KR101921363B1

KR101921363B1 - 결합 조직 질환을 치료하기 위한 브로멜라인으로부터의 단백분해 추출물

Info

Publication number: KR101921363B1
Application number: KR1020147001264A
Authority: KR
Inventors: 리오르 로젠버그; 가이 루빈; 에일론 에스쿨라이
Original assignee: 메디운드 리미티드
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2018-11-22
Also published as: ES2690568T3; DK2734216T3; JP6049714B2; EP2734216A4; EP2734216B1; JP2014520881A; RU2014106299A; CA2842291C; WO2013011514A1; AU2012285378B2; PT2734216T; PL2734216T3; US20170049865A1; US20140154229A1; US9511126B2; EP2734216A1; MX350145B; CN103687607A; CA2842291A1; ZA201400946B

Abstract

본 발명은 결합 조직 질환을 치료하기 위한 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 듀프트렌 질환(Dupuytren's disease) 및 파이로니 질환(Peyronie's disease) 등의 질환을 치료하기 위한 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물을 포함하는 상기 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

결합 조직 질환을 치료하기 위한 브로멜라인으로부터의 단백분해 추출물 {PROTEOLYTIC EXTRACT FROM BROMELAIN FOR THE TREATMENT OF CONNECTIVE TISSUE DISORDERS}

콜라겐은 결합 조직의 주성분이고, 이는 건(tendon), 인대 및 피부 등의 섬유 조직에서 대부분 발견된다. 다수의 질환 및 증상이 과다한 콜라겐 침착과 관련되며, 듀프트렌 질환 및 파이로니 질환이 가장 일반적이다.

듀프트렌 질환(DD)은, 약지와 소지에서 중수수지 관절(metacarpophalangeal joints; MCPJ) 및 근위지절 관절(proximal interphalangeal joints; PIPJ)의 경축을 통상 특징으로 하는, 손에서의 비정상 콜라겐 생성 및 침착의 결합 조직 질환이다. 수장근막 수준에서 과다한 콜라겐 침착과 함께 근섬유아세포로의 섬유아세포 증식 및 분화는 손바닥 및/또는 손가락에서 결절 및 섬유증 건(cord) 형성을 유발한다. 섬유증 건 및 결절은 섬유증 건의 경우에 직경 1mm부터 섬유증 결절의 경우에 직경 약 10mm까지 상이한 두께로 이루어질 수 있다. 질환이 진행됨에 따라, 건은 경축하기 시작하여, 손 기능을 간섭하고 저하시키는 손가락 굴곡-변형(굴곡 경축)을 유발한다.

DD의 유행은 연령에 따라 증가하고, 남성에서 보다 빈번히 발병된다. 유전적 감수성, 흡연, 음주, 당뇨병, 간질 및 반복된 근육운동이 DD의 통상적인 위험 인자인 것으로 생각된다. DD의 중증도 및 진행은 손가락 굴곡-경축의 발병도에 의해 분류될 수 있다.

외과적 근막절제는 대부분의 환자에서 일시적 성과지만, 양성 효과를 제공하는, 현재 DD에 대해 가장 광범위하게 이용가능한 치료이다. 그러나, 외과적 근막절제는 손가락 신경 손상, 손가락 소실, 피변 소실, 창상 치유 문제 및 수술후 강성 등의 특정 합병증 뿐만 아니라 통상의 수술상 합병증(예: 감염, 혈종, 조직 소실)을 수반한다. 또한, 근막절제는 장기의 회복 기간을 수반하고, DD가 매우 높은 재발율을 갖기 때문에 완전한 치유를 제공하지 않는다. 바늘 또는 얇은 칼날을 사용한 최소 침습적 절차가 시도되어 왔고; 이러한 절차는 보다 적은 합병증을 유발하지만, 재발율이 증가한다. 어떠한 수술적 중재도 또한 개발되지 않았고, 방사선치료, 초음파, 비타민 A, 비타민 E, 스테로이드 및 인터페론-γ의 주사를 포함한다.

시험관내 연구는 듀프트렌 건 조직을 파괴하는데 필요한 인장 계수 및 힘을 감소시키는 콜라게나제의 효능을 입증했고, 이는 콜라게나제가 효소적 근막절제에 효과적일 수 있음을 나타낸다. 임상적 연구에서 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 콜라게나제가 DD 경축을 완화시키고 발병된 관절에서 운동 범위를 개선시킴이 최근 입증됐다. DD 환자에서 콜라게나제 주사의 8년간의 추적은 MCPJ 경축이, 콜라게나제 치료를 적용하기 전의 초기 경축과 비교하여, 당해 질환의 재발 후에 덜 심각하였음을 나타냈다. 또한, 정상 성인 수장근막에 통상 부재하는 유형-III 콜라겐이 DD 환자의 조직에는 풍부한 것으로 나타났다.

파이로니 질환은 인간 중 10% 이하에서 발병하는, 연질 음경 조직에서 콜라겐이 풍부한 섬유 플라크의 성장을 수반하는 결합 조직 질환이다. 구체적으로, 섬유 플라크는 백막에서 형성되고, 음경 해면체를 둘러싸는 조직의 두꺼운 외피는 종종 통증과 관련되는 비정상 굴곡을 유발한다.

수술은 예상가능하게 반복가능한 효능을 갖는 것으로 보이는, 파이로니 질환을 치료하는 유일한 방법이다. 수술은, 당해 질환이 안정화되고 당해 기형이 성교를 간섭하고/하거나 극단적 통증을 유발하는 장기 투병의 경우에 통상 권고된다. 그러나, 음경의 영구적 단축을 포함한 합병증이 수술로부터 발생할 수 있다.

파이로니 질환 치료에 대한 비-수술적 방법이 또한 이용가능하지만, 이들은 모두 대개 비효과적이다. 직접적인 병변내 주사에 의해 당해 플라크를 용해시키려는 시도가 시험되어 왔다. 주사 방법 중에서, 방추형 콜라게나제를 포함하는 것들은 가장 일관된 효능을 나타내는 것으로 보이지만, 여전이 효과 및 기간이 매우 제한된다. 또한, 방사선 치료 및 레이저 기술이 시도되어 왔다.

미국 특허 제5,589,171호, 제6,086,872호 및 재허여된 미국 특허 제RE39,941호는, 섬유 발병된 수장근막에 콜라게나제를 적용하는 것을 포함하는, 듀프트렌 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 개시한다.

미국 특허 제6,022,539호는, 개체의 음경에서 섬유 파이로니 플라크 내로 콜라게나제를 주사하는 것을 포함하는, 파이로니 플라크로부터 고통받는 개체를 치료하는 방법을 개시한다.

미국 특허 제6,353,028호는, 결합 조직 질환: 파이로니 질환, 듀프트렌 질환 및 레더호스 섬유증을 치료하기 위한 칼슘 채널 차단제의 경피 전달을 촉진시키는 칼슘 채널 차단제 및 담체 제제를 포함하는 국소 의약을 개시한다.

미국 특허 공개공보 제2008/0206228호는 비대성 및 켈로이드 상처의 치료 뿐만 아니라 다양한 종류의 창상, 화상, 욕창, 혈관성 궤양 및 당뇨성 족부 궤양의 치료를 위해 콜라게나제와 함께 히알루론산 또는 이의 유도체를 함유하는 약제를 개시한다. 듀프트렌 질환의 치료가 명시적으로 개시되어 있다.

