MX2013014814A - Anticuerpos anti-psgl-1 y usos de los mismos. - Google Patents
Anticuerpos anti-psgl-1 y usos de los mismos.Info
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Abstract
En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a PSGL-1, polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican dichos anticuerpos, y vectores de expresión y células huésped para producir dichos anticuerpos. También se proporcionan aquí equipos y composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos que específicamente se unen a PSGL-1 así como métodos de tratamiento de una enfermedad o trastorno causado por o asociado con la proliferación incrementada y/o números de células T activadas utilizando los anticuerpos aquí descritos.
Description
ANTICUERPOS ANTI-PSGL-1 Y USOS DE LOS MISMOS
1. SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional US 61/496.249, presentada el 13 de junio de 2011, con el título "Anticuerpos ANTI-PSGL-1 y usos de los mismos". Todas las enseñanzas y el contenido de la mencionada solicitud provisional se incorporan en esta memoria descriptiva por referencia.
2. CAMPO DE LA INVENCION
En la presente memoria descriptiva se proveen anticuerpos que se unen específicamente al ligando-1 de glicoproteína P-selectina (PSGL-1, por su sigla en inglés), los polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, los vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos, las células huésped que comprenden tales vectores de expresión y las composiciones relacionadas. También se proporcionan métodos para el tratamiento de un trastorno o un trastorno causado por, o asociado con, una mayor proliferación y/o número de células T activadas, tal como soriasis, por medio del uso de anticuerpos anti-PSGL-1.
3. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Las respuestas inflamatorias a una infección o lesiones son iniciadas por la adherencia de leucocitos a la pared vascular (McEver
et al., 1997, J. Clin. Invest., 100 (3): 485-492). Las selectinas representan una familia de glicoproteínas que median las primeras interacciones entre células endoteliales - leucocito y plaquetas -leucocitos, durante la inflamación. La familia de las selectinas, que consta de L- selectina, E-selectina y P-selectina, comprende un dominio lectina NH2-terminal, seguido por un dominio similar a EGF, una serie de repeticiones de consenso, un dominio de transmembrana y una corta cola citoplásmica. Los dominios de lectina de las selectinas interactúan con ligandos glicoconjugados específicos con el fin de facilitar la adhesión celular. La L-selectina, expresada en la mayoría de los leucocitos, se une a ligandos en algunas células endoteliales y otros leucocitos. La E- selectina, expresada en las células endoteliales activadas por citoquina, se une a ligandos en la mayoría de los leucocitos. La P-selectina, expresada en las plaquetas activadas y células endoteliales, también se une a ligandos en la mayoría de los leucocitos.
El ligando-1 de glicoproteína P-selectina ("PSGL-1") también conocido como SELPLG o CD162 (grupo de diferenciación 162) es un ligando de glicoproteína tipo mucina humana para las tres selectinas (Constantin, Gabriela, 2004, Drugs News Perspect, 17(9): 579-585; McEver et al., 1997, J. Clin. Invest., 100 (3): 485-492). El PSGL-1 es un homodímero unido por disulfuro, con dos subunidades de 120 kD y se expresa en la superficie de los monocitos, linfocitos, granulocitos y en algunas células madre CD34 + . Es probable que el PSGL-1 contribuya al reclutamiento de leucocitos patológicos en
muchos desórdenes inflamatorios, ya que facilita las interacciones adhesivas de las selectinas, lo que sugiere que los inhibidores de PSGL-1, tal como anticuerpos a PSGL-1, son medicamentos antiinflamatorios potencialmente útiles.
Se han desarrollado varios anticuerpos anti-PSGL-1 (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional No. WO 2005/110475, publicada el 24 de noviembre de 2005; la publicación de solicitud internacional No. WO 2003/013603, publicada el 20 de febrero de 2003; Constantin, Gabriela, 2004, Drugs News Perspect, 17(9): 579-585).
4. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
En un aspecto, aquí se proveen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo que se unen específicamente a PSGL-1. En una modalidad, aquí se provee un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano, que comprende: (i) una región variable de cadena ligera ("VL") que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; (ii) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada ("VH") que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4; y (iii) una región constante de lgG4 humana que contiene una sustitución de Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada enumerada de acuerdo al índice EU (¡nmunoglobulina gama-G 1 )(Véase, Edelman et al., 1969, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85). En una modalidad
específica, aquí se provee un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende: (i) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1; y (ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad específica, aquí se provee un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende: (i) una cadena pesada que consistede la SEQ ID NO: 2; y (ü)una cadena ligera que consiste de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad específica, aquí se provee un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2, y una cadena ligera complementaria. En una modalidad específica, cualquiera de los anticuerpos monoclonales antes indicados esta purificado.
En otro aspecto, aquí se provee una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos monoclonales y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal que esta purificada.
En una modalidad, aquí se prove una preparación farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores en una solución acuosa que comprende citrato de sodio, cloruro de sodio, y ácido cítrico monohidrato. En una modalidad específica, la preparación farmacéutica es una solución acuosa que
comprende 9,1 mM citrato de sodio dihidrato, 150 m de cloruro de sodio, y 0,9 mM de ácido cítrico. En otra modalidad específica, el anticuerpo monoclonal está presente a una concentración de 0,267 mM en la preparación farmacéutica. En una modalidad específica, la preparación farmacéutica es una solución acuosa que comprende 2,676 g/L de sodio, 8,766 g/L de cloruro de sodio, 0,2 g/L de polisorbato 80, y 0,189 g/L de ácido cítrico. En otra modalidad específica, el anticuerpo monoclonal está presente a una concentración de 40 g/L en la preparación farmacéutica. En una modalidad específica, todas las soluciones acuosas antes indicadas se encuentran a pH 6,0.
En otro aspecto, aquí se proporcionan polinucleótidos que codifican un anticuerpo descrito aquí o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una modalidad específica, aquí se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, un vector de expresión comprende al polinucleótido aislado antes indicado. En ciertas modalidades, el vector de expresión además comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1. En una modalidad específica, el vector de expresión es un vector de expresión de mamífero. En otro aspecto, aquí se proporciona una célula huésped que comprende al vector de expresión antes indicado. En una modalidad específica, la célula huésped comprende (a) un primer ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 2, funcionalmente
unido a un promotor funcional en dicha célula huésped; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 1 funcionalmente unido a un promotor funcional en dicha célula huésped. En otra modalidad específica, el primer y segundo ácidos nucleicos de la célula huésped se encuentran en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión diferentes.
En otro aspecto, aquí se proporciona un método para producir cualquiera de los anticuerpos monoclonales arriba indicados que comprende cultivar a cualquiera de las células huésped arriba indicadas de tal modo que dichos primero y segundo ácidos nucleicos se expresan en dicha célula, y dichas cadenas ligera y pesada se ensamblan juntas para formar dicho anticuerpo.
En otro aspecto, aquí se provee una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de cadena pesada de anticuerpo que comprende los aminoácidos 1 a 228 de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad específica, aquí se provee una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad específica, aquí se provee un fragmento de cadena pesada de anticuerpo que comprende los aminoácidos 1 a 228 de la SEQ ID NO: 2. También se provee aquí el método para producir la cadena pesada antes indicada que comprende cultivar a cualquiera de las células huésped arriba indicadas de tal modo que dicha cadena pesada es expresada por la célula, y aislar dicha cadena pesada. En una modalidad específica, un método para producir cualquiera de los anticuerpos arriba
indicados comprende producir la cadena pesada de acuerdo al método arriba indicado para producir la cadena pesada, aislar dicha cadena pesada, y formar un complejo con dicha cadena pesada con una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO:1.
En otro aspecto, aquí se proporciona un equipo que comprende un primer embase de cualquiera de los anticuerpos monoclonales arriba indicado. En una modalidad específica, el primer embase es un frasco que contiene a dicho anticuerpo monoclonal como un cuerpo estéril liofilizado bajo vacio, y el equipo, además comprende un segundo embase que comprende un fluido farmacéuticamente aceptable. Aquí también se proporciona un dispositivo para inyección que contiene a cualquiera de los anticuerpos monoclonales antes indicados. En una modalidad específica, el dispositivo para inyección es una jeringa.
En otro aspecto, aquí se proporcionan métodos para prevenir y/o tratar una enfermedad o desorden asociado con o provocado por (totalmente o en parte) un aumento y/o cantidades de células T activadas respecto de los individuos sanos o de los individuos que no tiene la enfermedad o desorden particular. En una modalidad específica, aquí se proporciona un método para tratar un trastorno inflamatorio, que comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos monoclonales antes indicados. En otra modalidad específica, un método para tratar un trastorno inflamatorio, comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad
terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas antes indicadas. En una modalidad específica, el trastorno inflamatorio es una enfermedad autoinmune. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es soriasis. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es soriasis de placa. En otra modalidad específica, la soriasis de placa es moderada a severa. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es soriasis eritrodérmica. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es artritis soriatica. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es artritis reumatoidea. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es enfermedad de Crohn. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es espondilitis anquilosante. En otra modalidad específica, el trastorno inflamatorio es diabetes.
5. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1 presenta la electroforesis capilar en gel no reductora (CGE) para h15A7 y 15A7H. La flecha indica el pico para media molécula de anticuerpo.
Fig. 2 presenta la unión del anticuerpo 15A7H y el control a células TCD4+ humanas activadas. Los valores de EC50 (nM) se derivaron utilizando un modelo de ajuste de 4 parámetros de un sitio graficando la intensidad de fluorescencia media (MFI) versus la concentración de anticuerpo.
Fig. 3 presenta la respuesta a la dosis combinada del anticuerpo 15A7H en DTH trans-vivo en PBMC de 4 donantes. La media ± SEM combinada de los 4 donantes después del tratamiento con 0,03, 0,1, 0,3, 1 y 10 mg/kg de anticuerpo, o vehículo, pbmc: solo PBMC, V: vehículo, 0,03, 0,1, 0,3, 1 y 10 mg/kg de anticuerpo 15A7H. Las inhibiciones porcentuales del grosor de la planta del pie en respuesta al tratamiento con 0,03, 0,1, 0,3, 1, y 10 mg/kg de anticuerpo 15A7H.
Fig. 4 presenta las concentraciones plasmáticas de 24 horas del anticuerpo 15A7H en ratones C57BL/6 luego de una Unica inyección intraperitoneal. Los niveles plasmáticos combinados de los dos anticuerpos (medía ± SEM, n=4) en raza anímales experimentales se grafícan contra su porcentaje de inhibición del grosor de la planta del pie en el ensayo DTH trans-vivo.
Fíg. 5 presenta las concentraciones plasmáticas de 15A7H versus el tiempo en ratones C57BL/6. Se dosificó 4 ratones satélites por vía intraperitoneal con 0,03, 0,1, 0,3, 1, y 10 mg/kg del anticuerpo 15A7H. Se recolectaron las muestras sanguíneas a las 1, 3, 5 y 24 hrs.
Fig. 6 presenta laactividad de los anticuerpos 15A7H y control, que fueron probados a distintas concentraciones (5, 0,5, 0,05, 0,005 y 0,0005 g/ml).
Fig. 7A presenta la secuencia de aminoácido de la cadena pesada del anticuerpo 15A7H (SEQ ID NO: 2). La región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 4) se encuentra en letra negrita. Las
CDR (CDR1 (SEQ ID NO: 8), CDR2 (SEQ ID NO: 9), y CDR3 (SEQ ID NO: 10)) se encuentran enmarcadas en cuadrado. Las regiones de marco (FR1 (SEQ ID NO: 17), FR2 (SEQ ID NO: 18), FR3 (SEQ ID NO: 19), y FR4 (SEQ ID NO: 20)) también se encuentran indicadas. Se encuentra indicada la región constante. La secuencia de aminoácido de la región de bisagra (SEQ ID NO: 12) se encuentra enmarcada. La prolina substituida en la posición de aminoácido 228 en la región de bisagra se encuentra en letra cursiva.
Fig. 7B presenta la secuencia de aminoácido de la cadena ligera del anticuerpo 15A7H (SEQ ID NO: 1). La región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 3) está en letra negrita. Las CDR (CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6), y CDR3 (SEQ ID NO: 7)) se encuentran enmarcadas. Las regiones de marco (FR1 (SEQ ID NO: 13), FR2 (SEQ ID NO: 14), FR3 (SEQ ID NO: 15), y FR4 (SEQ ID NO: 16)) también se encuentran indicadas. Se encuentra indicada la región constante.
Cuadro 1: Lista de SEQ ID NO y sus secuencias correspondientes
6. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Aquí se proveen anticuerpos que se unen específicamente a PSGL-1. También se proveen ácidos nucleicos aislados que codifican a dichos anticuerpos. Además se proveen vectores y células huésped que comprenden ácidos nucleicos que codifican a tales anticuerpos o a los fragmentos de unión antígenos de los mismos. También se proveen métodos para preparar a estos anticuerpos, células, por ejemplo células CHO, los anticuerpos producidos por estas células y la purificación de los anticuerpos producidos. También se proporciona aquí un método para tratar y/o prevenir un desorden o
enfermedad descrito aquí (por ejemplo, una condición inflamatoria) que comprende administrar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí, que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1. En una modalidad específica, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal lgG4 15A7H descrito en los Ejemplos 1-4, infra.
6.1 Anticuerpos
Aquí se proveen anticuerpos monoclonales, que se unen de manera inmunoespecífica ligando uno de la glicoproteína P-selectina humana ("PSGL-1"). En una modalidad específica, aquí se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende: (i) una región variable de cadena ligera ("VL") que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; (ii) una cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada ("VH") que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4; y (iii) una región constante de lgG4 humana que contiene una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU. Ejemplos no limitantes de regiones constantes humanas se describen en el arte, por ejemplo, véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Preferentemente, el anticuerpo se une a PSGL-1 e induce de manera selectiva la
apoptosis de células T activadas (respecto de las otras células que expresan PSGL-1). En una modalidad específica, la unión del anticuerpo a PSGL-1 no interfiere con la interacción de P-selectina con PSGL-1, una función asociada con PSGL-1 y un requisito para la localización eficaz de células T activadas y neutrofilos en los tejidos objetivos.
En una modalidad específica, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a PSGL-1 es una inmunoglobulina de clase 4 de largo completo (lgG4), y preferentemente comprende una secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2, e incluso más preferentemente comprende una secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de cadena ligera la SEQ ID NO: 1 (siendo esto último el anticuerpo monoclonal 15A7H).
