MX2013000323A

MX2013000323A - Composiciones y metodos para suministro al sistema nervioso central de arilsulfatasa a.

Info

Publication number: MX2013000323A
Application number: MX2013000323A
Authority: MX
Inventors: Zahra Shahrokh; Pericles Calias; Jing Pan; Nazila Salamat-Miller; Katherine Taylor; Paul Campolieto; Lawrence Charnas; Teresa Leah Wright
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-25
Publication date: 2013-06-05
Also published as: NZ605873A; KR102537084B1; AU2021236557A1; KR20180059580A; JP6045493B2; HRP20191923T1; AU2017202289A1; KR102318997B1; KR20130135821A; EP2585104A4; KR102094094B1; RU2671503C2; WO2011163650A2; PL2585104T3; AU2019204051B2; LT2585104T; AU2019204051A1; KR20200035167A; AU2017202289B2; TW201206464A

Abstract

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a composiciones y métodos para suministro al CNS de enzimas lisosomales para tratamiento efectivo de enfermedades de almacenamiento lisosomal; en algunas modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal directa al CNS que comprende una proteína arilsulfatasa A (ASA), sal, y un tensoactivo de polisorbato para el tratamiento de Enfermedad de Leucodistrofía Metacromática.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA SUMINISTRO AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE ARILSULFATASA A REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a las Solicitudes de Patente Provisionales Estadounidenses números de serie 61/358,857 presentada en Junio 25 de 2010; 61/360,786, presentada en Julio 1 de 2010; 61/387,862, presentada en Septiembre 29 de 2010; 61/435,710, presentada en Enero 24 de 2011 ; 61/442,115, presentada en Febrero 11 de 2011 ; 61/476,210, presentada en Abril 15 de 201 1 ; y 61/495,268 presentada en Junio 9 de 2011 ; la totalidad de cada una de la cual se incorpora en la presente por referencia.

Esta solicitud se refiere a las solicitudes Estadounidenses tituladas "CNS Delivery of Therapeutic Agents", presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of Heparan N-Sulfatase," presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of lduronate-2-Sulfatase," presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of ß-Galactocerebrosidase," presentada en la misma fecha; "Treatment of Sanfilippo Syndrome Type B," presentada en la misma fecha; la totalidad de cada una de las cuales está de este modo incorporada en por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia de reemplazo de enzima (ERT) involucra la administración sistémica de proteínas naturales o recombinantemente derivadas y/o enzimas a un sujeto. Las terapias aprobadas son típicamente administradas a sujetos intravenosamente y son en general efectivas en el tratamiento de los síntomas somáticos de la deficiencia de enzima subyacente. Como un resultado de la distribución limitada de la proteína intravenosamente administrada y/o enzima en las células y tejidos del sistema nervioso central (CNS), el tratamiento de enfermedades que tienen una etiología del CNS ha sido especialmente estimulante debido a que las proteínas y/o enzimas intravenosamente administradas no cruzan adecuadamente la barrera hematoencefálica (BBB).

La barrera hematoencefálica (BBB) es un sistema estructural comprendido de células endoteliales que funciona para proteger el sistema nervioso central (CNS) de sustancias deletéreas en la corriente sanguínea, tales como bacterias, macromoléculas (por ejemplo, proteínas) y otras moléculas hidrofílicas, limitando la difusión de tales sustancias a través de la BBB y en el fluido cerebroespinal subyacente (CSF) y CNS.

Existen varias formas para eludir la BBB para mejorar el suministro cerebral de un agente terapéutico que incluye inyección intracraneal directa, permeabilización temporal de la BBB, y modificación del agente activo para alterar la distribución del tejido. La inyección directa de un agente terapéutico en el tejido cerebral deriva la complejidad de la vasculatura, pero sufre principalmente del riesgo de complicaciones (infección, daño al tejido, sensibilidad inmune) incurrida por inyecciones intra-craneales y pobre difusión del agente activo a partir del sitio de administración. A la fecha, la administración directa de proteínas en la sustancia cerebral no ha logrado efecto terapéutico significante debido a las barreras de difusión y al volumen limitado de terapéutico que puede ser administrado. La difusión asistida por convección se ha estudiado vía catéteres colocados en el parénquima cerebral usando infusiones a largo plazo, lentas (Bobo, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A 91 , 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), pero no terapias aprobadas usando actualmente este procedimiento para terapia a largo plazo. Además, la colocación de catéteres ¡ntracerebrales es muy invasiva y menos deseable como una alternativa clínica.

La inyección intratecal (IT), o la administración de proteínas al fluido cerebroespinal (CSF) también se ha intentado pero aún no ha sido proporcionado éxito terapéutico. Un desafío principal en este tratamiento ha sido la tendencia del agente activo para unir el revestimiento ependimal del ventrículo muy herméticamente el cual previene la subsecuente difusión. Actualmente, no existen productos aprobados para el tratamiento de enfermedades genéticas cerebrales por administración directamente al CSF.

En efecto, muchos creen que la barrera a la difusión en la superficie cerebral, así como también la carencia de métodos de suministro efectivos y convenientes, fueron también demasiado un obstáculo para lograr efecto terapéutico adecuado en el cerebro para cualquier enfermedad.

Muchos trastornos de almacenamiento lisosomal afectan el sistema nervioso y de este modo demuestran desafíos únicos en el tratamiento de estas enfermedades con terapias tradicionales. Existe a menudo una gran acumulación de glicosaminoglicanos (GAGs) en neuronas y meninges de individuos afectados, conduciendo a varias formas de síntomas del CNS. A la fecha, ningunos síntomas del CNS resultantes de un trastorno lisosomal han sido exitosamente tratados por cualesquiera medios disponibles.

De este modo, permanece una mayor necesidad para suministrar efectivamente agentes terapéuticos al cerebro. Más particularmente, existe una mayor necesidad para suministro más efectivo de agentes activos al sistema nervioso central para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosomal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un procedimiento efectivo y menos invasivo para suministro directo de agentes terapéuticos al sistema nervioso central (CNS). La presente invención está en parte, basada en el descubrimiento inesperado que una enzima de reemplazo (por ejemplo, arilsulfatasa A (ASA)) para una enfermedad de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, MDL) puede ser directamente introducida en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento a una alta concentración (por ejemplo, mayor de aproximadamente 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml o más) de manera que la enzima de difunde efectivamente y extensivamente a través de varias superficies y penetra varias regiones a través del cerebro, que incluyen regiones profundas del cerebro. Más sorprendentemente, los presentes inventores han demostrado que tal suministro de concentración de proteína alta se puede hacer usando formulaciones simples a base de amortiguador o salina y sin inducir efectos adversos sustanciales, tales como respuesta inmune severa, en el sujeto. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento altamente eficiente, clínicamente deseable y amigable al paciente para suministro directo al CNS para el tratamiento de varias enfermedades y trastornos que tienen componentes del CNS, en particular, enfermedades de almacenamiento lisosomal. La presente invención representa un avance significante en el campo de terapia de reemplazo de enzima y de objetivo del CSN.

Como se describe en detalle abajo, los presentes inventores han desarrollado exitosamente formulaciones estables para administración intratecal (IT) efectiva de una proteína de arilsulfatasa A (ASA). Se contempla, sin embargo, que varias formulaciones estables descritas en la presente son en general adecuadas para suministro al CNS de agentes terapéuticos, que incluyen varias otras enzimas lisosomales. Sin embargo, las formulaciones estables de conformidad con la presente invención pueden ser usadas para suministro al CNS vía varias técnicas y rutas que incluyen, pero no se limitan a, administraciones intraparenquimal, intracerebral, intraventricular cerebral (ICV), intratecal (por ejemplo, IT-Lumbar, IT-cisterna magna) y cualesquiera otras técnicas y rutas para inyección directamente o indirectamente al CNS y/o CSF.

