MX2013001088A - Derivados heterobiciclicos como inhibidores del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Derivados heterobiciclicos como inhibidores del virus de la hepatitis c.

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Abstract

Inhibidores de la replicación del HCV de fórmula (I): (Ver Formula) incluyendo formas estereoquímicamente isoméricas, y sales, hidratos o solvatos de los mismos, en donde R y R' tienen el significado como se define en la presente; la presente invención se refiere también a procedimientos para preparar dichos compuestos, composiciones farmacéuticas que los contienen y su uso, solos o en combinación con otros inhibidores del HCV, en la terapia del HCV.

Description

DERIVADOS HETEROBICÍCLICOS COMO INHIBIDORES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a derivados heterobicíclicos, en particular derivados de quinolinona, los cuales son inhibidores del virus de la hepatitis C (HCV), su síntesis y su uso, solos o en combinación, con otros inhibidores del HCV, en el tratamiento o la profilaxis del HCV.
TÉCNICA ANTECEDENTE El HCV es un virus de ARN sentido positivo de cadena sencilla que pertenece a la familia de virus Flaviviridae en el género Hepacivirus. El genoma viral se traduce en un marco de lectura abierto sencillo que codifica para proteínas estructurales y no estructurales múltiples.
Después de la infección aguda inicial, una mayoría de los individuos afectados desarrolla hepatitis crónica debido a que el HCV se replica de preferencia en los hepatocitos, pero no directamente citopático. En particular, la falta de una respuesta vigorosa por parte de los linfocitos T y la alta propensión del virus a mutar, parecen promover una alta tasa de infección crónica. La hepatitis crónica puede progresar hasta fibrosis del hígado, llevando a cirrosis, enfermedad del hígado de etapa terminal y HCC (carcinoma hepatocelular), haciéndola la causa principal de trasplantes de hígado.
Existen seis genotipos principales del HCV y más de 50 subtipos, los cuales están distribuidos de manera diferente geográficamente. El genotipo 1 del HCV es el genotipo predominante en Europa y en los Estados Unidos. La heterogeneidad genética extensiva del HCV tiene importantes implicaciones clínicas y de diagnóstico, explicando quizá las dificultades en el desarrollo de vacunas y la falta de respuesta a la terapia actual.
La transmisión del HCV puede ocurrir a través del contacto con sangre o productos sanguíneos contaminados, por ejemplo, después de la transfusión de sangre o el uso de fármacos intravenosos. La introducción de pruebas de diagnóstico usadas en el examen de la sangre ha llevado a una tendencia descendente en la incidencia del HCV post-transfusión. Sin embargo, dada la progresión lenta hasta la enfermedad del hígado de etapa terminal, las infecciones existentes continuarán presentando una carga económica y médica seria por décadas.
Las terapias actuales del HCV se basan en el interferón-alfa (IFN-a) (pegilado) en combinación con ribavirina. Esta terapia de combinación da una respuesta virológica sostenida en 40% de los pacientes infectados por el genotipo 1 del HCV y aproximadamente 80% de aquellos infectados por los genotipos 2 y 3. Además de la eficacia limitada sobre el genotipo 1 del HCV, esta terapia de combinación tiene efectos secundarios significativos que incluyen síntomas tipo influenza, anormalidades hematológicas y síntomas neuropsiquiátricos. Por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos más efectivos, más convenientes y mejor tolerados.
La experiencia con los fármacos para el VIH, en particular con los inhibidores de proteasa del VIH, ha enseñado que la farmacocinética sub-óptima y los regímenes de dosificación complejos, resultan rápidamente en fallas de acatamiento inadvertidas. Esto a su vez significa que la depresión de la concentración en 24 horas (concentración mínima en plasma) para los fármacos respectivos en un régimen para el VIH, disminuye con frecuencia abajo del umbral de la ICgo o la ED90 por grandes partes del día. Se considera que un nivel de depresión de 24 horas de por lo menos la IC50, y más realmente, la IC90 o la EDgo, es esencial para retardar el desarrollo de mutantes que escapan a los fármacos. El logro de la farmacocinética y la tasa de metabolismo del fármaco, necesarios para permitir dichos niveles de depresión, provee un desafío severo para el diseño de fármacos.
La proteína NS5A del HCV se localiza hacia el extremo 3' de la proteína NS4B y hacia el extremo 5' de la proteína NS5B. Tras el desdoblamiento post-traducción por la serina proteasa viral NS3/4A, la NS5A madura en una fosfoproteína de tres dominios que contiene zinc que existe como una especie hipofosforilada (56 kDa, p56) o una especie hiperfosforilada (58 kDa, p58). La NS5A del HCV está implicada en aspectos múltiples del ciclo de vida viral que incluyen la replicación viral y el ensamble de las partículas infecciosas, así como la modulación del ambiente de su célula hospedera. Aunque ninguna función enzimática se ha atribuido a la proteína, se reporta que interactúa con numerosos factores virales y celulares.
Muchas patentes y solicitudes de patente describen compuestos con actividad inhibidora del HCV, en particular la proteína NS5A como objetivo. El documento WO2006/133326 describe derivados de estilbeno, mientras que los documentos WO 2008/021927 y WO 2008/021928 describen derivados de bifenilo que tienen actividad inhibidora de la proteína NS5A del HCV. El documento WO 2008/048589 describe derivados de 4-(feniletinil)-1 H-pirazol y su uso antiviral. El documento WO 2008/070447 describe una amplia gama de compuestos inhibidores del HCV que incluyen una porción de bencimidazol. Los documentos WO-2010/017401 y WO-2010/065681 describen inhibidores de bis-imidazol de la proteína NS5A del HCV.
Existe la necesidad de inhibidores del HCV que puedan superar las desventajas de la terapia actual del HCV, tales como efectos secundarios, eficacia limitada, la emergencia de resistencia y fallas de acatamiento, así como mejorar la respuesta sostenida de la carga viral.
La presente invención se refiere a un grupo de derivados heterobicíclicos inhibidores del HCV, en particular derivados de quinolinona, con propiedades útiles respecto a uno o más de los siguientes parámetros: eficacia antiviral, perfil favorable de desarrollo de resistencia, toxicidad y genotoxicidad reducidas o la falta de las mismas, farmacocinética y farmacodinámica favorables, facilidad de formulación y administración, e interacciones fármaco-fármaco limitadas o la falta de las mismas con otras sustancias de fármaco, en particular otros agentes anti-HCV.
Los compuestos de la invención pueden ser también atractivos debido al hecho de que carecen de actividad contra otros virus, en particular contra el VIH. Los pacientes infectados con el VIH sufren con frecuencia de co-infecciones tales como el HCV. El tratamiento de dichos pacientes con un inhibidor del HCV que inhibe también al VIH, puede llevar a la emergencia de cepas resistentes del VIH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención provee compuestos, los cuales pueden representarse mediante la fórmula (I): incluyendo cualquier estereoisómero posible de los mismos, en donde: cada L ) es independientemente pirrolidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo, piperidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2Hlo u octahidro-1 H-indol-2-ilo, en donde cada uno de dichos heterociclos puede ser opcionalmente sustituido por uno o más átomos de halógeno; Z—C™ Y es CR4=C-NH, NH-C=CH o NH-C=N; Xi es CH y X2 es CH; o Xi es CH y X2 es N; o ^ es N y X2 es CH; W es carbonilo, sulfonilo o CR5R6; R y R' se seleccionan independientemente de -CR-|R2R3, arilo opcionalmente sustituido con 1 ó 2 sustituyentes seleccionados de halo y metilo, o heterocicloalquilo, en donde Ri se selecciona de alquilo de C- opcionalmente sustituido con metoxi, hidroxilo o dimetilamino; cicloalquilo de C3.6; tetrahidropiranilo; fenilo opcionalmente sustituido con 1 , 2 ó 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halo, alcoxi de Ci-4, trifluorometoxi o 2 sustituyentes en átomos de anillo adyacentes forman un grupo 1 ,3-dioxolano; bencilo opcionalmente sustituido con halo o metoxi; heteroarilo; y heteroarilmetilo; R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, amino, mono- o di-alquilamino de Ci-4, (cicloalquilo de C3-6)(alquilam¡no de Ci-4), alquilcarbonilamino de C1-4, fenilamino, alquiloxicarbonilamino de Ci-4, (alquiloxicarbonilo de C-uXalquilamino de C- ), alquilaminocarbonilamino de C1-4, tetrahidro-2-oxo-1 (2H)-pirimidinilo, pirrolidin-1-ilo, piperidin-1-ilo, 3,3-difluoropiperidin-1-ilo, morfolin-1-ilo, 7-azabiciclo[2.2.1]hept-7-ilo e imidazol-1 -ilo; y R3 es hidrógeno o alquilo de Ci-4, o CR2R3 forman juntos carbonilo; o CR1R3 forman un grupo ciclopropilo; R4 es hidrógeno, alquilo de Ci-4 o ciano; R5 y R6, cada uno independientemente, son alquilo de Ci-4; o CR5R6 forman juntos cicloalquilo de C3 7, oxetano o tetrahidrofurano; o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En otro aspecto, la presente invención provee compuestos los cuales pueden representarse mediante la fórmula ( ): incluyendo cualquier estereoisómero posible de los mismos, en donde: es independientemente pirrolidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo, piperidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-ilo u octahidro-1 H-indol-2-ilo; Z—C^Y es CH=C-NH, NH-C=CH o NH-C=N; R y R' se seleccionan independientemente de -CR1 R2R3, arilo opcionalmente sustituido con 1 ó 2 sustituyentes seleccionados de halo y metilo, o heterocicloalquilo, en donde Ri se selecciona de alquilo de C- opcionalmente sustituido con metoxi, hidroxilo o dimetilamino; cicloalquilo de C3-6; tetrahidropiranilo; fenilo opcionalmente sustituido con 1 , 2 ó 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halo, alcoxi de C-i-4, trifluorometoxi o 2 sustituyentes en átomos de anillo adyacentes forman un grupo 1 ,3-dioxolano; bencilo opcionalmente sustituido con halo o metoxi; heteroarilo; y heteroarilmetilo; R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, amino, mono- o d¡-alquilamino de C-i-4, (cicloalquilo de C3-6)(alquilamino de Ci-4), alquilcarbonilamino de C- , fenilamino, alquiloxicarbonilamino de C-i-4, (alquiloxicarbonilo de Ci-4)(alquilamino de C1-4), alquilaminocarbonilamino de Ci-4, tetrahidro-2-oxo-1 (2H)-pirimidinilo, pirrolidin-1-ilo, piperidin-1-ilo, 3,3-difluoropiperidin-1-ilo, morfolin-1 -ilo, 7-azabiciclo[2.2.1]hept-7-ilo e imidazol-1-ilo; y R3 es hidrógeno o alquilo de Ci-4, o CR2R3 forman juntos carbonilo;" o CR1R3 forman un grupo ciclopropilo; y las sales y los solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de compuestos de fórmula (I), o subgrupos de los mismos, como se especifica en la presente, para la inhibición del HCV. En forma alternativa, se provee el uso de dichos compuestos en la fabricación de un medicamento para inhibir el HCV.
En una primera modalidad de la presente invención, cada es independientemente pirrolidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo o piperidin-2-ilo, en donde cada uno de dichos heterociclos puede ser opcionalmente sustituido por uno o más átomos de halógeno.
En una segunda modalidad de la presente invención, cada L-^ es independientemente pirrolidin-2-ilo o 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo, en donde cada uno de dichos heterociclos puede ser opcionalmente sustituido por uno o más átomos de halógeno.
En una tercera modalidad de la presente invención, Z—C—Y es CH=C-NH.
En otra modalidad, R y R' son idénticos.
En otra modalidad, R2 es hidroxilo, amino, mono- o di-alquilamino de Ci-4, alquilcarbonilamino de C1-4 o alquiloxicarbonilamino de C-i. 4; en particular, R2 es alquilcarbonilamino de Ci-4 o alquiloxicarbonilamino de Ci-4, y R3 es hidrógeno.
En otra modalidad, R1 se selecciona de alquilo de C-i-4; alquilo de C2-4 sustituido con metoxi o hidroxilo; y fenilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halo y metilo. En particular, R1 se selecciona de alquilo de C3-4 ramificado; alquilo de C2-3 sustituido con metoxi; y fenilo opcionalmente sustituido con 1 sustituyente seleccionado de halo y metilo.
En otro aspecto, la invención provee un compuesto de fórmula (I) o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la profilaxis (o la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis) de infección por el HCV. Genotipos del HCV representativos en el contexto del tratamiento o la profilaxis de conformidad con la invención incluyen, pero no están limitados a, el genotipo 1 b (frecuente en Europa) y el genotipo 1a (frecuente en Norteamérica). La invención provee también un método para el tratamiento o la profilaxis de infección por el HCV, en particular del genotipo 1a o 1 b, que comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como se definió anteriormente.
Formas estereoisoméricas puras de los compuestos e intermediarios como se mencionó en la presente, se definen como isómeros sustancialmente libres de otras formas enantioméricas o diastereoméricas de la misma estructura molecular básica de dichos compuestos o intermediarios. En particular, el término "estereoisoméricamente puro" se refiere a compuestos o intermediarios que tienen un exceso estereoisomérico de por lo menos 80% (es decir, un mínimo de 90% de un isómero y un máximo de 10% de los otros isómeros posibles), hasta un exceso estereoisomérico de 100% (es decir, 100% de un isómero y nada del otro), más en particular, compuestos o intermediarios que tienen un exceso estereoisomérico de 90% hasta 100%, incluso más en particular que tienen un exceso estereoisomérico de 94% hasta 100%, y más en particular que tienen un exceso estereoisomérico de 97% hasta 100%. Los términos "enantioméricamente puros" y "diastereoméricamente puros" deben entenderse en una manera similar, pero entonces refiriéndose al exceso enantiomérico, y el exceso diastereomérico, respectivamente, de la mezcla en cuestión.
Formas estereoisoméricas puras o estereoisómeros de los compuestos e intermediarios de esta invención, pueden obtenerse mediante la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden separarse los enantiómeros entre sí mediante la cristalización selectiva de sus sales diastereoméricas con ácidos o bases ópticamente activos. Ejemplos de los mismos son ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico y ácido alcanforsulfónico. En forma alternativa, pueden separarse los enantiómeros mediante técnicas cromatográficas usando fases estacionarias quirales. Dichas formas estereoquimicamente isoméricas puras pueden derivarse también de las formas estereoisoméricas puras correspondientes de los materiales de partida apropiados, siempre que la reacción ocurra estereoespecíficamente. De preferencia, si se desea un estereoisómero específico, dicho compuesto se sintetiza mediante métodos de preparación estereoespecíficos. Estos métodos usarán en forma ventajosa materiales de partida enantioméricamente puros.
Los racematos diastereoméricos de los compuestos de fórmula (I) pueden obtenerse por separado mediante métodos convencionales. Métodos de separación física adecuados que pueden usarse en forma ventajosa son, por ejemplo, cristalización selectiva y cromatografía, por ejemplo, cromatografía en columna o cromatografía de fluidos supercríticos.
Los compuestos de fórmula (I) y los subgrupos de compuestos de fórmula (I) como se definieron anteriormente, tienen varios centros de quiralidad. De interés, son los centros estereogénicos del anillo de pirrolidina en el átomo de carbono 2. La configuración en esta posición puede ser aquella que corresponde a la L-prolina, es decir, o aquella que corresponde a la D-prolina, es decir, De interés particular son los compuestos de fórmula (I) o subgrupos de los mismos como se define en la presente, que sean de conformidad con la fórmula (la): más en particular: También de interés, es la configuración del grupo -CR1 R2R3: cuando R1 se selecciona de alquilo de d-4 opcionalmente sustituido con metoxi, hidroxilo o dimetilamino; cicloalquilo de C3.6; y tetrahidropiranilo, entonces se prefiere la configuración S; cuando R1 se selecciona de fenilo opcionalmente sustituido con 1 , 2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halo, alcoxi de C1-4, trifluorometoxi o 2 sustituyentes en átomos de anillo adyacentes forman un grupo 1 ,3-dioxolano; y heteroarilo; entonces se prefiere la configuración R.
Las sales de adición farmacéuticamente aceptables comprenden las formas de sales ácidas y básicas de adición no tóxicas terapéuticamente activas de los compuestos de fórmula (I), o subgrupos de los mismos. De interés son las formas libres, es decir, las formas no de sal de los compuestos de fórmula (I), o de cualquier subgrupo de compuestos de fórmula (I) especificado en la presente.
Las sales ácidas de adición farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse convenientemente tratando la forma de base con dicho ácido adecuado. Ácidos adecuados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácidos hidrohálicos, por ejemplo, ácido clorhídrico o bromhidrico, así como los ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico, y similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos acético, propiónico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (es decir, etanodioico), malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico (es decir, ácido hidroxil-butanodioico), tartárico, cítrico, metansulfónico, etansulfónico, bencensulfónico, p-toluensulfónico, ciclámico, salicílico, p-aminosalicílico, pamoico, y similares. A la inversa, dichas formas de sal pueden ser convertidas mediante tratamiento con una base adecuada en la forma de base libre.
Los compuestos de fórmula (I) que contienen un protón ácido pueden ser convertidos también en sus sales básicas de adición, en particular las formas de sales de adición de metal o amina, mediante tratamiento con bases orgánicas e inorgánicas adecuadas. Formas de sales básicas adecuadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metal alcalino y metal alcalinotérreo, por ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo, las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina e hidrabamina, y las sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina, y similares.
El término "solvatos" abarca cualquier solvato farmacéuticamente aceptable que los compuestos de fórmula (I), así como las sales de los mismos, son capaces de formar. Dichos solvatos son, por ejemplo, hidratos, alcoholatos, por ejemplo, etanolatos, propanolatos, y similares.
Algunos de los compuestos de fórmula (I) pueden existir también en formas tautómeras. Por ejemplo, las formas tautómeras de los grupos amida (-C(=0)-NH-) son iminoalcoholes (-C(OH)=N-). Se pretende que las formas tautómeras, aunque no indicadas explícitamente en las fórmulas estructurales representadas en la presente, sean incluidas dentro del alcance de la presente invención.
Como se usa en la presente, el término "alquilo de C-i-4" como un grupo o parte de un grupo, define grupos hidrocarburo de cadena recta o ramificada saturados que tienen de 1 a 4 átomos de carbono tales como, por ejemplo, metilo, etilo, 1-propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-butilo, 2-metil-1 -propilo o 2-metil-2-propilo. Para el propósito de la presente invención, de interés entre el alquilo de Ci_4 es el alquilo de C3-4, es decir, grupos hidrocarburo de cadena recta o ramificada que tienen 3 o 4 átomos de carbono, tales como 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-butilo, 2-metil-1 -propilo o 2-metil-2-propilo. De interés particular puede ser el alquilo de C3-4 ramificado, tal como 2-propilo, 2-butilo, 2-metil-1 -propilo o 2-metil-2-propilo.
El término "cicloalquilo de C3-6" como un grupo o parte del mismo, define grupos hidrocarburo cíclicos saturados que tienen de 3 a 6 átomos de carbono que forman en conjunto una estructura cíclica. Ejemplos de cicloalquilo de C3_6 incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
El término "alcoxi de C -4" como un grupo o parte de un grupo, significa un grupo de fórmula -O-alquilo de Ci-4, en donde el alquilo de C- es como se definió anteriormente. Ejemplos de alcoxi de C-i- son metoxi, etoxi, n-propoxi o isopropoxi.
El término "halo" es genérico para fluoro, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en la presente, el término "(=0)" u "oxo" forma una porción carbonilo cuando se une a un átomo de carbono. Debe observarse que un átomo sólo puede ser sustituido con un grupo oxo cuando la valencia de ese átomo lo permite de esta manera.
Como se usa en la presente, para el propósito de definir "arilo" como un grupo o parte del mismo, significa una estructura de anillo aromático que comprende opcionalmente uno o dos heteroátomos seleccionados de N, O y S, en particular de N y O. Dicha estructura de anillo aromático puede tener 5 ó 6 átomos de anillo.
Como se usa en la presente, el prefijo "hetero-" en la definición de un grupo significa que el grupo comprende por lo menos 1 heteroátomo seleccionado de N, O y S, en particular N y O. Por ejemplo, el término "heteroarilo" significa una estructura de anillo aromático como se define para el término "arilo" que comprende por lo menos 1 heteroatomo seleccionado de N, O y S, en particular de N y O, por ejemplo, furanilo, oxazolilo o piridinilo. En forma alternativa, el término "heterocicloalquilo de C3-6" significa un grupo hidrocarburo cíclico saturado como se definió para "cicloalquilo de C3-6" que comprende además por lo menos 1 heteroátomo seleccionado de N, O y S, en particular de N y O, por ejemplo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo o piperidinilo.
En donde la posición de un grupo en una porción molecular no sea especificada (por ejemplo, un sustituyente en el fenilo) o sea representada por un enlace flotante, dicho grupo puede ser posicionado en cualquier átomo de dicha porción, en tanto la estructura resultante sea químicamente estable.
Cuando alguna variable esté presente más de una vez en la molécula, cada definición es independiente.