국제특허 공개공보 WO 2004/037183호는 섬유증을 수반하는 증상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 개시하고, 그 중에는 파이로니 질환 및 듀프트렌 질환이 개시되어 있다. 당해 조성물은, 일부 목록으로, 포스포디에스테라제(PDE)-4 억제제, PDE-5 억제제 또는 cGMP를 상승시키는 화합물을 포함한다.

듀프트렌 경축 또는 파이로니 경축을 치료하기 위한, 미세소관 저해제를 포함하는 세포 주기 억제제, 항대사물질, 알킬화제, 빈카(vinca) 알칼로이드, PDE 억제제, 콜라게나제를 포함하는 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase)의 사용은 국제특허 공개공보 WO 2005/074913호에 개시되어 있다.

배경 기술하의 어디에도 식물 공급원으로부터의 단백분해 효소가 과다한 콜라겐 침착을 수반하는 결합 조직 질환의 치료에 유용하다는 것이 개시되거나 시사되어 있지 않다.

파인애플 식물(Ananas comosus)의 줄기로부터 유도된 추출물은 비생존 조직을 선택적으로 제거하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 추출물(또한 브로멜라인으로 명명됨)은 다양한 단백분해 및 가수분해 효소를 함유한다.

본 발명 출원인의 국제특허 공개공보 WO 2006/054309호는 브로멜라인에 존재하는 평균 분자량 23kDa의 단백분해 효소 대부분을 포함하는 브로멜라인으로부터 수득한 상기 괴사조직제거 조성물을 개시한다. WO 2006/054309호는 또한 생존불능 조직의 괴사조직을 제거하기 위한 상기 괴사조직제거 조성물의 용도를 개시한다.

과도한 콜라겐 침착을 수반하는 결합 조직 질환을 치료하기 위한 개선된 비-침습적 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.

본 발명은 결합 조직 질환을 치료하기 위한 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물을 제공한다. 특히, 본 발명은, 듀프트렌 질환 및 파이로니 질환을 포함하여, 과다한 콜라겐 침착과 관련되는 결합 조직 질환을 치료하기 위한 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물을 제공한다.

본 발명에 이르러, 브로멜라인, 예를 들면, 줄기 브로멜라인 또는 아나나인(ananain)에 존재하는 하나 이상의 시스테인 프로테아제를 포함하는 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물이 천연의 비-변성 콜라겐을 분해시킬 수 있음이 처음으로 개시된다. 예상치 않게, 듀프트렌 건 내로의 상기 단백분해 추출물의 주사는 정상의 건강한 결합 조직을 그대로 유지하면서 당해 건의 파괴를 야기했다.

본 발명은, 듀프트렌 건을 파괴 또는 용해시키는 상기 단백분해 추출물의 효과가 콜라게나제의 효과와 유사하거나 심지어 이보다 더욱 높음을 추가로 개시한다. 그러나, 콜라게나제는 다양한 유형의 콜라겐에 대한 친화성으로 인해 비-발병된 인대 또는 건의 손상을 유발할 수 있지만, 본 발명의 상기 단백분해 추출물은 발병된 건에 대한 특이성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 상기 단백분해 추출물은 과다한 콜라겐 침착을 수반하는 결합 조직 질환, 특히 듀프트렌 질환 및 파이로니 질환을 치료하기 위한 개선되고 안전한 약제를 제공한다.

고농도의 상기 단백분해 추출물이 작은 용적으로 제조될 수 있다는 사실에 기인하여, 이러한 작은 용적은 발병된 섬유 건 또는 플라크 내로 주사될 수 있고, 따라서 주변 조직에 대한 유출 및 손상을 피하고, 임상적 절차를 단순화시켜 환자의 순응도를 증가시킬 수 있다.

한 가지 국면에 따라, 본 발명은, 브로멜라인(bromelain)으로부터 수득한 치료학적 유효량의 상기 단백분해 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상기 약제학적 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 결합 조직 질환의 치료방법으로서, 상기 단백분해 추출물이 줄기 브로멜라인 및 아나나인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 결합 조직 질환이 과다한 콜라겐 침착과 관련되는 결합 조직 질환의 치료방법을 제공한다.

추가의 실시양태에 따라, 결합 조직 질환은 듀프트렌 질환(Dupuytren's disease), 파이로니 질환(Peyronie's disease), 오십견(frozen shoulder) 및 레더호스 질환(Ledderhose disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에 따라, 결합 조직 질환은 듀프트렌 질환이다. 또 다른 실시양태에 따라, 결합 조직 질환은 파이로니 질환이다.

한 가지 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물은 줄기 브로멜라인 및 아나나인을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물은 시스테인 프로테아제 전구체를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물은 시스테인 프로테아제 단편을 추가로 포함한다. 예시적 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물은 줄기 브로멜라인, 아나나인 및 시스테인 프로테아제 전구체를 포함한다.

추가의 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 마취제, 항균제 및 소염제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제를 추가로 포함한다.

추가의 실시양태에 따라, 상기 마취제는 아메토카인(테트라카인), 리그노카인(리도카인), 자이실로카인, 부피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 벤조카인, 메피보카인, 코카인 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태이다.

추가의 실시양태에 따라, 상기 항균제는 아만파딘 하이드로클로라이드, 아만파딘 설페이트, 아미카신, 아미카신 설페이트, 아모글리코사이드, 아목시실린, 암피실린, 암사마이신, 바시트라신, 베타-락탐, 칸디시딘, 카프레오마이신, 카베니실린, 세팔렉신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파졸린, 세파피린, 세프라딘, 세팔로글리신, 칠롬페니콜, 클로르헥시딘, 클로스헥시딘 글루코네이트, 클로르헥시딘 하이드로클로라이드, 클로록신, 클로르퀴르알돌, 클로르테트라사이클린, 클로르테트라사이클린 하이드로클로라이드, 시프로플록사신, 시르쿨린, 클린다마이신, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 클로트리마졸, 클록사실린, 데메클로사이클린, 디클로스사실린, 디요오도하이드록시퀸, 독시사이클린, 에탐부톨, 에탐부톨 하이드로클로라이드, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에르흐마이신 스테아레이트, 파르네솔, 플록사실린, 젠타마이신, 젠타마이신 설페이트, 그라미시딘, 지세오풀빈, 할로프로긴, 할로퀴놀, 헥사클로로펜, 이미노사이클린, 요오도클로르하이드록시퀸, 카나마이신, 카나마이신 설페이트, 린코마이신, 리네오마이신, 리네오마이신 하이드로클로라이드, 마크롤리드, 메클로사이클린, 메타사이클린, 메타사이클린 하이드로클로라이드, 메테닌, 메테나민 히푸레이트, 메테나민 만델레이트, 메티실린, 메토니다졸, 미코나졸, 미코나졸 하이드로클로라이드, 미노사이클린, 미노사이클린 하이드로클로라이드, 무피로신, 나프실린, 네오마이신, 네오마이신 설페이트, 네티미신, 네틸미신 설페이트, 니트로푸라존, 노르플록사신, 니스타틴, 옥토피록스, 올레안도마이신, 오르세팔로스포린, 옥사실린, 옥시테아클린, 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드, 파라클로로메타 자일레놀, 파로모마이신, 파로모마이신 설페이트, 페니실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 펜타미딘, 펜타미딘 하이드로클로라이드, 페네티실린, 폴리믹신, 퀴놀론, 스트렙토마이신 설페이트, 테트라사이클린, 토브라마이신, 톨나프테이트, 트리클로산, 트리팜핀, 리파마이신, 롤리테트라사이클린, 은 염, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스트룹토마이신, 설폰아미드, 테트라사이클린류, 테트라사이클린, 토브라마이신, 토브라마이신 설페이트, 트리클로카본, 트리클로산, 트리메토프림-설파메톡사졸, 틸로신, 반코마이신 및 이로트리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태이다.