También se contempla que varias formulaciones estables descritas en la presente son en general adecuadas para suministro al CNS de otros agentes terapéuticos, tales como proteínas terapéuticas que incluyen varias enzimas de reemplazo para enfermedades de almacenamiento lisosomal. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo puede ser una enzima sintética, recombinante, activada por gen o natural.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal directa al CNS que comprende una proteína arilsulfatasa A (ASA), sal, y un tensoactivo de polisorbato. En algunas modalidades, la proteína ASA está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 1-300 mg/ml (por ejemplo, 1-250 mg/ml, 1-200 mg/ml, 1-150 mg/ml, 1-100 mg/ml, 1-50 mg/ml). En algunas modalidades, la proteína ASA está presente en o hasta una concentración seleccionada de 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, ó 300 mg/ml.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la proteína ASA comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, la proteína ASA comprende una secuencia de aminoácido al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98% idéntica a la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, la formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente incluye una sal. En algunas modalidades, la sal es NaCI. En algunas modalidades, el NaCI está presente como una concentración que varía desde aproximadamente 0-300 mM (por ejemplo, 0-250 mM, 0-200 mM, 0-150 mM, 0-100 mM, 0-75 mM, 0-50 mM, ó 0-30 mM). En algunas modalidades, el NaCI está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 137-154 mM. En algunas modalidades, el NaCI está presente en una concentración de aproximadamente 154 mM.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde el tensoactivo de polisorbato se selecciona del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el tensoactivo de polisorbato es polisorbato 20. En algunas modalidades, el polisorbato 20 está presente a una concentración que varía aproximadamente 0-0.02%. En algunas modalidades, el polisorbato 20 está presente en una concentración de aproximadamente 0.005%.

En varias modalidades, la presente invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación además comprende un agente amortiguador. En algunas modalidades, el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste de fosfato, acetato, histidina, succinato, Tris, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el agente amortiguador es fosfato. En algunas modalidades, el fosfato está presente en una concentración no mayor de 50 mM (por ejemplo, no mayor de 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, ó 5 mM). En algunas modalidades, el fosfato está presente en una concentración no mayor de 20 mM. En varios aspectos la invención incluye una formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 3-8 (por ejemplo, aproximadamente 4-7.5, 5-8, 5-7.5, 5-6.5, 5-7.0, 5.5-8.0, 5.5-7.7, 5.5-6.5, 6-7.5, ó 6-7.0). En algunas modalidades, la formulación tiene un pH de aproximadamente 5.5-6.5 (por ejemplo, 5.5, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, ó 6.5). En algunas modalidades, la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0.

En varias modalidades, la presente invención incluye formulaciones estables de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación es una formulación líquida. En varias modalidades, la presente invención incluye formulación estable de cualquiera de las modalidades descritas en la presente, en donde la formulación es formulada como polvo seco liofilizado.

En algunas modalidades, la presente invención incluye una formulación estable para administración intratecal que comprende una proteína arilsulfatasa A (ASA) a una concentración que varía desde aproximadamente 1-300 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 154 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.005%, y un pH de aproximadamente 6.0. En algunas modalidades, la proteína ASA está a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml. En algunas modalidades, la proteína ASA está a una concentración de aproximadamente 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, ó 300 mg/ml.

En varios aspectos, la presente invención incluye un contenedor que comprende una forma de dosificación única de una formulación estable en varias modalidades descritas en la presente. En algunas modalidades, el contenedor se selecciona de una ampolleta, un vial, una botella, un cartucho, un reservorio, una lio-ject o jeringa pre-llenada. En algunas modalidades, el contenedor es una jeringa pre-llenada. En algunas modalidades, la jeringa pre-llenada se selecciona de jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona al horno, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona rociada, o jeringas de resina plástica sin silicona. En algunas modalidades, la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 50 ml_ (por ejemplo, menos de aproximadamente 45 mi, 40 mi, 35 mi, 30 mi, 25 mi, 20 mi, 15 mi, 10 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2.5 mi, 2.0 mi, 1.5 mi, 1.0 mi, ó 0.5 mi). En algunas modalidades, la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 3.0 ml_.

En varios aspectos, la presente invención incluye métodos para tratar la Enfermedad de Leucodistrofia Metacromática que incluye la etapa de administrar intratecalmente a un sujeto en necesidad de tratamiento una formulación de conformidad con cualquiera de las modalidades descritas en la presente.

En algunas modalidades, la presente invención incluye un método para tratar Enfermedad de Leucodistrofia Metacromática que incluye una etapa de administrar intratecalmente a un sujeto en necesidad de tratamiento una formulación que comprende una proteína anisulfatasa A (ASA) a una concentración que varía desde aproximadamente 1-300 mg/ml, NaCI a una concentración de aproximadamente 154 mM, polisorbato 20 a una concentración de aproximadamente 0.005%, y un pH de aproximadamente 6.

En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en ningunos efectos adversos sustanciales (por ejemplo, respuesta inmune severa) en el sujeto. En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en ninguna respuesta inmune mediada por células-T adaptivas sustanciales en el sujeto.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en suministro de la proteína arilsulfatasa A, a varios tejidos objetivo en el cerebro, la médula espinal, y/u órganos periféricos. En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en suministro de la proteína arilsulfatasa A, a tejidos cerebrales objetivos. En algunas modalidades, el tejido cerebral objetivo comprende materia blanca y/o neuronas en la materia gris. En algunas modalidades, la proteína A arilsulfatasa se suministra a neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales. En algunas modalidades, la proteína A arilsulfatasa se suministra además a las neuronas en la médula espinal.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación además resulta en suministro sistémico de la proteína ASA en tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, los tejidos periféricos objetivos son seleccionados de hígado, riñon, bazo y/o corazón.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en localización lisosomal en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en reducción de almacenamiento de sulfátida en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, el almacenamiento de sulfátida se reduce por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1-vez, 1.5-veces, ó 2-veces comparada con un control (por ejemplo, el almacenaje de GAG de pre-tratamiento en el sujeto). En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en vacuolización reducida en neuronas (por ejemplo, por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-vez, 1.5-veces, ó 2-veces comparada con un control). En algunas modalidades, las neuronas comprenden células Purkinje.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en actividad enzimática ASA incrementada en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la actividad enzimática ASA se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control (por ejemplo, la actividad enzimática endógena de pre-tratamiento en el sujeto). En algunas modalidades, la actividad enzimática ASA incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg ó 600 nmol/hr/mg.

En algunas modalidades, la actividad enzimática ASA se incrementa en la región lumbar. En algunas modalidades, la actividad enzimática ASA incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, ó 10,000 nmol/hr/mg.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en intensidad, severidad o frecuencia reducida, o comienzo retardado de al menos un síntoma o característica de MLD. En algunas modalidades, al menos un síntoma o característica de la MLD es deterioro cognitivo; lesiones de la materia blanca; espacios perivasculares dilatados en el parénquima cerebral, ganglios, cuerpos callosos, y/o tronco cerebral; atrofia; y/o ventriculomegalia.

En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada mes. En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada dos meses. En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en conjunto con administración intravenosa. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada semana. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada mes. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada dos meses. En ciertas modalidades, la administración intravenosa es más frecuente que la administración mensualmente, tal como dos veces semanalmente, semanalmente, cada tercer semana, o dos veces mensualmente.

En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e ¡ntratecales se realizan en el mismo día. En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e ¡ntratecales no se realizan dentro de una cierta cantidad de tiempo de entre sí, tal como no dentro de al menos 2 días, dentro de al menos 3 días, dentro de al menos 4 días, dentro de al menos 5 días, dentro de al menos 6 días, dentro de al menos 7 días, o dentro de al menos una semana. En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan en un esquema alterno, tal como administraciones alternadas semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente. En algunas modalidades, una administración intratecal reemplaza una administración intravenosa en un esquema de administración, tal como en un esquema de administración intravenosa semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente, cada tercera o cuarta o quinta administración en tal esquema puede ser reemplazada con una administración intratecal en lugar de una administración intravenosa.

En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan secuencialmente, tal como realizar administraciones intravenosas primero (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más) seguido por administraciones intratecales (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por más de dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más). En algunas modalidades, administraciones intratecales son realizadas primero (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses dosificando por dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más) seguido por administraciones intravenosas (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por más de dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más).

En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en ausencia de administración intravenosa.

En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en ausencia de terapia inmunosupresora concurrente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra datos de concentración de arilsulfatasa A (rhASA) ejemplares en suero después de la administración IV.

La Figura 2 ilustra datos de concentración de rhASA ejemplares en suero después de la administración IT-lumbar.

