MX2013013235A - Composiciones y metodos para la alteracion de los fenotipos de la displasia ectodermica hipohidrotica ligada a x (xlhed). - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para la administración temporal de agonistas de EDA, en particular ED1200, que se correlacionan con las ventanas de respuesta terapéuticas óptimas requeridas para la formación de cualquiera de las estructuras dependientes de EDA tales como apéndices ectodérmicos. El uso de los métodos descritos permite el diseño de regímenes de dosificación y administración terapéuticos objetivo a fin de corregir o alterar los fenotipos anormales asociados con los trastornos genéticos, en particular, XLHED.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA ALTERACIÓN DE LOS FENOTIPOS DE LA DISPLASIA ECTODÉRMICA HIPOHIDROTICA LIGADA A X (XLHED) CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a composiciones, métodos, ensayos y kits para, alterar y/o modificar el fenotipo de un individuo diagnosticado con o que sufre de XLHED.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La displasia ectodérmica hipohidrótica ligada a X (XLHED, por sus-, siglas en. inglés) es una enfermedad identificada en humanos, perros, ratones y ganado vacuno. Un subconjunto de la enfermedad humana, se ha atribuido a un defecto en. el gel EDA (anteriormente EDI) que codifica la proteina ectodisplasina (EDA, subtipo EDA-A1) que se ha mostrado que se implica en la morfogénesis de los folículos pilosos y las yemas dentales durante el desarrollo temprano. El fenotipo de la enfermedad es pelo escaso o ausente, pérdida de dientes y/o malformados, glándulas ecrinas hipóplásicas , infecciones benignas · recurrentes . y susceptibilidad incrementada a bronquitis y neumonía (Reed . y colaboradores, 1970; Nordgarden y colaboradores, 2001) . Existe morbilidad : y mortalidad significativa en niños afectados debidos a la hipertermia, provocada por la incapacidad de sudar. Las morbilidades significativas incluyen riesgo incrementado de . infecciones del tracto respiratorio, enfermedad ocular debido a ojos secos, asi como dificultades con la masticación, retraso del- crecimiento, mal aspecto, y deterioro del habla - que resulta de las anormalidades de - los dientes (dentición retardada, coronas de los dientes cónicas (dientes en forma de espiga) y oligodontia) . El primer modelo de XLHED se identificó en ratones seleccionados de la cepa Black. 6 para, tamaño grande que dio por resultado .la apariencia espontánea de la subcepa con desarrollo anormal de peló y dientes. Los animales afectados (designados "ratones Tabby" debido a la semejanza del patrón de pelo de las hembras heterocigóticas a aquel del gato tabby) carecen de proteína EDA funcional- debido a una mutación del marco de lectura que da por resultado la ausencia del dominio necesario para, el enlace y señalización del receptor que es critica para la morfogénesis normal de dientes, pelo y glándulas sudoríparas (Ferguson y colaboradores, 1997; Srivastava y colaboradores, 1997) . En consecuencia, estos ratones no tienen glándulas sudoríparas y no tienen pelo en la cola. El ratón Tabby actualmente es un modelo ampliamente usado para XLHED.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN El ligando de la familia TNF ectodisplasina A (EDA) y . su receptor EDAR son requeridos ' para el desarrollo apropiado de apéndices de . la piel tales como pelo, dientes y glándulas sudoríparas ecrinas. "Pérdida de función" de las mutaciones EDA provocada por displasia ectodérmica hipohidrótica ligada a. X (XLHED) , una condición que se puede mejorar en ratones y perros por la administración oportuna del EDA recombinante. .

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan métodos para la administración temporal de agonistas EDA, en particular EDI200, que se correlacionan con las ventanas de respuesta terapéutica requeridas para la formación de cualquiera de las estructuras dependientes de EDA tales como apéndices ectodérmicos . .

Se pueden inducir diferentes estructuras dependientes . de EDA en distintos puntos de tiempo, y pueden requerir diferentes dosis o tiempo de exposición. Interesantemente, .algunas estructuras se pueden inducir hasta varios días después de su tiempo de desarrollo normal. Esta propiedad es de interés cuando se consideran los agonistas de EDAR para propósitos terapéuticos. ¦ En una modalidad, la forma . recombinante de EDA-A1 (en. este documento, referida como EDI200, Fe : EDA1 o Fc-EDA) que consiste del dominio extracelular de la proteina fusionada a una porción de una inmunoglobulina se usa para corregir anormalidades fenotipicas en el feto de mamífero así como posnatalmente . La EDI200 tiene el dominio de enlace a receptor de la forma normalmente activa requerida para la señalización de EDA. Como un control, la . EDAR-Fc, una proteína recombinante que consiste del. dominio extracelular de receptor EDA fusionado a. la porción Fe de una inmunoglobulina, se usó como un inhibidor de EDI200 a fin de controlar la duración de la actividad de EDI200 in vivo.

Ahora se ha demostrado que existe un curso de tiempo de que l;a expresión del receptor EDA (EDAR) en mamíferos y que son. ventanas únicas- de eficacia para la administración de EDI200 (Fcr.EDAl) a fin de corregir fenotipos anormales asociados con la ausencia de la señalización de EDA tales como aquellos observados en pacientes con XLHED.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1A-1B es un panel de 3x3 fotografías tomadas de ratones WT .y Tabby que muestran que se rescatan de los protectores cuando los ratones se tratan in útero. Figura 1A: Eatones Tabby deficientes de EDA preñados en los días E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestación o crías Tabby recién nacidas a Pl (día de nacimiento), P2, P3, P4 o P5 se les administró EDI200¦ a 1 mg/kg iv (en madres) o ip (en recién nacidos), seguido 24 horas después por EDAR-Fc a 30 mg/kg para bloquear el EDI200 restante. Las crías de las madres tratadas, ó crías tratadas se analizaron al deteste para la presencia de pelo protector (cabezas de flecha) . Los controles WT y Tabby no tratados se muestran para comparación. El tiempo del tratamiento se indica en la parte superior de las fotografías'. Se muestran los tiempos más relevantes de tratamiento relativos con la inducción de pelo protector. Figura IB: Representación esquemática de los resultados. El período- relevante del desarrollo dependiente de EDA de apéndices derivados de la piel en los ratones Tabby se dividen en períodos de 24 horas (rectángulos), con el tiempo indicado . como días dé gestación embriónica (E11.5, E12.5, etcétera), y días post-natales de la vida (Pl, P2, etcétera, con Pl es el día del nacimiento) . Las indicaciones en los rectángulos se refieren al grado al cual el fenotipo Tabby se revirtió ( : sin' reversión, · similar a Tabby. +: alguna reversión. ++: reversión extensiva, similar a WT. nd: no determinado. La curca anterior representa la ventana de oportunidad de tratamiento deducida para la formación de pelo protector en los ratones Tabby.

La FIGURA 2A-2B es un panel de 3x3 fotografías tomadas de ratones WT y Tabby que muestran que las glándulas sudoríparas se rescatan cuando los ¦ ratones se trataron in útero y posnatalmente .. Figura 2A: Ratones Tabby deficientes de EDA preñados en los días E11.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestación o crías ' Tabby recién nacidas en Pl (día de nacimiento), P2, P3, P4 o P5 se les administró EDI200 a 1 mg/kg iy (en madres) o ip (en recién nacidos ) , seguido 24 horas después po.r EDAR-Fc a 30 mg/kg para bloquear el EDI200 restante. Las crías de las madres tratadas, o crías tratadas se analizaron al deteste para la presencia de glándulas sudoríparas usando una prueba d^ sudoración de yodo/almidón. Las aberturas de las glándulas sudoríparas se visualizan como puntos negros. Los controles WT. y Tabby no tratado se muestran para comparación.- El tiempo de tratamiento se indica en la parte superior de las fotografías. Se muestran los tiempos más relevantes de tratamientos relativos con la inducción de . glándulas¦ sudoríparas . Figura 2B: Representación esquemática de los resultados. El período relevante para el desarrollo dependiente de EDA de apéndices derivados de la piel en ratones Tabby se divide en períodos de 24 horas (rectángulos), con el tiempo indicado como días de gestación embriónica (E11.5,- E12.5, etcétera) y días pos-natales de la vida (Pl, P2, etcétera, con Pl que es el día de nacimiento)'. Las indicaciones en los rectángulos se refieren al grado al cual se revirtió el . fenotipo Tabby (---: sin reversión, probablemente Tabby. +: alguna reversión. ++: reversión extensiva, similar a WT . ncl: no determinada). La curva anterior representa la ventana de oportunidad de tratamiento deducida para la formación de glándulas sudoríparas en los ratones Tabby. · .

