MX2013001583A - Agente profilactico para esteatohepatitis no alcoholica. - Google Patents

Abstract

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente para la prevención o tratamiento de la enfermedad de hígado graso, preferiblemente NAFLD, de manera más preferible NASH. La presente invención proporciona un agente para la prevención o tratamiento de una enfermedad de hígado graso que contiene ibudilast como un agente activo.

Description

AGENTE PROFILACTICO Y TERAPEUTICO PARA ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHOLICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un agente para la prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso no alcohólico, en particular esteatohepatitis no alcohólica que comprende ibudilast como un ingrediente activo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todas las enfermedades de hígado graso que incluyen hígado graso similar a la enfermedad de hígado alcohólico el cual se presenta en personas sin hábito de beber se les denomina enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) . La síntesis de ácido graso en el hígado de pacientes con NAFLD aumenta constantemente . La síntesis de ácido graso en el hígado se considera que es un factor importante involucrado en la formación de hígado graso el cual provoca síndrome metabólico (documento 1 no de patente) .

Además, la sobreexpresión hepática de SREBP-1, un factor de transcripción clave que regula la síntesis hepática de ácido graso, desarrollado hígado graso en ratones (documento 2 no de patente) . Inversamente, se sabe que el bloqueo de la expresión de SREBP-1 atenúa el hígado graso en Ref . : 238675 ratones (documento 3 no de patente) .

La NAFLD generalmente se clasifica a grandes rasgos como un simple hígado graso con un pronóstico favorable y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH, por sus siglas en inglés) la cual acompaña la inflamación y fibrosis se relaciona con un pronóstico pobre y se considera a NASH como un tipo grave de NAFLD (documentos no de patente 4 a 7) .

El mecanismo propuesto para la patogénesis y progreso de NASH involucra actualmente la teoría de dos ataques (documento 4 no de patente) . En la teoría de dos ataques, se desarrolla NASH y progresa por simple hígado graso, el cual se produce por factores ambientales y genéticos, que se considera el "primer ataque", agregado a estrés oxidativo y citocina inflamatoria inducida por hígado graso, lo que se considera el "segundo ataque" (documentos no de patente 8 y 9) .

La terapia en el síndrome metabólico como base patológica de NASH es importante. Por lo tanto, se han utilizado agentes sensibilizantes a insulina, antioxidantes, agentes que disminuyen lípidos, agentes hepatoprotectores y bloqueadores del receptor de angiotensina II (documento 4 no de patente) .

No obstante, se reconoce que hasta la fecha no hay medicina la cual tenga pruebas recomendables en estrategias terapéuticas para NASH. Por ejemplo, se espera que un agente sensibilizante a insulina, pioglitazona, sea un agente de tratamiento para NASH. No obstante, de acuerdo con los resultados de la fase III (PIVENS) , la pioglitazona no tiene mejoras en la fibrosis y no puede satisfacer los criterios originales (documento 10 no de patente) . Además, existen preocupaciones respecto a los efectos secundarios de pioglitazona tales como riesgo de fracturas, ganancia de peso corporal e inicio o empeoramiento de fallo cardíaco (documento 11 nó de patente) .

Por otra parte, el ibudilast se utiliza ampliamente en el ámbito clínico como un agente mej orador de trastorno cerebrovascular, un agente de tratamiento para asma bronquial y un agente de tratamiento para conjuntivitis alérgica y se ha a verificado la seguridad del mismo. Conforme la acción de ibudilast, diversas acciones, tal como mejoramiento de relajante cerebrovascular de prostaciclina (PGI2) (documento 12 no de patente) , mejoramiento de la acción inhibidora de agregación plaquetaria (documento 13 no de patente) , efectos inhibidores en la contracción de las vías respiratorias, acción antagonista de leucotrieno, acción inhibidora de liberación de leucotrieno (documento 14 no de patente) , acción inhibidora de PDE (documento 1 de patente) y acción inhibidora de activación del factor inhibidor de liberación (MIF, por sus siglas en inglés) (documento 15 no de patente) son conocidos. No obstante, nunca se han conocido, efectos sobre la enfermedad del hígado graso, NAFLD, NASH e hígado graso.