La Figura 3 ilustra concentración de rhASA ejemplar en CSF después de la administración IV.

La Figura 4 ilustra concentración de rhASA ejemplar en CSF después de la administración IT-lumbar.

La Figura 5 ilustra análisis ejemplar del efecto de amortiguador y pH en la estabilidad térmica de rhASA.

La Figura 6 ilustra análisis de SDS-PAGE (Coomassie) ejemplar de rhASA después de dos semanas a 40 ±2°C.

La Figura 7 ilustra análisis de SDS-PAGE (Coomassie) ejemplar de rhASA en formulaciones IT después de 3 meses a 5 y 25°C.

Las Figuras 8A-8B representan aparición de producto de fármaco y sustancia de fármaco de rhASA ejemplar después de 48 horas de agitación (Figura 8A) y sacudimiento (Figura 8B).

La Figura 9 representa aparición de producto de fármaco de rhASA ejemplar (a/ac P20) con (n=2) y sin espacio de cabeza (n=1) después de agitar por 48 horas.

La Figura 10 ilustra datos ejemplares que demuestran la capacidad amortiguadora de la sustancia de fármaco de rhASA comparada con amortiguador de control cuando se titula con ácido clorhídrico.

La Figura 11 ilustra datos ejemplares que demuestran la capacidad amortiguadora de la sustancia de fármaco de rhASA comparada con un control amortiguador cuando se titula con hidróxido de sodio 1 M.

La Figura 12 representa muestras rhASA ejemplares en salina, pH 6.0 variante por concentración.

La Figura 13 ilustra análisis de SEC-HPLC ejemplar de rhASA (pH 5.5 de fase móvil) en 154 mM de NaCI, pH 5.9.

La Figura 14 ilustra análisis de SEC-HPLC ejemplar de rhASA (pH 7.0 de fase móvil) en 154 mM de NaCI, pH 5.9.

La Figura 15 ilustra perfiles de exclusión de tamaño ejemplares de línea base y 11 muestras de estabilidad al mes para rhASA en 154 mM de NaCI, pH 5.

La Figura 16 representa foto-micrografías ejemplares de tejido cerebral, meninges, infiltrados (grupos de dosis leva y alta, ambos sexos) después del tratamiento.

La Figura 17 representa foto-micrografías ejemplares de tejido cerebral, meninges, infiltrados (grupos de dosis leva y alta, ambos sexos) después del tratamiento.

La Figura 18 representa foto-micrografías ejemplares de tejido cerebral, perivascular, infiltrados (machos de dosis leves; hembras de dosis altas) después del tratamiento.

La Figura 19 representa teñido ejemplar con azul Alcian de médula espinal de ratones MLD inmunotolerantes tratados con rhASA representa resultados ejemplares que ilustran reducción de sulfátida como se determina por teñido de azul Alcian de la médula espinal cervical en animales que reciben inyecciones intratecales de hASA recombinante en los días 1 , 8, 15 y 22 a dosis de 520 mg/kg de peso cerebral o control de vehículo. Como se demuestra, el tratamiento con hASA recombinante inyectado intratecalmente resulta en reducción de acumulación de sulfátida en la médula espinal cervical.

La Figura 20 ilustra análisis de morfometría ejemplar de secciones de la médula espinal teñidas con azul Alcian de ratones MLD inmunotolerantes tratados con rhASA, que incluyen resultados ejemplares que ilustran densidad óptica de azul Alcian en médula espinal total (Médula Espinal-T), materia gris total (GM-T), materia gris lumbar (GM-L), materia gris cervical (GM-C), materia blanca total (WM-T), materia blanca lumbar (WM-L), y materia blanca cervical (WM-C) como se determina por análisis de morfometría. Como se demuestra, se observó una reducción estadísticamente significante en teñido azul Alcian en animales tratados con rhASA comparado con un control de vehículo.

La Figura 21 representa reducción ejemplar de teñido laMP en materia blanca (fimbria) de ratones MLD inmunotolerantes tratados con rhASA que representa resultados ejemplares que ilustran niveles de LAMP-1 en fimbria como se determina por inmunohistoquímica. Amplificación = 20X. Como se demuestra, el tratamiento con rhASA inyectada intratecalmente resulta en reducción de laMP-1 en la materia blanca cerebral.

La Figura 22 ilustra análisis de morfometría ejemplar de teñido laMP de cerebro de ratones MLD inmunotolerantes tratados con rhASA que representa resultados ejemplares que ilustran intensidad de teñido de LAMP-1 en cuerpo calloso (CC), fimbria (F), materia blanca cerebelar (CB-WM) y tronco cerebral (BS) de animales tratados con 20 mg/kg de rhASA intravenosa, 300 mg/kg de peso corporal de rhASA intratecal, 520 mg/kg por peso corporal de rhASA intravenosa, o control de vehículo.

La Figura 23 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles dosificados con vehículo después de la dosificación IT EOW por 6-meses de necropsia principal.

La Figura 24 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de rhASA a 1.8mg/dosis por 6-meses - necropsia principal.

La Figura 25 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de rhASA a 6.0 mg/dosis por 6- meses - necropsia principal.

La Figura 26 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de rhASA a 18.6 mg/dosis por 6- meses - necropsia principal.

La Figura 27 ilustra concentración ejemplar of ASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW (PBS-control) por 6-meses - necropsia de recuperación.

La Figura 28 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de vehículo por 6-meses - necropsia de recuperación.

La Figura 29 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de rhASA a 1.8 mg/dosis por 6- meses - necropsia de recuperación La Figura 30 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de rhASA a 6.0 mg/dosis por 6 meses - necropsia de recuperación La Figura 31 ilustra concentración ejemplar de rhASA en cerebros perforados de cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW de rhASA a 18.6 mg/dosis por 6-meses -necropsia de recuperación La Figura 32 ilustra concentración ejemplar de rhASA en perforaciones seleccionadas de la superficie del cerebro para animales tratados con control de dispositivo, vehículo, 1.8 mg, 6.0 mg y 18.6 mg. (macho y hembra separados, los datos de control del dispositivo son de necropsia de recuperación, todos los otros datos de necropsia principal).

La Figura 33 ilustra concentración ejemplar de rhASA en perforaciones seleccionadas de área profunda blanca del cerebro para animales tratados con control de dispositivo, vehículo, 1.8 mg, 6.0 mg y 18.6 mg. (macho y hembra separados, los datos de control del dispositivo son de necropsia de recuperación, todos los otros datos de necropsia principal).

La Figura 34 ilustra concentración ejemplar de rhASA en perforaciones seleccionadas del área profunda gris del cerebro para animales tratados con control de dispositivo, vehículo, 1.8 mg, 6.0 mg y 18.6 mg. (macho y hembra separados, los datos de control del dispositivo son de necropsia de recuperación, todos los otros datos de necropsia principal).

La Figura 35 ilustra concentración ejemplar de rhASA en perforaciones seleccionadas de varias regiones en animales tratados con control del dispositivo, vehículo, 1.8.mg, 6.0 mg y 18.6 mg. (macho y hembra combinados, los datos de control del dispositivo son de necropsia de recuperación, todos los otros datos de necropsia principal).

La Figura 36 ilustra concentración ejemplar de rhASA en secciones de la médula espinal de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW por 6-meses - necroscopia de recuperación.

La Figura 37 ilustra concentración ejemplar de rhASA en hígado de monos cinomólogos juveniles después de la dosificación IT EOW por 6-meses - necroscopia de recuperación.

La Figura 38 ilustra ubicaciones anatómicas ejemplares de ciertas perforaciones del cerebro.

La Figura 39 ilustra ubicaciones anatómicas ejemplares de ciertas perforaciones del cerebro.

La Figura 40 ilustra ubicaciones anatómicas ejemplares de ciertas perforaciones del cerebro.

La Figura 41 ilustra ubicaciones anatómicas ejemplares de ciertas perforaciones del cerebro.

La Figura 42 ilustra ubicaciones anatómicas ejemplares de ciertas perforaciones del cerebro.

La Figura 43 ilustra ubicaciones anatómicas ejemplares de ciertas perforaciones del cerebro.