Cada vez que se use en la presente, se entiende que el término "compuestos de fórmula (I)" o "los presentes compuestos" o términos similares, incluye los compuestos de fórmula (I), incluyendo las formas estereoisoméricas posibles, y las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Métodos de síntesis generales ESQUEMA 1 Los bloques estructurales usados en la síntesis de los compuestos de fórmula (I) se describen en el esquema 1. La a-amino cetona lia (esquema 1 , A = H2), con X un halógeno, en particular bromo o yodo, es acoplada con un derivado III adecuadamente protegido, en donde PG' es un grupo protector en el nitrógeno, de preferencia ter-butoxicarbonilo, en presencia de un reactivo de acoplamiento para la acilación del grupo amino, de preferencia HATU, en presencia de una base tal como DIPEA. El intermediario formado de esta manera es ciclizado hasta un compuesto de imidazol de fórmula general IV mediante tratamiento con acetato de amonio, de preferencia a una temperatura que varía entre 0°C y 150°C.
En forma alternativa, el imidazol IV intermediario puede obtenerse acoplando la a-halo cetona llb, en donde X y A representan cada uno independientemente un átomo de halo, X seleccionado de preferencia de yodo o bromo, y A seleccionado de preferencia de cloro, bromo o yodo, con un compuesto III adecuadamente protegido, en donde PG' es un grupo protector en el nitrógeno, de preferencia ter-butoxicarbonilo, en presencia de una base adecuada, por ejemplo DIPEA, seguido de ciclización hasta el intermediario de imidazol IV como se describió anteriormente. Este intermediario IV puede ser transformado hasta un éster borónico de fórmula V bajo condiciones catalizadas por Pd, por ejemplo, en presencia de Pd(dppf)CI2, bis(pinacolato)diboro y una base, por ejemplo, acetato de potasio.
Otros bloques estructurales se describen en los esquemas 2a, 2b, 2c y 3a, 3b, 3c y 3d.
En el esquema 2a, el derivado de ácido VI es convertido en el ß-cetoéster VII mediante métodos conocidos en la literatura, por ejemplo, mediante activación del ácido carboxílico con DCC o CDI seguida de, por ejemplo, reacción con ácido de Meldrum y descarboxilación subsiguiente en presencia de un alcohol, o como una alternativa, como se describe en los ejemplos, mediante condensación con una sal de magnesio de malonato de monoalquilo seguida descarboxilación. El ß-cetoéster VII (Raik refiriéndose a alquilo de C- ) es condensado entonces con VIII o X, seguido de ciclización hasta IXa y IXb, respectivamente (X' es un halógeno seleccionado de yodo o bromo, de preferencia bromo). Esta condensación puede llevarse a cabo en tolueno en presencia de ácido acético. La ciclización hasta los compuestos de fórmula IXa y IXb, puede llevarse a cabo térmicamente mediante reflujo en Dowtherm™ A (mezcla de óxido de difenilo y bifenilo). Un ejemplo preferido del grupo protector PG es benciloxicarbonilo (CBz).
ESQUEMA 2b En forma alternativa, pueden obtenerse compuestos de la fórmula general IXc mediante una secuencia carbonilativa de Sonogashira/ciclización catalizada por Pd como se describió en el esquema 2b, partiendo del compuesto de yodo-anilina A.I., bajo procedimientos similares como se describen en Applied Catalysis, A: General 2009, 369, 1-2, 125-132, y referencias citadas en la misma.
ESQUEMA 2c Pueden obtenerse compuestos de la fórmula general IXd, en donde R4 equivale a H o alquilo de C- , como se muestra en el esquema 2c. El compuesto VIII (X' es un halógeno seleccionado de yodo o bromo, de preferencia bromo) puede ser convertido hasta el compuesto A. IV, por ejemplo, mediante tratamiento de VIII con BCI3 en un solvente tal como benceno, a una temperatura menor que la temperatura ambiente, por ejemplo, mediante enfriamiento en hielo, seguido de tratamiento con AICI3 y el nitrilo A.lll (R equivale a H o alquilo de C- ) por ejemplo, a reflujo en benceno. Después de la hidrólisis, puede obtenerse el compuesto A.IV. La formación del enlace de amida partiendo de A.IV y VI, resulta en la formación del compuesto A.V. Esta reacción puede llevarse a cabo convirtiendo el compuesto VI hasta un halogenuro de ácido, por ejemplo, un fluoruro de ácido o cloruro de ácido, seguido de reacción con A. IV en presencia de una base. Otro ejemplo es la formación de A.V a partir de VI y A. IV mediante el uso del reactivo de acoplamiento hidrato de cloruro de 4-(4,6-dimetoxi [1.3.5] triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM). La ciclización de A.V, bajo condiciones básicas, por ejemplo KOH en EtOH, o NaOH en dioxano, resulta en el compuesto IXd.
ESQUEMA 3a La síntesis de compuestos de la fórmula XIII se describe en el esquema 3a. La formación del enlace de amida partiendo de XI (X' es un halógeno seleccionado de yodo o bromo, de preferencia bromo) y VI, resulta en la formación del compuesto XII. Esta reacción puede llevarse a cabo convirtiendo el compuesto VI hasta un halogenuro de ácido, por ejemplo, un fluoruro de ácido o cloruro de ácido, seguido de reacción con XI en presencia de una base. Otro ejemplo es la formación de XII a partir de VI y XI mediante el uso del reactivo de acoplamiento hidrato de cloruro de 4-(4,6-dimetox¡ [1.3.5] triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM). Los compuestos XII son convertidos entonces hasta los compuestos de la fórmula general XIII bajo condiciones básicas, por ejemplo, KOH en etanol.
ESQUEMA 3b El compuesto de la fórmula general A.XI (?' es un halógeno seleccionado de yodo o bromo, de preferencia bromo) puede obtenerse como se muestra en el esquema 3b. Mediante el uso de métodos descritos en la literatura (WO2007039578; Tet. Lett. 2001 , 42, 33, 5601-5603), el fluoruro A.VI puede ser convertido hasta A. IX. Este último es acoplado con un halogenuro de ácido A.X (en donde X" equivale a cloro o fluoro) en presencia de una base, por ejemplo, trietilamina, seguido de ciclización hasta el compuesto A.XI bajo condiciones básicas tales como, por ejemplo, K2CO3 acuoso 2N a reflujo.
ESQUEMA 3c El compuesto de fórmula general A.XVI puede obtenerse como se muestra en el esquema 3c. La dialquilación del éster A. XII con el halogenuro de alquilo adecuado, por ejemplo, Mel en el caso de R5=R6=metilo, en presencia de una base, por ejemplo NaH, resulta en el compuesto A.XIII. Este éster puede ser convertido hasta el compuesto A.XIV mediante hidrólisis subsiguiente, formación de la azida de acilo (por ejemplo, mediante tratamiento del ácido correspondiente de A.XIII con difenilfosforil azida) y reacción de Curtius. Después de la reducción del compuesto A.XIV hasta A.XV, el último compuesto es convertido hasta el compuesto A.XVI mediante acoplamiento con el ácido VI, por ejemplo, mediante tratamiento con HATU y una base tal como trietilamina, y ciclización subsiguiente hasta el compuesto A.XVI bajo condiciones ácidas, por ejemplo, en ácido acético a 50°C.
Un procedimiento alternativo para la síntesis del compuesto A.XIV (por ejemplo, en el caso en donde R5 y R6 junto con el carbono que los une, forman un oxetano), se describe en el esquema 3d. El anión, generado mediante reacción de transmetalación de, por ejemplo, butil litio y el compuesto A.XVIl a baja temperatura, por ejemplo -78°C, puede hacerse reaccionar con la sulfinamida A.XVIII. Después de la desprotección de la sulfinamida formada, bajo condiciones acidas, se obtiene el compuesto A.XIV, el cual puede ser transformado adicionalmente hasta A.XVI como se describe en el esquema 3c.
ESQUEMA 4 Los bloques estructurales A. XIX, obtenidos mediante métodos similares a los que se describen en los esquemas 2 (a, b, c) y los esquemas 3 (a, b, c y d) y V (esquema I), pueden ser convertidos hasta la estructura XIV, usando condiciones de Suzuki-Miyaura (esquema 4).
ESQUEMA 5 La síntesis de compuestos de fórmula general XlVa se describe en el esquema 5. El acoplamiento de Suzuki-Miyaura entre un halogenuro XV y el éster borónico V, resulta en el intermediario XVI, el cual puede ser convertido hasta XlVa mediante tratamiento con una base, por ejemplo, butil litio, y reacción con XVII.
ESQUEMA 6 Cuando PG' y PG en los esquemas 1 a 6 representan R'(C=0)- y R(C=0)-, respectivamente, los compuestos de la estructura general XIV están bajo la definición de los compuestos de fórmula (I). En ese caso, los esquemas 4 y 5 describen la síntesis de compuestos de fórmula (I).
En forma alternativa, el compuesto XIV puede ser desprotegido como se describe en el esquema 6. Por ejemplo, mediante tratamiento con ácido (por ejemplo, HCI en iPrOH) cuando PG o PG' representan ter- butiloxicarbonilo (Boc), el compuesto XX puede ser transformado hasta un compuesto de fórmula Ib, en donde R y R' son idénticos, mediante la formación clásica de la amida entre un ácido R-(C=0)OH y la bisamina XX como se describe en el esquema 7. Un método preferido es el uso de HATU en presencia de una base tal como DIPEA.
ESQUEMA 7 En donde PG' difiere de PG, es posible la desprotección selectiva, como se describe en el esquema 6, resultando en los compuestos XVIII o XIX, partiendo del compuesto XIV. Por ejemplo, en caso de que PG' equivalga a ter-butiloxicarbonilo (Boc) y PG equivalga a benciloxicarbonilo (Cbz), puede efectuarse la desprotección selectiva removiendo el grupo protector Boc bajo condiciones ácidas tales como HCI en iPrOH a temperatura ambiente, o removiendo el grupo protector CBz bajo condiciones reductoras tales como hidrógeno en presencia de un catalizador, por ejemplo, Pd(OH)2.
Cuando PG' representa R'(C=0)- o PG representa R(C=0)-, la síntesis de los compuestos XIV como se describe en los esquemas 1 a 5, resulta en los compuestos de fórmula XXI (esquema 8) o XXIII (esquema 9), respectivamente. Los compuestos XXI y XXIII pueden obtenerse a partir del compuesto XIX y R'(C=O)OH o el compuesto XVIII y R(C=O)OH, respectivamente, bajo condiciones típicas de formación de la amida. Estos compuestos pueden ser transformados entonces hasta los compuestos de fórmula (I). La desprotección selectiva de XXI hasta XXII, seguida de la formación del enlace de amida entre XXII y R(C=0)-OH, resulta en los compuestos de fórmula (I). Una secuencia de reacción análoga puede aplicarse entonces para transformar el compuesto XXIII en XXIV, y hacia adelante hasta los compuestos de fórmula (I).
ESQUEMA 8 ESQUEMA 9 En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) como se especifica en la presente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una cantidad terapéuticamente efectiva en este contexto, es una cantidad suficiente para estabilizar o para reducir la infección por el HCV en los sujetos infectados, o una cantidad suficiente para prevenir la infección por el HCV en sujetos en riesgo de que sean infectados. En otro aspecto, esta invención se refiere a un procedimiento para preparar una composición farmacéutica como se especifica en la presente, el cual comprende mezclar íntimamente un vehículo farmacéuticamente aceptable con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I), como se especifica en la presente.
Por lo tanto, los compuestos de la presente invención o cualquier subgrupo de los mismos, pueden formularse en varias formas farmacéuticas para propósitos de administración. Como composiciones adecuadas, pueden citarse todas las composiciones empleadas usualmente para administrar sistémicamente fármacos. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, una cantidad efectiva del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal de adición o complejo de metal como el ingrediente activo, se combina en mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable, cuyo vehículo puede tomar una amplia variedad de formas, dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas son deseables en forma de dosificación unitaria adecuada, en particular, para administración oralmente, rectalmente, percutáneamente o mediante inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, puede usarse cualquiera de los medios farmacéuticos usuales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, y similares, en el caso de preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elíxires, emulsiones y soluciones; o vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegración y similares, en el caso de polvos, pildoras, cápsulas y tabletas. Debido a su facilidad en la administración, las tabletas y cápsulas representan las formas unitarias de dosificación oral más ventajosas, en cuyo caso se usan obviamente vehículos farmacéuticos sólidos. Para composiciones parenterales, el vehículo comprenderá usualmente agua estéril, por lo menos en gran parte, aunque pueden incluirse otros ingredientes, por ejemplo, que faciliten la solubilidad. Pueden prepararse soluciones inyectables, por ejemplo, en las cuales el vehículo comprenda solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y de glucosa. Pueden prepararse también suspensiones inyectables, en cuyo caso pueden usarse vehículos líquidos, agentes de suspensión y similares adecuados. También incluidas son las preparaciones de forma sólida destinadas para ser convertidas, poco antes del uso, hasta preparaciones de forma líquida. En las composiciones adecuadas para administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente intensificador de penetración y/o un agente mojante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones menores, cuyos aditivos no introduzcan un efecto deletéreo significativo sobre la piel. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse también mediante inhalación oral o insuflación en la forma de una solución, una suspensión o un polvo seco, usando cualquier sistema de suministro conocido en la técnica.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Ejemplos de dichas formas de dosificación unitaria son tabletas (incluyendo tabletas ranuradas o recubiertas), cápsulas, pildoras, supositorios, empaques de polvo, obleas, soluciones o suspensiones inyectables y similares, y múltiplos segregados de las mismas.
Los compuestos de fórmula (I) muestran actividad contra el HCV, y pueden usarse en el tratamiento y la profilaxis de infección por el HCV o enfermedades asociadas con el HCV. Las últimas incluyen fibrosis progresiva del hígado, inflamación y necrosis que llevan a cirrosis, enfermedad del hígado de etapa terminal y carcinoma hepatocelular. Se sabe además que muchos de los compuestos de esta invención son activos contra las cepas mutadas del HCV. Además, los compuestos de esta invención pueden tener propiedades atractivas en términos de biodisponibílidad, muestran un perfil farmacocinético favorable, incluyendo una vida media aceptable, AUC (área bajo la curva), valores de pico y valle, y carecen de fenómenos desfavorables tales como inicio insuficientemente rápido o retención en los tejidos.
La actividad antiviral in vitro contra el HCV que muestran los compuestos de fórmula (I) puede ponerse a prueba en un sistema celular de replicón del HCV basado en Lohmann et al. (1999) Science 285: 110-1 13, con las modificaciones adicionales descritas por Krieger et al. (2001) Journal of Virology 75: 4614-4624 (cita incorporada en la presente como referencia), el cual se ejemplifica adicionalmente en la sección de ejemplos. Este modelo, mientras que no es un modelo de infección completo para el HCV, es aceptado ampliamente como el modelo de replicación autónoma del ARN del HCV vigoroso y eficiente disponible actualmente. Se apreciará que es importante distinguir entre los compuestos que interfieren específicamente con las funciones del HCV, de aquellos que ejercen efectos citotóxicos o citostáticos en el modelo del replicón del HCV, y como consecuencia causan una disminución en la concentración de enzimas reporteras enlazadas o del ARN del HCV. Se conocen en el campo pruebas para la evaluación de la citotoxicidad celular basada, por ejemplo, en la actividad de las enzimas mitocondriales usando colorantes de redox fluorógenos tales como la resazurina. Además, existen contra exámenes celulares para la evaluación de la inhibición no selectiva de la actividad de genes reporteros enlazados, tales como la luciferasa de luciérnaga. Tipos de células adecuados pueden ser equipados mediante transfección estable con un gen reportero de luciferasa cuya expresión dependa de un promotor génico constitutivamente activo, y dichas células pueden usarse como un contra examen para eliminar los inhibidores no selectivos.
Debido a sus propiedades anti-HCV, los compuestos de fórmula (I) o subgrupos de los mismos, como se especifica en la presente, son útiles en la inhibición de la replicación del HCV, en particular en el tratamiento de animales de sangre caliente, en particular humanos, infectados con el HCV, y para la profilaxis de infecciones por el HCV en animales de sangre caliente, en particular humanos. La presente invención se refiere además a un método de tratamiento de un animal de sangre caliente, en particular un humano, infectado por el HCV, o que está en riesgo de infección por el HCV, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I), como se definió anteriormente.
Los compuestos de fórmula (I) como se especifica en la presente, pueden usarse por lo tanto como un medicamento, en particular como un medicamento anti-HCV. Dicho uso como un medicamento o método de tratamiento comprende la administración sistémica a sujetos infectados por el HCV o a sujetos susceptibles a la infección por el HCV, de una cantidad efectiva para aliviar o prevenir los síntomas y condiciones asociados con la infección por el HCV.
La presente invención se refiere también al uso de los presentes compuestos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección por el HCV.
En general, se contempla que una cantidad diaria antiviral efectiva sería de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 0.02 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. Puede ser adecuado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más sub-dosis, a intervalos adecuados a lo largo del día. Dichas sub-dosis pueden formularse como formas de dosificación unitaria, por ejemplo, conteniendo aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, o aproximadamente 1 a aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg, o aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg, de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.
Terapia de combinación La invención se refiere también a una combinación de un compuesto de fórmula (I), una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y otro compuesto antiviral, en particular otro compuesto anti-HCV. El término "combinación" se refiere a un producto que contiene (a) un compuesto de fórmula (I), como se definió anteriormente, y (b) otro inhibidor anti-HCV, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de infecciones por el HCV.
Las combinaciones de la presente invención pueden usarse como medicamentos. Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) o cualquier subgrupo del mismo como se definió anteriormente, en la fabricación de un medicamento útil para inhibir la actividad del HCV en un mamífero infectado con virus del HCV, en donde dicho medicamento se usa en una terapia de combinación, dicha terapia de combinación comprendiendo en particular un compuesto de fórmula (I) y por lo menos algún otro agente anti-HCV, por ejemplo, IFN-a, IFN-a pegilado, ribavirina, albuferón, taribavirina, nitazoxanida Debio025, o una combinación de los mismos.
Otros agentes que pueden combinarse con los compuestos de la presente invención incluyen, por ejemplo, inhibidores de nucleósidos y no de nucleósidos de la polimerasa del HCV, inhibidores de proteasa, inhibidores de helicasa, inhibidores de NS4B y agentes que inhiben funcionalmente el sitio de entrada ribosomal interno (IRES), y otros agentes que inhiben la unión del HCV a las células o la entrada del HCV, la traducción del ARN del HCV, la transcripción del ARN del HCV, la replicación o maduración del HCV, o el ensamble o la liberación del virus. Compuestos específicos en estas clases incluyen inhibidores de proteasa del HCV, tales como telaprevir (VX-950), boceprevir (SCH-503034), narlaprevir (SCH-900518), ITMN-191 (R-7227), TMC-435350 (TMC-435), MK-7009, BI-201335, BI-2061 (ciluprevir), BMS-650032, ACH-1625, ACH-1095, GS 9256, VX-985, IDX-375, VX-500, VX-813, PHX-1766, PHX2054, IDX-136, IDX-316, ABT-450, EP-013420 (y congéneres) y VBY-376; los inhibidores de la polimerasa del HCV de nucleósidos útiles en la invención incluyen TMC649128, R7128, PSI-7851 , PSI 7977, IDX-189, IDX-184, IDX-102, R1479, UNX-08189, PSI-6130, PSI-938 y PSI-879 y varios otros análogos de nucleósidos y nucleótidos e inhibidores del HCV que incluyen aquellos derivados como nucleósidos modificados con 2 -C-metilo, nucleósidos modificados con 4'-aza y nucleósidos modificados con 7'-deaza. Inhibidores de la polimerasa de HCV no de nucleósidos útiles en la invención incluyen HCV-796, HCV-371 , VCH-759, VCH-916, VCH-222, ANA-598, MK-3281 , ABT-333, ABT-072, PF-00868554, BI-207127, GS-9190, A-837093, JKT-109, GL-59728, GL-60667, ABT-072, AZD-2795 y TMC647055.
Los siguientes ejemplos tienen el propósito de ilustrar la invención, y no deben considerarse como una limitación de su alcance.
En las fórmulas de los ejemplos, las siguientes notaciones tienen los significados que se dan a continuación: rt o r.t. significa temperatura ambiente; eq significa equivalente(s); h significa hora(s); min significa minuto(s); aq significa acuoso (ac); y MW, M.W. o m.w. significa microondas.
Parte experimental: Métodos de LCMS Método A: Condiciones generales: fase móvil A: H20 (TFA a 0.1 %; B: CH3CN (TFA a 0.05%). Tiempo de detención: 2 min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0.01 [90/10] a 0.9 [20/80] a 1.5 [20/80] a 1.51 [90/10]; flujo: 1.2 mL/min; temperatura de la columna: 50°C.
Método A1 : Shimadzü LCMS 2010, Shim-pack XR-ODS, 3 x 30 mm.
Método A2: Xtimate C18 2.1 x 30 mm, 3 pm.
Método A3: SHIMADZÜ Shim pack 2x30.
Método A4: Welch Xtimate C18 2.1 x 30 mm, 3 pm.
Método B: Agilent 1100, YMC-PACK ODS-AQ, 50 x 2.0 mm, 5 pm, fase móvil A: H20 (TFA a 0.1 %; B: CH3CN (TFA a 0.05%. Tiempo de detención: 10 min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0 [100/0] a 1 [100/0] a 5[40/60] a 7.5 [40/60] a 8 [100/0]; flujo: 0.8 mL/min; temperatura de la columna: 50°C.
Método C: Agilent 1 100, YMC-PACK ODS-AQ, 50 x 2.0 mm, 5 pm, fase móvil A: H2O (TFA a 0.1 %; B: CH3CN (TFA a 0.05%); tiempo de detención: 10 min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0 [90/10] a 0.8 [90/10] a 4.5 [20/80] a 7.5 [20/80] a 8 [90/10]; flujo: 0.8 mL/min; temperatura de la columna: 50°C.