추가의 실시양태에 따라, 상기 소염제는 비-스테로이드성 소염제 및 스테로이드성 소염제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

추가의 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 안정화제, 항산화제, 보존제, 완충제, 킬레이트제 및 등장화제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 성분을 추가로 포함한다.

추가의 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 고체 제형, 반고체 제형, 액체 제형 및 폼(foam) 제형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형태로 제형화된다. 특정한 실시양태에 따라, 고체 제형은 분말이다. 또 다른 실시양태에 따라, 액체 제형은 pH 약 6 내지 7의 주사가능한 용액이다.

예시적 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 발병된 섬유 조직 내로 주사에 의해 투여된다. 상기 약제학적 조성물은 단일 용량, 또는 발병된 섬유 조직 중의 2개 이상의 위치에서 분획으로 주사될 수 있다.

또 다른 국면에 따라, 본 발명은, 결합 조직 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 단백분해 추출물을 포함하는 상기 약제학적 조성물로서, 상기 단백분해 추출물이 줄기 브로멜라인 및 아나나인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 시스테인 프로테아제를 포함하고, 상기 결합 조직 질환이 과다한 콜라겐 침착과 관련되는, 상기 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 이들 및 기타 실시양태는 하기 도면, 상세한 설명, 실시예 및 특허청구범위와 관련하여 보다 잘 이해될 것이다.

도 1은 상기 단백분해 추출물의 2개 배치(batche)의 콜라겐분해 활성을 나타내는 그래프이다. 증가하는 농도의 상기 단백분해 추출물(MD2 H-05-27 및 MD5 H-10-46으로 지정됨)을 형광 표지된 콜라겐 유형 IV의 존재하에 20분 동안 항온처리했다. 항온처리 종료 시점에, 형광을 측정했다. 결과는 상대 형광 단위(RFU)로 제시되어 있다.
도 2는 콜라겐 유형 I 및 유형 IV에 대한 상기 단백분해 추출물의 콜라겐분해 활성을 나타내는 그래프이다. 상기 단백분해 추출물은 형광 표지된 콜라겐 유형 I 또는 콜라겐 유형 IV의 존재하에 다양한 시간 동안 항온처리했다. 항온처리 종료 시점에, 형광을 측정했다. 결과는 상대 형광 단위(RFU)로 제시되어 있다.
도 3은, 콜라게나제의 활성과 비교하여, 상기 단백분해 추출물의 콜라겐분해 활성을 나타내는 그래프이다. 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histoliticum) 콜라게나제를 형광 표지된 콜라겐 유형 IV 또는 형광 표지된 젤라틴과 함께 항온처리하고, 형광을 항온처리 20분 말기에 측정했다. 상기 단백분해 추출물을 형광 표지된 콜라겐 유형 IV와 함께 20분 동안 항온처리한 다음, 형광을 측정했다.
도 4는 상기 단백분해 추출물의 젤라티나제 활성을 나타내는 그래프이다. 증가하는 농도의 상기 단백분해 추출물의 2개 배치(J-01-19 및 J-14-45로 지정됨)를 형광 표지된 젤라틴의 존재하에 20분 동안 항온처리한 다음, 형광을 측정했다.
도 5A 내지 5C는 환자로부터 듀프트렌 건의 외과적 절단-제거를 나타내는 사진이다. 도 6A는 듀프트렌 질환을 갖는 환자에서 약지의 비정상 경축을 나타내는 사진이다. 도 4B는 병리학적 건의 외과적 제거를 나타내는 사진이다. 도 4C는 손바닥 베드로부터 제거 후의 건을 나타내는 사진이다.
도 6은 듀프트렌 건을 2개로 절단하는 것을 나타내는 사진이다.
도 7은 건의 고정을 나타내는 사진이다.
도 8은 듀프트렌 건 내로 용액의 주사 단계를 나타내는 사진이다.
도 9는 인장 연신기(tensile stretching machine)를 나타내는 사진이다.
도 10A 및 10B는 인장력 적용 전후의 건을 나타내는 사진이다. 도 10A는 인장력 적용 전의 건을 나타낸다. 도 10B는 인장력 적용 전 및 건 파괴 전의 건을 나타낸다.
도 11은 인장 강도 적용의 함수로서 듀프트렌 건 신장에 대한 염수의 효과를 나타낸다. 듀프트렌 건에 염수를 주사하고, 염수 속에서 24시간 동안 항온처리했다. 이어서, 상기 건을 인장 응력에 제공하고, 건 신장 및 파괴를 평가했다.
도 12는 인장 강도 적용의 함수로서 듀프트렌 건 신장에 대한 상기 단백분해 추출물의 효과를 나타낸다. 듀프트렌 건에 상기 단백분해 추출물을 주사하고, 상기 단백분해 추출물의 존재하에 24시간 동안 항온처리했다. 이어서, 상기 건을 인장 응력에 제공하고, 건 신장 및 파괴를 평가했다.
도 13은 인장 강도 적용의 함수로서 듀프트렌 건 신장에 대한 상기 단백분해 추출물의 단일 주사의 효과를 나타낸다. 듀프트렌 건에 상기 단백분해 추출물을 주사하고, 염수 속에서 24시간 동안 항온처리했다. 이어서, 상기 건을 인장 응력에 제공하고, 건 신장 및 파괴를 평가했다.

본 발명은, 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 과다한 콜라겐 침착을 수반하는 결합 조직 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

브로멜라인으로부터 수득한 상기 괴사조직제거 조성물(또한 Debrase^R로 명명됨)은 본 발명 출원인의 국제공개공보 WO 2006/054309호에 처음 개시되었고, 이의 내용은 본원에서 완전히 기재된 것과 같이 참조로서 도입된다. 국제공개공보 WO 2006/054309호에 개시된 상기 괴사조직제거 조성물은 줄기 브로멜라인 및 아나나인 등의 시스테인 프로테아제를 포함한다. 국제공개공보 WO 2006/054309호는 상기 괴사조직제거 조성물이 화상 피부, 즉 비생존 조직을 브로멜라인보다 더욱 효율적으로 제거했음을 추가로 개시한다. 그러나, 상기 괴사조직제거 조성물은 건강한 또는 생존 피부 또는 진피의 괴사조직제거에 불활성인 것으로 밝혀졌다[참조: Singer et al., 2010, J. Burn Care Res. 31: 304-309]. 따라서, 상기 괴사조직제거 조성물은 생존 조직이 아닌 비생존 조직에 대해 활성인 것으로 밝혀졌다.