Las Figuras 44A—44G ilustra la concentración de arilsulfatasa A humana recombinante (rhASA) en perforaciones de tejido extraídas de los tejidos cerebrales de monos cinomólogos juveniles y adultos administrados ya sea con un vehículo, 1.8mg rhASA ó 18.6mg de rhASA. Cada una de las Figuras 44A-44G corresponde a una región del tejido cerebral representada en la Figura 39.

Las Figuras 45A-45B ilustran comparaciones ejemplares de las concentraciones de arilsulfatasa A humana recombinante (rhASA) detectada en la materia blanca profunda (Las Figuras 45A) o en la materia gris profunda (Las Figuras 45B) tejidos cerebrales de monos cinomólogos juveniles y adultos los cuales fueron intratecalmente (IT) o intracerebroventricularmente (ICV) administrados con rhASA.

La Figura 46A ilustra concentraciones de rhASA detectada en vahas perforaciones de tejido obtenidas de monos cinomólogos juveniles (<12 meses de edad) administrados-IT con una dosis de 18.6 o a 1.8mg de arilsulfatasa A humana recombinante (rhASA). Como se ilustra tanto en las Figuras 40A-B, la concentración de rhASA suministrada a los tejidos estuvieran dentro, o de otro modo excedidas de la concentración terapéutica objetivo de 2.5mg/mg de proteína. Las regiones anatómicas de tejido cerebral las cuales corresponden a cada uno de los números perforados representados en la Figura 46A y Figura 46B son la: materia blanca subcortical (1); materia blanca periventricular y materia blanca profunda (2); materia blanca subcortical (3); materia blanca subcortical (4); cápsula interna (5); núcleo caudado de la cápsula interna (6); materia blanca profunda (7); materia blanca subcortical y corteza (8); putamen (9); materia blanca subcortical temporal y corteza (10), materia gris profunda (11), materia gris profunda (12), periventricular frontal y subcortical (13); materia blanca subcortical, corteza superficial perifalxiana (14); cuerpos callosos y materia blanca subcortical pericallosa (15); materia blanca profunda subcortical (16); materia gris profunda (17); materia gris profunda (18); materia blanca periventricular (19); materia blanca profunda subcortical (20); hipocampo (21); cuerpos callosos (22); materia blanca profunda (23); materia blanca subcortical, lóbulo occipital (24); y materia blanca cerebelar (25).

La Figura 47A ilustra el área del tejido de la materia blanca profunda extraído de mono cinomólogo administrado-IT con 1.8mg de rhASA. La Figura 47B ilustra inmunoteñido del tejido de la materia blanca profunda y distribución revelada de rhASA en células relevantes. La Figura 47C ilustra que la rhASA administrada IT demuestra co-localización del organelo en los tejidos de la materia blanca profunda de los monos cinomólogos y en particular en las lisosomas. En la Figura 47C, se ilustra el inmunoteñido con ASA en el cuadro izquierdo superior.

La Figura 48 compares la distribución de arilsulfatasa A etiquetada con 124l (rhASA) usando barrido de PET 24 horas después de ya sea la administración IT o ICV de tal rhASA etiquetada a un mono cinomólogo.

La Figura 49 ilustra la distribución de ASA etiquetada con 124l inmediatamente después de la administración ICV a un mono cinomólogo, y compara la distribución de ASA etiquetada con 124l administrada IT dentro de 2-5 horas. Como se demuestra, la administración IT suministra la ASA etiquetada con 124l a los mismos compartimientos iniciales (espina próxima y cisterna) como aquella mostrada para la administración ICV.

La Figura 50 representa administración ICV e IT ejemplar en un modelo de ratón.

La Figura 51 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD).

La Figura 52 representa un sistema de acceso implantable intratecal de bajo perfil PORT-A-CATH® ejemplar.

La Figura 53 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD).

La Figura 54 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD), el cual permite la administración en casa para una terapia de reemplazo de la enzima del CNS (ERT).

La Figura 55 ilustra y es un diagrama ejemplar de un dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD) con un mecanismo de seguridad.

La Figura 56A representa ubicaciones ejemplares dentro de un cuerpo del paciente donde una IDDD puede ser colocada; la Figura 56B representa varios componentes de un dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD); y la Figura 56C representa una ubicación de inserción ejemplar dentro de un cuerpo del paciente para inyección IT-lumbar.

Definiciones Para que se comprenda más fácilmente la presente invención, a continuación se definen primero ciertos términos. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.

Aproximadamente o alrededor de: Como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un rango de valores que caen dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o que sea evidente a partir del contexto (excepto donde tal número excedería 100% de un posible valor).

Mejora: Como se utiliza aquí, el término "mejora" denota la prevención, reducción o paliación de un estado, o la mejora del estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere la recuperación completa o la prevención completa de una condición del padecimiento. En algunas modalidades, la mejora incluye incrementar los niveles de la proteína pertinente o su actividad que es deficiente en los tejidos de padecimiento pertinentes.

Biológicamente activo: Como se utiliza aquí, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera como biológicamente activo. En modalidades particulares, donde una proteína o un polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o el polipéptido típicamente se refiere como una porción "biológicamente activa".

Agente espesante: Como se utiliza aquí, el término "agente espesante" se refiere a un compuesto que agrega masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada (por ejemplo, facilita la producción de una torta liofilizada esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierto). Los agentes espesantes ejemplares incluyen manitol, glicina, cloruro dé sodio, almidón de hidroxietilo, lactosa, sacarosa, trehalosa, polietilenglicol y dextrano.

Receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR): Como se utiliza aquí, el término "receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR)" se refiere a un receptor celular que enlaza las etiquetas de manosa-6-fosfato (M6P) en los precursores de las hidrolasas ácidas en el aparato Golgi que se destinan para el transporte al lisosoma. Además de los manosa-6-fosfatos, el CI-MPR también enlaza otras proteínas incluyendo IGF-II. El CI-MPR también es conocido como "receptor 6P/IGF-II", "receptor CI-MPR/IGF-II", "receptor IGF-II" o "receptor IGF2". Estos términos y abreviaturas de los mismos se utilizan aquí de forma intercambiable.

Terapia inmunosupresora concurrente: Como se utiliza aquí, el término "terapia inmunosupresora concurrente" incluye cualquier terapia inmunosupresora utilizada como pre-tratamiento, pre-condicionamiento o en paralelo a un método de tratamiento.

Diluyente: Como se utiliza aquí, el término "diluyente" se refiere a una sustancia diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, segura y no tóxica para la administración a un humano), útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguada en pH (por ejemplo, solución salida amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Forma de dosificación: Como se utiliza aquí, los términos "forma de dosificación" y "forma de dosificación unitaria" se refieren a una unidad físicamente discreta de una proteína terapéutica para que el paciente sea tratado. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Se comprenderá, sin embargo, que la dosis total de la composición se decidirá por el médico tratante dentro del alcance del juicio médico razonable.

Terapia de reemplazo de enzima (ERT): Como se utiliza aquí, el término "terapia de reemplazo de enzima (ERT)" se refiere a cualquier estrategia terapéutica que corrija una deficiencia enzimática proporcionando la enzima faltante. En algunas modalidades, la enzima faltante se proporciona mediante administración intratecal. En algunas modalidades, la enzima faltante se proporciona mediante infusión en el torrente sanguíneo. Una vez administrada, la enzima es tomada por las células y transportada al lisosoma, donde la enzima actúa para eliminar el material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia enzimática. Típicamente, para que la terapia de reemplazo de enzima lisosómica sea efectiva, la enzima terapéutica se suministra a los lisosomas en las células apropiadas en los tejidos objetivo donde se manifiesta el defecto de almacenamiento.

Mejorar, incrementar, o reducir. Como se utiliza aquí, los términos "mejorar", "incrementar" o "reducir", o los equivalentes gramaticales, indican los valores que son relativos a una medición de línea de base, tal como una medición en el mismo individuo antes de la iniciación del tratamiento aquí descrito, o una medida en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento aquí descrito. Un "individuo de control" es un individuo afligido con la misma forma de padecimiento por almacenamiento lisosómico que el individuo que se trata, quien es de aproximadamente la misma edad que el individuo que se trata (para asegurar que las fases del padecimiento en el individuo tratado y el individuo(s) de control sean comparables).