La FIGURA 3A-3B es un panel de 3x3 fotografías tomadas de ratones WT y Tabby que muestran que los pelos de la cola se rescatan cuando los ratones se trataron in útero y posnatalmente . Figura. 3A: Ratones Tabby deficientes de EDA preñados en los. días Ell .5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 e gestación o crías Tabby recién nacidas en Pl (día de nacimiento), P2, P3, P4 o P s . les administró EDI200 a 1 mg/kg iv (en madres) o ip (en recién nacidos.) , seguido 24 horas después por EDAR-Fc a 30 mg/kg para bloquear el EDI200 restante. Las crías de madres tratadas, o crías tratadas se analizaron al deteste para la . presencia de glándulas sudoríparas usando una prueba de sudor de yodo/almidón. Los controles WT y Tabby no . tratados se muestran para ' comparación. El tiempo de tratamiento se indica en la parte superior de las. fotografías. Se muestran los tiempos más relevantes de tratamiento relativo con la inducción del pelo de la cola. Figura 3B: Representación esquemática ue los resultados. El , período relevante para el desarrollo dependiente . de EDA de -apéndices derivados de la piel en los ratones Tabby -!se ¦ divide en periodos de 24 horas (rectángulos), con el tiempo indicado como dias de gestación embriónica (?11.G), E12.5, et.oó'era) y dias pos-natales de vida (Pl, P2, etcétera, con Pl que es el día de nacimiento) . Las indicaciones en los rectángulos se refieren al grado al cual el fenotipo Tabby se revirtió (—— : sin reversión, probablemente Tabby. ;+: alguna' reversión. ++ : reversión extensiva, similar a WT. nd: no determinado). Las curvas anteriores .representan las ventanas de oportunidad de tratamiento deducidas para la formación de pelo de la cola en los lados dorsales y ventrales de la . cola en los ratones Tabby, como se indica.

La FIGURA -4A-4C es un pane;], de fotografías tomadas de ratones WT y Tabby que muestran que los pelos de la cola se pueden inducir con varios dias de retraso. Figura 4A: Las fotografías de la cola de un ratón WT se tomaron diariamente desde el nacimiento (Pl) hasta el deteste (P21) . Las caras dorsales y ventrales de la cola están en los lados izquierdo y derecho, respectivamente. El pelo en la cara dorsal de la cola primero es- evidente en P6 (flecha). Solamente se muestran los . tiempos más relevantes.. Figura 4B: Las fotografías de la cola de un ratón Tabby deficiente de EDA tratado en Pl con EDI 200 y 24 h< ras después con un exceso de EDAR-Fc se tomaron diariamente desde el nacimiento (Pl) hasta el deteste (P21). El pelo en la cara dorsal de la cola primero es evidente en PIO (flecha), es. decir aproximadamente días después que en un ' ratón WT . Solamente se muestran los tiempos más relevantes. Figura.4C: Lo mismo con el Panel B de la Figura 3, que muestra aproximadamente 4 días separados de E16.5, que es el. primer tiempo en el cual el pelo de la cola dorsal se puede inducir en ratones Tabby, y Pl, que es el tiempo de tratamiento de . iniciación en el experimento mostrados en . el panel B. Esto, juntó con los resultados mostrados en los paneles A y B sugieren que la formación de pelo de la cola dorsal en los ratones Tabby tratados en Pl con EDI200 se establece con un retraso de aproximadamente 4 días comparado con los ratones WT .

. La FIGURA 5A-5B es un panel de fotografías tomadas dé ratones WT y Tabby . que muestran que los ojos se rescatan cuando los' ratones se trataron in útero y posnatalmente . Figura 5A: Ratones Tabby deficientes de EDA preñados en los días ET1.5, E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestación o crías Tabby recién nacidas en Pl (día de nacimiento), P2, P3, P4 o P5 se les administró EDI200 a 1 mg/kg i (en madres) o ip (en recién nacidos), seguido 24 horas después por EDAR-Fc a 30 mg/kg para bloquear el EDI200 restante. En un caso, a un ratón preñado se le administró EDI200. en 1 mg/kg a E18.5, y las crías recibieron nuevamente EDI200 en 1 mg/kg en P2, sin ningún EDAR-Fc. Las crías de madres tratadas, o crías tratadas se analizaron al deteste para la apariencia de los ojos. Los controles WT y Tabby no tratados se muestran para comparación. El tiempo de tratamiento se indica en la parte superior de las fotografías. Se muestran los tiempos más relevantes del tratamiento relativos con la reversión de los ojos. Observar que para los ratones tratados en E18.5 y P3, solamente uno de los trece ratones tuvo un fenotipo de ojos claramente revertido. Figura 5F : Representación esquemática de los resultados. El período relevante para- el desarrollo dependiente de EDA en apéndices dérivados de la piel en los ratones Tabby se dividen en . períodos de 24 horas (rectángulos) , con el tiempo indicado como días de gestación embriónica (E11.5, E12.5·, etcétera) y días pos-natales de vida (Pl, P2, etcétera, con Pl que es el día de nacimiento) . Las indicaciones en los rectángulos se refieren al grado al cual el fenotipo Tabby se revirtió ( : sin reversión, similar a Tabby. +: alguna reversión. ++: reversión extensiva, similar WT . nd: no ¦ (eterminado ) .

La FIGURA 6Á-6B es un panel de fotografías tomadas de ratones ' WT y Tabby que muestran que se rescatan varios dientes en diversos tiempos cuando lós ratones se trataron in útero y posnatalmeiite . Figura 6A.: Ratones Tabby deficientes de EDA preñados en los días ?11.G), E13.5, E14.5, E16.5, E17.5 de gestación o crias Tabby recién nacidas en Pl (día de nacimiento), P2, P3, P4 o P5 se les administró EDI200 a l mg/kg iv (en madres) o ip (en recién nacidos), seguido 24 horas después por EDAR-Fc a 30 mg/kg para bloquear el EDI200 restante. En un aso, un ratón Tabby preñado se trató en E14.5 con EDI200 pero sin la inyección de EDAR-Fc 24 horas después (E14.5. (sin detención)). Las crías de madres tratadas, o crías tratadas se sacrificaron a aproximadamente un mes de edad y se analizaron para morfología de los dientes en la mandíbula inferior...¦ Los controlas WT y Tabby no tratados se muestran para comparación. El tiempo de tratamiento se indica en la parte superior de las fotografías. Se muestra los tiempos más relevantes del tratamiento relativo con la inducción de dientes. Cabeza de flecha completa blanca. Forma característica del segundo molar de WT . Cabeza de flecha abierta:, porción anterior del primer molar. Cabeza.de flecha delgada: Tercer , molar; . Es digno de. mención que en los ratones Tabby, el tercer molar (molar, pequeño en el lado izquierdo de las fotografías) puede estar ya sea presente o ausente. Figura 6B: Representación esquemática de los resultados. El período relevante para el desarrollo dependiente de EDA de apéndices derivados de la piel en los ratones Tabby se divide en períodos . de 24 horas (rectángulos), con el tiempo indicado como días de gestación embriónica (E11.5, . E12.5, etcétera) y días post-natales de vida (Pl, P2, etcétera, con Pl qué es el día de nacimiento) . Las indicaciones en los rectángulos se refieren al grado al cual el fenotipo Tabby se revirtió (---: sin reversión, similar a. Tabby. +: alguna reversión. ++: reversión extensiva, similar o mayor que WT. nd: no determinado). Las curvas anteriores representan las ventanas de oportunidad de tratamiento deducidas para la formación de molares en la y inferior de ratones . Tabby. MI, M2, M3: molares 1, 2 y 3.