LITA DE CITAS DOCUMENTOS DE PATENTE [Documento de patente 1] WO 2004/050091 DOCUMENTOS NO DE PATENTE [Documento 1 no de patente] Shinji, T. et al., 2005, J". Clin. Invest., 115:1139-1142 [Documento 2 no de patente] Shimano, H., et al., 1996, J. Clin. Invest., 98:1575-1584.

[Documento 3 no de patente] Yahagi , N. et al., 2002,. J. Biol. Chem. , 277:19353-19357 [Documento 4 no de patente] Toshi i Saibara et al., NASH Shinryo best approach (el mejor método para el tratamiento de NASH) Chugai-igakusha, 5 de diciembre del 2008.

[Documento 5 no de patente] Schaffner, F., et al., 1986, Prog. Liver. , Dis . 8:283-298.

[Documento 6 no de patente] Neuschwander-Tetri . B. A., et al., 2003. Hepatology. , 37:1202-1219 [Documento 7 no de patente] Erickson, S.K., et al. 2009, J. Lipid. Res., 50:S412-416.

[Documento 8 no de patente] Day, CP., et al. 1998, Gastroenterology. , 114:842-845 [Documento 9 no de patente] Browning, J.D. et al. , 2004, J". Clin. Invest. 114:147-152.

[Documento 10 no de patente] Sanyal, A. J., et al. 2010, N. Engl. J. Med., 362:1675-1685.

[Documento 11 no de patente] Harrison, S.A., et al. 2010, Hepatology, 51:366-369.

[Documento 12 no de patente] Osashi, M. , et al. 1986, Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. , 280 :216-229.

[Documento 13 no de patente] Ohashi, M . , et al. 1986, Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 283:321-334.

[Documento 14 no de patente] Mitsuo Ohashi, 1989, Zensoku (asma), 2:103-107.

[Documento 15 no de patente] Cho, Y., et al. 2010, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. , 107:11313-11318 SUMARIO DE LA INVENCION PROBLEMAS A SER RESUELTOS POR LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente para la prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso, preferiblemente NAFLD, de manera más preferible NASH.

MEDIO PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS Los inventores han descubierto que ibudilast mejora la totalidad de hígado graso, inflamación hepática y fibrosis hepática las cuales son las condiciones patológicas principales de NASH, y han llevado a cabo la invención.

Específicamente, la presente invención se relaciona con los siguientes incisos (1) a (4) . (1) Un agente para prevenir o tratar enfermedad de hígado graso que comprende ibudilast como un ingrediente activo; : (2) El agente descrito en el inciso (1) , en el cual la enfermedad de hígado graso es enfermedad de hígado graso no alcohólico; (3) El agente descrito en el inciso (2) , en el cual la enfermedad de hígado graso no alcohólico es esteatohepatitis no alcohólica; y (4) El agente descrito en (2) , en el cual la enfermedad de hígado graso no alcohólico es hígado graso simple .

EFECTO DE LA INVENCION Dado que el agente para la prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso de la presente invención comprende ibudilast, puede inhibir la totalidad de la síntesis de ácido graso en un hígado, el hígado graso, la inflamación hepática y la fibrosis hepática y por lo tanto puede evitar eficazmente o tratar una enfermedad de hígado graso, preferiblemente NAFLD, de manera más preferible NASH.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra el efecto de ibudilast sobre la síntesis hepática de ácido graso (administración de 10 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor + el error estándar (n = 5 a 6, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 2 muestra el efecto de ibudxlast sobre el contenido de triglicéridos hepáticos (administración de 10 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor ± el error estándar (n = 5 a 6, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 3 muestra el efecto de ibudxlast sobre el contenido hepática de triglicéridos (administración de 10, 30 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor ± el error estándar (n = 6, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 4 muestra el efecto de ibudilast en la expresión de ARNm para TNF en el hígado (administración de 10, 30 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor + el error estándar (n = 9 a 10, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 5 muestra el efecto de ibudilast en la expresión de ARNm para MCP-1 en el hígado (administración de 10, 30 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor ± el error estándar (n = 9 a 10, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 6 muestra el efecto de ibudilast sobre la expresión de ARNm para IL-?ß en el hígado (administración de 10, 30 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor ± el error estándar (n = 9 a 10, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 7 muestra el efecto de ibudilast en la expresión de ARNm para TGFp en el hígado (administración de 10, 30 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor ± el error estándar (n = 9 a 10, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

La figura 8 muestra el efecto de ibudilast sobre la expresión de ARNm para collal en el hígado (administración de 10, 30 y 100 mg/kg, dos veces al día) . El valor numérico es la media de valor + el error estándar (n = 9 a 10, *p<0.05 en comparación con el vehículo) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En lo siguiente se describirá con detalle la presente invención.