También se proporciona aquí los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende las secuencias de región variable de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y al menos una porción de una región constante de cadena pesada de humano que contiene a la región de bisagra de lgG4 de humano a lo largo e incluyendo una sustitución de Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada de humano enumerado de acuerdo al índice EU. En una modalidad específica, un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo aquí es un fragmento F(ab')2.
Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí preferentemente están aislados, mucho más preferentemente purificado.
Como se utiliza aquí y a menos que se especifique de otra forma, los términos "se une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "une específicamente" y "reconoce específicamente" son términos análogos en el contexto de los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo y se utilizan de manera intercambiable aquí, y se refieren a la unión de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo a través del sitio de combinación del antígeno con su epitope, como se entenderá por una persona experta en el arte. En una modalidad especifica, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno también se puede unir a otros péptidos o polipéptidos, aunque generalmente con una menor afinidad como se determina, por ejemplo, mediante inmunoensayo, Biacore™, instrumento inExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID), u otros ensayos conocidos en el arte. En una modalidad específica, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno se une al antígeno con una Ka que es al menos 2 logs, 2,5 logs, 3 logs, 4 logs o mayor que la Ka cuando el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo se une a otro antígeno. En otra modalidad específica, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno no reacciona de manera cruzada uniéndose con otras proteínas. En modalidades específicas, un anticuerpo o un fragmento
de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí específicamente se une a una isoforma nativa o a una variante nativa de PSGL-1 (que es una isoforma que existe de manera natural o una variante de PSGL-1 en un animal que se puede aislar a partir de un animal, preferentemente un humano). En modalidades particulares, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí se une inmunoespecíficamente a PSGL-1 de humano o a un fragmento del mismo. En modalidades específicas, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí se une específicamente a PSGL-1 de humano y/o a PSGL-1 de cinomolgo o a un fragmento de lo mismo.
La secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 11 presenta a la PSGL-1 humana de largo completo, con numero de acceso en GenBank™ AAA74577.1, Gl: 902797. En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 tal como se determina, por ejemplo, mediante ELISA o mediante otro ensayo de unión de antígeno conocido en el arte, o descrito aquí.
En aspectos específicos, aquí se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a PSGL-1 de humano y/o cinomolgo y que es una inmunoglobulina G (que tiene una región pesada-gama) de clase 4 (una lgG4) que es un tetrámero de dos dímeros idénticos unidos por disulfuro, donde cada uno comprende una cadena pesada y una cadena ligera. El anticuerpo preferentemente comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:2. Más
preferentemente, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO:2 y una cadena ligera de la SEQ ID NO:1. Con respecto a la cadena ligera, en una modalidad específica, la cadena ligera de un anticuerpo descrito aquí es una cadena ligera kappa.
En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí comprende una cadena pesada que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2. En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí comprende una cadena ligera que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1, y que comprende una cadena pesada que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2. En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí comprende una cadena ligera que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1. En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí comprende una cadena pesada que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.
En una modalidad específica, los anticuerpos proporcionados aquí son anticuerpos monoclonales lgG4 que se unen específicamente a PSGL-1. Se sabe que los anticuerpos lgG4 sufren un proceso llamado intercambio de brazo Fab, también conocido como recambio de lgG4, en donde la susceptibilidad aumentada de los enlaces de disulfuro de la bisagra de lgG4 nativa a la reducción permiten que las cadenas pesadas se separen y se reasocien al azar para producir una población de moléculas lgG4 mixta con pares de
cadenas pesadas y cadenas ligeras aleatorizadas (Aalberse et al., 1999. Int Arch Allergy Immunol 118:187-189; Labrijn, et al., 2009, Nat Biotec nol 27:767-771; Schuurman et al., 2001. Mol Immunol 38:1-8; van der Neut Kolfschoten et al., 2007. Science 317:1554-1557).
Se ha demostrado que una mutación de Serina por Prolina en la posición 241 utilizando numeración de Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) o en la posición 228 utilizando el índice EU (Edelman et al., 1969, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85) en la región de bisagra de la lgG4 de humano resulta en una reducción considerable de la formación de enlaces de disulfuro intracadena, resultando en la reducción de las moléculas "medio-anticuerpo" de lgG4 y con una heterogeneicidad/recambio reducido de las moléculas de lgG4 (Bloom et al. 1997, Protein Sci, 6:407-415; Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 30(1): 105-108)). También hay informes publicados de que esta mutación en la bisagra puede disminuir el recambio de lgG4 y aumentar la vida media de las moléculas de lgG4 en vivo (Labrijn, et al., 2009, Nat Biotechnol 27:767-771; Stubenrauch, et al., 2010, Drug Metab Dispos 38:84-91). El autor Van der Neut Kolfschoten et al., informó que el dominio CH3 de lgG4 y no la bisagra del núcleo esta predominantemente involucrado de la reacción del intercambio del brazo Fab (véase Van der Neut Kolfschoten et al, 2007, Science, 317:1554-1557 ("Van der Neut
Kolfschoten") at page 1555, col. 2). El autor Van der Neut Kolfschaten informó que intercambiando el dominio CH3 de I g G 1 por el dominio CH3 de lgG4 activaba el intercambio del brazo Fab para la I g G 1 , mientras que intercambiando el dominio CH3 de lgG4 anulaba el intercambio del brazo Fab para la lgG4 (Véase, p. 1555 y Figura 2D).
En una modalidad específica, aquí se provee anticuerpos lgG4 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a PSGL-1, y que contienen una o más sustituciones de aminoácidos en la región de bisagra de lgG4, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo retiene la unión específica a dicho PSGL-1 y donde el recambio de lgG4 es reducido respecto de un anticuerpo que comprende una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dicha una mas sustituciones de aminoácidos. En una modalidad específica, la región de bisagra de lgG4 solamente comprende una única sustitución de aminoácido. Un ejemplo de una "región de bisagra de lgG4 humana", es la región en la cadena pesada de un anticuerpo lgG4 entre los dominios CH1 y CH2 que consisten de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:12, tal como se define en Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 30(1): 105-108.
En una modalidad específica, una reducción en el recambio de lgG4 se determina detectando una menor cantidad de medias moléculas de anticuerpo o del intercambio de brazo producido a partir de un anticuerpo aquí descrito que contiene una o más
sustituciones de aminoácidos en la región de bisagra, comparado con la cantidad de medias moléculas de anticuerpo o del intercambio de brazo producido a partir de una molécula de lgG4 que contiene una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dicha una o más sustituciones de aminoácidos. Se puede usar cualquier ensayo bien conocido en el arte para detectar la producción de medio anticuerpo y moléculas biespecíf icas de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Van der Neut Kolfschoten et al, 2007, Science, 317:1554-1557, para ejemplos de ensayos para detectar la producción de anticuerpos biespecíficos.
En una modalidad específica, aquí se provee anticuerpos monoclonales lgG4 que se unen específicamente a PSGL-1, que comprenden una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en la posición de aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
En una modalidad específica, un anticuerpo descrito aquí comprende un cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1 y una cadena pesada que comprende una Prolina en la posición 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
En una modalidad específica, un anticuerpo monoclonal, que se une de manera inmunoespecíf ica a PSGL-1 de humano comprende: (i) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1; y (ii) una cadena pesada que comprende una región constante de lgG4 humana que contiene una o más sustituciones de aminoácidos en la región de bisagra lgG4, donde dicho anticuerpo
retiene la unión específica a dicho PSGL-1 y donde el recambio de lgG4 se reduce respecto de un anticuerpo que comprende una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dicha una o más sustituciones de aminoácidos.
En una modalidad específica, un anticuerpo monoclonal, que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano comprende (i) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1; y (ii) una cadena pesada que comprende una región constante de lgG4 humana que comprende una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en la posición de aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU o la posición 241 de acuerdo al sistema de numeración de Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; y Edelman et al., 1969, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85).
En una modalidad específica, un anticuerpo monoclonal, que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano comprende: (i) una región VL de cadena que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:3; (ii) una región VH de cadena que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4; y (iii) una región constante de lgG4 humana que contiene una región de bisagra de lgG4 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región de bisagra, donde dicho anticuerpo retiene la unión especifica a PSGL-1 y donde el recambio de lgG4 se reduce respecto
de un anticuerpo que comprende una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dicha una o más sustituciones de aminoácidos.
En una modalidad específica, un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano comprende: (i) una cadena pesada que comprende una región VH de cadena que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4, y (ii) una región constante de cadena pesada de a lgG4 humana que comprende una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en la posición de aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
En una modalidad específica, un anticuerpo monoclonal, que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano comprende: (i) una región VL de cadena que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:3; (ii) una cadena pesada que comprende una región VH de cadena que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4; y (iii) una región constante de cadena pesada de a lgG4 humana que comprende una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en la posición de aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal lgG4 como se describe aquí comprende los CDR VH que tienen la secuencia de aminoácidos aquí descrita (por ejemplo, véase el Cuadro 3) y los CDR VL que tienen la secuencia de aminoácidos descrita aquí (por ejemplo, véase el Cuadro 2), donde el anticuerpo se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 y que tiene una mutación en la región de
bisagra que reduce el recambio de lgG4 (por ejemplo, una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU). En una modalidad específica, el anticuerpo monoclonal lgG4 se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 y comprende una cadena pesada que comprende (a) una región de cadena VH que comprende las SEQ ID NO: 8, 9 y 10; y (b) una región constante de cadena pesada de lgG4 humana que contiene una sustitución de aminoácido de Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU. Más preferentemente, el anticuerpo además comprende una cadena ligera que comprende una región de cadena VL que comprende las SEQ ID No: 5, 6, y 7.
El Cuadro 2, a continuación presenta, las CDR VL (en particular, CDR 1 VL, CDR2 VL, y CDR3 VL) de la secuencia de aminoácido de 15A7H. El Cuadro 3, a continuación presenta, las CDR VH (en particular, CDR 1 VH, CDR2 VH, y CDR3 VH) de la secuencia de aminoácido de 15A7H. En modalidades específicas, un anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano (SEQ ID NO: 11) comprende las secuencias CDR VL del Cuadro 2. En modalidades específicas, un anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano (SEQ ID NO: 11), comprende las secuencias CDR VH seleccionadas de aquellas del Cuadro 3.
Cuadro 2: Secuencia de aminoácidos VL CDR
Cuadro 3: Secuencia de aminoácidos VH CDR
En una modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 humano y que comprende: (i) una región variable de cadena ligera ("VL") que comprende una CDR1 VL, CDR2 VL, y CDR3 VL que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y 7, respectivamente; (¡i) una región variable de cadena pesada ("VH") que comprende una CDR1 VH, CDR2 VH, y CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, respectivamente; y (iii) una región constante de cadena pesada de lgG4 que contiene una región de bisagra de I g G que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región de bisagra, donde dicho anticuerpo retiene la unión específica a dicho PSGL-1 y donde el recambio lgG4 es reducido respecto de una anticuerpo que comprende una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dichas una o más sustituciones de aminoácido.
En una modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 humano y que comprende: (i) una región de cadena VL que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; (ii) una región de cadena VH que comprende una CDR1 VH, CDR2 VH, y CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, respectivamente; y (iii) una región constante de cadena pesada de lgG4 humana que contiene una región de bisagra de lgG4 que comprende una o más sustituciones de aminoácido en la región de bisagra, donde dicho anticuerpo retiene la unión específica a dicho PSGL-1 y donde el recambio de lgG4 se reduce respecto de un anticuerpo que comprende una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dichas una o más sustituciones de aminoácido.
En una modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 humano y que comprende: (i) una región de cadena VL que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; (ii) una cadena pesada que comprende región VH de cadena que comprende una CDR1 VH, CDR2 VH, y CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, respectivamente; y (iii) una región constante de cadena pesada de una lgG4 humana que comprende una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en la posición de aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
En una modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito
que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 de humano y que comprende: (i) una región VL de cadena que comprende una CDR1 VL, CDR2 VL, y CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 7, respectivamente; (M) una región VH de cadena que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4; y (Mi) una región constante de cadena pesada de lgG4 humana que contiene una región de bisagra de lgG4 que comprende una o más sustituciones de aminoácido en la región de bisagra, donde dicho anticuerpo retiene la unión específica a dicho PSGL-1 y donde el recambio lgG4 es reducido respecto de un anticuerpo que comprende una región de bisagra de lgG4 que no comprende a dichas una o más sustituciones de aminoácido.
En una modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a PSGL-1 humano y que comprende: (i) una región de cadena VL que comprende una CDR1 VL, CDR2 VL, y CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 7, respectivamente; (ii) una cadena pesada que comprende una región de cadena VH que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4; y (iii) una región constante de cadena pesada de una lgG4 humana que comprende una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en la posición de aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí, es el que se une inmunoespecíficamente a PSGL-1, por ejemplo, a un
polipéptido PSGL-1 humano de la SEQ ID NO: 11, que comprende regiones marco (por ejemplo, regiones marco del dominio VL y del dominio VH). Ejemplos no limitantes de regiones marco de humano se describen en el arte, por ejemplo, véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest. Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
El cuadro 4, a continuación, presenta la secuencia de aminoácidos del marco VL (FR) (en particular, las secuencias FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL, y FR4 VL) del anticuerpo 15A7H. El Cuadro 5, a continuación, presenta la secuencia de aminoácidos FR VH (en particular, las secuencias FR 1 VH, FR2 VH, FR3 VH, y FR4 VH) del anticuerpo 15A7H.
Cuadro 4: Secuencia de aminoácidos VL FR
Cuadro 5: Secuencia de aminoácidos VH FR
En ciertas modalidades, los anticuerpos lgG4 arriba descritos que tienen una mutación en la región de bisagra que reduce el recambio de lgG4 comprende las FR VL que tienen la secuencia de aminoácido descrita aquí (véase Cuadro 4). En modalidades específicas, un anticuerpo descrito aquí comprende una región de cadena VL que comprende FR 1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4 de los cuadros 1 y 3.
En ciertas modalidades, los anticuerpos lgG4 arriba descritos que tienen una mutación en la región de bisagra que reduce el recambio lgG4 comprenden a las FR VH que tienen la secuencia de aminoácido aquí descrita (véase Cuadro 5). En modalidades específicas, un anticuerpo comprende una región de cadena VH que comprende FR 1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4, de los cuadros 2 y 4.