Método D: Shimadzu LCMS 2010, Shim-pack XR-ODS, 3 x 30 mm, fase móvil A: H20 (TFA a 0.1 %); B: CH3CN (TFA a 0.05%), tiempo de detención: 2 min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0.01 [100/0] a 0.9 [70/30] a 1.5 [70/30] a 1.51 [100/0]; flujo: 1.2 mL/min; temperatura de la columna: 50°C.
Método E: Cromatografía de líquidos: Waters Alliance 2695, detector UV. Waters 996 PDA, escala: 210-400 nm; detector de masa: Waters ZO, fuente de iones: ES+, ES-; columna usada: SunFire C18 3.5 µ 4.6 x 100 mm; fase móvil A: NH4OOCH 10 mM + HCOOH a 0.1 % en H20; fase móvil B: CH3OH; temperatura de la columna: 50°C; flujo: 1.5 mL/min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0 [65/35] a 7 [5/95] a 9.6 [5/95] a 9.8 [65/35] a 12 [65/35].
Método F: Xtimate C18 2.1 x 30 mm, 3 pm, fase móvil A: H2O (1.5 mL de TFA/4 L); B: CH3CN (0.75 mL de TFA/4 L); tiempo de detención: 3 min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0.0 [90/10] a 1.35 [20/80] a 2.25 [20/80] a 2.26 [90/10]; 3.0 [90/10]; flujo: 0.8 mL/min; temperatura de la columna: 50°C.
Método G: Condiciones generales: fase móvil A: H20 (1.5 mL de TFA/4 L); B: CH3CN (0.75 mL de TFA/4 L); tiempo de detención: 2 min; tiempo del gradiente (min) [% de A/% de B] 0.0 [100/0] a 0.9 [40/60] a 1.5 [40/60] a 1.51 [100/0]; 2.0 [100/0]; flujo: 1.2 mL/min; temperatura de la columna: 50°C.
Método G1 : Xtimate C18, 2.1 x 30 mm, 3 pm.
Preparación de los intermediarios Se añadió NaOH 1 N en agua (1250 mL) a L-valina (150 g, 1280 mmoles) en un matraz de fondo redondo de 3 L equipado con una barra de agitación magnética. A esta solución se añadió Na2C03 (67.8 g, 640 mmoles), y la mezcla de reacción se enfrió hasta 0°C en un baño de agua helada. Se añadió gota a gota cloroformiato de metilo (107 mL, 1390 mmoles), y la mezcla de reacción se dejó calentando hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó por 15 horas. La mezcla de reacción se lavó con acetato de etilo (3 x 400 mL). La capa acuosa se enfrió sobre un baño de agua helada y se acidificó mediante HCI concentrado (ac.) hasta pH=2. La mezcla de reacción se extrajo con CH2CI2 (3 x 1000 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04 y el solvente se concentró, para dar el producto crudo. El producto crudo se calentó a reflujo con 150 mL de etanol y 150 mL de agua por 2 horas. Entonces, la mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y los sólidos cristalinos se filtraron, para dar ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metil-butanoico (146 g, 65% de rendimiento).
Se añadió en una porción MgCI2 (153 g, 1640 mmoles) a una solución de malonato de etil potasio (354.9 g, 2085 mmoles) en THF (2500 mL). La mezcla de reacción se agitó por 7 horas a 65-70X, y entonces a 30°C durante la noche. Se añadió lentamente una solución de Cbz-L-prolina (400 g) en THF (1000 mL) a una mezcla de CDI (312.1 g, 1924.8 mmoles) en THF (1500 mL), y se agitó a 30°C por 2 horas. La solución se añadió a la mezcla de malonato de etilo durante 20 minutos a 20 a 30°C, y se agitó durante la noche a 30°C. La mezcla se enfrió hasta 20°C y se neutralizó con HCI diluido (4 N, 1800 mL). La solución se concentró y el producto se disolvió en acetato de etilo y se enjuagó con bicarbonato de sodio acuoso a 5%. La capa orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente: éter de petróleo: acetato de etilo = 20: 1 a 3:1), para dar 2-(3-etoxi-3-oxopropanoil)pirrolidin-1-carboxilato de (S)-bencilo (460 g, 90% de rendimiento).
Método A4; Rt: 1.23 min. m/z = 341.9 (M+Na)+. Masa exacta: 319.1.
Se añadió 4-bromoanilina (40 g, 235 mmoles) a una mezcla de 2-(3-etoxi-3-oxopropanoil)pirrolidin-1-carboxilato de (S)-bencilo (100 g, 313 mmoles) en tolueno (800 mL) conteniendo ácido acético (16.7 mL, 313 mmoles) y puesta a reflujo por 6 horas usando un aparato de Dean Stark para remover el agua de la reacción. El solvente se removió, y el residuo que contenía al intermediario de condensación 1 , se disolvió en Dowtherm™ A (260 mL). La mezcla se agitó a 235°C por 1.5 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, y se añadió éter (800 mL) seguido de heptano (500 mL). Un residuo oleoso se precipitó y el solvente se decantó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente: CH2CI2: acetato de etilo = 1 :1), resultando en el compuesto 2 (28 g, 1 1 % de rendimiento total).
Método A3; Rt: 1.31 min. m/z = 428.9 (M+H)+ Masa exacta: Se añadió 3-bromoanilina (186 g, 1080 mmoles) a una mezcla de 2-(3-etoxi-3-oxopropanoil)pirrolidin-1-carboxilato de (S)-bencilo (460 g, 1440 mmoles) en tolueno conteniendo ácido acético (86.4 g, 1440 mmoles), y se puso a reflujo por 8 horas usando un aparato de Dean Stark para remover el agua de la reacción. La mezcla se concentró bajo presión reducida y se secó bajo vacío. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin más purificación (662 g). Un matraz adaptado con un agitador, cabeza destilación y embudo de goteo se purgó con nitrógeno. Se añadió Dowtherm™ A (90 mL) y entonces se calentó hasta 240°C. Una solución del intermediario de condensación 3 (662 g) en Dowtherm™ A (900 mL) se añadió durante 10 minutos, mientras la temperatura se mantenía en la escala de 230-245°C. La mezcla se calentó por otra hora a 240°C y entonces se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadieron éter de petróleo (2000 mL) y heptano (2400 mL). Un residuo oleoso se formó y el solvente se decantó. El residuo oleoso recogido se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente: CH2CI2: EtOAc = 10: 1 a 1 :3), resultando en el compuesto 4 (38 g).
Método B; Rt: 5.20 min. m/z = 429.0 (M+H)+. Masa exacta: 428.1 . Columnas: AD-H 50 mm x 4.6 mm, 3 pm; flujo: 4 mL/min; Fase móvil: A: CO2> B: EtOH (dietilamina a 0.05%), 5% a 40% de B en A; temperatura: 40°C, isómero 4a: Rt: 1.53 min; 4b: Rt: 1 .73 min. 100°C (temperatura del aceite) por 4 h Una mezcla de 2-bromonaftaleno (950 g, 4589 mmoles), cloruro de acetilo (260 mL, 4589 mmoles), nitrobenceno (6000 mL) y cloruro de aluminio (642.2 g, 4818 mmoles) se agitó por 4 horas a 100°C. La mezcla se vertió sobre agua helada, la suspensión acuosa espesa resultante se filtró, y la fase orgánica se separó del filtrado. La fase orgánica se lavó con agua (2000 mL), se secó sobre Na2S04 y se filtró. El solvente se removió mediante destilación. El residuo se recristalizó a partir de una solución de hexano: acetato de etilo (10: 1 ), resultando en 1 -(6-bromonaftalen-2-il)etanona (480 g, 42% de rendimiento).
Se añadió TMSOTf (13.4 g, 60.2 mmoles) a una solución agitada de 1-(6-bromonaftalen-2-il)etanona (300 g, 1204 mmoles) y BS (235.8 g, 1324 mmoles) en CH3CN (6000 mL). La mezcla se agitó por 24 horas a 30°C. La mezcla de reacción se diluyó con éter, se lavó con H2O, se secó sobre Na2SO4> se filtró, y se concentró bajo presión reducida. El residuo de la 2- bromo-1-(6-bromonaftalen-2-¡l)etanona cruda (526 g) se usó en el siguiente paso sin más purificación.
Se disolvió 2-bromo-1-(6-bromonaftalen-2-il)etanona (526.5 g, 1204 mmoles) en CH3CN (6000 mL). Se añadió Boc-L-prolina (284 g, 1325 mmoles) a la solución, y la mezcla de reacción se agitó por 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota Et3N (480 mL, 3612 mmoles) a la solución. La mezcla de reacción se agitó por 15 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo vacio y el compuesto crudo 5 (794 g) se usó en el siguiente paso sin más purificación.
Método A1 ; Rt: 1.68 min. m/z = 484.1 (M+Na)+. Masa exacta: Se disolvió el compuesto 5 (794 g, 1204 mmoles) en tolueno (6000 mL), y se añadió acetato de amonio (1855 g, 24096 mmoles) a la solución. La mezcla se agitó por 12 horas a 100°C. La solución se diluyó con acetato de etilo (1000 mL), y se lavó con agua (2 x 500 mL). La capa inorgánica se extrajo con acetato de etilo (2 x 500 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron bajo vacío. El residuo se trituró en CH3CN (300 mL) por 0.5 horas a 0°C, resultando en el compuesto 6 (140 g, 26% de rendimiento basado en 1-(6-bromonaftalen-2-¡l)etanona).
Método A; Rt: 1.28 min. m/z = 442.1 (M+H)+. Masa exacta: 441.1. 6a A la solución del compuesto 6 (75 g, 170 mmoles) se añadió dioxano/HCI (750 mL) a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó por 1 hora. La mezcla se filtró para obtener el compuesto 6a (73 g).
A una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (47.2 g, 270 mmoles) en CH3CN (1200 mL), se añadieron HOBt (36.4 g, 270 mmoles) y EDC.HCI (51.6 g, 270 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó por 30 minutos a temperatura ambiente y se añadió el compuesto 6a (73 g). La solución se enfrió entonces hasta 0°C, se añadió diisopropiletilamina (75 g, 578 mmoles), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (1500 mL) y se lavó con NaOH acuoso (0.5 N, 1000 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera. La capa orgánica combinada se secó y se concentró. El producto crudo obtenido se lavó con CH3CN, resultando en el compuesto 6b (80 g, a partir del compuesto 6: 94%).
Se añadió Pd(PPh3)4 (1 1.6 g, 15.8 mmoles) a una mezcla del compuesto 6 (140 g, 316.5 mmoles), bis(pinacolato)diboro (160.7 g, 633 mmoles), KOAc (62 g, 633 mmoles) y tolueno (4000 mL) bajo nitrógeno. La mmoles), KOAc (62 g, 633 mmoles) y tolueno (4000 mL) bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó por 15 horas a 85°C. Después de enfriamiento, se añadió CH2CI2) y la mezcla se lavó con Na2C03, seguido de salmuera. El agua se extrajo con CH2CI2 (3 x 900 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron bajo vacío. El residuo se recristalizó en un solvente mixto de hexano/i-Pr20 (3/2, 2 x 150 mL), resultando en el compuesto 7 ( 05 g, 63% de rendimiento).
Método A3; Rt: 1.35 min. m/z = 490.1 (M+H)+. Masa exacta: 489.3.
Se añadieron el compuesto 6b (69 g, 138.2 mmoles), 4,4,4,,4,l5,5,5,,5'-octametil-2,2,-bi(1 ,3,2-dioxaborolano) (70.2 g, 276.4 mmoles) y CH3COOK (27.1 g, 276.4 mmoles) a tolueno (1500 mL) seguido de Pd(dppf)CI2 (5 g, 6.9 mmoles) bajo N2 a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante la noche. Después de enfriamiento, se añadió acetato de etilo (1000 mL), y la mezcla se lavó con NaHC03 saturado (1500 mL) y salmuera. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y después de filtración, se concentró en vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna, resultando en el compuesto 7a (52 g, 68% de rendimiento).
Método C; Rt: 4.01 min. m/z = 547.3 (M+H)+. Masa exacta: 546.3.
SFC: Columna: (AS)-H 150 mm x 4.6 mm; 5 µp? Flujo: 3 mL/min. Fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 3.11 min. SFC: Columna: OD-H 50 mm x 4.6 mm; 3 µ?t?. Flujo: 4 mL/min. Fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 1.34 min.
Se añadió Pd(PPh3)4 (17.4 g, 15.1 mmoles) en una porción a una mezcla del compuesto 7 (37 g, 75.6 mmoles) y el compuesto 2 (32.3 g, 75.6 mmoles), Na2CO3/H2O (16 g/300 mL), tolueno (600 mL) y etanol (300 mL) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 90°C. La mezcla de reacción se filtró y se lavó con metanol (500 mL). El filtrado se concentró bajo vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (3 x 300 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron hasta sequedad bajo vacío. El residuos se disolvió en CH3CN y se purificó mediante cromatografía de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H2O = 40/60 a 65/35, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el pH de la solución se ajustó a 8 a 9 con NaHCO3 acuoso saturado. Se removió CH3CN bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 150 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron bajo Na2S04. La solución se evaporó, y el producto puro 8 se secó bajo vacío (12.7 g, 19% de rendimiento).
Método C; Rt: 3.91 min. m/z = 710.5 (M+H)+. Masa exacta: 709.3. 7 Se añadió Pd(PPh3)4 (20.5 g, 17.8 mmoles) en una porción a la mezcla del compuesto 7 (43.5 g, 88.9 mmoles) y el compuesto 4 (38 g, 88.9 mmoles), Na2CO3/H20 (18.8 g/300 mL), tolueno (650 mL) y etanol (350 mL) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 90°C. La mezcla de reacción se filtró y se lavó con metanol (500 mL). El filtrado se concentró bajo vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (2 x 500 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron hasta sequedad bajo vacío. El residuo se trituró en CH3CN, para dar el producto 9 (25 g, 40% de rendimiento).
Método A1 ; Rt: 1.22 min. m/z = 710.3 (M+H)+. Masa exacta: 709.3.
Se añadió HCI 4N/dioxano (4.2 ml_, 17 mmoles) a una solución del compuesto 9 (6 g, 8.5 mmoles) en CH2CI2 (40 mL) a 0°C. La mezcla se dejó calentando hasta temperatura ambiente y se agitó por 10 minutos. El precipitado se filtró y se lavó con éter ter-butilmetílico, para dar el compuesto 10 (5.2 g, 87% de rendimiento).
Método A; Rt: 1.14 min. m/z = 610 (M+H)+. Masa exacta: 609.3.
A una solución del compuesto ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)- 3-metilbutanoico (3.6 g, 20.4 mmoles) en CH3CN (100 mL), se añadieron EDC.HCI (3.9 g, 20.4 mmoles) y HOBT (2.75 g, 20.4 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces se añadió el compuesto 10 (5.2 g, 7.6 mmoles). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C y se añadió DIPEA (4.4 g, 30.4 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 15 horas. La mezcla se concentró y el residuo se diluyó con 150 mL de CH2CI2 y 75 mL de NaOH acuoso 0.5 N. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 x 75 mL), se secó y se concentró, para dar el producto crudo 11. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin más purificación (4.9 g, 87% de rendimiento).
Método A; Rt: 1.19 min. m/z = 767.3 (M+H)+. Masa exacta: 766.4.
Se añadió Pd(OH)2/C (20%, 3 g, seco) a una solución del compuesto 1 1 (4.9 g, 6.4 mmoles) en metanol (40 mL). La mezcla se hidrogenó bajo H2 (345 kPa) a 40°C. Después de 18 horas, la mezcla se filtró sobre diatomita y se concentró. El producto crudo del compuesto 12 se usó en el siguiente paso sin más purificación (4.0 g, 75% de rendimiento).
Método A; Rt: 1.04 min. m/z = 633.3 (M+H)+. Masa exacta: 632.3.
A una solución del compuesto ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (2.6 g, 15.1 mmoles) en CH3CN (40 mL), se añadieron EDC.HCI (2.8 g, 15.1 mmoles) y HOBT (2.0 g, 15.1 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 12 (4.0 g, 6.3 mmoles). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C y se añadió DIPEA (3.2 g, 25.2 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (120 mL) y NaOH acuoso 0.5 N (50 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 x 50 mL), se secó y se concentró, para dar el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de alto de rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1%). La fracción deseada se recogió y el valor del pH de la solución se ajustó a aproximadamente 6 con ácido cítrico acuoso 0.5 N. Se removió CH3CN bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 150 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron bajo Na2S04. La solución se evaporó y el compuesto 13 se secó bajo vacío (2 g, 40% de rendimiento). Se separó 1 g de la mezcla diastereomérica 13 mediante separación por SFC.
Las dos fracciones deseadas se recogieron, y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El producto puro se secó bajo vacio. Se obtuvieron 335 mg de 13a y 310 mg de 13b.
SFC: Columna: OD-3 150 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 2.5 mL/min. Fase móvil: EtOH a 40% (dietilamina a 0.05%) en C02. 13a: Rt: 4.9 min; 13b: Rt: 7.8 min; isómero 13b: método C; Rt: 3.63 min. m/z = 790.5 (M+H)+. Masa exacta: 789.4; isómero 13a: método C; Rt: 3.69 min. m/z = 790.4 (M+H)+. Masa exacta: 789.4. 13b: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6; isómero principal descrito) d ppm 0.83 - 0.95 (m, 12 H), 1.87 - 2.10 (m, 6 H), 2.10 - 2.24 (m, 2 H), 2.24 -2.38 (m, 2 H), 3.55 (s, 6 H), 3.78 - 3.93 (m, 4 H), 4.09 (t, J=8.3 Hz, 1 H), 4.15 (t, J=8.0 Hz, 1 H), 4.94 (dd, J=8.0, 3.3 Hz, 1 H), 5.06 - 5.18 (m, 1 H), 5.86 (s, 1 H), 7.29 - 7.41 (m, 2 H), 7.66 (s, 1 H), 7.75 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 7.80 - 8.10 (m, 5 H), 8.14 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 8.27 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 1 1.73 (br. s, 1 H), 1 1.89 (s, 1 H).
A ácido (2S,3R)-3-metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico (63.5 mg, 0.332 mmoles) disuelto en diclorometano (100 mL) en un matraz de fondo redondo de 250 mL, se añadió trietilamina (0.13 mL, 0.95 mmoles) seguida de COMU (142 mg, 0.33 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, se añadió el compuesto 12 (200 mg, 0.32 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. Se añadió HCI 5-6N en ¡PrOH (10 mL) a la mezcla de reacción, y posteriormente la mezcla se lavó con solución de Na2CO3 acuoso saturado (2 x 200 mL). La capa orgánica se secó sobre MgS04 y después de filtración, el filtrado se evaporó hasta sequedad para dar un polvo pardo. El polvo obtenido se purificó mediante cromatografía de gel de sílice mediante elución con MeOH de 0 a 8% (NH3 7N) en EtOAc. Después de la colecta de las fracciones relevantes y la evaporación de los volátiles, se obtuvo el compuesto 13-A1 como un polvo blanco-amarillo (105 mg, 0.130 mmoles, 41 %).
Método E; Rt: 5.01 min. m/z = 806.3 (M+H)+. Masa exacta: 805.4.
Se sintetizó el compuesto 13-A2 de igual manera como se describió para el compuesto 13-A1 usando ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)butanoico en lugar de ácido (2S,3R)-3-metox¡-2-(metoxicarbonilamino)butanoico.
Método E; Rt: 5.0 (dos picos) min. m/z = 776.4 (M+H)+. Masa exacta: 775.4.
Se sintetizó el compuesto 13-A3 de igual manera como se describió para el compuesto 13-A1 , usando ácido (2S,3S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilpentanoico en lugar de ácido (2S,3R)-3-metox¡-2-(metoxicarbonilamino)butanoico.
Método E; Rt: 5.45 y 5.61 min. m/z = 804.4 (M+H)+. Masa exacta: 803.4.
Se sintetizó el compuesto 13-A4 de igual manera como se describió para el compuesto 13-A1 , usando ácido 2-(metoxicarbonilamino)-2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)acético en lugar de ácido (2S,3R)-3-metoxí-2-(metoxicarbonilamino)butanoico.
Método E; Rt: 4.94 min. m/z = 832.4 (M+H)+. Masa exacta: 831.4.
Se sintetizó el compuesto 13-A5 de igual manera como se describió para el compuesto 13-A1 , usando ácido (2S,3R)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilpentanoico en lugar de ácido (2,S,3R)-3-metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico.
Método E; Rt: 5.54 y 5.64 min. m/z = 804.4 (M+H)+. Masa exacta: 803.4.
Se sintetizó el compuesto 13-A6 de igual manera como se describió para el compuesto 13-A1 , usando ácido (S)-4-metox¡-2-(metoxicarbonilamino)butanoico en lugar de ácido (2S,3R)-3-metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico.
Método E; Rt: 5.03 min. m/z = 806.4 (M+H)+. Masa exacta: 805.4.
Se sintetizó el compuesto 13-A7 de igual manera como se describió para el compuesto 13-A1 , usando sal de diciclohexilamina de ácido (S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)-3-metoxipropanoico en lugar de ácido (2,S,3R)-3-metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico.
Método E; Rt: 5.70 min. m/z = 834.4 (M+H)+. Masa exacta: 833.4.
