MX2013009777A - Recuperacion microbiana mejorada de petroleo en condiciones alcalinas. - Google Patents

Abstract

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Description

RECUPERACION MICROBIANA MEJORADA DE PETROLEO EN CONDICIONES ALCALINAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención pertenece al campo de recuperación microbiana mejorada de petróleo (MEOR) . En particular, la invención se refiere a métodos microbianos novedosos, eficientes, económicos y seguros para el ambiente para mejorar la recuperación de petróleo, así como a los microorganismos útiles en tales métodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La demanda de petróleo crudo ha excedido la producción existente en los Estados Unidos por más de 30 años, lo que ocasionó que aumentaran la demanda de petróleo importado y la dependencia de proveedores extranjeros. Cualquier tecnología nueva que pudiera aumentar la eficiencia de la recuperación de petróleo sería sumamente beneficiosa para países que, como Estados Unidos, tienen grandes cantidades de petróleo no recuperables in sifcu (OIP, por sus siglas en inglés) en yacimientos petrolíferos existentes.

La mayoría del petróleo no recuperado en el hemisferio occidental no es petróleo ligero, sino petróleo pesado o arena impregnada de brea. En Venezuela y California se encuentran grandes depósitos de petróleo pesado. Canadá tiene grandes depósitos de arenas impregnadas de brea. En la REF: 243036 actualidad, la producción de petróleo pesado requiere grandes cantidades de energía.

La mayoría del petróleo se encuentra en arenisca, limolita o carbonato. A diferencia de lo que ocurre con el gas natural, la recuperación de petróleo no es eficiente. Las tecnologías existentes de producción convencional de petróleo solo logran recuperar aproximadamente la mitad del petróleo originalmente in situ en un yacimiento de petróleo ligero. En el caso del petróleo pesado, usualmente la recuperación es menor que 10 % . Las arenas impregnadas con brea son tan pesadas que no fluyen y no puede recuperarse petróleo de ellas mediante perforación o bombeo convencionales. Una tecnología que podría recuperar un porcentaje mayor de petróleo residual podría aumentar la producción de petróleo de los yacimientos existentes y reducir la necesidad de Estados Unidos de importar petróleo. El petróleo adicional recuperado de yacimientos productores de petróleo existentes podría reducir la necesidad de explorar y desarrollar áreas silvestres que son potenciales nuevos yacimientos petrolíferos. Esta recuperación adicional de petróleo existente podría cubrir la necesidad de desarrollo de fuentes de energía renovables alternativas.

El petróleo in situ original (OOIP, por sus siglas en inglés) es el petróleo que se encontraba presente en el yacimiento de petróleo cuando fue descubierto. El volumen del yacimiento está determinado por el tamaño y la porosidad del carbonato o la arenisca. La porosidad de la roca es una medida de la cantidad de pequeñas cámaras o microtrampas que se encuentran en la roca que pueden contener agua o petróleo. Generalmente, el petróleo es empujado hacia la superficie por las presiones existentes del yacimiento de petróleo, pero a medida que trascurre el tiempo la presión en el pozo de petróleo disminuye. Por lo tanto, es necesario generar una sobrepresion con otros medios tales como la inyección de agua o una inyección de gas para la recuperación secundaria del 00IP. La selección de una técnica de recuperación secundaria específica depende del tipo de acumulación de hidrocarburo y de la naturaleza del yacimiento. La inyección de agua o el desplazamiento por inyección de agua es una técnica de recuperación secundaria común. En la inyección de agua, se inyecta agua presurizada en la formación rocosa que contiene petróleo. Idealmente, el agua inyectada desplaza el petróleo residual y lo mueve hacia un pozo de producción. Por lo general en la inyección de agua, primero se recupera petróleo crudo libre de agua y luego una mezcla de petróleo crudo y agua de los pozos de producción. En algún momento, el porcentaje de agua en la mezcla de petróleo-agua (a la que se hace referencia como corte de agua) a partir de esta técnica es tan elevado que no resulta económico continuar bombeando petróleo del pozo. Cuando se utiliza agua como "fluido motor" , el problema es que el agua y el petróleo no son miscibles. El agua que tiene menor viscosidad fluirá por encima del petróleo y sobrepasará grandes cantidades de petróleo. Por lo tanto, incluso luego de una recuperación secundaria, una parte significativa del petróleo crudo permanece en la formación, en algunos casos hasta 75 % del OOIP. Normalmente, la fracción de petróleo crudo no recuperable es la mayor para petróleo pesado, brea e hidrocarburos de complejos amplios. En Estados Unidos, este OIP residual en pozos petroleros antiguos podría ser de hasta 300 mil millones de barriles de petróleo ligero. Se estima que a nivel mundial la cantidad de petróleo no recuperable es de 2 billones de barriles. Existen unos 5 billones de barriles adicionales de petróleo pesado, cuya mayoría no es recuperable. Gran parte de este petróleo remanente se encuentra en microtrampas debido a fuerzas de capilaridad o adsorbido sobre superficies minerales (saturación de petróleo no reducible) , así como sobrepasado en la formación rocosa.

Recuperación mejorada de petróleo Se hace referencia a la recuperación de petróleo mediante la inyección de fluidos encontrados en el yacimiento como Recuperación mejorada de petróleo (EOR, por sus siglas en inglés) . Es un subconjunto de recuperación mejorada de petróleo en sentido más general (IOR, por sus siglas en inglés) que puede incluir estrategias operativas tales como la perforación de pozos de relleno y la perforación horizontal. Aunque algunas veces se hace referencia a ella como recuperación terciaria, puede implementarse con procesos secundarios. Se han propuesto y utilizado diversos tipos de EOR con el transcurso de los años. La complejidad técnica y el costo elevado de los químicos han impedido que el uso de EOR se extienda y solo representa alrededor del 10 % de la producción de petróleo de los Estados Unidos.

Han habido dos enfoques principales de EOR: térmico y no térmico.

Procesos térmicos Los procesos térmicos funcionan al calentar la roca almacén y el petróleo para reducir la viscosidad del petróleo pesado. Generalmente, cuanto más baja es la viscosidad del petróleo, mejor será su recuperación. El proceso térmico más utilizado es la inyección con vapor en la que se aumenta la temperatura del yacimiento y del petróleo remanente mediante la energía térmica del vapor. También puede utilizarse agua caliente, pero no es tan eficiente en la transferencia térmica al petróleo y la roca en el yacimiento. Desafortunadamente, en ambos procesos la mayoría de la energía térmica se pierde en el entorno y no calienta el petróleo. La combustión in situ del petróleo es mucho más eficiente que el vapor dado que solo calienta el yacimiento y no las tuberías y la roca recubierta. Sin embargo, es difícil controlar la combustión in situ y se utiliza muy pocas veces. Normalmente, se requiere la energía equivalente a medio barril de petróleo para recuperar un barril de petróleo mediante un proceso térmico de inyección con vapor. Sin embargo, esto depende de la saturación de petróleo y de la configuración del yacimiento. Dado que la mayor parte de la energía que porta el vapor se da a las tuberías, la pared rocosa y el yacimiento, es mejor utilizarlo únicamente en yacimientos con un contenido elevado de petróleo para recuperar tanto petróleo como sea posible con el vapor empleado para calentar la roca almacén. Por lo general, los métodos térmicos son utilizados en petróleo pesado porque reduce la viscosidad del petróleo y aumenta su movilidad y su relación de movilidad (movilidad del fluido desplazante respecto a la movilidad del petróleo o fluido desplazado) . Usualmente, un proceso térmico recupera de 50 a 60 %, pero la ganancia energética neta es mucho menor que ello debido a la gran cantidad de energía necesaria para producir vapor. La situación ideal para la recuperación térmica de petróleo es cuando existe una fuente cercana de energía residual o sin costo para la generación de vapor.

Procesos no térmicos Los métodos no térmicos son más adecuados para petróleos ligeros y moderadamente viscosos. Los objetivos principales para estos procesos son disminuir la tensión interfacial (IFT) entre el petróleo y el fluido desplazante, y mejorar la relación de movilidad. Muchos de los procesos no térmicos con los que se experimentó o que fueron utilizados en el transcurso de los años dependen de tensioactivos para reducir la viscosidad del petróleo y disminuir la IFT entre el petróleo y el fluido desplazante. Idealmente, la movilidad del fluido desplazante no debería ser mayor que la del petróleo. La relación de movilidad (movilidad del fluido desplazante respecto a la movilidad del fluido desplazado) debería ser baja. Es posible aumentar la movilidad del petróleo mediante la reducción de la viscosidad y la reducción de la IFT. A medida que se disminuye la IFT, el petróleo se vuelve más miscible con el fluido hasta que se convierte en una fase y la IFT es cero. Esto disminuye la relación de movilidad y aumenta la recuperación de petróleo. De manera alternativa, es posible aumentar la viscosidad del fluido desplazante mediante la adición de polímeros para "espesar" el líquido. Los métodos no térmicos requieren menos energía y son más adecuados para petróleo ligero de 100 cp o menos. Sin embargo, la mayoría de los métodos no térmicos requieren considerable experimentación en laboratorio y optimización de procesos. Por lo general, el costo elevado de los tensioactivos y de los polímeros es el factor limitante para EOR química.

Existen dos clases principales de EOR química o no biológica. Una es la inundación miscible con un fluido desplazante que es miscible con el petróleo del yacimiento y que reducirá la IFT a cero. Estos fluidos desplazantes pueden ser solventes tales como propano o pentano o gases compresibles que son solubles en el petróleo. La temperatura del yacimiento debe ser lo suficientemente baja para que el gas pueda ser comprimido a un líquido a la presión que puede soportar el yacimiento sin fractura. Algunos ejemplos de gases compresibles son: gas natural, gas de combustión, dióxido de carbono y nitrógeno. El dióxido de carbono se ha vuelto el más prominente en los últimos años, en parte debido a la posibilidad de secuestro de gas invernadero. La cantidad de dióxido de carbono necesaria para recuperar petróleo es considerable (500-1500 sm3/ sm3 de petróleo) . Aunque estos procesos pueden recuperar hasta 20 % del OOIP, su uso se limita a una parte de todos los yacimientos debido a los requisitos de temperatura y de presión de los yacimientos, y a la disponibilidad de los gases. En la actualidad, en más de 80 % de todos los proyectos de EOR con gas dióxido de carbono, el gas se entrega al sitio de pozo mediante cañerías de minas profundas de dióxido de carbono en algunos lugares en Estados Unidos .

La otra clase principal utiliza una formulación química como fluido desplazante. Los compuestos químicos interactúan con el petróleo o el agua o con ambos de forma tal que aumenta la relación de movilidad y la IFT, lo que lleva a mejor movilidad y recuperación de petróleo. Los métodos químicos tienen una ventaja importante respecto tanto a gases térmicos como a métodos térmicos debido a que tienen menos requisitos económicos y no se ven limitados por la ubicación y la disponibilidad de gases o fuentes económicas de energía térmica. Los económicos son los mayores impedimentos para el uso de EOR química. Muchos de los químicos usados en estos procesos son producidos a partir de petróleo y su costo aumenta al aumentar el precio del petróleo.

Existen cuatro procesos principales de inundación química.

La inundación química funciona al mejorar la relación de movilidad y disminuir el contraste de permeabilidad del yacimiento. En la mayoría de los casos, se bombea un tapón de solución de polímero de alrededor de 20 a 40 % del volumen de poro en los pozos de inyección. La pérdida de polímero en la roca almacén porosa y en la degradación del polímero debido a fuerzas de cizallamiento puede limitar el éxito del método. Los polímeros pueden ser polímeros químicos sintéticos tales como poliacrilamida, o productos biológicos tales como polisacáridos . Algunos biopolímeros son más eficaces en salinidad elevada que los polímeros químicos, pero su producción es más costosa.

La inundación con tensioactivos disminuye la IFT entre el petróleo y el agua. Una molécula de tensioactivo tiene un grupo polar en un extremo de la molécula y una región hidrofóbica en el otro extremo de la molécula. El tensioactivo ideal es el que se encontrará tanto en la fase de petróleo como en la fase acuosa en la interface petróleo-agua. Suelen utilizarse sulfonatos de petróleo u otros compuestos de petróleo con un grupo polar o cargado como tensioactivos . La pérdida excesiva de tensioactivos en la superficie de la roca almacén y el costo elevado de la producción de tensioactivos ha limitado el uso de este proceso. Sin embargo, los tensioactivos pueden ser empleados en combinación con otros métodos de EOR química para aumentar el rendimiento.

La inundación alcalina y la inundación con polímeros tensioactivos alcalinos (ASP, por sus siglas en inglés) se beneficia de los compuestos ácidos que se encuentran naturalmente en el petróleo. En la inundación alcalina, se inyecta una solución acuosa de químicos alcalinos, tal como hidróxido de sodio, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio en un yacimiento. Los químicos alcalinos reaccionan con los compuestos ácidos, a los que también se hace referencia como ácido nafténico, del petróleo crudo para formar tensioactivos in si tu en la superficie del petróleo. Esto causa una reducción en IFT y, en algunos casos, una emulsión espontánea del petróleo. La inundación alcalina es seguida por un tapón de tensioactivo y polímeros en solución que puede aumentar en forma significativa la recuperación de petróleo. Asimismo, el álcali reduce la adsorción del tensioactivo en la superficie de la formación rocosa y, por lo tanto, disminuye el costo.

Este proceso se limita al petróleo que tiene suficiente ácido orgánico que puede transformarse en tensioactivos adecuados. La cantidad de ácido en el petróleo del yacimiento puede ser determinada mediante extracción con una base y la posterior titulación con hyamine o mediante titulación directa de ácido en un solvente orgánico. Este análisis genera un número de acidez que se define como los miligramos de hidróxido de potasio necesarios para neutralizar los ácidos presentes en un gramo de petróleo. Comúnmente se cree que el petróleo objetivo debe tener un número de acidez de 0.4 o superior para que pueda ser sometido a inundación alcalina. Sin embargo, esto es únicamente una aproximación dado que simplemente un número de acidez no proporciona detalles sobre el tipo de ácidos presentes en el petróleo. La titulación directa de todo el ácido en el petróleo es conocida como número de acidez total (TAN, por sus siglas en inglés) y es, por lo general, mucho mayor que el ácido extractado que se tituló con hyamine. El número TAN puede inducir a error ya que los ácidos de hidrocarburos son muy lipófilos para ser extraídos del petróleo con solución de hidróxido de sodio diluido. Estos ácidos lipófilos grandes tampoco funcionarán como buenos tensioactivos o jabones en la interface petróleo-agua. Los ácidos de hidrocarburos pequeños son demasiado hidrófilos para ser detectados por titulación con hyamine y tampoco son útiles como jabones debido a que se mueven en la fase acuosa y no ayudan a disminuir la IFT del petróleo. Por lo tanto, la mejor medida de ácido naftánico se realiza mediante extracción acuosa y titulación con hyamine.

La inundación con ASP puede ser el proceso de EOR química de menor costo para yacimientos de petróleo que contienen petróleo no recuperado con un número de acidez extraíble de 0.4 o superior. Desafortunadamente, la mayor parte de los yacimientos de los Estados Unidos no tiene suficiente ácido extraíble como para ser sometidos a inundación con ASP. Algunos yacimientos petrolíferos tienen TAN elevados, lo que es interpretado como el resultado de muchos años de degradación microbiana. Sin embargo, este lento proceso natural también ha eliminado la mayor parte de los alcanos y otros compuestos de petróleo más ligeros, por lo que queda petróleo residual muy viscoso. En 1998, A. K. Stepp y T. French propusieron un proceso para una primera biodegradación del petróleo con el fin de aumentar el TAN para que el petróleo fuera más susceptible a inundación con ASP o alcalina. La limitación del proceso de dos etapas es que los hidrocarburos aromáticos y los alcanos de menor peso molecular se convertirían más rápidamente en ácidos grasos que los hidrocarburos de elevado peso molecular. Otro problema es que muchos de los ácidos grasos que se producen también serán utilizados como fuentes de carbono por los microorganismos inyectados y los microorganismos nativos.

Otra limitación del proceso de dos etapas es que la primera etapa, de biodegradación del petróleo para aumentar el contenido ácido, puede ser un proceso largo que tome muchos meses o años. El tiempo real necesario para completar la conversión biológica de hidrocarburos en ácidos grasos es variable e impredecible . La capacidad de determinar el contenido ácido real en el petróleo residual atrapado en el yacimiento subterráneo es limitada. Perforar la formación del yacimiento para analizar el petróleo es muy costoso y no es una técnica justificada y razonable. El comienzo demasiado temprano de la inundación alcalina antes de que se genere suficiente ácido no producirá suficiente recuperación de petróleo debido a que el TAN es muy bajo. Retrasar el comienzo del proceso alcalino causaría más degradación de hidrocarburos livianos y una pérdida de la fracción de petróleo ligero con un aumento en viscosidad que también retrasaría el comienzo de la producción de petróleo.

Por lo tanto, es necesario combinar la degradación microbiana de petróleo con inundación alcalina y con ASP de forma tal que pueda lograrse una recuperación elevada de petróleo sin pérdida de petróleo debido a los procesos de biodegradacion o procesos largos de múltiples etapas. Es necesario un nuevo proceso alcalino que pueda ser utilizado en una gran cantidad de yacimientos y que reduzca el costo químico de tensioactivos y polímeros.

Recuperación microbiana mejorada de petróleo (MEOR) Un tipo especial de técnica EOR utiliza microorganismos tales como bacterias y arqueobacterias para desplazar el petróleo adsorbido o en microtrampas de la roca. El objetivo de esta técnica, conocida como recuperación microbiana mejorada de petróleo (MEOR) , es aumentar la recuperación de petróleo de los hidrocarburos de la subsuperficie original con microorganismos, en lugar de utilizar los procesos de recuperación química más costosos. Normalmente, estos procesos biológicos utilizan microorganismos para lograr resultados similares a los de los métodos químicos al reducir la IFT y la relación de movilidad del fluido motor del agua respecto al petróleo. Los mecanismos principales por los que se piensa que funcionan los microorganismos son: (1) alteración de la permeabilidad de la formación subterránea mediante la producción de ácidos de bajo peso molecular a partir de la biodegradacion de hidrocarburos que ocasionan la disolución de la roca, (2) producción de biotensioactivos que pueden disminuir la IFT y formar micelas de petróleo en agua en forma similar a los tensioactivos químicos, (3) mediación de cambios en la mojabilidad de la gotita de petróleo mediante el crecimiento de la gotita y el cambio de la superficie del petróleo a una superficie menos hidrofóbica, (4) producción de biopolímeros que mejoran la relación de movilidad del agua respecto al petróleo al aumentar la viscosidad del agua y taponar los canales de flujo elevado, (5) producción de hidrocarburos de bajo peso molecular mediante la conversión enzimática de los hidrocarburos grandes en moléculas más pequeñas, lo que reduce la viscosidad del petróleo, (6) generación de gases (predominantemente dióxido de carbono y nitrógeno) que aumenta la presión de la formación.

En la actualidad, se considera que MEOR es el enfoque más económico de todos los procesos de EOR, pero generalmente es el menos utilizado. Una de las limitaciones de los procesos de MEOR que estimulan los microorganismos nativos es que existe poco control de los seis mecanismos propuestos de recuperación biológica de petróleo. También es posible que otros mecanismos desconocidos sean responsables de los ensayos más exitosos de MEOR. No es probable que se utilice este proceso biológico para recuperar petróleo de grandes yacimientos petrolíferos si no se comprende mejor o no se tiene un mayor control sobre él. Para que este proceso se utilice como otros procesos de producción de petróleo térmicos o químicos, sería mejor que cada uno de los mecanismos antemencionados fuera evaluado en forma individual .

Se han propuesto muchos microorganismos para llevar a cabo varios mecanismos del proceso microbiano de movilización en las formaciones subterráneas. Los ensayos in situ de estos microorganismos involucraron la inyección de una población microbiana exógena en pozos de petróleo de escasa producción o viejos. Se proporcionaron nutrientes y sales minerales al cultivo de inoculación como aditivos en el agua que se bombeó en los pozos para la recuperación de petróleo. El desarrollo de los microorganismos exógenos se limitó por las condiciones predominantes en la formación. Las restricciones físicas como que los poros de la formación sean de variable o pequeño tamaño, así como la temperatura, salinidad y presión elevadas de los fluidos en la formación y la baja concentración de oxígeno en el agua de la formación, limitan mucho los tipos y cantidades de microorganismos que pueden inyectarse y prosperar en la formación. Además, resultó evidente que los microorganismos nativos estimulados por los nutrientes representaban un papel de gran importancia en la recuperación de petróleo. Por consiguiente, es difícil determinar cuál de los diversos mecanismos biológicos están en funcionamiento.

Las restricciones biológicas, tal como la competencia entre microorganismos nativos y el estrés de los entornos cambiantes (de superficie a subsuperficie) también pueden limitar la viabilidad de los microorganismos exógenos. Se ha propuesto el uso de microorganismos nativos, usualmente anaeróbicos, en proyectos de MEOR para superar estos problemas. Se sabe que las bacterias y otros microorganismos pueden crecer en forma nativa en los yacimientos de petróleo y pueden ser utilizados para mejorar la producción petrolífera. También se sabe que las bacterias y otros microorganismos metabolizarán diversos componentes de petróleo como fuente de carbono y de energía. Adicionalmente a los efectos beneficiosos de la producción de tensioactivos, solventes y otros metabolitos que pueden resultar en un aumento de la producción petrolífera, pueden consumir petróleo como fuente de carbono. Desafortunadamente, por lo general prefieren consumir los alcanos cortos.

De hecho, el proceso de biodegradación de petróleo depende de la emulsión de petróleo de forma tal que los hidrocarburos puedan ser transportados en células bacterianas para convertir ácidos grasos como fuentes de carbono y de energía. Este proceso puede ser utilizado para remediar derrames de petróleo y otros sitios contaminados con petróleo mediante el suministro de microorganismos nativos con nutrientes o mediante la inoculación con cultivos de microorganismos que pueden degradar el petróleo. En el caso de remedio biológico de sitios contaminados con petróleo, los microorganismos pueden producir metabolitos tales como tensioactivos que ayudan a emulsionar petróleo de forma que puedan luego utilizar el petróleo emulsionado como fuente de carbono. Ambas funciones ayudan a eliminar la contaminación por hidrocarburos del sitio. Sin embargo, en el caso de MEOR, únicamente la producción de metabolitos tales como tensioactivos , biopolímeros , enzimas de escisión de hidrocarburos, solventes y ácidos orgánicos son beneficiosos para la producción de petróleo aumentada. Además de proporcionar una fuente de energía, el consumo de petróleo ligero no es beneficioso para la producción mejorada de petróleo del yacimiento.

La biodegradación de las cadenas de carbono más cortas de alcanos reduce la parte más liviana de la mezcla de hidrocarburos en el petróleo. La eliminación de alcanos de cadena corta de esta mezcla aumenta la viscosidad general de la mezcla de hidrocarburos. Es más difícil recuperar del yacimiento la mezcla de viscosidad más elevada. El porcentaje de petróleo recuperable disminuye. Además, el petróleo recuperado es más difícil de transportar a través de tuberías y más difícil de refinar. Por lo tanto, la producción de compuestos útiles mediante microorganismos para recuperación mejorada de petróleo resulta costosa.

Este proceso de estimulación de todos los microorganismos nativos en un yacimiento de petróleo mediante la adición de nutrientes resulta impredecible. El crecimiento de los microorganismos puede producir el efecto beneficioso de desplazar el petróleo atrapado en un yacimiento petrolífero. De manera alternativa, el consumo de petróleo ligero puede tornar el petróleo más viscoso y disminuir la recuperación total de petróleo.

Sería menos perjudicial que todos los componentes del petróleo se degradaran en la misma forma, pero en este caso los microorganismos degradan los alcanos de cadena más corta y los compuestos aromáticos de peso molecular más bajo con mayor facilidad como fuentes de energía y de carbono. Por lo tanto, a menos que no se encuentren los genes que codifican alcanos de cadena corta o compuestos aromáticos livianos en todos los microorganismos, tanto inyectados como nativos, es probable que la degradación de hidrocarburos livianos ocurra más rápidamente que la degradación de los hidrocarburos pesados. El hecho de que los depósitos de petróleo cercanos a la superficie, que en su mayor parte son sometidos a biodegradación, normalmente tengan gran cantidad de petróleo de viscosidad elevada, niveles elevados de hidrocarburos asfálticos y pocos alcanos de cadena (corta) liviana. Se cree que las arenas impregnadas de brea canadienses son el residuo pesado que representa alrededor de 10 % del depósito original de petróleo a partir del que se ha degradado 90 % del petróleo .