En otra modalidad específica, un anticuerpo monoclonal lgG4 aquí descrito comprende (i) una región de cadena VL que comprende FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL, y FR4 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, 14, 15, y 16, respectivamente; y (ii) una región VH de cadena que comprende FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, y FR4 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, 18, 19, y 20, respectivamente, y que tiene una mutación en la región de bisagra que reduce el recambio lgG4. En una modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito comprende una región VL de cadena que comprende FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL, y FR4 VL que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, y
16, respectivamente. En otra modalidad específica, un anticuerpo aquí descrito comprende una región de cadena VH que comprende FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, y FR4 VH que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID No: 17, 18, 19, y 20, respectivamente.
En modalidades particulares, la glicosilación de la región constante de los anticuerpos aquí descrita se puede modificar. Por ejemplo, una región constante aglicosilada de una anticuerpo puede ser preparada (es decir, en la región constante de anticuerpo carece de glicosilación) o se puede preparar una región constante de un anticuerpo que comprende una mutación o una sustitución en uno o más sitios de glicosilación para eliminar la glicosilación en el uno o más sitios de glicosilación.
La glicosilación puede ocurrir a través de una glicosilación unida a N o una glicosilación unida a O (o unida a asparragina). La glicosilación unida a N involucra la modificación del carbohidrato en el grupo NH2 de la cadena lateral de un aminoácido de asparragina en un polipéptido. La glicosilación unida a O involucre una modificación de carbohidrato en el grupo hidroxilo en la cadena lateral de un aminoácido serina, treonina, o hidroxilisina.
En ciertas modalidades, los anticuerpos aglicosilados pueden ser producidos en células bacterianas que carecen de la maquinaria de glicosilación necesaria. Las células que tienen una maquinaria de glicosilación alterada han sido descritas en el arte y pueden ser utilizadas como células huésped en las cuales se expresen
anticuerpos recombinantes aquí descritos para producir de este modo un anticuerpo con una glicosilación alterada. Véase, por ejemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como, Patente Europea No: EP 1.176.195; Publicaciones PCT WO 03/035835; WO 99/54342.
En ciertas modalidades, una o más modificaciones can pueden ser realizadas a la región Fe de un anticuerpo aquí descrito, generalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media sérica, fijación de complemento, unión del receptor Fe, y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Estas modificaciones son conocidas en la técnica, y se describen por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional WO No. 2008/153926 A2. Ejemplos de tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a: 1) alterar el número de residuos de cisteína en la región de bisagra para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo; 2) mutar uno o más aminoácidos en el dominio CH2-CH3 de la región de interface del fragmento Fc-bisagra e un anticuerpo para disminuir la vida media biológica del anticuerpo; 3) reemplazar uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 de acuerdo al índice ELI de Kabat con un residuo de aminoácido diferente de tal modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero mantenga la capacidad de unirse a antígeno del anticuerpo parental; y/o 4) modificar uno o
más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 de acuerdo al índice EU de Kabat para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy. Aquí se proveen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo que se unen de manera inmunoespecífica a PSGL-1 y que pueden modular la actividad PSGL-1. En ciertas modalidades, un anticuerpo y un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo proporcionado aquí se unen inmunoespecíficamente a PSGL-1 sin inhibir la unión de PSGL-1 a P-selectina, e induce la apoptosis de células T activadas. La actividad PSGL-1 puede relacionarse con cualquier actividad de PSGL-1 conocida o descrita en el arte, por ejemplo, activación de células T durante una respuesta inflamatoria. La actividad PSGL-1 o a función PSGL-1 se utiliza de manera intercambiable aquí. En ciertos aspectos, la actividad PSGL-1 inducida por el ligando PSGL-1 (por ejemplo, P-selectina) que se une a PSGL-1.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-PSGL-1 o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí no bloquea o inhibe la unión de P-selectina a PSGL-1.
En una modalidad específica, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí reduce el reclutamiento de leucocitos durante una respuesta inflamatoria.
En ciertos aspectos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí reduce o inhibe la sobrevida de células que expresan PSGL-1 y responde a la señalización de actividad PSGL-1 (por ejemplo, células que proliferan en respuesta a la estimulación de ligando PSGL-1, señalización PSGL-1 o unión a selectina), por ejemplo, induce la apoptosis en células T activadas. Ensayos de sobrevida celular se describen en el arte y se pueden realizar fácilmente por un experto en el arte. Por ejemplo, se puede evaluar la viabilidad celular usando tinción de azul tripan y otros marcadores de muerte o de viabilidad celular conocidos en el arte (por ejemplo, Anexina-1, yodo propidio (Pl) o 7-AAD, véase Gerber A, Bohne M, Rasch J, Struy H, Ansorge S, Gollnick H., 2000. I nvestigation of annexin V binding to lymphocytes after extracorporeal photoimmunotherapy as an early marker of apoptosis. Dermatology. 2000;201 (2): 111-7, Coder, D. M. 2001. Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry. 9.2.1-9.2.14, y Muppidi, J., Porter, M. and Siegel, R. M. 2004. Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death. Current Protocols in Immunology. 59:3.17.1-3.17.36.).
En modalidades específicas, los anticuerpos aquí descritos se unen específicamente a PSGL-1 e inhiben (por ejemplo, inhiben parcialmente o completamente) la sobrevida de células T activadas
ensayadas a través de métodos descritos aquí o conocidas por un experto en el arte (por ejemplo, ensayo de exclusión de azul de tripan, véase Coder, D. M. 2001. Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry. 9.2.1-9.2.14). En algunas modalidades, el término "inhibe" o "inhibición" representa la reducción o prevención de la sobrevida de células T activadas. La sobrevida de células T activadas se puede reducir en alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, alrededor de 100%, alrededor de 125%, alrededor de 150% o más comparados con un control (por ejemplo, sobrevida de células T en ausencia de los anticuerpos descritos aquí o en presencia de un anticuerpo no especifico).
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-PSGL-1 descrito aquí es capaz de inducir la apoptosis (es decir, muerte celular programada) de células T activadas que expresan PSGL-1. Los ensayos de apoptosis se describen en el arte y se pueden realizar fácilmente por un experto en el arte (Véase, por ejemplo, Muppidi, J., Porter, M. and Siegel, R. M. 2004. Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death. Current Protocols in Immunology. 59:3.17.1-3.17.36). El término "induce" o "que induce" representa el inicio de o un aumento de la apoptosis por sobre un nivel control. La apoptosis de células T activadas puede ser inducido en alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de
80%, alrededor de 90%, alrededor de 100%, alrededor de 125%, alrededor de 150% o más comparado con un control (por ejemplo apoptosis de células T activadas en ausencia de anticuerpos aquí descritos o en presencia de un anticuerpo no específico).
Las células T y las líneas de células T que son adecuadas para ser usadas en los ensayos descritos aquí que se refieren a la actividad de PSGL-1 están fácilmente disponibles (por ejemplo, ARR, DU.528, Jurkat, H-SB2, RPMI 8402, CML-T1, Karpas 45, KE-37/SKW-3, SUP-T1 , SUP-T3, MOLT 3/4, P12-lchikawa, PF-382, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17, TALL-104, DND-41, Loucy, MOLT 13, Peer/Be13, HUT 78/H9, HUT 102, MT-1, DEL, JB6, Karpas 299, SU-DHL1, 12H5, 3D054.8, 3DO11.10, 8D051.15, o 3D018.3) o pueden ser fácilmente Identificadas utilizando métodos conocidos en el arte (Véase, por ejemplo, Thornton, A. M. 2003. Fractionation of T and B Cells Using Magnetic Beads. Current Protocols in Immunology. 55:3.5A.1-3.5A.11., Hathcock, K. 2001. T Cell Enrichment by Cytotoxic Elimination of B Cells and Accessory Cells. Current Protocols in Immunology. 00:3.3.1-3.3.5., Horgan, K., Shaw, S. and Boirivant, M. 2009. Immunomagnetic Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 85:7.4.1-7.4.9., and Kanof, M. E. 2001. Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 00:7.3.1-7.3.5). En modalidades particulares, las células o líneas de células para ser usadas en ensayos de proliferación celular pueden expresar PSGL-1, ya sea endógenamente o recombinantemente. Las células o
líneas celulares para ser usadas en los ensayos de viabilidad celular pueden expresar PSGL-1, endógenamente o recombinantemente, y ejercer cambios en la viabilidad celular en respuesta al ligando PSGL-1 o a la unión de anticuerpo anti-PSGL-1. Las células o líneas celulares para ser usadas en los ensayos de apoptosis pueden expresar PSGL-1, ya sea endógenamente o recombinantemente, y ejercer cambios en la apoptosis en respuesta a la unión del ligando PSGL-1 o del anticuerpo anti-PSGL-1. Preferentemente las células o líneas celulares son de humano (por ejemplo ARR, DU.528, Jurkat, H-SB2, RPMI 8402, CML-T1, Karpas 45, KE-37/SKW-3, SUP-T1, SUP-T3, OLT 3/4, P12-lchikawa, PF-382, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17, TALL-104, DND-41, Loucy, MOLT 13, Peer/Be13, HUT 78/H9, HUT 102, MT-1, DEL, JB6, Karpas 299, o SU-DHL1).
Los métodos para determinar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo a su antígeno objetivo están fácilmente disponibles y descritos en el estado del arte. Por ejemplo, las afinidades y las propiedades de un anticuerpo por su antígeno objetivo, pueden ser determinadas por una diversidad de métodos de ensayo in vitro (ensayos basados en bioquímica o inmunología) conocidos en el arte tales como métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmuno-absorvente de enzima unida (ELISA), o radioimmunoensayo (RIA)), o cinética (por ejemplo, análisis Biacore™), y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de unión competitiva, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET),
¡nmunoprecipitación, inmunoforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se están examinando y/o utilizar una variedad de métodos de detección que incluye pero no están limitados a marcas cromo génicas, fluorescentes, luminiscentes, o isotópicas. En ciertas modalidades, el uso de marcas no es necesario, por ejemplo, los sistemas Biacore™ utilizan el fenómeno natural de resonancia de plasma de superficie (SPR) para entregar datos en tiempo real, sin el uso de marcadores.
En una modalidad específica, los anticuerpos aquí descritos están aislados. En una modalidad específica, los anticuerpos aquí descritos están purificados. En una modalidad particular, un anticuerpo descrito aquí es un anticuerpo monoclonal recombinante.
En una modalidad particular, aquí se provee un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que ha sido modificado de una manera adecuada para fabricación a gran escala. Esto puede involucrar clonar secuencias de polinucleótido que codifican los dominios necesarios de un anticuerpo anti-PSGL-1, de tal modo que uno o más CDR o FR, en un vector de expresión adecuado que también contiene las secuencias de polinucleótido, que codifican regiones constantes adecuadas, de modo que se produce un anticuerpo completo. La secuencia de polinucleótido proporcionada por los vectores de expresión son secuencias de nucleótido que pueden ser optimizadas para maximizar el
rendimiento del anticuerpo y la estabilidad para las condiciones de fabricación en el cultivo celular y para los procesos de purificación.
6.2 Polinucleótidos
En ciertos aspectos, aquí se proveen polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo aquí descrito que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno PSGL-1, y los vectores que comprenden a estos polinucleótidos recombinantes para las células huésped (por ejemplo, organismos microbianos, tales como E. coli y células de mamífero, tales como células de hibridoma murino, células CHO, y fibroblastos 3T3). Aquí se proveen polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican a cualquiera de los anticuerpos o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo de los mismos que se proporcionan aquí, así como vectores que comprenden a tales secuencias de polinucleótido, por ejemplo, vectores de expresión para su expresión eficiente en células huésped, por ejemplo, células de mamífero. En una modalidad específica, el polinucleótido que comprende secuencias de nucleótido que codifican a cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí se aislan o se purifican.
En aspectos particulares, proporcionados aquí se encuentran los polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótido que
codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo, que se unen de manera inmunoespecifica a PSGL-1 y que comprenden una secuencia de aminoácido como aquí se ha descrito.
En modalidades específicas, un polinucleótido descrito aquí codifica para una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2.
Los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótido que codifican una cadena pesada que comprende a los FR VH y a los CDR de los anticuerpos aquí descritos (Véase, por ejemplo, Cuadros 2 y 4) y además comprende una mutación en la región de bisagra que reduce el recambio de lgG4.
También se proporcionan aquí polinucleótidos que codifican una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 2, que se han optimizado, por ejemplo, mediante optimización de codón/ARN, reemplazo con secuencia señal heterólogas, y eliminación de elementos de inestabilidad de ARNm. También se provee aquí polinucleótidos que codifican una cadena ligera de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1, el cual está optimizado, por ejemplo, mediante optimización de codón/ARN, reemplazo con secuencia señal heterólogas, y eliminación de los elementos de ARNm de inestabilidad. Los métodos para generar ácidos nucleicos optimizados que codifican un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo para la expresión recombinante introduciendo los cambios de codón y/o eliminando las regiones inhibidoras en el ARNm pueden ser realizadas adaptando los
métodos de optimización descritos en, por ejemplo, Las patentes U.S. Nos. 5.965.726; 6.174.666; 6.291.664; 6.414.132; y 6.794.498, consecuentemente. Por ejemplo, los sitios de corte potenciales y los elementos de inestabilidad (por ejemplo, elementos ricos en A/T o A/U) dentro del ARN se pueden mutar sin alterar los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos para aumentar la estabilidad del ARN para la expresión recombinante. Las alteraciones utilizan la degeneración del código genético, por ejemplo, usando un codón alternativo para un aminoácido idéntico. En algunas modalidades, puede ser deseable alterar uno o más codones para codificar una mutación conservadora, por ejemplo, un aminoácido similar con una estructura química similar y propiedades y/o funciones similares respecto del aminoácido original. Estos métodos pueden aumentar la expresión de un anticuerpo anti-PSGL-1 o de un fragmento de unión a antígeno del mismo respecto de la expresión de un anticuerpo anti-PSGL-1 codificado por los polinucleótidos que no han sido optimizados. Además, las secuencias de polinucleótido pueden ser diseñadas para coincidir con el uso del codón preferido en la célula huésped, por ejemplo uso de codón en E. coli o uso de codón en CHO.
Una secuencia de polinucleótido optimizada que codifica un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrita aquí puede hibridarse con una secuencia de polinucleótido no optimizada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí.