El agente para la prevención o tratamiento de enfermedad con hígado graso en la presente invención comprende ibudilast como un ingrediente activo.

Ibudilast es un compuesto conocido representado por la siguiente fórmula (1) y se puede preparar de acuerdo con un método de preparación conocido (como el descrito en JP-B-52-293138) .

[Fórmula química 1] En la presente invención, la "enfermedad de hígado graso" significa un nombre general para enfermedades en las cuales la grasa neutra se deposita en los hepatocitos y provoca hepatopatía. Incluye enfermedad de hígado alcohólico y enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) .

En la presente invención, la "enfermedad de hígado graso no alcohólico" tiene las mismas definiciones que el hígado graso no alcohólico y la esteatosis hepática no alcohólica. Los ejemplos de enfermedad de hígado graso no alcohólico incluye esteatohepatitis no alcohólica (NASH) e hígado graso simple.

Por ejemplo, la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) es una hepatopatía la cual se caracteriza por depósitos grasos principalmente macrovesiculares en hígado y es similar a lo que se encuentra en tejido de hígado de hepatopatía alcohólica pese a la carencia de antecedentes significativos de ingestión de alcohol y se define como un concepto de la enfermedad que incluye hígado graso simple con un buen pronóstico y NASH progresivo ["NASH-NAFLD no shinryo c gaido" (Guía de diagnóstico de NASH y NAFLD) (editado por The Japan Society of Hepatology, BUNKODO, agosto de 2006)].

Además, los ejemplos de características de enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) incluye las siguientes características. 1. No hay antecedentes significativos de ingestión de alcohol (cantidad de alcohol: 20 g o menos/día). 2. No hay enfermedad crónica hepática la cual se une a causa clara tal como viral (HCV, HBV) o autoinmune . 3. Síndrome metabólico, obesidad, diabetes, hiperlipide ia, hipertensión, hiperuricemia, síndrome de apnea al dormir o similar, son factores de riesgo. La posibilidad de graso simple <NASH aumenta en personas que presentan múltiples factores de riesgo. 4. La causa también incluye varias enfermedades y medicinas las cuales llevan a un metabolismo normal de lípidos o una función mitocondrial anormal.

La esteatohepatitis no alcohólica (NASH) se define, por ejemplo, como sigue {"Diagnosis guide for NASH and NAFLD" (Guía de diagnóstico para NASH y NAFLD" (editada por la The Japan Society of Hepatology, BUNKODO, Agosto del 2006)). 1. Matteoni (Matteoni, C. A., et al. 1999. Gastroenterology..116: 1413-1419) clasificó a NAFLD en cuatro tipos. Tipo 1: hígado graso simple, tipo 2: esteatohepatitis, tipo 3: necrosis de hígado graso (acompañado por degeneración y formación de globos), tipo 4: necrosis de hepatocitos acompañada por cuerpos de mallori o fibrosis (acompañado por degeneración de formación de globos) . La tipo 3 y tipo 4 la cual tiene una frecuencia significativamente alta en progreso a cirrosis y la muerte relacionada con el hígado se define como esteatohepatitis no alcohólica (NASH) a partir del examen de un pronóstico a largo plazo. 2. La American Association for the Study of Liver Diseases define ejemplos de hallazgos esenciales para NASH que incluyen metamorfosis grasa (macrovesicular>microvesicular, presente principalmente en la porción del lóbulo central) , inflamación intralobular (migración ligera de neutrófilos y monocitos) , degeneración del hepatocito en forma de globo (presente principalmente en la zona circundante del cambio graso y en la porción lóbulo central) en la Single Topic Conference 2002 (Neuschwander-Tetri, B.A., et al. 2003. Hepatology, 37: 1202-1219), y se define al tipo 3 y tipo 4 (clasificación de Matteoni) de NAFLD como NASH. 3. Brunt (Brunt, E. M. , et al., 1999. Am. J.