Individuo, sujeto, paciente: Como se utiliza aquí, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se refieren a un humano o un sujeto mamífero no humano. El individuo (también referido como "paciente" o "sujeto") que se trata es un individuo (feto, bebé, niño, adolescente, o adulto) que sufre de un padecimiento.

Administración intratecal: Como se utiliza aquí, el término "administración intratecal" o "inyección intratecal" se refiere a una inyección en el cana! espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Se pueden utilizar diversas técnicas incluyendo, sin limitación, la inyección cerebroventricular lateral a través de un trepanado o punción cisternal o lumbar o similar. En algunas modalidades, la "administración intratecal" o el "suministro intratecal" de acuerdo con la presente invención se refiere al suministro o administración IT por medio de la región o área lumbar, es decir, el suministro o administración IT lumbar. Como se utiliz aquí, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral.

Enlazador. Como se utiliza aquí, el término "enlazador" se refiere a, en una proteína de fusión, una secuencia de aminoácidos aparte de aquella que aparece en una posición particular en la proteína natural y que generalmente se diseña para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una a-hélice, entre dos radicales de proteína. Un enlazador también se refiere como un espaciador.

Lioprotector. Como se utiliza aquí, el término "lioprotector" se refiere a una molécula que previene o reduce la inestabilidad química y/o física de una proteína u otra sustancia tras la liofilizacion y el subsiguiente almacenamiento. Los lioprotectores ejemplares incluyen azúcares tales como sacarosa o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio: un poliol tal como alcoholes de azúcar superior o trihídricos, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; Pluronics; y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un lioprotector es un azúcar no reductor, tal como trehalosa o sacarosa.

Enzima lisosómica: Como se utiliza aquí, el término "enzima lisosómica" se refiere a cualquier enzima que sea capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas mamíferos o que pueda rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico. Las enzimas lisosómicas adecuadas para la invención incluyen tanto las enzimas lisosómicas modificadas como las enzimas lisosómicas de tipo salvaje y se pueden producir utilizando métodos recombinantes y sintéticos o se pueden purificar a partir de fuentes naturales. Las enzimas lisosómicas ejemplares se listan en la Tabla 1.

Deficiencia de enzima lisosómica: Como se utiliza aquí, "deficiencia de enzima lisosómica" se refiere a un grupo de desórdenes genéticos que resultan de la deficiencia en al menos una de las enzimas que se requieren para desdoblar las macromoléculas (por ejemplo, sustratos de enzima) a péptidos, aminoácidos, monosacáridos, ácidos nucleicos y ácidos grasos en los lisosomas. Como consecuencia, los individuos que sufren de las deficiencias de enzima lisosómica tienen materiales acumulados en diversos tejidos (por ejemplo, CNS, hígado, bazo, intestino, paredes de los vasos sanguíneos y otros órganos).

Padecimiento por almacenamiento lisosómico: Como se utiliza aquí, el término "padecimiento por almacenamiento lisosómico" se refiere a cualquier padecimiento que resulta de la deficiencia de una o más enzimas lisosómicas necesarias para metabolizar las macromoléculas naturales. Estos padecimientos típicamente dan como resultado la acumulación de moléculas no degradadas en los lisosomas, dando como resultado números incrementados de gránulos de almacenamiento (también llamados vejigas de almacenamiento). Estos padecimientos y diversos ejemplos se describen en más detalle debajo.

Polipéptido: Como se utiliza aquí, un "polipéptido", generalmente hablando, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace de péptido. En algunas modalidades, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales se une a los otros por medio de al menos un enlace de péptido. Aquellos de habilidad ordinaria en el arte apreciarán que, opcionalmente, los polipéptidos algunas veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que no obstante son capaces de integrarse a una cadena de polipéptidos.

Enzima de reemplazo: Como se utiliza aquí, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos en parte la enzima deficiente o faltante en un padecimiento a ser tratado. En algunas modalidades, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos en parte la enzima lisosómica deficiente o faltante en un padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo es capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas mamíferos o puede rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico. Las enzimas de reemplazo adecuadas para la invención incluyen tanto las enzimas lisosómicas modificadas como las enzimas lisosómicas de tipo salvaje y se pueden producir utilizando métodos recombinantes y sintéticos o se pueden purificar a partir de fuentes naturales. Una enzima de reemplazo puede ser una enzima recombinante, sintética, activada por genes o natural.

Soluble: Como se utiliza aquí, el término, "soluble" se refiere a la habilidad de un agente terapéutico para formar una solución homogénea. En algunas modalidades, la solubilidad del agente terapéutico en la solución dentro de la cual se administra y mediante la cual se transporta al sitio de acción objetivo (por ejemplo, las células y los tejidos del cerebro) es suficiente para permitir el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico al sitio de acción que se tiene como objetivo. Varios factores pueden impactar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden impactar la solubilidad de la proteína incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes co-solubilizantes o sales (por ejemplo, sales de calcio). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan tal que las sales de calcio se excluyen de tales composiciones. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos de conformidad con la presente invención son solubles en su composición farmacéutica correspondiente. Se apreciará que, mientras que las soluciones isotónicas son generalmente preferidas para los fármacos parenteralmente administrados, el uso de soluciones isotónicas puede limitar la solubilidad adecuada para algunos agentes terapéuticos y, en particular algunas proteínas y/o enzimas. Las soluciones ligeramente hipertónicas (por ejemplo, cloruro de sodio hasta 175mM en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) y las soluciones que contienen azúcar (por ejemplo, sacarosa hasta 2% en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) han demostrado ser adecuadamente toleradas en los monos. Por ejemplo, la composición de la formulación de bolo CNS más comúnmente aprobada es la solución salina (NaCI 150mM en agua).

Estabilidad: Como se utiliza aquí, el término "estable" se refiere a la habilidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima recombinante) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayor parte de su actividad biológica pretendida y/o su integridad fisioquímica) sobre periodos de tiempo extendidos. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de tal agente terapéutico, se pueden evaluar durante periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, durante al menos 1 , 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En general, las composiciones farmacéuticas aquí descritas se han formulado tal que sean capaces de estabilizar, o alternativamente desacelerar o prevenir la degradación, de uno o más agentes terapéuticos formulados con las mismas (por ejemplo, las proteínas recombinantes). En el contexto de una formulación, una formulación estable es una en la cual el agente terapéutico ahí esencialmente retiene su integridad física y/o química y su actividad biológica tras el almacenamiento y durante los procesos (tales como el congelamiento/deshielo, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteína, se puede medir por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), la pérdida de actividad enzimática, la generación de fragmentos de péptido y el cambio de los perfiles de carga.

Sujeto: Como se utiliza aquí, el término "sujeto" significa cualquier mamífero, incluyendo humanos. En ciertas modalidades de la presente invención el sujeto es un adulto, un adolescente o un bebé. También se contempla por la presente invención la administración de las composiciones farmacéuticas y/o el desempeño de los métodos de tratamiento in-útero.

Homología sustancial: La frase "homología sustancial" se utiliza aquí para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, dos secuencias generalmente se consideran como "sustancialmente homólogas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos que heredan características funcionales y/o estructurales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, ciertos aminoácidos típicamente se clasifican como aminoácidos "hidrofóbicos" o "hidrofílicos", y/o como que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo se puede considerar una sustitución "homóloga".

Como es bien conocido en este arte, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST de hendidura, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology, Altschul, et al.., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs", Nucleic Acids Res, 25:3389-3402,1997; Baxevanis, et al.., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homólogas, los programas anteriormente mencionados típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, se considera que dos secuencias son sustancialmente homólogas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos sobre un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo pertinente es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70,75, 80, 85, 90, 95, 100,125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Identidad sustancial: La frase "identidad sustancial" se utiliza aquí para referirse a una comparación entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como es bien conocido en este arte, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST de hendidura, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et ai, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas anteriormente mencionados típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos sobre un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo pertinente es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

CSF sintético: Como se utiliza aquí, el término "CSF sintético" se refiere a una solución que tiene pH, composición de electrólitos, contenido de glucosa y osmolaridad consistente con el fluido cerebroespinal. El CSF sintético también se refiere como CSF artificial. En algunas modalidades, el CSF sintético es una solución B de Elliott.