예상치 않게, 본 발명은 브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물이 시험관내에서 콜라겐분해 활성을 나타내고 듀프트렌 질환을 앓고 있는 대상체로부터 수득한 손바닥 섬유 건을 용해시킬 수 있음을 개시한다. 본 발명의 상기 단백분해 추출물은 건강한 결합 조직을 분해시키지 않기 때문에, 본 발명은 특히 듀프트렌 질환 또는 파이로니 질환을 앓고 있는 대상체에서 콜라겐이 풍부한 섬유 조직을 용해시키기 위한 안전하고 효율적인 효소적 약제를 제공한다.

용어 "브로멜라인으로부터 수득한 상기 단백분해 추출물" 및 "상기 단백분해 추출물"은 본 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 상호 교대로 사용되며, 브로멜라인으로부터 부분적으로 정제된 효소 제제를 지칭한다.

용어 "브로멜라인"은 현재 상업적으로 이용가능한 다수의 브로멜라인 분말 제제를 지칭한다. 브로멜라인의 제조업자의 예는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 시그마 앤드 챌린지 바이오프로덕츠 캄파니 리미티드(Sigma and Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan)를 포함한다. 브로멜라인은 파인애플 식물의 줄기로부터 제조된다. 브로멜라인을 수득하는 전형적인 공정은 다음과 같다: 파인애플 식물의 줄기로부터 액즙을 먼저 인산(phosphoric acid)으로 약 3 또는 4의 pH로 조정하고, 수소화나트륨 또는 황화수소나트륨을 첨가하여 설프하이드릴 산화로부터 보호한다. 불활성 물질은 약 30% 아세톤에서 침전시키고, 여과 후, 정화된 액체를 70% 아세톤으로 침전시킨다. 이 침전물을 원심분리로 회수하고, 인산으로 산성화된 수소화나트륨 또는 황화수소나트륨을 함유하는 물에 재용해시켜 재침전시키거나, 또는 진공 오븐 내에서 직접 건조시킨다. 상기 물질이 재침전되면, 70% 아세톤이 사용된다. 이러한 공정으로부터의 건조 물질은 본 발명의 상기 괴사조직제거 조성물을 수득하기 위한 출발 물질로서 적합하다.

본 발명의 상기 단백분해 추출물은 브로멜라인에 존재하는 하나 이상의 시스테인 프로테아제를 포함할 수 있다. 예시적 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물(또한 Debrase^R 또는 Nexobrid^R로서 명명됨)은 시스테인 프로테아제 줄기 브로멜라인(EC 3.4.22.32) 및 아나나인(EC 3.4.22.31)을 포함한다. 상기 단백분해 추출물은, 예를 들면, 아나나인(EC 3.4.22.31) 전구체, 과일 브로멜라인(EC 3.4.22.33) 전구체 및 줄기 브로멜라인(EC 3.4.22.31) 전구체 등과 같은 브로멜라인의 하나 이상의 시스테인 프로테아제 전구체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단백분해 추출물은 시스테인 프로테아제 단편[참조: WO 2006/054309], 자칼린-유사 렉틴[참조: Raval et al., Glycobiology, 2004, 14(12): 1247-1263] 및/또는 브로멜라인 억제제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단백분해 추출물은 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다:

(a) 약 2.4 내지 약 4 범위의 pH를 갖는, 항산화제를 임의로 포함하는 상기 산성 용액으로 브로멜라인을 현탁시키고;

(b) (a)의 현탁액을 약 2.4 내지 약 4 범위의 pH로 조정하고;

(c) 필터 보조제를 (b)의 현탁액에 첨가하고;

(d) (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(e) (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염을 첨가하여, 황산암모늄의 포화도를 약 40% 내지 약 50% 범위로 수득하고;

(f) (e)의 현탁액을 약 2.5 내지 약 4 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 3℃ 내지 10℃에서 항온처리하고;

(h) (g)의 현탁액을 원심분리하여 황산암모늄 침전물을 수득하고;

(i) 항산화제를 임의로 포함하고 약 2.4 내지 약 4 범위의 pH를 갖는 상기 산성 용액에 상기 황산암모늄 침전물을 용해시키고;

(j) (i)의 용액을 약 10 kDa 한외 여과기를 통해 여과하고;

(k) (j)의 체류된 용액을 동결건조시킨다.

일부 실시양태에 따라, 브로멜라인의 현탁은 약 2.4 내지 4의 pH를 갖는 임의의 상기 산성 용액에서 수행된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 산성 용액 또는 완충액의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 수중 아세트산, 아세테이트 완충액 및 1% 티오글리콜산을 함유하는 아세테이트 완충액(pH 2.4-4)이 포함된다. 특정 예시적 실시양태에 따라, 상기 산성 용액은 미국 특허 제5,830,739호 및 제4,197,291호에 기재된 완충액 및 용액으로부터 선택되고, 이의 내용은 본원에서 완전히 기재된 것과 같이 참조로서 도입된다.

상기 산성 용액은 항산화제를 임의로 포함할 수 있다. 항산화제의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아스코르브산, 디하이드로퀴논, 부틸화된 하이드록시톨루엔 및 디티오트레이톨이 포함된다. 상기 항산화제는 약 0.5% 내지 약 2%, 바람직하게는 1%의 농도로 첨가될 수 있다.

상기 산성 용액은 습윤제를 추가로 포함할 수 있다. 습윤제의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, n-옥탄올이 포함된다.

항산화제를 임의로 포함하는 상기 산성 용액의 pH는 약 2.4 내지 약 4의 범위일 수 있다. 바람직한 특정 실시양태에서, 항산화제를 임의로 포함하는 상기 산성 용액의 pH는 약 2.4 내지 약 2.6의 범위이다.

추가의 실시양태에 따라, 필터 보조제(filter aid)가 (a)의 현탁액에 첨가된다. 한 가지 실시양태에서, 상기 필터 보조제는 실리카를 포함한다. 바람직하게는, 상기 필터 보조제는 하소되는 천연 규조토이고, 따라서 더욱 빠른 유속이 달성된다.

목적하는 단백질의 침전은 단계 (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염을 첨가함으로써 수행된다. 황산암모늄 염은 황산암모늄의 포화도를 약 40% 내지 약 50% 범위로 수득하기 위하여 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 황산암모늄 염은 황산암모늄의 40% 포화도를 수득하기 위하여 첨가될 수 있다.

이어서, 단계 (f)의 현탁액을 3℃ 내지 10℃의 온도에서 항온처리한다. 바람직하게는, 단계 (f)의 현탁액은 3℃ 내지 10℃의 온도에서 적어도 10시간 동안 항온처리한다. 더욱 바람직하게는, 단계 (f)의 현탁액은 4℃에서 12 내지 24시간 동안 항온처리한다.

항온처리의 종결 시점에서, 단계 (g)의 현탁액은 목적하는 단백질, 즉 단백분해 효소를 침전시키기 위하여 원심분리한다. 이어서, 상기 침전물은 항산화제를 임의로 포함하는 상기 산성 용액에 용해시킨다. 예시적 실시양태에서, 현탁액은 4℃에서 적어도 10시간 동안 항온처리한다.

단계 (i)의 용액은 약 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 체류시키기 위하여 여과 단계로 처리된다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (i)의 용액은 약 10 kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 막 필터를 통하여 여과된다.