En el pasado, se han enseñado formas de aumentar el crecimiento de microorganismos que desplazan y movilizan petróleo de los yacimientos de petróleo subterráneos.

Generalmente, estos métodos recomiendan agregar nutrientes. También se ha indicado la adición de varios cultivos de bacterias seleccionadas que agregaron capacidades beneficiosas. Incluso se ha informado el aislamiento de microorganismos que únicamente pueden degradar hidrocarburos de peso molecular elevado (vea, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,013,654). Sin embargo, agregar estos cultivos seleccionados no es suficiente para lograr el resultado deseado. Aunque estos métodos anteriores describen la existencia de microorganismos que se alimentan únicamente de petróleo de peso molecular elevado, no proveyeron métodos para aumentar la biodigestión de petróleos pesados, al tiempo que eliminan el consumo de hidrocarburos de bajo peso molecular con otros microorganismos nativos. Es probable que los microorganismos que residen naturalmente en el yacimiento de petróleo tengan la capacidad de degradar petróleo de menor peso. Generalmente, la adición de nutrientes estimularía el crecimiento de todos los microorganismos presentes. Debido a que los hidrocarburos más pequeños pueden ser transportados a través de la membrana celular, los microorganismos que consumen petróleo de bajo peso pueden crecer más rápidamente que los que consumen petróleo de peso elevado y dominarán la población resultante de la estimulación.

No existen métodos en la técnica que prevengan eficazmente la biodegradación más rápida del petróleo de baja viscosidad y bajo peso en comparación con la biodegradación más lenta del petróleo viscoso de peso elevado en el cultivo mezclado de un yacimiento de petróleo. Se ha informado que existen cepas puras de microorganismos que degradan únicamente petróleo pesado (Purwasena I. A., et ál . Proceeding of International Petroleum Technology Conference Doha, Catar, 7-9 de diciembre de 2009) . Sin embargo, no existe un método para prevenir el crecimiento de los microorganismos nativos degradantes de cadena corta que generalmente residen en la mayoría de los yacimientos a menos de 80 °C.

Por lo tanto, el mismo proceso que es beneficioso para recuperar petróleo también es perjudicial para la viscosidad del petróleo y se sabe que aumentar la viscosidad del petróleo residual que se encuentra en el yacimiento disminuye la recuperación de petróleo.

Por consiguiente, son necesarios nuevos enfoques de recuperación mejorada de petróleo que sean eficientes energéticamente y que puedan ser utilizados en forma exitosa y confiable en contextos de campos grandes para permitir la recuperación de petróleo actualmente no recuperable en yacimientos petrolíferos existentes. Este nuevo método debería ser capaz de degradar en forma selectiva determinados compuestos objetivo que se encuentran en el petróleo que permanece en el yacimiento de forma que el petróleo se modifique para mejorar la recuperación por inyección con agua o por inyección química con agua. Además, los genes y enzimas que codifican pueden ser modificados y su expresión puede ser regulada para transformar en la mejor forma el petróleo para mejorar la producción y la recuperación. Los microorganismos huésped pueden ser seleccionados de forma que sobrevivan a condiciones extremas en el yacimiento al momento de la inyección con agua o durante una EOR química por inyección con agua .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Presentar microorganismos con genes para vías metabólicas útiles para la recuperación mejorada de petróleo de yacimientos subterráneos, arenas impregnadas con brea, arena petrolífera y otras fuentes de petróleo pesado al tiempo que se elimina el consumo de la parte más ligera del petróleo es un objetivo de esta invención. De manera adicional, es un objeto de esta invención dar al organismo receptor o huésped de estos genes una ventaja competitiva para el ambiente especialmente modificado del yacimiento de recursos hidrocarburos antes y/o durante un procesos de recuperación de petróleo por inyección de agua alcalina.

En un aspecto, la invención concierne un método para mejorar la recuperación de petróleo que comprende (a) inocular un yacimiento de petróleo con un consorcio que comprende microorganismos que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad y que tienen una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos, pero tienen la capacidad de convertir hidrocarburos en ácidos grasos, (b) permitir que el consorcio prolifere y degrade hidrocarburos de más de 12 carbonos y (c) lograr una recuperación mejorada de petróleo del yacimiento de petróleo.

En una modalidad, se proporcionan o se encuentran naturalmente presentes en el yacimiento condiciones alcalinas .

En una modalidad adicional, al menos la etapa (b) se lleva a cabo en condiciones alcalinas.

En otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos que son naturalmente alcalófilos, haloalcalófilos o resistentes a la alcalinidad.

En otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos modificados para ser alcalófilos, haloalcalófilos o resistentes a la alcalinidad.

En aun otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos que naturalmente tienen una capacidad deficiente para degradar hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos.

En una modalidad adicional, el consorcio comprende microorganismos modificados para que sean incapaces de degradar hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos .

En incluso una modalidad adicional, el consorcio comprende microorganismos en los que se disminuyen, eliminan o modifican una o más vías metabólicas de degradación de hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos .

En una modalidad diferente, el consorcio comprende microorganismos que naturalmente tienen la capacidad de degradar cadenas de hidrocarburos de más de alrededor de 12 carbonos .

En otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos modificados para que sean capaces de degradar cadenas de hidrocarburos de más de alrededor de 12 carbonos .

En aun otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos en los que se introducen una o más vías metabólicas para degradar cadenas de hidrocarburos de más de alrededor de 12 carbonos .

En una modalidad adicional, el consorcio comprende microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos de elevado peso molecular presente en el yacimiento de petróleo como fuente de carbono.

En incluso una modalidad adicional, el consorcio comprende microorganismos capaces de crecer en un ambiente con concentración elevada de sal (halófilos) .

En una modalidad, se proporciona o se encuentra naturalmente presente en el yacimiento un ambiente con concentración elevada de sal.

En incluso una modalidad adicional, el consorcio comprende microorganismos capaces de utilizar carbonos simples donde los carbonos simples pueden, por ejemplo, ser seleccionados del grupo que consta de glucosa, sacarosa, mañosa, almidón, glicerina, ácidos orgánicos y otros azúcares sencillos.

En una modalidad adicional, en la etapa (a) se inyecta una mezcla nutriente que comprende una fuente de carbono soluble en el yacimiento de petróleo junto al consorcio, donde la mezcla de nutrientes puede también comprender opcionalmente un nutriente no hidrocarburo tal como, por ejemplo, extracto de levadura, peptona, succinato, lactato, formato, acetato, propionato, glutamato, glicina, lisina, citrato, glucosa y/o soluciones vitamínicas.

En una modalidad particular, los microorganismos son del dominio Archaea y/o son bacterias.

En otras modalidades, el consorcio puede crecer a pH 9.0 o más, o a pH 10.0 o más.

En varias modalidades, el consorcio puede comprender microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de usar hidrocarburos aromáticos de anillo y/o hidrocarburos modificados que contienen azufre y/o hidrocarburos modificados que contienen nitrógeno .

En otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de producir tensioactivos .

En incluso otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos, alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que fueron modificados para producir tensioactivos. En otra modalidad, la producción de tensioactivos no depende de la expresión de genes que codifiquen la degradación de hidrocarburos.

En aun otra modalidad, el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos, alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de producir polímeros extracelulares .

En una modalidad adicional, el método de la presente invención comprende además la etapa de inyección con agua en tal yacimiento con un fluido alcalino o un fluido que contiene un compuesto tóxico para los microorganismos nativos, con el fin de reducir la concentración de microorganismos que tienen la capacidad de utilizar tales hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos .

En incluso una modalidad adicional, el método de la presente invención comprende adicionalmente la etapa de adición al yacimiento de al menos un inhibidor químico para controlar una vía metabólica de al menos un microorganismo nativo presente en el yacimiento y/o un microorganismo haloalcalófilo, alcalófilo obligado o resistente a la alcalinidad que fue inoculado en el yacimiento.

En una modalidad, el inhibidor químico inhibe la degradación de alcanos de cadena corta mediante los microorganismos nativos y/o que fueron inoculados.

En otro aspecto, la invención implica un microorganismo aislado, preferentemente del dominio Archaea o una bacteria, que (i) es un haloalcalófilo, un alcalófilo obligado o resistente a la alcalinidad, y (ii) tiene una capacidad deficiente de degradación de hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos.

En una modalidad, el microorganismo es un haloalcalófilo, un alcalófilo obligado o resistente a la alcalinidad y tienen una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos, pero tienen la capacidad de convertir hidrocarburos en ácidos grasos.

El microorganismo puede tener naturalmente las propiedades descritas y/o puede ser modificado para que tenga una o más de las propiedades descritas .

En diversas modalidades, el microorganismo puede crecer en condiciones alcalinas de pH 9.0 o más, o condiciones alcalinas de pH 10.0 o más.

En otra modalidad, el microorganismo tiene la capacidad de utilizar cadenas de hidrocarburos de más de 12 carbonos.

En una modalidad adicional, el microorganismo tiene la capacidad de utilizar hidrocarburos modificados que contienen azufre .

En incluso una modalidad adicional, el microorganismo de conformidad con la reivindiación 25 tiene la capacidad de utilizar hidrocarburos modificados que contienen nitrógeno.

La invención también tiene que ver con un consorcio que comprende microorganismos que poseen una o más de las propiedades descritas anteriormente.

Adicionalmente , la invención tiene que ver con un consorcio que comprende uno o más tipos de microorganismos, tal como se describe en la presente anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención tiene que ver con un yacimiento de petróleo que comprende un consorcio en él.

El consorcio utilizado en los métodos de la presente puede contener uno o más tipos diferentes de microorganismos.

Por lo tanto, por ejemplo, puede contener microorganismos que son tanto haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad y halófilos, además de tener una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta. Sin embargo, también es posible que el consorcio contenga dos tipos diferentes de microorganismos: uno, haloalcalófilo, alcalófilo obligado o resistente a la alcalinidad y con una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta y otro, un halófilo que también tiene una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta.

Cabe señalar que dos o más de las diversas modalidades que se enumeraron anteriormente o se describieron en la presente en otra forma pueden ser utilizadas en cualquier combinación, y que cualquiera de tales combinaciones se encuentra comprendida por el alcance de la presente invención .

También se señala que varias modalidades descritas en conexión con un aspecto de la invención también están contempladas respecto a otros aspectos de la invención. Por lo tanto las modalidades descritas respecto a los métodos de la presente invención también se aplican a otros aspectos, tales como el consorcio de microorganismos o los microorganismos aislados presentes en tal consorcio, según sea el caso.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La patente o solicitud contiene al menos una figura en color. Si se solicitara y luego de efectuado el pago de la tasa necesaria, la oficina entregará copias de la publicación de la solicitud de patente con la o las figuras en color.

La Figura 1 ilustra una vía de degradación de alcanos mediante microorganismos.

La Figura 2 ilustra la conversión de ácidos grasos en jabón a pH alcalino.

La Figura 3 ilustra la emulsión de petróleo con jabones de ácidos grasos a pH alcalino.

La Figura 4 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de alcano monooxigenasa de cadena larga LadA (SEQ ID NO: 1) con la proteína hipotética Gen ID 9420269 HacjB3_12265 de halófilos resistentes a alcalinidad Halalkalicoccus jeotgali B3 (SEQ ID NO: 2) y con otra proteína hipotética del halófilo Halorubrum lacusprofundi (ATCC 49239) ID del gen 7401614 Hlac 0096 (SEQ ID NO: 3) .

En la Figura 5 se muestra el bloqueo de la generación de genes acd3 y aldY5 de Haloferax volcanii D32. La banda de PCR de 1.3 kilobases generada a partir de los genomas de múltiples aislados mutantes, pero no a partir de Haloferax volcanii de tipo natural, demuestra el bloqueo exitoso de los genes acd3 y aldY5.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I . Definiciones A menos que se defina de otra forma, todos los términos, notaciones y otra terminología científica de la técnica empleada en la presente tienen los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos, se definen en la presente términos con significados comúnmente comprendidos con fines de claridad y/o para hacer una referencia específica, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe ser necesariamente interpretada como una representación de diferencia sustancial respecto a lo que generalmente se entiende en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en la presente son generalmente comprendidos y comúnmente empleados mediante metodología convencional por los expertos en la técnica, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular muy utilizadas que se describen en Sambrook et ál . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Además, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 93, enero de 2011, John Wiley & Sons, Inc. Los procedimientos que involucran la utilización de kits y reactivos disponibles comercialmente se llevan a cabo según los protocolos y/o parámetros establecidos por los fabricantes, a menos que se indique lo contrario.

Debe observarse que tal como se usan aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la", incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones como "comprende" o "que comprende" indican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros mencionado, pero no la exclusión de todo otro número entero o grupo de números enteros .

Todas las publicaciones que se mencionan en la presente se incorporan a la misma mediante esta referencia para describir y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones. Las publicaciones que se citan en la presente se mencionan para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Ningún contenido de la presente debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a preceder las publicaciones en virtud de una fecha anterior de prioridad o una fecha anterior de invención. Además, las fechas reales de publicación pueden ser diferentes a las que se muestran y deben ser verificadas en forma individual.

En la presente, se emplea el término "yacimiento de petróleo" en su sentido más amplio e incluye todas las formas de depósitos de hidrocarburos que incluyen, de modo no taxativo, pozos productivos, pozos sin producción, pozos experimentales, pozos exploratorios y similares a los que se puede acceder por cualquier medio, tal como, por ejemplo, uno o más pozos .

La expresión "petróleo crudo" se refiere al líquido inflamable de origen natural que se encuentra en formaciones rocosas y que comprende una mezcla compleja de hidrocarburos de distintos pesos moleculares y otros compuestos orgánicos. De modo no taxativo, el petróleo crudo puede contener, por ejemplo, una mezcla de parafinas, compuestos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, aromáticos, cíclicos, policíclicos y/o poliaromáticos . El petróleo crudo puede ser genérico o provenir de un yacimiento indicado para recuperación mejorada de petróleo conforme a la presente invención.

Los términos "pozo" y "yacimiento" pueden ser utilizados en la presente en forma intercambiable y se refieren a una formación subterránea o en el lecho marino de la que puede recuperarse petróleo. Los términos pozo y yacimiento incluyen la composición física/química de la estructura suelo-roca-sedimento del yacimiento bajo la superficie.

La expresión "muestra ambiental" significa cualquier sustancia expuesta a hidrocarburos, incluso una mezcla de agua y petróleo que comprende microorganismos . Tal como se usa en la presente, muestra ambiental incluye muestras de agua y petróleo que comprenden poblaciones de microorganismos de varios géneros y especies y/o microorganismos nativos. Las muestras ambientales pueden comprender un consorcio microbiano único para una región geográfica o yacimiento objetivo o, de manera alternativa, el consorcio microbiano puede adaptarse a otros sitios ambientales, regiones geográficas y yacimientos.

El término "microorganismo" se utiliza en la presente en su sentido más amplio e incluye todos los microorganismos, incluso bacterias, hongos, arqueobacterias y protistas, y animales microscópicos como plancton, planarias y amebas. Los microorganismos preferidos para los fines de la presente invención son bacterias y arqueobacterias.

La expresión "consorcio microbiano" se utiliza en la presente para hacer referencia a múltiples poblaciones microbianas que interactúan. Los miembros de un consorcio se comunican entre sí. Ya sea mediante el intercambio de metabolitos o mediante el intercambio de señales moleculares dedicadas, cada población o individuo detecta y responde a la presencia de otros en el consorcio. Esta comunicación permite una división del trabajo dentro del consorcio. El rendimiento general del consorcio depende de una combinación de tareas llevadas a cabo por los individuos o subpoblaciones que lo conforman .

Las arqueobacterias comprenden uno de los tres dominios distintivos de la vida, junto a las bacterias y los eucariontes . Vea, por ejemplo, Makarove y Koonin, Genome Biology 4 :115 (2003) .

La expresión "resistente a la alcalinidad" se utiliza en la presente para hacer referencia a un organismo capaz q crecer a un pH de 9 o más, pero que presenta velocidades de crecimiento óptimas a pH neutro.

La expresión "alcalófilo obligado" se utiliza en la presente para hacer referencia a un organismo cuyo crecimiento es óptimo a un pH al menos dos unidades sobre la neutralidad o a un pH de 9 o más.

La expresión "haloalcalófilo obligado" se utiliza en la presente para hacer referencia a un organismo cuyo crecimiento es óptimo a una concentración de sal de 100,000 o más, y a un pH de 9.0 o más.

Vea, por ejemplo, Koki Horikoshi, Microbiology and Molecular Biology Reviews , diciembre de 1999, págs . 735-750, que contiene una reseña sobre microorganismos resistentes a la alcalinidad y alcalófilos, así como "Alkaliphiles" 1999 ISBN 90-5702-458-6 publicado por Kodanha Ltd, Tokio, Japón, autor: Koki Horikoshi.

El término "halófilo" se utiliza en la presente para hacer referencia a un extremófilo que prospera en ambientes con concentraciones elevadas de sal, normalmente de al menos alrededor de 5 % (50,000 ppm) , o al menos alrededor de 10 %, o al menos alrededor de 15 %.

El término "halófilo obligado" se utiliza en la presente para hacer referencia a un extremófilo cuyo crecimiento depende en forma obligatoria de concentraciones elevadas de sal, normalmente de al menos alrededor de 5 % (50,000 ppm), o al menos alrededor de 10 %, o al menos alrededor de 15 %.

Los términos "represión" e "inhibición" se utilizan en la presente con referencia a la expresión génica en forma intercambiable y se refieren a cualquier proceso que resulte en una disminución de la producción de un producto génico, independientemente del mecanismo subyacente. Un producto génico puede ser tanto ARN como una proteína. La represión génica incluye los procesos que disminuyen la transcripción de un gen y/o la traducción de AR m. Por lo tanto, se incluyen específicamente en esta definición los procesos que inhiben la formación de un complejo de inicio de transcripción, aquellos que disminuyen las velocidades de transcripción y aquellos que antagonizan la activación transcripcional es represión génica. Estas represiones pueden ser reversibles o irreversibles, y ambas opciones se incluyen específicamente en esta definición. La represión puede ser parcial únicamente con valores bajos del gen expresado o sin genes expresados, y sin producto génico proteico sintetizado.

El término "transferencia génica lateral" se utiliza en la presente en su sentido más amplio y se refiere a la transmisión de información genética de un genoma a otro.

El término "tensioactivo" tal como se usa en la presente significa agentes de superficie activa producidos en forma microbiana que incluye, de modo no taxativo, glucolípidos (por ejemplo, soforolípidos o lípidos de ramnosa) , lipoproteínas , complejos de ácidos grasos-polisacáridos , mono- y diglicéridos , lipoheteropolisacáridos, peptidolípidos , lípidos neutros, ácidos corinomicólicos , dimicolatos de trehalosa y complejos de proteínas-polisacáridos .

El término "jabón" se utiliza en la presente en su sentido más amplio para describir cualquier hidrocarburo con uno o más grupos carboxilo, o también se hace referencia a él como un ácido graso, que fue convertido a una sal ácida mediante remoción alcalina del ion hidrógeno y el reemplazo con un ion mono- o divalente .

El término "hidrocarburo" se utiliza en la presente en su sentido más amplio para describir cualquier compuesto orgánico que contiene únicamente carbono e hidrógeno (en algunos casos puede contener átomos de azufre o nitrógeno) . El término incluye específicamente, de modo no taxativo, hidrocarburos saturados (alcanos) , hidrocarburos no saturados (incluyen alquenos y alquinos) , cicloalcanos e hidrocarburos aromáticos (árenos) .

La expresión "hidrocarburo de cadena corta" se utiliza en la presente para hacer referencia tanto a alcanos de cadena lineal como alcanos de cadena ramificada que contienen 12 carbonos o menos.

Un "alcano de cadena corta", tal como se define en la presente, contiene de 1 a 4 átomos de carbono.

Tal como se define en la presente, un "hidrocarburo de peso molecular elevado" es un hidrocarburo que tiene al menos alrededor de 40 carbonos, por ejemplo, un hidrocarburo que tiene entre alrededor de 40 y alrededor de 60, o entre alrededor de 40 y alrededor de 80, o entre alrededor de 40 y alrededor de 100, o entre alrededor de 40 y alrededor de 120 carbonos .

La expresión "inyección de agua" se utiliza en la presente para hacer referencia a un proceso de recuperación de petróleo crudo en el que se bombea un fluido que contiene agua en un pozo de inyección en contacto con una formación subterránea que contiene petróleo crudo para llevar el petróleo crudo residual hacia otro pozo que también se encuentra en contacto con una formación subterránea con el propósito de producir petróleo.

La expresión "complemento de nutrientes" se refiere a la adición de nutrientes que benefician el crecimiento de microorganismos capaces de utilizar petróleo crudo como fuente de carbono principal pero que crecen en forma óptima con otros nutrientes no hidrocarburos, es decir, extracto de levadura, peptona, succinato, lactato, formato, acetato, propionato, glutamato, glicina, lisina, citrato, glucosa y/o soluciones vitamínicas.

II . Descripción Detallada La presente invención se refiere a métodos mejorados para la recuperación microbiana de petróleo que se caracteriza por la utilización de microorganismos que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que, de manera adicional, tienen una capacidad deficiente para utilizar los hidrocarburos de cadena corta aunque tienen la capacidad de convertir hidrocarburos en ácidos grasos. La última propiedad resulta útil para emulsionar el petróleo a pH alcalino.

En determinadas modalidades de la presente invención, se presentan medios para utilizar un proceso de inyección de agua microbiano alcalino para movilizar el petróleo restante en un yacimiento petrolífero. En este proceso microbiano, el contenido ácido del petróleo crudo aumenta por la degradación microbiana de los hidrocarburos a pH alcalino. Los microorganismos preferidos para este proceso son seleccionados o modificados para convertir componentes de hidrocarburos en alcoholes, aldehidos, cetonas y/o ácidos grasos que son más útiles a pH alcalino para asistir la emulsión y la dispersión de petróleo en el fluido motor de inyección en agua. Los ácidos grasos del intervalo preferido de tamaño se convierten en jabones que pueden encontrarse en la interfaz de petróleo a agua a pH alcalino. Los hidrocarburos más pequeños se convierten únicamente a alcoholes o aldehidos que no tienen un grupo carboxilo cargado negativamente tales como los ácidos grasos. Estos alcoholes de bajo peso molecular de alrededor de dos a ocho carbonos son más útiles como tensioactivos que los ácidos grasos de bajo peso molecular correspondientes. Los métodos que se presentan en la presente invención son indicados para seleccionar el intervalo preferido de tamaño de hidrocarburos modificados por el consorcio microbiano y dirigen las vías para producir los productos que resultan más beneficiosos para la emulsión de petróleo y la reducción de la tensión interfacial .

Conforme a la presente invención, determinadas vías metabólicas tales como las vías necesarias para la degradación completa de alcanos de cadena corta son seleccionadas de microorganismos presentes en un consorcio. Como resultado, el consorcio contendrá microorganismos que no solo son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, sino que también tienen una capacidad deficiente para utilizar los hidrocarburos de cadena corta (por ejemplo, de menos de alrededor de 20 carbonos, o de alrededor de 12 carbonos o menos) .

En particular, se seleccionan o se modifican las bacterias y otros microorganismos (por ejemplo, arqueobacterias) con cuidado para que tengan una capacidad deficiente de consumir los hidrocarburos de bajo peso molecular totalmente hasta la vía de ß oxidación. Los ácidos grasos que ingresan en la vía de ß oxidación mediante la conversión a acil-CoA pueden convertirse en energía para el crecimiento celular. Eric J. Steen et ál . describen un método de modificación de vías a E. coli en " icrobial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass" Nature 463,559-562 (28 de enero de 2010) doi : 10. l038/nature0872l : que se incorpora mediante esta referencia. El informe al que se hace referencia es un ejemplo de inactivación de un gen para la ß-oxidación de ácidos grasos con el fin de generar una acumulación de ácidos grasos y alcoholes para la producción de biocombustibles. Se informa que los ácidos grasos de C8-C18 se encuentran en concentraciones tan elevadas como 0.3 g/1.