Adecuado para suministro al CNS: Como se utiliza aquí, la frase "adecuado para suministro al CNS" o "adecuado para suministro intratecal" que se refiere a las composiciones farmacéuticas de la presente invención generalmente se refiere a la estabilidad, tolerabilidad, y propiedades de solubilidad de tales composiciones, así como la habilidad de tales composiciones para suministrar una cantidad efectiva del agente terapéutico contenido ahí al sitio de suministro que se tiene como objetivo (por ejemplo, el CSF o el cerebro).

Tejidos objetivo: Como se utiliza aquí, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que sea afectado por el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado o cualquier tejido en que la enzima lisosómica deficiente sea normalmente expresada. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales hay una cantidad detectable o anormalmente alta de sustrato de la enzima, por ejemplo almacenada en los lisosomas celulares del tejido, en pacientes que sufren de o susceptibles al padecimiento por almacenamiento lisosómico. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que despliegan una característica, síntoma o patología asociada al padecimiento. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales la enzima lisosómica deficiente es normalmente expresada en un nivel elevado. Como se utiliza aquí, un tejido objetivo puede ser un tejido objetivo del cerebro, un tejido objetivo de la médula espinal y/o un tejido objetivo periférico. Los tejidos objetivo ejemplares se describen en detalle debajo.

Radical terapéutico: Como se utiliza aquí, el término "radical terapéutico" se refiere a una porción de una molécula que suministra el efecto terapéutico de la molécula. En algunas modalidades, un radical terapéutico es un polipéptido que tiene actividad terapéutica.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) que confiere un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado, en una proporción de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por cualquier prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). Particularmente, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica o composición efectiva para tratar, mejorar, o prevenir una condición o padecimiento deseado, o para exhibir un efecto preventivo o terapéutico detectable, tal como mejorar los síntomas asociados con el padecimiento, prevenir o retardar el inicio del padecimiento, y/o también disminuir la severidad o frecuencia de los síntomas del padecimiento. Una cantidad terapéuticamente efectiva comúnmente se administra en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente efectiva (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad terapéuticamente efectiva específica (y/o la dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el desorden que se trata y la severidad del desorden; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y/o la tasa de excreción o metabolismo de la proteína de fusión específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las artes médicas.

Tolerable: Como se utiliza aquí, los términos "tolerable" y "tolerabilidad" se refieren a la habilidad de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para no producir como respuesta una reacción adversa en el sujeto a quién se administra tal composición, o alternativamente para no producir como respuesta una reacción adversa seria en el sujeto a quién se administra tal composición. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas por el sujeto a quién se administran tales composiciones.

Tratamiento: Como se utiliza aquí, el término "tratamiento" (también "tratar") se refiere a cualquier administración de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima lisosómica) que parcialmente o completamente alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la severidad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de un padecimiento, desorden, y/o condición particular (por ejemplo, el síndrome de Hunter, el síndrome de Sanfilippo tipo B). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no exhibe signos del padecimiento, desorden y/o condición pertinente y/o de un sujeto que exhibe sólo signos anticipados del padecimiento, desorden, y/o condición. Alternativamente o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos del padecimiento, desorden y/o condición pertinente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos mejorados para el suministro directa efectiva de un agente terapéutico al sistema nervioso central (CNS). Como se discute anteriormente, la presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que una enzima de reemplazo (por ejemplo, una proteína ASA) para un padecimiento por almacenamiento lisosómico (por ejemplo Enfermedad de Leucodistrofia etacromática) se puede introducir directamente en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento en una alta concentración sin inducir efectos adversos sustanciales en el sujeto. Más sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que la enzima de reemplazo se puede suministrar en una solución salina simple o formulación basada en amortiguador, sin utilizar CSF sintético. Aun más inesperadamente, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención no da como resultado efectos adversos sustanciales, tales como respuesta inmune severa, en el sujeto. Por consiguiente, en algunas modalidades, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en ausencia de la terapia inmunosupresors concurrente (por ejemplo, sin inducción de tolerancia inmune por el pre-tratamiento o el pre-condicionamiento).

En algunas modalidades, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención permite la difusión eficiente a través de diversos tejidos del cerebro dando como resultado un suministro efectivo de la enzima de reemplazo en diversos tejidos del cerebro objetivo en regiones del cerebro superficiales, poco profundas y/o profundas. En algunas modalidades, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención dio como resultado una cantidad suficiente de enzimas de reemplazo entrando a la circulación periférica. Como consecuencia, en algunos casos, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención dio como resultado el suministro de la enzima de reemplazo en tejidos periféricos, tales como el hígado, el corazón, el bazo y el riñon. Este descubrimiento es inesperado y puede ser particularmente útil para el tratamiento de padecimientos por almacenamiento lisosómico que tienen componentes tanto CNS como periféricos, que típicamente requeriría tanto la administración intravenosa como la administración intratecal regular. Se contempla que la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención puede permitir la dosificación y/o frecuencia reducida de inyección /V sin comprometer los efectos terapéuticos en los síntomas periféricos que se tratan.

La presente invención proporciona diversas características inesperadas y benéficas que permiten el suministro eficiente y conveniente de las enzimas de reemplazo a diversos tejidos objetivo del cerebro, dando como resultado el tratamiento efectivo de padecimientos por almacenamiento lisosómico que tienen indicaciones CNS.

Diversos aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se diga lo contrario.

Proteínas Terapéuticas En algunas modalidades, los métodos inventivos y composiciones proporcionadas por la presente invención son usados para suministrar una proteína arílsulfatasa A (ASA) al CNS para el tratamiento de Enfermedad de Leucodistrofia Metacromática. Una proteína ASA adecuada puede ser cualquier molécula o una porción de una molécula que puede sustituirse por una actividad de proteína arilsulfatasa A (ASA) que se origina naturalmente o rescatar uno o más fenotipos o síntomas asociados con deficiencia de ASA. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la invención es un polipéptido que tiene un N-término y un C-término y una secuencia de aminoácido sustancialmente similar o idéntica a la proteína ASA humana madura.

Típicamente, se produce ASA humana como una molécula precursora que es procesada a una forma madura. Este proceso ocurre en general removiendo el péptido señal de 18 aminoácidos. Típicamente, la forma precursora también es referida como una proteína precursora de longitud completa o ASA de longitud completa, la cual contiene 507 aminoácidos. Los 18 aminoácidos N-terminales son desdoblados, resultando en una forma madura que es de 489 aminoácidos de longitud. De este modo, se contempla que los 18 aminoácidos N-terminales son en general no requeridos para la actividad de proteína ASA. Las secuencias de aminoácido de la forma madura (SEQ ID NO:1) y precursora de longitud completa (SEQ ID NO:2) de una proteína ASA humana que se origina naturalmente o de tipo nativo típica, se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Arilsulfatasa A Humana De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es la proteína ASA humana madura (SEQ ID NO:1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada puede ser un homólogo o un análogo de la proteína ASA humana madura. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteína ASA humana madura puede ser una proteína ASA humana madura modificada que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido comparada con una proteína ASA que se origina naturalmente o de tipo nativa (por ejemplo, SEQ ID NO:1 ), mientras retiene la actividad de la proteína ASA sustancial. De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente homóloga a la proteína ASA humana madura (SEQ ID NO:1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la proteína ASA humana madura (SEQ ID NO:1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO:1. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de proteína ASA humana madura.

Alternativamente, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención es una proteína ASA de longitud completa. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada puede ser un homólogo o un análogo de la proteína ASA humana de longitud completa. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteína ASA humana de longitud completa puede ser una proteína ASA humana de longitud completa modificada que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido comparada con una proteína ASA de longitud completa que se origina naturalmente o de tipo nativa (por ejemplo, SEQ ID NO:2), mientras retiene la actividad sustancial de la proteína ASA. De este modo, En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la proteína ASA humana de longitud completa (SEQ ID NO:2). En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de proteína ASA humana de longitud completa. Como se usa en la presente, una proteína ASA de longitud completa típicamente contiene una secuencia de péptido señal.