상기 단백분해 추출물은 여과후 동결건조시킬 수 있고, 증류수로 세척한 다음, 동결건조시키거나, 여과한 다음, 동결건조시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물은 멸균 용액을 수득하기 위하여 적어도 약 0.5㎛의 기공 크기를 갖는 필터 막을 통하여 여과하고, 이는 이어서 동결건조시켜 저장한다. 바람직하게는, 상기 단백분해 추출물은, 이의 안정성이 수분의 부재하에 연장되기 때문에, 동결건조된 분말로서 저장된다. 사용 전에, 상기 단백분해 추출물은 용액에 용해시켜 약 6 내지 약 7의 pH를 갖는 용액을 수득한다.

예시적 실시양태에 따라, 상기 단백분해 추출물은 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다:

(a) 1% 아스코르브산 및 n-옥탄올을 포함하고 약 2.4 내지 약 2.6의 pH를 갖는 0.3M 아세트산으로 브로멜라인을 현탁시키고;

(b) (a)의 현탁액을 약 2.5 내지 약 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(c) 실리카를 포함하는 필터 보조제를 (b)의 현탁액에 첨가하고;

(d) 필터 프레스(filter press)를 통하여 (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(e) (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염(285g/ℓ)을 첨가하여 황산암모늄의 40% 포화도를 수득하고;

(f) (e)의 현탁액을 약 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 4℃에서 대략 12 내지 24시간 동안 항온처리하고;

(i) 1% 아스코르브산을 포함하고 약 2.4 내지 약 2.6의 pH를 갖는 0.3M 아세트산에 황산암모늄 침전물을 용해시키고;

(j) 10 kDa 한외-여과기를 통하여 (i)의 용액을 여과하고;

(k) (j)의 체류된 용액을 여과하여 멸균 용액을 수득하고;

(l) (k)의 여과된 용액을 동결건조시킨다.

용어 "듀프트렌 질환" 및 "DD"는 본원에서 상호 교대로 사용되고, 손가락을 완전히 펼수 없고 통상 손바닥을 향해 굴곡되어 있는 질환을 지칭한다. 구체적으로, 듀프트렌 질환은 통상적으로 척골 부위에서 수장근막 중의 섬유종 결절의 형성과 함께 시작된다. 당해 결절은 손바닥으로부터 손가락으로 놓여 있는 섬유 밴드 또는 건을 진행하고 형성한다. 결국, 이는 영구적 손가락 굴곡-경축을 유도한다. 약지는 가장 통상적으로 영향을 받고, 이어서 새끼손가락이 영향을 받는다.

용어 "듀프트렌 건" 및 "발병된 건"은 본원에서 상호 교대로 사용되고, 손바닥 피부 아래에서 종축으로 작용하는 안면 섬유 밴드를 지칭한다. 이들 밴드는, 당해 밴드에 부착되어 결국 발병된 손가락의 영구 굴곡-경축으로 진행하는 오버레이 피부 및 원위 손가락의 경축을 유도한다. 전형적으로, 듀프트렌 건은 다수의 섬유아세포, 세포외 매트릭스(ECM) 단백질, 특히 콜라겐의 침착 증가 및 근섬유아세포를 포함한다.

본 발명의 상기 단백분해 추출물은 과다한 콜라겐 침착과 관련된 기타 질환을 갖는 개체를 치료하는데 유용하다. 콜라겐 침착을 수반하는 기타 섬유 조직 변형 및 이상은 파이로니 질환, 레더호스 섬유증, 및 관절낭, 건 및 인대초의 섬유증을 포함한다. 따라서, 상기 단백분해 추출물은 또한 오십견(접착성 관절포염)의 치료에 유용할 수 있다. 과다한 콜라겐 침착 또는 섬유 조직 변형을 수반하는 이들 결합 조직 질환은 창상 또는 화상과 무관하다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 결합 조직 질환과 관련된 적어도 하나 이상의 증상의 완화 또는 제거를 지칭한다. 예를 들면, 듀프트렌 질환과 관련된 증상은, 일부 목록으로, 관절 경축, 관절의 운동 범위 감소를 포함한다. 파이로니 질환의 증상은, 예를 들면, 통증, 비정상 굴곡 및 발기 부전을 포함한다.

상기 단백분해 추출물의 용어 "치료학적 유효량"은 조성물이 투여되는 대상체에게 유리한 효과를 제공하기에 충분한 상기 단백분해 추출물의 양이다.

용어 "약"은, 용액 또는 현탁액의 pH를 언급하는 경우, 지시된 pH의 상하 0.5 pH 단위가 본 발명의 범위에 포함됨을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 약제학적 조성물은 상기 단백분해 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

용어 "약제학적으로 허용되는"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물 및 보다 특히는 인간에서 사용하기 위한 기타 일반적으로 인정되는 약전에 수록된 것을 의미한다.

용어 "담체"는 상기 단백분해 추출물이 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 물 및 오일, 예를 들면, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨씨유 등, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매일 수 있다. 염수 용액, NaCl/CaCl₂ 수용액, 수성 덱스트로즈, 글리세롤 용액 및 알부민 용액이 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 상기 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우, 물이 담체로서 또한 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 안정화제, 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 규산칼슘, 폴리비닐피롤리돈 및 셀룰로오즈를 추가로 포함할 수 있다. 당해 조성물은 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁화제; 보존제, 예를 들면, 티머로살, 벤질 알콜, 파라벤, 메틸- 또는 프로필하이드록시벤조에이트; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 디하이드로퀴논, 부틸화된 하이드록시톨루엔 및 디티오트레이톨; 및 완충제, 예를 들면, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 나트륨 벤조에이트, 칼륨 벤조에이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 타르트레이트; 킬레이트제, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산; 및 등장성 조절제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 마취제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 마취제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아메토카인(테트라카인), 리그노카인(리도카인), 자이실로카인, 부피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 벤조카인, 메피보카인, 코카인 및 이들의 배합물이 포함된다.

상기 약제학적 조성물은 항균제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 항균제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아만파딘 하이드로클로라이드, 아만파딘 설페이트, 아미카신, 아미카신 설페이트, 아모글리코사이드, 아목시실린, 암피실린, 암사마이신, 바시트라신, 베타-락탐, 칸디시딘, 카프레오마이신, 카베니실린, 세팔렉신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파졸린, 세파피린, 세프라딘, 세팔로글리신, 칠롬페니콜, 클로르헥시딘, 클로스헥시딘 글루코네이트, 클로르헥시딘 하이드로클로라이드, 클로록신, 클로르퀴르알돌, 클로르테트라사이클린, 클로르테트라사이클린 하이드로클로라이드, 시프로플록사신, 시르쿨린, 클린다마이신, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 클로트리마졸, 클록사실린, 데메클로사이클린, 디클로스사실린, 디요오도하이드록시퀸, 독시사이클린, 에탐부톨, 에탐부톨 하이드로클로라이드, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에르흐마이신 스테아레이트, 파르네솔, 플록사실린, 젠타마이신, 젠타마이신 설페이트, 그라미시딘, 지세오풀빈, 할로프로긴, 할로퀴놀, 헥사클로로펜, 이미노사이클린, 요오도클로르하이드록시퀸, 카나마이신, 카나마이신 설페이트, 린코마이신, 리네오마이신, 리네오마이신 하이드로클로라이드, 마크롤리드, 메클로사이클린, 메타사이클린, 메타사이클린 하이드로클로라이드, 메테닌, 메테나민 히푸레이트, 메테나민 만델레이트, 메티실린, 메토니다졸, 미코나졸, 미코나졸 하이드로클로라이드, 미노사이클린, 미노사이클린 하이드로클로라이드, 무피로신, 나프실린, 네오마이신, 네오마이신 설페이트, 네티미신, 네틸미신 설페이트, 니트로푸라존, 노르플록사신, 니스타틴, 옥토피록스, 올레안도마이신, 오르세팔로스포린, 옥사실린, 옥시테아클린, 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드, 파라클로로메타 자일레놀, 파로모마이신, 파로모마이신 설페이트, 페니실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 펜타미딘, 펜타미딘 하이드로클로라이드, 페네티실린, 폴리믹신, 퀴놀론, 스트렙토마이신 설페이트, 테트라사이클린, 토브라마이신, 톨나프테이트, 트리클로산, 트리팜핀, 리파마이신, 롤리테트라사이클린, 은 염, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스트룹토마이신, 설폰아미드, 테트라사이클린류, 테트라사이클린, 토브라마이신, 토브라마이신 설페이트, 트리클로카본, 트리클로산, 트리메토프림-설파메톡사졸, 틸로신, 반코마이신 및 이로트리신이 포함된다.