Se sintetizó el compuesto 3-A8 partiendo del compuesto 13-A7. Se agitó el compuesto 13-A7 (135 mg, 0.162 mmoles) en MeOH (9 mL), y se añadió HCI 6 M en iPrOH (2.9 mL), la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 3 horas, y los volátiles se removieron. El polvo obtenido (130 mg) se agitó en acetonitrilo (10 mL) y se trató con cloroformiato de metilo y N-metilimidazol, hasta que el producto de partida se consumiera. Los volátiles se removieron, se disolvieron en MeOH (5 mL), se trataron con HCI 6M en iPrOH (5 mL), y la mezcla se puso a reflujo por 2 horas, los volátiles se removieron, y el compuesto se purificó mediante CLAR preparativa (RP Vydac Denali C18 - 10 pm, 250 g, 5 cm), fase móvil (solución de NH4HCO3 a 0.25% en agua, CH3CN)), y las fracciones deseadas se recogieron, se evaporaron, se disolvieron en MeOH y se evaporaron de nuevo. Después de desecación en vacío, se obtuvo el compuesto 13-A8 (32 mg).
Método E; Rt: 4.88 min. m/z = 792.4 (M+H)+. Masa exacta: 791.4.
Se añadió gota a gota cloruro de oxalilo (50 mL, 581.5 mmoles), a temperatura ambiente, a una solución del compuesto 14 (50 g, 232.5 mmoles) en CH2CI2 (750 mL) y DMF (1 mL, 1 1.6 mmoles). La mezcla de reacción se agitó por 0.5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró bajo vacío, y el residuo se usó sin más purificación. Se obtuvo un total de 65 g del producto crudo 15.
A una solución del compuesto 15 (65 g, 232.5 mmoles) en THF (750 mL) se añadieron dietilamina (18.7 g, 255.7 mmoles) y NaOH 1 N en agua (465 mL, 465 mmoles). La mezcla se agitó por 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 mL). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron y se concentraron bajo vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano: acetato de etilo = 10: 1), para dar el producto 16 (36 g, 57% de rendimiento, 2 pasos).
Método A3; Rt: 1.39 min. m/z = 269.9 (M+H)+. Masa exacta: Se añadió Pd(PPh3)4 (4.3 g, 3.7 mmoles) en una porción a una mezcla del compuesto 7 (18.1 g, 37 mmoles) y el compuesto 16 (10 g, 37 mmoles), Na2C03 (8 g, 74 mmoles), agua (160 mL), tolueno (320 mL) y etanol (160 mL) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 90°C. La mezcla de reacción se extrajo con CH2CI2 (dos veces, 300 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron bajo vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 mL), y entonces se añadió éter de petróleo (200 mL) a la mezcla. La solución clara de la capa superior se decantó, y el residuo de aceite negro se removió. Se añadió más éter de petróleo (800 mL) a la solución resultante. El sólido resultante se recogió mediante filtración y se secó entonces, para dar el producto 17 (14.7 g, 72% de rendimiento).
Método A3; Rt: 1.28 min. m/z = 553.2 (M+H)+. Masa exacta: 552.3.
Se añadió lentamente n-BuLi (26.7 mL, 71.6 mmoles) a una solución del compuesto 17 (9 g, 16.3 mmoles) en THF seco (300 mL) bajo nitrógeno -20°C, mientras la temperatura de reacción se mantenía abajo de 0°C. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó por otra hora a la misma temperatura. Se añadió 1-N-Boc-2-ciano-pirrolidina (obtenida de acuerdo con los procedimientos descritos en J. Med. Chem., 2002, 45, 4581-4584 (3.5 g, 17.9 mmoles) en THF (10 mL) a la solución resultante a -50°C, y la mezcla se agitó por otros 20 minutos a la misma temperatura. La mezcla de reacción se extinguió añadiendo lentamente agua (15 mL). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron bajo vacío, para dar el producto crudo 18.
El producto crudo se purificó mediante cromatografía de alto de rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 45/55 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con aHC03 acuoso saturado. Se removió CH3CN bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 150 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4. La solución se evaporó, y el producto puro se secó bajo vacío (5 g, 45% de rendimiento).
Método B; Rt: 5.67 min. m/z = 676.3 (M+H)+. Masa exacta: 675.3; SFC: Columnas: Chiralpak OD-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: metanol (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A. Isómero 18a: Rt: 5.51 min; isómero 18b: Rt: 6.71min.
Se disolvió el compuesto 18 (1.8 g, 2.7 mmoles) en CH2CI2 (10 mL), y se añadió gota a gota a 0 a 5°C HCI 4 N en 1 ,4-dioxano (2 mL, 8.1 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 hora, se filtró y el sólido se lavó con éter ter-butilmetílico (20 mL), resultando en el producto 19 (1.4 g).
Método D; Rt: 1.52 min. m/z = 476.3 (M+H)+. Masa exacta: 475.2.
A una solución del compuesto ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1.01 g, 5.8 mmoles) en CH3CN (20 ml_), se añadieron HOBT (0.8 g, 5.8 mmoles) y EDC.HCI (1.08 g, 5.8 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 19 (1.14 g). La suspensión acuosa espesa resultante se enfrió hasta 0°C y se añadió DIPEA (1.3 g, 8.4 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con 30 mL de CH2CI2 y 15 mL de NaOH acuoso 0.5 N. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 x 15 mL). La capa orgánica se secó y se concentró, para dar el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 35/65 a 70/30, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con aHC03 acuoso saturado. Se removió CH3CN bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 200 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron bajo Na2S04. La solución se evaporó, resultando en el compuesto 20 (0.893 g).
Método B; Rt: 5.14 min. m/z = 790.4 (M+H)+. Masa exacta: 789.4; SFC: Columna: Chiralpak AS-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.35 mL/min. Fase móvil: MeOH a 40% (dietilamina a 0.05%) en C02; 20a: Rt: 4.5 min; 20b: Rt: 8.0 min.
Se disolvió el compuesto 8 (1500 mg, 2.11 mmoles, 1.00 equiv.) en HCI 5-6N en isopropanol (150 mL, 900 mmoles, 426 equiv.) en un matraz de fondo redondo de 250 mL, y la mezcla de reacción se agitó por 20 horas a 100°C bajo atmósfera de nitrógeno y se dejó enfriando hasta temperatura ambiente. A la suspensión acuosa espesa se añadió tBuOMe (100 mL). Los sólidos se filtraron y se lavaron con tBuOMe (2 x 50 mL) y se secaron de inmediato bajo vacío, para dar 1.23 g del compuesto 21 como un polvo amarillo el cual se usó como tal en los siguientes pasos.
A ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (314 mg, 1.80 mmoles) en diclorometano (150 mL) en un matraz de fondo redondo de 500 mL se añadió trietilamina (0.713 mL, 5.13 mmoles), seguida de hexafluorofosfato de 2-(3H-[1 ,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)-1 ,1 ,3,3-tetrametilisouronio (V) (682 mg, 1.80 mmoles). La mezcla se sónico por 10 minutos. Entonces, se añadió el compuesto 21 (500 mg, 0.86 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió HCI en ¡PrOH (5-6 N, 10 mL), y la solución resultante se lavó sucesivamente con una solución de Na2C03 acuoso saturado (2 x 200 mL) y salmuera (100 mL). Después de desecación sobre sulfato de magnesio y filtración, el filtrado se evaporó hasta sequedad para dar un polvo blanco. El polvo se purificó usando cromatografía en columna (NH3 (7N en MeOH)/CH2CI2 0-6.5%)), para dar el compuesto 22 como un polvo blanco (mezcla diastereomérica, 636 mg; 93%). Parte de la mezcla diastereomérica (586 mg) se recristalizó a partir de metanol/acetonitrilo/DMSO 5/2/2 (9 mL). Los sólidos se filtraron, se lavaron con metanol (2 x 2 mL) y se secaron en un horno de vacío a 40°C durante el fin de semana, para dar el isómero 22b (122 mg, 92% de descomposición).
SFC: columna: (AS) 500 mm x 4.6 mm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: eOH a 35% (conteniendo iPrNH2 a 0.2%); retención por 15 minutos; temperatura: 50°C; Rt (6.38 min); UV: 4.0% de isómero 22a; UV: 96.0% de isómero 22b. LC-MS (22b) método E; Rt: 4.81 min. m/z = 790.3 ( +H)+. Masa exacta: 789.4.
El filtrado se enfrió hasta 4°C durante el fin de semana, y el precipitado resultante se filtró, se lavó con metanol y se secó en un horno de vacío a 40°C durante la noche, para dar el isómero 22a (164 mg, 92% de descomposición) como un polvo blanco.
SFC: columna: (OD)-H 500 mm x 4.6 mm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: MeOH a 10-40% (conteniendo iPrNH2 a 0.2%) a un régimen de 1.6%/min, MeOH a 40-50% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%) a un régimen de 5% y retención por 4.00 min; temperatura: 50°C; Rt (21.74 min); UV: 95.9%, 22a; Rt (22.72 min); UV: 4.1 %, 22b. LC-MS (22a): método E; Rt: 5.04 min. m/z = 790.4 (M+H)+. Masa exacta: 789.4.
A ácido (2,S,3R)-3-metoxi-2-(metoxicarbonilamino)butanoico (251 mg, 1.31 mmoles) disuelto en diclorometano (150 mL) en un matraz de fondo redondo de 250 mL se añadió trietilamina (0.694 mL, 4.99 mmoles), seguida de hexafluorofosfato de 2-(3H-[1 ,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)-1 ,1 ,3,3-tetrametilisouronio (V) (498 mg, 1.31 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 10 minutos. Se añadió el compuesto 21 (365 mg, 0.624 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió entonces HCI en ¡PrOH (5-6 N, 10 mL), y la solución resultante se lavó sucesivamente con solución de Na2C03 acuoso saturado (2 x 200 mL) y salmuera (100 mL). La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y el filtrado se concentró en vacío, para dar un polvo pardo. El polvo se purificó usando cromatografía en columna (NH3 (7N en MeOH)/DCM 0-8%), para dar el compuesto 23 (390 mg; 75%) como un polvo blanco.
Método D; Rt: 4.40 y 4.52 min. m/z = 822.3 (M+H)+. Masa exacta: 821.4.
Se recristalizaron 340 mg de la mezcla diastereomérica a partir de metanol (8 mL). Los sólidos se filtraron y se lavaron con metanol (2 x 2 mL) y se secaron en un horno de vacío a 40°C durante la noche, para dar el compuesto 23b (73 mg, 14%, 93% de descomposición) como un polvo blanco.
SFC: columna: (OD)-H 250 mm x 4.6 mm¡ flujo: 3.5 mL/min; Fase móvil: MeOH a 40%, 10.00 min; temperatura: 30X, Rt (3.58 min, 23a); UV: 3.4%; Rt (4.49 min, 23b); UV: 96.6%. Método D; Rt: 4.39 min. m/z = 822.3 (M+H)+. Masa exacta: 821.4.
El filtrado se purificó mediante SFC preparativa sobre Chiralpak Diacel OD 20 x 250 mm; fase móvil (C02, metanol con ¡PrNH2 a 0.2%). Las fracciones deseadas se recogieron, se evaporaron, se disolvieron en metanol y se evaporaron de nuevo, dando el compuesto 23a (1 14 mg) como un polvo blanco (22%, 100% de descomposición).
SFC: columna: (OD)-H 500 mm x 4.6 mm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: MeOH a 40% (conteniendo iPrNH2 a 0.2%); retención por 19.50 min, MeOH a 40-50% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%); retención por 4.10 minutos; temperatura: 50°C; Rt (6.5 min, 23a) UV: 100.00%; Rt (7.5 min, 23b) UV: 0.00%. LC-MS: método E; Rt: 4.44 min. m/z = 822.5 (M+H)+. Masa exacta: 821.4; y el compuesto 23b (41 mg) como un polvo blanco (7%, 94% de descomposición).
SFC: columna: (OD)-H 500 mm x 4.6 mm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: MEOH a 40% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%); retención por 19.50 min, MeOH a 40-50% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%); retención por 4.10 min; temperatura: 50°C; Rt (6.5 min, 23 a) UV: 2.99%; Rt (7.5 min, 23b) UV: 97.01 %.
A ácido (2S,3S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilpentanoico (248 mg, 1.31 mmoles) disuelto en diclorometano (150 mL) en un matraz de fondo redondo de 250 mL se añadió trietilamina (0.694 mL, 4.99 mmoles), seguida de hexafluorofosfato de 2-(3H-[1 ,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)-1 ,1 ,3,3-tetrametilisouronio (V) (498 mg, 1.31 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 10 minutos. Se añadió el compuesto 21 (365 mg, 0.624 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió HCI en iPrOH (5-6 N, 10 mL), y la solución resultante se lavó con solución de Na2C03 acuoso saturado (2 x 200 mL) y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de filtración, el solvente se evaporó en vacío para dar un polvo pardo. El polvo se purificó usando cromatografía en columna (NH3 (7N en MeOH)/DCM 0-6.5%), para dar la mezcla diastereomérica 24 (395 mg) como un polvo blanco.
LC-MS: método E; Rt: 5.5 y 5.7 min. m/z = 818.4 (M+H)+. Masa exacta: 817.4.
Se recristalizaron 345 mg de la mezcla diastereomérica a partir de metanol (5 mL). Los sólidos se filtraron, se lavaron con metanol (2 x 2 ml_) y se secaron en un horno de vacio a 40°C durante la noche, para dar el compuesto 24a (78 mg, 14%, 93% de descomposición) como un polvo blanco.
LC-MS: método E; Rt: 5.7 min. m/z = 818.4 (M+H)+. Masa exacta: 817.4.
SFC: columna: (OD)-H 250 mm x 4.6 mm; flujo: 3.5 mL/min; fase móvil: MeOH a 40%, 10.00 min; temperatura: 30°C; Rt (3.29 min, 24a) UV: 97.7%; Rt (4.55 min, 24b) UV: 2.3%.
El filtrado se purificó mediante SFC preparativa (Chiralpak Diacel OD 20 x 250 mm; fase móvil (C02, metanol con ¡PrNH2 a 0.2%)). Las fracciones deseadas se recogieron y se evaporaron, dando el compuesto 24a (54 mg, 10%, 100% de descomposición) como un polvo blanco.
LC-MS: método E; Rt: 5.7 min. m/z = 818.4 (M+H)+. Masa exacta: 817.4; columna SFC: (OD)-H 500 mm x 4.6 mm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: MeOH a 40% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%), retención por 19.50 min, MeOH a 40-50% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%), retención por 4.10 min; temperatura: 50°C; Rt (6.8 min, 24a) UV: 100.00; Rt (8.0 min, 24b) UV: 0.00%, y el compuesto 24b como un polvo blanco (130 mg, 25%, 100% de descomposición).
LC- S: método E; Rt: 5.5 min. m/z = 818.4 (M+H)+. Masa exacta: 817.4; columna: (ÓD)-H 500 mm x 4.6 mm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: MeOH a 40% (conteniendo ¡PrNH2 a 0.2%), retención por 19.50 min, MeOH a 40-50% (conteniendo iPrNH2 a 0.2%), retención por 4.10 min; temperatura: 50°C; Rt (6.8 min); UV: 0.0%; Rt (8.0 min, 24b) UV: 100.0%.
Se disolvieron el compuesto 25 (10 g, 43.5 mmoles) y NaOH (5.2 g, 130.4 mmoles) en H20 (60 mL), CH3CH2OH (60 mL) y THF (180 mL). La mezcla de reacción se agitó por 12 horas a temperatura ambiente. El solvente orgánico se removió en vacío. La mezcla se extrajo entonces con acetato de etilo (2 x 100 mL). La capa acuosa se neutralizó con HCI 1 (aún a pH=4) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron bajo vacío, resultando en el compuesto 26 (9.1 g, 97% de rendimiento).
Se disolvieron el compuesto 26 (9.1 g, 42.1 mmoles), HOBT (13.6 g, 101.1 mmoles) y EDC.HCI (19.4 g, 101.1 mmoles) en DMF (60 mL), y se añadió lentamente NH3.H20 (30 mL). La mezcla de reacción se agitó por 15 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió entonces en vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 mL) y se lavó con NaOH 1 N (20 mL) seguido de salmuera, se secó sobre Na2S04 y se concentró bajo vacío, resultando en el compuesto 27 (7.6 g, 84% de rendimiento). 28 29 Se disolvió el compuesto 28 (15.7 g, 63.1 mmoles) en CH2CI2 seco (250 mL), y se añadió DMF (1.5 mL) a la solución. Se añadió gota a gota cloruro de oxalilo (13.5 mL, 157.5 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó por 0.5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró bajo vacío, y el residuo (22 g) se usó directamente sin más purificación. 30 A la solución del compuesto 29 (22 g, mezcla cruda) en THF seco (250 mL), se añadieron el compuesto 27 (7.6 g, 35.3 mmoles) y NaOH 1 N (ac, 85 mL, 85 mmoles). La mezcla se agitó por 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrajo entonces con acetato de etilo (3 x 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaOH 1 N en agua (15 mL), salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo vacío, resultando en el compuesto 30.
Método A1 ; Rt: 1.36 min. m/z = 446.1 (M+H)+. Masa exacta: 445.1.
Se calentaron el compuesto 30 (17 g, 38.1 mmoles) en CH3CH2OH (200 mL) y KOH a 10% (34 mL) hasta 80°C por 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0°C y se neutralizó hasta pH=7 añadiendo cuidadosamente HCI concentrado. El precipitado resultante se recogió mediante filtración y se lavó con acetato de etilo/hexano (5/1 ), resultando en el compuesto 31 (12.6 g; 77%).
Método C; Rt: 4.27 min. m/z = 428.0 (M+H)+. Masa exacta: 427.1. [a]58920 = 0.75 (CH2CI2, 9.47 mg/mL).
SFC: columnas: Chiralpak OD-3 50 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 4 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%; 5 a 40% de B en A, temperatura 40°C; Rt: 1 .4 min.
SFC: columnas: Chiralpak AS-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 5 a 40% de B en A, temperatura 40°C; Rt: 4.4 min. 32 Se añadió Pd(PPh3) (3.0 g, 2.6 mmoles) a la mezcla del compuesto 31 (1 1 g, 25.7 mmoles), compuesto 7 (12.5 g, 25.7 mmoles), Na2CO3 (5.4 g, 51.4 mmoles), agua (110 ml_), CH CH2OH (1 10 mL) y tolueno (220 mL) en una porción bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 80°C. El solvente orgánico se removió bajo vacío, y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron entonces sobre Na2S04 y se concentraron hasta sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo/acetato de etilo = 2/1 a 1/2). El producto obtenido se purificó adicionalmente mediante cromatografía de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 20/80 a 70/30, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el valor del pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 añadiendo K2C03. Entonces, el solvente orgánico se removió bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron bajo Na2S04. La solución se evaporó, resultando en el compuesto 32 (23% de rendimiento).
Método C; Rt: 4.21 min. m/z = 71 1.3 (M+H)+. Masa exacta: 710.3.
SFC: columnas: Chiralpak OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ?t?; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 5.47 min [a] 58920 = -44.54 (CH2CI2, 5.25 mg/mL).
SFC: columnas: Chiralpak AS-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 4.25 min. 33 A la solución del compuesto 32 (3.2 g, 4.5 mmoles) en CH2CI2 (20 mL), se añadió gota a gota HCI 4 N en dioxano (5.6 mL) a 0°C. Cuando el material de partida se consumió por completo, el solvente se removió bajo vacío. El residuo se lavó con éter ter-butilmetílico (2 x 10 mL), para dar el compuesto 33 (2.47 g).
Se añadió Pd(OH)2/C (0.3 g, 0.43 mmoles) a la solución del compuesto 33 (2.47 g, 3.82 mmoles) en CH3OH bajo nitrógeno. La mezcla resultante se hidrogenó a 40°C bajo el H2 (3.515 kg/cm2) por 14 horas. La mezcla se filtró sobre celite y se concentró. El residuo (1.2 g, compuesto 34) se usó directamente en el siguiente paso sin más purificación. 35 A una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1.05 g, 6 mmoles) en CH3CN (20 mL), se añadieron HOBT (0.81 g, 6 mmoles) y EDC.HCI (1.14 g, 6 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 34 (1.2 g). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C y se añadió diisopropiletilamina (1.6 g). La mezcla se agitó a 20°C por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (30 mL) y NaOH 0.5 N acuoso (15 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 x 15 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron, para dar el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3OH/H2O = 40/60 a 70/30, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el valor del pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con K2CO3. Entonces, se removió CH3OH bajo presión reducida, y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4. La solución se evaporó, resultando en el compuesto 35 (1.0 g). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, isómero principal descrito) d ppm 11.79 - 12.44 (m, 2 H, dos singuletes principales a 11.84 y 12.34) 7.82 - 8.49 (m, 8 H) 7.56 - 7.68 (m, 2 H) 7.23 -7.33 (m, 2 H) 5.09 - 5.17 (m, 1 H) 4.78 -4.87 (m, 1 H) 4.07 - 4.17 (m, 2 H) 3.73 - 3.96 (m, 4 H) 3.55 (2x s, 6 H) 1.89 -2.36 (m, 10 H) 0.79 - 1.07 (m, 12 H).
Método C; Rt: 3.97 min. m/z = 791.5 (M+H)+. Masa exacta: SFC: columnas: Chiralpak OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 3.05 min [a] 58920 = -24.25 (CH2CI2l 2.55 mg/mL). 36 37 Se disolvieron el compuesto 36 (10 g, 43.5 mmoles) y NaOH (5.2 g, 130.4 mmoles) en H20 (40 mL), CH3CH2OH (40 mL) y THF (120 mL). La mezcla de reacción se agitó por 3 horas a 50°C. El solvente orgánico se removió entonces bajo vacío. El residuo se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). La capa acuosa se acidificó con HCI concentrado hasta pH=2 y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se concentraron bajo vacío, para dar el producto 37 (9.3 g, 98% de rendimiento).