En algunas modalidades, una proteína terapéutica incluye una porción de objetivo (por ejemplo, una secuencia de objetivo de lisosoma) y/o un péptido de penetración de membrana. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo y/o un péptido de penetración de membrana es una parte intrínseca de la porción terapéutica (por ejemplo, vía un enlace químico, vía una proteína de fusión). En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción de manosa-6-fosfato. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción IGF-I. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción IGF-II.

Otras enfermedades por almacenamiento lisosómico v enzimas de reemplazo Se contempla que los métodos inventivos y composiciones de acuerdo con la presente se pueden utilizar para tratar otras enfermedades por almacenamiento lisosómico, en particular aquellos padecimientos por almacenamiento lisosómico que tienen síntomas y/o etiología CNS, incluyendo, pero no limitado a, aspartilglucosaminuria, padecimiento por almacenamiento de éster de colesterol, padecimiento de Wolman, cistinosis, padecimiento de Danon, padecimiento de Fabry, lipogranulomatosis de Farber, padecimiento de Farber, fucosidosis, galactosialidosis tipos l/ll, padecimiento de Gaucher tipos l/ll/lll, leucodistrofia de células globoides, padecimiento de Krabbe, padecimiento por almacenamiento de glicógeno II, padecimiento de Pompe, gangliosidosis GM1 tipos l/ll/lll, gangliosidosis G 2 tipo I, padecimiento de Tay Sachs, gangliosidosis GM2 tipo II, padecimiento de Sandhoff, gangliosidosis GM2, a-manosidosis tipos l/ll, beta-manosidosis, leucodistrofia metacromática, mucolipidosis tipo I, sialidosis tipos l/ll, mucolipidosis tipos ll/lll, padecimiento de célula I, mucolipidosis tipo MIC polidistrofia pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis tipo I, mucopolisacaridosis tipo II, mucopolisacaridosis tipo IIIA, síndrome de Sanfilippo, mucopolisacaridosis tipo 11 IB, mucopolisacaridosis tipo MIC, mucopolisacaridosis tipo IIID, mucopolisacaridosis tipo IVA, síndrome de Morquio, mucopolisacaridosis tipo IVB, mucopolisacaridosis tipo VI, mucopolisacaridosis tipo VII, síndrome de Sly, mucopolisacaridosis tipo IX, deficiencia múltiple de sulfatasa, lipofuscinosis ceroide neuronal, padecimiento de Batten CLN1 , padecimiento de Batten CLN2, padecimiento de Niemann-Pick tipos A B, padecimiento de Niemann-Pick tipo C1 , padecimiento de Niemann-Pick tipo C2, picnodisostosis, padecimiento de Schindler tipos l/ll, padecimiento de Gaucher y padecimiento por almacenamiento de ácido siálico.

Una revisión detallada de la etiología genética, las manifestaciones clínicas, y la biología molecular de los padecimientos por almacenamiento lisosómico se detalla en Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995). De esta manera, las enzimas deficientes en los padecimientos anteriormente mencionados son conocidas por aquellos de habilidad en el arte, algunas de éstas se ejemplifican en la Tabla 2 debajo: TABLA 2 Los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para suministrar varias otras enzimas de reemplazo. Como se utiliza aquí, las enzimas de reemplazo adecuadas para la presente invención pueden incluir cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos parcialmente la actividad de la enzima lisosómica deficiente o faltante en un padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo es capaz de reducir la sustancia acumulada en los lisosomas o puede rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico.

En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada puede ser cualquier enzima lisosómica conocida por estar asociada con el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada es una enzima seleccionada a partir de las enzimas listadas en la Tabla 2 anterior.

En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la invención puede tener una secuencia de tipo salvaje o existente de manera natural. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la invención puede tener una secuencia modificada que tiene identidad u homología sustancial a la secuencia existente de manera natural o de tipo salvaje (por ejemplo, que tiene al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia a la secuencia de tipo salvaje o existente de manera natural).

Una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención se puede producir por cualquier medio disponible. Por ejemplo, las enzimas de reemplazo se pueden producir de manera recombinante utilizando un sistema de célula hospedera diseñado para expresar un ácido nucleico que codifica la enzima de reemplazo. Alternativamente o adicionalmente, las enzimas de reemplazo se pueden producir activando genes endógenos. Alternativamente o adicionalmente, las enzimas de reemplazo pueden ser parcialmente o completamente preparadas mediante síntesis química. Alternativamente o adicionalmente, las enzimas de reemplazo también se pueden purificar a partir de fuentes naturales.

Donde las enzimas se producen de manera recombinante, se puede utilizar cualquier sistema de expresión. Por dar algunos ejemplos, los sistemas de expresión conocidos incluyen, por ejemplo, huevo, baculovirus, planta, levadura, o células mamíferas.

En algunas modalidades, las enzimas adecuadas para la presente invención se producen en células mamíferas. Ejemplos no limitantes de células mamíferas que se pueden utilizar de conformidad con la presente invención incluyen línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1 , ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, Países Bajos); línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionario humano (293 or 293 cells subcloned for growth in suspensión culture, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59,1977); línea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT1080); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc, Nati. Acad. Sci. EEUU, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, ather, Biol. Reprod., 23:243-251 , 1980); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se utilizan para suministrar enzimas de reemplazo producidas a partir de células humanas. En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención se utilizan para suministrar enzimas de reemplazo producidas a partir de células CHO.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo suministradas utilizando un método de la invención contienen un radical que enlaza a un receptor en la superficie de las células del cerebro para facilitar la absorción celular y/o la focalización lisosómica. Por ejemplo, tal receptor puede ser el receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (Cl-MPR) que enlaza los residuos manosa-6-fosfato (M6P). Además, el CI-MPR también enlaza otras proteínas incluyendo IGF-II. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención contiene residuos M6P en la superficie de la proteína. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo adecuada para la presente invención puede contener oligosacáridos bis-fosforilados que tienen mayor afinidad de enlace para el Cl- PR. En algunas modalidades, una enzima adecuada contiene hasta aproximadamente un promedio de aproximadamente al menos 20% de oligosacáridos bis-fosforilados por la enzima. En otras modalidades, una enzima adecuada puede contener aproximadamente 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% de oligosacáridos bis-fosforilados por la enzima. Mientras que tales oligosacáridos bis-fosforilados pueden estar presentes de manera natural en la enzima, se debe notar que las enzimas se pueden modificar para poseer tales oligosacáridos. Por ejemplo, las enzimas de reemplazo adecuadas se pueden modificar por ciertas enzimas que son capaces de catalizar la transferencia de N-acetilglucosamina-L-fosfato a partir de UDP-GIcNAc a la posición 6' de mañosas a-1 ,2-enlazadas en enzimas lisosómicas. Los métodos y composiciones para producir y utilizar tales enzimas se describen por, por ejemplo, Canfield et al. en la Patente Norteamericana No. 6,537,785, y en la Patente Norteamericana No. 6,534,300, cada una incorporada aquí por referencia.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo para el uso en la presente invención se pueden conjugar o fusionar a un radical dirigido lisosómico que es capaz de enlazar a un receptor en la superficie de las células del cerebro. Un radical dirigido lisosómico adecuado puede ser IGF-I, IGF-II, RAP, p97, y vanantes, homólogos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, incluyendo aquellos péptidos que tienen una secuencia al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idéntica a una secuencia de péptidos IGF-I, IGF-II, RAP, p97 humanos maduros de tipo salvaje).

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo adecuadas para la presente invención no han sido modificadas para mejorar el suministro o el transporte de tales agentes a través del BBB y hacia el CNS.

Formulaciones Composiciones y soluciones farmacéuticas acuosas (es decir, formulaciones) que son tradicionalmente usadas para suministrar agentes terapéuticos al CNS de un sujeto incluyen solución salina isotónica no amortiguada y la solución B de Elliott, que es CSF artificial. Una comparación que bosqueja las composiciones del CSF con relación a la solución B de Elliott se incluye en la Tabla 3 debajo. Como se muestra en la Tabla 3, la concentración de la solución B de Elliott se asemeja mucho a aquella del CSF. La solución B de Elliott, sin embargo, contiene una concentración de amortiguador muy baja y consecuentemente no puede proporcionar la capacidad de amortiguamiento adecuada necesaria para estabilizar los agentes terapéuticos (por ejemplo, las proteínas), especialmente sobre periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, durante las condiciones de almacenamiento). Además, la solución B de Elliott contiene ciertas sales que pueden ser incompatibles con las formulaciones pretendidas para suministrar algunos agentes terapéuticos, y en particular enzimas o proteínas. Por ejemplo, las sales de calcio presentes en la solución B de Elliott son capaces de mediar la precipitación de proteínas y reducir por consiguiente la estabilidad de la formulación.