La FIGURA 7A-7C es un diagrama del procedimiento general de los experimentos descritos en este documento. Figura 7A. En los organismos deficientes. de EDA (en este caso ratones), el EDA endógeno es ya sea no fabricado o inactivo, pero el receptor de EDA permanece expresado en la forma competente de señalización. La proporción .de EDA recombinante en la forma de Fc-EDA es suficiente para activar la ruta de señalización de EDAR y para rescatar algo o todo del fenotipo deficiente de EDA. '- El tratamiento es efectivo si se aplica en tiempos cuando el. EDAR endógeno . puede responder . Figura 7B. La administración del . Fc-EDA se puede hacer directamente en ratones deficientes de EDA recién nacidos, o indirectamente en los fetos por administración a. la madre preñada con Fc-EDA. La porción Fe permite la transferencia transplacentaria y de esta manera acceso a los fetos. La: dosis y tiempo de la administración de Fc-EDA se puede . elegir. Figura 7C: la acción del Fc-EDA en animales deficientes -EDA tratados se puede bloquear, después de un Intervalo de tiempo deseado mediante la administración de un exceso de EDAR-Fc. El EDAR-Fc también puede alcanzar la circulación fetal por el sistema de transporte transplacentario .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN . . A menos .que se defina de. otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona, de experiencia ordinaria en el campo al cual está invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o . equivalentes a aquellos. descritos en este documento se pueden usar en la práctica o prueba de los métodos caracterizados en la invención, se describen a continuación métodos y materiales.

Definiciones Para conveniencia, . el significado de ciertos términos y frases empleados en la ' especificación, se proporcionan a continuación ejemplos y reivindicaciones adjuntas. Las definiciones no se proponen para ser limitantes en carácter y sirven para proporcionar un entendimiento más claro de ciertos aspectos. de la presente invención.

El término "activación" como se usa en este documento se refiere a cualquier alteración de una ruta de señalización o respuesta biológica que incluye, por ejemplo incrementos por arriba de niv Les básales, restauración a niveles básales desde un estado inhibido, y estimulación de la ruta por encima de niveles básales.

El término "ventana de. desarrollo alineada" significa los marcos de tiempo correlativos entre dos o más especies en su desarrollo de un fenotipo. Las ventanas de desarrollo alineadas pueden. reflejas las ventanas de tratamiento donde el desarrollo de dos especies está en concordancia. Las ventanas de desarrollo alineadas también pueden proporcionar la base sobre la cual definen las ventanas de tratamiento "conducentes", "retardadas" . o "expandidas". El uso. del término "alineado" en este documento no se propone para implicar que los puntos de inicio y detención de las ventanas se igualarán exactamente. Una persona de experiencia en el campo aprecia que el desarrollo entre . cualquiera de los' dos organismos (aún de la misma especie) no se presentará exactamente en la misma forma en exactamente el mismo tiempo. Por lo tanto, se aprecia que las variaciones intra- e inter-especie. se presentan y que "alineado" se propone para referirse a. aquellas ventanas de desarrollo alineadas (inclusive de las variaciones ligeras) aceptadas por una persona de experiencia en el campo.

El término "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de. un organismo (por. ejemplo, un paciente humano) o de componentes (por ejemplo, células) o de fluidos corporales (por ejemplo, sangre, suero, esputo, orina, etcétera) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido, órgano, sistema, orgánico o fluido biológico. La muestra puede ser una "muestra clínica" que es una muestra derivada de un paciente. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a, esputo, sangre, células de la sangre, (por ejemplo, glóbulos blancos ), fluido amnióticó, plasma, semen, médula ósea, y tejido' o núcleo, muestras de biopsia finas o éxtraídas con aguja, orina, fluido peritoneal, y fluido pleural, o células del mismo. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para propósitos histológicos. Una muestra biológica también se puede referir como una "muestra de paciente" . . . , ' El término "correlacionar" o "correlación" como se usan en este documento se refiere a la relación entre dos o más. variables aleatorias o valores de datos observados. Una correlación puede, ser¦ estadística sí,, en el análisis por medios estadísticos o pruebas, la relación se. descubre que satisface el umbral de importancia de ' la prueba estadística usadas.

Una "ventana de desarrollo" es un marco de tiempo por el cual uno b más fenotipos se desarrollan normalmente en un organismo.

El término "embrión" significa- una descendencia no nacida en el proceso de desarrollo.

El término "etapa embriónica" se refiere a cualquiera de las fases a través de las cuales un embrión pasa en desarrollo. Las etapas embriónicas se han clasificado por varios métodos- incluyendo el sistema de etapas de Ca negie y el sistema de etapas de Theiler.

El término, "tipo de célula" se refiere á una célula de una fuente dada (por ejemplo, un tejido, órgano) o una célula en un estado dado de diferenciación, o una célula asociada con una patología dada o constitución genética.

El término "condición" se refiere al estado o cualquier célula, organismo, sistema orgánico u organismo. Las condiciones pueden reflejar un estado de enfermedad o simplemente la presentación fisiológica o situación de una entidad. Las condiciones se pueden caracterizar como condiciones fenotipicas tal como la presentación macroscópica de una enfermedad o. condiciones genotípicas tal como el gen subyacente o perfiles de expresión de proteínas asociados con la condición. Las condiciones pueden ser benignas o malignas.

El término "detectable" se refiere a un patrón de expresión de RNA . que es detectable a través de técnicas estándares de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , PCR de transcriptasa inversa (RT) , expresión diferencial, y análisis Northern, ¦ o cualquier método que sea ' ien conocido por aquellas personas de experiencia en el campo. Similarmente, los patrones de expresión de proteínas se pueden "detectar" a través dé técnicas ' estándares tales como Western blot.

"Mamífero" . para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos., animales domésticos y granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, monos etcétera. De manera preferente, el mamífero es un humano.

La frase . "un. método para tratar" o su equivalente, cuando se aplica a, por ejemplo, XLHED se refiere a un procedimiento o curso de acción que se diseña para reducir, eliminar o alterar la presentación fenotípica y/o efectos secundarios asociados con una enfermedad o condición en un individuo, o para aliviar los síntomas de la enfermedad o condición. "Un método para tratar" una enfermedad o trastorno no significa, necesariamente que la enfermedad o trastorno otro trastorno, de hecho, se eliminará completamente, o que los síntomas de la enfermedad u otro trastorno, de hecho, se aliviarán completamente. Frecuentemente, un', método para tratar cáncer se llevará a cabo aún con . una baja probabilidad de éxito, pero el cual, dado ' el historial médico ; y expectación de supervivencia estimada de un individuo, no obstante se considera un curso de acción benéfico total.

Las frases "administración parenteral" y "parenteralmente administrado" como se usa en este documento significa modos de administración. diferentes a . la administración entérica y tópica, usualmente por inyección e incluye, sin limitación, intravenosa, ' intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular , intraorbital , intracardíaca , intradérmica , intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticulár , intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e infusión . intrastémica .

El término "prenatal" significa antes del •nacimiento o durante el embarazo.

El término "postnatal" significa después del nacimiento.

El término "presentación fenotípica" se refiere a la presentación macroscópica de una enfermedad.

El término "predecir" significa un estado . o reclamación de que un evento particular es, o es muy probable que se presente, en el futuro.

El término "pronóstico" significa . un estado o reclamación de que un evento biológico particular, o es muy probable que, se presentará en el futuro.

El término "progresión" o "progresión de la enfermedad" significa el. avance o empeoramiento de o hacia una enfermedad o condición.

El término . "su eto" se refiere, a pacientes humanos u otros vertebrados en particular mamíferos e incluye cualquier individuo que se desee examinar o tratar usando los métodos de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, se entenderá que "paciente" no implica, automática que los síntomas o enfermedades están presentes. Como se usa en este documento, el término "paciente" se refiere de manera preferente a un humano en necesidad de tratamiento.

El término "tratar" como se usa en este documento, a menos que se indique de otra manera,, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir, ya . sea parcial o completamente, las manifestaciones. : fenotípicas de una enfermedad o condición. El término "tratamiento" como se usa en este documento, a menos que se indique de otra manera, se refiere al acto de tratar.