Se disolvieron el compuesto 37 (9.3 g, 43.1 mmoles), HOBT (13.4 g, 99 mmoles) y EDC.HCI (19 g, 99 mmoles) en DMF (40 mL). La solución se agitó a 20°C por 30 minutos. A la solución, se añadió lentamente NH3.H2O (20 mL). La mezcla de reacción se agitó por 15 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió en vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 mL). La mezcla se lavó con NaHCC>3 saturado y solución acuosa de NH4CI. La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró bajo vacío, para dar el compuesto 38 (6.2 g, 67% de rendimiento).
A la solución del compuesto 29 (7.0 g, 26.1 mmoles) en THF seco (100 mL), se añadieron el compuesto 38 (5.6 g, 26.1 mmoles) y NaOH 1 N (ac, 52 mL, 52.2 mmoles). La mezcla se agitó por 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaOH 1 N en agua (50 mL), salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo vacío, resultando en el compuesto 39 (8.3 g, 71 % de rendimiento).
Método A1 ; Rt: 1.37 min. m/z = 468.1 (M+Na)+. Masa exacta: 445.1.
La solución del compuesto 39 (8.3 g, 18.6 mmoles) en CH3CH2OH (100 mL) y KOH a 10% (17 mL), se calentó hasta 80°C por 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0°C y se neutralizó hasta pH=7 con solución acuosa de HCI 10 N. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se disolvió en CH2CI2 (80 mL) y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró bajo vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1 a 1/3), resultando en el compuesto 40 (1.8 g, 21 % de rendimiento).
Método A; Rt. 1.42 min. m/z = 428.1 (M+H)+. Masa exacta: 427.1.
SFC: columnas: Chiralpak AD-H 50 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 4 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%; 5% a 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 1.98 min.
SFC: columnas: Chiralpak OD-H 50 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 4 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%; 5% a 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 1.45 min.
Se añadió Pd(PPh3)4 (0.27 g, 0.23 mmoles) a la mezcla del compuesto 40 (1 g, 2.33 mmoles), compuesto 7 (1.14 g, 2.33 mmoles), Na2CO3 (0.5 g, 4.67 mmoles), agua (11.3 mL), CH3CH2OH (10 mL) y tolueno (20 mL) en una porción bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 90°C. El solvente orgánico se removió bajo vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1 a 1/3). El compuesto 41 obtenido se volvió a purificar mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H2O = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 10 con K2CO3. Entonces, se removió CH3CN bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 15 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2S04. La solución se evaporó y el residuo se secó bajo vacío, resultando en el compuesto 41 (0.58 g, 35% de rendimiento).
Método C; Rt: 4.1 1 min. m/z = 71 1.3 (M+H)+. Masa exacta: 710.3.
SFC: columnas: Chiralpak OD-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 8.45 min.
SFC: columnas: Chiralpak OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.35 mIJmin; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 5.72 min.
A la solución del compuesto 41 (0.58 g, 0.82 mmoles) en CH2CI2 (5 mL), se añadió gota a gota a 0°C HCI 4N en dioxano (0.35 mL). Después de la conversión completa hasta el compuesto 42, el solvente se removió en vacío. El residuo se lavó con éter ter-butilmetílico (2 x 3 mL), resultando en el compuesto 42 (0.5 g).
Método A; Rt: 0.98 min. m/z = 61 1.5 (M+H)+. Masa exacta: 610.3.
Se añadió Pd(OH)2/C (0.15 g, 0.22 mmoles) a la solución del compuesto 42 (0.5 g) en CH3OH bajo nitrógeno. La mezcla resultante se hidrogenó a 40°C bajo la presión de 3.515 kg/cm2 por 18 horas. La mezcla se filtró sobre celite y se concentró. El residuos se usó directamente en el siguiente paso sin más purificación (0.38 g).
Método A; Rt: 1.02 min. m/z = 477.3 (M+H)+. Masa exacta: 476.2.
A una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.43 g, 2.4 mmoles) en CH3CN (10 mL), se añadieron HOBT (0.43 g, 3.2 mmoles) y EDC.HCI (0.63 g, 3.2 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 43 (0.38 g). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C y se añadió diisopropiletilamina (0.51 g, 4.0 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (50 mL) y NaOH 0.5 N (20 mL; ac). La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 10 mL). Después de la evaporación de los volátiles, el producto crudo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H2O = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 6 con ácido cítrico 0.5 N. Entonces, se removió CH3CN bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron bajo Na2S04. La solución se evaporó y el residuo se secó bajo vacío, resultando en el compuesto 44 (181 mg).
Método C; Rt: 3.86 min. m/z = 791.5 (M+H)+. Masa exacta: 790.4.
SFC: columnas: Chiralpak OD-H 50 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 4 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 1.42 min.
SFC: columnas: Chiralpak AS-H 50 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%; 5% a 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 5.26 min. [a] 58920 = -228.0 (CH2CI2, 1 mg/mL). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, isómero principal descrito) d ppm 11.67 - 12.44 (2 H, m, dos singuletes principales a 11.82 y 12.26) 7.61 - 8.36 (10 H, m) 7.23 (2 H, d, J= 8.3 Hz) 5.08 - 5.16 (1 H, m) 4.82 (1 H, dd, J= 4.9, 7.7 Hz) 4.06 - 4.17 (2 H, m) 3.70 - 3.98 (4 H, m) 3.55 (3H, s) 3.54 (3 H, s) 1.85 - 2.35 (10 H, m) 0.8-1.05 (12 H, m).
Se añadieron EDC.HCI (0.63 g, 3.3 mmoles) y HOBt (0.45 g, 3.3 mmoles) a una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.58 g, 3.3 mmoles) en acetonitrilo (45 mL). La mezcla se agitó a 10°C por 1 hora y entonces se añadió el compuesto 42 (0.9 g). La mezcla se enfrió hasta 0°C y después de la adición de diisopropiletilamina (0.72 g, 5.6 mmoles), la mezcla se agitó a 10°C por 48 horas. Después de la filtración de la mezcla de reacción, el filtrado se concentró en vacío y el residuo resultante se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y HCI 1 N (15 mL). El sólido se filtró, se lavó con éter ter-butilmetílico (5 mL) y se secó bajo alto vacío, para dar el compuesto 42a (0.4 g). La capa orgánica se separó y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (15 mL) y salmuera y se secó sobre Na2S04. Después de filtración, el solvente se removió en vacío. El residuo se lavó con éter ter-butilmetílico (10 mL) y se secó bajo alto vacío, resultando en más compuesto 42a (0.3 g).
Método A2; Rt: 0.84 min. m/z = 767.8 (M+H)+. Masa exacta: 767.3.
Una mezcla del compuesto 42a (0.56 g), (Boc)20 (0.34 g, 1.54 mmoles, 2 equiv:), trietilamina (0.33 mL, 2.31 mmoles) y Pd(OH)2 a 20% seco/C (0.5 g) en metanol (5 mL), se agitó bajo atmósfera de hidrógeno a 10°C por 3 horas. La mezcla se filtró, y el filtrado se evaporó en vacio. El residuo obtenido se disolvió en CH2CI2 (10 mL) y se lavó con H20 (5 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y después de filtración, el filtrado se concentró en vacío. El residuo obtenido se lavó con éter ter-butilmetílico (3 mL). El sólido (0.47 g) se filtró y se secó bajo alto vacío.
Método A2; Rt: 1.00 min. m/z = 734.4 (M+H)+. Masa exacta: 733.4.
El sólido se disolvió en CH2CI2 (5 mL), y se añadió gota a gota a 0°C HCI 4 N/dioxano (3 mL, 12 mmoles). La mezcla se agitó a 10°C por 1 hora. El solvente se removió en vacío, y el residuo se solidificó con éter ter-butilmetílico (2 mL). El sólido se filtró y se secó bajo alto vacío, para dar el compuesto 42b (0.36 g).
Método A2; Rt: 0.82 min. m/z = 634.1 (M+H)+. Masa exacta: 633.3.
Una mezcla del compuesto 42b (0.3 g), ácido (R)-2-(ter-butoxicarbonilamino)-2-fenilacético (0.25 g, 0.99 mmoles), anhídrido cíclico de ácido propilfosfónico (0.9 mL, 1.69 mmoles,), diisopropiletilamina (0.6 mL, 2.7 mmoles, 6 equiv.) y DMF (6 mL), se agitó a 10°C por 1 hora. Se añadieron CH2CI2 (5 mL) y solución de NaHCC>3 saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera (2 3 mL) y se secó sobre Na2S04. Después de filtración, el solvente se removió en vacío. El residuo obtenido se lavó con éter ter-butilmetílico (3 mL). El sólido se filtró y se secó bajo alto vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (columna: Grace Vydac 250 x 20 mm x 5 pm; fase, móvil A: agua (conteniendo TFA a 0.075%, v/v); fase móvil B: acetonitrilo (conteniendo TFA a 0.025%, v/v); magnitud de flujo: 30 mL/min, gradiente: 35-50% (v/v) de B en A de 0 a 11 min).
Las fracciones puras se recogieron y se basificaron con NaHCO3 a pH=8. Los volátiles se removieron en vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera (10 mL) y se secó sobre Na2S04. Después de filtración, el solvente se removió en vacío, para dar el compuesto 44-1 (0.1 1 g).
Método C; Rt: 4.10 min. m/z = 867.5 (M+H)+. Masa exacta: 866.4.
Se disolvió el compuesto 44-1 (1.8 g, crudo) en CH2CI2 (20 mL), y se añadió gota a gota a 0°C HCI/dioxano (6 mL, 24 mmoles). La mezcla se agitó a 0°C por 2 horas. El solvente se removió en vacio. El residuo se lavó con éter dietílico (3 mL) y CH2CI2 (5 mL). El sólido se secó bajo alto vacío, para dar el compuesto 44-1 a (0.82 g).
Método A2; Rt: 0.85 min. m/z = 767.3 (M+H)+. Masa exacta: 766.4.
Se añadió cloroformiato de metilo (0.33 g, 3.49 mmoles) a la mezcla del compuesto 44-1a en H20 (10 mL) y éter ter-butilmetílico (10 mL) a 0°C. Se añadió NaOH (0.12 g, 3.1 mmoles). La mezcla se agitó a 0°C por 1 hora, y entonces se añadió CH2CI2 (10 mL). La capa orgánica se lavó con H20 (10 mL) y se secó (Na2S04). Después de filtración, el solvente se evaporó en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (columna: Grace Vydac 250 x 20 mm x 5 µ, fase móvil A: agua (conteniendo TFA a 0.075%, v/v), fase móvil B: acetonitrilo (conteniendo TFA a 0.025%, v/v), magnitud de flujo: 30 mL/min, gradiente: 35-50% de B (v/v) en A de 0 a 11 min). Las fracciones puras se recogieron y se basificaron con solución de NaHC03 saturado a pH=8. Los volátiles se removieron en vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (2 15 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera (10 mL) y se secó sobre Na2S04. Después de filtración, el solvente se removió en vacío. El residuo resultante se secó adicionalmente en vacío, para dar el compuesto 44-2 (45 mg) como un polvo blanco.
Método B; Rt: 5.05 min. m/z = 825.5 (M+H)+. Masa exacta: 824.4.
Se añadió cloroformiato de ciclopentilo (0.44 g, 3 mmoles) a la mezcla del compuesto 44-1 a (0.2 g), H20 (5 mL) y MTBE (5 mL) a 0°C. Se añadió NaOH (0.1 g, 2.5 mmoles) en H20 (0.5 mL). La mezcla se agitó a 0°C por 1 hora. Se añadió HCI 1 N hasta pH=3 seguido de CH2CI2 (10 mL). La capa orgánica se lavó con H20 (10 mL). El solvente se removió en vacío, y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (columna: Grace Vydac 250 x 20 mm x 5 µ, fase móvil A: agua (conteniendo TFA a 0.075%, v/v), fase móvil B: acetonitrilo (conteniendo TFA a 0.025%, v/v), magnitud de flujo: 30 mL/min, gradiente: 35-50% de B (v/v) en A de 0 a 11 min). Las fracciones puras se recogieron y se basificaron con NaHCO3 a pH=8. Los volátiles se removieron en vacío, y el residuo obtenido se extrajo con CH2CI2 (2 x 15 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera (10 mL) y se secó sobre Na2SO4. Después de filtración, el solvente se removió en vacío. El residuo resultante se liofilizó, resultando en el compuesto 44-3 (34 mg).
Método B; Rt: 5.35 min. m/z = 879.6 (M+H)+. Masa exacta: Se añadieron lentamente ciclobutanol (2 g, 27.7 mmoles) y N,N-dimetilanilina (3.69 g, 30.5 mmoles) a una mezcla de trifosgeno (8.22 g, 27.7 mmoles, 1 equiv.) en THF seco (20 mL) a 0°C. Después de 10 minutos, la reacción se calentó hasta 10°C y se agitó por 12 horas. Se añadió CH2CI2 seco (20 mL), y la mezcla se vertió lentamente en una solución de N-hidroxisuccinimida (4.14 g, 36 mmoles) en CH2CI2 seco (20 mL) a 0°C. La mezcla se agitó a 10°C por 10 horas. Se añadió H20 (20 mL), y la mezcla se agitó por 3 horas. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera (20 mL) y se secó sobre Na2SO4. El solvente se removió bajo vacío, resultando en 2,5-dioxopirrolidin-1 -il carbonato de ciclobutilo (1 g, 16% de rendimiento).
Al compuesto 44-1 a (0.1 g) en THF (5 mL), se añadió gota a gota una solución de aHC03 saturado (1.25 mL). Después, se añadió gota a gota 2,5-dioxopirrolidin-1-ilcarbonato de ciclobutilo (0.03 g) en THF (2 mL). La mezcla se agitó a 10°C por 1 hora y se añadió ácido cítrico acuoso a 10% (3 mL). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 5 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 mL) y se secaron sobre Na2SO4. El solvente se removió bajo vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (columna: Grace Vydac 250 x 20 mm x 5 µ?t?, fase móvil A: agua (conteniendo TFA a 0.075%, % en v/v), fase móvil B: acetonitrilo (conteniendo TFA a 0.025%, % en v/v), magnitud de flujo: 30 mL/min; gradiente: 35-50% de B (v/v) en A de 0 a 11 min). Las fracciones puras se combinaron y se basificaron con NaHC03 saturado hasta pH=8. Los volátiles se removieron en vacío. La mezcla resultante se extrajo con CH2CI2 (2 x 15 mL). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (10 mL) y se secaron sobre Na2S04. El solvente se removió en vacío, resultado en el compuesto 44-4 (0.023 g).
Método B; Rt: 5.16 min. m/z = 865.3 (M+H)+. Masa exacta: Se disolvieron el compuesto 45 (4 g, 15.9 mmoles) y el compuesto 38 (3.8 g, 17.7 mmoles) en THF seco (250 mL). La mezcla se calentó hasta 80°C y se agitó por 1 hora. Entonces, se añadió hidrato de cloruro de 4-(4,6-dimetoxi[1.3.5]triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM, 1.2 equiv.), y la mezcla se agitó a 80°C durante la noche. La mezcla se concentró, se añadió agua (60 mL) y entonces se extrajo con CH2CI2 (3 x 150 mL). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2S04, se filtró, y el solvente se removió bajo vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (columna: C18, eluyente: CH3CN/H2O de 47/53 a 77/23, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió y se basificó mediante NaHC03 acuoso saturado. La mezcla se concentró y se extrajo con CH2CI2 (2 x 200 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2S04, y el solvente se evaporó bajo vacío. El producto puro se secó bajo vacío (4.2 g, 59%).
Método F; Rt: 1.63 min. m/z = 470.0 (M+Na)+. Masa exacta: 447.1.
Una solución del compuesto 46 (4.2 g, 9.4 mmoles) y KOH ( 0%, ac, 3 equiv.) en CH3CH2OH (120 mL), se agitó a 20°C durante la noche. La mezcla se concentró y se añadió agua (40 mL). La mezcla se extrajo con CH2CI2 (3 x 120 mL), y las capas orgánicas combinadas se separaron. Las capas orgánicas se secaron sobre Na2SO4 y el solvente se removió bajo vacío. El compuesto 47 se secó en vacío (3.2 g, 79%).
Método C; Rt: 4.31 min. m/z = 430.0 (M+H)+. Masa exacta: 429.1.
SFC: columnas: Chiralpak OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%; 5% a 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 4.27 min.
SFC: columnas: Chiralpak AD-3 150 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: isopropanol (dietilamina a 0.05%; 5% a 40% de B en A, temperatura 40°C: Rt: 5.64 min. [a] 58920 = -96.8 (CH3OH, 2.5 mg/mL).
Se añadió en porciones Pd(PPh3)4 (0.2 equiv.) a una mezcla del compuesto 47 (2 g, 4.6 mmoles), compuesto 7 (2.4 g, 1.1 equiv.) y Na2C03 (2.0 equiv.) en H2O/tolueno/CH3CH2OH (1/2/1) (32 mL, 16 mL/lote) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó a 100°C bajo irradiación de microondas por 2 horas. La mezcla se concentró y se añadió agua (30 mL). La mezcla se extrajo con CH2CI2 (3 x 80 mL). Las capas orgánicas combinadas se separaron, se secaron sobre Na2S04, y el solvente se removió bajo vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (columna: C18, eluyente: CH3CN/H20 de 35/65 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %).
La fracción deseada se recogió y se basificó mediante NaHC03 acuoso saturado. La mezcla se concentró y se extrajo con CH2CI2 (3 x 100 mL). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04, y el solvente se removió bajo vacío. Se secó el compuesto 48 en vacío (1.9 g, 58%).
Método F; Rt: 1.55 min. m/z = 713.5 (M+H)+. Masa exacta: 712.3.
Se disolvió el compuesto 48 (1.8 g, 2.5 mmoles) en CH2CI2 (30 mL), y se enfrió hasta 0°C. Se añadió gota a gota HCI en dioxano (4 N, 10 mL) a 0-5°C, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. La mezcla se filtró entonces, y el sólido se lavó con éter ter-butilmetílico (20 mL). El residuo (1.8 g) se usó directamente en el siguiente paso.
Método F; Rt: 1.14 min. m/z = 513.1 (M+H)+. Masa exacta: 512.2.
A una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1.23 g, 7.0 mmoles) en CH3CN (50 mL), se añadieron EDC.HCI (7.0 mmoles) y HOBt (7.0 mmoles). La mezcla se agitó a 0°C por 1 hora, y entonces se añadió el compuesto 49 (1.7 g). La suspensión acuosa espesa se enfrió entonces hasta 0°C y se añadió DIPEA (1.5 g). La mezcla se agitó a 20°C por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (30 mL) y se añadió NaOH acuoso 0.5 N (15 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 x 15 mL). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2S04 y se concentró para dar el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (columna: C18, eluyente: CH3CN/H20 de 35/65 a 50/50, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió y se basificó mediante NaHCÜ3 acuoso saturado hasta pH~8. La mezcla se concentró y se extrajo con CH2CI2 (2 x 100 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, y el solvente se removió bajo vacío. El producto crudo se purificó entonces adicionalmente mediante cromatografía de fluidos supercriticos (columna: Chiralpak AS 250 x 25 mm I D., 20 µp?, fase móvil: A: C02, B: metanol (DEA a 0.5%); B en A de 5% a 40%, flujo: 50 mL/min). El solvente se removió bajo vacío, y se obtuvo el compuesto 50 después de líofilización (640 mg).
Método C; Rt: 3.84 min. m/z = 827.3 (M+H)+. Masa exacta: 826.4. [a] 58920 = -232.8 (CH2CI2, 2.5 mg/mL). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, isómero principal descrito) d ppm 11.79 - 12.44 (m, 2 H, dos singuletes principales a 11.86 y 12.33) 8.12 - 8.34 (m, 3 H) 7.83 - 8.05 (m, 6 H) 7.63 -7.69 (m, 1 H) 7.49 (d, 1 H; J= 8.0 Hz) 7.31 (d, 1 H, J= 8.5 Hz) 5.08 - 5.16 (m, 1 H) 4.94 - 5.05 (m, 1 H) 4.50 - 4.65 (m, 1 H) 4.21 - 4.39 (m, 1 H) 4.04 - 4.16 (m, 1 H) 3.93 - 4.04 (m, 1 H) 3.75 - 3.89 (m, 2 H) 3.55 (s, 6 H) 2.88 - 3.04 (m, 1 H) 2.60 - 2.77 (m, 1 H) 2.10 - 2.26 (m, 2 H) 1.83 - 2.10 (m, 4 H) 0.79 - 1.07 (m, 12 H).
SFC: columnas: Chiralpak AS-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 3 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 5.73 min.
SFC: columnas: Chiralpak OD-3 150 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 5.98 min.
SFC: columnas: Chiralpak OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 3.49 min.
Se añadió NaH (60%, 3.13 g, 78 mmoles, 2 equiv.) a DMSO (100 mL) seguido de la adición, gota a gota, de malonato de dietilo (12.54 g, 78 mmoles, 2 equiv.). La mezcla de reacción se calentó hasta 100°C por 40 minutos. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, se añadió 1 ,4-dibromo-2-nitrobenceno (10 g, 35.60 mmoles), se continuó la agitación por 30 minutos a temperatura ambiente, y entonces se calentó hasta 100°C por 1 hora. La mezcla de reacción se extinguió con NH4CI saturado acuoso (50 mL). Entonces, se añadió EtOAc (150 mL), y la capa orgánica se separó y se lavó con agua (50 mL) y salmuera (50 mL). La capa orgánica se secó, se filtró y entonces se concentró, resultando en el compuesto 51 (15 g), el cual se usó sin más purificación en el siguiente paso.