Los productos de bioconversion preferidos son alcoholes de cadena corta que son útiles para reducir la viscosidad del petróleo y que funcionan como cotensioactivos en petróleo emulsionante. Se selecciona, se modifica o se controla un consorcio de microorganismos de forma tal que el cultivo microbiano depende de una fuente de carbono soluble provista por la mezcla nutriente inyectada con los microorganismos y con inyección con agua, o del bioconsumo de los hidrocarburos de elevado peso molecular presentes en el petróleo. No se disminuyen ni se eliminan en forma intencional las vías metabólicas que degradan únicamente los hidrocarburos de elevado peso molecular. Estas vías son beneficiosas debido a que el consumo de carbohidratos de elevado peso molecular provee una fuente adicional de carbono y la eliminación de petróleo de elevado peso molecular reduce la viscosidad del petróleo. La reducción de la viscosidad mejora tanto el valor como la recuperación del petróleo.

Además, la conversión de hidrocarburos de C-13 a C-40 a ácidos grasos resulta útil para la emulsión de petróleo a pH alcalino. Este espectro de ácidos grasos es lo suficientemente pequeño como para ser extraído de la gotita de petróleo y para reaccionar con el material alcalino para formar jabón mediante la pérdida de un protón. El intervalo preferido de tamaño de ácidos grasos puede ser ajustado según la temperatura, salinidad y otros factores ambientales anticipados en el yacimiento. Este ajuste puede ser realizado mediante experimentación en laboratorio al agregar diversos ácidos grasos tales como ácido hexadecanoico a muestras de petróleo del yacimiento (tal como se describe en el Ejemplo 3) y medir la tensión interfacial con el fluido motor. Además de determinar el intervalo preferido de tamaño mediante la determinación de la reducción de IFT de petróleo y fluido motor, puede analizarse petróleo con varios niveles (número de acidez definido como cantidad en mg de KOH por gramo de petróleo necesario para neutralizar el ácido) y tipos (cantidad y configuración de átomos de carbono) de ácidos grasos para la recuperación en experimentos en laboratorio de inundación de núcleo o columnas empacadas con arena. La ventaja de estos experimentos es que pueden ser utilizados para determinar en forma rápida el intervalo de tamaños para cada tipo de ácido graso o alcohol graso que será más beneficioso para la emulsión del tipo de petróleo encontrado en varios yacimientos. Además, es posible evaluar el pH y la concentración de sal para que el fluido motor sea utilizado en el proceso de recuperación de petróleo de yacimientos.

Estos intervalos de tamaño para cada tipo de hidrocarburo, que producirán el aumento más eficaz en la recuperación de petróleo en las condiciones anticipadas en la aplicación real en yacimientos petrolíferos, pueden ser utilizados para seleccionar vías metabólicas para la ubicación y la expresión de genes para las enzimas necesarias en el microorganismo huésped modificado. Entonces, los microorganismos huésped modificados pueden ser analizados en el laboratorio para determinar si pueden crecer en el tipo de petróleo encontrado en el yacimiento y aumentar el contenido de ácidos grasos del petróleo al degradarse. La conversión de las moléculas del sustrato de petróleo en ácidos grasos y alcoholes grasos puede ser determinada por cromatografía de gases del petróleo, cromatografía líquida de la fase acuosa o mediante extracción acuosa básica de los ácidos grasos del petróleo seguida de la producción de un derivado para cromatografía de gases. La espectrometría de masas directa o en combinación con cromatografía líquida o de gases también es una vía posible para analizar y cuantificar los alcoholes y ácidos grasos formados mediante degradación microbiana del petróleo. A través de estos métodos, cada cepa de microorganismos modificados puede ser evaluada para determinar su capacidad para transformar el petróleo en un número de acidez mayor que es mayor que en el petróleo nativo.

No solo aumentará el número de acidez, sino que el intervalo de tamaño de ácidos puede llevarse hasta el tamaño que es mejor para disminuir la IFT entre el petróleo y el fluido motor. Los productos ácidos pequeños que son demasiado hidrófilos como para encontrarse en la superficie petrolífera se moverían en el fluido motor hidrofílico y no serían útiles para la recuperación de petróleo. De manera adicional, podrían ser perjudiciales para reducir el pH del fluido motor. Como contrapartida, los hidrocarburos muy grandes pueden ser tan hidrofóbicos que se encontrarían en su totalidad en la fase oleosa y no contribuirían en forma eficaz al número de acidez extractable ni ayudaría a disminuir la IFT del petróleo. Por lo tanto, el petróleo que fue degradado y transformado en ácidos resultará útil para mejorar la emulsión del petróleo en condiciones alcalinas. Como consecuencia, la totalidad del petróleo restante se convertiría en un mejor objetivo para la inundación alcalina o la inundación con polímeros tensioactivos alcalinos.

Se hace referencia al proceso de recuperación de petróleo en el que el fluido motor se mantiene a un pH alcalino como inundación alcalina. Se hace referencia al proceso de recuperación de petróleo en el que el fluido motor también contiene un polímero químico y un tensioactivo químico en combinación con un fluido motor alcalino como inundación con polímeros tensioactivos alcalinos o inyección con agua ASP. La solución motriz acuosa es un químico alcalino tal como bicarbonato, carbonato o hidróxido de sodio. El químico alcalino reacciona con los compuestos ácidos en el petróleo crudo y produce el tensioactivo in situ. La reducción de IFT representa el mecanismo principal de emulsión de petróleo. El proceso es complejo debido a varias reacciones con los fluidos y las rocas almacén. Las interacciones adversas con la roca almacén pueden ser minimizadas mediante el uso de químicos de pH alcalino moderado, tales como bicarbonato y carbonato de sodio. Cuando este proceso se combina con las formulaciones químicas adicionales de un polímero químico y tensioactivo químico (ASP) agregado, los principales mecanismos de recuperación son tanto la reducción de IFT como la mejora de la relación de movilidad. Ambos métodos requieren que el petróleo del yacimiento tenga un número de acidez de 0.5 o superior para que sean económicamente eficaces. J. Xie, B. Chung, L. Leung informaron una descripción más detallada de la inundación alcalina para EOR en Simposio internacional de petróleo pesado y operaciones térmicas de la Society of Petroleum Engineers realizado en Calgary, Alberta, Canadá, 20-23 de octubre de 2008 y se encuentra disponible en la SPE como la publicación SPE/PS/CHOA 117221 PS2008-323.

Además de transformar el petróleo nativo en uno de mayor contenido ácido, especialmente del tipo de ácidos (hasta cierto grado, soluble tanto en el petróleo como en la fase acuosa y que tiene tanto una región lipofílica como una región hidrofílica) más adecuado para la formación de jabones durante una inundación alcalina o con ASP, otra modalidad representa el aumento del contenido ácido del petróleo nativo simultáneamente al desarrollo del proceso alcalino. Durante el proceso alcalino, los microorganismos alcalófilos crecen en la superficie del petróleo y producen el espectro de ácidos grasos que asisten la emulsión del petróleo. Dado que esto ocurre en la otra superficie del petróleo líquido, pueden formarse pequeñas gotitas de petróleo y emulsionarse en el agua alcalina. Este proceso expone, entonces, una nueva superficie de petróleo a los microorganismos que crecen. De esta forma, los alcalófilos pueden colocarse sobre el petróleo más rápidamente a medida que el agua alcalina elimina las gotitas de petróleo. Cuanto más rápido conviertan los hidrocarburos en ácidos grasos, más rápidos son los microorganismos para emulsionar toda la capa de petróleo. Por lo tanto, un microorganismo que puede crecer rápidamente a pH alcalino recuperará más petróleo y a una velocidad mayor que un microorganismo que debe convertir hidrocarburos en ácidos grasos a pH neutro, seguido de una inundación alcalina.

Además de facilitar la emulsión de jabones a partir de los ácidos grasos a pH alcalino, el pH elevado también actúa para interrumpir o eliminar el crecimiento de microorganismos nativos. Frecuentemente, los microorganismos que se han adaptado a entornos extremos tales como con pH elevado y concentraciones elevadas de sal han evolucionado con cambios significativos en sus secuencias de aminoácidos. Las enzimas alcalófilas y haloalcalófilas son significativamente más en los aminoácidos cargados negativamente y menos en el aminoácido lisina cargado positivamente, lo que ayuda a prevenir la adquisición de genes para enzimas de utilización de petróleo de cadena ligera.

Si los microorganismos inoculados carecían de determinados genes no deseados, pero eran similares a los microorganismos nativos, podían captar genes no deseados de los microorganismo nativos. Incluso si el cultivo modificado fuera contundente y creciera con rapidez podría adquirir genes que codificaran el metabolismo de petróleo de bajo peso. Esto podría ocurrir mediante el proceso de transferencia genética lateral (LGT) , de la que se sabe que ocurre en muchos entornos naturales. Captar tales genes daría a los microorganismos una ventaja competitiva o evolucionaría, y dominarían pronto la población.

Al utilizar microorganismos o fluidos alcalinos que prefieren condiciones alcalinas, esta invención provee un medio para prevenir la LGT de forma tal que el cultivo seleccionado o modificado de microorganismos con las propiedades deseadas no adquiere vías perjudiciales o no deseadas para mejorar la producción de petróleo. La transferencia genética lateral es usual entre bacterias y arqueobacterias como un mecanismo para compartir información genética entre diferentes especies. Se cree que representa un rol importante en la evolución y se sabe que ocurre en organismos superiores. La prevención de la LGT es una parte importante de la implementación exitosa de los microorganismos modificados.

Al prevenir el metabolismo del petróleo ligero, también se previene el correspondiente aumento de viscosidad ocasionado por la eliminación de fracciones de petróleo ligero. Tal como ya se mencionó, cuanto más elevada es la viscosidad del petróleo, menor será la recuperación. Los efectos beneficiosos de los microorganismos, tales como la reducción de la IFT, el aumento de la eficiencia del barrido y la mejora de la relación de movilidad podrían ser anulados por el aumento de la viscosidad. Sin embargo, si los microorganismos únicamente pueden consumir petróleo pesado u otras fuentes de carbono, puede evitarse el efecto más perjudicial. Esto hace que el procesos de MEOR de la presente invención sea más predecible y más eficaz.

El uso de un microorganismo haloalcalófilo o alcalófilo obligado, o resistente a la alcalinidad, requiere que se eliminen determinados genes de un microorganismo a pH neutro o no alcalófilo, o que se modifique la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína que codifique. Estos cambios son necesarios para que las proteínas sean funcionales a pH más elevado. Estos cambios necesarios pueden ser determinados mediante análisis de proteínas homologas que se encuentran tanto en microorganismos a pH alcalino como a pH neutro. Adicionalmente , pueden emplearse análisis estructurales tridimensionales para determinar residuos cargados positivamente en la superficie, como la lisina, que pueden ser cambiados a residuos aminoácidos cargados negativamente, tales como el ácido aspártico. Este tipo de cambios de residuos de aminoácidos resultará en un aumento de carga negativa que es generalmente beneficioso para la funcionalidad a pH elevado y con gran cantidad de sal. Es posible realizar una gran cantidad de cambios potencialmente beneficiosos y luego analizarlo mediante la expresión en un modelo alcalófilo o haloalcalófilo tal como Natronobacterium magadii y N. gregoryi .

El estudio de la biodegradacion de hidrocarburos ayuda a comprender el mecanismo de metabolismo de alcanos de cadena corta. Generalmente se tornan solubles los alcanos de cadena más corta en agua junto con tensioactivos producidos por las bacterias o arqueobacterias . Luego, el alcano soluble se adsorbe en la membrana hidrofóbica de la célula y es transportada a través de la membrana del microorganismo. Las enzimas de la membrana convierten el alcano en alcohol. Reacciones químicas posteriores catalizadas por otras enzimas convierten el alcohol en un aldehido y luego en un ácido orgánico, al que también se hace referencia como ácido graso. Entonces, el ácido graso puede ser metabolizado adicionalmente por la célula para obtener energía y bloques de construcción para su crecimiento. La biología del metabolismo de los alcanos de cadena corta es la más estudiada y más comprendida. El metabolismo de hidrocarburos más grandes o de peso molecular más elevado es más complejo y menos comprendido. Los hidrocarburos más grandes o de mayor peso son mucho menos solubles y más difíciles de transferir a través de la membrana celular. Sin embargo, se sabe que la biodegradacion de petróleo de elevado peso molecular ocurre, pero a una velocidad menor. J.D. Van Hamme, A. Singh y 0. Ward plantean una descripción más detallada de la degradación biológica en Microbiology and Molecular Biology Reviews, diciembre de 2003, págs . 503-549, Vol . 67, n.° 4, DOI : 10.1128/M BR.67.4.503-549.2003. Esta invención depende de que los microorganismos modificados o seleccionados retrasen el metabolismo de los alcanos de cadena ligera. La modificación preferida implica detener la conversión de alcanos en el intervalo de dos a ocho carbonos en el alcohol correspondiente de dos a ocho carbonos, y transferirlo a la interface petróleo-agua donde puede actuar para reducir la viscosidad del petróleo y actuar como cotensioactivo.

En determinadas modalidades de los métodos de la presente invención, se inhiben los genes que codifican proteínas en la vía de alcano hidroxilasa, que son capaces de degradar hidrocarburos de baja viscosidad y bajo peso, por ejemplo, son eliminados, mutados o disminuidos en el microorganismo seleccionado o modificado. Adicionalmente , se evita la LGT del entorno debido a que las enzimas nativas son menos activas a pH más elevado. Es decir, no es probable que la adquisición de genes similares que codifican la degradación de petróleo de mejor peso de otros microorganismos de pH neutro ocurra al pH elevado de los microorganismos alcalinos. Sin embargo, no se evita la producción de tensioactivos , cotensioactivos u otros metabolitos, la cual es beneficiosa para la movilización del petróleo. Se mantiene la expresión de genes necesarios para la producción de tensioactivos sin el consumo del petróleo de baja viscosidad.

Diferentes conjuntos de genes codifican cada vía metabólica diferente que hace posible que los microorganismos utilicen los hidrocarburos como una fuente de energía. Generalmente, la degradación y el consumo de hidrocarburos de peso molecular más elevado son permitidos por diferentes genes que los que codifican las vías metabólicas de cadena ligera. Los genes que codifican las enzimas necesarias para la degradación de hidrocarburos y los genes para la producción de tensioactivos pueden ser regulados por los mismos promotores. Sin embargo, no es posible mover y separar cada conjunto de genes con la tecnología de biología molecular actual de forma que puedan ser controlados independientemente .

Las enzimas que degradan los hidrocarburos tienen diferentes especificidades de sustrato. La primera etapa de degradación de alcanos es la oxidación de cualquiera de los carbonos terminales o de un carbono interno para formar un alcohol primario o secundario. Las monooxigenasas son un tipo de enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo de hidrocarburos y tienen sitios de unión que demuestran preferencia o especificidad por alcanos de cadena lineal de diferentes longitudes. Además, existen monooxigenasas que oxidarían hidrocarburos aromáticos de diferentes tamaños. Muchos de los genes han sido aislados y se han caracterizado sus secuencias. Muchos otros aún no han sido aislados, pero se espera que tengan secuencias similares y diferentes especificidades. Es posible obtener nueva información genética a partir de microorganismos que habitan en los sitios petrolíferos con sondas para genes en regiones muy conservadas de las secuencias proteicas de enzimas clave y de secuencias que determinan la especificidad por el sustrato.

En la actualidad, se encuentra disponible información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de muchas monooxigenasas que degradan hidrocarburos de petróleo de diferentes tipos y tamaños, y se han identificado regiones muy conservadas. Se han identificado regiones muy conservadas de las secuencias proteicas necesarias para la actividad catalítica. Otras son específicas para el sustrato y variarán conforme al tamaño y al tipo de hidrocarburo que oxidan. Por ejemplo, los 8 residuos aminoácidos de histidina que son necesarios para la actividad catalítica en todas las alcano monooxigenasas se encuentran en tres bloques de histidina (Histl, HE [L/M] XHK (SEQ ID NO: 8); Hist2, EHXXGHH (SEQ ID NO: 9); and Hist3, LQ H [S/A] DHHA (SEQ ID NO: 10)) informadas por J. B. van Beilen et ál en Applied and Environmental Microbiology, diciembre de 2002, págs . 5933-5942, Vol . 68, n.° 12, DOI 10.1128/AEM.68.12.5933-5942.2002. Esta información puede ser utilizada para buscar microorganismos en un entorno que puede degradar varios hidrocarburos . Pueden llevarse a cabo la secuenciación de muestras ambientales e identificarse nuevos genes de oxigenasa mediante la homología de secuencia de ADN. Es posible utilizar sondas de los sitios altamente conservados para aislar genes que codifican monooxigenasas que existen en los microorganismos que habitan los sitios que contienen petróleo y compuestos alcalinos. Por ejemplo, H. Al-Awadhi et ál. aislaron los microorganismos que utilizan hidrocarburos alcalófilos y halófilos de áreas intermareales alcalinas oleosas de las costas de Kuwait en Applied Microbiol Biotechnology (2007) 77:183-186. Análisis adicional basado en las secuencias de los sitios específicos para el sustrato pueden identificar genes que codifican el uso de hidrocarburos de mayor peso molecular a pH elevado.

Aunque es más lenta que la utilización de cadena ligera, la degradación de hidrocarburos de cadena pesada puede proveer una fuente adicional de carbono sin perjudicar la viscosidad o el valor del petróleo. Se han aislado microorganismos que solamente pueden crecer en componentes de petróleo pesado. Se ha demostrado que ellos tienen genes que codifican enzimas específicas para determinados hidrocarburos pesados y que carecen de los genes para utilizar los alcanos de cadena corta más livianos. Por ejemplo, L. Wang et ál . informaron haber aislado Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 de un yacimiento subterráneo de petróleo en el norte de China que degrada y metaboliza únicamente n-alcanos de cadena larga (C15-C36) , pero no n-alcanos de cadena corta (C8-C14) . Se depositó la secuencia completa del genoma de G. thermodenitrificans NG80-2 en la base de datos GenBank y se incorpora con la correspondiente publicación en Proc Nati Acad Sci USA, 27 de marzo de 2007 pág. 5602-5607 mediante esta referencia. Es posible realizar una comparación de las secuencias de proteínas para identificar sondas y secuencias de sustrato específicas que pueden ser producidas para los genes de alcano monooxigenasas de cadena corta o larga. Estas sondas pueden ser utilizadas para analizar ADN aislado de un yacimiento de petróleo o sitio específico. Mediante este y otros métodos de microbiología, es posible identificar los microorganismos que son responsables de la degradación de petróleo ligero y pesado en un yacimiento. Por ejemplo, al buscar la secuencia proteica LadA, una alcano monooxigenasa larga, a partir de termófilos y no halófilos, Geobacillus thermodenitrificans NG80-2, en GenBank, una secuencia proteica con 49 % de identidad con LadA con la mayoría de los residuos aminoácidos en el sitio de reacción putativo y un sitio de unión a flavina idéntico a los residuos de aminoácidos encontrados en Halalkalicoccus jeotgali (DSMZ 4425) , que es alcalófilo y halófilo. Otra secuencia proteica hipotética del genoma de Halorubrum lacusprofundi (ATCC 49239) , que se informa es halófilo pero no alcalófilo, también es 49 % idéntica en secuencia proteica y casi idéntica en el sitio activo putativo a la monooxigenasa encontrada en G. thermodenitrificans NG80-2. Al comparar secuencias de proteínas homologas de ambientes de pH alcalino a ambientes neutros, es posible predecir cambios en los residuos aminoácidos de la superficie que adaptarán las proteínas para pH óptimos más elevados. Este tipo de información de secuencia puede ser utilizada para realizar modificaciones a los aminoácidos para lograr que las enzimas de baja concentración de sal y pH neutro sean funcionales ya sea a pH elevado o a pH elevado y elevadas concentraciones de sal. Cada una de las secuencias modificadas puede ser expresada como nuevas enzimas que pueden ser analizadas para determinar su pH óptimo y su solubilidad salina.

Además de hidrocarburos de elevado peso molecular, el petróleo contiene compuestos que no se desearía encontrar en el petróleo a ser refinado para obtener varios productos petrolíferos. Un grupo amplio de compuestos no deseados es el de hidrocarburos modificados con elevada cantidad de azufre. El azufre puede ser el tercer elemento más abundante en petróleo crudo y se encuentra en cantidades especialmente elevadas en el petróleo pesado. Disminuir el contenido de azufre aumentaría el valor del petróleo pesado. Se han aislado bacterias capaces de atacar en forma selectiva los enlaces C-S y se han dilucidado sus vías metabólicas. La mayoría de las cepas estudiadas fueron cultivadas en forma aeróbica e incluyen: Rhodococcus erythropolis, Nocardia spp., Agrojacterium s . cepa MC501, Mycobacterium spp., Gordona sp. cepa CYKS1, Klebsiella spp., Xanthomonas spp. y el termófilo Paenibacillus . Se ha demostrado que estas bacterias son eficaces para la desulfuración de diversos hidrocarburos que contienen azufre encontrados en el petróleo crudo. Sin embargo, el proceso es un sistema de agua y petróleo de dos etapas que requiere tensioactivos y mezcla con gran consumo de energía. Para lograr una tasa de eliminación de azufre que supere el 50 %, fueron necesarias cantidades elevadas de agua respecto al petróleo en reactores con buena aireación y buena capacidad de mezcla. Los aspectos importantes del proceso incluyen el diseño del reactor, la recuperación del producto y la separación de petróleo y agua, Otro grupo de hidrocarburos no deseados son los compuestos nitrogenosos . El petróleo crudo puede contener alrededor de 0.5 % a 2.1 % de nitrógeno con 70 % o más en forma de compuestos no básicos de carbazol, índoles y pirrólos. Estos compuestos son venenosos para los catalizadores de craqueo, son tóxicos y tienen como consecuencia la contaminación del aire. Eliminar los compuestos nitrogenosos aumentaría el valor del petróleo recuperado mediante el proceso de MEOR. Se han aislado varias especies de bacterias que contienen vías metabólicas para la transformación oxidativa de los compuestos nitrogenosos que se encuentran en el petróleo crudo. Kaiser, J. P. et ál . publicaron una reseña de estos procesos bacterianos en Microbiol . Rev. 60:483-498. Se identificaron los genes responsables de la degradación de carbazol mediante la cepa CA10 de Pseudomonas sp. y fueron clonados en E. coli por Sato et ál .. Se informó que transformaron una amplia gama de compuestos aromáticos. Se publicaron los resultados en J. Bacteriol. 179: 4841-4849 en 1997.

La adaptación alcalina de las enzimas necesarias para las vías de desulfuración o de denitrogenación puede ser llevada a cabo para hacer las proteínas funcionales en un entorno de pH elevado del alcalófilo huésped. Su incorporación a un cultivo diseñado para la recuperación de petróleo también puede reducir el contenido de azufre o de nitrógeno del petróleo recuperado. Sin embargo, dado que estos son procesos oxidativos, es importante que se eliminen los genes responsables del metabolismo de cadena ligera de forma que los alcanos de cadena corta no se degraden rápidamente .

Muchos microorganismos que utilizan hidrocarburos también pueden utilizar fuentes de carbono solubles y simples. Por lo general, cuando la concentración de una fuente de carbono simple es lo suficientemente alta, disminuye la expresión de todos los genes necesarios para la utilización de hidrocarburos. Algunos ejemplos de fuentes de carbono solubles comprenden azúcares sencillos, glicerina, almidón, ácidos grasos y otras moléculas orgánicas. Esta es una forma de prevenir la utilización de aléanos de cadenas cortas siempre que se mantengan concentraciones elevadas de fuentes de carbono simples. Si el microorganismo receptor o huésped, modificado para el entorno del yacimiento de petróleo, no contiene las vías adecuadas para la utilización de fuentes de carbono solubles económicas, los genes necesarios para las vías podría ser transferidos al microorganismo huésped.