El término "resultado del tratamiento" significa el resultado de uno - o más tratamientos. Los resultados del tratamiento pueden ser positivos o negativos. El carácter del resultado del tratamiento, tal como un resultado "positivo" se puede medir objetiva o subjetivamente. Po ejemplo, un resultado positivo se puede reflejar en la caracterización subjetiva del paciente de su condición (por ejemplo, el "sentirse" mejor),/ o se puede representar por una medición objetiva del trastorno (por ejemplo, un incremento en el crecimiento · de cabello, morfología de los. dientes o capacidad de sudar) . . .

El término, "ventana de tratamiento" como se usa en este documento se refiere al marco de tiempo dentro del cual la administración de una composición farmacéutica ejercerá por lo menos algún resultado del tratamiento positivo. Las ventanas de tratamiento se pueden medir en horas, días, semanas, meses o años. También puede presentarse en un tiempo justo después de la fertilización pero antes del implantación embriónica, cuando el organismo ín útero o en cualquier momento antes del . nacimiento, o después. Para este fin, resulta que una ventana de tratamiento para un orgcinismo desde- la concepción, hasta el nacimiento (incluyendo in útero) se puede caracterizar en términos de tratamiento de la mare. En este caso, poner. en contacto a la madre en la composición farmacéutica es análogo al "tratamiento" del embrión o feto aunque se refiere como tratamiento de la madre. Las ventanas de tratamiento pueden coincidir con las ventanas de desarrollo alineadas. Las ventanas de tratamiento pueden ser conducentes, retrasadas o expandidas.

El término "ventana de tratamiento expandida" significa un marco de tiempo durante el cual el tratamiento se puede administrar que es más prolongado en duración que una ventana, de tratamiento con base solamente en una ventana de desarrollo alineada. Las ventanas de tratamientos expandidas pueden ser coincidentes desde el inicio final con el inicio o final de ,una ventana de . desarrollo alineada y prolongadas ya sea antes o posterior en el tiempo. También pueden ser más grandes que una ventana de desarrollo alineada y extendidas tanto antes como después en el tiempo, siendo en consecuencia inclusive de una o más ventanas de desarrollo alineadas. Las ventanas de tratamiento expandidas se pueden expresar en términos de horas, dias, semanas, meses, o años. Las ventanas de tratamiento expandidas pueden ser 1-20%, 2-30%, 5-50% o más largas que la ventana, de desarrollo normal que constituye la ventana de desarrollo alineada. Pueden ser 3x, 4x, 5x o más. largas.

El término "ventana de tratamiento retardada" significa un marcó de tiempo durante el. cual el tratamiento se puede administrar que comienza después en el tiempo que una ventana de tratamiento basada solamente en una ventana , de desarrollo alineada. Las ventanas de tratamiento retardadas comienzan en algún punto de tiempo después de una ventana de desarrollo alineada esperada y extendida después en el tiempo. Se pueden extender indefinidamente y pueden cubrir una o más ventanas de desarrollo alineadas subsecuentes. Las ventanas de tratamiento retardadas se pueden expresar en términos de horas, días, semanas, meses o años. Las ventanas de tratamiento retardadas pueden ser 1-2,0%, 2-30%, 5-50% o más largas que la ventana de desarrollo normal que constituye la ventana de. desarrollo alineada. Pueden ser 3x, 4x, 5x ' o más largas. Si son más. largas que una ventana de desarrollo alineada, entonces por definición de la ventana de tratamiento retardada es una ventana de tratamiento expandida que comienza simplemente en un tiempo posterior.

El término "ventana de tratamiento conducente" significa un marco de tiempo . durante el cual se puede administrar un tratamiento que comienza antes en el tiempo que una ventana de tratamiento, basada solamente en una ventana de desarrollo alineada. Las ventanas de desarrollo conducentes que . son antes del inicio de una ventana de desarrollo alineada esperada. También pueden ser más grandes que una ventana de desarrollo alineada y extendida en y más allá de una o . más ventanas de desarrollo alineadas. Las ventanas de tratamiento conducentes se pueden expresar en términos de horas, días, semanas, meses o años. Las ventanas de tratamiento conducentes pueden ser 1-20%, 2-30%, 5-50% o más largas que la ventana de desarrollo normal que constituye la ventana de desarrollo alineada. Pueden ser 3x, 4x, 5x . ¦o más largas. Si son más largas que una ventana de desarrollo alineada, entonces por definición la ventana de tratamiento conducente es una ventana de tratamiento ^expandida que comienza simplemente en un tiempo anterior.

El término . "agente terapéuticamente efectivo" significa una composición que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, órgano, sistema, organismo, animal¦ o humano . que está siendo investigado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro especialista clínico.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significa la cantidad del compuesto o combinación sujeto que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, órgano, sistema, organismo, animal o humano que está siendo investigado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro especialista clínico. En este contexto, la respuesta biológica o médica incluye resultados del tratamiento.

Alteración o modificación de la presentación fenotípica La presente invención proporciona métodos para la corrección, alteración o mitigación de varias presentaciones fenotípicas asociadas con displasia ectodérmica, específicamente XLHED. Las presentaciones fenotípicas de la displasia ectodérmica incluyen, pero no se limitan a, pérdida o dientes anormalmente formados (incluyendo, pero no limitado a, cualquier del primero, segundo o tercer molares, o el primero o segundo, premolar, canino o primero o segundo incisivos), morfología anormal s falta de glándulas sudoríparas, glándulas de Meibomian, glándulas del tracto respiratorio superior, glándulas sebáceas, glándulas salivales y otras glándulas, falta o morfología anormal de varios tipos de pelo, y alopecia.

La corrección, alteración y/o mitigación de las presentaciones fenotípicas asociadas con XLHED se logran por la . administración de una forma recombinante del ligando para el receptor de EDA. Tales composiciones de EDA recombinantes incluyen aquellas descritas con detalle en la solicitud de patente de E.U.A. USSN 12/756, 268 presentada el- 8 de Abril de 2010 que es una continuación de. la solicitud de patente de E.U.A. USSN 10/503, 999 presentada el 25 de Octubre de 2004, ahora la Patente de E.U.A. otorgada 7,736,657, que es una Solicitud de Entrada de Fase Nacional Sección 371 35 U.S.C. de la Solicitud . Internacional No. PCT/EP2002/009354 presentada el 21 de Agosto de 2002, que designa a los E.U.A., y que reclama el beneficio de la prioridad de la Solicitud Alemana No. 10205368.5 presentada el 10. de Febrero de 2002' y la Solicitud Alemana No. 10205583.1 presentada el 11 de Febrero de 2002, los contenidos de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en sus totalidades.

En una modalidad de la invención, la proteina de fusión recombinante- es EDI200 (también conocidas como Fc-EDA, Fe : EDA1 ) . La EDI200 es una proteina de fusión Fe completamente humanizada que. consiste de la región Fe de la IgGl humana y el dominio de enlace al receptor (Dominio del factor de Necrosis Tumoral (TNF) ) de EDA-A1. La proteina biológicamente activa .se glicosila y existe principalmente como un hexámero, comprendido de seis especies monoméricas Fc:ÉDA-Al idénticas. La secuencia de..380 aminoácidos de la especie monomérica- se proporciona en este documento como SEQ ID NO: 1.

Administración y dosificación Cuando el. organismo que se trata es un mamífero tal como un humano, la composición se puede administrar por cualquier medio conocido en el campo incluyendo, pero no limitado a administración oral, intraperitoneal , o vías parenterales, incluyendo intracraneal (por ejemplo, intraventricular, ¦ intraparenquimál e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutánea, . transdérmica, por las vías aéreas (aerosol), nasal, rectal, y tópica (incluyendo bucal y sublingual) . En ciertas modalidades, las composiciones . se administran por . infusión o inyección intravenosa.