En modalidades específicas, una secuencia de nucieótido optimizada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrita aquí hibridiza bajo condiciones de alta rigurosidad con una secuencia de polinucleótido no optimizada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrita aquí. En una modalidad específica, una secuencia de nucieótido optimizada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo hibridiza bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad, de rigurosidad intermedia o baja con una secuencia de nucieótido no optimizada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrita aquí. La información con respecto a condiciones de hibridación ha sido descrita, véase, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente US No. 2005/0048549 (por ejemplo, párrafos 72-73), la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
Los polinucleótidos se pueden obtener, y la secuencia de nucieótido de los polinucleótidos puede ser determinada, por cualquier método conocido en el arte. Las secuencias de nucieótido que codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí, y las versiones modificadas de estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo pueden ser determinadas usando métodos bien conocidos en el arte, es decir, codones de nucleótidos que se sabe que codifican aminoácidos particulares son ensamblados de
tal modo que generen un ácido nucleico que codifique al anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo. Un polinucleótido como este que codifica el anticuerpo puede ser ensamblado a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo cual, por ejemplo, involucra la síntesis de oligonucleótidos que se sobreponen, los que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que se híbrida y liga a aquellos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados a través de PCR. Diversos métodos para generar genes sintéticos a partir de oligonucleótidos son conocidos en el estado del arte.
Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí puede ser generado a partir del ácido nucleico proveniente de una fuente adecuada (por ejemplo, un hibridoma) usando métodos bien conocidos en el arte (por ejemplo, por métodos como PCR y otros métodos de clonamiento molecular). Por ejemplo, la amplificación por PCR que usa partidores sintéticos hibridizables a los extremos 3' y 5' de una secuencia conocida pueden ser llevados a cabo utilizando ADN genómico obtenido de células que producen el anticuerpo de interés, por ejemplo células de hibridoma. Dichos métodos de amplificación por PCR pueden ser utilizados para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica
la cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo. Dichos métodos de amplificación por PCR se pueden usar para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada de un anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados se pueden clonar en vectores para la expresión en células huésped y para un clonamiento posterior, por ejemplo, para generar anticuerpos quiméricos y humanizados. La cadena constante generalmente es kappa o lambda para la cadena ligera del anticuerpo, para la cadena pesada de anticuerpo esta puede ser, sin limitación, de cualquier isotipo de IgG (por ejemplo IgG 1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humanas) o de otras ¡nmunoglobulinas, incluyendo variantes alélicas.
Si no se encuentra disponible un clon que contenga un ácido nucleico que codifique un anticuerpo particular, pero sea conocida la secuencia de la molécula de anticuerpo, entonces se puede sintetizar por vía química un ácido nucleico que codifique a la inmunoglobulina y clonarlo en vectores de clonamiento replicables utilizando un método bien conocido en el arte.
El ADN que codifica anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótido que sean capaces de unirse específicamente a ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos). Una vez aislado, el AND se puede colocar en vectores de expresión, los cuales luego son
transfectados a células huésped procariotas o eucariotas tales como células de E. coli, de levadura (Pichia, Saccharomyces) células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma (NSO), células de insecto o vegetales que de otra forma no producen la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo en las células huésped recombinantes.
6.3 Células Huésped y Expresión Recombinante de los Anticuerpos
En ciertos aspectos, aquí se proporcionan células huésped que expresan de manera recombinante los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí y los vectores de expresión relacionados. Aquí se proporcionan vectores de expresión que comprenden polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno derivados de anticuerpo descritos aquí para la expresión recombinante en células huésped procariotas y eucariotas, preferentemente en células de mamífero. También se proporciona aquí las células huésped que comprenden a tales vectores de expresión para expresar de manera recombinante los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí. En un aspecto particular, aquí se proporcionan métodos para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí, que comprende expresar dicho
anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo a partir de una célula huésped.
La expresión recombinante de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí que se une de manera inmunoespecífica a un antígeno PSGL-1 involucra la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo. Una vez que el polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí ha sido obtenido, el vector para la producción del anticuerpo del fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo puede ser producido mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Por lo cual, los métodos para preparar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo expresando un polinucleótido que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que codifica la(s) secuencia(s) de nucleótido se describen aquí. Se pueden utilizar métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en el arte para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican al anticuerpo o secuencias que codifican al fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo y señales de control transcripcional y traduccional adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. También se proporcionan vectores
replicables que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo descrito aquí, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o un fragmento de unión antígeno derivado del anticuerpo, funcionalmente unido a un promotor, en particular, a un promotor que proporciona expresión en una célula de mamífero. Estos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótido que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (Véase, por ejemplo, Publicaciones internacionales Nos. WO 86/05807 y WO 89/01036; y patente US No. 5.122.464) y dominio variable del anticuerpo se puede clonar en este vector para la expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa, o ambas cadenas ligera y pesada completas. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, episomas derivados de EBV, cromosomas artificiales y similares. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula huésped. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de las cadenas de anticuerpo a partir de una célula huésped. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina, un péptido heterólogo proveniente de una proteína que no es inmunoglobulina o un péptido artificial.
El vector de expresión es transferido a una célula huésped a través de técnicas convencionales conocidas en el arte (por ejemplo transfección mediada por liposoma, transfección mediada por
policatión, fusión de protoplasto, microinyecciones, precipitación con fosfato de calcio, electroporación, transferencia por vectores virales) y luego se cultivan las células transfectadas a través de técnicas convencionales para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí. Por lo cual, aquí se proveen células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí, funcionalmente unido a un promotor heterólogo. En ciertas modalidades para la expresión de anticuerpos de doble cadena, se pueden co-expresar los vectores que codifican a ambas las cadenas ligera y pesada en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla más adelante. En ciertas modalidades, una célula huésped contiene un vector que comprende un polinucleótido que codifica a ambas la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo descrito aquí, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En modalidades específicas, una célula huésped contiene dos vectores diferentes, un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada de un anticuerpo descrito aquí, o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del mismo), y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo descrito aquí, o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno del mismo). En otras modalidades, una primera célula huésped comprende un primer vector que comprende un
polinucleótido que codifica una cadena pesada de un anticuerpo descrito aquí, o un fragmento del mismo, y una segunda célula huésped comprende un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo descrito aquí.
Se pueden utilizar una variedad de sistemas de expresión huésped - vector para expresar moléculas de anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí (Véase, por ejemplo, la patente US No. 5.807.715 y la patente US No. 7.604.800). Tales huésped- sistemas de expresión representan vehículos mediante los cuales se pueden producir las secuencias codificantes de interés y ser posteriormente purificadas, pero también representa las células que pueden, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias de nucleótido codificante adecuadas, expresar in situ una molécula de anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí. Estos incluyen pero no están limitados a microorganismos tales como bacteria (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformados con ADN recombinante de bacteriófago, ADN plasmidial o ADN cosmidial vectores de expresión que contienen secuencias de anticuerpo codificantes o secuencias codificantes de fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión recombinantes de levadura que contienen secuencias de anticuerpo codificantes o secuencias codificantes de fragmento de
unión a antígeno derivado de anticuerpo; sistemas de célula de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contiene secuencias de anticuerpo codificantes o secuencias codificantes de fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo; sistemas de célula vegetal (por ejemplo, de alga verde tal como Chlamydomonas reinhardtii) infectadas con vectores de expresión recombinantes de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmidio recombinantes (por ejemplo, plasmidio Ti) que contiene secuencias de anticuerpo codificantes o secuencias codificantes de fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo; o sistemas de célula de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7030, HsS78Bst, HeLa, y NIH 3T3) que portan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores y/o mejoradores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneina, promotor de inmunoglobulina, promotor de actina) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7.5K del virus vaccinia o virus vacuna, CMV, Virus Simio 40). Otros elementos reguladores para la expresión en células eucarióticas son las señales de poliadenilación tales como BGH polyA, SV40 tardío o temprano poliA. Alternativamente, se pueden usar señales de poliadenilación de inmunoglobulina u otros genes. En otra modalidad específica, las células eucarióticas, especialmente
para la expresión de un anticuerpo monoclonal lgG4 descrito aquí, se usan para la expresión de un anticuerpo descrito aquí o fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino (CHO), en conjunto con un vector tal como el principal elemento promotor del gen intermedio temprano de citomegalovirus humano es un Sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; and Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos aquí son producidos por células CHO o células NSO. En una modalidad específica, la expresión de las secuencias de nucleótido que codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí que se unen inmunoespectficamente a un antígeno PSGL-1 es regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión se pueden seleccionar de manera ventajosa dependiendo del uso que se pretende dar a la molécula de anticuerpo que está siendo expresada. Por ejemplo, cuando se ha de producir una gran cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son fácilmente purificados.
Además, una cepa de célula huésped puede ser seleccionada, la cual modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto del gen en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y el procesamiento de los productos de proteína puede ser importante para la función de la proteína. Células huésped diferentes poseen características y mecanismos específicos para el procesamiento post-traduccional y la modificación de proteínas y de productos génicos. Las líneas celulares o células huésped adecuadas se pueden elegir para asegurar la correcta modificación y procesamiento o que la proteína externa sea expresada. Para este propósito, se pueden usar células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcripto primario, la glicosilación, y la fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen pero no están limitadas a células CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, NSO (una línea celular de mieloma murino que no produce alguna cadena de inmunoglobulina de manera endógena), CRL7030 y HsS78Bst. En ciertas modalidades, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí se producen en células de mamífero, tales como células CHO.
A largo plazo, se prefiere la expresión estable en la producción de alto rendimiento de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo recombinantes. Por ejemplo, es posible modificar por ingeniería genética líneas celulares de mamífero que
expresan de manera estable la molécula de anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación viral, es posible transformar células huésped con ADN controlado con elementos de control de expresión adecuados (por ejemplo, secuencias de promotor, de mejoradores, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Luego de la introducción del ADN extraño, es posible permitir que las células modificadas se cultiven por 1 a 2 días en medio no selectivo, y luego cambiarlas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmidio recombinante confiere Resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plasmidio en sus cromosomas. Después del clonamiento de célula única, se expanden las células a líneas de producción celular. Este método se puede usar ventajosamente para modificar las líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo. Dichas líneas celulares modificadas pueden ser particularmente útiles en la selección y la evaluación de composiciones que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Se pueden usar un número de sistemas de selección, incluyendo pero no limitado a, timidina quinasa de virus herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantinaguanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 48:202), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) genes que se pueden usar en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También es posible usar Resistencia antimetabolito como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem.62: 191 -217; Mayo, 1993, TIB TECH 11 (5): I55-2 15); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Se pueden aplicar de manera rutinaria métodos de tecnología de ADN recombinante que son comúnmente conocidos en el arte para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1, los cuales se incorporan como referencia aquí en su totalidad.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo o un
fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo se pueden aumentar por medio de amplificación por vector (para una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification para la expresión of cloned genes in mammal cells ¡n DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema del vector que expresa el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped puede ser co-transfectada con dos o más vectores de expresión descritos aquí, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores de selección seleccionables idénticos o diferentes los cuales permiten la expresión suficiente de polipéptidos de cadena pesada y de cadena ligera. Las células huésped pueden ser co-transfectadas con cantidades diferentes de los dos o más vectores de expresión.
Alternativamente, se puede usar un único vector el cual codifica, y es capaz de expresar, ambos polipéptidos de cadena
pesada y de cadena ligera. Las secuencias codificantes para las cadenas ligera y pesada puede comprender ADNc o ADN genómico. El vector de expresión puede ser monocistrónico o multicistrónico. Por ejemplo una construcción de ácido nucleico bicistrónica puede comprender en el siguiente orden un promotor, la cadena pesada de un anticuerpo descrito aquí), and una cadena ligera de un anticuerpo descrito aquí. En un vector de expresión como tal, la transcripción de ambas cadenas puede ser dirigida por el promotor, mientras que la traducción del ARNm desde la cadena pesada puede ocurrir a través de un mecanismo de barrido dependiente de "cap" y la traducción del ARNm desde la cadena ligera puede ser a través de un mecanismo de barrido independiente de "cap", por ejemplo, a través de IRES.
En algunas modalidades, las moléculas de anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo son producidas cultivando las células huésped por un período de tiempo suficiente para permitir la alta expresión de las moléculas en las células huésped. En algunas modalidades las moléculas son expresadas en células de mamífero, por ejemplo en células CHO en medio libre de suero o en un medio definido del punto de vista químico. En algunas modalidades, las moléculas de anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo son recuperados desde el medio de cultivo como un polipéptido secretado o puede ser recuperado desde lisados de la célula huésped si por ejemplo se expresa sin una señal secretora.
Una vez que una molécula de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí se ha producido por medio de expresión recombinante, se puede purificar por cualquier método conocido en el arte para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por medio de cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, particularmente de afinidad por el antígeno específico luego de Proteína A, y por medio de cromatografía en columna de exclusión de tamaño), por centrifugación, solubilidad diferencial, precipitación, filtración, HPLC de fase reversa, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de las proteínas para obtener preparaciones de las moléculas sustancialmente homogéneas y biológicamente activas. Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo descritos aquí se pueden fusionar a secuencias de polipéptido heterólogas para facilitar la purificación.
En modalidades específicas, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí es aislado o purificado. Por ejemplo, en una modalidad particular, una preparación de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo descrito aquí se encuentra sustancialmente libre de material celular, componentes del medio y/o precursores químicos. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo en el cual el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo es
separado de los componentes celulares de las células de las cuales es aislado o producido de manera recombinante. Cuando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo es producido de manera recombinante, este también por lo general se encuentra sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de alrededor de 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, o 0,1% del volumen de la preparación de proteína. Cuando se produce el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo por medio de síntesis química, por lo general está sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos, es decir, es separado de los precursores químicos o de otros productos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, tales preparaciones del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo poseen menos de alrededor de 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o de compuestos diferentes del anticuerpo de interés o del fragmento de unión a antígeno derivado del anticuerpo de interés.