Gastroenterol . 94: 2467-2474) clasifica el, progreso de NASH en cuatro etapas de acuerdo con el nivel de fibrosis: etapa 1: porción del lóbulo central (zona 3), etapa 2: etapa 1 + región portal, etapa 3: formación de reticulado, etapa 4: cirrosis.

En la presente invención, el hígado graso simple es un caso de enfermedades de hígado graso las cuales se caracterizan por únicamente depósitos grasos en hepatocitos y no está acompañada por necrosis de hepatocitos, inflamación y fibrosis .

Los ejemplos de enfermedad de hígado graso a los cuales se aplica el agente para prevención y tratamiento en la presente invención incluyen, preferiblemente, la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) , de manera más preferible la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) o el hígado graso simple, y de manera especialmente preferible la esteatohepatitis no alcohólica..

Como se describe en lo anterior, la teoría de dos ataques se reconoce como un mecanismo detrás del inicio y progreso de NASH (Toshiji Saibara et al., NASH Shinryo best pproach (el mejor enfoque para el tratamiento de NASH) , Chugai-igakusha, 5 de diciembre del 2008) .

En la teoría de dos ataques, NASH se desarrolla y progresa a través del siguiente mecanismo detrás del inicio y el progreso. En primer lugar, se produce acumulación de grasa en hígado (hígado graso) como el primer ataque. Después se produce NASH y progresa por inicio de inflamación hepática y fibrosis hepática debido a estrés oxidativo, citocina inflamatoria o similar causada por el hígado graso, como el segundo ataque. El inicio y progreso de NASH lleva a cirrosis y hepatoma.

Respecto al primer ataque, ibudilast en primer lugar mejora el hígado graso al inhibir la acumulación de grasa en el hígado mediante la inhibición de la actividad lipogénica en hígado y disminuye el contenido de triglicéridos hepáticos. Respecto al segundo ataque, ibudilast mejora la inflamación hepática y la fibrosis hepática al inhibir las gotitas de lípidos y la migración de células inflamatorias en el hígado, inhibiendo el estrés oxidativo y el nivel de expresión de citocinas inflamatorias e. inhibiendo la expresión de un gen en relación a la inflamación hepática y fibrosis hepática. En base en el mecanismo anterior, se considera que ibudilast puede inhibir efectivamente un mecanismo de inicio y progreso de NASH.

El agente para la prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso en la presente invención comprende ibudilast y, si es necesario, se puede mezclar con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos. El portador el cual opcionalmente puede ser mezclado, puede cambiar dependiendo- de la forma de dosificación, la forma de administración o similar. Los ejemplos del portador incluyen excipientes, agentes de unión, desintegrantes, lubricantes, correctivos, sabores, colorantes y edulcorantes, y similares.

Además, el agente para prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso en la presente invención se puede utilizar en diversas formas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos preferibles de la forma incluyen cápsulas, polvos, tabletas, granulos, pelotillas, inyecciones, medicinas líquidas, ungüentos y parches y similares.

Por lo tanto, el agente para prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso en la presente invención se puede administrar al paciente en una forma para administración oral y administración parenteral . Especialmente, entre estas, es preferible la preparación oral considerando la facilidad de uso para un paciente.

La cantidad de ibudilast en el agente para prevención o tratamiento de enfermedad de hígado graso en la presente invención se puede cambiar apropiadamente de acuerdo con la edad del paciente, peso, síntoma y día de administración o similar.

En la administración oral para adultos (aproximadamente 60 kg) , ibudilast se administra preferiblemente a una dosis de 10 mg a 200 mg una vez, de manera más preferible 10 mg a 60 mg una y dos veces ó tres veces al día.

Además, en la forma de inyección para adultos (aproximadamente 60 kg) , ibudilast preferiblemente se administra en una dosis de 10 mg a 200 mg por una vez, de manera más preferible 10 mg a 60 mg por una vez y dos veces a tres veces al día.