Se disolvió el compuesto crudo 51 (15 g) en DMSO (100 ml_). Se añadieron LiCI (3.0 g, 70 mmoles) y H2O (0.64 g, 35.6 mmoles), y la reacción se calentó hasta 100°C por 3 horas. La reacción se enfrió y se vertió en EtOAc (200 mL) y salmuera (200 mL). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, y el filtrado se concentró. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 50/1), resultando en el producto 52 (9.0 g).
Se añadió NaH (60%, 3.75 g, 93 mmoles) a una suspensión agitada del compuesto 52 (8.0 g, 27.8 mmoles) en DMF (90 mL) a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, se añadió Mel (22.2 g, 156 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se vertió en agua helada (200 mL) y EtOAc (200 mL). La capa orgánica se lavó con agua (3 x 200 mL), salmuera, se secó y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 200: 1), resultando en el compuesto 53 (7.0 g., 80% de rendimiento).
Al compuesto 53 (7.0 g, 22.1 mmoles), disuelto en MeOH (80 mL) y THF (40 mL), se añadió KOH (2 M, 80 mL, 160 mmoles, 2.7 equiv.). La mezcla de reacción se calentó hasta 80°C por 5 horas y entonces se concentró en vacío. El residuo se diluyó con agua (50 mL) y se lavó con éter ter-butilmetilico (50 mL). La capa acuosa se acidificó hasta pH 2 mediante la adición de HCI 6 M, y entonces se extrajo con EtOAq (3 x 50 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó y se concentró, resultando en el compuesto 54 (5.0 g, 79%).
Se disolvió el compuesto 54 (8.8 g, 30.5 mmoles) en CH2CI2 (200 mL) bajo N2. Después de la adición de trietilamina (4.01 g, 39.6 mmoles), la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 15 minutos. Se añadió difenilfosforil azida (DPPA) (1 1 g, 40.0 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 3 horas. Después de la remoción de los volátiles en vacío, el residuo obtenido se diluyó con tolueno (200 mL), y la mezcla se calentó a reflujo por 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió HCI (6 M, 100 mL). La solución resultante se calentó a reflujo por 3 horas. La mezcla cruda se concentró en vacío, se diluyó con agua helada y se basificó con NaOH acuoso (5 M), se extrajo con EtOAc (500 mL), se lavó con salmuera y se secó sobre Na2S04, y entonces se concentró en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía (éter de petróleo: acetato de etilo =10: 1 ), resultando en el compuesto 55 (7.1 g, 89%).
Se disolvió ácido (S)-1-(ter-butoxicarbonil)pirrolidin-2-carboxílico (6.42 g, 29.8 mmoles) en diclorometano (150 mL), y se añadieron HATU (20.6 g, 54.2 mmoles) y trietilamina (8.22 g, 81.4 mmoles). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente por 15 minutos, y entonces se añadió el compuesto 55 (7.1 g, 27.4 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 1 hora, y entonces se añadió agua (150 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó y después de filtración, se concentró en vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo = 20:1), resultando en el compuesto 56 (8.9 g, 72%).
Método A2; Rt: 1.30 min. m/z = 477.9 (M+Na)+. Masa exacta: 455.1.
Se disolvió el compuesto 56 (8.9 g, 19.5 mmoles) en MeOH (50 mL), se añadió Pt/C (1.0 g), y la mezcla se agitó bajo H20 (1.406 kg/cm2) durante la noche. La filtración y la remoción de los volátiles resultaron en el compuesto 57 (8.3 g, 100%).
Se disolvió el compuesto 57 (8.3 g, 19.5 mmoles) en HOAc (100 mL). La mezcla de reacción se calentó hasta 50°C por 1 hora, y entonces se concentró en vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo = 7:1 ), resultando en el compuesto 58 (1.5 g). [a] 58920 = -93.12 (CH3OH, 2.50 mg/mL).
Método G1 ; Rt: 1.19 min. m/z = 408.1 (M+H)+. Masa exacta: 407.1.
A una mezcla agitada del compuesto 58 (730 mg, 1.79 mmoles) en DMSO (10 mL) se añadieron el compuesto 7 (1.05 g, 2.15 mmoles) y una solución de Na2CO3 (2 M, 2.68 mL), y entonces se añadió Pd(dppf)CI2 (105 mg, 0.143 mmoles) bajo N2 a temperatura ambiente. Después de la adición, la mezcla se agitó a 60-70X por 1 hora. Después de que se concluyó la adición se añadió diclorometano (50 mL), y la mezcla se lavó con agua (3 x 100 mL) y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró en vacío. El residuo se purificó sobre gel de sílice en la cromatografía en capa delgada (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 1/100), resultando en el compuesto 59 (778 mg; 63%).
Método A2; Rt: 1.01 min. m/z = 691.5 (M+H)+. Masa exacta: 690.4.
A la solución del compuesto 59 (500 mg, 0.72 mmoles) se añadió metanol/HCI (10 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó por 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se lavó con éter ter-butilmetilico (20 mL) y se filtró, resultando en el compuesto 60 (355 mg, 99%).
Método A2; Rt: 0.81 min. m/z = 491.1 (M+H)+. Masa exacta: 490.3.
A una solución del compuesto 60 (355 mg, 0.72 mmoles) en CH3CN (30 mL), se añadieron HOBt (234 mg, 1.73 mmoles), EDC (333 mg, 1.73 mmoles), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (304 mg, 1.73 mmoles) y diisopropiletilamina (560 mg, 4.34 mmoles) a temperatura ambiente bajo N2. Después de la conversión hasta el compuesto 61 , la mezcla se diluyó con CH2CI2 (50 mL) y se lavó con NaOH acuoso (0.5 N, 50 mL) y salmuera. La capa orgánica se secó y después de filtración, se concentró en vacío. El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (Phenomenex Gemini C18 150 x 30 mm x 5 pm (eluyente: (NH3 a 0.05% en H20)/CH3CN 44/64 v/v)), resultando en el compuesto 61 (231 mg, 40% de rendimiento).
Método C; Rt: 3.53 min. m/z = 805.4 (M+H)+. Masa exacta: 804.4. [a] 58920 = -146.67 (CH3OH, 1.07 mg/mL).
SFC: columnas: Chiralcel OD-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm¡ flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 9.10 min.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 7.71 min. 1H RMN (600 MHz, DMF + TFA en gotitas) d ppm 0.87 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 0.95 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 1.00 (d, J=6.9 Hz, 3 H), 1.77 (s, 3 H), 1.85 (s, 3 H), 2.05 - 2.16 (m, 2 H), 2.17 - 2.38 (m, 6 H), 2.48 -2.59 (m, 2 H), 3.62 (s, 3 H), 3.62 (s, 3 H), 3.91 (dd, J=12.8, 8.6 Hz, 1 H), 3.96 -4.01 (m, 1 H), 4.01 - 4.07 (m, 2 H), 4.32 (dd, J=8.5, 6.7 Hz, 2 H), 4.85 (t, J=7.8 Hz, 1 H), 5.42 (dd, J=7.8, 6.5 Hz, 1 H), 7.07 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 7.17 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.70 (d, J=8.2 Hz, 1 H), 7.84 (dd, J=8.1 , 1.8 Hz, 1 H), 7.89 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 7.96 (dd, J=8.7, 1.8 Hz, 1 H), 8.08 (dd, J=8.7, 1 .8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 8.13 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 8.34 (s, 1 H), 8.58 (s, 1 H), 10.76 (br. s., 1 H), 12.83 (br. s., 1 H). 62 A oxetan-3-ona (5 g, 69 mmoles) en THF (50 ml_), se añadieron secuencialmente 2-metilpropan-2-sulfinamida (8.34 g, 69 mmoles) y Ti(OEt) (20 ml_). La reacción se calentó hasta 50°C por 5 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se extinguió con agua (200 mL). El precipitado se filtró y el filtrado se extrajo con CH2CI2 (2 x 50 mL). La capa orgánica combinada se separó y se lavó con agua (50 mL) y salmuera (50 mL). La capa orgánica se secó y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (CH2CI2), para dar el compuesto 62 (5.5 g, 46% de rendimiento).
Se disolvió 4-bromo-1-yodo-2-nitrobenceno (3 g, 9.18 mmoles) en THF anhidro (20 mL) bajo atmósfera de N2, y el matraz se enfrió hasta -78°C. La mezcla se agitó por 5 minutos y se añadió lentamente n-BuLi (4.4 mL, 2.5 moles/L). La mezcla de reacción se tornó de color oscuro, y se continuó la agitación a -78°C por 15 minutos. Entonces, se añadió lentamente el compuesto 62 (1.92 g, 1 1 mmoles) a la mezcla. La reacción se agitó por 30 minutos a -78°C, y entonces se calentó hasta temperatura ambiente. La mezcla se vertió en agua (50 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). Las fases orgánicas se separaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron hasta sequedad. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 3/1), resultando en el compuesto 63 (1.3 g, 38% de rendimiento).
Método A2; Rt: 1.04 min. m/z = 378.7 (M+H)+. Masa exacta: 378.0. 63 67 Se disolvió el compuesto 63 (1.3 g, 3.45 mmoles) en MeOH (10 mL), y se añadió lentamente HCI/dioxano (4N, 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos y la mezcla se concentró, resultando en el intermediario 64 (0.89 g).
Método A2; Rt: 0.60 min. m/z = 272.7 (M+H)+.
Al intermediario 64 (0.89 g) en un matraz de 50 mL, se añadieron HATU (1.49 g, 3.94 mmoles), trietilamina (0.66 g, 6.56 mmoles) y ácido (S)-1-(ter-butoxicarbonil)pirrolidin-2-carboxílico (0.84 g, 3.94 mmoles). El residuo se disolvió en CH2CI2 (10 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 40 minutos. La mezcla se extinguió con agua (20 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). Las fases se separaron, y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04 y entonces se concentró. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 2/1 ), resultando en el intermediario 65 (1.27 g). Se disolvió el intermediario 65 (1 g, 2.1 mmoles) en MeOH/agua (20 mL, 1 :1 ), se añadieron Fe en polvo (0.35 g, 6.3 mmoles) y NH4CI (0.55 g, 10.5 mmoles), y la mezcla se agitó a reflujo por 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y entonces se concentró hasta sequedad. El residuo obtenido se lavó con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). La capa orgánica se separó y se concentró en vacío, resultando en el intermediario 66 (0.77 g).
Método A2; Rt: 1.07 min. m/z = 464.0 (M+Na)+. Masa exacta: 441.1.
Se disolvió el intermediario 66 (0.77 g, 1.75 mmoles) en AcOH (20 mL) La solución resultante se agitó a 80°C por 30 minutos. La mezcla de reacción se concentró bajo vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo: acetato de etilo = 1 :1), resultando en el compuesto 67 (0.49 g, 66%).
Método B; Rt: 4.06 min. m/z = 422.0 (M+H)+. Masa exacta: 421.1.
A un matraz de 20 mL conteniendo el compuesto 67 (0.49 g, 1.16 mmoles), el compuesto 7 (0.68 g, 1.4 mmoles) y Pd(dppf)CI2 (45 mg, 0.058 mmoles), se añadieron THF (10 mL) y Na2C03 acuoso (2 mL, 2 N). La mezcla se baldeó tres veces con nitrógeno gaseoso. La mezcla de reacción se agitó a 80°C por 15 minutos. La mezcla se extinguió con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 5 mL). Las fases se separaron, la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04 y se concentró. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: CH2CI2/metanol = 10/1), resultando en el compuesto 68 (0.37 g, 45%).
Método A2; Rt: 0.92 min. m/z = 705.4 (M+H)+. Masa exacta: 704.4.
Se disolvió el compuesto 68 (0.2 g, 0.28 mmoles) en CH2CI2 (5 mL), y se añadió lentamente TFA (5 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos y la mezcla se concentró en vacío, resultando en el compuesto 69.
Método A2; Rt: 0.77 min. m/z = 505.1 (M+H)+. Masa exacta: 504.3.
A una solución del compuesto 69 (200 mg) en CH2CI2 (10 mL), se añadieron ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (140 mg, 0.80 mmoles), EDC (170 mg, 0.94 mmoles), HOBt (10 mg, 0.076 mmoles) y trietilamina (154 mg, 1.52 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se lavó con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 10 mL). La capa orgánica combinada se secó y se concentró, y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (YMC-pack ODS-AQ 150 x 30 mm x 5 pm).
Fase móvil: A: agua + TFA a 0.1 %, B: acetonitrilo. Eluir de 26% de B a 52% de B en A por un total de 15 min. Magnitud de flujo: 25 mL/min).
A las fracciones adecuadas, se añadió Na2C03 hasta que el valor del pH fuese de 9. La solución se concentró para remover el acetonitrilo, y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). La capa orgánica se separó y se concentró hasta sequedad, para dar el compuesto 70 (92 mg).
Método C; Rt: 3.37 min. m/z = 819.4 (M+H)+. Masa exacta: 818.4.
SFC: columnas: Chiralcel OD-3 150 mm x 4.6 mm; 3 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 5.66 min.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ?t?; flujo: 2.5 mUmin; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 3.44 min. 1H RMN (600 MHz, DMF-d7 + TFA en gotitas) d ppm 0.87 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 0.95 (d, J=6.9 Hz, 3 H), 1.00 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 2.07 - 2.16 (m, 2 H), 2.18 - 2.25 (m, 1 H), 2.26 - 2.37 (m, 4 H), 2.37 -2.43 (m, 1 H), 2.49 - 2.58 (m, 2 H), 3.62 (s, 3 H), 3.63 (s, 3 H), 3.91 (dd, J=14.2, 8.0 Hz, 1 H), 3.96 - 4.12 (m, 3 H), 4.32 (dd, J=8.4, 6.9 Hz, 1 H), 4.35 (dd, J=8.6, 6.7 Hz, 1 H), 4.91 (t, J=8.1 Hz, 1 H), 4.98 (d, J=7.2 Hz, 1 H), 5.00 (d, J=7.3 Hz, 1 H), 5.10 (d, J=7.2 Hz, 1 H), 5.24 (d, J=7.3 Hz, 1 H), 5.42 (dd, J=7.8, 6.5 Hz, 1 H), 7.08 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 7.19 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.94 (d, J=1.2 Hz, 1 H), 7.99 (dd, J=8.5, 1.8 Hz, 1 H), 8.00 (dd, J=8.1 , 1.8 Hz, 1 H), 8.09 (dd, J=8.7, 1.8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 8.12 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 8.15 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 8.23 (s, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 8.59 (s, 1 H), 1 1.64 (br. s., 1 H), 13.33 (br. s., 1 H).
Una mezcla del compuesto 71 (6.5 g, 19.8 mmoles) y Fe (4.98 g, 89.2 mmoles) en CH3COOH (30 mL) y CH3CH2OH (30 mL), se puso a reflujo por 1.5 horas. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, y después de la adición de NaHC03 acuoso saturado, se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 mL). La capa orgánica combinada se separó, se secó sobre Na2S04 y el solvente se removió en vacío, resultando en el compuesto 72 (5.9 g).
Método A2; Rt: 1.17 min. m/z = 299.6 (M+H)+. Masa exacta: 298.9.
La mezcla del compuesto 72 (2.0 g, 6.7 mmoles), éster ter-butílico de ácido 2-etinil-piperidin-1-carboxílico (2.8 g, 13.4 mmoles) y Pd(dppf)Cl2 (0.245 g, 0.335 mmoles) en dietilamina (30 mL), se agitó bajo monóxido de carbono a la presión de 2 MPa a 120°C. Después de 6 horas, la mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en CH2CI2 (50 mL) y se lavó con salmuera (2 x 20 mL). Entonces, la capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 30/1 a 1/30). La sección deseada se recogió y se concentró. El residuo se trituró mediante CH3OH y el sólido (impureza) se removió mediante filtración. El filtrado se concentró, y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H2O = 30/70 a 60/40, ácido trifluoroacético a 0.05%). Entonces, el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 7-8 con NaHCC>3, y se removió el acetonitrilo bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2S04. Después de filtración, el filtrado se evaporó y el residuo obtenido se secó bajo vacío, resultando en el compuesto 73 (0.21 g, 8% de rendimiento).
Método A2; Rt: 1.10 min. m/z = 408.9 (M+H)+. Masa exacta: 408.1.
Se añadió Pd(PPh3)4 (59 mg, 0.051 mmoles) a la mezcla del compuesto 73 (0.21 g, 0.51 mmoles), compuesto 7 (0.25 g, 0.51 mmoles), Na2C03/H20 (0.1 1 g, 1 mL), tolueno (2 mL) y CH3CH2OH (1 mL) en una porción bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 90°C. Entonces, la solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se concentró en vacío. El residuo obtenido se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con agua (3 x 5 mL). Las fracciones orgánicas se secaron sobre Na2S04 y se concentraron bajo presión reducida. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H2O = 30/70 a 60/40, ácido trifluoroacético a 0.05%). El pH de la solución obtenida se ajustó a aproximadamente 7-8 con NaHC03, y se removió el acetonitrilo bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron con Na2S04. Después de filtración, el filtrado se concentró en vacío, resultando en el compuesto 74 (0.1 1 g, 31 %).
Método A2; Rt: 1.02 min. m/z = 690.4 (M+H)+. Masa exacta: 689.4.
Se añadió HCI 4N/dioxano (0.16 mL, 0.64 mmoles) a la solución del compuesto 74 (0.11 g, 0.16 mmoles) en CH2CI2 (2 mL) a 0°C. La mezcla se agitó entonces a temperatura ambiente por 1 hora. El precipitado formado se filtró y la torta se lavó con éter ter-butilmetílico (2 x 10 mL), para dar el compuesto crudo 75 (78 mg).
Método A2; Rt: 0.76 min. m/z = 490.2 (M+H)+. Masa exacta: 489.3. 76 A una solución ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (84 mg, 0.48 mmoles) en acetonitrilo (3 mL), se añadieron EDC.HCI (122.7 mg, 0.64 mmoles) y HOBt (86.5 mg, 0.64 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 75 (78 mg). La suspensión acuosa espesa resultante se enfrió hasta 0°C y se añadió diisopropiletilamina (103.4 mg, 0.8 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó entonces con CH2CI2 (20 mL) y NaOH acuoso 0.5 N (5 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con NaCI acuoso a 13% (3 x 10 mL). El solvente se removió, y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H2Ó = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 6 con ácido cítrico (0.5 N, ac). Entonces, el acetonitrilo se removió bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4.
Después de filtración, el solvente se removió y el residuo se secó en vacío, resultando en el compuesto 76 (33 mg).
Método B; Rt: 5.11 min y 5.03 min. m/z = 804.2 (M+H)+. Masa exacta: 803.4.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 30% de B en A: Rt: 3.71 min y 4.87 min.
Se disolvió el compuesto 77 (50 g, 227 mmoles) en etanol (600 mL). Posteriormente, se añadió una suspensión de Na2S03 (71.6 g, 568 mmoles) en etanol (1000 mL) y agua (1250 mL). La suspensión se agitó a 70°C por 15 horas. Entonces, a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se acidificó con HCI (2N) a pH=2 y se concentró en vacío. El residuo restante se disolvió bajo reflujo en salmuera (1000 mL). Posteriormente, se añadió agua (100 mL), y la solución se enfrió en un baño de hielo. El precipitado se recogió mediante filtración, resultando en el compuesto 78 (57.3 g, 89%).
A una solución de cloruro de tionilo (50 ml_) se añadieron el compuesto 78 (30 g, 106 mmoles) y DMF (1 gota), y la mezcla de reacción se calentó hasta reflujo por 4 horas. Tras el enfriamiento, la mezcla de reacción se trató azeotrópicamente con tolueno por tres veces. El residuo se disolvió en una cantidad mínima de tolueno, y entonces la mezcla resultante se añadió a una mezcla de solución de hidróxido de amonio acuoso concentrado (1 ml_) y THF (10 ml_) a -10°C. Después de agitación por 2 horas, la reacción se extinguió añadiendo una solución de ácido clorhídrico acuoso 6 M hasta que el pH fuese de 4. La capa orgánica se separó y se secó entonces y se concentró en vacío. Se añadió éter de petróleo a la suspensión acuosa resultante y el producto se recogió mediante filtración en vacío, para dar el compuesto 79.
Una suspensión del compuesto 79 (21.2 g, 75 mmoles) en Hl a 57% (250 mL), se calentó a 90°C por 4 horas. Después de enfriamiento hasta temperatura ambiente, la mezcla púrpura oscura se diluyó con acetato de etilo (500 mL) y después se lavó sucesivamente mediante Na2S2O3 acuoso saturado, NaHC03 acuoso saturado y salmuera. La capa orgánica incolora se secó sobre MgS04 anhidro, se filtró y se concentró hasta sequedad. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H20 de 22/78 a 52/48 con NH3H2O a 0.01 % como regulador de pH), resultando en el compuesto 80 (18.6 g).
Método B; Rt: 3.36 min. m/z = 250.9 (M+H)+. Masa exacta: 249.9.