6.4 Composiciones Farmacéuticas
En la presente descripción se proveen composiciones, composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En aspectos particulares, las composiciones que aquí se describen se pueden aplicar en usos in vitro, in vivo o ex vivo. En modalidades
específicas, en la presente descripción se provee una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo. Tal como que aquí se describen.y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones terapéuticas que contienen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se proveen, se pueden preparar para su almacenamiento, al mezclar el anticuerpo, que tiene el grado de pureza deseado, con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales, fisiológicamente aceptables (Reminqton's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington: The Science v Practice of Pharmacv, 21 st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD), en la forma de formulaciones o soluciones acuosas liofilizadas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores, a las dosis y las concentraciones utilizadas, e incluyen reguladores de pH, tales como fosfato, citrato, citrato de sodio dihidrato y de otros ácidos orgánicos; y/o agentes tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Las composiciones, tal como aquéllas que se describen en la presente memoria descriptiva, también pueden contener más de un compuesto activo (por ejemplo, moléculas, como ejemplo, anticuerpo o anticuerpos, tal como se describe en la presente memoria descriptiva) necesarios para la indicación particular que se está tratando. En ciertas modalidades, las formulaciones comprenden un
anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se provee aquí, y uno o más compuestos activos con actividades complementarias, que no se ven adversamente afectados entre sí. Tales moléculas se encuentran apropiadamente presentes en combinación, en cantidades que son eficaces para el objetivo perseguido. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como aquí se describe, se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos. Dicha terapia combinada se puede administrar al paciente en serie o simultánea o secuencialmente.
Las composiciones que se utilizan en la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de, por ejemplo, membranas estériles de filtración.
En aspectos específicos, las composiciones farmacéuticas que aquí se proveen contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como aquí se proporcionan, y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, tal como soriasis, o uno o más de sus síntomas. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que es segura y suficiente para prevenir o tratar una enfermedad. Tal
como se utiliza en la presente descripción, el término "tratar", "tratado," "tratando" o "tratamiento" se utiliza en la presente descripción para referirse a la provisión de un resultado clínico benéfico o deseado, en un paciente con una enfermedad. Los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o desacelerar la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la sobrevida en comparación con la sobrevida esperada si no se recibe tratamiento.
Los vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se provee aquí, incluyen cualquier vehículo conocido por aquellos expertos en el arte, por ser adecuado para la forma de administración particular. En una modalidad, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo se formula en preparaciones farmacéuticas adecuadas, tal como soluciones o suspensiones estériles para administración parenteral.
Además, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, puede estar formulado como el único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición o se puede combinar con otros ingredientes activos (tal como uno o más agentes terapéuticos o profilácticos).
En las composiciones, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se provee aquí se mezcla con un vehículo o portador farmacéutico adecuado. Las concentraciones del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo en las composiciones puede, por ejemplo, ser eficaz para el suministro de una cantidad, después de su administración, que previene y/o trata un trastorno o enfermedad, tal como las que aquí se describen (por ejemplo, un trastorno inflamatorio) o su síntoma.
En una modalidad, las composiciones están formuladas para administración de dosis única. Para formular una composición, la fracción en peso del compuesto se disuelve, suspende, dispersa o se mezcla de otro modo, en un vehículo seleccionado, a una concentración eficaz, de tal manera que el trastorno se alivia, se trata o uno o más síntomas se mejoran.
En ciertos aspectos, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se provee en la presente descripción, está incluido en el vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz, suficiente para generar un efecto terapéuticamente útil en la ausencia de, o con mínimos o insignificantes efectos secundarios en el paciente tratado. Una concentración terapéuticamente eficaz se puede determinar empíricamente al probar los compuestos en sistemas in vitro e in vivo, por medio del uso de métodos de rutina y luego extrapolar las dosis en humanos a partir de ellos.
La concentración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo en la composición farmacéutica dependerá, por ejemplo, de las características fisicoquímicas del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, el horario de las dosis y la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos por aquellos expertos en el arte.
Las composiciones farmacéuticas, en otra modalidad, proveen una dosis de alrededor de 0,001 mg a alrededor de 100 mg de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, por kilo de peso corporal, diariamente. Las formas de dosis unitarias farmacéuticas se pueden preparar para proporcionar de alrededor de 0,001 mg a alrededor de 100 mg y/o una combinación de otros ingredientes esenciales opcionales, por forma de dosis unitaria. En una modalidad específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo se formula con una concentración de 40 mg/mL.
El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo se puede administrar de una sola vez o se puede dividir en un número de dosis más pequeñas, para ser administradas a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosis precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad o el trastorno que se tratan y que aquí se describen y se pueden determinar empíricamente, por medio del uso de protocolos de prueba conocidos o por extrapolación de los datos de los ensayos in vivo o in vitro. Cabe señalar que los valores de las concentraciones y las dosis
también pueden variar con la severidad de la enfermedad o el trastorno a aliviar. Ha de entenderse, además, que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosis específicas se pueden ajustar en el tiempo, según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas se proveen para su administración a humanos y animales, en formas de dosis unitarias, tal como soluciones o suspensiones parenterales estériles que contienen cantidades adecuadas de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en este documento. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, en una modalidad, se formula y administra en formas de dosis unitaria o formas de dosis múltiples. Las formas de dosis unitaria, tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a unidades físicamente discretas, adecuadas para pacientes animales y humanos, y envasados individualmente, como se conoce en el arte. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno derivado del anticuerpo, suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, junto con el vehículo, portador o diluyente farmacéutico requerido. Ejemplos de formas de dosis unitaria incluye ampollas y jeringas. Las formas de dosis unitaria se pueden administrar en fracciones o varias de ellas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosis unitaria, envasada en un solo recipiente, para ser
administrada en forma de dosis unitaria segregada. Ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen frascos, o botellas de medio litro o de litros. Por lo tanto, la forma de dosis múltiples corresponde a una multiplicidad de dosis unitarias que no están segregadas en el envase.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que aquí se describe se encuentra en una composición farmacéutica líquida. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables pueden, por ejemplo, prepararse disolviendo, dispersando o, de otro modo, mezclando un anticuerpo que aquí se describe en un portador o vehículo, tal como por ejemplo, agua, una solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol, y similares, para formar de esta manera una solución o una suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que se administrará también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes reguladores de pH y similares.
Métodos actuales de preparación de tales formas de dosis son conocidos o serán evidentes para los expertos en este arte; por ejemplo, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington: The Science y Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD.
Se pueden preparar formas de dosis o composiciones que
contengan un anticuerpo en el rango de 0,005% a 99,9%, donde el resto es un vehículo no tóxico. Métodos para la preparación de estas Composiciones son conocidos para los expertos en el arte.
La administración parenteral, en una modalidad, se caracteriza por la inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa, que también se contempla en la presente descripción. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para soluciones o suspensión en líquido, antes de la inyección, o como emulsiones. Las soluciones y emulsiones inyectables también contienen uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, una solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes taponamiento de una solución de pH, estabilizantes, agentes potenciadores de la solubilidad y otros agentes similares. Otras vías de administración pueden incluir la administración entérica, la administración intracerebral, la administración nasal, la administración intrarterial, administración intracardiaca, infusión intraósea, administración intratecal, infusión intravenosa, implantación subcutánea o inyección, la administración intramuscular, administración intrarrectal, administración intravaginal, administración intraperitoneal y la administración intrapulmonar.
Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles estériles y secos, tal como polvos liofilizados, listos para combinarse con un solvente, justo antes de su uso, y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas.
Si se administra por vía intravenosa, los vehículos adecuados incluyen una solución salina fisiológica o regulada en su pH con fosfato salino (PBS), agua y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tal como glucosa, polietilenglicol, polipropilénglicol y sus mezclas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables utilizados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, soluciones de regulador de pH, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, propílénglicol de polietilenglicol para vehículos miscibles en agua; e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para ajustar el pH.
De forma ilustrativa, la infusión intravenosa o intraarterial de una solución acuosa estéril que contiene un anticuerpo es una forma eficaz de administración. Otra modalidad es una solución o suspensión acuoso u oleosa estéril, que contiene un material activo inyectado, en caso necesario, para producir el efecto farmacológico
deseado.
En una modalidad específica, una preparación farmacéutica comprende citrato de sodio, cloruro de sodio, ácido cítrico, polisorbato 80 y agua. En una modalidad específica, una preparación farmacéutica comprende citrato de sodio, cloruro de sodio, y ácido cítrico. En una modalidad específica, una preparación farmacéutica comprende 9,1 mM de citrato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio y 0,9 mM de ácido cítrico. En una modalidad específica, una preparación farmacéutica comprende un anticuerpo o conjugado, que aquí se describen, con una concentración de 0,267 mM. En una modalidad específica, una preparación farmacéutica comprende 2,676 g/L de citrato de sodio, 8,766 g/L de cloruro de sodio, 0,2 g/L de polisorbato 80 y 0,189 g/L de ácido cítrico. En una modalidad específica, una preparación farmacéutica comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que aquí se describe con una concentración de 40 g/L. Preferentemente, las anteriores preparaciones farmacéuticas tienen un pH de 6.0.
En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas son polvos liofilizados, que se pueden reconstituir para su administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. También pueden ser reconstituidos y formulados como sólidos o geles.
El polvo liofilizado se prepara al disolver un anticuerpo, tal como el que se provee aquí, en un solvente adecuado. En algunas modalidades, el polvo liofilizado es estéril. El solvente puede
contener un excipiente, que mejora la estabilidad, u otro componente farmacológico del polvo o de la solución reconstituida, que se prepara a partir del polvo. Los excipientes que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, sorbital, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El solvente también puede contener un regulador de pH, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otro regulado de pH, conocido por aquellos expertos en el arte, donde en una modalidad, se encuentra a alrededor de un pH neutro. La posterior filtración estéril de las soluciones, seguida de la liof ilización bajo condiciones estándares, conocidas por aquellos expertos en el arte, proporciona la formulación deseada. En una modalidad, las soluciones resultantes se repartirán en frascos para liofilización. Cada frasco contendrá una sola dosis o dosis múltiples del compuesto. El polvo liofilizado puede almacenarse en condiciones apropiadas, como de alrededor de 4°C a temperatura ambiente.
La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para uso en administración parenteral. Para la reconstitución, se añade el polvo liofilizado a agua estéril u otro vehículo adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Tal cantidad puede determinarse empíricamente.
6.5 Métodos Terapéuticos
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de
anticuerpo que aquí se describen son útiles para tratar trastornos y enfermedades asociados con, o causados por (total o parcialmente) la mayor proliferación y/o número de células T activadas, en relación con la proliferación y/o el número de células T activadas que se encuentran en individuos sanos o individuos que no padecen trastorno o enfermedad en particular. Tales enfermedades y trastornos son conocidos para un experto en el arte o pueden ser determinados por un técnico en el arte. En una modalidad específica, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo que aquí se describen son útiles para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad autoinmune. En una modalidad específica, la enfermedad o trastorno inflamatorio es soriasis, soriasis en placas, artritis soriática, artritis reumatoidea, enfermedad de Crohn y espondilitis anquilosante.
Ejemplos no limitantes o no restrictivos de trastornos y enfermedades que se pueden tratar por medio del uso de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo, que aquí se describen incluyen soriasis, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis (incluyendo artritis reumatoidea, artritis reumatoidea juvenil, osteoartritis y artritis soriática), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eczematosa), síndrome de Sjogren, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis,
queratoconjuntivitis, diabetes tipo I, enfermedades inflamatorias del intestino, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones por medicamentos, reacciones de reversión de lepra, eritema nodoso leproso, uveítis autoinmune, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición bilateral idiopática progresiva neurosensorial, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos, trom bocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopático, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior, fibrosis pulmonar intersticial, alergias, tal como alergia atópica, SIDA, neoplasias de células T, como leucemias o linfomas.
Además, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo son útiles para prevenir y/o tratar ciertos trastornos y enfermedades asociados con, o causados por (total o parcialmente) por la mayor proliferación y/o número de células T activadas, en relación con la proliferación y/o el número de células T activadas que se encuentran en individuos sanos o individuos que no padecen trastorno o enfermedad en particular. Ejemplos no restrictivos de trastornos y enfermedades que se pueden prevenir y/o tratar por medio del uso de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de anticuerpo que aquí se describe incluyen casos de enfermedad del huésped contra el injerto y casos de rechazo a trasplante (incluyendo rechazo de trasplantes utilizando
tejidos alogénicos o xenogénicos) tal como trasplante de médula ósea, trasplante de hígado, trasplante de riñon o trasplante de cualquier órgano o tejido.
En consecuencia, en la presente descripción se proveen métodos para prevenir y tratar enfermedades y trastornos, por medio del uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En una modalidad específica, tales métodos comprenden la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En modalidades específicas, el anticuerpo administrado para tratar un trastorno o enfermedad, que aquí se describe, es 15A7H.
En una modalidad, "tratamiento" o "tratando" un trastorno o trastornos se refiere a una mejora de una enfermedad o trastorno, o al menos de unos de sus síntomas visibles. En otra modalidad, "tratamiento" o "tratando" se refiere a una mejora de al menos un parámetro físico medible, asociado con una enfermedad o trastorno, no necesariamente discernible por el sujeto. En aún otra modalidad, "tratamiento" o "tratando" se refiere a una inhibición de la progresión de una enfermedad o trastorno, ya sea físicamente, por ejemplo, por estabilización de un síntoma discernible, fisiológicamente, por ejemplo, por estabilización de un parámetro físico, o por ambos.
En modalidades específicas, el método de tratamiento que aquí se describe se encarga de la reducción o mejora de la progresión, severidad y/o duración de un trastorno o enfermedad tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otras modalidades especificas, el método de tratamiento que aquí se describe reduce uno o más síntomas de un trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
En una modalidad particular, un método para tratar un trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, puede lograr al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos, debido a la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva: (i) la reducción o mejora de la severidad del trastorno o enfermedad y/o uno o más síntomas asociados; (ii) una reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con el trastorno o enfermedad; (¡ii) la prevención de la recurrencia del trastorno o enfermedad; (iv) la regresión del trastorno o enfermedad y/o uno o más síntomas asociados; (v) una reducción en la hospitalización de un paciente; (vi) la reducción en la duración de la hospitalización; (vii) el aumento en la sobrevida de un paciente; (viii) la inhibición de la progresión del trastorno o enfermedad y/o uno o más síntomas asociados; (¡x) el aumento o la mejora del efecto terapéutico de otra terapia; (x) una reducción o la eliminación del trastorno o enfermedad; (xi) una reducción en la mortalidad; (xii) una
reducción en la tasa de hospitalización; (xiii) la prevención del desarrollo o inicio de uno o más síntomas asociados con el trastorno o enfermedad.