Es decir, al proveer niveles suficientes de una fuente de energía y de carbono soluble para mantener células vivas y el crecimiento celular, los microorganismos nativos pueden no depender del metabolismo de hidrocarburos aléanos para su crecimiento y supervivencia. Esto podría llevar a la disminución y la baja expresión de genes, o incluso a la pérdida de los genes que codifican enzimas que producen metabolitos útiles, tales como tensioactivos que emulsionan los hidrocarburos no solubles.

Por lo tanto, debe proveerse un medio para mantener una expresión génica elevada y niveles elevados de determinadas proteínas. Esto puede llevarse a cabo mediante una variedad de técnicas biológicas que incluyen, de modo no taxativo, los genes que codifican cada uno de los productos metabólicos, tales como de producción de tensioactivos, sean controlados por un promotor constitutivo o inducible. Ello permite la expresión elevada tanto de la transcripción como de la traducción de estos genes, lo que provee medios para prevenir una disminución que puede ocurrir con el promotor de tipo natural cuando la célula detecta un nivel elevado de una fuente de carbono preferida o de metabolización más sencilla. En los procesos de MEOR que utilizan únicamente cultivos de origen natural de microorganismos que consumen petróleo en combinación con microorganismos nativos presentes en el yacimiento de petróleo, la adición de demasiada cantidad de una fuente de carbono simple, tal como melaza, podría causar una reducción de la producción de tensioactivos y, de forma inesperada, menor emulsión de petróleo.

El problema de depender de procesos microbianos de origen natural es que la degradación del petróleo y la recuperación del petróleo se vuelven menos eficientes cuando se suministra una fuente de energía y de carbono fácilmente metabolizada, tal como la melaza. Sin embargo, si no se suministrara una fuente de carbono simple, el crecimiento podría enlentecerse y podría también resultar en una baja producción de petróleo. Además, la falta de una fuente de carbono seleccionará las cepas de microorganismos que pueden utilizar los hidrocarburos existentes en el yacimiento de petróleo. Asimismo, los microorganismos que tienen genes que les permiten consumir petróleo ligero crecerán y se multiplicarán más rápidamente que cualquier otro microorganismo, agregado o nativo, que únicamente contenga genes para el consumo de petróleo pesado. Por lo tanto, es mejor proveer fuentes de carbono adecuadas para las cepas modificadas o seleccionadas, para que puedan crecer lo suficientemente rápido para prevalecer sobre las cepas nativas que tienen la capacidad de metabolizar alcanos de cadena corta.

Los promotores génicos contienen secuencias de ADN específicas y elementos de respuesta que son reconocidos por proteínas conocidas como factores de transcripción. Estos factores unen las secuencias promotoras con AR polimerasa, la enzima que copia o transcribe el gen codificado en el ADN en un ARN mensajero (ARNm) . Entonces, el ARNm puede migrar hacia un ribosoma donde se traduce en un producto génico o proteico .

La represión génica y la inhibición de la expresión se refieren a cualquier proceso que resulta en una disminución en la producción de un producto génico, ya sea mediante un proceso reversible o irreversible. Un producto génico puede ser tanto AR como una proteína. La represión génica incluye los procesos que disminuyen la transcripción de un gen y/o la traducción de AR m. Por ejemplo, un proceso que inhibe la formación de un complejo de inicio de transcripción o aquellos que disminuyen las velocidades de transcripción o aquellos antagonistas de que la activación transcripcional es represión génica.

Un promotor inducible es uno controlado o regulado por algún factor extracelular que puede aumentar o disminuir la transcripción y la traducción de genes en sus productos. En un ejemplo específico de degradación de n-alcanos, los genes alk de Pseudomonas oleovorans son responsables de la degradación de n-alcanos. Estos genes se ubican en dos grupos de genes controlados por un promotor controlado por la proteína AlkS . Esta proteína responde al hidrocarburo octano. La presencia de octano aumenta o activa la expresión de estos genes y de sus productos proteicos. Sin embargo, la presencia de una fuente de carbono preferida, como ácidos orgánicos, disminuye o elimina la presencia de este mismo promotor. Estas bacterias emulsionarían y degradaría n-alcanos a menos que se proveyeran niveles elevados de una fuente de carbono preferida. En este caso, los genes para la degradación de hidrocarburos estarían apagados. EÍsto limitaría la utilidad de los microorganismos para recuperar sitios contaminados con hidrocarburos y podría volverse menos eficaz para degradar hidrocarburos si se presentaran fuentes de carbono más fácilmente metabolizadas . Sin embargo, al inactivar la disminución del promotor por fuentes de carbono preferidas y la inactivación de genes del grupo que son necesarios para el metabolismo de alcanos, este microorganismo puede ser modificado como una bacteria que emulsiona petróleo que puede crecer en fuentes de carbono solubles.

La mutación de la secuencia de la proteína AlkS que une la fuente de carbono de forma que no afecte el sitio de unión del octano representa un medio para la inactivación de la disminución por una fuente de carbono soluble simple. Otro método es la modificación de genes que codifican que la vía de producción de tensioactivos o biopolímeros sea controlada por un promotor diferente. Esto provee una vía de control de la producción de tensioactivos o biopolímeros que no depende de la fuente de carbono.

Al mantener el crecimiento en un medio que contiene una fuente de carbono soluble, los genes que codifican el metabolismo de hidrocarburos alcanos de cadena corta pueden ser inactivados por una variedad de medios. Los métodos adecuados para inactivar estos genes incluyen, de modo no taxativo, mutágenos químicos y UV y otras formas de radiación. De manera adicional, es posible reemplazar los genes funcionales con genes no funcionales. La tecnología de silenciamiento génico, desarrollada por A. Fire et ál . , Nature 391 (6669) : 806-11 (1998), ha ayudado a comprender mejor cómo los genes regulan el funcionamiento celular en mamíferos. Estos métodos de inactivación de genes específicos pueden ser utilizados para ubicar genes clave responsables de cualquier proceso metabólico que sea llevado a cabo por una célula o microorganismo. Además, si no se encontraran en el dominio público las secuencias genómicas completas de los microorganismos seleccionados para petróleo mejorado, puede secuenciarse fácilmente el genoma completo con la tecnología actual a un costo bastante bajo.

Puede utilizarse un gen funcional para reemplazar otro gen funcional. El nuevo gen también puede incluir un gen indicador para seleccionar fácilmente los microorganismos que contienen el nuevo gen. Por ejemplo, puede insertarse un grupo funcional de genes que codifica una vía metabólica de hidrocarburos de elevado peso molecular en una célula hospedadora. Podría reemplazar un grupo de genes para una vía metabólica de hidrocarburos de bajo peso molecular .que fue eliminada o inactivada. De manera adicional, puede darse a la célula un gen de resistencia para un antibiótico u otra toxina. Este es un método comúnmente utilizado para seleccionar células que han incorporado con éxito nuevo material genético. Entonces, es posible cultivar las células seleccionadas hasta obtener grandes cantidades con técnicas de fermentación a gran escala conocidas por los expertos en la técnica de biotecnología.

Sin embargo, existe un problema potencial con la eliminación de los genes del metabolismo de alcanos de cadena corta. Los genes que codifican el metabolismo de hidrocarburos de cadena ligera pueden encontrarse en grupos con los genes necesarios para producir metabolitos útiles, tales como tensioactivos para la emulsión del petróleo. Dado que los tensioactivos son secretados para asistir la transferencia de alcanos de cadena corta a través de la membrana celular, pueden combinarse con genes que metabolizan alcanos o controlados por el mismo promotor. En ese caso, el aumento de metabolitos útiles y la disminución del metabolito de cadena ligera pueden requerir manipulación génica más compleja. Es decir, no debería inactivarse la totalidad del grupo de genes relacionados al consumo de alcanos, sino las enzimas clave para el metabolismo de alcanos de cadena corta.

Un problema que puede prevenir el éxito de este enfoque es que los genes que codifican la emulsión de hidrocarburos del petróleo, que beneficia la recuperación de petróleo, no resultan beneficiosos para los microorganismos si el petróleo no es consumido por las bacterias. Además, si el cultivo bacteriano tiene una fuente de carbono preferida en el fluido de inyección con agua, se perderían rápidamente los genes para la producción de tensioactivos. Por lo general, una población microbiana portaría únicamente los genes necesarios para prosperar en un entorno determinado. Si esos genes no fueran necesarios, se perderían pronto. Es por ello que los nutrientes, especialmente la fuente de carbono, debe ser controlada detenidamente si el proceso depende únicamente de la recuperación de petróleo de pozos mediante microorganismos de tipo natural. Por lo tanto, deben darse algunas ventajas a los microorganismos modificados para que sobrevivan más en el entorno del yacimiento de petróleo. Los microorganismos modificados que únicamente pueden metabolizar petróleo de peso molecular elevado o producir tensioactivos para emulsión de petróleo deben tener una ventaja competitiva respecto a los microorganismos nativos que pueden metabolizar alcanos de cadena corta.

Presentar microorganismos con genes útiles para la recuperación mejorada de petróleo de yacimientos subterráneos, arenas impregnadas con brea, arena petrolífera y otras fuentes de petróleo pesado al tiempo que se elimina el consumo de la parte más ligera del petróleo es el objetivo de esta invención. De manera adicional, es el objetivo de esta invención dar al organismo receptor o huésped de estos genes una ventaja competitiva para el ambiente especialmente modificado del yacimiento de recursos hidrocarburos. Los genes aislados de bacterias y arqueobacterias nativos de los yacimientos de petróleo o de filtraciones de petróleo de origen natural que proveen mecanismos beneficiosos para la recuperación mejorada y que se modifican y se expresan en niveles elevados en microorganismos huésped. Los microorganismos huésped son seleccionados por su supervivencia en el entorno extremo de un yacimiento de petróleo. Se provee a los microorganismos huésped una ventaja selectiva para el entorno del yacimiento. En la presente invención, y en un caso específico, la ventaja selectiva es tolerancia a pH elevado. Adicionalmente , tal como se discutió anteriormente, los microorganismos utilizados en los métodos de la presente invención tienen una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta, pero tienen la capacidad de convertir hidrocarburos en ácidos grasos que pueden ser útiles para la emulsión de petróleo a pH alcalino. Además, los microorganismos modificados pueden tener la capacidad de utilizar una fuente de carbono y/o energía especial provista en el fluido de inyección con agua. Los genes que codifican el consumo de componentes de petróleo tóxicos o petróleo pesado también son beneficiosos tanto para los microorganismos como para el proceso de recuperación de petróleo. Estos genes beneficiosos pueden ser conservados o transferidos a los microorganismos modificados.

En la solicitud estadounidense pendiente de n.° de serie 12/869,647, publicada el 24 de marzo de 2011 como la publicación de la solicitud estadounidense n.° 20110067856, cuya descripción se incorpora en forma expresa en su totalidad en la presente mediante esta referencia, se describen métodos diseñados para detener o reducir el consumo de petróleo ligero beneficioso para el consorcio de microorganismos que se utiliza para producir tensioactivos y otros metabolitos beneficiosos para la producción mejorada de petróleo. La publicación de la solicitud estadounidense n.° 20110067856 también divulga microorganismos que, además de tener una capacidad deficiente para degradar hidrocarburos de cadena corta de alrededor de 12 carbonos o menos , son capaces de crecer en un ambiente con salinidad elevada y métodos y medios para su selección y su preparación mediante técnicas de modificación genética.

De acuerdo a una modalidad, el consorcio utilizado en los métodos de la presente invención incluirá bacterias que tendrán, además, la capacidad de vivir y crecer en un entorno de salinidad elevada.

Se implementa la tecnología de la presente invención mediante la inoculación de un yacimiento de petróleo con un cultivo de uno o más microorganismos que contienen, cada uno, combinaciones de genes para los diversos mecanismos beneficiosos para la producción mejorada de petróleo. Los métodos de la presente invención permiten una amplia variedad de diseños y, por lo tanto, puede diseñarse una combinación de mecanismos para un tipo particular de yacimiento. Adicionalmente , puede proveerse un medio para controlar y mantener la expresión elevada de estos genes. En determinadas modalidades, la presente invención provee, junto a los microorganismos, el componente químico para crear el entorno adecuado para que los microorganismos que también elimina los microorganismos nativos que pueden consumir el petróleo movilizado, especialmente los alcanos de cadena corta.

En este ejemplo, se inocula un cultivo de microorganismos que necesita pH elevado en un fluido alcalino de inyección con agua, tal como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio o hidróxido de sodio, utilizado para recuperar petróleo. En la industria petrolera, este proceso es conocido como método de recuperación de petróleo y usualmente se combina con polímeros y tensioactivos en un proceso conocido como inundación con polímeros tensioactivos alcalinos (ASP) . Hsu et ál . informan una descripción más detallada de este proceso en la patente estadounidense n.° 6,022,834, que se incorpora en la presente mediante esta referencia .

Es probable que el aumento del nivel de alcalinidad en el yacimiento resulte tóxico para los microorganismos nativos, pero se prefiere el pH para el cultivo de microorganismos seleccionados o modificados inoculados. En el modo preferido, se inhibirán o eliminarán los organismos nativos que pueden consumir petróleo ligero o producir sulfuro de hidrógeno. Por lo tanto, los nutrientes agregados beneficiarán únicamente el crecimiento de los microorganismos diseñados/procesados y no el crecimiento de los microorganismos nativos perjudiciales. En la modalidad preferida, los microorganismos inoculados crecerán rápidamente al pH alcalino del proceso y producirán ácidos grasos a partir del petróleo y otras fuentes de carbono que emulsionarán el petróleo residual a pH alcalino. A medida que el fluido motor emulsiona y barre el petróleo, nuevas superficies de petróleo se ven expuestas a los microorganismos alcalinos.

De manera adicional, o como alternativa, a la manipulación genética, es posible lograr el control de las vías metabólicas en los microorganismos mediante el uso de compuestos químicos que afectan la función de una o más de las enzimas en las vías metabólicas. Dado que es difícil manipular la constitución genética de los microorganismos nativos presentes en un yacimiento de petróleo al momento de la inoculación con microorganismos modificados, preferentemente, las vías metabólicas de los microorganismos nativos son controladas por inhibidores químicos que se discuten más adelante. (1) Aislamiento y selección de los genes de recuperación de petróleo que codifican proteínas y vías para MEOR Se han aislado e informado más de 100 microorganismos que degradan petróleo. Muchos han sido estudiados y se han publicado las secuencias de los genes relacionados a diversas funciones del proceso de degradación de petróleo. En algunos casos, por ejemplo, Alcanivorax borkumensis SK2 , se ha secuenciado y publicado (Schneiker S et ál . , "Genome sequence of the ubiquitous hydrocarbon-degrading marine bacterium Alcanivorax borkumensis.", Nat Biotechnol, agosto de 2006, 24 (8) : 997-1004) el genoma completo de 3,120,143 pares de bases (bp) , y se encuentra disponible en la base de datos de NCBI Genome Project Datábase (NC_008260; GenBank AM286690) . A. borkumensis SK2 es una bacteria marina que utiliza hidrocarburos de petróleo como fuente exclusiva de energía y de carbono, y que crece en forma predominante en alcanos y en algunas ocasiones se convierte en el microorganismo dominante que puede representar hasta el 80 % de la comunidad microbiana en un entorno contaminado con petróleo. Las bacterias del género Alcanivorax pertenecen a un grupo más grande de bacterias hidrocarbonoclásticas que también incluye los géneros Cyclolasticus, Marinobacter, Neptunomonas, Oleiphilus, Oleisprira y Thalassolituus . Estas bacterias son capaces de metabolizar tanto hidrocarburos alifáticos como hidrocarburos aromáticos, y representan una buena fuente de genes involucrados en las vías de utilización de hidrocarburos .

Dado que la secuenciación genómica es rápida y económica, se encuentran disponibles los genes bacterianos y sus roles en la degradación de hidrocarburos, producción de tensioactivos y regulación génica. Las bases de datos tales como GenBank, Swiss Prot y otras proveen datos de las secuencias genómicas de estos microorganismos que degradan hidrocarburos. Se pueden realizar búsquedas en estos datos con programas informáticos como BLASTX y BLASTN en el National Center for Biotechnology Information. Además, puede utilizarse la amplificación por PCR basada en sondas con secuencias complementarias de las secuencias de enzimas muy conservadas, de las que se sabe que son necesarias para la degradación de hidrocarburos, para aislar y caracterizar genes homólogos de nuevos microorganismos de sitios contaminados con petróleo y yacimientos de petróleo. Esto puede ser llevado a cabo para analizar el cambio en la secuencia proteica que ha evolucionada para adaptarse a diferentes entornos. Tales métodos representarían una vía útil para encontrar modificaciones en secuencias enzimáticas que evolucionaron como una adaptación al entorno específico. Por ejemplo, los microorganismos aislados de un sitio hidrocarburo y alcalino podrían contener enzimas que podrían degradar hidrocarburos a pH elevado. Estas secuencias enzimáticas podrían ser comparadas a las enzimas homologas que actúan en un entorno neutro para comprender cómo modificar la secuencia de proteínas de microorganismos de pH neutro para que actúen en microorganismos alcalófilos.

En el caso de A. borkumensis SK2 , se han identificado varios grupos de genes que requieren la degradación de alcanos grandes de hasta 32 carbonos de longitud y la degradación de alquilcicloalcanos y compuestos alifáticos ramificados. Parte de este proceso de metabolismo de hidrocarburos es la producción de tensioactivos para la emulsión de varios tipos de hidrocarburos. En el caso de hidrocarburos de menor peso molecular o más pequeños, la emulsión asiste la transferencia del hidrocarburo a través de la membrana celular de forma que pueda ser metabolizada . Por lo tanto, este grupo de genes incluye genes útiles para la movilización de petróleo que podría ser transferido a un microorganismo huésped. También contiene genes no deseados, tales como los genes que codifican las proteínas necesarias para transferir alcanos pequeños a la célula para su ruptura adicional y su consumo. De acuerdo con la presente invención, los genes no deseados no son transferidos a un microorganismo huésped o son inactivados o eliminados. Los genes necesarios para el metabolismo de alcanos mayores o alquilcicloalcanos o hidrocarburos aromáticos policíclicos serían candidatos para ser transferidos a microorganismos huésped.

Es posible eliminar o modificar las enzimas que oxidan alcanos de cadena corta hasta ácidos grasos tales como alcohol deshidrogenasa o aldehido deshidrogenasa . Esta vía podría ser detenida en el alcohol o aldehido, o podría enlentecerse para proveer alcoholes de cadena corta como cotensioactivos . De manera alternativa, es posible eliminar los genes para toda la vía de hidrocarburos de cadena corta con el fin de prevenir la reducción de la viscosidad del petróleo mediante la eliminación de alcanos pequeños. En el modo preferido, se modifica un alcalófilo o haloalcalófilo obligado para que actúe como huésped. Se provee al alcalófilo huésped los genes necesarios para la degradación de todos los componentes de petróleo cuya conversión sería beneficiosa en los ácidos y alcoholes más útiles para la reducción de la IFT y la emulsión del petróleo residual del yacimiento. El microorganismo huésped también puede requerir una fuente de energía y de carbono soluble para mantener el crecimiento, para compensar el metabolismo más lento de estos hidrocarburos más grandes y recalcitrantes, y la falta de ácidos grasos pequeños a ser utilizados.

Muchos microorganismos que degradan petróleo son fuentes útiles de genes que codifican proteínas para producir productos para la movilización de petróleo. En un ejemplo, las células pueden secretar uno o más biotensioactivos para asistir la emulsión de las gotitas de petróleo de forma que el petróleo pueda ser absorbido a través de la pared celular. Se han utilizado varias cepas de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis para producir un lipopéptido llamado surfactina a escala comercial. Este lipopéptido también es útil como emulsionante y como antibiótico. Tal como lo describieron Cooper et ál. en 1981, Appl . Environ. Microbiol. 42:408-412, by Javaheri et al. in 1985, Appl. Environ. Microbiol. 50:698-700, and Guerra-Santos et al. in 1986 Appl. Microbial. Biotech. 24:443-448, las bacterias pueden ser utilizadas para producir estos tensioactivos mediante fermentación con manipulación de factores ambientales y nutricionales con el fin de aumentar el rendimiento. Más recientemente, Mulligan et ál . informaron en la patente estadounidense n.° 5,037,758 que una cepa genéticamente modificada de B. subtilis ATCC # 21332 con una mutación en un sitio en un gen de JS. subtilis de tipo natural es capaz de producir surfactina a concentraciones mucho más elevadas que el tipo natural. Por lo tanto, al usar técnicas de transferencia génica, estos genes tan estudiados que codifican la producción de tensioactivos pueden ser transferidos a varias células hospedadoras y puede controlarse la producción de tensioactivos .

Existen muchos tipos de biotensioactivos que podrían resultar útiles en la emulsión de petróleo. Pseudomonas aeruginosa y otras especies pueden producir ramnolípidos , que tienen una estructura diferente a la surfactina, pero que aún actúan para inmovilizar petróleo. Otros tensioactivos, tales como soforolípidos y lípidos de mannosileritritol y glicolípidos , son producidos por varias cepas de Candida . Se han informado más de 200 variaciones diferentes de biotensioactivos . Las diferentes estructuras de tensioactivos presentan diferentes grados de eficacia según el pH, la concentración salina y otros factores ambientales.

Además de los tensioactivos y los biopolímeros funcionales a pH elevado y/o a concentraciones elevadas de sal, también sirven como tensioactivos a pH alcalino los ácidos grasos producidos a partir de las primeras etapas de la biodegradacion de hidrocarburos encontrados en petróleo. A diferencia de los tensioactivos complejos como la surfactina y los ramnolípidos , es posible sintetizar ácidos grasos de tamaño moderado en el intervalo de alrededor de 13 a 24 carbonos directamente a partir de hidrocarburos encontrados en petróleo con pocas enzimas extracelulares . Podrían emplearse varias técnicas de aislamiento para aislar microorganismos alcalófilos o resistentes a la alcalinidad a partir de sitios contaminados con petróleo y con alcalinidad elevada o acuíferos subterráneos. Esto podría proveer tanto microorganismos como información genética que serían útiles para seleccionar y modificar un cultivo de microorganismos para pH alcalino elevado o EOR por inyección con ASP como proceso combinado de recuperación de petróleo.

El proceso de identificación de nuevos genes que se basa en la similitud u homología de las secuencias de ADN a secuencias génicas conocidas de función similar es conocido por los expertos en la técnica de biología molecular. En el pasado han sido utilizados diversos métodos. Un método es marcar sondas de secuencias de AR complementarias con etiquetas fluorescentes o radiomarcas que se unirán a ARNm de los genes expresados por las bacterias en el ambiente. Una segunda técnica implica el uso de amplificación por PCR de ADN aislado del entorno con sondas producidas a partir de regiones de los genes buscados de secuencia conservada. Un tercer método para determinar bioactividades es explicado por J. M. Short en la patente estadounidense n.° 6,030,779. Es posible aislar secuencias de genes nuevas en entornos de interés tales como un yacimiento de petróleo en el que se está desarrollando una operación de MEOR exitosa con cualquiera de estos métodos. Una alternativa es un entorno similar extremo al que puede encontrarse en un yacimiento de petróleo durante una inundación alcalina.

Los microorganismos que únicamente metabolizan hidrocarburos complejos o de elevado peso molecular representan otro grupo de microorganismos que degradan petróleo que son una buena fuente de genes que codifican productos útiles. Por ejemplo, Banerjee et al. informaron en la patente estadounidense n.° 5,013,654 (1991) sobre cepas de una bacteria aeróbica que crece en parafinas de cadenas de más de 12 carbonos de longitud. También aislaron una cepa mutante de P. aeruginosa SB-1, denominada SB-3, que tiene la propiedad de crecer en parafinas sólidas en petróleo crudo de 20 carbonos o más, pero que no crece en hidrocarburos líquidos de cadena más ligera. Las bacterias tales como SB-3, que fueron depositadas en American Type Culture Collection, Washington D.C. como P. aeruginosa A.T.C.C. 39615 contienen los genes para el metabolismo y la degradación extracelular de petróleo pesado. Estos genes, y otros aislados por medios similares, pueden ser transferidos a un microorganismo huésped que es capaz de prosperar en el entorno extremo de un yacimiento de petróleo. La combinación de esta capacidad de crecer en un pozo y degradar petróleo pesado con la capacidad de producir diversos tensioactivos y biopolímeros , y la imposibilidad de consumir petróleo ligero resulta útil en la recuperación de petróleo ligero. Si tales microorganismos pudieran también utilizar una fuente de carbono simple, podrían crecer rápidamente y predominar la microflora de un yacimiento. De manera adicional, podría darse al microorganismo modificado un gen de resistencia a las toxinas, además de la resistencia a la alcalinidad, como una ventaja competitiva adicional respecto a los microorganismos nativos que podrían consumir el petróleo ligero.