Se añadió trietilamina (40.5 mL, 296 mmoles) a una solución del compuesto 80 (18.6 g, 74 mmoles) en acetona (200 mL). Se añadió el compuesto 29 (12.8 g, 48 mmoles) a la mezcla de reacción bajo enfriamiento. Después de agitación por 5 horas, la mezcla de reacción se diluyó con agua y se acidificó mediante HCI 2 N hasta pH 4. El precipitado resultante se recogió mediante filtración y se transfirió entonces a otro matraz. Una solución de K2CO3 (15 g) en agua (100 mL) se añadió, y la mezcla de reacción se puso a reflujo por 2 horas hasta que la reacción llegara a ser homogénea. La mezcla de reacción se acidificó mediante HCI 2 N hasta pH=4. El precipitado se filtró y se lavó con agua. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H2O de 35/65 a 65/35 con CF3COOH a 0.75% como regulador de pH), resultando en el compuesto 81 (8.3 g, 45%).
Método A2; Rt: 1.05 min. m/z = 487.8 (M+Na)+. Masa exacta: 465.0.
Se añadió Pd(dppf)2CI2 (140 mg) a una mezcla del compuesto 81 (1 g, 2.1 mmoles) y el compuesto 7a (1.4 g, 2.5 mmoles), en una solución de Na2C03 acuoso (2 M, 4 mL) y DMSO (8 mL) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó a 80°C por 30 minutos. La mezcla se concentró y se añadió agua (30 mL). La mezcla resultante se extrajo con CH2CI2 (3 x 80 mL). Las capas orgánicas combinadas se separaron, se secaron sobre Na2SO4 y después de filtración, el solvente se removió en vacio. El sólido resultante (1.75 g) se usó directamente en el siguiente paso.
Método A2; Rt: 0.99 min. m/z = 804.4 (M+H)+. Masa exacta: 803.3.
Se disolvió el compuesto 82 (1.5 g, 1.86 mmoles) en una mezcla de AcOH (10 mL) y HBr acuoso (5 mL). La mezcla se agitó a 60°C por 4 horas. La mezcla se concentró, y el residuo obtenido se lavó mediante acetonitrilo. El sólido resultante se filtró, para dar el compuesto 83 como una sal de HBr (0.9 g).
Método A2; Rt: 0.94 min. m/z = 670.3 (M+H)+. Masa exacta: 669.3.
A una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (125 mg, 0.7 mmoles) en CH3CN (10 mL), se añadieron EDC.HCI (137 mg, 0.7 mmoles) y HOBt (97 mg, 0.7 mmoles). La mezcla se agitó a 0°C por 1 hora y se añadió el compuesto 83 (0.4 g). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C, se añadió diisopropiletilamina (0.3 g, 2.3 mmoles), y la mezcla se agitó adicionalmente a 20°C por 15 horas. Los volátiles se removieron. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (30 mL) y NaOH 0.5 N acuoso (15 mL), la capa orgánica se separó y se lavó entonces con salmuera (3 x 15 mL). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 y después de filtración, se concentró. El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H20 de 35/65 a 65/35 con CF3COOH a 0.75% como regulador de pH). La fracción deseada se recogió y se basificó mediante NaHCO3 acuoso saturado hasta pH~8. La mezcla se concentró y se extrajo entonces con CH2CI2 (3 x 100 mL).
La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y el solvente se removió en vacío, resultando en el compuesto 84 (86 mg).
Método B; Rt: 4.83 min. m/z = 827.6 (M+H)+. Masa exacta: 826.4.
SFC: columnas: Chiralcel AS-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.5 mUmin; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 2.73 y 3.55 min.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 2.58 y 3.05 min.
A una solución del compuesto 83 (1.2 g, 1.79 mmoles) en DMF (15 mL), se añadieron ácido (R)-2-(ter-butoxicarbonilamino)-2-fenilacético (0.54 g, 2.15 mmoles), anhídrido cíclico de ácido 1-propanfosfónico (3.8 mL, 6.62 mmoles) y diisopropiletilamina (0.92 g, 7.16 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (50 mL) y NaOH 0.5 N (ac, 15 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (3 x 20 mL). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 y después de filtración, se concentró en vacío. El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H2O de 32/68 a 62/38 con CF3COOH a 0.75% como regulador de pH). La fracción deseada se recogió y se basificó mediante NaHC03 acuoso saturado hasta pH~8. La mezcla se concentró, y la mezcla resultante se extrajo con CH2CI2 (3 x 100 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y el solvente se removió en vacío, resultando en el compuesto 85 (750 mg).
Se disolvió el compuesto 85 (600 mg, 0.66 mmoles) en HCI/dioxano (10 mL). La mezcla se agitó a 20°C por 1.5 horas y se concentró, resultando en el compuesto 86 (625 mg).
Método G1 ; Rt: 0.89 min. m/z = 803.1 (M+H)+. Masa exacta: 802.3.
Se añadió gota a gota diisopropiletilamina (369.7 mg, 2.87 mmoles) a una solución del compuesto 86 (600 mg, 0.72 mmoles) en CH2CI2 (15 ml_) a 0°C. Se añadió cloroformiato de metilo (81.2 mg, 0.86 mmoles). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora, y entonces se lavó mediante KOH acuoso (15 mL), NaHC03 (15 mL) y salmuera (15 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y después de filtración, el filtrado se concentró. El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (eluyente: CH3CN/H20 de 31/69 a 61/39 con CF3COOH a 0.75% como regulador de pH). La fracción deseada se recogió y se basificó mediante NaHC03 saturado (3 x 100 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y después de filtración, el solvente se removió en vacío. El producto se purificó adicionalmente mediante SFC (eluyente: C02 supercrítico/CH3CH2OH de 65/35 a 80 mL/min con DEA a 0.05% como regulador de pH, temperatura de la columna: 38°C, presión de la boquilla: 100 barias, temperatura de la boquilla: 60°C, temperatura del evaporador: 20°C, temperatura del condensador de ajuste: 25°C, longitud de onda: 220 nm). La capa orgánica se concentró hasta sequedad, resultando en el compuesto 87 (1 13 mg).
Método B; Rt: 4.91 min. m/z = 861.3 (M+H)+. Masa exacta: 860.3.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ?t?; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 5.39 min.
A una solución de fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF, 51.2 g, 197.4 mmoles, 1.5 equiv.) en DMF (100 ml_), se añadieron tamices moleculares de 4 A en polvo (30 g). La mezcla resultante se agitó por 30 minutos. La mezcla se filtró y el filtrado se transfirió a un matraz de reacción de 1000 mL. Se añadió una solución del compuesto 88 (30 g, 131.6 mmoles, 1.0 equiv.) en DMF (50 mL) a la solución anterior por medio de un embudo de adición durante 10 minutos, mientras se mantenía la temperatura interna abajo de -15°C. Después de agitación por 20 minutos, se añadió HCI 2 N (60 mL) durante 5 minutos. Después de envejecimiento por 1 hora, la mezcla se enfrió hasta 2.5°C y se filtró. La torta de filtración se lavó mediante DMF/agua (10% (v/v), 2 x 36 mL). El filtrado se combinó y se concentró en vacío. El residuo resultante se recristalizó a partir de 2-propanol (50 mL), para dar el compuesto 89 deseado (13 g). 89 90 La solución del compuesto 89 (7.5 g) en tolueno (100 mL) se enfrió hasta -10°C, y se añadió MeMgCl (3N en éter etílico, 25 mL, 74.6 mmoles) durante 2 minutos bajo N2, durante lo cual la temperatura se elevó hasta 0°C. La mezcla se dejó agitando a -10°C por 1 hora. Entonces, se añadió ácido clorhídrico 3 N (91 mL, 274 mmoles) durante 3 minutos por medio de un embudo de adición. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 18 horas. La reacción se extinguió con NaHC03 0.5 M (30 mL), y la mezcla obtenida se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos. La capa orgánica se lavó con agua, Na2S04 acuoso a 10% (2 x 5 mL) y agua (2 x 5 mL). La capa orgánica se concentró y después se co-concentró con tolueno (50 mL) y MeOH (50 mL). El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente del gradiente: éter de petróleo: acetato de etilo = 20:1 a 8: 1). La sección deseada se recogió y los volátiles se removieron en vacío, para dar el compuesto 90 (6.4 g).
Método A2; Rt: 0.88 min. m/z = 219.7 (M+H)+. Masa exacta: 219.0.
Se añadió 2,4-dimetoxi-bencilamina (4.3 g, 25.6 mmoles) al compuesto 90 (5.6 g, 25.6 mmoles, 1.0 equiv.) en DMF (12 ml_). La mezcla de reacción se agitó bajo irradiación de microondas por 0.5 horas a 120°C bajo nitrógeno. El solvente se removió bajo vacío. El residuo se solidificó mediante metanol (10 mL), resultando en el compuesto 91 (6.8 g, 73%).
Método A2; Rt: 1.33 min. m/z = 366.8 (M+H)+. Masa exacta. 366.0.
Se añadió ácido trifluoroacético (6.4 g, 55.9 mmoles) a una solución del compuesto 91 (6.8 g, 18.6 mmoles) en CH2CI2 (68 mL). La mezcla se agitó por 0.5 horas, después de lo cual el solvente se removió. Al residuo obtenido, se añadió éter ter-butilmetílico (50 mL), y la mezcla se filtró. El filtrado se recogió y se lavó con solución acuosa de Na2C03 saturado. La capa orgánica se secó sobre MgS04 se filtró y se concentró, resultando en el compuesto 92 (3.6 g).
Método A2; Rt: 1.00 min. m/z = 216.6 (M+H)+. Masa exacta: 216.0.
A la solución del compuesto 92 (5.74 g, 16.7 mmoles) y el compuesto 29 (3.6 g, 16.7 mmoles) en CH2CI2 (25 mL), se añadió gota a gota piridina (25 mL). La mezcla se agitó por 1 hora a temperatura ambiente.
Entonces, la solución se concentró en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 2.5/1 ), resultando en el compuesto 93 (3.8 g, 51 %).
Método A2; Rt: 1.22 min. m/z = 445.8 (M+H)+. Masa exacta: 445.1.
Se añadió Na2C03 (0.95 g, 9 mmoles) en H2O (15 mL) a una mezcla del compuesto 93 (2.0 g, 4.8 mmoles), compuesto 7 (2.2 g, 4.8 mmoles), etanol (15 ml_) y tolueno (30 ml_). Después, se añadió Pd(PPh3)4 (0.52 mg, 0.45 mmoles) en una porción bajo nitrógeno. La mezcla se agitó por 10 horas a 90°C. Entonces, la solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se concentró en vacío. El residuo se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con agua (3 x 10 mL). La solución se secó sobre Na2S0 y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente del gradiente: acetato de etilo/diclorometano = 1/5 a 3/1), resultando en el compuesto 94 (2.0 g, 61 %).
Método A2; Rt. 1.08 min. m/z = 728.3 (M+H)+. Masa exacta: 729.2.
Un tubo secado al horno con una barra de agitación, se cargó con el compuesto 94 (1.44 g, 1 .98 mmoles, 1.0 equiv.) y NaOH triturado (0.276 g, 6.9 mmoles, co-evaporado con tolueno seco). Se añadió dioxano seco (14 mL) por medio de una jeringa. La mezcla se agitó en un baño de aceite precalentado a 110°C por 1.5 horas. La mezcla se dejó enfriando hasta temperatura ambiente, después de lo cual se añadió etanol. La solución se concentró en vacío, y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H2O = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con NaHCO3 saturado. Entonces, el acetonitrilo se removió bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2S04. La solución se concentró y el residuo obtenido se secó en vacío, resultando en el compuesto 95 (0.22 g, 16%).
Método A2; Rt: 0.92 min. m/z = 71 1.2 (M+H)+. Masa exacta: 710.3.
Se disolvió el compuesto 95 (0.2 g, 0.28 mmoles) en CH2CI2 (5 mL), y se añadió gota a gota HCI concentrado (5 mL). La mezcla se agitó a 60°C por 3 horas. El solvente se evaporó en vacío. El residuo se lavó con una mezcla de éter ter-butilmetílico y metanol (1 : 1). El sólido se filtró y se secó bajo alto vacío. Se usó el compuesto 96 crudo (0.138 g) en el siguiente paso como tal.
Se añadieron EDC.HCI (0.1 16 g, 0.604 mmoles) y HOBT (0.081g, 0.604 mmoles), a la solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.106 g, 0.604 mmoles) en acetonitrilo (5 ml_). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 96 (0.138 g). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C y se añadió DIEA (0.13 g, 1.0 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y HCI 1 N (5 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con NaHC03 saturado y salmuera. El producto crudo obtenido después de la concentración de la capa orgánica se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). La fracción deseada se recogió, y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con NaHC03. Entonces, se removió el acetonitrilo bajo presión reducida, y la capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL). Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre a2S04. La solución obtenida se concentró y el residuo obtenido de esta manera se secó en vacío, resultando en el compuesto 97 (3.0 mg).
Método B; Rt: 4.38 min. m/z = 791.1 (M+H)+. Masa exacta: 790.4.
CLAR quiral: columnas: OJ-R 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 0.5 mL/min; fase móvil: A: H20 (TFA a 0.069%), B: acetonitrilo A/B = 80/20. Rt: 15.5 min.
CLAR quiral: columnas: AS-R 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 0.5 mL/min; fase móvil: A: H20 (TFA a 0.069%), B: acetonitrilo A/B = 80/20. Rt: 14.9 min.
Se disolvió el compuesto 4 (1 g, 2.3 mmoles) en CH2CI2 (20 mL). Se añadió NIS (0.44 g, 2.6 mmoles), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. La mezcla se lavó mediante Na2S03 a 10% y entonces mediante salmuera. El solvente se removió en vacío. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente: acetato de etilo/éter de petróleo, 1 :1 ). Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron en vacío. El sólido resultante se suspendió en acetato de etilo (3 mL) y se agitó por 30 minutos. Se recogió el compuesto 98 (polvo amarillo, 0.5 g, 39%) mediante filtración, y se secó en un horno de alto vacío. 98 Una mezcla del compuesto 98 (0.28 g, 0.506 mmoles), Zn(Me)2 (1M en heptano, 1 mL, 1.012 mmoles), Pd2(dba)3 (28 mg, 0.0304 mmoles) y BINAP (19 mg, 0.0304 mmoles) en THF seco (4.5 mL), se agitó bajo N2 durante la noche a 20°C. Se añadieron más Zn(Me)2 (1 M en heptano, 1 mL), Pd2(dba)3 (28 mg) y BINAP (20 mg). La mezcla se agitó por otras 3 horas a 20°C, seguido de la adición de más Zn(Me)2 (1 mL), Pd2(dba)3 (28 mg) y BINAP (20 mg). La mezcla se agitó bajo N2 durante la noche a 20°C. La mezcla se extinguió con NH4CI acuoso saturado, y la mezcla se extrajo con diclorometano (2 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2S04. El solvente se removió en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente del gradiente: éter de petróleo/acetato de etilo: de 100/0 a 1/3), resultando en el compuesto 99 (75 mg, 34%).
Método A2; Rt: 1.07 min. m/z = 441.0 (M+H)+. Masa exacta: 440.1.
Se disolvieron el compuesto 99 (75 mg, 0.170 mmoles) y el compuesto 7 (0.1 g, 0.204 mmoles) en THF (1.6 mL), y se añadió una solución de Na2CO3 (72 mg, 0.68 mmoles) en H20 (0.4 mL), seguida de Pd(PPh3)4 (40 mg, 0.034 mmoles) bajo N2. La mezcla se agitó bajo irradiación de microondas por 15 minutos a 70°C bajo N2. Los volátiles se removieron en vacío, y se añadió agua (5 mL). La capa acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 10 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2S04. El solvente se removió en vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de vaporización instantánea (eluyente del gradiente: primero: acetato de etilo/metanol: de 100/0 a 10/1 , entonces diclorometano/metanol = 12/1), resultando en el compuesto 100 (70 mg).
Método A2¡ Rt: 1.03 min. m/z = 724.2 (M+H)+. Masa exacta: 723.3.
Una mezcla del compuesto 100 (70 mg, 0.097 mmoles) en HCI concentrado (1 mL) y CHCI3 (1 mL), se agitó por 1 hora a 60°C. El solvente se removió en vacío. El residuo se co-evaporó con tolueno (2 x 10 mL), resultando en el compuesto 101 (70 mg).
Método A2; Rt: 0.80 min. m/z = 490.2 (M+H)+. Masa exacta: 489.2. 102a/102b Se enfriaron hasta 0°C el compuesto 101 (70 mg), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (41 mg, 0.23 mmoles), EDC.HCI (46 mg, 0.24 mmoles) y HOBt (7 mg, 0.048 mmoles) en CH2CI2 (2 ml_). Se añadió DIEA (0.17 ml_, 0.97 mmoles). La mezcla se agitó durante la noche a 15°C. El solvente se removió en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (C18, eluyente: CH3OH/H20 de 15/85 a 45/55 con TFA a 0.1 % como regulador de pH). Las fracciones puras se recogieron, y la mezcla se basificó con NaHC03 acuoso saturado a pH=8. Los volátiles se removieron en vacío. El precipitado se filtró y se secó en vacío, resultando en el compuesto 102a (14.6 mg) y el compuesto 102b (14.2 mg), por separado. 102a: método B; Rt: 4.63 min. m/z = 804.3 (M+H)+. Masa exacta: 803 4.
SFC: columnas: Chiralcel AS-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 2.84 min.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.5 mIJmin; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 2.43 min. 102b: método B; Rt: 4.79 min. m/z = 804.3 (M+H)+. Masa exacta: 803.4.
SFC: columnas: Chiralcel AS-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ?t?; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 8.75 min.
SFC: columnas: Chiralcel OD-H 150 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 9.63 min.
Se añadió NCS (0.31 g, 2.34 mmoles) a una solución del compuesto 4 (0.5 g, 1.17 mmoles) en CH2CI2. La mezcla se puso a reflujo por 4 horas, y después de enfriamiento hasta temperatura ambiente, se lavó con Na2SO3 a 10%, K2CO3 a 10% y salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, y la solución obtenida se concentró bajo presión reducida. El residuo obtenido se lavó con CH2CI2 y se filtró, resultando en el compuesto 103 (0.18 g)- Método A2; Rt: 1.09 min. m/z = 462.8 (M+H)+. Masa exacta: 462.0.
Se añadió Pd(PPh3)4 (0.1 g, 0.087 mmoles, 0.25 equiv.) a la mezcla del compuesto 103 (0.16 g, 0.346 mmoles) y el compuesto 7 (0.17 g, 0.346 mmoles) en THF (6 mL) y H20 bajo nitrógeno. La mezcla se agitó bajo irradiación de microondas por 15 minutos a 80°C. Entonces, la solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se concentró en vacío. El residuo obtenido se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con agua (3 x 10 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente del gradiente: acetato de etilo/diclorometano = 1/5 a 3/1 ). La fracción deseada se recogió, el solvente se evaporó y el residuo obtenido se secó en vacío, resultando en el compuesto 104 (0.22 g, 50%).
Método A2; Rt: 1.02 min. m/z = 744.2 (M+H)+. Masa exacta: 743.3.
Se disolvió el compuesto 104 (0.2 g, 0.156 mmoles) en CH2CI2 (3 y se añadió gota a gota HCI concentrado (3 mL). La mezcla se agitó a 60°C por 3 horas. El solvente se evaporó en vacío, y el residuo obtenido se lavó con una mezcla de éter ter-butilmetílico y metanol (1/1 ). El sólido se filtró y se secó bajo alto vacío, resultando en el compuesto 105 (90 mg). El producto crudo se usó como tal en el siguiente paso.
Se añadieron EDC.HCI (71.7 mg, 0.374 mmoles) y HOBT (50.5 mg, 0.374 mmoles), a una solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (65.5 mg, 0.374 mmoles) en acetonitrilo (5 mL). La mezcla se agitó a 20°C por 1 hora. Entonces, se añadió el compuesto 105 (90.8 mg). La suspensión acuosa espesa se enfrió hasta 0°C y se añadió DIEA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y solución acuosa de HCI 1 N (5 mL). La capa orgánica se separó y se lavó con solución acuosa saturada de aHC03 y salmuera. La capa orgánica se concentró y el producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). Las fracciones deseadas se recogieron y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con NaHC03 saturado. Entonces, se removió el acetonitrilo bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2S04. Después de filtración, el solvente se evaporó y el residuo obtenido se secó en vacio, resultando en el compuesto 106a (13.1 mg) y el compuesto 106b (6.7 mg). 106a: Método C; Rt: 3.58 min. m/z = 824.4 (M+H)+. Masa exacta: 823.4.
SFC: columnas: Chiralcel OD-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 5.38 min.
SFC: columnas: Chiralcel AS-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 9.27 min. 106b: Método C; Rt: 3.70 min. m/z = 824.4 (M+H)+. Masa exacta: 823.4.
SFC: columnas: Chiralcel OD-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 5 38 min.
SFC: columnas: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 8.66 min.
Se agitaron el compuesto 4 (1 g, 2.3 mmoles) y Selectfluor (0.81 g, 2.3 mmoles) en DMA (10 mL) a 150°C por 15 minutos. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se vertió NaHC03 saturado pre-enfriado (100 mL). El precipitado se filtró, se lavó con H20 y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (eluyente: CH2CI2/EtOAc, 1/1). Las fracciones recogidas se combinaron y se concentraron en vacío. El residuo obtenido se solidificó mediante THF (3 mL), resultando en el compuesto 107 (0.13 g).
Método A2; Rt: 1.55 min. m/z = 447.0 (M+H)+. Masa exacta: 446.1.