En una modalidad, "prevención" o "prevenir" un trastorno o enfermedad se refiere al término o parcial inhibición del comienzo o desarrollo del trastorno o enfermedad.
En una modalidad específica, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis. Generalmente, se acepta que los linfocitos T juegan un papel trascendental en la patogénesis de la soriasis. En una modalidad específica, un método para tratar la soriasis comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método para mejorar o prevenir uno o más síntomas de soriasis comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis incluyen, pero no se limitan a, manchas rojas de la piel cubiertas de escamas plateadas, manchas levantadas de piel, manchas de pequeña escala en la piel, piel seca, piel agrietada, incluyendo pústulas y picazón en la piel; engrosamiento de uñas, uñas estriadas o con cavidades y rigidez e inflamación en las articulaciones.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es la soriasis en placas. La soriasis en placas o soriasis vulgar es la forma más común de soriasis y se caracteriza por placas cutáneas eritematosas levantadas, fuertemente demarcadas, cubiertas por escamas plateadas. Existe una predilección de las lesiones por involucrar las superficies extensoras de las extremidades, la zona lumbosacra y el cuero cabelludo. Los correspondientes hallazgos histopatológicos incluyen infiltración celular inflamatoria significativa de la dermis y epidermis, aumento del número de vasos dilatados, y un engrosamiento sustancial de la epidermis con la diferenciación trastornada de queratinocitos e hiperqueratosis. Aproximadamente un tercio de los pacientes con soriasis en placas se clasifican como que padecen una enfermedad moderada o grave y son, por consiguiente, candidatos para terapia, más allá de tratamiento tópico.
En una modalidad específica, un método para tratar soriasis en placas comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método para mejorar o prevenir uno o más síntomas de soriasis en placas comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de
anticuerpo tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis en placas incluyen, pero no se limitan a, manchas rojas de la piel cubiertas de escamas plateadas, manchas levantadas de piel, manchas de pequeña escala en la piel, piel seca, piel agrietada, incluyendo pústulas y picazón en la piel; engrosamiento de uñas, uñas estriadas o con cavidades y rigidez e inflamación en las articulaciones.
En otra modalidad, el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis crónica en placas. En una modalidad específica, un método para tratar soriasis crónica en placas comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método, que aquí se describe, es para mejorar o prevenir uno o más síntomas de la soriasis crónica en placas comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis crónica en placas incluyen, pero no se limitan a, manchas rojas levantadas en la piel, simples o múltiples, que van desde el tamaño de una moneda a un mayor tamaño, en cualquier parte del cuerpo, incluyendo, pero no limitado a, rodillas, codos, regiones lumbosacra, cuero cabelludo y uñas.
En otra modalidad, el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis guttata. En otra modalidad especifica, un método para tratar soriasis guttata comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método para prevenir o mejorar uno o más síntomas de soriasis guttata comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis guttata incluyen, pero no se limitan a, erupciones en forma de gota de agua de placas escamosas en la piel, seguidos de una infección, tal como una infección de garganta por estreptococos.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis inversa. En una modalidad específica, un método para tratar soriasis inversa (también llamada soriasis intertriginosa y soriasis flexural) comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método para prevenir o mejorar uno o más síntomas de soriasis inversa comprende la administración a un paciente que lo necesite,
de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis inversa incluyen, pero no se limitan a, áreas lisas, normalmente húmedas de la piel que son de color rojo e inflamadas, a diferencia de las escamas asociadas a la soriasis en placas, en una o más de las siguientes partes del cuerpo: axilas, ingle, debajo de los senos y en otros pliegues de la piel alrededor de los genitales y asentaderas.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis pustulosa. En una modalidad específica, un método para tratar soriasis pustulosa comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método que aquí se describe para prevenir o mejorar uno o más síntomas de soriasis pustulosa comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis pustulosa incluyen, pero no se limitan a, ampollas llenas de pus, que varían en tamaño y ubicación, pero sobre todo en las manos y los pies.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de
acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis eritrodérmica. En una modalidad específica, un método para tratar soriasis eritrodérmica comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método que aquí se describe para prevenir o mejorar uno o más síntomas de soriasis eritrodérmica comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis eritrodérmica incluyen, pero no se limitan a, enrojecimiento agresivo de la piel, periódico y generalizado y el desprendimiento de las escamas en hojas, en lugar de escamas pequeñas. El enrojecimiento y desprendimiento de la piel a menudo se acompaña de dolor intenso y picazón, aumento de la frecuencia cardiaca y fluctuación de la temperatura corporal.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es soriasis reumatoidea. En una modalidad específica, un método para tratar soriasis reumatoidea comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
En otra modalidad específica, un método que aquí se describe es para prevenir o tratar uno o más síntomas de soriasis reumatoidea comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de soriasis reumatoidea, incluyen, pero no se limitan a, fatiga, pérdida de apetito, fiebre baja, inflamación de los ganglios, debilidad, dolor en las articulaciones de las muñecas, codos, hombros, caderas, rodillas, tobillos, dedos de los pies, mandíbula, manos, pies, dedos y/o cuello, rigidez matutina, dolor en el pecho cuando se respira (pleuresía), quemazón en el ojo, picazón, secreción y nódulos debajo de la piel, entumecimiento, hormigueo o ardor en las manos y pies.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es la enfermedad de Crohn. En una modalidad específica, un método para tratar la enfermedad de Crohn comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método que aquí se describe es para prevenir o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad de Crohn, comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se
describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de la enfermedad de Crohn son, pero no se limitan a, dolor abdominal tipo cólico (área del vientre), fiebre, fatiga, pérdida de apetito, dolor al pasar las heces (tenesmo) agua y diarrea persistente, pérdida de peso involuntaria, estreñimiento, inflamación de los ojos, fístulas (generalmente alrededor del área rectal que pueden causar drenaje de pus, moco o heces), dolor en las articulaciones, inflamación del hígado, úlceras en la boca, sangrado rectal y heces con sangre, protuberancias en la piel o llagas (úlceras) e inflamación de las encías.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es espondilitis anquilosante. En una modalidad específica, un método para tratar la espondilitis anquilosante comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método para mejorar o prevenir uno o más síntomas de la espondilitis anquilosante comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de la espondilitis anquilosante incluyen, pero no se limitan a, dolor frecuente y rigidez en espalda baja y asentaderas, columna vertebral y/o cuello; dolor y sensibilidad
que se extiende a costillas, omóplatos, caderas, muslos y talones; inflamación del ojo (iridociclitis y uveítis), causando enrojecimiento, dolor de ojos, pérdida de visión, flotadores y fotofobia, fatiga y náuseas.
En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno tratado de acuerdo con los métodos que aquí se describen es la diabetes mellitus. En una modalidad específica, un método para tratar la diabetes mellitus comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En otra modalidad específica, un método para mejorar o prevenir uno o más síntomas de la diabetes mellitus comprende la administración a un paciente que lo necesite, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los síntomas de la diabetes mellitus incluyen, pero no se limitan a, pérdida de peso, poliuria (orinar frecuentemente), polidipsia (aumento de la sed), polifagia (aumento del apetito), enfermedad cardiovascular, retinopatía diabética, neuropatía diabética, estado hiperosmolar no cetónico y cetoacidosis diabética.
En modalidades particulares, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, se administra a un paciente que previamente ha recibido o se encuentra actualmente recibiendo una o más terapias.
En modalidades particulares, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, se administra a un paciente que previamente ha recibido o se encuentra actualmente recibiendo una o más terapias. En otras modalidades particulares, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, se administra a un paciente que es, o se sospecha que pueda ser resistente o refractario a una terapia anti-inflamatoria.
En ciertos aspectos, se proveen aquí métodos para aniquilar las células T en un individuo que así lo necesite, donde dicho método comprende la administración a dicho individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En ciertos aspectos, se provee aquí métodos para inducir la apoptosis de las células T activadas, en un individuo que así lo necesite, donde dicho método comprende la administración a dicho individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que aquí se describe o una composición farmacéutica del mismo se puede administrar mediante cualquier método adecuado a un paciente que así lo necesite. Ejemplos no limitantes de métodos de administración incluyen infusión intravenosa, inyección o implante subcutáneo, por vía
intramuscular, intratecal, intraperitoneal , intrarrectal, intravaginal, ¡ntranasal, intragástrica, por vía intratraqueal , o entrega Intrapulmonar y/o cualquier otro método de entrega o suministro físico, que aquí se describe o conocido en el arte. En una modalidad, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo se administra sistémicamente (por ejemplo, parenteralmente) a un paciente que así lo necesite. En otra modalidad, un anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo se administra localmente (por ejemplo, intratumoralmente) a un paciente que así lo necesite. Cada dosis puede o no ser administrada por una vía de administración idéntica. En algunas modalidades, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, se puede administrar por múltiples vías de administración, simultáneamente o secuencialmente, con otras dosis del mismo (u otro) anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
Cuando una enfermedad o uno de sus síntomas está siendo tratado, la administración del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo típicamente se lleva a cabo después de la aparición de la enfermedad o sus síntomas. Cuando un síntoma de una enfermedad está siendo prevenido, la administración del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, típicamente se lleva a cabo antes de la aparición de los síntomas.
La dosis y frecuencia de la administración de un anticuerpo o
un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, o una composición farmacéutica del mismo se administra de acuerdo con los métodos para prevenir y/o tratar, mientras se reducen al mínimo los efectos secundarios. La dosis exacta de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, que se debe administrar a un sujeto en particular o una composición farmacéutica del mismo se puede determinar por parte de un médico, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. Los factores que se deben considerar incluyen la severidad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, edad y peso del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es) con otros agentes terapéuticos o drogas, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. La dosis y frecuencia de la administración de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, o una composición farmacéutica del mismo se puede ajusfar a lo largo del tiempo, para proveer niveles suficientes del anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, o para mantener el efecto deseado.
La dosis precisa a utilizarse en la formulación también dependerá de la vía de administración y la seriedad de un trastorno inflamatorio o enfermedad y se debe decidir de acuerdo al juico del médico y a las circunstancias de cada paciente.
Las dosis eficaces se pueden extrapolar de las curvas de respuesta-dosis, derivadas de los sistemas de ensayo en modelos
animales o in vitro.
En una modalidad, la dosis de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, que se administra a un paciente para prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno es típicamente de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal de un paciente. En otra modalidad, una dosis adecuada de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que es terapéuticamente eficaz para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que aquí se describen, se encuentra en el rango de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal de un paciente.
En modalidades específicas, una "cantidad eficaz" de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, se refiere a una cantidad de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que es suficiente para lograr al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) la reducción o mejora de la severidad de una enfermedad o trastorno que aquí se describen y/o uno o más síntomas asociados; (ii) la reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria descriptiva; (iii) la prevención en la recurrencia de una enfermedad o trastorno; (iv) la regresión de una enfermedad o trastorno y/o uno o más síntomas asociados; (v) la reducción en la hospitalización de un paciente; (vi) la reducción en la permanencia en el hospital; (vii) el
aumento en la sobrevida de un paciente; (viii) la inhibición de la progresión de una enfermedad o trastorno y/o uno o más síntomas asociados; (ix) el aumento o mejora del efecto terapéutico de otra terapia; (x) una reducción o eliminación de la enfermedad o el trastorno; (xi) una reducción en la mortalidad; (xii) una reducción en la tasa de hospitalización; (xiii) la prevención del desarrollo o aparición de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno; y (xiv) la mejora en la calidad de vida, tal como se evalúa mediante métodos ampliamente conocidos en el arte, por ejemplo, cuestionarios. En algunas modalidades, una "cantidad eficaz", tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la cantidad de un anticuerpo que aquí se describe, para lograr un resultado específico, descrito en la Sección 6. infra. En ciertas modalidades, una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo es de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 1,000 mg.
En algunas modalidades, una dosis única de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describen, se administra una o más veces a un paciente, para prevenir y/o tratar un trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
En modalidades particulares, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo se administra a un paciente de acuerdo con los métodos para prevenir y/o tratar un trastorno o enfermedad
que se presenta en ciclos, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo o la composición farmacéutica se administra por un periodo de tiempo, seguido por un periodo de descanso (es decir, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo o la composición farmacéutica no se administra por un periodo de tiempo).
Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se provee aquí, se puede administrar antes de, simultáneamente o después de la administración de una o más terapias adicionales (por ejemplo, agentes) para su uso para prevenir y/o tratar el trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en el cual un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo y una o más terapias adicionales se administran a un paciente. En modalidades específicas, las terapias se pueden administrar en serie o secuencialmente.
En otra modalidad específica, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, se utiliza en combinación con una cantidad de otra terapia (tal como, por ejemplo, un agente antiinflamatorio) para prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En una modalidad específica, dicha combinación de terapias posee efecto sinérgico. En otras modalidades, tal combinación tiene un efecto acumulativo.
En una modalidad específica, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo y la terapia adicional permite el uso de dosis más bajas (por ejemplo, dosis bajo el punto óptimo) del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo y/o la terapia adicional y/o la administración menos frecuente del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, o la terapia adicional a un paciente. En ciertas modalidades, la capacidad de utilizar dosis más bajas de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como aquí se describe, y/o de una terapia adicional y/o de administrar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, o dicha terapia adicional reduce, menos frecuentemente, la toxicidad asociada con la administración de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, o de dicha terapia adicional, respectivamente, a un paciente, sin reducir la eficacia de un anticuerpo o de dicha terapia adicional, respectivamente, en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno o enfermedad tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En algunas modalidades, la administración de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, en combinación con una terapia adicional da como resultado una mejor eficacia del anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, y/o de dicha terapia adicional, en prevenir y/o tratar un trastorno o enfermedad, tal como se describe en la presente memoria
descriptiva. En algunas modalidades, la administración de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, y uno o más terapias adicionales evitan o reducen los efectos secundarios adversos o indeseados que se asocian con el uso de cualquier terapia única.