En general, una dosis adecuada de EDI200 estará en el intervalo de 0.01 a 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del recipiente, paciente o individuo al dia, generalmente en el intervalo de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al dia. Por ejemplo, la EDI200 se puede administrar en 0.05- mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, '3.5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o 50 mg/kg por dosis individual. La composición farmacéutica se puede administrar una vez al dia, o se puede administrar . como dos, tres, o más dosis en intervalos apropiados por todo el dia o aun usando infusión o suministro continuo a través de una formulación de liberación controlada. En ese case, la EDI200 contenida en cada subdosis puede ser correspondientemente más pequeña a fin de lograr la dosificación diaria total. La dosificación también puede ser de acuerdo con esquemas de múltiples dosificaciones de una, dos, tres o más dosis. La unidad de dosificación también se puede componer para el suministro durante varios días, por ejemplo, usando, una formulación de liberación sostenida convencional que, proporcione una liberación sostenida durante un periodo de varios dias. Las ormulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en el campo y son particularmente útiles' para el suministro de agentes en un sitio' particular, tal como se podría usar con los agentes de la presente invención. En esta modalidad, la unidad de dosificación contiene un múltiple correspondiente de la dosis diaria.

El efecto, de una sola dosis en cualquier fenotipo o síntoma particular¦. puede . ser de larga duración, tal que las dosis subsecuentes :se administran en no más de intervalos de 3, 4, o 5 días, o en intervalos de no " más de 1, 2, 3, o 4 semanas.

El técnico experto apreciará que ciertos factores pueden afectar la dosificación y tiempos requeridos para tratar efectivamente a un sujeto, incluyendo pero no limitado a la gravedad de. la . enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Por otra parte, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición puede incluir un solo tratamiento o una serie de tratamientos. Las evaluaciones de las dosificaciones más efectivas y vidas medias in vivo para, las composiciones farmacéuticas indiviciuales abarcadas por la invención se pueden hacer usando metodologías convencionales o sobre la base de la prueba in vive usando un modelo animal apropiado.

La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos EDI200 caracterizados en la invención. La presente invención también contempla el uso de combinaciones de . compuestos o combinaciones de regímenes de tratamiento, cada uno de los cuales tiene como una administración componente de una composición farmacéutica que comprende EDI200. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar , en una variedad de formas dependiendo de si el tratamiento local o sistémico se desea y en el área que se trata. La administración puede ser tópica (por ejemplo, por un parche transdérmico) , pulmonar, por . ejemplo, por inhalación ó insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal , intranasal, epidermal y transdérmica, oral o parenteral. La administdración parenteral. incluye intravenosa, intraarterial , subcutánea, intraperitoneal o infusión intramuscular; subdérmica, por ejemplo, a través de un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, por administración intraparenquimal , intratecal o intraventricular, la EDI200 se puede administrar de una manera para fijar como objetivo un tejido particular.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, rocíos, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Condones recubiertos, guantes, y similares también pueden ser útiles.. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellos' en las cuales la.EDI200 está en una mezcla con¦ un . agente de suministro tópico tales como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de . ácido graso, esteroides, agentes quelantes y surfactantes.

En una modalidad de la invención, el sujeto, paciente o individuo que recibe el .tratamiento con una composición farmacéutica que .comprende EDI200 es la madre del individuo que expresa el fenotipo anormal. En este caso, se puede tratar en cualquier momento antes de la concepción (fertilización) .

En una modalidad, la madre se trata dentro de 3 días de . fertilización . En otra modalidad, la madre se trata antes del implante, del embrión.. En una modalidad, la madre se trata después del implante del embrión. La madre se puede tratar en cualquier momento durante la gestación del embrión, o posnatalmente . Si se trata durante la gestación, el tratamiento puede ser continuo durante un número de horas, días o semanas.. El tratamiento puede ser discontinuo o intermitente. Si se trata 'durante la gestación del embrión, el tratamiento puede ser durante una o más etapas de Carnegie especificadas del embrión, ya sea secuencial o separadas, a tiempo. En una modalidad, la madre se trata a tiempo cuando su descendencia puede recibir una cantidad efectiva de EDI200 de la madre cuando está lactando. En esta modalidad, la madre se puede tratar en cualquier momento antes de (o después) del nacimiento del descendiente donde EDI200 se puede encontrar en los fluidos de lactancia (por ejemplo, leche materna) de la madre.

En una . modalidad, la madre se pone en contacto con una composición farmacéutica que comprende EDI200 en uno o más tiempos dentro, de las etapas de Carnegie 17-23. En una modalidad, la madre se trata entre la etapa de. Carnegie 17 y 22. En una modalidad, : la' madre se trata durante una de las etapas de Carnegie, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23. El tratamiento también puede abarcar una o más etapas en total o en parte.

La determinación de la ventana de tratamiento para humanos se puede . lograr a través de los datos correlativos de uno o más modelos animales representativos donde se han alineado etapas de desarrollo. Tales alineaciones aceptadas en la técnica son aquellas de las etapas, de Carnegie' y Thieler. Adicionalmente , y de acuerdo con la presente invención, el intervalo, de tales ventanas de tratamiento alineadas puede variar. Las variaciones se pueden basar en otra evidencia de las diferencias del proceso de desarrollo conocidas en el. campo. Por ejemplo, se debe mostrar un fenotipo que se rescata fuera de una ventana de desarrollo alineada, la ventana de tratamiento se puede ajusfar para tomar en cuenta estos datos. En un ejemplo, se sabe que el inicio del pelo de la cola en el ratón puede aún' tomar cuatro días después del desarrollo normal cuando los- animales se tratan con EDI200. En tal caso, la ventana 'de tratamiento coincidirá con una etapa de Carnegie o Theiler posterior y por consiguiente ser una ventana de tratamiento retardada o alargada. Por lo tanto, se debe entender que de acuerdo con la presente invención, las ventanas de tratamiento se pueden aumentar por diferencias en el . desarrollo tal que el tratamiento puede ser necesario antes del proceso del desarrollo normal del fenotipo en cuestión, después del proceso del desarrollo normal del fenotipo en cuestión o a lo largo de un programa de dosificación que se expande para abarcar más de una sola ventana de desarrollo o ventana de desarrollo alineada.

La determinación de la ventana de tratamiento disponible para la madre que alterará o modificará un fenotipo anormal en la descendencia nacida se puede hacer al medir los marcadores en la sangre o suero de las madres preñadas que proporcionan correlaciones a la edad del embrión. Tales mediciones incluyen, pero no se limitan a, gonadotropina coriónica humana (hCG)., hormonas tales como estrógeno, testosterona, progesterona, u otros bioindicadores del estado de la. madre o feto incluyendo glucosa, proteínas y similares. Las mediciones físicas del embrión o feto también pueden informar las. ventanas de tratamiento apropiadas. Estas mediciones tienen la ventaja -de no ser invasivas pero todavía precisas. Un método incluye mediciones fetales obtenidas .a través de ultrasonido.

No es menos . cierto que el embrión o feto debe requerir tratamiento con las composiciones de la presente invención, tal como EDI200, los métodos son disponibles para administrar las composiciones directamente al embrión a través de técnicas endoscópicas, quirúrgicas o microquirúrgicas . La administración¦ por tales métodos, puede ser a una célula, tejido, órgano o sistema orgánico del feto o al fluido amniótico que circunda el feto.

La presente invención . también . proporciona un el tratamiento de la descendencia después del nacimiento. Dependiendo del tipo que se altera, ciertas ventanas de tratamiento permanecen abiertas después del nacimiento. El tratamiento de la descendencia puede ser en cualquier momento después del nacimiento pero de manera preferente en el primer año de vida .

En una modalidad, donde la morfología de los dientes se presenta como anormal, es posible el tratamiento posterior con composiciones farmacéuticas que comprenden EDI200.