EJEMPLOS A continuación, se describirá la presente invención por ejemplos específicos. No obstante, la invención no se limita a estos ejemplos.

EJEMPLO 1 Efectos inhibidores de ibudilast en hígado graso (evaluaciones utilizando modelo de hígado graso) .

En NAFLD, se considera que la síntesis de ácido grasos en el hígado es un factor importante involucrado en la formación de hígado graso (Shinji, T., et al. 2005, J". Clin. Invest. 115:' 1139-1142). Por lo tanto, con referencia a los métodos descritos en Delzenne et al. (Delzenne, N. M . , et al., 1997, J Hepatol., 26: 880-885) y Tsuchida et al. (Tsuchida. A., et al., 2004, J. Bio. Chem. , 279: 30817-30822) , se examinaron los efectos de ibudilast sobre hígado graso mediante la utilización de ratones realimentados en los cuales se incrementó la síntesis de ácido graso en el hígado.

Después de 48 horas de ayuno, ratones machos C57BI/6J, de 8 semanas de edad (CLEA Japan, Inc.) se realimentaron durante cuatro horas. Al grupo vehículo como un control, se les administró por vía oral 2% (v/v) de aceite de ricino hidrogenado y PEG-60 (NIKKOL HCO-60, Nikko Chemicals Co., Ltd.) antes del ayuno y después de los períodos de ayuno de 12, 24, 36 y 48 horas. A los grupos tratados con ibudilast se disolvieron 10 ó 100 mg/kg de ibudilast a 2% (v/v) de aceite de ricino hidrogenado con PEG-60 que se administró oralmente antes del ayuno y después de los períodos de ayuno de 12, 24, 36 y 48 horas.

A los ratones se les volvió a suministrar con la dieta estándar (CE-2, CLEA Japan, Inc.) después de 30 minutos de la administración oral después de los períodos de ayuno de 48 horas y se sometió a análisis anatómico a los ratones después de los períodos de realimentación de cuatro horas. Se midió el contenido de triglicéridos y la biosíntesis de ácido graso en hígado aislado.

Se extrajeron los triglicéridos del hígado mediante la utilización del método mejorado de Folch et al. (Folch, J., et al. 1957, J". Biol . Chem. 226: 497-509). Los tejidos fueron homogeneizados mediante la utilización de una mezcla de cloroformo-metanol 2:1 (v/v) .

El homogeneizado que se obtiene se agita durante una hora para extraer una fracción lipídica seguido por obtención del sobrenadante por centrifugación a sequedad. La extracción se llevó a cabo dos veces en el mismo procedimiento a partir del sedimento de los tejidos y el sobrenadante que se obtiene se mezcla uniéndolo para secado. El extracto seco se disuelve a 4% (v/v) de Tritón X-100 y la concentración de triglicéridos se mide utilizando el reactivo Liquitech TG-II (Roche Diagnostics K.K.). El resultado se muestra por la media de valor + el errór estándar.

El análisis estadístico se realiza utilizando la prueba de comparación múltiple de Williams en donde el nivel de significancia estadística es menor de 5%.

La síntesis de ácido graso en el hígado se mide utilizando la síntesis de ácido graso a partir del ácido acético. El tejido se incuba en 02 95% (v/v) , C02 5% (v/v) , ácido acético 0.5 mM (0.25 µ??/?t??, de ácido [1-14C] acético) y amortiguador HEPES fosfato Krebs-Ringer (pH 7.4) que contiene BSA 0.2% (v/v) durante dos horas a 37 °C. Después, al tejido aislado, se le agrega una solución de etanol que contiene 15% (p/v) de hidróxido de potasio y se incuba durante 2 horas a 85 °C para saponificar.

Después de agregar éter de petróleo y agitación posterior durante 30 minutos, se separa la capa etérea como la capa superior obtenida por centrifugación. Después de que el mismo procedimiento se lleva a cabo dos veces, la capa acuosa se ajusta utilizando ácido clorhídrico a pHl . Después de agregar éter de petróleo y agitar durante 30 minutos se recolecta la capa etérea como la capa superior obtenida por centrifugación. Se lleva a cabo el mismo procedimiento dos veces. Después de mezclar la capa etérea recolectada junta, se obtiene una solución y se seca. Después de que el extracto seco se disuelve en cloroformo se agrega agua purificada a la misma seguido por agitación durante 30 minutos.