En una modalidad específica, el sujeto al que se le administra un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que aquí se describe es un animal (por ejemplo, un mono Cynomolgus o un ser humano). En una modalidad preferida, el sujeto al que se le administra un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, que aquí se describe, es un humano. En una modalidad específica, el sujeto al que se le administra un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo exhibe uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
6.6 Métodos en Base a Células
En la presente descripción se proporcionan métodos para inducir o potenciar la apoptosis en una célula que expresa PSGL-1, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva. En una modalidad, la célula es una célula inmune. En una modalidad específica, la célula es una célula T. En una modalidad más específica, la célula es una célula T activada. Los métodos para detectar la apoptosis se describen en el arte y se pueden llevar a
cabo fácilmente por un experto en el arte. En modalidades específicas, un método para inducir o potenciar la apoptosis de las células T activadas que expresan PSGL-1 comprende poner en contacto las células con una cantidad eficaz de un anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en donde la cantidad eficaz es suficiente para inducir o potenciar la apoptosis, tal como se evalúa mediante métodos conocidos por un experto en el arte.
La presente memoria descriptiva proporciona métodos para reducir o inhibir la sobrevida de las células que expresan PSGL-1, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en la presente descripción. En una modalidad, la célula es una célula inmune. En una modalidad específica, la célula es una célula T. En una modalidad más específica, la célula es una célula T activada. Ensayos de sobrevida celular se describen en el arte y se pueden llevar a cabo fácilmente por parte de un experto en el arte. Por ejemplo, la viabilidad celular se puede evaluar mediante el uso de la tinción de azul de tripan u otros marcadores de muerte celular (por ejemplo, tinción de anexína-5) o marcadores de viabilidad (por ejemplo, yoduro de propidio o exclusión 7-AAD) conocido en el arte. En modalidades específicas, un método para reducir o inhibir la sobrevida de las células T activadas que expresan PSGL-1 comprende poner en contacto las células con una cantidad eficaz de un anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en donde la cantidad
eficaz reduce o inhibe a la sobrevida de las células, tal como se evaluó mediante métodos conocidos para un experto en el arte (por ejemplo, ensayo de exclusión con azul de tripan o yodo propidio o exclusión 7-AAD).
6.7 Equipos
En la presente descripción se provee un paquete o equipo farmacéutico, que comprende uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo que se proporcionan aquí. Opcionalmente asociada a dicho envase (s) se puede encontrar una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración a seres humanos.
En una modalidad específica, tal como se provee aquí, se encuentra un equipo que comprende un primer recipiente o contenedor, que incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En una modalidad específica, un equipo comprende un primer recipiente que es un frasco que contiene dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, como un polvo estéril Mofilizado con vacío, y el equipo
comprende, además, un segundo recipiente que comprende un fluido farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad específica, tal como se provee aquí, se encuentra un dispositivo de inyección que contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En una modalidad específica se encuentra un dispositivo de inyección para el anticuerpo en soluciones estériles. En una modalidad específica, un dispositivo de inyección, tal como el que se provee aquí, en una jeringa.
También se proveen equipos que se pueden utilizar en los métodos anteriores. En una modalidad, un equipo comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, preferentemente un anticuerpo purificado, en uno o más envases o recipientes. En una modalidad específica, los equipos que aquí se describen contienen un PSGL-1 sustancialmente aislado, como control. En otra modalidad específica, los equipos que aquí se describen comprenden además un anticuerpo de control que no reacciona con PSGL-1. En otra modalidad específica, los equipos que aquí se describen contienen uno o más elementos para detectar la unión de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo a PSGL-1 (por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo se pueden conjugar en un sustrato detectable, tal como un compuesto
fluorescente, un sustrato enzimático, un radiocompuesto activado, un compuesto luminiscente o un segundo anticuerpo, que reconoce al primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo. En modalidades específicas, el equipo puede incluir un PSGL-1 producido recombinantemente o sintetizado químicamente. El PSGL-1 proporcionado en el equipo también puede estar unido a un soporte sólido. En una modalidad más específica, los medios de detección del equipo descrito anteriormente incluyen un soporte sólido al que está unido el PSGL-1. Dicho equipo puede también incluir un anticuerpo anti-humano no unido a una molécula reportera o indicadora. En esta modalidad, la unión del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno derivado de anticuerpo, un PSGL-1 se puede detectar mediante la unión de dicho anticuerpo marcado con una molécula reportera o indicadora.
7. EJEMPLOS
Los ejemplos en esta sección (es decir, sección 6) se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación.
7.1 Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales anti-P3GL-1
Las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de 15A7 humanizado descrito en la Publicación de Solicitud Internacional WO 2005/110475, publicada el 24 de Noviembre, de 2005, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El
anticuerpo h15A7 posee un isotipo de anticuerpo lgG4 con una cadena ligera tipo kappa. Se introdujo una mutación de Ser228 ? Pro228 por medio de PCR usando partidores mutagénicos en la región de bisagra de h15A7. La mutante de bisagra resultante de h15A7 se denomina aquí como 15A7H. El resto de la secuencia de proteína de 15A7H es idéntica a h15A7. La secuencia de aminoácido de 15A7H se muestra en la Figura 7 A-B y se describe en las SEQ ID NO: 1 y 2. Las secuencias de genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo fueron introducidas en vectores de expresión eucariótica derivado del vector pAD-CMV1 (descrito en la EP 393 438).
Se generó 15A7H usando métodos conocidos en el arte. Brevemente, fueron co-transfectados vectores de expresión recombinante que codifican los marcadores de selección dihidrofolato reductasa (DHFR) y neomicina fosfotransferasa además de la cadena ligera y la cadena pesada para 15A7H, respectivamente, en la suspensión de células huésped adaptadas CHO-DG44. La selección de células transfectadas establemente ocurrió dos días después de la transfección en medio selectivo de hipoxantina/libre de timidina y con adición del antibiótico G418. Una vez que las células se recuperaron de la selección inicial, se indujo una amplificación génica basada en DHFR por medio de la adición de metotrexato. Se desarrolló una línea celular de producción monocíonal de 15A7H por depósito único de células usando una célula huésped CMO-DG44. Para la producción del anticuerpo15A7H, se expandieron las células
para inoculo para la producción en biorreactor. Se realizó la producción en biorreactor en un modo de lote alimentado por 8 a 14 días. Para soportar la producción de anticuerpo y para prolongar el período de producción de cultivo celular, se agregó un medio nutriente de alimentación durante la etapa de producción. Se cosechó el caldo de cultivo celular por centrifugación y filtración terminal para eliminar de manera eficiente las células, proporcionando un fluido de cultivo libre de células (CCF) para la purificación posterior del producto. Luego de remover las células durante la cosecha, se purificó la proteína a través de cromatografía de afinidad con proteína A y con cromatografía de intercambio aniónico y catiónico. Además, se incluyeron dos etapas robustas de depuración de virus, una etapa de inactivación viral a pH bajo y una etapa de nanofiltración para la remoción del virus.
Se determinó la pureza de 15A7H por el método de electroforesis capilar en gel. Se desnaturaron las muestras con SDS (dodecil sulfato de sodio) y se separaron basado en el tamaño en un capilar relleno con un regulador de pH gel que actúa como un medio de tamiz. En muestras reducidas, se reducen los enlaces de disulfuro con 2-mercaptoethanol, lo que resulta en picos separados para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En muestras no reducidas, se agregó yodoacetamida, un agente alquilante para evitar cualquier fragmentación inducida por la preparación de la muestra y para asegurar que el pico principal de IgG se mantiene intacto.
Las muestras fueron inyectadas electrocinéticamente y las
proteínas movilizadas fueron detectadas por absorbancia UV a 200 nm usando un detector UV. Para muestras reducidas, se informaron los porcentajes de área corregida en el tiempo (TCA %) de la suma de cadena pesada y ligera (% LC + HC). El valor posible de informar para las muestras no reducidas es el TCA% del pico principal de I g G .
Una cantidad menor de medias moléculas de anticuerpo fue detectada por medio de electroforesis de gel en capilar no reductora (CGE) (Figura 1) indicando que la mutación de Ser228 ? Pro228 disminuyó de manera importante la formación del enlace de disulfuro intra-cadena en la región de bisagra. La cantidad de medias moléculas de anticuerpo se redujo de ~8-10% para h15A7 hasta menos de 1% para 15A7H.
Una formulación para 15A7H se muestra en el Cuadro 6.
Cuadro 6: Formulación de 15A7H
El pH de la formulación es 6,0.
7.2 Ejemplo 2: Unión de anticuerpos 15A7H sobre células
T humanas primaria? activadas
Se examinó 15A7H para la unión en células T CD4+ primarias humanas activadas.
7.2.1 MATERIALES Y METODOS
Cultivo celular y Activación de células T: Se cultivaron células T CD4+ de sangre periférica a 37°C a 1x106 en medio RPMI completo y se estimularon por 2 días y se agregó 20 µg/ml de PHA-L (Sigma, Catálogo # L2769). Se incubaron las células por otros cuatro a cinco días a 37°C con 20 ng/ml de IL-2 (R&D systems, Catálogo #RD202-IL) para producir "células T CD4+ activadas".
Ensayo de unión celular: Se contaron células T CD4+ humanas activadas y se plaquearon a 1x105 células/100 µ? en regulador de pH FACS en una placa de cultivo de 96 cavidades de fondo redondo (Falcon BD, Catálogo # 353263) y se incubaron en hielo por 30 minutos.
Se diluyeron la lgG4 control isotipo anti-lisozima, h15A7 y 15A7H hasta 90 ug/ml en regulador de pH FACS en una placa de dilución de fondo plano (Falcon, Catálogo # 353077). Se prepararon once diluciones seriadas de tres veces de las preparaciones de anticuerpo para cada anticuerpo a lo largo de la placa con una concentración de partida de 30 ug/ml.
Se peletearon y resuspendieron muestras de células en
duplicado en 100 µ I de cada dilución de anticuerpo para una concentración de partida inicial de 30 pg/ml. Se incubaron las células en hielo por 60 minutos. Se peletearon las células y se lavaron con el regulador de pH de lavado seguido de la adición de 100 µ? de anticuerpo secundario conjugado diluido de F(ab)2 de Cabra anti-lg humanas con R-PE. El anticuerpo secundario conjugado de F(ab)2 de Cabra anti-lg humanas con R-PE (BD Biosciences, Catálogo # 554655; stock a 1,05 mg/ml) fue previamente diluido 1:800 en regulador de pH FACS, las células fueron incubadas en hielo durante 30 minutos en la oscuridad luego peleteadas y lavadas un par de veces con el regulador de pH de lavado. Se resuspendieron las células en 150 µ? de regulador de pH de lavado y se fijaron con adición de 50 µ? de citofix BD/regulador de pH de fijación Cytoperm (BD Biosciences, Catálogo* 554655).
Se analizaron las muestras en el analizador de arreglos BD
FACS Array Bioanalyzer. Se adquirieron alrededor de 5000 eventos usando el citómetro de flujo BD FACS Array para cada muestra celular con una puerta para "linfocito" fijada de acuerdo a SSC y FSC y la fluorescencia media que fue determinada para cada muestra.
Análisis de los Datos: Se determinaron la afinidad de unión del anticuerpo lgG4 anti-lisozima, h15A7 y 15A7H a células T CD4 + activadas graficando la concentración de anticuerpo versus el índice de fluorescencia media (MFI) para cada muestra en duplicado usando XLfit (modelo: dosis respuesta de un sitio, 205). Se determinaron los
valores de EC50 para cada curva de unión.
7.2.2 RESULTADOS:
Unión a células T Humanas activadas: Usando cítometría de flujo, se determinó la unión de 15A7H a células T CD4+ humanas activadas. La Figura 2 demuestra que 15A7H se une con una EC50 de 0,22 nM.
Los datos de unión de agregado desde múltiples donantes demuestran que 15A7H se unió a células T CD4+ activadas con una EC50 media de 0,22 +/- 0,02. Los valores de EC50 provenientes de 4 donantes fueron usados para calcular Media +/- SEM. Se ensayó el anticuerpo h15A7 bajo las mismas condiciones y se unió a células T CD4+ activadas con una EC50 media de 0,27 +/-0.05. Por lo cual, 15A7H y h15A7 demuestran una unión comparable a células T activadas (véase el Cuadro 7).
Cuadro 7: Ensayo de unión a células T CD4+ activadas.
7.3 Ejemplo 3: Actividad in-vivo de 15A7H de hipersensibilidad tipo retardada trans-vivo de humano en modelo de ratón
Se ensayó 15A7H en el modelo de hipersensibilidad tipo retardada trans-vivo (DTH) en ratones hembra C57BL/6. Se
administraron por vía i.p. las dosis de 0,03, 0,10, 0,3, 1 y 10 mg/kg de 15A7H en un regulador de pH de formulación. Se ensayó el anticuerpo h15A7 bajo las mismas condiciones.
7.3.1 MATERIALES Y METODOS
Ensayo Trans Vivo: Se adquirieron ratones hembras C57BL/6 desde Harían Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, Indiana) de 6 a 8 semanas de edad y se usaron dentro de cuatro semanas desde su llegada. Todos los ratones se albergaron en un ambiente libre de patógenos, y se trataron de acuerdo a las directrices NIH. Todos los experimentos en animales fueron revisados por y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) y se llevaron a cabo de conformidad con la directriz NIH, "Guiding Principies for Research Involving Animáis and Human Beings."
Se recolectó sangre por medio de veni-punción de donantes humanos normales que se sabia eran buenos respondedores al tétano. Se retiró cien mi de sangre total en tubos CPT Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se rotaron a 1800 RCF durante 30 min. La capa leucocitaria que contiene las células mononucleares y las plaquetas fue separada, lavada tres veces, y resuspendida en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) y contada. La contaminación de plaquetas fue minimizada por múltiples lavados en PBS. No se permitió más de una razón 1:1 de plaquetas a PBMC. Las células fueron inmediatamente inyectadas en las plantas de los ratones.
Se utilizó toxoide tetánico adsorbido en fosfato de aluminio (TT-Tetguard) a una concentración de 0,25 Lf por sitio de inyección (la unidad Lf es el valor de floculación, la cantidad de toxoide que cuando se mezcla con una unidad Internacional de antitoxina produce una mezcla de floculación óptima).
Se inyectaron 7 a 10 X 106 PBMC mezclados con 0,25 unidades Lf de TT en un volumen total de 50 µ?, en las plantas traseras de los ratones. El grosor de la planta se midió antes de la inyección y a las 24 horas post-inyección, usando un calibre indicador de grosor (Mitutoyo, Aurora, IL). El grosor previo a la inyección se restó del grosor después de la inyección a las 24 horas para obtener el cambio en el grosor de la pata. Todas las mediciones se realizaron en pulgadas.