Etapas de embriones humanos A través :de los primeros .60 días de la gestación humana, se han identificado 23 etapas morfológicas "de Carnegie" (nombradas de esta manera debido a que el trabajo comenzó en Carnegie Institution) con base en los promedios de tales características, como número de somitas, y longitud embriónica. A un embrión se le asigna una etapa de Carnegie (numerada de 1 a 23) con base en sus características externas. Las etapas se basan en el desarrollo morfológico externo y/o interno del embrión vertebrado, y no son directamente dependientes en su edad o tamaño. El período embriónico humano apropiado se divide en 23 etapas de Carnegie. Estas se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Etapas de Carnegie del Desarrollo de Embriones Humanos Etapas de embriones de ratón . Los embriones, de ratón se pueden estadificar de acuerdo con una variedad de criterios, los más generales de los cuales son aquellos descritos, por Theiler en "The House Mouse: . Atlas of Mouse Development" (Springer-Verlag, Nueva York, 1989) . Los datos en la Tabla 2 se refieren a embriones de cruzas entre ratones híbridos Fl (C57BL X CBA) . La tabla se ' extrae del proyecto EMAP . eMouse Atlas Project (http://www.emouseatlas.org) . La columna "dpc" representa los días pos-concepción, a la mañana siguiente después de que el tapón vaginal se descubre que está designado 0.5 dpc (o EO.5) . · Etapas de Theiler de Desarrollo de Embriones Comparación de las etapas embriónicas En el nacimiento, el ratón contiene los mismos tipos de células y tejidos diferenciados como un humano aunque la cria de ratón se desarrolla totalmente y nace solamente 19 días después de la fertilización del lóbulo, comparado cor. aproximadamente 266 días para el humano. Para las 100 horas iniciales o aproximadamente del desarrollo posfertilización, sin embargo, los embriones de ratón y humano son virtualmente indistinguibles visualmente entre si. Estas similitudes se han documentado muchas veces con correlaciones y comparaciones que se actualizarla través de los años.

En consecuencia, se establecerá por una persona de experiencia que ciertas ventanas de desarrollo, o ventanas de desarrollo alineadas, entre los roedores (ratón y rata) y humanos existen y que estas ventanas proporcionan una excelente correlación de tiempo de desarrollo a través de las especies. Como tal, las ventanas de tratamiento ' identificadas en las especies no . humanas se pueden convertir en una ventana de tratamiento para especies humanas. Esto no es diferente a la dependencia .colocada en los modelos animales en la predicción de la eficacia en humanos. La Tabla 3 proporciona una comparación entre humano, ratón; y rata pero otras especies se han examinado y se han calculado las etapas.

Tabla 3: Etapas de Carnegie de Múltiples Especies (9-15) Tabla 3b: Etapas de Carnegie de Múltiples Especies Otro medio para identificar las ventanas de tratamiento para sujetos humanos incluye el uso de marcadores directos y/o indirectos de desarrollo. En una modalidad de la invención, los marcadores de edad estacional se pueden usar para determinar el tiempo de administración de la EDI200. Por ejemplo, después del . implante, las células dentro de la placenta en desarrollo (sincitiotrofoblastos) sintetizan y secretan gonadotropina coriónica humana (hCG) en el torrente sanguíneo materno. La función principal de la hCG en suero es mantener el corpus luteum en el ovario materno y por lo tanto mantiene el embarazo temprano. Sin embrago, como se puede observar a partir de la Tabla 4, los niveles, de hCG en el suero de la madre proporciona una indicación en cuanto al intervalo de edad gestácional del. embrión o feto. La tabla se adaptó del sitio de la red del Dr. Mark Hill at the University of New South Walesv (UNSW) . ¦ Tabla 4 : Niveles de hCG en suero A partir de la tabla es evidente que las mediciones de hCG pueden informar a . un especialista clinico en cuanto- a la etapa de desarrollo del embrión y por consiguiente el tiempo de administración de la EDI200 se puede determinar para proporcionar el resultado óptimo para la alteración del fenotipo .

Otros medios para determinar la ventana de administración terapéutica más apropiada incluyen métodos tales como aquellos ¦ revisados y descritos por O'Rahilly (O'Rahilly R, y colaboradores, Developmental Stages in Human Embryo.s: Revised. and New Measurements . Cells Tissues Organs 2010; 192:73-84), los contenidos de la cual se incorporan en este documento en su totalidad. En estos métodos, la longitud más. grande o GL (GL; definida como la longitud de un embrión o un feto exclusivo de' las extremidades, inferiores) se midió a través de ultrasonido y se correlacionó con los días de gestación o etapa de Carnegie. La Tabla 5 resume los descubrimientos de O'Rahilly. Por lo tanto, además de las gráficas de Theiler y Carnegie, se pueden hacer mediciones actuales- a través de ultrasonido del embrión o feto y la administración de EDÍ200 hecha en el momento cuando permitirla la eficacia terapéutica más grande corno es ensañado por la presente invención.

Tabla 5: Uso de Longitud más Grande como la Guia de Ventana de Tratamiento Las ventanas de tratamiento o desarrollo también se pueden definir como "durante la gestación", en un tiempo relacionado con- la madurez en el nacimiento, un tiempo relativo con el -tiempo de independencia, un tiempo de apariencia o terminación de la dentición primaria o en la dentición permanente. Les tiempos comparativos se enlistan para ratones, perros y humanos en la Tabla 6.

Tabla 6: Ventanas de Tratamiento Adicionales La invención se ilustra adicionalmente por los ]_ø siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Mapeo de la capacidad de respuesta del tejido a la EDA recombinante (FciEDAl) 15 El ligando de ectodisplasina A (EA) de la familia TNF y su receptor EDAR son requeridos para el desarrollo apropiado de los apéndices' de la piel, tales como pelo, dientes y glándulas sudoríparas ecrinas. "La pérdida de función" de las mutaciones de EDA provocadas por la displasia 20 ectodérmica hipohidrótica ligada a X (XLHED) , una condición que se puede mejorar en ratones y perros por la administración a tiempo de lá EDA recombinante o EDI200.

En un esfuerzo para determinar la capacidad de respuesta temporal de: los tejidos a la EDI200 así. como la dosis requerida y duración de la señalización de la EDI200 necesaria para la formación de cualquiera de las estructuras dependientes de EDA tales como apéndices ectodérmicos , se condujeron los siguientes experimentos.

Brevemente, él método consiste, de administrar a un animal deficiente de EDA (por ejemplo, la cepa del ratón Tabby) con una proteína de fusión Fc-EDA biológicamente activa, EDI200, en una dosis elegida (por ejemplo 1 mg/kg) y en un punto de tiempo particular en el desarrollo, seguido, después de un cierto intervalo de tiempo (por ejemplo 24 h) , por un exceso de un inhibidor de EDA (por ejemplo la proteína de fusión EDAR-Fc en 30mg/kg) . El método fue aplicable tanto in útero como posnatalmente . De esta manera, el método proporciona control del tiempo de la administración, duración de la exposición y dosis del agonista de EDAR (EDI200) en ratones deficientes de EDA. Los resultados de los estudios fueron sorprendentes.. Se determinó que las diferentes estructuras dependientes de EDA se pueden inducir en distintos puntos de tiempo, y pueden requerir diferentes dosis o tiempos de exposición. Interesantemente, algunas estructuras se pueden inducir por hasta varios, días después de su .tiempo de desarrollo normal. Este ' descubrimiento es de gran interés cuando se consideran los ' agonistas de EDAR y las ventanas de eficacia para, propósitos terapéuticos.

Animales de Estudio Se usaron ratones Tabby y sus contrapartes de tipo silvestre en la evaluación in vivo de EDI200. La cepa de ratón Tabby fue una raza BbCBAa Aw~J/A-EdaTa/J (000314 ; Jackson Laboratory) de agouti de vientre blanco como matantes EdaTa/EdaTa y EdaTa/Y. La cepa de ratón WT fue en la misma raza de antecedentes genéticos como controles +/+ y +/Y.

El fenotipo Tabby en los ratones fue el resultado de la deficiente de Ectodisplasina-Al (Srivastava y colaboradores 1997) . Esta cepa de ratón fue el modelo animal de XLHED y se usó para la expresión génica y los estudios de eficacia de EDI200. Los ratones . de cepa WT fueron los animales de control para los ratones de cepa Tabby. Los animales machos y hembras se asignaron aleatoriamente a los grupos de prueba. Los ratones se manipularon de acuerdo con las directrices institucionales y de la Oficina Veterinaria Federal Suiza, con la autorización de "Office vétérinaire cantonal du cantón de Vaud".

Tratamiento In útero Macho y hembras Tabby se aparearon durante la noche, luego se separaron. Los ratones se pesaron diariamente para supervisar la ganancia de peso. Los ratones preñados se inyectaron intravenosamente (i.v.) co . Fc-EDAl (EDI200; n 150 µ? PBS) a 1 mg/kg (por ejemplo 25 g para una hembra de 25 g) . Veinticuatro (24) horas después las hembras se inyectaron i.v. con hEDAR-Fc de 25 a 30 mg/kg (por ejemplo 750 de EDAR-Fc a 4.3 mg/ml en 200 µ? para una hembra de 25 g) .