Después de centrifugación, la capa de cloroformo se obtiene como la capa inferior. Después el residuo secado se disuelve en metanol, la combinación de centelleo' se mezcla con la solución obtenida para medir la radioactividad utilizando un contador de centelleo líquido (Tri-Craba 1900CA, PerkinElmer) . El resultado se muestra como la media de valor + el error estándar. Se realiza análisis estadístico utilizando la prueba de comparación múltiple de Williams en donde el nivel de significancia estadística es menor de 5%.

Ibudilast disminuye la síntesis de ácido graso en el hígado lo cual se considera importante para formar un hígado graso en ÑAFLD (figura 1) . Además, el contenido de triglicéridos en el hígado el cual es un índice del hígado graso también disminuye significativamente (figura 2) . En consecuencia, se ha demostrado que ibudilast tiene excelentes efectos inhibidores sobre la síntesis de ácidos grasos en el hígado y en el desarrollo de hígado graso.

EJEMPLO 2 Efecto inhibidor de ibudilast en hígado graso (Evaluación utilizando el modelo de hígado graso relacionado con obesidad) La obesidad y la resistencia a insulina se consideran como las bases patológicas principales en NAFLD (Kristina, M. , et al. 2006, J Clin Endocrinol Metab. , 91: 4573-4761) . Por lo tanto, el efecto de ibudilast sobre el hígado graso se evaluó utilizando ratones B6.V-Lepob/J (ob/ob; Charles River Laboratories Japón, Inc.), un modelo de resistencia a insulina e hígado graso relacionado con la obesidad.

Se utilizaron ratones ob/ob machos (Charles River Laboratories Japón, Inc.) a las siete semanas de edad. Al grupo vehículo como un control se le administró dos veces al día por vía oral 2% (v/v) de aceite de ricino hidrogenado con PEG-60 (NIKKOL HCO-60, Nikko Chemicals Co. , Ltd.). A los grupos tratados con ibudilast se disuelven 10, 30 ó 100 mg/kg de ibudilast a 2% (v/v) de aceite de ricino hidrogenado con PEG-60 se administró oralmente dos veces al día.

A las 15 a 21 horas después de finalización del período de administración de dos semanas, se diseccionó a los ratones en estado alimentado. Se midió el contenido de triglicérido en el hígado aislado.

Se extrajeron triglicéridos del hígado al utilizar el método mejorado de Folch et al. (Folch, J. , et al. 1957. J. Biol. Chem. , 226: 497-509). Los tejidos se homogeneizaron mediante la utilización de una mezcla de cloroformo y metanol 2:1 (v/v) .

El homogeneizado que se obtiene se agita durante una hora para extraer una fracción de lípidos, seguido por la obtención del sobrenadante por centrifugación a sequedad. La extracción se lleva a cabo dos veces en el mismo procedimiento a partir del sedimento de los tejidos y el sobrenadante que se obtiene se mezcla junto para secado. El extracto seco se disuelve a 4% (v/v) de Tritón X-100 y se mide la concentración de glicéridos utilizando el reactivo Liquitech TG-II (Roche Diagnostics K. K.). Los resultados se muestran como la media de valor ± error estándar. El análisis estadístico se realiza utilizando la prueba de comparación múltiple de Williams en donde el nivel de significancia estadística es menor de 5%.

Ibudilast disminuye de manera significativa el contenido de triglicéridos en hígado el cual es un índice de hígado graso en el modelo de resistencia a insulina e hígado graso, relacionado con la obesidad, de ratones ob/ob (figura 3) . En base en los resultados, se muestra claramente que ibudilast presenta excelentes efectos de mejoramiento en hígado graso de pacientes con obesidad y resistencia a insulina .

EJEMPLO 3 Efectos inhibidores de ibudilast en inflamación hepática y fibrosis hepática Se examinaron los efectos de ibudilast sobre la inflamación hepática y fibrosis hepática utilizando ratones alimentados con dieta deficientes en metionina y colina (MCD, por sus siglas en inglés) á los cuales se les indujo inflamación hepática y fibrosis hepática involucrada en condiciones patológicas humanas como NASH.