또 다른 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 소염제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 소염제는 비스테로이드성, 스테로이드성 또는 이들의 배합물일 수 있다. 비스테로이드성 소염제의 비제한적 예는 옥시캄, 예를 들면, 피록시캄, 이속시캄, 테녹시캄, 수독시캄; 살리실레이트, 예를 들면, 아스피린, 디살시드, 베노릴레이트, 트리리세이트, 사파프린, 솔프린, 디플루니살 및 펜도살; 아세트산 유도체, 예를 들면, 디클로페낙, 펜클로페낙, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴, 이소세팍, 푸로페낙, 티오피낙, 지도메타신, 아세마타신, 펜티아작, 조메피락, 클린다낙, 옥세피낙, 펠비낙 및 케토롤락; 페나메이트, 예를 들면, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 니플룸산 및 톨페남산; 프로피온산 유도체, 예를 들면, 이부프로펜, 나프록센, 베녹사프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 페노프로펜, 펜부펜, 인도프롭펜, 피르프로펜, 카르프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 미로프로펜, 티옥사프로펜, 수프로펜, 알미노프로펜 및 티아프로페닉; 피라졸, 예를 들면, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 페프라존, 아자프로파존 및 트리메타존을 포함한다. 이들 비스테로이드성 소염제의 추출물이 또한 사용될 수 있다.

상기 스테로이드성 소염제의 비제한적 예에는 코르티코스테로이드, 예를 들면, 하이드로코르티손, 하이드록시-트리암시놀론, 알파-메틸 덱사메타손, 덱사메타손-포스페이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 클로베타솔 발레레이트, 데소니드, 데스옥시메타손, 데스옥시코르티코스테론 아세테이트, 덱사메타손, 디클로리손, 디플로라손 디아세테이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루아드레놀론, 플루클로롤론 아세토니드, 플루드로코르티손, 플루메타손 피발레이트, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루코르틴 부틸에스테르, 플루오코르톨론, 플루프레드니덴(플루프레드닐리덴) 아세테이트, 플루란드레놀론, 할시노니드, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 부티레이트, 메틸프로드니솔론, 트리암시놀론 아세토니드, 코르티손, 코르토독손, 플루세토니드, 플루드로코리손, 디플루오로손 디아세테이트, 플루라드레놀론, 플루드로코르티손, 디플루로손 디아세테이트, 플루라드레놀론 아세토니드, 메드리손, 암시나펠, 암시나피드, 베타메타손 및 이의 에스테르의 밸런스(balance), 클로로프레드니손, 클로르프레드니손 아세테이트, 클로코르텔론, 클레시놀론, 디클로리손, 디플루르프레드네이트, 플루클로로니드, 플루니솔리드, 플루오로메탈론, 플루페롤론, 플루프레드니솔론, 하이드로코르티손 발레레이트, 하이드로코르티손 사이클로펜틸프로피오네이트, 하이드로코르타메이트, 메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 및 이의 추출물이 포함된다.

상기 약제학적 조성물은 건조 또는 동결건조 제형, 반고체 제형, 액체 제형 또는 폼 제형으로 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물은 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 스프레이 또는 패치 형태로 제형화될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 발병 부위에 국소, 피하, 피내 또는 근육내 투여할 수 있다.

특정 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 주사에 의해 투여된다. 예시적 실시양태에 따라, 상기 약제학적 조성물은 발병된 섬유 결절 또는 건 내로 또는 섬유 플라크 내로 직접 주사된다. 또는, 상기 약제학적 조성물은 외과적 절개로 이식된다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 멸균 주사가능 제제가 수용액 또는 유성 현탁액으로 제형화될 수 있다.

피부에 국소 사용하는 경우, 상기 약제학적 조성물은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 스프레이 또는 에어로졸 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 비히클의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 바셀린, 아쿠아퍼, 네오베이스, 프로필렌 글리콜, 글리세린 등이 포함된다. 2종 이상의 이들 비히클의 배합물이 또한 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 소정 기간에 걸쳐 활성 성분의 연장된 방출을 가능하게 하는 조절 방출 또는 서방출 제형으로 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 조성물은 선택된 부위에서 조절된 기간에 걸쳐 상기 단백분해 추출물을 방출하는 생분해성, 생적합성 고분자 이식편과 함께 투여된다. 고분자 물질의 예에는 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 이들의 공중합체 및 블렌드가 포함된다[참조: Medical applications of controlled release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla.]. 또는, 상기 약제학적 조성물은 겔로서 국소 적용된다. 사용될 수 있는 고분자 물질의 예는 다당류, 특히 셀룰로오즈 유도체, 예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 카복시메틸 셀룰로오즈 및 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 키틴, 키토산 및 알기네이트이다. 겔 제형은 소정 기간에 걸쳐 활성 성분의 연장된 방출을 가능하게 할 것이다.

상기 약제학적 조성물은 폼으로 제형화될 수 있다. 기체 추진제를 사용하여, 발포가능한 조성물을 폼으로 생성 및 투여한다. 적합한 기체 추진제의 예에는 휘발성 탄화수소, 예를 들면, 부탄, 프로판, 이소부탄 또는 이들의 혼합물 및 플루오로카본 기체가 포함된다. 상기 조성물은 안정화제를 추가로 포함하는 수성, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있다. 상기 안정화제는 당해 조성물의 점도를 증가시키고, 조성물 안정성에 기여할 수 있고/있거나 폼 침강 속도를 지연시킬 수 있다. 안정화제의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 천연 발생 고분자 물질(예: 알기네이트, 알부민, 카라기난, 크산탄 검, 전분), 반합성 고분자 물질, 예를 들면, 셀룰로오즈 에테르(예: 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 카복시메틸 셀룰로오즈, 하이드록시 프로필메틸 셀룰로오즈) 및 합성 고분자 물질(예: 폴리비닐 알콜, 카복시비닐 중합체 및 폴리비닐피롤리돈)이 포함된다.

약물의 제형화 및 투여 기술은 본원에서 참조로서 도입되는 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최근판]에서 발견할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 단일 용량, 또는 발병 섬유 조직 중의 2개 이상의 부위에 분획으로 투여할 수 있다. 투여되는 상기 단백분해 추출물의 양은 플라크를 연화 및/또는 파괴하는 유효량이다. 상기 단백분해 추출물의 유효량은 약 0.2mg/일 내지 약 40mg/일의 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 조성물은, 임의로 0.2 내지 0.5ml의 용액 또는 현탁액에 각각 약 0.5 내지 1.5mg을 포함하는 2개 이상의 분획으로 투여된다.