Se registraron las fechas de', nacimiento y después se tomaron fotografías, diarias de la cola y los ojos. En el destetado (21 días después del nacimiento), se tomaron fotografías de la cola, la punta de la cola, ' del pelo protector, de la región retro-auricular, y de los ojos. También se llevó a cabo una prueba de sudor como se describe en la publicación de PCT O 2010/113117 y su documento de prioridad, los contenidos de cada una de las cuales se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. En el día 30 después del nacimiento, los animales se" sacrificaron y sé llevó a cabo la histología; de la tráquea (tinción con azul Alcian y tinciones con hematoxilina/eosina (H&E) ) , de los parpados (H&E) y de las almohadillas plantares (H&E) . Los cráneos se recolectaron y se prepararon y se tomaron fotografías de los molares superiores e inferiores. Tratamiento Postnatal En el nacimiento se etiquetaron las crías por punción de una almohadilla plantar .con una aguja calibre 30 sumergida en tinta china. El Fc-EDA a 1 mg/kg se inyectó intraperitonealmente en 15 µ? de PBS en . el día de nacimiento (Pl) o en P2, P3, P4- o P5. El hEDAR-Fc se administró a través de la misma vía 24. horas después. El análisis de los ratones se llevó a cabo como ¦ se describe . en lo anterior para los tratamientos in útero.

Evaluación de la corrección del fenotipo Los animales se evaluaron visualmente (animales vivos o cráneos aislados o secciones de tejido) para la corrección del fenotipo Tabby con respecto a la presencia de glándulas sudoríparas, ' molares, glándulas traqueales, glándulas de ¡Meibomian, pelo de la cola, pelo detrás de las orejas, torcedura de la cola y apariencia de los ojos.

Prueba de sudor Las patas traseras se pintaron con una solución de 3% de yodo (p/v) en etanol. Una vez secas, las patas se pintaron con una suspensión de 40%. (p/v) de almidón en aceite mineral. Las fotografías se tomaron uno a dos minutos después. La prueba de almidón-yodo se determinó que es positiva, cuando fueron visibles puntos negros, indicativos de la. presencia del . medio líquido y consistente con la presencia de glándulas sudoríparas.

Información general de los descubrimientos Veinticuatro (24) horas de la exposición a EDI200 en los días antes del nacimiento o en 7 días después del nacimiento indicaron que la diferencia de ios procesos de desarrollo dependientes de EDA tienen diferentes ventanas de oportunidad de tratamiento. Aunque unos procesos requieren exposición corta a la EDI200 a fin de la restauración del fenotipo WT, otras parecen que requieren una exposición más prolongada. Esto puede¦ ser. debido a los procesos de desarrollo de múltiples etapas que están en juego. También se determinó que un- tratamiento de 24 horas, llevado a cabo en cualquier momento durante el desarrollo, solo puede rescatar un conjunto limitado de fenotipos dependientes de EDA sugiriendo que las múltiples administraciones también pueden ser útiles y proporcionan una aplicación más amplia sobre múltiples fenotipos. En consecuencia, múltiples tratamientos con EDI200 distribuidos por toda la fase de desarrollo cuando el EDA1 está activo se esperaría que logre una restauración máxima. del fenotipo WT.

Con respecto a la dosificación, en los ratones se determinó que EDI200 a l mg/kg permanece activo por más de 24 horas. También se descubrió previamente que > 3.5 horas de exposición de ratones Tabby -recién nacidos a 2 µq de EDI200 administrados intravenosamente es suficiente para corregir el crecimiento del pelo en la cola. (Swee y colaboradores 2009). Considerando que. la vida media de eliminación de EDI200 (45 horas) se estima que es por lo menos 10 veces más prolongada que el período de exposición necesario para obtener un efecto biológico, la vida media de eliminación de EDI200 no es un factor limitante en aspectos con. la actividad/eficacia terapéutica, por lo menos cuando se considera la inducción del pelo de la cola. .

Ejemplo 2: Corrección del fenotipo pre- y pos-natal A fin de evaluar un marco, de tiempo amplio para la capacidad del EDI200 de corregir los aspectos del fenotipo Tabby por la exposición de ratones prenatales a EDI200, a los ratones Tabby preñados se les administró intravenosamente una dosis efectiva de EDI200 en un día embriónico elegido de desarrollo. Veinticuatro (24) horas después a los ratones se les administró intravenosamente · un exceso de EDAR-Fc para interrumpir/neutralizar el. EDI200 circulante y restante.

Para evaluar ' la capacidad, del EDI200 para corregir los aspectos del fenotipo Tabby por la exposición de ratones neonatos a EDI200, a crias Tabby se les administró una dosis efectiva de E.D12.00. por la vía intra-peritoneal en varios días pos-nacimiento. Veinticuatro (24). horas después se les administró a los ratones un exceso de EDAR-Fc por la vía intra-peritoneal para interrumpir/neutralizar el EDI200 circulante restante. Véase la Figura 7 para el procedimiento general.

El diseño del .estudio fue como sigue: ratones Tabby preñados se trataron iv en el día embriónico indicado (E11.5 . o .E13.5 o E14.5 o. E16.5 o E17.5) con ÉDI200 a 1 mg/kg, seguido 24 horas después por EDAR-Fc a 30 mg/kg. Alternativamente, a crias Tabby recién nacidas se les inyecto ip con EDI200 a 1 mg/kg (a Pl, P2, P3, P4 o P5) , seguido 24 horas después por EDAR-Fc a 30 mg/kg. En algunos, casos, se administró EDI200, pero se omitió el EDAR-Fc (por ejemplo en E14.5 o en Pl) . Cuando se indicó, el EDI200 se administró repetidamente en diferentes puntos de tiempo (E18.5 y P3), y EDAR-Fc se omitió. En un grupo de control negativo, en el día embriónico a ratones Tabby preñados E13.5 se les administró intravenosamente tanto 1 mg/kg EDI200 como 30 mg/kg de EDAR-Fc. Los ratones WT no tratados se incluyeron como controles. El desarrollo del pelo de la cola se supervisó diariamente durante tres semanas y una evaluación general de la corrección del fenotipo Tabby se llevó a cabo al rededor del día postnatal P23 para, la evaluación externa del fenotipo, y a aproximadamente P30 para la evaluación de la morfología de los. dientes y secciones de tejido de análisis. Tres crías por carnada se ;analiz-aron para evaluar el efecto de la exposición prenatal¦ a EDI200, y tres animales , por grupo se analizaron para evaluar los efectos de la exposición posnatal a EDI200.- Los animales se evaluaron visualmente (animales vivos ó secciones de tejido o' cráneos aislados) para la corrección del fenotipo Tabby con respecto a la presencia de glándulas sudoríparas, ' molares, glándulas traqueales, glándulas de Meibomian, pelo de la cola, pelo detrás de las orejas, torcedura de la cola y apariencia de los ojos.

En esta investigación con respecto a la exposición de 24 horas a 1 mg/kg de EDI200 en los primeros 8 días antes del nacimiento o en los 5 días después del nacimiento, se descubrió que los siguientes fenotipos de los ratones Tabby se corrigieron po . el tratamiento con EDI200 en el intervalo de tiempo indicado. Las fotografía; representativas de los efectos del tratamiento con EDI200 comparados con los animales de control ..se presentan en las Figuras 1-6 y muestran lo siguiente: a. ningún fenotipo Tabby se corrigió en los descendientes de los ratones Tabby preñados administrados tanto con EDI200 como EDAR en el Día E13.5 (datos no mostrados). b. La exposición ¦ de EDI200 de los embriones en E14.5 sin exposición subsecuente a EDAR-Fc restauraron las características . WT adicionales (algunas glándulas sudoríparas, algunos pelos de la cola, pelo detrás de las orejas, morfología molar, comparados con el mismo tratamiento . donde el EDAR-Fc ' se administró subsecuentemente en E15.5 (Figura..6 y datos no mostrados).