Más recientemente, Lei Wang et ál . (PNAS 27 de marzo de 2007, vol. 104 (13) :5602-7) informó sobre la secuencia genómica de la Geobacillus termófila aislada de un yacimiento de petróleo profundo que puede crecer en aléanos de cadena larga de hasta C36, pero no tuvo la capacidad de crecer en alcanos de cadena corta. Su análisis de la secuencia genómica demostró que no contenía ninguna secuencia de genes homologa a los genes AlkB que codifican las monooxigenasas intracelulares que oxidan los alcanos de cadena corta. Se informó también que este grupo tenía una enzima extracelular y soluble para la oxidación de alcanos de cadena larga en los alcoholes correspondientes. Este es un ejemplo de un gen que puede incorporarse en un microorganismo para la conversión de los alcanos de cadena larga en moléculas más capacitadas para movilizar petróleo en una micela. Adicionalmente , para convertir el alcohol en un ácido graso que tuviera carga negativa en pH alcalino, se necesitaría la célula modificada expresara dos enzimas adicionales mediante. Las enzimas adicionales requeridas son una alcohol deshidrogenasa para convertirlo en un aldehido y una aldehido deshidrogenasa. Los genes para estas enzimas necesarias para la producción de ácidos grasos de cadena larga pueden copiarse de la Geobacillus o de otro microorganismo tal como Mycojbacterium vanbaalenii PYR-1 o Petrotoga sp . AR80.

Los microorganismos aislados de yacimientos petrolíferos pesados u otros lugares contaminados con petróleo tienen probabilidades de contener genes para todos los tipos de vías que metabolizan hidrocarburos. Las monooxigenasas intracelulares que evolucionaron en cuanto al transporte y la oxidación de alcanos de cadena ligera pueden diferenciarse de las enzimas extracelulares necesarias para la oxidación de hidrocarburos de peso molecular mayor que son muy grandes e insolubles como para transportarse a través de la membrana celular. Si las enzimas de estas vías se utilizan en la cepa modificada, puede que se necesite una modificación de secuencias para que se secreten las enzimas y que permanezcan en la otra membrana celular. Las enzimas secretadas deben ser funcionales a pH alcalino y a concentraciones elevadas de sal del fluido motor utilizado en la inundación con ASP.

Además de la degradación de las parafinas de peso molecular elevado, los microorganismos pueden degradar otros hidrocarburos no deseados en el petróleo. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos que contienen azufre, tales como tiofenos y dibenzotiofenos (DBT) , pueden encontrarse presentes en el petróleo en niveles lo suficientemente elevados como para ser tóxicos para las bacterias y perjudiciales para el proceso de refinamiento. La presencia de azufre en el petróleo reducirá el valor del petróleo recuperado. En general, se quita el azufre antes del refinamiento mediante procesos químicos costosos. La necesidad de un proceso con un costo menor ha estimulado el desarrollo de procesos biológicos basados en varias especies de bacterias que han sido aisladas, las cuales pueden degradar los compuestos de azufre.

En un ejemplo, la Rhodococcus sp. cepa IGTS8 convierte DBT en 2 -hidroxibifenilo (HBP) y azufre inorgánico. La vía requiere dos monooxigenasas y una desulfinasa. Además de la caracterización de secuencias, estas enzimas se han mejorado mediante mutagénesis de sitio dirigido para ampliar la especificidad del sustrato para que incluya tiofenos y benzotiofenos . Se presenta una descripción más detallada de la vía en Gray, K.A. et al. en Nature Biotechnology 14; 1705-1709 (1996) . Si bien esta biodesulfuración del petróleo crudo es eficiente en cuanto a la eliminación de azufre con una escasa reducción del valor combustible, su uso generalizado se ha inhibido debido al costo de operación de los grandes reactores de agitación y aireación. Puede eliminarse el problema del costo del reactor al transferir los genes que codifican a las proteínas en la vía metabólica a un alcalófilo huésped de modo tal que funcionen en un pH más elevado de un yacimiento de petróleo sometido a un fluido alcalino de inyección con agua. Estas proteínas pueden degradar simultáneamente los hidrocarburos que contienen azufre al mismo tiempo que se emulsiona el petróleo y se barre del yacimiento durante el proceso con fluido alcalino de inyección con agua-MEOR.

Puede utilizarse un intermedio de la vía de desulfuración de dibenzotiofeno DBT, 2-hidroxibifenil-2- sulfinato, para contribuir a la solubilidad del petróleo. Se conocen cuatro genes en la Rhodococcus erythroplis IGTS8 que codifican cuatro enzimas que catalizan cada etapa de la ví de desulfuración. Esto se utilizó a gran escala para eliminar el azufre del petróleo. Se han encontrado secuencias de genes similares en más de una docena de distintas especies de microorganismos, entre ellos tres de los genes que se encuentra en la Oceanobacillus iheyensis, que es un microorganismo halotolerante alcalófilo de aguas profundas. O. iheyensis carece del gen DszB que codifica la última enzima que convierte el sulfinato en 2 -hidroxibifenilo y sulfito o la última etapa de desulfuración. Puede modificarse una vía ya sea para detenerse en el sulfinato o en el 2-hidroxibifenilo, cualquiera de los dos compuestos que fuese mejor para la emulsión de las gotas de petróleo en las condiciones químicas y térmicas del yacimiento. En este modelo, disminuye el nivel de azufre del petróleo producido. Además, el producto de la desulfuración puede contribuir en la recuperación del petróleo como otro emulsificador .

En resumen, el microorganismo preferido de la presente invención (i) contiene genes funcionales para la modificación extracelular de hidrocarburos de peso molecular elevado a un pH alcalino; (ii) carece de genes funcionales para el transporte y la oxidación de alcanos de cadena corta en la membrana celular; (iii) contiene los genes para la producción de compuestos útiles para la recuperación y la movilización del petróleo, tales como tensioactivos y polímeros que son funcionales a pH alcalino; y (iv) se encuentra regulado para expresar los compuestos útiles a niveles elevados aun cuando se le aporta un complemento de nutrientes de carbono simple. En una modalidad preferida, el microorganismo es capaz de funcionar y de crecer en el medio a pH elevado de un yacimiento de petróleo sometido a un proceso con fluido alcalino de inyección con agua. También en la modalidad preferida, los microorganismos alcalófilos crecen más enérgicamente en el petróleo a un pH alcalino que los microorganismos neutrófilos nativos. En otra modalidad preferida, el microorganismo es capaz de funcionar ya sea en un medio aeróbico o con limitación de oxígeno. Con el cuidado de que no suceda una degradación del alcano de cadena corta, la intercepción de aire que contiene oxígeno tiene la capacidad de acelerar el proceso de degradación de crecimiento y de oxidación de los hidrocarburos de peso molecular elevado convirtiéndolos en hidrocarburos más pequeños de peso molecular reducido o compuestos con mayor solubilidad en agua para la reducción de la viscosidad. Además, si se desea, puede reducirse el contenido de azufre y de nitrógeno del petróleo. (2 ) Selección de extremófilos Aquellos organismos que logran desarrollarse en medios que matarían a la mayoría de los organismos son denominados extremófilos . Estos medios pueden contener organismos de los tres dominios si bien, por lo general, se encuentran habitados casi exclusivamente por organismos procariotas, muchos de los cuales pertenecen al dominio Archaea. Un tipo de medio extremo es un medio alcalino. Los medios acuáticos de origen natural de pH extremadamente elevado han existido en la Tierra durante muchos años. Ejemplos actuales de ello son los lagos de soda o lagos alcalinos o fuentes minerales alcalinas, así como también algunos yacimientos de petróleo, los cuales han existido durante años con un pH 9.0 o mayor. Esto ha permitido la evolución de organismos que se han adaptado a estas condiciones alcalinas constantes. Además, los lugares contaminados por el ser humano, tales como el Lago Calumet en Illinois, se han vuelto altamente alcalinos luego de aproximadamente cien años de descarga de desechos industriales. G.S. Roadcap et ál . en Ground Water vol . 44, n.° 4, páginas 511-517, 2006 informó sobre Bacillus y Clostridia con crecimiento activo en agua de un pH de hasta 13.2. A diferencia de la mayoría de los lagos de soda naturales, este vertedero de pH elevado no tenía un contenido elevado de sal. Un vertedero con baja concentración de sal puede proporcionar alcalófilos que pueden funcionar a niveles elevados de pH pero que no requerirían además concentraciones elevadas de sal. Los microorganismos han desarrollado también genes que codifican la resistencia a estos medios extremos o tóxicos a través de un proceso evolutivo que puede haber llevado millones de años. Algunos investigadores creen que estos medios extremos son más característicos de cuando comenzó la vida en la Tierra.

Estos medios extremos pueden proporcionar fuentes, tanto de microorganismos como de su información genética que puede transferirse a microorganismos huéspedes adecuados que tengan la capacidad de funcionar en el medio extremo de un yacimiento de petróleo. En el caso de que un yacimiento de petróleo contenga microorganismos nativos que sean perjudiciales para la recuperación del petróleo (degradantes de petróleo ligero) , se ajusta el pH del fluido de inyección con agua a un nivel alcalino que es tóxico para los microorganismos nativos o inhibe las enzimas de la membrana celular necesarias para la captación y el metabolismo de alcanos de cadena corta. Se mantiene el fluido a un pH dentro del intervalo preferido favorable para la cepa modificada y dentro del intervalo de pH preferido para que las enzimas secretadas puedan catalizar la conversión de hidrocarburos a alcoholes y ácidos grasos. Este ajuste puede lograrse mediante inyección con agua con un fluido como parte del proceso de recuperación del petróleo. Por lo tanto, la selección de microorganismos alcalófilos para utilizar en la recuperación de petróleo es la base del presente método. La presente invención proporciona métodos para desarrollar un cultivo de microorganismos que lleven a cabo un proceso de recuperación del petróleo sin el consumo no deseado de alcanos de cadena corta. En métodos pasados con MEOR, con simplemente estimular a los microorganismos nativos en los yacimientos de petróleo, el consumo de hidrocarburos de cadena corta podría causar una reducción de la viscosidad del petróleo .

Los medios con pH elevado y con combinación de pH elevado y concentraciones de sal elevadas pueden ser habitados por microorganismos alcalófilos y haloalcalófilos de ambos dominios; bacterias y Archaea. Los medios acuáticos pueden tener un pH variable o un pH elevado constante. Los microorganismos resistentes a la alcalinidad (tolerantes al pH elevado) pueden habitar medios acuáticos tanto con pH elevado variable como constante. Estos son diferentes que los microorganismos verdaderamente alcalófilos que habitan únicamente medios con pH elevado. Los microorganismos resistentes a la alcalinidad pueden funcionar y crecer a un pH superior a 9.0, pero, preferentemente a un pH aproximadamente de 7.0.

Los microorganismos que pueden vivir en un medio con pH elevado tienen a menudo un pH citoplásmico mayor que pH 7.0, pero aun así menor que el pH de medios externos. El pH citoplásmico puede estimarse mediante la determinación del pH óptimo de las enzimas internas de las células. Las enzimas externas, ya sean modificadas en el microorganismos huésped alcalófilo o encontradas de forma natural en los alcalófilos huésped de tipo natural, deberían tener un pH óptimo dentro del intervalo de pH utilizado para procesos de inyección de agua alcalina. Si las enzimas que se pretende que conviertan la gama de hidrocarburos a alcoholes y ácidos grasos no tiene un pH óptimo lo suficientemente elevado para la inyección de agua alcalina, entonces el pH óptimo de las enzimas puede modificarse mediante cambios a los residuos aminoácidos en la superficie de la enzima o en el sitio reactivo o en los sitios de unión.

Normalmente, las proteínas y otras moléculas que preparan las células de los microorganismos no funcionan a niveles elevados de pH. Para que las enzimas y otros compuestos dentro del citoplasma de un alcalófilo funcionen en una solución con un nivel de pH elevado, deben realizarse cambios en la superficie de las proteínas y en los niveles de pH óptimo de las enzimas. Puede alterarse la cantidad y el tipo de aminoácidos básicos de la proteína que se encuentran en su superficie. Por ejemplo, el aminoácido básico lisina es remplazado a menudo por la arginina. Los análisis de las secuencias genómicas de estos alcalófilos obligados tanto de arqueobacterias como de bacterias indican un aumento en algunos residuos de aminoácidos y una disminución en otros residuos de aminoácidos. Se presenta un informe más detallado en Tsuyoshi Shirai et ál . en Protein Engineering vol . 10, n.° 6, págs .627-634 , 1997 y Koki Horikoshi, Microbiology and Molecular Biology Reviews, diciembre de 1999, págs. 735-750. "Alkaliphiles" 1999 ISBN 90-5702-458-6 publicado por Kodanha Ltd, Tokio, Japón, autor: Koki Horikoshi.

El cambio de un par de bases en un codón de tres pares de bases es una mutación sencilla y no tiene como resultado un cambio de carga del aminoácido que codifica. El cambio de una lisina a un ácido aspártico requiere un cambio en dos pares de bases en el codón (Lys, AAA o AAG a Asp, GAU o GAC) . Para realizar un cambio tan radical, de un aminoácido básico a uno ácido, se necesita una mutación doble o triple de los pares de bases del codón. Estos cambios radicales son del tipo que se encuentra en proteínas homologas tal como se observó en la comparación de microorganismos alcalófilos y no alcalófilos. Es improbable que estos ocurran a partir de mutaciones en un solo par, lo cual no tendría como resultado diferencias de carga tan grandes. Por lo tanto, este tipo de adaptación sería lenta y no es probable que ocurra en una especie durante muchos años.

Es poco probable que la adaptación ocurra como resultado de una única transferencia de genes horizontal de un microorganismo no alcalófilo para transformarse en un alcalófilo obligado. Los genes de microorganismos no alcalófilos o con un citoplasma de pH neutro deben modificarse primero de modo que las enzimas que codifican tengan pH óptimos elevados. Esta característica esencial del citoplasma de pH elevado de alcalófilos obligados puede ser la base de un medio que prevenga la transferencia no deseada de la mayoría de las bacterias, dado que la mayoría de las bacterias tienen citoplasmas de pH neutro. Si el microorganismo nativo no es alcalófilo, los genes de otros microorganismos nativos en el yacimiento de petróleo no producirán enzimas con el pH óptimo preferido que funcionen en un alcalófilo obligado, especialmente las enzimas que son enzimas de membrana involucradas en la transferencia y conversión de compuestos aromáticos y alcanos de cadena corta. Si un yacimiento de petróleo subterráneo contuviera una población numerosa de microorganismos que pudieran metabolizar el petróleo ligero, no podrían recogerse estos genes no deseados de los microorganismos alcalófilos obligados modificados. Para ser funcionales, los genes autóctonos tendrían que sufrir grandes cambios de modo que fuesen funcionales en la membrana o el citoplasma de pH elevado del microorganismos alcalófilo huésped. Por lo general, es poco probable que los yacimientos de petróleo que tienen un pH aproximadamente neutro contengan microorganismos que pudiesen aportar genes funcionales a los alcalófilos obligados.

En determinadas modalidades de la presente invención, se agregan nuevos genes a los microorganismos alcalófilos huésped. Luego de que se selecciona un microorganismo para utilizar en una inyección de agua alcalina de un yacimiento, puede ser deseable agregar genes para la degradación y el uso de hidrocarburos de peso molecular elevado y/o la producción de tensioactivos y polímeros. Si estos genes son transferidos de otros microorganismos, puede ser necesario modificar los genes para una expresión y función elevadas de las enzimas codificadas con un pH óptimo elevado. Esto puede lograrse mediante la combinación de un diseño racional de secuencia de proteínas y una mutagénesis de sitio dirigido. Por lo tanto, las proteínas y las enzimas necesarias para la producción de un tensioactivo o una enzima de escisión de hidrocarburos útil para la emulsión del petróleo pueden modificarse para transformarse en un alcalófilo luego de que se modifiquen las secuencias de genes para hacer que las proteínas sean más funcionales a un pH mayor que 9.0.

De acuerdo con la presente invención, si fuese necesario, las proteínas y las enzimas necesarias para la producción de un tensioactivo o una enzima de escisión de hidrocarburos útil para la emulsión del petróleo pueden modificarse para transformarse en un alcalófilo luego de que se modifiquen las secuencias de genes para hacer que las proteínas sean más funcionales a un pH elevado. Se evalúan las secuencias con mutación para comprobar su expresión y actividad a un pH de 9.0. Además, los microorganismos modificados no adquirirán los genes de consumo de petróleo ligero de los microorganismos activos que existen en el yacimiento, dado que las enzimas codificadas son óptimas a un pH neutro.

Ejemplos de microorganismos alcalófilos: Bacillus alcalophilus Bacillus agaradhaerens Bacillus cohnii Bacillus vedderi Bacillus firmus Bacillus cepa YN-2000 Bacillus halodurans C-125 Bacillus licheniformis PWD-1 Bacillus pseudofirmus 0F4 Bacillus cepa A30-1 (ATCC53841) , un microorganismos termófilo y alcalófilo aislado de un área de fuente termal del Parque Nacional Yellowstone, EUA. ang, Y. X. y B.C. Saha (1993) J. Am. Oil Chem. Soc. ,70, 1135-1138 Bacillus cohnii D-6, FERM P-1592. Produce un detergente y H202 proteasas alcalinas resistentes que también es estable a 60 °C. Yoshida y Horikoshi (Patente japonesa JP 740710, 1972) .

Thermomonospora s . Aislada por George, S. P., et ál . (2001) que informa sobre una xilanasa termoestable .

Bioresource Technol . , 78, 221-224.

Oceanobacillus iheyensis HTE831. Se aisló una bacteria halotolerante y alcalófila en el mar profundo de Iheya Ridge, Japón, a 1050 metros. Es una nueva especie que no pertenece al género conocido.

Halófilos arquéales alcalófilos: Los halófilos alcalófilos pueden encontrarse en lagos de soda hipersalinos tales como el Lago Magadi en Kenia, los lagos Wadi Natrum en Egipto y los lagos de soda en China. Estos pueden modificarse para producir biotensioactivos y otros compuestos biológicos de recuperación de petróleo que fueron efectivos a pH alcalino. Por lo general, el pH alcalino es mejor para la emulsión del petróleo. Puede lograrse el aumento de pH de la inyección de agua mediante la adición de soda cáustica y tendría la ventaja adicional de suprimir el crecimiento de microorganismos endógenos que pudieran interferir o tener efectos perjudiciales en la calidad del petróleo producido.

Halother othrix orenii es un anaerobio aislado de un lago de sal tunecino que crece en NaCl 3.4 M (sal al 20 %) en 68 °C. Ref. Cayol J-L et ál 1994 Int. J. Syst. Bacteriol . 44: 534-540.

Natronojbacterium magadii y N. gregoryi son halófilos alcalófilos, aunque no termófilos, que se han aislado del Lago Magadi en Kenia (ref. Tindall et ál 1984 ATCC 43099 y 43098) . Tienen un H óptimo de 9.5 y un intervalo de sal de NaCl 2.0-5.2 M.

Natronomonas pharaonis (NC_007426, NC_007427 y NC_007428) es un halófilo extremo alcalófilo aislado de un lago de soda. Se completó la secuencia de este genoma de arqueobacterias de 2.6 Mbp en 2005.

Halalkalicoccus tibetensis (cepa DS12T) . Aislado del Lago Zabuye, Meseta Tibetana, China.

Halalkalicoccus jeotgalt B3 Natronococcus occultus (NCIMB2192T) Thermococcus alcaliphilus sp. (DSM10322) una arqueobacteria hipertermófila aislada de un sistema hidrotérmico marino en la Isla Vulcano, Italia. El pH óptimo es de 9.0 a una temperatura óptima de 85 °C.

Además de los microorganismos enumerados anteriormente, existe una lista más grande en Enache, M. et ál . en International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2007), 57:2289-229, que se incorpora expresamente a la presente mediante esta referencia. Además de los alcalófilos enumerados anteriormente, pueden seleccionarse otros halófilos de colecciones de cultivos o ser aislados de medios con un pH elevado. (3 ) Uso de inhibidores químicos para el control de las vías metabólicas El control de las vías metabólicas dentro de los microorganismos puede lograrse tanto mediante el uso de manipulación genética como mediante el uso de compuestos químicos que afectan la función de cualquier enzima en la vía metabólica. La eficacia de la recuperación de petróleo dependerá de todos los microorganismos que crecen en un yacimiento sometido a inyección con agua. Esto puede implicar una combinación de inoculación de microorganismos, microorganismos seleccionados o modificados que tienen la capacidad de reducir la viscosidad del petróleo o emulsionar el petróleo para una recuperación mayor, pero el proceso también puede verse afectado por los microorganismos nativos que no fueron del todo eliminados por el medio extremo creado por la inyección con agua. Los microorganismos inoculados pueden diseñarse para alterar el petróleo crudo de modo tal que pueda barrerse de una forma más eficiente de la roca almacén. El proceso de diseño puede darse por medios de transferencia o inactivación genética o mediante el uso de inhibidores químicos. Dado que los microorganismos nativos no han sido seleccionados o modificados por manipulación genética, puede que estos degraden el petróleo crudo de forma tal que se reduzca el valor y la recuperación del petróleo. Esto puede contrarrestar o deshacer las alteraciones ventajosas logradas por la inoculación de microorganismos. Dado que los microorganismos nativos se encuentran ya presentes en el yacimiento subterráneo, es difícil transferir o manipular su constitución genética. Por lo tanto, el uso de inhibidores químicos es el método preferido para el control de las vías metabólicas de los microorganismos nativos.

Estos inhibidores químicos pueden ser seleccionados o diseñados para unirse a las enzimas esenciales que se conoce que son parte de las vías de degradación que se encuentran típicamente en los microorganismos nativos degradantes del petróleo en los yacimientos de petróleo. La Figura 1 ilustra algunas de las reacciones químicas principales que son catalizadas por las enzimas creadas mediante microorganismos que pueden utilizar hidrocarburos y ácidos carboxílicos creados a partir de hidrocarburos. Además de las reacciones químicas catalizadas, la transferencia de sustrato de hidrocarburo a través de las membranas celulares mediante la transferencia de proteínas también puede bloquearse mediante compuestos químicos que se unen a estas proteínas de transferencia. Los inhibidores químicos pueden funcionar mediante cierta cantidad de mecanismos. Algunos ejemplos no taxativos son las moléculas que son similares al sustrato y que compiten por el sitio reactivo de unión con el sustrato. Estos compuestos inhibidores pueden no reaccionar como el sustrato o si reaccionan, no abandonan el sitio reactivo como el sustrato en cuestión. Otros tipos de inhibidores se unen o reaccionan con la enzima en otra parte de la molécula que no sea el sitio reactivo e inactivan la enzima. Los inhibidores pueden unirse fuertemente a la enzima o pueden reaccionar químicamente con la enzima para inactivarla de forma permanente. Cualquiera de estos inhibidores o una combinación de ellos puede utilizarse para alterar las vías metabólicas de los microorganismos involucrados en la utilización del petróleo crudo.

Un ejemplo no taxativo de reacción o vía que puede inhibirse es la degradación de alcanos de cadena corta. En general, la degradación biológica procede mediante la absorción del alcano por la membrana celular, la conversión a un alcohol mediante la enzima intracelular, seguida por la conversión a un aldehido por otra enzima y luego la conversión a un ácido carboxílico mediante otra enzima. Si cualquiera de las etapas se ralentiza o se detiene, se previene el efecto perjudicial del consumo del petróleo ligero y el aumento de la viscosidad del petróleo como resultado de una pérdida ligera de hidrocarburo.