특정한 실시양태에서, 상기 단백분해 추출물을 포함하는 상기 약제학적 조성물이 투여되는 기간은 수시간, 예를 들면, 2 내지 12시간 동안 고정된다.

본 명세서 전반에 걸쳐 개시된 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태이다.

하기 실시예는 본 발명의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 본 발명의 원리를 설명하기 위해 기재된 구체적 기술, 조건, 물질, 비율 및 보고된 데이타는 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 않된다.

실시예 1

당해 단백분해 추출물의 콜라겐분해 활성

상기 단백분해 추출물은 국제공개공보 WO 2006/054309호에 기재된 바와 같이 브로멜라인으로부터 수득했다.

콜라겐 유형 IV를 분해시키는 데브라세(Debrase) 2개 배치의 효능을 먼저 측정했다. 분석은, 기질로서 형광으로 표지된 DQ 콜라겐 유형 IV^TM을 함유하는 EnzChek^R 젤라티나제/콜라게나제 분석 키트(Invitrogen)에 기초했다. 이 기질은 콜라게나제에 의해 효율적으로 소화되어 고도의 형광 펩티드를 제공하는 것으로 공지되었다. 형광의 증가는 단백분해 활성에 비례한다.

각각의 웰에, 데브라세 반응 완충제(0.15M 트리스-HCl 및 10mM EDTA, pH 7.6)을 첨가하여 100㎕의 최종 용적을 수득했다. 이어서, DQ 콜라겐 유형 IV^TM 0.5㎍/㎕ 10㎕를 각각의 웰에 첨가했다. 이어서, 0.225 내지 1ng/㎕의 농도로 상이한 용적(10 내지 80㎕)의 새롭게 제조한 데브라세를 데브라세 완충제 중의 웰에 첨가하여 1.5 내지 20ng/웰의 농도를 수득했다. 데브라세 완충제를 음성 대조군으로 사용했다. 반응 플레이트를 실온에서 20분 동안 항온처리했다. 반응을 중단시키기 위해, 20㎕의 정지 반응 용액(데브라세 완충제 중의 0.324mM 요오도아세트산)을 첨가했다. 형광 강도는 표준 형광 필터를 구비한 형광 마이크로-플레이트 판독기(Analyst AD, LJL)에 의해 측정했다. 효소 부재하에 항온처리한 웰로부터 배경 형광을 뺐다.

도 1은 데브라세 2개 배치의 콜라겐분해 활성을 나타낸다. 당해 도면에 제시된 바와 같이, 데브라세 2개 배치는 유사한 콜라겐분해 활성을 나타냈고, 이는 본 발명의 상기 단백분해 추출물을 수득하는 실험 공정이 일관된 효소 제제를 제공함을 나타낸다.

이어서, 콜라겐 유형 I 및 IV를 분해시키는 상기 단백분해 추출물의 효능을 측정했다. 당해 목적을 위해, 형광으로 표지된 DQ 콜라겐 유형 IV^TM 및 DQ 콜라겐 유형 I^TM을 기질로서 사용했다. 분석은 상기한 바와 같이 수행했고, 도 2에 지시된 기간 동안 지속했다. 반응은 20㎕ 정지 반응 용액(데브라세 완충제 중의 0.324mM 요오도아세트산)의 첨가에 의해 중단시키고, 형광 강도를 상기한 바와 같이 측정했다.

콜라게나제를 소정 활성(1단위는 5시간 내에 37℃, pH 7.5에서 콜라겐으로부터 E-류신 균등물 1μM을 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의된다)을 갖는 양성 대조군으로 사용된 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 정제했다.

클로스트리디움 히스톨리티쿰 콜라게나제를 사용한 분석을 위해, 콜라게나제용 반응 완충제(0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl, 0.2mM 나트륨 아지드, pH 7.6)을 첨가하여 각각의 웰당 100㎕의 최종 용적을 수득했다. 이어서, 클로스트리디움 콜라게나제 완충제 중의 상이한 용적(10 내지 80㎕)의 클로스트리디움 콜라게나제(0.4 내지 1mU/㎕)를 참조 웰에 첨가하여 5 내지 80mU/웰 범위의 농도에 도달시켰다. 클로스트리디움 콜라게나제 반응을 정지시키기 위해, 콜라게나제 완충제 중의 2mg/ml 1,10-페난트롤린 20㎕를 첨가했다.

클로스트리디움 콜라게나제로부터의 데이타는 mUnit당 참조 값으로 사용했다. 상기 단백분해 추출물(또한 데브라세라 명명됨) 샘플로부터의 데이타를 참조 값으로 나누어 mU/ng 데브라세를 측정했다.

도 2는 상기 단백분해 추출물이 콜라겐 유형 I 및 IV를 각각 1.58 및 1.27mU/ng의 특이 활성으로 분해시켰음을 나타낸다.

이어서, 상기 단백분해 추출물의 활성을 콜라겐에 대한 클로스트리디움 히스톨리티쿰 콜라게나제 활성과 비교했다. 젤라틴에 대한 콜라게나제의 단백분해 활성은 EnzChek^R 젤라티나제/콜라게나제 분석 키트(Invitrogen) 및 DQ 젤라틴^TM(Invitrogen)을 기질로 사용하여 또한 측정했다.

도 3은 상기 단백분해 추출물이 콜라겐 유형 IV에 대한 콜라겐분해 활성을 나타냈음을 보여주며, 이는 콜라겐에 대한 상업적으로 이용가능한 콜라게나제에 의해 수득한 것보다 더욱 높았다.

도 4는 상기 단백분해 추출물이 젤라티나제 활성을 나타냈음을 보여준다. 당해 도면에 제시된 바와 같이, 상기 단백분해 추출물의 젤라티나제 활성은 2 내지 8ng/웰의 농도 범위에서 선형이었다.

실시예 2

당해 단백분해 추출물은 듀프트렌 건의 파괴를 촉진시킨다 .

듀프트렌 건은 근막절제를 시행한 환자로부터 수득했다(도 5A, 5B 및 5C). 동의 형태는 수술 전에 모든 대상체가 서명하였고, 당해 연구는 헬싱키 위원회에 의해 승인되었다. 실험은 당해 건의 근막절제를 수행하는 상기 단백분해 추출물의 효능을 검사했다.

조직 제조

환자로부터 수득한 건을 이들의 길이에 따라 2개 또는 3개 단편으로 나누었다(도 6). 상기 건은 프롤렌 1 봉합(Ethicon, Somerville, NJ)을 통해 기계적 시험 장치에 크랙코브(Crackov) 기술로 연결했다(도 7). 2개 건 중의 하나에 상기 단백분해 추출물(건 크기에 따라 상기 단백분해 추출물 0.3 내지 0.5ml)를 주사하고, 제2 대조군 건에 염수를 주사했다(도 8). 상기 단백분해 추출물 그룹의 건은 상기 단백분해 추출물 용액에 침지시키고, 대조군 그룹의 건은 염수에 침지시켰다. 두 그룹을 37℃에서 24시간 동안 항온처리했다.