La dieta MCD (Oriental Yeast Co., Ltd.) producida de acuerdo con el reporte previo de Okumura et al. (Okumura, K., et al. 2006, Hepatol. Res., 36: 217-228) se administró a ratones C57BI/6J machos (CLEA Japan, Inc.) a las diez semanas de edad, durante seis semanas.

Después de la alimentación de la dieta MCD durante seis semanas, se administró oralmente aceite de ricino hidrogenado con PEG-60 (NIKKOL HCO-60, Nikko Chemicals Co., Ltd.) al grupo tratado con vehículo y se disolvió 10, 30 ó 100 mg/kg de ibudilast a 2% (v/v) de aceite de ricino hidrogenado con PEG-60 que se administró oralmente al grupo tratado con ibudilast, dos veces al día durante 14 días.

Posteriormente, se midió las expresiones de ARNm para TNFa, CP-1, IL-?ß, TGF$ y collal en hígado aislado utilizando el método de PCR en tiempo real cuantitativo. La expresión de ARNm ARNr 18S se utilizó como un estándar interno del método de PCR en tiempo real cuantitativo y se midió de modo similar.

El AR total hepático se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) . El tratamiento con desoxirribonucleasa del ARN extraído se realiza utilizando el equipo RNase-Free DNase Set (Qiagen) y RNeasy mini kit (Qiagen) .

La transcripción inversa de ARN se realiza utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de ribonucleasa (Applied Biosystems) .

La PCR en tiempo real cuantitativa se realiza utilizando un equipo TaqMan Fast Universal PCR Master ix (Applied Biosystems) y Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem) .

Las sondas TaqMan y los cebadores se obtienen como conjuntos de- análisis para cada AR m objetivo (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems, Inc.), específicamente, TNFa de ratón (Mm00443258_ml) , MCP-1 de ratón (Mm99999056_ml) , IL-?ß de ratón (MmO0434228_ml) , TGF de ratón (Mm01178819_ml) , collal de ratón (Mm00801666_gl) y ARNr 18s (Hs99999901_sl) .

Además, cada operación en relación a PCR en tiempo real cuantitativa se lleva a cabo de acuerdo con el manual unido a cada reactivo, kits y dispositivo. La expresión de ARNm del gen de interés (objetivo) se muestra como un valor relativo en el cual el ARNr 18S se define como el estándar interno. Los resultados se muestran como la media de valor ± al error estándar. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando prueba de comparación múltiple de Williams en donde el nivel de significancia estadística es menor de 5%.

Se encontró que ibudilast disminuye la expresión de ARNm de TNFa, MCP-1 e IL-?ß en hígado el cual es un índice de inflamación hepática, y la expresión de ARNm de TGFP y collal en hígado, los cuales son un índice de fibrosis hepática (figura 4 a figura 8) . En consecuencia, se demostró que ibudilast inhibe la inflamación hepática y la fibrosis hepática .

Aunque la invención se ha descrito, con detalle y con referencia a modalidades específicas de la misma, será evidente para una persona experta en el ámbito que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la misma.

Esta solicitud se basa en la solicitud de patente japonesa No. 2010-180656 presentada el 12 de agosto del 2010, el contenido de la cual se incorpora en la presente como referencia.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL Como un resultado de lo mencionado en lo anterior, se encontró que ibudilast mejora la totalidad de hígado graso, inflamación hepática y fibrosis hepática las cuales fueron las condiciones patológicas principales de NASH. Por lo tanto, el agente para la prevención o tratamiento de la presente invención que comprende ibudilast es útil para prevenir o tratar una enfermedad de hígado graso, preferiblemente NAFLD, de manera más preferible NASH.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (4)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - El uso de ibudilast como ingrediente activo para preparar un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad de hígado graso.

2. - El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la enfermedad de hígado graso es una enfermedad de hígado graso no alcohólico.

3. - El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde la enfermedad de hígado graso no alcohólico es esteatohepatitis no alcohólica.

4. - El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde la enfermedad de hígado graso no alcohólico es hígado graso simple.