En algunos casos, la acumulación y la secreción de intermedios en la vía pueden también beneficiar la recuperación del petróleo. Por ejemplo, los alcoholes grasos de cadena corta dentro del intervalo de tamaño de 2 a 8 carbonos son útiles como cotensioactivos en la emulsión del petróleo. En otro ejemplo, los ácidos grasos un poco más grandes de tamaño dentro del intervalo de 6 a 20 carbonos son útiles para la emulsión del petróleo, especialmente a un pH alcalino, al formar moléculas de jabón que contribuyen con las micelas del petróleo. En los ejemplos que anteceden, puede inducirse una acumulación de alcohol mediante la adición de un inhibidor de la enzima alcohol deshidrogenasa de cadena corta grasa. Puede lograrse una acumulación de ácidos grasos mediante la inhibición de cualquiera de las enzimas necesarias para la betaoxidación de los ácidos grasos .

Se ha informado que una cierta cantidad de compuestos químicos inhibe la betaoxidación de los ácidos grasos. Thijsse GJE., en 1964, informó sobre la acumulación de los ácidos grasos en pseudomonas que oxidan alcanos (Biochim. Biophys. Acta 84:195-197). En 1979, B. M. Raaka y J. M. Lowenstein informaron que el DL-2 -bromooctanoato causa la inactivación completa e irreversible de la 3 -cetotiolasa I, una enzima de betaoxidación, (J. of Biological Chemistry Vol. 254, n.° 14, págs . 6755-6762). También fue informado que el ácido salicílico inhibe 3-cetoacil-CoA tiolasa en las P. fluorescens por M. H. Choi et ál . en 2008, publicado en línea el 3 de octubre de 2008, www.interscience.wiley.com, DOI 10.1002/bit .22149. La inhibición de la betaoxidación fue comparable con la del ácido acrílico y se creyó que era similar, pero con ' la ventaja adicional de que el ácido salicílico no era metabolizado por los microorganismos como sí sucede con el ácido acrílico y por lo tanto duraría m s.

Dada la importancia médica de los ácidos grasos en los seres humanos, la inhibición de la transferencia de los ácidos grasos a través de las membranas celulares se ha estudiado más en células eucariotas que en las bacterias. Al menos seis de los genes de proteínas que transfieren ácidos grasos en mamíferos han sido clonados y se han caracterizado sus proteínas (Wu, Q.; Ortegon, A. M. ; Tsang, B.;Doege, H. ; Feingold, K.R. ; Stahl, A. Mol. Cell Biol . 2006, Vol . 26, págs . 3455-3467). La identificación de pequeños compuestos inhibidores ha sido una tecnología esencial para el desarrollo de tratamientos contra la obesidad, las enfermedades cardiovasculares y la resistencia a la insulina inducida por las grasas . Se describe el cribado de alto rendimiento para los inhibidores de captación de ácidos grasos en levaduras humanizadas por P.N. Black y C.C. DiRusso en la patente estadounidense 7,070,944. Las proteínas de transferencia de ácidos grasos también se encuentran en bacterias y existe un informe sobre una familia de ácidos grasos transportadores que se conservan de bacterias a humanos por Hirsch, D . ; Stahl, A.; Lodish, H.F.; Proc . Nati. Acad. Sci., EUA, 1998, Vol. 95, págs. 8625-8629.

Un trabajo más reciente ha utilizado mutaciones inducidas por transposón de bacterias del género Alcanivorax para identificar los genes necesarios para la exportación de derivados de ácidos grasos tales como ásteres de cera y ácidos polihidroxialcanoicos (PHA) . Un informe reciente fue presentado por E. Manilla-Perez et ál. y publicado en J. Bacteriology Vol . 192, n.° 3 (2009), págs . 643-656. La exportación de ácidos grasos puede ser ventajosa para aumentar el número de ácidos de petróleo crudo para la emulsión y la importación de hidrocarburos de cadena corta puede ser ventajosa para inhibir para prevenir la merma del petróleo ligero del yacimiento de petróleo. El aislamiento de los genes que codifican cada proteína de transferencia proporcionarla un método de cribado para inhibidores que no disminuyen la exportación de ácidos grasos, pero que inhiben la importación de alcanos de cadena corta u otros hidrocarburos ligeros.

La combinación de la manipulación genética y del uso de inhibidores químicos tales como ácido acrílico han sido utilizados para la producción de ácidos polihidroxialcanoicos (PHA) debido a que su uso produce termoplásticos y elastómeros biodegradables . Un informe más detallado de la producción de PHA mediante la E. coli recombinante en combinación con el uso del inhibidor de ácido acrílico es presentado por K. Zhao et ál. en FEMS Microbiology letters, 218 (2003), págs. 59-64. Trabajos más recientes se han enfocado en el uso de los microorganismos que son capaces de secretar derivados de ácidos grasos tales como Alcanivorax borkumensis . Un informe reciente fue presentado por E.

Manilla-Perez et al. y publicado en J. Bacteriology, Vol. 192, n.° 3 (2009), págs . 643-656.

Puede determinarse la efectividad de cualquier inhibidor químico mediante el análisis de una gama de concentraciones de inhibidores sumado al cultivo de microorganismos que crecen en una muestra de petróleo crudo o un sustrato de hidrocarburo simple tal como hexadecano. La secreción de ácidos grasos al medio puede determinarse mediante la conversión del ácido graso a éster metílico para el análisis por GC . En el ejemplo 4 se utilizó una digestión de petróleo de Río Rojo en Montana para analizar unos pocos inhibidores químicos diferentes de betaoxidación para medir el efecto de los inhibidores en el petróleo y el contenido de ácido del petróleo crudo.

Se proporcionan más detalles de la invención en los siguientes ejemplos no taxativos.

Todas las referencias que se citan a lo largo de la presente descripción, y las referencias que se citan en esta, se incorporan expresamente a la presente mediante esta referencia.

Ejemplo 1 La Figura 4 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de alcano monooxigenasa de cadena larga LadA (SEQ ID NO: 1) con la proteína hipotética Gen ID 9420269 HacjB3_12265 de halófilos resistentes a alcalinidad Halalkalicoccus jeotgali B3 (SEQ ID NO: 2) y con otra proteína hipotética del halófilo Halorubrum lacusprofundi ( ATCC 49239) ID del gen 7401614 Hlac 0096 (SEQ ID NO: 3) . Las composiciones de aminoácidos para las tres proteínas se muestran a continuación.

Proteína GI : 134268638_G_thermodenitrificans Longitud = 440 aminoácidos Peso molecular = 50463.66 Daltones Aminoácido Número % Mol Ala A 28 6 .36 Cys C 5 1 .14 Asp D 28 6 .36 Glu E 32 7 .27 Phe F 18 4 .09 Gly G 33 7 .50 His H 20 4 .55 lie I 26 5 .91 Lys K 31 7 .05 Leu L 33 7 .50 Met M 10 2 .27 Asn N 20 4 .55 Pro P 16 3 .64 Gln Q 10 2 .27 Arg R 23 5.23 Ser S 23 5.23 Thr T 19 4.32 Val V 32 7.27 Trp W 7 1.59 Tyr Y 26 5.91 Proteína GI : 299125497_H_jeotgali Longitud = 461 aminoácidos Peso molecular = 51901.50 Daltones Aminoácido Número % Mol Ala A 44 9.54 Cys C 3 0.65 Asp D 39 8.46 Glu E 49 10.63 Phe F 21 4.56 Gly G 35 7.59 His H 13 2.82 lie I 14 3.04 Lys K 9 1.95 Leu L 30 6.51 Met M 12 2.60 Asn N 10 2.17 Pro P 21 4.56 Gln Q 15 3.25 Arg R 38 8.24 Ser S 24 5.21 Thr T 28 6.07 Val V 34 7.38 Trp W 6 1.30 Tyr Y 16 3.47 Proteína GI : 222478535_H_lacusprofund Longitud = 458 aminoácidos Peso molecular = 50806.91 Daltones Aminoácido Número % Mol Ala A 41 8.95 Cys C 3 0.66 Asp D 47 10.26 Glu E 44 9.61 Phe F 17 3.71 Gly G 32 6.99 His H 15 3.28 lie I 10 2.18 Lys K 11 2.40 Leu L 30 6.55 Met M 6 1.31 Asn N 6 1.31 Pro P 26 5.68 Gln Q 15 3.28 Arg R 30 6.55 Ser S 27 5.90 Thr T 34 7.42 Val V 44 9.61 Trp W 6 1.31 Tyr Y 14 3.06 Ejemplo 2: Aislamiento de microorganismos de sitios con pH y salinidad elevados, y aislamiento de microorganismos de sitios con pH elevado y baja salinidad Etapa 1: Aislamiento de microorganismos de medios con pH elevado El aislamiento de los microorganismos de lugares con pH y salinidad elevados, o el aislamiento de lugares con pH elevado y salinidad baja es un método preferido para obtener microorganismos huésped para un proceso de recuperación de petróleo alcalino. Los sitios que han sido contaminados con petróleo durante mucho tiempo son los más preferidos dado que también pueden contener microorganismos que pueden crecer en una variedad de hidrocarburos . Algunos pozos de petróleo contienen agua con pH elevado y qué ha sido de un pH elevado durante muchos años . Es también probable que los microorganismos de lugares de petróleo alcalino sean resistentes a los efectos tóxicos del petróleo y pueden utilizarse para la recuperación de petróleo o como microorganismos huésped para la modificación de vías metabólicas útiles para la recuperación de petróleo. Los microorganismos aislados de este tipo de lugares son útiles también como fuente de secuencias de proteínas de enzimas que son optimizadas para funcionar a pH elevado.

Los medios alcalinos de pH elevado constante que también se encuentran en concentraciones elevadas de iones de sodio (salinidades que exceden los 100,000 ppm total de sólidos disueltos) son los más comunes. Los lagos de soda y los desiertos de soda son medios de origen natural y estables que se encuentran en el mundo. Estos son los mejores para el aislamiento de los microorganismos alcalófilos y halófilos. Es más probable que los medios que tienen un pH y una concentración de sal variable contengan microorganismos resistentes a la alcalinidad y halotolerantes . Los lugares alcalinos que contienen hidrocarburos líquidos, tales como los campos petrolíferos o fosos de eliminación de salmuera/petróleo residual o estanques de evaporación son buenos lugares para el aislamiento de microorganismos que son alcalófilos o haloalcalófilos y que tienen también la capacidad de metabolizar varios de tipos de hidrocarburos. El agua subterránea con alta concentración de iones de calcio a un pH elevado es menos común, pero es una buena fuente de alcalófilos que no son además halófilos y que pueden crecer a bajas concentraciones de salinidad.

Puede que se necesite que los microorganismos seleccionados para el uso en MEOR funcionen en el medio con poco oxígeno de un pozo petrolífero. Los anaerobios facultativos son microorganismos huésped ideales porque pueden sobrevivir a la exposición de oxígeno. Son especialmente buenos lo microorganismos que pueden utilizar nitrato como un aceptor de elección. Los microorganismos anaeróbicos pueden utilizarse en aplicaciones donde las grandes cantidades de aire pueden inyectarse con el fluido con inyección de agua. Los microorganismos aislados de estos medios pueden también ser una fuente de información genética o de secuencias de genes que pueden utilizarse para modificar genéticamente un microorganismo para analizarlo y utilizarlo en yacimientos de petróleo a pH elevado o donde se utilice una salmuera alcalina como inyección de agua.

En un ejemplo, H. Al-Awadhi, et ál . , en Appl . Microbiol. Biotechnol . 2007, 77:183-186, informó sobre el aislamiento de las cepas Marinobacter, Micrococcus, Dietzia, Bacillus, Oceanobacillus y Citricoccus que pudieron crecer con una gama de compuestos alcanos y aromáticos como fuentes únicas de carbono y energía. Estos microorganismos fueron aislados de la zona intermareal de la costa del Golfo Pérsico. La contaminación con petróleo es aguda en un área productora de petróleo tal como el Golfo Pérsico. La larga costa del Golfo comprende áreas en las que el agua de las mareas se encuentra atrapada y se vuelve salina y alcalina como resultado de la evaporación. Por lo tanto, es probable que los lugares que contienen tanto petróleo como un nivel alto de salinidad a un pH alcalino contengan microorganismos alcalinos que pueden utilizar varios hidrocarburos.

Si se sigue el método de Al-Awadhi et ál . , los microorganismos en biopelículas que recubren las partículas de grava son raspados con un cepillo de dientes esterilizado en agua estéril. Se realiza un recuento de los microorganismos alcalófilos que utilizan petróleo mediante el cultivo de un medio inorgánico de ágar descrito por Horikoshi 1998, Alkaliphiles. En: Horikoshi K, Grant WD (eds) Extremophiles : microbial Ufe in the extreme environments . iley-Liss, Londres, págs . 155-179. Se contaron los halófilos en el medio inorgánico descrito por Sorkhoh et ál . (1990). Las colonias representativas se aislaron y se purificaron en el medio sólido antemencionado. Los cultivos puros se identificaron mediante el análisis de sus secuencias genómicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) . Se extrajo el ADN genómico mediante un kit de extracción de ADN (Sigma, EUA) . Se amplificó el ácido nucleico ribosomal 16S (ARNr) mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PC , por sus siglas en inglés) . El fragmento de 550 bp del ADN ribosomal 16S se amplificó enzimáticamente con la combinación del cebador eubacteriano universal G %F con la secuencia 5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ' (SEQ ID NO : 4) y DS907R con la secuencia 5 ' -CCCCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3 ' (SEQ ID NO: 5) (Santegoeds et ál. 1998 Appl. Environ Microbiol 64:3731-3739). Se purificaron los productos de PCR y se secuenciaron . Las secuencias obtenidas se compararon con aquellas de bacterias conocidas mediante la base datos GenBank y se depositaron con el número de registro DQ646492-DQ646515.

Se analizaron los aislados para su crecimiento en un medio que contiene 0.5 % de hidrocarburos alcanos individuales de C-13 a C-40 y los compuestos aromáticos de naftaleno y fenantreno como únicas fuentes de carbono. El pH del medio para los alcalófilos se mantuvo a pH 11. Se encontró que el pH óptimo para el crecimiento de los alcalófilos aislados que utilizan petróleo fue de entre pH 8 y pH 10. Todos los aislados pueden resistir la alcalinidad hasta pH 11, pero no hasta pH 12.

Al-Awadhi efc ál . encontraron que la mayoría de los aislados puede utilizar una amplia gama de alcanos de C-13 a C-40 y los dos hidrocarburos aromáticos analizados. Sin embargo, unos pocos solamente pueden utilizar una reducida gama de hidrocarburos. Este método puede utilizarse para aislar los microorganismos alcalófilos de tipo natural que únicamente tienen la capacidad de degradar los hidrocarburos de peso molecular elevado. Mediante estos métodos, pueden obtenerse las cepas puras de microorganismos halófilos y alcalófilos que puede degradar solo ciertos intervalos objetivo o tipos de hidrocarburos. De manera alternativa, estas cepas aisladas pueden secuenciarse para encontrar variaciones en las enzimas que son conocidas por degradar hidrocarburos de determinado intervalo de tamaños, tales como la monooxigenasa LadA, que es una enzima que convierte los alcanos con una longitud mayor que 15 carbonos en alcoholes, o NidA3B3 que es uña enzima de degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos . La información de la secuencia puede utilizarse para adaptar otras enzimas para que funcionen a pH o salinidad elevados mediante sustitución de aminoácidos homólogos .

Se conoce menos de los microorganismos que se encuentran en medios con baja salinidad, pero con alcalinidad y calcio elevados. Las comunidades de microorganismos pueden no desarrollarse bien dada la baja concentración de nitrógeno y fósforo. Los estanques de agua con desecho industrial, tales como los lugares de producción de cemento e índigo, son bueno lugares para explorar alcalófilos de baja salinidad. G. S. Roadcap et ál . Ground water 44, n.° 4:511-517(2006) presenta el descubrimiento de más de 100 cepas de Bacillus y Clostridium mediante secuenciación de ARN ribosomal 16S de los microorganismos de un lugar con pH elevado y bajo en sodio en Lago Calumet, próximo a Chicago, Illinois. El pH del agua de este lugar es mayor que 13. El lugar del Lago Calumet es conocido también por tener contaminación de hidrocarburos y es probable que contenga microorganismos que degradan hidrocarburos que también tengan la habilidad de crecer a pH elevado. Al utilizar el procedimiento similar al de Al-Awadhi et al. con un medio bajo en sodio, las cepas de microorganismos pueden aislarse de un lugar tal como el lugar del Lago Calumet. Esos microorganismos aislados pueden analizarse para determinar su capacidad de utilizarse ya sea con hidrocarburos ligeros o pesados.

Etapa 2 : Aislamiento del ADN y de los genes necesarios para la producción de tensioactivos y el consumo del petróleo líquido Las cepas de microorganismos seleccionadas para la producción de tensioactivos eficaces y de alto nivel pueden caracterizarse más aun mediante el secuenciación de genes. Se extrae el ADN de los filtros de policarbonato tal como se describe en Minz efc al. (1999) Appl . Environ. Microbiol . 65: 4666-4671. Este procedimiento fue modificado por Kebbouche-Gana et al. El ADN fue sometido a un proceso de electroforesis , escindido del gel y purificado con un kit de extracción de gel (Genomic DNA purification system PROM, EGA) . Los ADN purificados de las cepas seleccionadas fueron amplificados con cebadores arquéales de ARNr 16s específico ( 5 ' -TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3 ' (SEQ ID NO: 6) y 5' YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3 ' (SEQ ID NO: 7)). La información de secuencia del ARNr 16s puede alinearse con la secuencia de ARNr de alcalófilos conocidos para la identificación del género y la familia.

Las sondas de ADN o ARNm pueden basarse en genes conocidos de un organismo que produce un tensioactivo . Un ejemplo es Pseudomonas aeruginosa, que produce ramnolípidos . La síntesis de este glicolípido es mediante reacciones secuenciales de transferencia de glicosilo. Los genes involucrados en la biosíntesis de ramnolípidos se codifican en un plásmido y su expresión se encuentra regulada por un sistema de percepción de quorum. Se presenta un informe más completo en Lang y Wullbrandt (1999) Appl . Microbiol . Biotechnol., 51:22-32. Otras especies, tales como Bacillus subtilis, producen surfactina, un lipopéptido que contiene aproximadamente 7 residuos de aminoácidos. Otros microorganismos secretan biotensioactivos de peso molecular elevado que constan de polisacáridos , lipoproteínas y lipopolisacáridos . El aislamiento y la identificación de los tensioactivos secretados por las cepas aisladas pueden realizarse mediante HPLC con un sistema de detección de espectrometría de masa. La identificación de la naturaleza química de los tensioactivos producidos por cada cepa aislada puede ser una información útil para encontrar genes que son necesarios para la producción y secreción de tensioactivos . Por ejemplo, un glicolípido similar a un ramnolípido probablemente dependa de genes similares a aquellos involucrados en su biosíntesis en P. aeruginosa. Estos genes de microorganismos bien caracterizados podrían utilizarse para construir sondas para encontrar genes similares en los aislados alcalófilos.

Sin embargo, si los tensioactivos producidos por los microorganismos alcalófilos son totalmente nuevos y diferentes a todos los compuestos de superficie activa estudiados a fondo, entonces pueden utilizarse otros métodos de aislamiento genético. Por ejemplo, los niveles elevados correlativos de ARNm con producción de niveles elevados de tensioactivos pueden utilizarse para encontrar los genes necesarios. Si la presencia de los alcanos induce la producción de tensioactivos, entonces el nivel de ARNm necesario para la producción de tensioactivos puede incrementarse. El uso de micromatrices de ADN puede identificar el aumento en la transcripción de genes al ARNm cuando la producción de tensioactivos es inducida, así como también la secuencia de pistola transcriptómica de ARN o ADNc (WTSS o ARN-Seq) . Además, la secuencia de ADNc específico creada a partir de ARNm aumentado puede utilizarse para identificar la secuencia de genes necesaria.

En base a este método, la identificación de genes necesaria para la producción de tensioactivos y la degradación de petróleo líquido pueden realizarse mediante la exhibición de ARNm diferencial. Este método fue utilizado para identificar genes relacionados con el metabolismo de la ciclohexonona (Brzostowicz et ál . (2000) J. bacterial. 182: 4241-4248) . Estas técnicas de ARNm hacen posible el acceso a genes regulados directamente sin la purificación de los productos de los genes. Estos enfoques están basados en comparaciones de dos cultivos y en la identificación de genes cuyo ARNm es más abundante cuando se induce una vía metabólica. En el ejemplo antemencionado, si la producción de tensioactivos es inducida por la presencia de petróleo, entonces el ARNm que codifica la producción de tensioactivos, así como las enzimas para el metabolismo del petróleo, tendrá niveles más elevados en comparación con el cultivo no inducido. Estas técnicas se basan en la hibridación del ADN en membranas tal como se describe en Chuang y Blattner 1993 J. bacteriol . , 175:5242-5252. Este método que Brzostowiez et ál. llevó al descubrimiento de los genes para dos enzimas monooxigenasas responsables de la oxidación de la ciclohexanona . Esta misma técnica puede utilizarse para la identificación de los genes que codifican las proteínas y los productos de genes de microorganismos alcalófilos que carecen de una homología de secuencia suficiente para unirse a las sondas construidas en base a enzimas mesófilas homologas de secuencia de proteínas.

Las sondas pueden basarse también en secuencias de proteínas de enzimas homologas con un sitio catalítico y sitios de unión conservados. En este caso, se construyó una sonda corta de ADN degenerada para unirse con cualquier ADN que tenga una secuencia de pares de bases que codificaría la secuencia de residuos de aminoácidos altamente conservada.

Si bien todos estos métodos pueden tener éxito para el aislamiento de nuevos genes necesarios para la producción de tensioactivos y la degradación de hidrocarburos líquidos en halófilos, la secuenciación de grandes cantidades de halófilos obligados habilitará una identificación y un aislamiento más veloz de los nuevos genes.

Etapa 3 : Prevención y modificación del metabolismo de alcanos de cadena corta La expresión de genes necesaria para la producción y secreción de tensioactivos y para la degradación de los hidrocarburos de peso molecular elevado son procesos ventajosos para la movilización del petróleo. La degradación de los alcanos de cadena corta y otros componentes de baja viscosidad del petróleo es perjudicial para la recuperación del petróleo. Por lo tanto, si los genes de los microorganismos pudiesen ser modificados para que los microorganismos no metabolizaran el petróleo ligero, la viscosidad disminuiría y la recuperación de petróleo aumentaría. Sin embargo, esto deber hacerse de modo tal que la producción de tensioactivos , la cual puede encontrarse bajo el control de un único promotor genético, no sea prevenida. Con la pérdida del metabolismo del petróleo líquido, otra fuente utilizable de carbono es necesaria para desviar la pérdida de energía del metabolismo de hidrocarburos de cadena ligera. A menudo los genes necesarios tanto para el consumo de hidrocarburos líquidos como la producción de tensioactivos se encuentran juntos. Por lo tanto, desactivar o eliminar los genes necesarios para la captación de los aléanos de cadena corta debe hacerse de modo tal que los genes necesarios para la producción elevada de tensioactivos no sea desactivados o disminuidos.

Un método para lograr esta modificación específica de genes es el remplazo por genes homólogos. Un gen de tipo natural es remplazado con un gen nuevo que tiene una secuencia de nucleótidos modificada y que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos diferente. Este proceso puede utilizarse para lograr pequeños cambios en las enzimas para cambiar la eficiencia o especificidad catalítica de la enzima. Un cambio en uno o dos residuos de aminoácidos puede interferir con la capacidad de la nueva enzima para que se una al mismo sustrato o para que catalice las etapas esenciales de la conversión del sustrato para producir a la misma velocidad. Este proceso ha sido utilizado en muchos sistemas genéticos donde se remplazan genes similares con genes con mutaciones mediante recombinación homologa (Molecular Biotechnology editado por Glick y Pasternak, 2003, capítulo 8) . Junto con los genes con mutaciones, se incorpora un marcador seleccionable de modo que los microorganismos nuevos que han captado el gen con mutaciones puedan ser seleccionados. Este proceso necesita un determinado nivel de herramientas de manipulación genética. Afortunadamente, un sistema de bloqueo genético ha sido desarrollado para los halófilos Archaea, Haloferax volcanii y Halobacterium salinarum en base al gen pyrE del cual trata Bitin-Banin et ál. en J. Bacteriol . 2003, 185: 772-778. Este sistema ha sido desarrollado adicionalmente y ahora se encuentran disponibles cuatro selecciones distintas (Allers et ál . , Appl . Environ. Microbiol. 2004, 70: 943-953) para Hf. volcanii. Al utilizar esta técnica u otras técnicas de remplazo genético con marcadores seleccionables , los genes monooxigenasas aislados de los halófilos de tipo natural pueden remplazarse con secuencias de genes modificados.