기계적 시험

항온처리 24시간 후, 모든 건을 기계적 인장 응력 시험 장치(Zwick 1445 시험 시스템, Zwick Co., Germany)에 연결시켰다. 각각의 건을, 건 또는 연결 봉합이 파괴될 때까지, 증가된 하중에 제공했다. 당해 장치는 파괴될 때까지 적용된 인장력을 측정했다.

조직학적 분석

각 시료의 샘플을 조직학적 분석 및 질환 단계의 측정을 위해 수득했다.

통계학적 분석

시험 그룹과 비교하여 대조군 그룹의 효율은 피셔 정확 검정법을 사용하여 시험했다.

결과

상기 단백분해 추출물(n=10)로 처리한 모든 건은 연신후에 파괴되었다(도 10A 및 10B). 상기 단백분해 추출물로 처리한 건 중의 일부는 건이 완전히 파괴되었고, 기계적 시험 전에 실제로 용해되었다. 모든 대조군 건(n=9)은 인장력 적용 후에 파괴되지 않았다. 도 11에 도시된 바와 같이, 모든 대조군 건은, 매우 높은 하중이 적용되어 파괴될 때까지, 건의 증가 응력에 따라 제한된 신장에 의해 나타내어지는 유사한 응력 신장 패턴을 나타냈다. 대조적으로, 상기 단백분해 추출물로 처리한 모든 건은 건의 인장 강도의 소실을 나타냈고, 이는 매우 낮은 응력에서 당해 건의 파괴에 이르렀다(도 12). 당해 결과는 낮은 용량, 즉 0.8mg/ml의 상기 단백분해 추출물이 듀프트렌 질환 건을 파괴시킬 수 있고, 이러한 효과가 보다 높은 용량의 상기 단백분해 추출물, 즉 150mg/ml 이하에서 추가로 입증되었음을 증명했다.

듀프트렌 건의 신장에 대한 상기 단백분해 추출물의 단일 주사의 효과를 평가하기 위해, 건에 3개의 상이한 부위에서 상기 단백분해 추출물을 주사하고, 이어서 상기 단백분해 추출물의 부재하에 염수 중에서 24시간 동안 37℃로 항온처리했다.

도 13은 듀프트렌 건의 3개 부위에 제공된 상기 단백분해 추출물의 주사가 당해 건의 인장 강도를 4 내지 5계수까지 감소시킬 수 있음을 나타낸다(도 13 참조, 시험 1a 및 2는 각각 18N 및 15N의 응력에서 건 파괴를 나타낸다). 1개의 건(도 13, 시험 1b)는 0.4N의 응력에서 파괴되었다. 이들 결과는 듀프트렌 건을 용해시키는 상기 단백분해 추출물의 효능을 입증하고, 본 발명의 상기 단백분해 추출물이 과다한 콜라겐 침착을 수반하는 기타 결합 조직 질환 뿐만 아니라 듀프트렌 질환에 대한 매우 효과적인 효소적 약제임을 명백하게 암시한다.

본 발명이 상기 본원에서 특별하게 제시되고 기재된 것으로 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 오히려, 본 발명의 범위는 하기하는 특허청구범위에 의해 제한된다.

Claims

브로멜라인으로부터 수득되는 단백분해 추출물을 포함하는 결합 조직 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 단백분해 추출물이 줄기 브로멜라인, 아나나인, 적어도 하나의 시스테인 프로테아제 전구체, 및 자칼린-유사 렉틴을 포함하고, 상기 결합 조직 질환이 과다한 콜라겐 침착과 관련되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결합 조직 질환이 듀프트렌 질환(Dupuytren's disease), 파이로니 질환(Peyronie's disease), 오십견(frozen shoulder) 및 레더호스 질환(Ledderhose disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결합 조직 질환이 듀프트렌 질환인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결합 조직 질환이 파이로니 질환인, 약제학적 조성물.
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제1항에 있어서, 마취제, 항균제(antibacterial agent) 및 소염제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 마취제가 아메토카인(테트라카인), 리그노카인(리도카인), 자이실로카인, 부피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 벤조카인, 메피보카인, 코카인 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 항균제가 아만파딘 하이드로클로라이드, 아만파딘 설페이트, 아미카신, 아미카신 설페이트, 아모글리코사이드, 아목시실린, 암피실린, 암사마이신, 바시트라신, 베타-락탐, 칸디시딘, 카프레오마이신, 카베니실린, 세팔렉신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파졸린, 세파피린, 세프라딘, 세팔로글리신, 칠롬페니콜, 클로르헥시딘, 클로스헥시딘 글루코네이트, 클로르헥시딘 하이드로클로라이드, 클로록신, 클로르퀴르알돌, 클로르테트라사이클린, 클로르테트라사이클린 하이드로클로라이드, 시프로플록사신, 시르쿨린, 클린다마이신, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 클로트리마졸, 클록사실린, 데메클로사이클린, 디클로스사실린, 디요오도하이드록시퀸, 독시사이클린, 에탐부톨, 에탐부톨 하이드로클로라이드, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에르흐마이신 스테아레이트, 파르네솔, 플록사실린, 젠타마이신, 젠타마이신 설페이트, 그라미시딘, 지세오풀빈, 할로프로긴, 할로퀴놀, 헥사클로로펜, 이미노사이클린, 요오도클로르하이드록시퀸, 카나마이신, 카나마이신 설페이트, 린코마이신, 리네오마이신, 리네오마이신 하이드로클로라이드, 마크롤리드, 메클로사이클린, 메타사이클린, 메타사이클린 하이드로클로라이드, 메테닌, 메테나민 히푸레이트, 메테나민 만델레이트, 메티실린, 메토니다졸, 미코나졸, 미코나졸 하이드로클로라이드, 미노사이클린, 미노사이클린 하이드로클로라이드, 무피로신, 나프실린, 네오마이신, 네오마이신 설페이트, 네티미신, 네틸미신 설페이트, 니트로푸라존, 노르플록사신, 니스타틴, 옥토피록스, 올레안도마이신, 오르세팔로스포린, 옥사실린, 옥시테아클린, 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드, 파라클로로메타 자일레놀, 파로모마이신, 파로모마이신 설페이트, 페니실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 펜타미딘, 펜타미딘 하이드로클로라이드, 페네티실린, 폴리믹신, 퀴놀론, 스트렙토마이신 설페이트, 테트라사이클린, 토브라마이신, 톨나프테이트, 트리클로산, 트리팜핀, 리파마이신, 롤리테트라사이클린, 은 염, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스트룹토마이신, 설폰아미드, 토브라마이신, 토브라마이신 설페이트, 트리클로카본, 트리클로산, 트리메토프림-설파메톡사졸, 틸로신, 반코마이신 및 이로트리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 소염제가 비-스테로이드성 소염제 및 스테로이드성 소염제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 안정화제, 항산화제, 보존제, 완충제, 킬레이트제 및 등장화제(tonicity agent)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 성분을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 고체 제형, 반고체 제형, 액체 제형 및 폼(foam) 제형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형태로 제형화되는, 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 고체 제형이 분말인, 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 액체 제형이 pH 6 내지 7의 주사가능한 용액인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 발병된 섬유 조직 내로 주사하기에 적합한 것인, 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 단일 용량으로 주사하기에 적합한 것인, 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 발병된 섬유 조직 중의 2개 이상의 위치에서 분획으로 주사하기에 적합한 것인, 약제학적 조성물.
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