Desarrollo de pelos protectores (E13.5 a E15.5). Los pelos protectores se rescataron por el. tratamiento con EDI200 en E14.5, no. se interrumpieron, y por 24 horas de exposición en E14.5 ( 3/3 ratones ) . 24 horas de exposición en E13.5 se rescataron solo pocos pelos protectores (en 2/3 ratones). No se observó efecto en los puntos de tiempo tempranos o posteriores examinados. Véase la Figura 1.

Desarrollo de glándulas sudoríparas (E17.5 a P5) . Pocas glándulas sudoríparas se rescataron por el tratamiento con EDI200 en E14.5, no se interrumpieron, y numerosas glándulas sudoríparas se rescataron por el tratamiento con EDI200 en Pl, no se interrumpieron.. Ninguna glándulas sudorípara se rescató por 24 horas de exposición a E16.5 o más temprano. Las glándulas sudoríparas se rescataron por 24 horas de exposición a EDI200 en E17.5 (pocas glándulas sudoríparas) o en Pl a P5 (numerosas glándulas sudoríparas) . Véase la Figura 2.

Desarrollo de dientes (E13.5 a E16.5) . El primer molar se rescató por el tratamiento con EDI200 en E14.5, no se interrumpió. Para los grupos de tratamiento de estímulo de 24 horas, se observó un efecto en E14, con el molar parcialmente agrandado (2/3 ratones). El segundo molar (inferior) se rescató por el tratamiento en E14.5 o E16.5 (3/3 ratones en cada punto de tiempo) . Véase la Figura 6.

Desarrollo del pelo, de la cola (E16.5 a P4). Los pelos de la cola se rescataron en la cara dorsal por el tratamiento con EDI200 en. E14.5, no se interrumpió y por el tratamiento EDI200 en Pl, no se interrumpió. El pelo de la cola dorsal también se rescató por una exposición de 24 horas, en E16.5, E17.5, Pl, o P2. Los pelos de la cola se rescataron en la cara ventral por el tratamiento con EDI200 en l4.5, no se interrumpió, y por el tratamiento en Pl, no se interrumpió. El pelo de la cola ventral también se rescató por una exposición de 24 horas en Pl, P2 o P3. No ' se observó efecto en los puntos de tiempo anteriores o posteriores. Véase la Figura 4.

La reversión de los ojos en ratones Tabby no parece que se rescate en cualquier período de 24 horas en las dosis usada en ( este experimento, tampoco por el tratamiento en E14.5, o Pl, no se, interrumpió .¦ Sin embargo, la reversión de los ojos se podría lograr en un tratamiento con EDI200 más prolongado (El8..5 y P3, sin interrupción con EDAR-Fc. Pero en este caso solamente 1/3 crías tuvieron apariencia de los ojos revertida). Véase la Figura 5.

Desarrollo de; pelos' detrás de las orejas (E14.5 a E16.5). Los pelos detrás de las orejas se rescataron por el tratamiento con EDI200 en E14.5 y no se interrumpió. Algún rescate por un exposición a 24 horas en E14.5, y poco rescate en E16.5 (datos no mostrados). : i. NO se estableció un impacto claro del tratamiento con EDI200 en la torcedurá de la cola.

Ejemplo 3 Determinación de la Dosificación A fin de determinar el tiempo de exposición mínimo necesario para obtener la actividad terapéutica completa del EDI200 para alterar o corregir el fenotipo, se llevaron a cabo los métodos de Swee y colaboradores (Swee LK, Ingold-' Salamin K, Tardivel A, Willen L, Gaide O, Favre M, Demotz S, ikkola M, Schneider P. (2009) J. Biol. Chem. 284: 27567- 27576) .

Como en los estudios previos, se descubrió que la inyección de EDAR-Fc antes de 3.5 horas después de la administración de 2 g de EDI200 evitó el crecimiento del pelo en la cola, mientras que el EDAR-Fc ya no fue efectivo cuando se inyectó > 3.5 horas después del tratamiento con EDI200.

Considerando que la vida media de eliminación del EDI200 (45 horas) se. estima que es por lo menos 10 más prolongado que el período de exposición necesario para obtener un efecto biológico, la vida media de eliminación del EDI200 no es limitante de su actividad terapéutica, por lo menos cuando se considera la inducción del pelo' de la cola. ¦

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo . descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una proteína, caracterizada, porque es EDI200.

2. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N0:1.

3. La proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, , caracterizada porque la secuencia de aminoácidos se representa por SEQ ID N0:1 o que es un hexámero de seis especies idénticas de las cuales la secuencia de aminoácido se representa por SEQ' ID N0:1.

4. La proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proteína se glicosiía.

5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteína de conformidad con cualquier de reivindicación anterior.

6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende un surfactante .

7. La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada porque se adapta para la administración de 0.01-200..0. mg de EDI200 por kg de peso corporal del receptor al día, en donde opcionalmente la administración es una vez al dia y/o en 0.05 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg,: 3.5 mg/kg, .7 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, y 50 mg/kg por dosis individual.

8. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, caracterizada porque se adapta para la administración por infusión intravenosa y/o por infusión continua..

9'. La proteina de . conformidad con las reivindicaciones 1-4 o la composición ' farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para el uso en un método para corregir, alterar o mitigar una presentación fenotipica asociada con displasia ectodérmica.

10. La proteina o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, para. el uso en el método de la reivindicación 9, en donde el método es un método para alterar, una o más. presentaciones fenotipicas de displasia ectodérmica en un organismo mamifero diagnosticado con, o que se sospecha que tiene displasia ectodérmica, en. donde la presentación fenotipica de la displasia ectodérmica se selecciona del grupo que' consiste de: pérdida de dientes, dientes anormalmente formados, morfología anormal o falta de glándulas sudoríparas, falta de glándulas de Meibomian, falta de glándulas del tracto respiratorio superior,, falta de glándulas sebáceas, falta de glándulas salivales, falta o morfología anormal de varios tipos de pelo, y alopecia, y en donde el método comprende administrar la composición al organismo mamífero' durante la gestación del organismo mamífero, en donde opcionalmente la displasia ectodérmica es displasia ectodérmica . e hipohidrótica.

11. La proteína o composición farmacéutica de conformidad con . la reivindicación 10 para el uso de las reivindicación 10, caracterizada, porque la composición farmacéutica- que comprende EDI200 se administra al organismo por el tratamiento de la madre.

12. La . proteína o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11 para el uso de la reivindicación 11, caracterizada porque el tratamiento de la madre es parentera Imente por un método seleccionado del grupo que consiste de inyección in útero, inyección intravenosa : o inyección intra-arterial .

13. La proteína o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 para el uso de la reivindicación 12, caracterizada porque la displasia ectodérmica. es displasia ectodérmica hipohidrótica y la composición farmacéutica se. administra en un periodo de tiempo durante la . gestación seleccionada del grupo que consiste de: después de la fertilización pero antes del implante, después del implante, ' entre las semanas 5-9 de gestación; entre las semanas 6-8 de gestación, durante la semana 6 de gestación, durante la semana 7 de gestación, durante la semana 8 de gestación y después de la semana 8 de gestación .

14. La proteina o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13 para el uso de la reivindicación 13, caracterizada porque la displasia ectodérmica es displasia ectodérmica hipohidrótica y en donde la presentación fenotípica es falta . o morfología anormal de varios tipos de pelo o. alopecia y. la administración es entre las semanas' 6-8 de gestación o durante una ventana de tratamiento que comienza en un tiempo posterior de la gestación, en donde opciónalmente la ventana de tratamiento comprende 4-10 días'.

15. La proteína o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13 para el uso de la reivindicación 13, caracterizada porque la displasia ectodérmica es displasia ectodérmica hipohidrótica y la presentación fenotípica es (i). morfología anormal o ;. falta de glándulas sudoríparas y la. administración es después de la semana 8 de gestación; o (ii) pérdida de dientes o dientes anormalmente formados y la administración es entre las semanas 5-9 de gestación, en donde opcionalmente la pérdida o dientes anormalmente formados incluye uñó o más del primero, segundo o tercer molares, o el primero o segundo premolar, canino o primero o segundo incisivo.