proteolítico se sumergieron en la solución de extracto proteolítico y los cordones del grupo de control se sumergieron en la solución salina. Ambos grupos se incubaron a 37°C durante 24 horas.

Prueba mecánica Después de 24 horas de incubación, todos los cordones se conectaron a un dispositivo de prueba de presión tensora mecánica (sistema de prueba Zwick 1445, Zwick Co., Alemania). Cada cordón se sometió a una carga en aumento hasta que el cordón o la sutura de conexión se rompieron. El dispositivo midió la fuerza de tensión hasta la ruptura.

Análisis histológico Una muestra de cada espécimen se obtuvo para análisis histológico y para determinar el estado de la enfermedad.

Análisis estadístico La eficiencia del grupo de control comparada con el grupo de estudio se evaluó al usar una prueba exacta Fisher.

Resultados Todos los cordones tratados con el extracto proteolítico (n=10) se rompieron después del estiramiento (figuras 10A y 10B). Algunos de los cordones tratados con el extracto proteolítico se rompieron casi por completo, prácticamente se disolvieron, antes de la prueba mecánica. Todos los cordones de control (n=9) no se rompieron después de aplicar la fuerza de tensión. Como se representa en la figura 11 , todos los cordones de control mostraron un patrón de alargamiento de presión similar representado por un alargamiento limitado con presión en aumento del cordón hasta que se rompió cuando se aplicó una carga muy alta. Por el contrario, todos los cordones tratados con el extracto proteolítico presentaron pérdida de la fuerza de tensión del cordón, lo que culminó en la ruptura del cordón a una presión muy baja (figura 12). Estos resultados demostraron que bajas dosis, es decir 0.8 mg/ml, del extracto proteolítico fueron capaces de romper los cordones de Dupuytren enfermos y que este efecto se demostró todavía más en dosis mayores del extracto proteolítico, es decir, hasta 150 mg/ml.

Para evaluar el efecto de una sola inyección del extracto proteolítico sobre el estiramiento del cordón de Dupuytren, los cordones se inyectaron con el extracto proteolítico en tres sitios diferentes a lo largo del cordón, y después se incubaron en solución salina en ausencia del extracto proteolítico durante 24 horas a 37°C.

La figura 13 muestra que inyecciones del extracto proteolítico suministradas en tres sitios de los cordones de Dupuytren, fueron capaces de reducir la fuerza de tensión de los cordones en un factor de 4 a 5 (véase, la figura 13, prueba 1a y 2 que muestran la ruptura de cordón a una presión de 18 N y 15 N, respectivamente 13). Un cordón (figura 13, prueba 1 b) se sometió a una presión de 0.4 N. Estos resultados demostraron la eficacia del extracto proteolítico para disolver cordones de Dupuytren y claramente implican que el extracto proteolítico de la presente invención es un medicamento enzimático altamente eficaz para la enfermedad de Dupuytren, al igual que para otras enfermedades del tejido conectivo que involucran deposición en exceso de colágeno.

Las personas expertas en la técnica apreciaran que la presente invención no está limitada por lo que se ha mostrado y descrito en particular anteriormente. En lugar de eso, el alcance de la invención está definido por las reivindicaciones anexas.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. El uso de una composición farmacéutica que comprende un extracto proteolítico para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad del tejido conectivo, en donde el extracto proteolítico comprende por lo menos una proteasa de cisteína seleccionada del grupo que consiste en bromelaína y ananaína de tallo, y en donde la enfermedad del tejido conectivo está asociada con deposición en exceso de colágeno.

2. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la enfermedad del tejido conectivo se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Dupuytren, enfermedad de Peyronie, periartritis escapulohumeral y enfermedad de Ledderhose.

3. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la enfermedad del tejido conectivo es enfermedad de Dupuytren.

4. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la enfermedad de tejido conectivo es enfermedad de Peyronie.

5. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el extracto proteolítico comprende bromelaína y ananaína de tallo.

6. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el extracto proteolítico adicionalmente comprende por lo menos un precursor de proteasa de cisteína.

7. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica adicionalmente comprende un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente anestésico, un agente antibacterial y un agente antiinflamatorio.

8. El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde el agente anestésico se selecciona del grupo que consiste en ametocaína (tetracaína), lignocaína (lidocaína), xilocaína, bupivacaína, prilocaína, ropivacaína, benzocaína, mepivocaína, cocaína y combinaciones de las mismas.

9. El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde el agente antibacterial se selecciona del grupo que consiste en clorhidrato de amanfadina, sulfato de amanfadina, amikacina, sulfato de amikacina, amoglicósidos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, bacitracina, beta-lactanos, candicidina, capreomicina, carbenicilina, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, cefradina, cefaloglicina, quilón fenicoles, clorohexidina, gluconato de clorhexidina, cloridrato de clorhexidina, cloroxina, cloroquiraldol, clortetraciclina, clorhidrato de clortetraciclina, ciprofloxacina, circulina, clindamicina, clorhidrato de clindamicina, clotrimazol, cloxacilina, demeclociclina, diclosaxilina, diyodohidrixiquina, doxiciclina, clorhidrato de etambutol, eritromicina, estolato de eritromicina, estearato de erimicina, farnesol, floxacilina, gentamicina, sulfato de gentamicina, gramicidina, griseofulvina, haloprogina, haloquinol, hexaclorofeno, iminociclina, yodoclorhidroxiquina, kanamicina, sulfato de canamicinta, lincomicina, lineomicina, clorhidrato de lineomicina, macrólidos, meclociclina, metaciclina, clorhidrato de metaciclina, metanina, hipurato de metanamina, mandelato de metanamina, meticilina, metonidazol, miconazol, clorhidrato de miconazol, minocilina, clorhidrato de minocilina, mupirocina, nafcilina, neomicina, sulfato de neomicina, netilmicina, sulfato de netilmicina, nitrofurozano, norfloxacina, nistatina, octopirox, oleandomicina, orcefalosporinas, oxacilina, oxitetraciclina, clorhidrato de oxitetraciclina, paraclorometaxilenol, paramomicina, sulfato de paramomicina, penicilinas, penicilina G, penicilina V, pentamidina, clorhidrato de pentamidina, feneticilina, polimisinas, quinolonas, sulfato de estreptomicina, tetraciclina, tobramicina, tolnaftato, triclosán, trifampina, rifamicina, rolitetraciclina, sales de plata, espectinomicina, espiramicina, estruptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, tetraciclina, tobramicina, sulfato de tobramicina, triclocarbano, triclosán, trimetoprim sufametoxazol, tilosina, vancomicina e irotricina.

10. El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en agentes antiinflamatorios no esteroideos y agentes antünflamatorios esteroideos.

11. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica adicionalmente comprende un componente seleccionado del grupo que consiste en un agente estabilizante, un antioxidante, un conservador, un agente regulador de pH, un agente quelante y un agente de tonicidad.

12. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica está formulada en una forma seleccionada del grupo que consiste en una formulación sólida, una formulación semi sólida, una formulación líquida y una formulación de espuma.

13. El uso como el que se reclama en reivindicación 12, en donde la formulación sólida es un polvo.

14. El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde la formulación líquida es una solución inyectable con un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.

15. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección al tejido fibroso enfermo.

16. El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección como una dosis única.

17. El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección en alícuotas en dos o más ubicaciones en el tejido fibroso enfermo.