Mediante este proceso u otros procesos de manipulación genética, pueden realizarse ciertos cambios en las secuencias de aminoácidos de las enzimas para facilitar la captación o el metabolismo de los aléanos de condena ligera. Este proceso puede realizarse mediante cambios aleatorios a cualquiera de los aminoácidos en la secuencia de las enzimas mediante ensayo y error. Las enzimas resultantes con los cambios en los aminoácidos pueden ser analizadas en busca de cambios en la unión al sustrato, en la especificidad del sustrato y en la velocidad de conversión al producto. En general, la mayoría de los cambios aleatorios tendrán poco efecto o disminuirán la velocidad catalítica. Este proceso es mucho más sencillo si se conoce la estructura tridimensional de la enzima o si se puede determinar mediante análisis cristalográfico por rayos X. En este ejemplo, la estructura de algunas monoooxigenasas con aléanos específicos fue determinada y podría ser útil en la predicción de aminoácidos claves que pueden modificarse. Por ejemplo, hacer mutaciones en determinados puntos de los residuos de aminoácidos en los sitios de unión, también conocidos como bloques de histidina, probablemente prevenga o cause una disminución en la velocidad de metabolismo de los alcanos.

La modificación de cualquiera de los residuos de aminoácidos, especialmente las histidinas, afectará la capacidad de estas enzimas para metabolizar hidrocarburos líquidos. Puede evaluarse cierta cantidad de enzimas modificadas en un modelo alcalófilo, tal como Oceanobacillus iheyensis, para determinar la capacidad de las enzimas de funcionar a un pH elevado. Pueden evaluarse los alcalófilos de tipo natural modificados con las enzimas de conversión de alcanos modificados en el laboratorio para determinar su capacidad para producir tensioactivos, pero con la habilidad limitada de crecimiento en octano o diesel como fuente de carbono. Del grupo de microorganismos modificados, se seleccionaron las cepas que lograron altos niveles de crecimiento utilizando una fuente de carbono no costosa que producen altos niveles de tensioactivos y que consumen la menor cantidad de petróleo de peso molecular ligero (C6-C8) . El consumo de alcanos de cadena corta puede determinarse mediante el análisis del petróleo residual en el recipiente de reacción. Un método más sensible emplea un alcano marcado con isótopo de carbono 14. Pueden medirse pequeñas cantidades de captación de carbono isotópico en las células. De manera alternativa, la velocidad puede determinarse a partir del dióxido de carbono isotópico producido.

De este grupo de microorganismos modificados, los halófilos seleccionados son analizados para determinar su capacidad para movilizar el petróleo en un set de muestra básica con inyección de agua en el laboratorio. Este ensayo consiste en saturar una muestra básica de una roca almacén o una columna empacada con arena con petróleo . Luego se bombea un flujo de agua o salmuera a través de la muestra básica hasta que se lava el petróleo libre. Luego se introduce un cultivo de microorganismos en una solución amortiguadora de cultivo en la muestra básica que todavía contiene petróleo residual. Se deja que la muestra básica inoculada con microorganismos se incube durante una a dos semanas. Luego de la incubación, se pasa un flujo de solución amortiguada con inyección de agua a la muestra y se mide la cantidad de petróleo eliminado por este flujo en función del volumen del flujo de solución amortiguadora. Con esta pequeña prueba de menor escala en el laboratorio, puede medirse y compararse la efectividad de cada cultivo de tipo natural modificado. Los cultivos mejorados deberían mostrar un aumento en la velocidad y en la cantidad total de petróleo eliminado de la muestra. Debería también haber un aumento en la cantidad de microorganismos que indique el crecimiento en el medio con salinidad elevada. Sin embargo, esta prueba corta no indica que haya consumo de petróleo o alcanos de cadena ligera dado que el tiempo durante el cual los microorganismos están en contacto con el petróleo es demasiado breve y no hay forma sencilla de medir el total de petróleo residual.

Por lo tanto, se necesita otro ensayo para determinar el consumo de alcanos de cadena corta. Las condiciones de digestión deberían coincidir con el fluido motor o solución amortiguadora con inyección de agua. Debería contener la fuente de carbono soluble, tal como melaza que se utilizará para complementar el crecimiento. Sin embargo, la fuente de carbono soluble no puede ser un catabolito que causará represión de la degradación de alcanos de los genes de la vía. Un informe sobre las fuentes de carbono que pueden causar represión de las vías de degradación de alcanos en Pseudomonas putida se encuentra en F. Rojo et ál. en J. Bacteriology 2003 185: 4772-4778. La incubación debería ser lo suficientemente larga (varias semanas) para medir la degradación y la pérdida de alcanos o un cambio en la composición total de los hidrocarburos y alcanos o un cambio en la cantidad relativa de varios hidrocarburos si se utiliza una mezcla o una muestra de petróleo. La medida de un microorganismo modificado o seleccionado que será un buen candidato comercial es que no haya disminución, o una disminución relativamente menor, en el hidrocarburo de peso más ligero. En contraste, se realiza este mismo ensayo con los microorganismos nativos aislados del depósito o yacimiento de petróleo. Un ensayo que utiliza únicamente la estimulación de los microorganismos nativos podría producir menos petróleo, o producir petróleo con una fracción mayor de peso molecular elevado. Los mejores cultivos serán aquellos que puedan producir la mayor cantidad de tensioactivos y la mayor cantidad de petróleo sin disminuir el porcentaje de petróleo ligero en las muestras de petróleo.

Ejemplo 3: Adición de ácidos grasos de alcanos de diversas longitudes al petróleo crudo para determinar en forma experimental la emulsión de petróleo a pH alcalino Este análisis se llevó a cabo mediante la mezcla de pequeñas cantidades de ácidos carboxílicos con una muestra de petróleo. La muestra de petróleo utilizada fue una muestra de petróleo con elevada concentración de azufre de la formación de arenisca de Pennsylvania en Byron, Wyoming. Los ácidos carboxílicos utilizados en el ensayo fueron: un ácido de 16 carbonos (hexadecanoico) Ci6H3202, un ácido de 8 carbonos (octanoico) 0??.1602, un ácido de 4 carbonos (butanoico) C4H802, un ácido de tres carbonos C3H602 y un ácido de 2 carbonos C2H402. Se agregó una cantidad de ácido aproximadamente suficiente para neutralizar 1.0 mg de KOH por gramo de petróleo o un número de acidez de 1.0. Se calentaron el ácido orgánico y el petróleo hasta alrededor de 50 °C durante 30 minutos para disolver el ácido en el petróleo. Luego, se mezcló el petróleo con la arena en una relación de 3 mi (2.67 g) de petróleo con 10 g de arena. La arena era arena limpia de 30 mesh de Home Depot. Se empaquetó la mezcla de petróleo y arena en una columna pequeña y luego se eluyó con el fluido motor de ensayo mediante flujo por gravedad. Todas las eluciones de ensayo fueron realizadas a una temperatura ambiente de alrededor de 25 °C. El volumen de elución fue de 20 mi. Se separaron el petróleo y el fluido acuoso, y se pesó el petróleo seco. La primera elución se realizó con una solución de salmuera con NaCl al 1 % a pH neutro. La segunda elución se realizó con una solución de salmuera con NaCl al 1 %, NaOH al 0.05 % a aproximadamente pH 12. La tercera elución fue salmuera con Tween 20 al 1 %, NaCl al 1 % y NaOH al 0.05 % a pH 12. La primera elución se realizó para evaluar una inyección con agua con salmuera. La segunda, para evaluar una inundación alcalina y la tercera, para representar una inundación alcalina con tensioactivos químicos. Los resultados indican que la elución de petróleo adicional a pH alcalino fue afectada por la cadena larga del ácido graso. Los ácidos grasos más largos aumentaron la viscosidad del petróleo y disminuyeron la elución de arena, que tenía más impacto que el jabón de los ácidos grasos para ayudar en la emulsión del petróleo. Los ácidos grasos de cadena más corta fueron menos solubles en el petróleo y más solubles en el agua, y no fueron tan eficaces para la emulsión de petróleo con salmuera. El efecto depende de la temperatura y el experimento de elución debe llevarse a cabo a aproximadamente la misma temperatura que se espera en la formación del yacimiento. Esto también se hace para determinar mejor el intervalo de tamaño preferido para los ácidos grasos producidos en forma microbiana a partir de la degradación del petróleo crudo del yacimiento.

Puede realizarse un ensayo similar a pequeña escala con el petróleo crudo parcialmente biodegradado. El petróleo modificado puede ser extraído con una concentración estándar de hidróxido de sodio y luego retitulado para determinar la cantidad de ácidos grasos extraíbles. Los ácidos grasos extraídos pueden ser determinados mediante la conversión de ésteres metílicos para análisis por cromatografía de gases. Además, es posible utilizar las columnas empacadas con arena para evaluar la elución alcalina del petróleo parcialmente degradado. Puede evaluarse el grado de biodegradación del petróleo mediante una combinación de número de acidez, tipo de ácidos grasos, análisis por cromatografía de gases de petróleo degradado y no degradado, y recuperación de petróleo de columnas empacadas con arena. Los microorganismos preferidos son los cultivos que pueden aumentar el número de acidez y el tipo de ácidos que son mejores para una mayor elución con inundación alcalina y que degradan menos los hidrocarburos de cadena más corta .

Tabla 1 Resultados de elución de columna empacada con arena Petróleo recuperado (gramos) de 10 g de arena/3 mL (2.67 g) en columna Byron Ejemplo 4 Eliminación de genes en la vía de degradación de ácidos grasos y alcanos de Haloferax volcanii Se ha demostrado que la proteína acil coenzima A deshidrogenasa, codificada por el gen fadE, es necesaria en E. coli para la degradación eficaz de los ácidos grasos mediante la vía de beta oxidación. En la cepa B23 de Geobacillus thermoleovorans que degrada alcanos, se identificó la proteína aldehido deshidrogenasa, AldH, y se demostró que convierte varios aldehidos grasos en ácidos grasos. De manera similar, se demostró que una aldehido graso deshidrogenasa codificada por aldl en la cepa M-l de Acinetobacter sp. convierte varios aldehidos grasos en ácidos grasos.

Se llevaron a cabo búsquedas de FadE, Aldh y Aldl en la base de datos Genbank con BLASTP para encontrar coincidencias en la secuencia genómica de Haloferax volcanii DS2. La mejor coincidencia para FadE consiste en Acd3 (YP_003535250.1) . La mejor coincidencia tanto para AldH como para Aldl fue AldY5 (YP_003533953.1) .

Se produjeron bloqueos directos de los genes acd3 y aldY5 mediante recombinación homologa en la cepa GFF127, un aislado de Haloferax volcanii DS2 que contiene un bloqueo del gen pyrE2 con un marcador de resistencia a mevinolina (es decir, pyrE2ñ : :MEV) . Se construyeron segmentos lineales de ADN que contenían 1000 nucleótidos de secuencia inmediatamente anterior al gen diana, seguido del gen pyrE2 de Haloferax volcanii , seguido por una secuencia de 1000 nucleótidos inmediatamente posterior al gen diana para el bloqueo de genes . Los segmentos de ADN fueron generados mediante una estrategia de fusión por PCR en la que se amplificaron por PCR tres partes de un segmento (gen de flanqueo y gen pyrE2) en una primera etapa, independientemente del genoma de Haloferax volcanii. Los cebadores para la amplificación del gen pyrE2 en los extremos anterior y posterior contenían secuencias en los extremos 51 que coincidían con las secuencias de flanqueo anterior y posterior del gen señalado para bloqueo. En una etapa posterior, se ensamblaron las tres partes del segmento en una reacción por PCR que contenía tres partes y cebadores de PCR en cualquier extremo del segmento. Luego se transformaron los segmentos de ADN en GFF127 mediante transformación PEG (Dyall-Smith, The Halohandbook : protocols for haloarchaeal genetics, 2009) y se seleccionó el gen pyrE2 en el medio carente de uracilo (medio Hv-Ca) . Se aislaron las colonias transformantes. Se confirmó el reemplazo de los genes diana mediante amplificación por PCR de los empalmes en ambos extremos de los sitios de integración con un cebador interno al marcador pyrE2 y un cebador externo a la construcción de integración, aproximadamente 1.2 kb anterior o posterior. La banda de PCR de aproximadamente 1.3 kilobases generada a partir de los genomas de múltiples aislados mutantes, pero no a partir de Haloferax volcanii de tipo natural, demostró el bloqueo exitoso de los genes acd3 y aldY5 (ver la Figura 5) . Se confirmó la ausencia del gen diana en los genomas de mutantes aislados por la ausencia de un producto de PCR generado con un par de cebadores de ADN interno al gen (491 o 480 pares de bases para los genes acd3 y aldY5, respectivamente) . Como control, se observó el producto de PCR interno cuando se llevó a cabo la PCR en comparación con una cepa de tipo natural.

Ejemplo 5: Determinación del efecto de los inhibidores químicos para aumentar el contenido ácido del petróleo Procedimiento experimental : Se utilizó un microorganismo que degrada petróleo para evaluar el uso de los inhibidores químicos para enlentecer la utilización de hidrocarburos en petróleo. En un ejemplo no taxativo, se informó que se evaluaron tres compuestos químicos diferentes que inhiben la betaoxidación en petróleo y en medio de cultivo en una muestra de petróleo con una cepa de Rhodococcus rhodochrous ATCC # 53968 en medio mínimo m9. Con el fin de evaluar la capacidad de cada inhibidor químico para enlentecer el consumo de ácidos grasos, se generó un cultivo de bacterias en una muestra de petróleo crudo durante tres días con el petróleo crudo como única fuente de carbono.

Se prepararon cuatro matraces, cada uno con una relación media de petróleo/agua de 1 a 5 (10 mi de petróleo crudo cada 50 mi de medio de cultivo) . Se añadió cada uno de los tres inhibidores químicos en un matraz diferente y se dejó digerir en un cuarto matraz como control sin agregar inhibidor químico. Se agitaron los matraces a una temperatura ambiente de alrededor de 25 °C en condiciones aeróbicas . Se monitoreó el progreso de la digestión microbiana por densidad óptica a 600 nm y mediante observación del color oleoso marrón en la fase acuosa. Tres días después de agregar los inhibidores, o a los seis días de incubación con petróleo, se retiró una pequeña muestra de petróleo (0.31 g) . Luego de otros 6 días, se extrajo una segunda muestra del mismo tamaño. Se extrajeron los ácidos orgánicos de cada muestra de petróleo con NaOH al 1 % en etanol al 70 % y se agitaron las muestras en forma vigorosa durante 1 minuto. Entonces, se extrajo el material extraíble acuoso con hexano para eliminar cualquier resto de petróleo. Se secaron las muestras de ácidos orgánicos extraídos al vacío y se convirtieron en ésteres metílicos con BF3 en metanol .

Se analizaron las muestras de ésteres metílicos mediante GC (cromatografía de gases) con HP (Hewlett Packard) 5890 GC con una columna capilar Agilent Technologies, HP-5 (PH reticulado 5 %) ME Siloxane 0.25 micrómetros de recubrimiento, una longitud de 30 metros y un ID (diámetro interno) de columna de 0.32 mm. Se utilizó helio como gas portador. La detección se llevó a cabo con un detector FID y se integraron las áreas con máximos con un integrador HP 3396. El programa de temperatura mantuvo una temperatura de 40 °C durante 1.0 minutos, luego aumentó 15 grados por minuto hasta 280 °C y finalmente mantuvo una temperatura de 280 °C durante 5 minutos. Se agregó una solución madre de 2 -bromooctanoato y 2-bromohexadecanoato a una muestra de petróleo crudo no digerido del Río Rojo y luego se extrajo por el mismo procedimiento que las muestras de petróleo biodigeridas para cuantificar la cantidad de ácidos orgánicos extraídos mediante este procedimiento. El área promedio para estos dos ácidos orgánicos fue usada para estimar la cantidad de ácidos orgánicos en micromoles por unidad de área determinada por el integrador de GC. Se calculó que el número fue aproximadamente de 1.0 micromoles por 100 unidades de área. En la Tabla 2 se enumeran las unidades de área de los picos de GC. Se utilizó este número para estimar los micromoles de ácidos orgánicos extraídos del petróleo. Esta estimación fue utilizada para calcular la cantidad en mg de KOH equivalente a la cantidad estimada de micromoles de ácido orgánico. Se menciona este número en la última fila de la Tabla 2 como el AN (número de acidez) calculado para cada experimento de digestión. Tres de los números estimados se basan únicamente en ácidos orgánicos que son lo suficientemente hidrofóbicos como para permanecer en la fase oleosa y no moverse hacia la fase acuosa. Los ácidos orgánicos medidos incluyen los ácidos carboxílicos producidos por las bacterias y que fueron secretados fuera de las células y migraron nuevamente hacia la fase oleosa. También son hidrocarburos lo suficientemente pequeños como para ser extraídos en el solvente de extracción acuoso de etanol . Es probable que este número sea menor que el número total de acidez (TAN) , una medida que se suele utilizar para evaluar la respuesta del petróleo crudo a la inyección con agua alcalina.

Al finalizar el experimento, se separaron el petróleo y el agua y se determinó el volumen. El volumen de petróleo fue de 11.5 mi para la muestra sin inhibidor, 10.0 mi para la muestra con 2 -bromooctanoato y 9.0 mi para la muestra con 2-bromohexadecanoato . El volumen de petróleo de la muestra con ácido acrílico había aumentado hasta 33.5 mi. Esto indicó que en algún punto durante el experimento, el petróleo formó una emulsión de agua en petróleo estable, que podría haber acarreado una disminución en la cantidad de petróleo retirado en los 0.31 g retirados el día 6 y el día 12 para análisis por GC. Se podría haber informado una cantidad menor de ésteres metílicos determinados mediante análisis por GC. Se determinó que la cantidad de fase acuosa fue de 22.5 mi para la muestra de ácido acrílico y de 46 mi, 48 mi y 47.5 mi para las otras. Esto refuerza las pruebas de que se formó una emulsión de agua en petróleo. Una vez terminado el experimento, se utilizó un volumen mayor a 1 mi para determinar el número de acidez mediante extracción alcalina alcohólica de ácidos y titulación inversa con pH ácido a neutro. Esto es similar al método utilizado para la formación de ásteres metílicos mediante GC que informan A.G. Shepherd et ál . en Energy Fuels 2010, 24, págs . 2300-2311 DOI : 10.1021/ef900949m. La incorporación de medio acuoso en la forma de emulsión estable de la digestión inhibida con ácido acrílico interfirió con la titulación inversa para determinar los ácidos carboxílicos extraídos. El número de acidez de la emulsión fue aproximadamente el doble que el de las otras muestras de petróleo, sin correcciones para la menor concentración de petróleo utilizada en 1 g de emulsión. Los números de acidez finales fueron de 10 mg de KOH por gramo de emulsión oleosa producida a partir de la digestión inhibida con ácido acrílico. El número de acidez calculado para la digestión no inhibida fue de 5 mg de KOH por gramo. Se analizaron las otras dos digestiones inhibidas y se encontró que 4.5 mg de ácido 2 -bromooctanoico y 6.5 de ácido 2-bromohexadecanoico inhibieron la digestión. Se determinó que el petróleo no diferido tiene un número de acidez de 6.5 mg de KOH mediante análisis de una muestra de 1 gramo y una muestra de 10 gramos. Idealmente, este análisis ácido debería llevarse a cabo en muestras de 10 a 50 gramos para mayor precisión.

Resultados ; En la Tabla 2 se enumeran las unidades de área del integrador de alrededor de 20 picos de GC que se observaron en cada una de las muestras digeridas del petróleo del Río Rojo. La muestra no digerida de petróleo mostró un nivel bajo de picos de éster metílico. Se cree que los picos de elución más temprana representan ésteres metílicos de ácidos carboxílicos de hidrocarburos livianos y que los picos de elución más tardía representan ésteres metílicos de los ácidos orgánicos más pesados. Se compara el subtotal de las unidades de área de los picos que eluyen antes de que transcurran 13 minutos con el subtotal de los picos que eluyen posteriormente. Se enumera la totalidad de los picos seleccionados y de todos los picos integrados mediante el integrador por GC a continuación en cada columna. Se enumeran las unidades de área totales para todos los picos integrados por el integrador por GC para todas las muestras del yacimiento de petróleo en el Río Rojo en Montana.

Análisis de los resultados; El análisis por GC de la digestión con 2-bromohexadecanoato mostró un pico muy grande a los 14 minutos correspondiente al tiempo de retención del compuesto inhibidor. También se observaron algunos picos grandes más tempranos entre los 9 y los 13 minutos, los que dificultaron la determinación del aumento de ácidos grasos de la digestión de petróleo. Además, la cantidad de este pico fue mayor que la concentración de 2 -bromohexadecanoato agregada como inhibidor al medio acuoso. Se asumió que el inhibidor de hidrocarburos de cadena larga fue absorbido en la fase oleosa a una concentración mayor. Por lo tanto, el área total de picos informada para este inhibidor es mayor debido al éster metílico de 2 -bromohexadecanoato . Se observó un pico mucho menor para el 2 -bromooctanoato y no tuvo efecto de importancia en el área total de picos. No se observaron picos para el éster metílico de ácido acrílico y se cree que no se retiene en la columna de GC a 40 °C.

La digestión con bacterias aumenta la cantidad total de ácidos carboxílicos en todas las muestras. Las digestiones con los inhibidores químicos de betaoxidación producen aproximadamente los mismos o un poco más de picos totales de éster metílico que la digestión bacteriana sin inhibidor. Al comparar el área subtotal de los picos se observa un aumento en la digestión sin inhibición respecto a aquella con ácido acrílico y que las digestiones inhibidas con 2 -bromooctanoato tienen una diferencia relativa en la velocidad de aumento. Los picos de elución más tardía aumentan a una velocidad mayor con los inhibidores que sin ellos. Por ejemplo, la muestra de 12 días sin inhibidor aumenta de 5.9 a 45.9 unidades de área para picos hasta 13 minutos. La muestra con inhibidor ácido acrílico tiene un aumento de 5.9 a 43.7 unidades de área que inferior al aumento observado sin el inhibidor. Los picos de elución más tardía aumentan de 3.6 a 14.3 sin el inhibidor, pero las áreas de picos posteriores aumentan a 22.5 unidades de área con ácido acrílico. Esto sugiere que los inhibidores enlentecen la conversión de ácidos grasos grandes en ácidos grasos más pequeños. Las medidas de densidad óptica y la observación de las muestras sugieren que las bacterias crecen más rápidamente y digieren el petróleo a mayor velocidad en las digestiones sin inhibición. Luego de 6 días de digestión, la densidad óptica alcanzó los 2.23 para la digestión sin inhibición, comparada con valores de 0.49 para la muestra inhibida con ácido acrílico, 1.84 para el ácido 2 -bromooctanoico y 2.4 para el ácido 2 -bromohexadecanoico . Luego de 12 días de digestión, la muestra sin inhibición alcanzó un valor de 4.0 , el ácido acrílico aumentó a 1.7, y a 2.2 y 2.4 los otros dos inhibidores. Por lo tanto, con este análisis experimental es posible determinar qué inhibidores aumentan el contenido de ácido carboxílico o el número de acidez del petróleo más rápidamente con la menor cantidad de consumo de petróleo. El consumo de petróleo puede ser determinado mediante la cuantificación del petróleo restante o mediante el crecimiento de bacterias con petróleo como única fuente de carbono. Parece que todos los inhibidores ayudaron a reducir el uso de ácidos grasos y el consumo de petróleo al tiempo que produjeron un aumento en el número de acidez. También parece que el ácido acrílico fue el más útil dado que también ayudó a formar una emulsión estable de agua en petróleo, que también podría mejorar la recuperación de petróleo.