Ensayo de 15A7H y h15A7: Se disolvieron 15A7H y h15A7 (10 mg/ml de stock) en un vehículo que contiene citrato de sodio 25 mM y cloruro de sodio 115 mM con Tween 80 0,04%, pH 5,97. Se inyectaron los ratones i.p. con 0,2 mi de vehículo o 15A7H o h15A7 a 0,03, 0,1 , 0,3, 1, y 10 mg/kg, una hora antes de las inyecciones en las plantas con PBMC con o sin TT. Cada dosis de anticuerpo 15A7H y h15A7 fue ensayado en los PBMC provenientes de cuatro donantes diferentes y se usó un ratón por tratamiento por donante. Los grupos de tratamiento 15A7H y h15A7 fueron comparados con el grupo tratado con vehículo.
Estadísticas: Todos los valores se informan como la media ± SEM a menos que se indique de otra forma. Los cambios en el
grosor de la planta en el grupo tratado con el fármaco fueron comparados con el grupo tratado con vehículo. Se combinaron el delta de grosores de las patas de 4 experimentos individuales de donantes y se calculó la media ± SEM. El porcentaje de inhibición del grosor de la pata se calculó como sigue: 100 X (? grosor de la pataveh - ? grosor de la patatármaco) / (? grosor de la pataveh - ? grosor de la pataPB c)- Se probó la significancia de los efectos inhibidores usando Kruskal-Wallis un Análisis de una vía de la Varianza (ANOVA) en Rangos. Se considera que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente importante.
Niveles Plasmáticos de 15A7H y h15A7 en ratones C57BL/6: se determinaron los niveles plasmáticos de 15A7H y h15A7 a 0,03, 0,1, 0,3, 1, y 10 mg/kg, 24 horas después de la inyección intraperitoneal en ratones hembra C57BL/6. Las muestras de plasma se recolectaron a partir de animales experimentales trans-vivo DTH al término del experimento. Se realizó el bioanálisis en todas las muestras.
Estudio farmacocinético Satélite de 15A7H: Se usaron ratones hembra satélite C57BL/6 recibiendo dosis intraperitoneales de 15A7H (los mismos niveles de dosis que antes) para recolectar los datos que son más intensos respecto de las concentraciones en plasma de 15A7H. Estos ratones no fueron tratados con PBMC humanos o toxoide tetánico. Los tiempos de muestreo para estos ratones "PK" fueron 1, 3, 5, y 24 h después de la dosificación. Cada grupo de dosis de ratones PK consistió de 6 ratones. Dentro de cada grupo de dosis, se usó un subgrupo de 3 ratones para el muestreo a la 1 y 5
horas, y otro subgrupo de 3 ratones se uso para el muestreo a las 3 y 24 horas.
Bloanálisis de h15A7 y 15A7H: Se usó un ELISA de emparedado para cuantificar las concentraciones de h15A7 o 15A7H en el plasma de ratones. Brevemente, se usaron placas de microtitulación de 96 cavidades recubiertas con PSGL-1 para unir h15A7 o 15A7H en la muestra de plasma diluida. Después de lavar, se detectó h15A7 o 15A7H unido con un anticuerpo monoclonal lgG4 anti-humano marcado con biotina y enzima marcada con (HRP)-estreptavidina. Se midió la cantidad de producto coloreado formado durante la reacción del sustrato fotométricamente y esta aumentó con el aumento de la concentración de h15A7 o 15A7H en la muestra. La concentración de h15A7 o 15A7H que corresponde a la absorbancia óptica medida se calculó por medio de ajuste de datos de la curva estándar no lineal. El rango de las muestras de calibración fue de 0,04 a 1,2 ng/mL. Las muestras se diluyeron al menos 1:100. Por lo cual, el límite inferior de cuantificación de h15A7 o de 15A7H en el plasma complete fue de 4 ng/mL. Usando factores de dilución mayores es posible aumentar el límite superior de la cuantificación hasta 2,4 mg/mL (1:2000000).
Debido a las leves diferencias de la reactividad del material de referencia de h15A7 y 15A7H en el ELISA, se usaron dos curvas de calibración y dos conjuntos de controles de calidad. Se analizaron las muestras de animales tratados con h15A7 versus la curva de calibración de h15A7, y las muestras de animales tratados con
15A7H se analizaron versus la curva de calibración de 15A7H.
7.3.2 RESULTADOS
TRANS VIVO DTH: La Figura 3 muestra la dosis respuesta combinada de 15A7H anticuerpo en trans vivo DTH en 4 PBMC de donante tal como se muestra por el porcentaje de inhibición de DTH luego del tratamiento con 15A7H. Cuando los ratones fueron dosificados i.p. a -1 hora, con 0,03, 0,1, 0,3, 1, y 10 mg/kg, ambos h15A7 y 15A7H inhibieron el trans vivo DTH en una manera dependiente de la dosis. El Cuadro 8 muestra la dosis respuesta y el porcentaje de inhibición de 15A7H y h15A7 en trans-vivo DTH. Una dosis única de 15A7H o h15A7 a 0,3 mg/kg y superior, mostró una inhibición Importante de trans vivo DTH. La ED50 para h15A7 y 15A7H en este ensayo fue de 0,09 y 0,1 mg/kg respectivamente, n = 4 donantes.
Cuadro 8: Dosis respuesta y % de inhibición de DTH en trans-
CONCENTRACIONES PLASMATICAS DEL COMPUESTO: Las concentraciones plasmáticas de 15A7H para ambos ratones satélite PK y DTH se resumen en la Figura 5. La Figura 4 muestra las concentraciones plasmáticas combinadas de 24 horas de 15A7H graficado contra él % de inhibición de DTH. Nótese que las concentraciones medias a las 24 horas después de la dosificación para los ratones PK y DTH para un nivel de dosis determinado fueron muy similares. Esto sugiere que, a pesar que los ratones PK y DTH fueron tratados de manera diferente (solo los ratones DTH recibieron los PBMC y toxoide tetánico), las farmacocinéticas de 15A7H en los dos casos fueron muy similares. Las concentraciones en plasma de ambos h15A7 y 15A7H fluctuaron solo dentro de un rango bastante estrecho en el transcurso de tiempo del estudio
(mediciones de la concentración entre 1 y 24 horas después de la dosificación).
PK-PD: El Cuadro 9 y el Cuadro 10 muestran las concentraciones en plasma a las veinticuatro horas (PK) de los anticuerpos h15A7 y 15A7H y el correspondiente porcentaje de inhibición de trans- vivo DTH (PD) a las mismas dosis. La Figura 4 compara la relación PK-PD de 15A7H en el modelo trans- vivo DTH. Se calcularon las ED50 para h15A7 y 15A7H siendo de 687 y 770 ng/ml respectivamente, n = 4 donantes.
Cuadro 9: Relación PK-PD en el modelo trans- vivo DTH.
Cuadro 10: Relación PK-PD en el modelo trans- vivo DTH.
7.3.3 CONCLUSION
Una dosis única de 15A7H o h15A7 a 0,3 mg/kg y mayor, mostró un porcentaje de ¡nhibición significativo de trans vivo DTH. La ED50 para h15A7 y 15A7H en el ensayo trans-vivo DTH fue de 0,09 y 0,1 mg/kg, respectivamente. Las concentraciones plasmáticas de ambos h15A7 y 15A7H fluctuaron solo dentro de un rango bastante estrecho a lo largo del transcurso de tiempo del estudio.
7.4 Ejemplo 4: Evaluación de la Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC)
En un esfuerzo por determinar si 15A7H posee actividad CDC,
se usaron ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa para medir la actividad CDC a varias concentraciones.
7.4.1 MATERIALES y METODOS
Se usaron células Ramos (obtenidas de la ATCC; cat# CRL- 1596) como las células blanco y se cultivaron en medio DMEM completo (Invitrogen, Carlsbad, CA¡ Número de Catálogo 11995) con 0,5 mg/ml de Geneticins (Invitrogen, Carlsbad, CA; Número de Catálogo 10131). Se usó complemento de conejo como la fuente de proteínas del complemento (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY; número de catálogo: AIC4000-1). Se usó el medio de Citotoxicidad Cedarlane como el medio de ensayo (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY; Número de catálogo: CL95100).
Se determinó la actividad CDC a través de la liberación de LDH desde células blanco usando el equipo de detección de Citotoxicidad "Cytotoxicity Detectíon KitPLUS (LDH)" (Roche Applied Science, Indianapolis, IN; Número de catálogo: 04 744934 001). Se usó un anti CD20 humano de ratón purificado del hibridoma 1F5 (ATCC), Birmingham, AL; Número de catálogo: 6140-01) para activar el complemento como un anticuerpo control positive en el ensayo. Se usó lgG4 K humana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Número de catálogo: I4639) como un control de isotipo. Las muestras y controles se establecieron como sigue (Todas las muestras poseen duplicados): Muestras: 100 µ? complemento estándar de conejo
(diluidas 1:6 en medio de ensayo) + 50 µ? células blanco (células Ramos en medio de ensayo) + 50 µ? de diluciones de anticuerpo, Control basal: 200 µ? medio de ensayo Control de liberación máxima: 50 µ? células blanco + 100 µ? complemento estándar de conejo + 50 µ? medio de ensayo Control de liberación espontánea: 50 µ? de células blanco + 100 µ? de estándar de complemento de conejo + 50 µ? de medio de ensayo
La placa se incubó a 37°C en una incubadora de C02 húmeda por 3 horas. Después de 30 minutos desde el término de la incubación (luego de 2,5 horas de incubación), se agregó 10 µ? de Solución de Lisis (proporcionada en el Equipo de Detección de Citotoxicidad) a la muestra de control de la liberación máxima. Al final de la incubación, la placa se centrifugó a 200 g por 10 minutos a temperatura ambiente, y se transfirieron 100 µ? de sobrenadante libre de células hacia los pocilios correspondientes de una placa de fondo plano de 96 cavidades para la detección de LDH. Se agregaron 100 µ? de Mezcla de Reacción (proporcionada en el Equipo de Detección de Citotoxicidad) a cada cavidad y se incubó la placa a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos en oscuridad. Al final de la segunda incubación, la reacción se detuvo agregando 50 µ? de solución Stop (proporcionada en el Equipo de Detección de Citotoxicidad). La absorbancia fue medida a la longitud de onda de 490-492 nm en el lector de placa SpectraMAX Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se calculó CDC% usando ([liberación inducida pro Anticuerpo] - [Control de liberación Espontánea])/
([Liberación Máxima] - [Control de liberación Espontánea]) x 100%. 7.4.2 RESULTADOS
Se probó la actividad CDC de 15A7H bajo condiciones optimizadas para la respuesta CDC de anti-CD20 con las células Ramos. Como se muestra en la 6 y el Cuadro 11, se probaron diferentes concentraciones de anticuerpos con dilución fija del complemento de 1:12 para la actividad CDC. No se detectó actividad CDC para 15A7H, h15A7 o para el control negativo de lgG4. CD20 de ratón anti-humano demostró una clara dosis respuesta del anticuerpo.
Cuadro 11: Porcentaje de actividad CDC de 15A7H a diferentes concentraciones
7.4.3 CONCLUSION
15A7H no muestra actividad CDC hasta la concentración de 5 pg/ml de anticuerpo a la dilución de complemento de 1:12 en los ensayos realizados en células Ramos.
7.5 Ejemplo 5: Estudio Clínico
Se administra 15A7H a individuos por administración intravenosa de dosis únicas crecientes de 125 pg/kg, 500 pg/kg, 1000 pg/kg y 2000 pg/kg y en otros individuos a través de administración subcutánea de dosis únicas de 500 pg/kg y 1000 pg/kg. Se adaptó la dosis. Se usó 15A7H resuspendido en la formulación descrita en el Cuadro 6. Luego de la administración, se realizaron los ensayos de laboratorio clínico (por ejemplo, hematología, química clínica y análisis de orina), por ejemplo en una base semanal, usando métodos conocidos en el arte. También se determinaron los parámetros farmacocinéticos, por ejemplo en una base semanal, usando métodos conocidos en el arte.
Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en esta solicitud se enumeran por este medio incorporadas por referencia en su totalidad como si cada publicación individual o solicitudes de patente fuse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia. A pesar que la anterior invención se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será
fácilmente aparente para aquellos de experiencia normal en el arte a la luz de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden ser realizadas a la misma sin apartarse del espíritu o espectro de las cláusulas anexas.
Claims (16)
1. Un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende: (i) una región variable ("VL") de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3; (ii) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena ("VH") que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4; y (iii) una región constante de lgG4 humana que contiene una sustitución de Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
2. Un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende: (i) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1; y (ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2.
3. Un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmmunoespecífica a PSGL-1 de humano que comprende: (i) una cadena pesada que consiste de la SEQ ID NO: 2; y (ii) una cadena ligera que consiste de la SEQ ID NO: 1.
4. Un anticuerpo monoclonal que se une de manera inmmunoespecífica a PSGL-1 de humano y que comprende una cadena pesada, que comprende: (i) una región VH de cadena que comprende las SEQ ID NO: 8, 9, y 10; y (ii) una región constante de cadena pesada lgG4 humana que contiene una sustitución de aminoácido Serina por Prolina en el aminoácido 228 de la cadena pesada enumerado de acuerdo al índice EU.
5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo a la reivindicación 4, en donde el anticuerpo monoclonal además comprende una cadena ligera que comprende una región VL de cadena que comprende las SEQ ID NO: 5, 6, y 7.
6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo está purificado.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el anticuerpo monoclonal está purificado.
9. Una cadena pesada de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 2.
10. Un equipo que comprende un primer envase que contiene el anticuerpo monoclonal de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Un dispositivo para inyección que contiene al anticuerpo monoclonal de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
12. El dispositivo para inyección de acuerdo a la reivindicación 11, en donde el dispositivo para inyección es una jeringa.
13. Un método para tratar un trastorno inflamatorio, el método comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 8 o la reivindicación 9.
14. Un método para tratar un trastorno inflamatorio, que comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 7 o 8.
15. El método de acuerdo a la reivindicación 13 o 14, en donde el trastorno inflamatorio es una enfermedad autoinmune.
16. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el trastorno inflamatorio es: soriasis, soriasis de placa, soriasis de placa crónica, soriasis guttata, soriasis inversa, soriasis pustular, soriasis eritrodérmica, artritis soriática, artritis reumatoidea, Enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, o diabetes.
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