Se añadió Pd(PPh3)4 (0.098 g, 0.085 mmoles) a una mezcla del compuesto 107 (0.15 g, 0.34 mmoles), compuesto 7 (0.16 g, 0.34 mmoles) y Na2C03 (0.16 g, 1.53 mmoles) en THF (9 mL) y H20 (2.15 mL) en una porción bajo nitrógeno. La mezcla se agitó bajo irradiación de microondas por 15 minutos a 80°C. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, y el solvente se removió en vacío. La purificación mediante cromatografía en capa delgada preparativa (eluyente: CH2CI2/metanol, 1/10), resultó en el compuesto 108 (0.10 g).
Se disolvió el compuesto 108 (0.1 g, 0.12 mmoles) en CHCI3 (5 ml_) y HCI concentrado (2 ml_). La mezcla se agitó a 60°C en un tubo sellado por 1 hora. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y la capa acuosa se concentró en vacío. El sólido resultante se co-evaporó con tolueno (2 x 10 mL), resultando en el compuesto 109 (0.1 g).
Se añadieron EDC.HCI (70 mg, 0.36 mmoles) y HOBt (50 mg, 0.36 mmoles), a la solución de ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (63 mg, 0.36 mmoles) en acetonitrilo (5 mL). La mezcla se agitó a 10°C por 1 hora. Entonces, se añadieron a 0°C el compuesto 109 (100 mg) y DIEA (0.18 g, 1.4 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 2 horas y se concentró en vacío. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = 30/70 a 60/40, CF3COOH a 0.1 %). Las fracciones deseadas se recogieron, y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 8 con NaHC03. El acetonitrilo se removió bajo presión reducida. La capa acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), y las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2S04. Las soluciones se evaporaron, y los residuos se secaron en vacío. Los productos resultantes se solidificaron mediante éter ter-butilmetilico, resultando en el compuesto 1 10a (21 mg) y el compuesto 10b (17 mg). 1 10a: Método C; Rt: 3.49 min. m/z = 808.5 (M+H)+. Masa exacta: 807.4.
SFC: columna: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: ¡PrOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 9.14 min.
SFC: columna: Chiralcel OD-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo. 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 6.08 min. 1 10b: Método C; Rt: 3.60 min. m/z = 808.4 (M+H)+. Masa exacta: 807.4.
SFC: columna: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: ¡PrOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: Rt: 9.43 min.
SFC: columna: Chiralcel OD-H 150 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 40% de B en A: Rt: 4.62 min. 111 112 Se disolvieron el compuesto 111 (20 g, 119 mmoles) y K2C03 (23 g, 165 mmoles) en THF (60 mL) y H2O (60 mL) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 5 minutos, la mezcla se enfrió hasta 0°C, y se añadió lentamente Cbz-CI (22 g, 131 mmoles). La mezcla se agitó entonces a temperatura ambiente por 2 horas. La mezcla se acidificó hasta pH=3, y el producto se extrajo con diclorometano (2 x 40 mL). La capa orgánica combinada se concentró y el residuo obtenido se secó en vacío, resultando en el compuesto 1 12 (34 g, 96%). 113 114 Se añadió acetonitrilo (23.7 g, 580 mmoles) a 3-bromoanilina (1 13) (10 g, 58 mmoles) en tolueno (70 mL). La mezcla se enfrió hasta 0°C y se añadió gota a gota BCI3 (1 M en CH2CI2, 64 mL, 64 mmoles), mientras se mantenía la temperatura abajo de 10°C. Después, se añadió AICI3 (1 1.6 g, 87 mmoles) en pequeñas porciones a 0°C. La mezcla de reacción se calentó hasta 90°C por 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se extinguió con HCI acuoso (2N, 100 mL). La mezcla se calentó hasta 50°C por 1 hora, se enfrió hasta temperatura ambiente y se separó. La capa orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se recogió, se secó y se concentró, resultando en el compuesto 1 14 (4 g).
Método A2; Rt: 0.98 min. m/z = 215.7 (M+H)+. Masa exacta: 215.0.
Se disolvió el compuesto 112 (15 g, 49.5 mmoles) en SOCI2 (30 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se puso a reflujo por 50 minutos, y entonces se concentró en vacío. Al residuo obtenido, se añadieron secuencialmente a 0°C el compuesto 114 (12.7 g, 59.4 mmoles) y piridina (60 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos. El producto se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano (2 x 50 mL). La capa orgánica se separó y se concentró hasta sequedad. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo; 2/1), resultando en el compuesto 1 15 (14.5 g).
Método A2; Rt: 1.36 min. m/z = 521.0 (M+Na)+. Masa exacta: 498.1.
Se añadieron el compuesto 1 15 (2.0 g, 4 mmoles) y NaOH (0.48 g, 12 mmoles) a dioxano seco a temperatura ambiente. La mezcla se calentó hasta 100°C bajo irradiación de microondas por 20 minutos (8 reacciones paralelas se llevaron a cabo y se prepararon juntas). La mezcla se filtró, y el filtrado se concentró en vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (eluyente: éter de petróleo y acetato de etilo, 2:1 ), resultando en el compuesto 1 16 (1.5 g).
Método A2; Rt: 1.21 min. m/z = 483.1 (M+H)+. Masa exacta: 482.1.
Se disolvió el compuesto 1 16 (1.5 g, 3.1 mmoles) en HBr a 40%/ácido acético (15 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se calentó hasta 80°C por 40 minutos. La mezcla se concentró en vacío, resultando en el compuesto 117 (0.8 g).
Método A2; Rt: 0.83 min (isómero menor), 0.89 min (isómero mayor), m/z = 346.9 (M+H)+. Masa exacta: 346.1.
Se disolvieron el compuesto 1 17 (0.8 g), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.8 g, 4.6 mmoles), EDC.HCI (0.9 g, 4.6 mmoles), HOBt (0.06 g, 0.046 mmoles) y TEA (0.46 g, 4.6 mmoles) en CH2CI2 (20 mL) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 50 minutos. La mezcla se lavó con agua y se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). La capa orgánica combinada se secó y se concentró, resultando en un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo), resultando en el compuesto 118 (0.7 g).
Método A2; Rt: 1.04 min. m/z = 503.9 (M+H)+. Masa exacta: 503.1.
Se pusieron a reflujo el compuesto 118 (pureza de 70%, 0.50 g, 1.0 mmoles), el compuesto 7a (0.55 g, 1 .0 mmoles), Pd(PPh3)4 (0.35 g, 0.3 mmoles) y Na2C03 (0.52 g, 4.0 mmoles) en tolueno (5 mL), etanol (5 mL) y H2O (5 mL) bajo atmósfera de N2 durante la noche. La mezcla se enfrió hasta 20°C y se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). La capa orgánica se concentró en vacío. El residuo se lavó con éter ter-butilmetílico (10 mL) y CH3CN (5 mL). El polvo resultante se purificó mediante CLAR preparativa.
Columna: Grace Vydac C18, 200 x 25 mm x 5 pm, temperatura de la columna: 40°C, fase móvil A: agua (conteniendo TFA a 0.075%, v/v), fase móvil B: acetonitrilo, magnitud de flujo: 30 mL/min, gradiente: 30-45% de B, 0-15 min).
Las fracciones recogidas adecuadas se neutralizaron mediante NaHC03 saturado. El solvente orgánico se removió en vacío. El precipitado se filtró, se lavó con H20 y éter ter-butilmetílico, y se disolvió en metanol. La solución se concentró en vacío, resultando en el compuesto 119a (77.1 mg).
Una fracción de la mezcla se purificó adicionalmente mediante SFC (instrumento: Berger ultiGram™ SFC, Mettler Toledo Co, Ltd. Columna MG II: Chiralcel OJ, 5 pm, Daicel Chemical Industries, Ltd 50 x 30 mm I.D. Fase móvil: A: CO2 supercrítico, B: MeOH (conteniendo dietilamina a 0.2%), A:B = 70:30 a 60 mL/min. Temperatura de la columna: 38°C, longitud de onda: 220 nm. Presión de la boquilla: 100 barias. Temperatura de la boquilla: 60°C. Temperatura del evaporador: 20°C. Temperatura del condensador de ajuste. 25°C).
La fracción recogida se concentró en vacio. El residuo obtenido se purificó mediante TLC preparativa (eluyente: CH2CI2/metanol, 10:1 ). La fracción recogida se concentró bajo vacío y se suspendió en CH3CN (1 mL) y entonces MTBE (3 mL). El sólido resultante se disolvió en metanol (2 mL) y se filtró. El filtrado obtenido se concentró en vacío, resultando en el compuesto 119b (20 mg). 119a: Método C; Rt: 3.86 min. m/z = 844.5 (M+H)+. Masa exacta: 843.4.
SFC: columna: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 µ??; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 30% de B en A: Rt: 4.45 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6¡ isómero principal descrito) 5 ppm 0.82 - 0.99 (m, 12 H), 1.17 - 2.43 (m, 17 H), 3.54 (s, 3 H), 3.55 (s, 3 H) 3.78 -3.89 (m, 2 H), 3.95 (t, J=8.5 Hz, 1 H), 4.09 (t, J=8.3 Hz, 1 H), 4.41-4.53 (m, 1 H), 4.76 - 4.85 (m, 1 H), 5.08-5.16 (m, 1 H), 5.88 (s, 1 H), 7.30 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 7.53 (d, J=8.0 Hz, 1 H), 7.63 - 7.67 (m, 1 H), 7.72-7.80 (m, 1 H), 7.82-8.06 (m, 5 H), 8.11-8.18 (m, 1 H), 8.22-8.33 (m, 2 H), 1 1.77-11.92 (m, 2 H). 19b: Método B; Rt: 5.20 min. m/z = 844.3 (M+H)+. Masa exacta: 843.4.
SFC: columna: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2 B: MeOH (dietilamina a 0.05%); 30% de B en A: Rt: 3.22 min.
SFC: columna: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5% a 40% de B en A: Rt: 7.91 min.
El compuesto 120 (1.0 g, 4.14 mmoles), tamices moleculares de 4 A (1.0 g) y el compuesto 114 (0.9 g, 4.14 mmoles) en xileno (10 mL), se agitaron y se pusieron a reflujo por 1 hora. Se añadió cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM, 13 g, 4.6 mmoles), y la mezcla se agitó y se puso a reflujo por 12 horas. La mezcla se filtró, y el filtrado se concentró en vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/CH^Cb = 1/1 , entonces éter de petróleo/acetato de etilo = 1/1 v/v), resultando en el compuesto 121 (0.6 g).
El compuesto 121 (0.6 g, 1.37 mmoles) y NaOH (0.2 g, 5 mmoles) en dioxano (10 ml_), se agitaron por 1 hora a 100°C bajo N2. La mezcla se vertió en NH CI a 10% (50 mL), y el solvente orgánico se removió en vacío. La mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 x 50 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron y se concentraron en vacío. El residuo obtenido (0.6 g) se agitó por 2 horas a 20°C en HCI/dioxano (10 mL). La mezcla se concentró en vacío. La mezcla obtenida (0.6 g) y ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.36 g, 2.1 mmoles), EDC.HCI (0.4 g, 2.1 mmoles) y HOBt (0.09 g, 0.69 mmoles) en CH2CI2 (10 mL), se agitaron a 0°C. Se añadió DIEA (0.9 g, 6.9 mmoles). La mezcla se agitó por 12 horas a 20°C. La mezcla se lavó dos veces con H20, salmuera, se secó y se evaporó en vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo, entonces CH3OH). Las fracciones puras se recogieron y el solvente se concentró en vacío, resultando en el compuesto 122 (0.3 g).
El compuesto 122 (0.3 g, 0.6 mmoles), compuesto 7a (0.33 g, 0.6 mmoles), Pd(PPh3)4 (0.066 g, 0.18 mmoles), Na2C03 (0.252 g, 0.24 mmoles) en tolueno (6 mL), CH3CH2OH (6 mL) y H2O (6 mL), se pusieron a reflujo bajo N2 por 12 horas. El solvente se removió en vacío. La mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 ml_). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron y se evaporaron en vacío. El residuo se purificó mediante TLC de gel de sílice preparativa (eluyente: CH2CI2/CH3OH = 10/1 ). Las fracciones puras se recogieron y el solvente se concentró en vacío. El residuo se purificó adicionalmente mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (C18, eluyente: CH3CN/H20 de 15 /85 a 35/65 con CF3COOH a 0.1 % como regulador de pH). Las fracciones puras se recogieron, se neutralizaron mediante NaHC03 saturado, y el solvente orgánico se evaporó. La mezcla resultante se extrajo con CH2CI2. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera y se secó sobre a2S04. La capa orgánica se filtró y se concentró en vacío. El residuo se solidificó mediante éter ter-butilmetilico y entonces se co-evaporó con CH3CN, resultando en el compuesto 123 (136.6 mg).
Método C; Rt: 3.70 min. m/z = 816.3 (M+H)+. Masa exacta: 815.4.
SFC: columna: Chiralcel OJ-H 250 mm x 4.6 mm; 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02 B: EtOH (dietilamina a 0.05%); 5 a 40% de B en A: isómero menor (4.6%) Rt: 7.97 min; isómero mayor (95.4%), Rt: 8.37 min.
EJEMPLOS BIOLÓGICOS Actividad anti-HCV de los compuestos de fórmula (I) Prueba del replicón Los compuestos de fórmula (I) se examinaron por su actividad inhibidora en el replicón del HCV. Esta prueba celular se basa en una construcción de expresión bicistrónica, como es descrito por Lohmann et al. (1999) Science vol. 285 pp. 1 10-1 3, con modificaciones descritas por Krieger et al. (2001) Journal of Virology 75: 4614-4624, en una estrategia de examen de objetivos múltiples.
En esencia, el método fue el siguiente: La prueba usó la línea de células establemente transfectada Huh-7 luc/neo (referida en lo sucesivo como Huh-Luc). Esta línea de células alberga un ARN que codifica para una construcción de expresión bicistrónica que comprende las regiones NS3-NS5B de tipo silvestre del HCV tipo 1 b traducidas a partir de un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), precedida de una porción de reportero (FfL-luciferasa), y una porción de marcador seleccionable (neoR, neomicina fosfotransferasa). La construcción es flanqueada por las NTRs (regiones no traducidas) 5' y 3' del HCV tipo 1 b. El cultivo continuo de las células del replicón en presencia de G418 (neoR), depende de la replicación del ARN del HCV. Las células de replicón establemente transfectadas que expresan el ARN del HCV, que se replican en forma autónoma y a altos niveles, codificando entre otras cosas para luciferasa, se usaron para el examen de los compuestos antivirales.
Las células de replicón se sembraron en placas de 384 cavidades en presencia de los compuestos de prueba y control, los cuales se añadieron a varias concentraciones. Después de una incubación de tres días, se midió la replicación del HCV poniendo a prueba la actividad de luciferasa (usando substratos y reactivos de prueba de luciferasa estándar y un formador de imágenes de microplaca ViewLux™ ultraHTS de Perkin Elmer). Las células de replicón en los cultivos control tienen alta expresión de luciferasa en ausencia de cualquier inhibidor. La actividad inhibidora del compuesto sobre la actividad de luciferasa se monitoreó en las células Huh-Luc, permitiendo una curva de respuesta a la dosis para cada compuesto de prueba. Entonces, se calcularon los valores de la EC50, que representan la cantidad de compuesto requerida para disminuir el nivel de actividad de luciferasa detectada en 50%, o más específicamente, para reducir la capacidad del ARN del replicón del HCV genéticamente ligado para que se replique.
Resultados En donde un compuesto de fórmula (I) se puso a prueba más de una vez en la prueba del replicón, el promedio de todos los resultados de prueba se da en el cuadro 1 siguiente: CUADRO 1 CUADRO 1 (CONTINUACION) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) Descripción de la prueba para la medición del transporte transepitelial de los compuestos de prueba a través de las monocapas de células LLC-MDR1 La permeabilidad apical a basolateral (AtoB) de los compuestos de prueba en presencia del inhibidor de P-gp GF 120918 (Pap x 10"6 cm/seg), se midió después de un período de incubación de 120 minutos. La integridad de la monocapa de células se evaluó en cada cavidad de incubación a través de la inclusión del compuesto marcador fluorescente de baja permeabilidad, fluoresceína.
En detalle, se sembraron células LLC-MDR1 (células LLC-PK1 transducidas establemente con MDR1 en un sistema de trans-cavidades) en inserciones de cultivo de células de 24 cavidades (Millicell®-PCF, 0.4 pm, 13 mm 0, 0.7 cm2) a 400 000 células/cm2. El medio de cultivo de células consiste de medio 199 complementado con suero de bovino fetal (FBS) a 10% y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, y se reemplazó el día después de la siembra y el día antes del experimento. El experimento de transporte se llevó a cabo 5 días después de la siembra. En el día del experimento, soluciones de los compuestos de prueba se aplicaron al lado apical de las monocapas para evaluar el transporte en la dirección AtoB. El medio usado en la prueba fue (OPTI-MEM (1x) (GIBCO) con albúmina de suero de bovino a 1 % en p/v. Las inserciones se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada que contenía CO2 a 5%. Muestras de los compartimientos del aceptor y donador se recogieron después de un tiempo de incubación de 120 minutos, para evaluar la permeabilidad y para permitir la estimación de la recuperación de los compuestos de prueba durante el experimento, respectivamente. Se llevaron a cabo los experimentos del transporte por triplicado. Se midieron las concentraciones absolutas de los compuestos de prueba usando LC-MS/MS, y se cuantificaron por medio de una curva de calibración.

Claims (13)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un compuesto de fórmula (I): o un estereoisómero ndientemente pirrolidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo, piperidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-ilo u octahidro-1 H-indol-2-ilo, en donde cada uno de dichos heterociclos puede ser opcionalmente sustituido por uno o más átomos de halógeno; Z—C—Y es CR4=C-NH, NH-C=CH o NH-C=N; ^ es CH y X2 es CH; o Xi es CH y X2 es N; o Xi es N y X2 es CH; W es carbonilo, sulfonilo o CR5R6; R y R' se seleccionan independientemente de -CR1R2R3, arilo opcionalmente sustituido con 1 ó 2 sustituyentes seleccionados de halo y metilo, o heterocicloalquilo, en donde R1 se selecciona de alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido con metoxi, hidroxilo o dimetilamino; cicloalquilo de C3-6; tetrahidropiranilo; fenilo opcionalmente sustituido con 1 , 2 ó 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halo, alcoxi de Ci-4, trifluorometoxi o 2 sustituyentes en átomos de anillo adyacentes forman un grupo 1 ,3-dioxolano; bencilo opcionalmente sustituido con halo o metoxi; heteroarilo; y heteroarilmetilo; R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, amino, mono- o di-alquilamino de C1- , (cicloalquilo de C3-6)(alquilamino de C1-4), alquilcarbonilamino de Ci-4, fenilamino, alquiloxicarbonilamino de Ci-4, (alquiloxicarbonilo de Ci^)(alquilamino de C- ), alquilaminocarbonilamino de C-i-4, tetrahidro-2-oxo-1 (2H)-pirimidinilo, pirrolidin-1-ilo, piperidin-1-ilo, 3,3-difluoropiperidin-1-ilo, morfolin-1-ilo, 7-azabiciclo[2.2.1]hept-7-¡lo e imidazol- -ilo; y R3 es hidrógeno o alquilo de Ci-4, o CR2R3 forman juntos carbonilo; o CR-1 R3 forman un grupo ciclopropilo; R4 es hidrógeno, alquilo de d-4 o ciano; R5 y 6, cada uno independientemente, son alquilo de Ci-4; o CR5Re forman juntos cicloalquilo de C3-7, oxetano o tetrahidrofurano; o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. - El compuesto de fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada es independientemente pirrolidin-2-ilo, 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo o piperidin-2-ilo. 3. - El compuesto de fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada independientemente pirrolidin-2-ilo o 2-aza-biciclo[3.1.0]hexan-3-ilo, en donde cada uno de dichos heterociclos puede ser opcionalmente sustituido por uno o más átomos de halógeno. 4 - El compuesto de fórmula (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque Z~C~Y es CH=C-CH. 5 - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque R y R' son los mismos. 6 - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque R2 es hidroxilo, amino, mono- o di-alquilamino de Ci-4, alquilcarbonilamino de C-i-4, alquiloxicarbonilamino de Ci-4; en particular, R2 es alquilcarbonilamino de C-M o alquiloxicarbonilamino de C-M, y R3 es hidrógeno. 7 - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque R1 se selecciona de alquilo de C -4; alquilo de C2- sustituido con metoxi o hidroxilo; y fenilo opcionalmente sustituido con 1 ó 2 sustituyentes seleccionados independientemente de halo y metilo; en particular, R1 se selecciona de alquilo de 03.4 ramificado; alquilo de C2-3 sustituido con metoxi; y fenilo opcionalmente sustituido con 1 sustituyente seleccionado de halo y metilo. 8 - El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque es de fórmula la: 9. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 10. - El compuesto de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 8 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, para usarse en la prevención o el tratamiento de una infección por el HCV en un mamífero. 1 1. - Un producto que contiene (a) un compuesto de fórmula (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y (b) otro 10 inhibidor del HCV, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de infecciones por el HCV. 12. - El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 9, en la preparación de un medicamento c 15 para prevenir o tratar una infección por HCV en un mamífero. 13 - El uso de un producto que contiene (a) un compuesto de fórmula (I) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y (b) otro inhibidor del HCV, en la preparación de un medicamento para tratar infecciones por el HCV, en donde el medicamento está adaptado para ser 20 administrable de manera simultánea, por separado o secuencialmente.
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