Tabla 2 Ejemplo 6: Modificación genética de un microorganismo resistente a la alcalinidad para la producción de tensioactivos Columnas empacadas con arena : Se utilizaron dos cepas de Pseudomonas como bacterias huésped resistentes a la alcalinidad en las que introducir grupos de ensayo de genes para la expresión heteróloga y la producción de biotensioactivos . Los biotensioactivos fueron producidos en un medio que contenía una fuente de carbono simple y que no estaba en contacto con petróleo. Tal producción no estaba vinculada al metabolismo de los hidrocarburos de cadena corta.

Introducción de genes de producción de tensioactivos de ramnolípidos rhlAB en cepas alcalófilas de Pseudomonas alcaliphila y Pseudomonas toyotomiensis El operón rhlAB de Pseudomonas aeruginosa PAOl (ATCC BAA-47) codifica genes para la producción de un biotensioactivo ramnolípido. Se ha demostrado que la expresión heteróloga de los genes rhlA y rhlB que codifican una enzima de ramnosil transferasa 1 es suficiente para producir monorramnolípidos con actividad biotensioactiva en E.coli (Ochsner et ál . 1994; Fang et ál . DOE report 2007) y P.putida (Wittgens, 2011) .

Se introdujeron los genes rhlA y rhlB en las especies alcalófilas de Pseudomonas y se expresaron en ellas en forma heteróloga. Se amplificaron los genes rhlA y rhlB por una única PCR de ADN genómico de Pseudomonas aeruginosa PA01 con cebadores prGFF286 (que contienen un sitio de restricción de Kpnl, un sitio de unión ribosomal y el comienzo de una secuencia de ORF de rhlA) y prGFF287 (que contiene un sitio de restricción de Xbal, un codón de terminación adicional y el final de la secuencia de ORF de rhlB) . Se digirió el fragmento resultante con Kpnl y Xbal, y posteriormente se clonó en el plásmido pBBRlMCS digerido con Kpnl/Xbal, con lo que la expresión génica de rhlAB queda controlada por el promotor LacZ en pBBRlMCS. Se secuenció el plásmido resultante, pGFF88, en el inserto y en las uniones del inserto para comprobar la fidelidad de la clonación celular. Se transformó los plásmidos pBBRlMCS y pGFF88 en Pseudomonas alcaliphila (DSM 17744) y Pseudomonas toyotomiensis (JCM15604) mediante electroporación (modificada de Sonnenschein et ál . , 2011 J. Microbiological Methods) . En resumen, se esparcieron las células en dos placas Mh-YCA (por litro: 25 g de NaCl , 15 g de ágar, 5 g de extracto de levadura, 5 g de casaminoácidos , 1 g de glutamato de sodio, 1 g de NH4C1, 1 g de KH2P04, 1 g de KCl , 200 mg de MgS04-7H20, 36 mg de FeC12-4H20, 0.36 mg de MnCl-4H20, ajustado a pH 7.0 con Na2C03) y se dejaron crecer durante la noche a 30 °C. Se rasparon las células en un volumen total de 4 mi de solución amortiguadora B3 (glucosa 300 mM, CaCl2 5 mM, HEPES 25 mM, MgCl2 5 mM) , se centrifugaron durante 2 minutos a 20,000 g y se lavaron dos veces con 1 mi de solución amortiguadora B3 helada. Luego se resuspendieron las células en 200 µ? de solución amortiguadora B3 helada. Se mezcló una alícuota de 50 µ? de células con 1 µ? de ADN de pBBRIMCS o pGFF88, se transfirió a una cubeta de electroporación (2 mm) , se sometió a un pulso de 2 kV (10 kV/cm) y se agregaron 900 µ? de medio SOC. Se transfirió la suspensión a un tubo de cultivo, se incubó durante 12 horas a 30 °C y se esparcieron en placas con medio Mh-YCA que contenía 400 g/ml de cloranfenicol . Se incubaron las placas a 30 °C. Se aislaron las colonias y se comprobaron por PCR, con cebadores de flanqueo del sitio de clonación múltiple pBBRIMCS y cebadores internos a la secuencia rhlAB. Además, se amplificaron por PCR las secuencias de ADNr y se secuenciaron, con lo que se confirmó que los aislados pertenecían a la especie de Pseudomonas adecuada.

Se evaluó la producción de biotensioactivos ramnolípidos en cepas modificadas con el ensayo de esparcimiento de petróleo (Fang et al., DOE report, 2007). Las células se cultivaron durante tres días a 30 °C en medio YCA-10 (por litro: 25 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 5 g de casaminoácidos , 5 g de Na2C03, 1 g de glutamato de sodio, 1 g de NH4C1, 1 g de KH2P04, 1 g de KCl, 200 mg de MgS04-7H20, 36 mg de FeC12-4H20, 0.36 mg de MnCl-4H20, ajustado a pH 10.0 con KOH) que contiene 5 pg/ml de cloranfenicol . Para los ensayos de esparcimiento, se colocaron 50 mi de agua destilada en un plato de petri de 15 era y se agregaron 50 µ? de petróleo a la superficie del agua. Se agregó una gota de 10 µ? de suspensión de cultivo o medio a la superficie del petróleo y se midió el diámetro del área de la zona clara (si la hubiera) luego de 2 minutos. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3 Se analizó la producción de ramnolípidos en sobrenadantes de cultivos de seis días de antigüedad en la cepa resultante de P. alcaliphila que presenta el vector rhlAB (GFF 253) con el ensayo de orcinol (tal como lo describen Fang et ál . , DOE report, 2007) . Se compararon los resultados con los estándares de ensayo a partir de ramnolípidos (Sigma-Aldrich) , lo que indicó que la cepa produjo entre 50 mg/L y 100 rag/L de ramnolípidos .

Columnas empacadas con arena : Se evaluó la capacidad de elución de petróleo en una columna pequeña empacada con arena de un cultivo de seis días para evaluar la capacidad de las cepas modificadas que producen biotensioactivos ramnolípidos. Una columna pequeña empacada con arena tenía un volumen de alrededor de 50 mi y se produjo al llenar una columna de vidrio que contenía agua con arena seca de 30 mesh. Se determinó el volumen de poro mediante la determinación del peso de la columna vacía, el peso de la arena seca necesaria para llenar la columna y el peso final de la columna llena de arena y agua. Se prepararon dos columnas de esta forma. La columna #1 tenía un volumen de poro de 21.5 mi y la columna #2 tenía un volumen de poro de 22.8 mi. Se bombeó petróleo en la parte inferior de las columnas verticales para llenar cada columna con petróleo. El petróleo utilizado en este experimento era petróleo moderadamente pesado (API 24) de Ecuador. Se determinó la cantidad de petróleo bombeado en las columnas y el peso fue de 15.4 g para la columna #1 y 15.0 g para la columna # 2. A una densidad de 0.91, el petróleo llenó 16.9 mi de los 21.5 mi de volumen de poro en la columna #1 (79 %) y 16.5 mi de los 22.8 mi de volumen de poro en la columna #2 (72.4 %) .

Luego se eluyó el petróleo con agua a una velocidad de flujo de alrededor de 6 ml/minuto. Después de aproximadamente 30 volúmenes de poro de agua, se determinó el peso del petróleo eluido. En la columna #1, eluyeron 10.57 g o 68.6 % del petróleo aplicado. En la columna #2, eluyeron 8.73g o 58.2 % del petróleo aplicado. A continuación, se bombearon 30 volúmenes de poro de una solución amortiguadora a pH 10.0 en cada columna para determinar si podría eluir más petróleo con una solución amortiguadora con pH más elevado. El peso adicional de petróleo que eluyó con los 30 volúmenes de poro fue de 0.38 g para la columna #1 y de 0.23 g para la columna #2. Luego se bombeó una alícuota de 50 mi de cada cultivo a través de cada columna a la misma velocidad de flujo durante dos horas, que representó aproximadamente 30 volúmenes de poro de flujo. Se aplicó la cepa de P. alcaliphila que produce biotensioactivos ramnolípidos con el vector rhlAB (GFF 253) a la columna # 1 y la cepa de P. alcaliphila. con un vector vacío sin genes rhlA y rhlB (GFF 255) a la columna #2. Se recuperó una cantidad adicional de 0.57 g con la cepa productora de biotensioactivos y de 0.25 g con el control de vector vacío (GFF 255) . El flujo adicional de soluciones que contenían cada microorganismo durante dos días provocó la elución de otros 0.32 g de la columna #1 y de 0.61 g de la columna #2. Al finalizar el experimento, se extrajo cada columna con una mezcla de hexano y tolueno. Se secó la mezcla extraída con flujo de aire templado (alrededor de 50 °C) durante varios días para eliminar el hexano y el tolueno. Se utilizó el peso de cada muestra para determinar la masa de cada columna. El peso total de petróleo extraído con solventes fue de 2.65 g o 17.2 % del petróleo originalmente aplicado a la columna #1 y 3.31 g o 22.1 % de la columna #2. El total de petróleo recuperado de la columna #1 fue de 11.84 g o 76.9 % con elución acuosa y 14.49 g o 94.1 % del petróleo aplicado con extracción total. El total de petróleo recuperado de la columna #2 fue de 9.82 g o 65.5 % con elución acuosa y 13.13 g u 87.5 % del petróleo aplicado con extracción total.

La cantidad de petróleo eluido inmediatamente después de la aplicación de microorganismos productores de tensioactivos fue mayor que en la aplicación de microorganismos con el vector vacío, que no exhibió la presencia de tensioactivo en el ensayo de esparcimiento de petróleo. Sin embargo, durante los dos días posteriores a la elución luego de la aplicación inicial de microorganismos, se eluyó un poco más de petróleo con el control de vector vacío (GFF255 contra GFF253) . La cantidad de petróleo eluida con el ramnolípido fue relativamente pequeña y puede haberse visto limitada por el bajo nivel de producción (50 a 100 mg/1) o por el hecho de que el ramnolípido es menos activo a un pH elevado y es más adecuado para un pH neutro o levemente ácido. Se corrió una columna más grande empacada con arena de 250 mi a pH 7 para evaluar el efecto del pH.

Se empaquetó la columna más grande en la misma forma que la más pequeña, y se colocaron 422.5 g de arena con un volumen de poro de 101.1 mi en la columna #1 y 427.1 g de arena y un volumen de poro de 100.8 mi en la columna #2. Se llenó cada columna con petróleo mediante bombeo desde la parte inferior hasta que comenzó a eluir petróleo por la parte superior. Se bombeó un total de 88 g de petróleo en la columna #1 y de 83.5 g en la columna #2. Se dejó el petróleo en la columna durante dos días antes de aplicar las soluciones de medio amortiguado. La velocidad de flujo se redujo a 1.0 ml/minuto para las columnas más grandes y se recogió cada muestra de 50 mi que eluyó para los dos primeros volúmenes de poro (200 mi) . Se determinó la cantidad de petróleo mediante la eliminación del agua de cada tubo de recolección y la determinación del peso del petróleo remanente. El fluido utilizado en ambas columnas fue el medio a pH 1 en el que se cultivaron los microorganismos. Se recogieron los siguientes 500 mi, o 5 volúmenes de poro, como muestras de 100 mi y se determinó el peso del petróleo en la misma forma. Al final del volumen de poro número 7, se aplicó cada uno de los dos cultivos bacterianos diferentes a una de las dos columnas. Se aplicaron las células productoras de ramnolípidos (GFF253) a la columna # 1 y las células de control de vector vacío (GFF255) a la columna #2. Los siguientes dos volúmenes de poro fueron recogidos como muestras de 50 mi y se determinó el peso del petróleo eluido mediante eliminación del agua, tal como se describió anteriormente. Los cuatro volúmenes de poro posteriores eluyeron y fueron recogidos como dos muestras de dos volúmenes de poro cada una. Se determinó la cantidad de petróleo en cada muestra y se enumera en la Tabla 4 que se encuentra más adelante. Al finalizar el experimento de elución acuosa, se secaron las columnas con flujo de aire y luego se extrajo con 100 mi de tolueno. Se secó el tolueno con flujo de aire templado hasta que se eliminó todo el solvente volátil. El peso final de extracto de tolueno luego de algunos días de secado indicó la cantidad de petróleo no recuperado que permanecía en las columnas luego de las extracciones bacterianas.

Los resultados de la columna de pH neutro fueron similares a los de la columna más pequeña de pH elevado. Eluyó más petróleo con las bacterias que producen los ramnolípidos en el primer volumen de poro posterior a la inyección de células. Se observó que los microorganismos de control (GFF255) que contenían un vector vacío sin genes que codificara la producción de ramnolípidos parecían tener un efecto retardado en la elución' del petróleo. Esto podría deberse a la mayor densidad celular de GFF255 en comparación con la cepa GFF253 (densidad óptica 4.25 a 600 nm contra 2.48 para la cepa GFF253) .

La cantidad de petróleo que eluyó efectivamente como resultado del ramnolípido fue pequeña. Aunque el gen se transfirió en forma exitosa a la cepa resistente a la alcalinidad, tal como se mostró anteriormente, la elución de petróleo fue poca. Esto puede deberse a los bajos niveles de expresión o a la ineficacia de este biotensioactivo en particular a pH elevado. Sin embargo, representa una forma útil para medir el beneficio de diversos biotensioactivos para recuperar petróleo.

Tabla 4 Ejemplo 7: Introducción de otras vías de producción de biotensioactivos en otros microorganismos resistentes a la alcalinidad : Introducción de genes de producción de biotensioactivos ramnolípidos en Bacillus halodurans resistente a la alcalinidad Se introdujeron rhlA y rhlB en la cepa C-125 de Bacillus halodurans (JCM9153), una cepa resistente a la alcalinidad que crece en condiciones de pH elevado por encima de 11. Se amplificaron los genes rhlA y rhlB por una única PCR de ADN genómico de Pseudomonas aeruginosa PAOl con cebadores prGFF296 (que contienen el comienzo del ORF de rhlA) y prGFF300 (que contiene un sitio de restricción de SacI, un codón de terminación adicional y el final de la secuencia de ORF de rhlB) . Se generaron un fragmento de ADN que contiene el sitio de restricción Salí, el promotor hag (sigmaD) y el comienzo del gen rhlA mediante PCR de ADN genómico de B. halodurans con cebadores prGFF294 (que contienen un sitio de restricción Salí y una secuencia anterior al ORF de hag) y prGFF295 (que contiene la secuencia inversa complementaria al comienzo del ORF de rhlA seguida de la secuencia inversa complementaria a una secuencia promotora hag inmediatamente anterior al hag ORF) . En una PCR posterior, se unieron los dos fragmentos y se amplificaron como si fueran un fragmento solo con los cebadores prGFF294 y prGFF300. Se digirió el fragmento resultante con Salí y SacI, y luego se clonó en el plásmido p W33N digerido con Sall/Sacl. Se secuenció el plásmido resultante, pGFF94, en el inserto y en las uniones del inserto para comprobar la fidelidad de la clonación celular. Se transformaron los plásmidos p W33N y pGFF94 en B.haloduransJCM9153 y se colocaron en placas en un medio nutriente de ágar que contenía 3 pg/ml de cloranfenicol , tal como se describió anteriormente (Wallace, 2011) . Se aislaron las colonias y se confirmó la presencia del plásmido en los aislados mediante PCR con cebadores que flanqueaban los sitios múltiples de clonación p W33N y con cebadores internos a la secuencia rhlAB.

Introducción de genes de producción de biotensioactivos de surfactina en Bacillus halodurans resistente a la alcalinidad En un ejemplo, se introdujo un segmento de ADN que contenía el operón para la producción de surfactina que incluye srfAA, srfAB, comS, srfAC, srfAD, ycxA, ycxB, ycxC, ycxD y sfp de la cepa ATCC21332 de Bacillus subtilis en la cepa C-125 de Bacillus halodurans (JCM9153) , una cepa con resistencia a la alcalinidad que crece en condiciones de pH elevado por encima de pH 11. Se amplifica el segmento de ADN en una única PCR a partir de ADN genómico de la cepa ATCC21332 de Bacillus subtilis con cebadores prGFF314 (que contiene un sitio de restricción Sbfl y una secuencia anterior al ORF de srfAA) y prGFF315 (que contiene una secuencia de sitio de restricción SwaI posterior a la secuencia de ORF de sfp) . El fragmento resultante se digiere con Sbfl y SwaI, y posteriormente se clona en el plásmido pNW33N digerido con Sbfl/Smal. Se introduce el plásmido resultante en la cepa C-125 de Bacillus halodurans (JCM9153) a través de los métodos establecidos. De manera alternativa, se introduce un segmento de ADN que contiene los mismos genes en la cepa C-125 de Bacillus halodurans (JCM9153) regulado por un promotor diferente para la expresión óptima en Bacillus halodurans. Por ejemplo, se amplifica con PCR el promotor anterior al gen hag de la cepa C-125 de Bacillus halodurans (JCM9153) con los cebadores prGFF313 (que contiene un sitio de restricción hindIII seguido por una secuencia que coincide con el extremo 5 prima del promotor) y prGFF312 (que contiene un sitio de restricción Sbfl seguido por una secuencia inversa complementaria al promotor hag inmediatamente anterior al sitio de unión ribosomal) . Se corta el fragmento resultante y se liga a pNW33N en los sitios HindIII y Sbfl. Se amplificó con PCR un segmento de ADN que contenía el operón de producción de surfactina que incluye srfAA, srfAB, comS, srfAC, srfAD, ycxA, ycxB, ycxC, ycxD y sfp de la cepa ATCC21332 de Bacillus subtilis con prGFF311 (que contiene un sitio de restricción Sbfl, un sitio de unión ribosomal y una secuencia que coincide con el comienzo del ORF de srfAA) y prGFF315 (que contiene una secuencia de sitio de restricción SwaI posterior a la secuencia de ORF de sfp) . Se corta el segmento resultante con Sbfl y SwaI y se clona en los sitios Sbfl y Smal del vector pN 33N que contiene el promotor hag, y el operón de surfactina quedó regulado por el promotor hag. Se introduce el plásmido resultante en la cepa C-125 de Bacillus halodurans (JCM9153) a través de los métodos establecidos.

Tabla 5 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método de mejora de la recuperación de petróleo caracterizado porque comprende (a) inocular un yacimiento de petróleo con un consorcio que comprende microorganismos que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad y que tienen una capacidad deficiente para utilizar hidrocarburos de cadena corta de 12 carbonos o menos, pero tienen la capacidad de convertir hidrocarburos en ácidos grasos, (b) permitir que el consorcio prolifere y degrade hidrocarburos de más de 12 carbonos y (c) lograr una recuperación mejorada de petróleo del yacimiento de petróleo.

2. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque la etapa (b) se desarrolla en condiciones alcalinas:

3. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos que son naturalmente alcalófilos, haloalcalófilos o resistentes a la alcalinidad.

4. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos que son modificados para ser alcalófilos, haloalcalófilos o resistentes a la alcalinidad.

5. El método de conformidad con la reivindiación 1, 2, 3 ó 4, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos que tienen naturalmente una capacidad deficiente para degradar hidrocarburos de cadena corta de 12 carbonos o menos .

6. El método de conformidad con la reivindiación 1, 2, 3 ó 4, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos modificados para ser incapaces de degradar hidrocarburos de cadena corta de 12 carbonos o menos .

7. El método de conformidad con la reivindiación 6, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos en los que se disminuyen, eliminan o modifican una o más vías metabólicas de degradación de hidrocarburos de cadena corta de 12 carbonos o menos.

8. El método de conformidad con la reivindiación 1, 2, 3 ó 4, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos que tienen naturalmente la capacidad de degradar hidrocarburos de cadena de más de 12 carbonos .

9. El método de conformidad con la reivindiación 1, 2, 3 ó 4, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos modificados para que sean capaces de degradar hidrocarburos de cadena de más de 12 carbonos .

10. El método de conformidad con la reivindiación 9, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos en los que se introducen una o más vías metabólicas para degradar cadenas de hidrocarburos de más de 12 carbonos.

11. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos de elevado peso molecular presentes en el yacimiento de petróleo como fuente de carbono .

12. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos que adicionalmente son capaces de crecer en un entorno con salinidad elevada.

13. El método de conformidad con la reivindiación 12, caracterizado porque el entorno de salinidad elevada se encuentra en el caracterizado porque yacimiento.

14. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos capaces de utilizar carbonos simples.

15. El método de conformidad con la reivindiación 14, caracterizado porque los carbonos simples son seleccionados del grupo que consta de glucosa, sacarosa, mañosa, almidón, glicerina, ácidos orgánicos y otros azúcares sencillos.

16. El método de conformidad con la reivindiación 1, 11, 12, 13, 14 ó 15, caracterizado porque en la etapa (a) se inyecta una mezcla de nutrientes que comprende una fuente de carbono soluble en el yacimiento de petróleo junto con el consorcio .

17. El método de conformidad con la reivindiación 16, caracterizado porque la mezcla de nutrientes comprende al menos un nutriente no hidrocarburo.

18. El método de conformidad con la reivindiación 17, caracterizado porque el nutriente no hidrocarburo es seleccionado del grupo que consta de extracto de levadura, peptona, succinato, lactato, formato, acetato, propionato, glutamato, glicina, lisina, citrato, glucosa y soluciones vitamínicas .

19. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque los microorganismos son del dominio Archaea y/o son bacterias.

20. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio es capaz de crecer a pH 9.0 o mayor.

21. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio es capaz de crecer a pH 10.0 o mayor .

22. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de utilizar hidrocarburos aromáticos.

23. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos, alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, que tienen la capacidad de utilizar hidrocarburos modificados que contienen azufre.

24. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de utilizar hidrocarburos modificados que contienen nitrógeno.

25. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de producir tensioactivos .

26. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que tienen la capacidad de producir polímeros extracelulares .

27. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque comprende además la etapa de inyección con agua en tal yacimiento con un fluido alcalino o un fluido que contiene un compuesto tóxico para los microorganismos nativos, con el fin de reducir la concentración de microorganismos que tienen la capacidad de utilizar tales hidrocarburos de cadena corta de 12 carbonos o menos .

28. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente la etapa de adición al yacimiento de al menos un inhibidor químico para controlar una vía metabólica de al menos un microorganismo nativo presente en el yacimiento y/o un microorganismo haloalcalófilo, alcalófilo obligado o resistente a la alcalinidad que fue inoculado en el yacimiento.

29. El método de conformidad con la reivindiación 28, caracterizado porque el inhibidor químico inhibe la degradación de alcanos de cadena corta mediante los microorganismos nativos y/o que fueron inoculados.

30. Un microorganismo aislado del dominio Archaea o bacteria caracterizado porque (i) es un haloalcalófilo, alcalófilo obligado o resistente a la alcalinidad, y (ii) tiene una capacidad deficiente de degradación de hidrocarburos de cadena corta de 12 carbonos o menos.

31. El microorganismo aislado de conformidad con la reivindiación 27, caracterizado porque el microorganismo tiene naturalmente las propiedades (i) y (ii) .

32. El microorganismo aislado de conformidad con la reivindiación 29, caracterizado porque se modifica el microorganismo para que tenga las propiedades (i) y (ii) .

33. El microorganismo de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque pertenece al dominio Archaea.

34. El microorganismo de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque es una bacteria.

35. El microorganismo aislado de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque es capaz de crecer en condiciones de alcalinidad de pH 9.0 o mayor.

.36. El microorganismo aislado de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque es capaz de crecer en condiciones de alcalinidad de pH 10.0 o mayor.

37. El microorganismo de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque tiene la capacidad de utilizar cadenas de hidrocarburos de más de 12 carbonos.

38. El microorganismo aislado de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque tiene la capacidad de utilizar hidrocarburos modificados que contienen azufre.

39. El microorganismo aislado de conformidad con la reivindiación 30, caracterizado porque tiene la capacidad de utilizar hidrocarburos modificados que contienen nitrógeno.

40. Un consorcio caracterizado porque comprende uno o más tipos de microorganismos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 39.

41. Un yacimiento de petróleo caracterizado porque comprende un consorcio de conformidad con la reivindiación 40.

42. El método de conformidad con la reivindiación 1, caracterizado porque el consorcio comprende microorganismos del dominio Archaea y/o bacterias que son haloalcalófilos , alcalófilos obligados o resistentes a la alcalinidad, y que fueron modificados para producir tensioactivos .

43. El método de conformidad con la reivindiación 42, caracterizado porque la producción de tensioactivos no depende de la expresión de genes que codifiquen la degradación de hidrocarburos.