TABLA 3 Solución Na* K* Ca" Mg" HC03- c pH Fosforo Glucosa so mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mg/L mg/L CSF 1 17-137 2.3 2.2 2.2 22.9 113- 7.31 1.2-2.1 45-80 127 Solución B de 149 2.6 2.7 2.4 22.6 132 6.0-7.5 2.3 80 Elliott La presente invención proporciona formulaciones, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconstituida, para agentes terapéuticos que han sido formulados de manera que son capaces de estabilizar, o alternativamente mostrar o prevenir la degradación de uno o más agentes terapéuticos formulados con las mismas (por ejemplo, las proteínas recombinantes). En lagunas modalidades, las presentes formulaciones proporcionan formulación de liofilización para agentes terapéuticos. En algunas modalidades, las presentes formulaciones proporcionan formulaciones acuosas para agentes terapéuticos. En algunas modalidades, las formulaciones son formulaciones estables.

Formulaciones estables Como se usa en la presente, el término "estable" se refiere a la habilidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima recombinante) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayor parte de su actividad biológica pretendida y/o su integridad fisioquímica) sobre periodos de tiempo extendidos. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de tal agente terapéutico, se pueden evaluar durante periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, preferiblemente durante al menos 1 , 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En el contexto de una formulación, una formulación estable es una en la cual el agente terapéutico ahí esencialmente retiene su integridad física y/o química y su actividad biológica tras el almacenamiento y durante los procesos (tales como el congelamiento/deshielo, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteína, se puede medir por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), la pérdida de actividad enzimática, la generación de fragmentos de péptido y el cambio de los perfiles de carga.

La estabilidad del agente terapéutico es de particular importancia con respecto al mantenimiento del rango especificado de la concentración de agente terapéutico requerido para permitir al agente servir su función terapéutica propuesta. La estabilidad del agente terapéutico se puede evaluar adicionalmente con relación a la actividad biológica o integridad fisioquímica del agente terapéutico durante periodos de tiempo extendidos. Por ejemplo, la estabilidad en un punto de tiempo dado se puede comparar contra la estabilidad en un punto de tiempo anterior (por ejemplo, en el día 0 de formulación) o contra el agente terapéutico no formulado y los resultados de esta comparación se pueden expresar como un porcentaje. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención mantienen al menos 100%, al menos 99%, al menos 98%, al menos 97% al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% o al menos 50% de la actividad biológica o integridad fisioquímica del agente terapéutico sobre un periodo de tiempo extendido (por ejemplo, según se mide sobre al menos aproximadamente 6-12 meses, a temperatura ambiente o bajo condiciones de almacenamiento aceleradas).

Los agentes terapéuticos son preferiblemente solubles en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. El término "soluble" que se refiere a los agentes terapéuticos de la presente invención se refiere a la habilidad de tales agentes terapéuticos para formar una solución homogénea. Preferiblemente, la solubilidad del agente terapéutico en la solución dentro de la cual se administra y mediante la cual se transporta al sitio de acción objetivo (por ejemplo, las células y los tejidos del cerebro) es suficiente para permitir el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico al sitio de acción que se tiene como objetivo. Varios factores pueden impactar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden impactar la solubilidad de la proteína incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes co-solubilizantes o sales (por ejemplo, sales de calcio). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan tal que las sales de calcio se excluyen de tales composiciones.

Formulaciones adecuadas, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconstituida, pueden contener un agente terapéutico de interés a varias concentraciones. En algunas modalidades, las formulaciones pueden contener un agente terapéutico o proteína de interés a una concentración en el rango de aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 100 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 80 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 60 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 50 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 40 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 30 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 25 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 20 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 60 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 50 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 40 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 30 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 25 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 20 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 15 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 10 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta 10 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta 20 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta 40 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml hasta 100 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml hasta 50 mg/ml, o aproximadamente 5 mg/ml hasta 25 mg/ml). En algunas modalidades, las formulaciones de conformidad con la invención pueden contener un agente terapéutico a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, ó 100 mg/ml Las formulaciones de la presente invención son caracterizadas por su tolerabilidad ya sea como soluciones acuosas o como soluciones liofilizadas reconstituidas. Como se usa en la presente, los términos "tolerable" y "tolerabilidad" se refieren a la capacidad de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para no provocar una reacción adversa en el sujeto a quién tales composiciones son administradas, o alternativamente no provoca una reacción adversa seria en el sujeto a quién tal composición se administra. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas por el sujeto a quién se administra tales composiciones.

Muchos agentes terapéuticos, y en particular las proteínas y enzimas de la presente invención, requieren pH controlado y excipientes específicos para mantener su solubilidad y su estabilidad en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. La Tabla 4 de abajo identifica ciertos aspectos ejemplares de las formulaciones de proteína que se consideran importantes para mantener la solubilidad y la estabilidad de los agentes terapéuticos de proteína de la presente invención.

TABLA 4 Parámetro Rango Típico/Tipo Fundamento pH 5 a 7.5 Para estabilidad Algunas veces también para solubilidad Tipo de acetato, succinato, citrato, Para mantener pH óptimo Amortiguador histidina, fosfato o Tris También puede afectar la estabilidad Concentración Para mantener pH del También puede estabilizar o Amortiguador agregar fuerza iónica Tonificador NaCI, azúcares, manitol Para suministrar soluciones iso- osmóticas o isotónicas Surfactante Polisorbato 20, polisorbato 80 Para estabilizar contra interfaces y corte Otro Aminoácidos (por ejemplo, Para estabilidad o solubilidad arginina) en decenas a cientos de mejorada mM Amortiguadores El pH de la formulación es un factor adicional el cual es capaz de alterar la solubilidad de un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima o proteína) en una formulación acuosa o para una formulación de pre-liofilización. De conformidad con las formulaciones de la presente invención preferiblemente comprenden uno o más amortiguadores. En algunas modalidades, las formulaciones acuosas comprenden una cantidad de amortiguador suficiente para mantener el pH óptimo de la composición entre aproximadamente 4.0-8.0 (por ejemplo, aproximadamente 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.2, 6.4, 6.5, 6.6, 6.8, 7.0, 7.5, ó 8.0). En algunas modalidades, el pH de la formulación es entre aproximadamente 5.0-7.5, entre aproximadamente 5.5-7.0, entre aproximadamente 6.0-7.0, entre aproximadamente 5.5-6.0, entre aproximadamente 5.5-6.5, entre aproximadamente 5.0-6.0, entre aproximadamente 5.0-6.5 y entre aproximadamente 6.0-7.5. Amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo acetato, citrato, histidina, fosfato, succinato, tris(hidroximetil)aminometano ("Tris") y otros ácidos orgánicos. La concentración de amortiguador e intervalo de pH de las composiciones farmacéuticas de la presente invención son factores en el control o ajuste de la tolerabilidad de la formulación. En algunas modalidades, un agente amortiguador está presente a una concentración que varía entre aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 150 mM, o entre aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, un agente amortiguador adecuado está presente a una concentración de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM ó 150 mM.

Tonicidad En algunas modalidades, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconsitutida, contienen un agente de isotonicidad para mantener las formulaciones isotónicas. Típicamente, por "isotónica" se tiene por entendido que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica como la sangre humana. Las formulaciones isotónica generalmente tendrán una presión osmótica desde aproximadamente 240 mOsm/kg hasta aproximadamente 350 mOsm/kg. La isotonicidad se puede medir utilizando, por ejemplo, una presión de vapor u osmómetros de tipo punto de congelación. Los agentes de isotonicidad ejemplares incluyen, pero no se limitan a, glicina, sorbitol, manitol, cloruro de sodio y arginina. En algunas modalidades, los agentes isotónicos adecuados pueden estar presentes en las formulaciones acuosas y/o pre-liofilizadas a una concentración desde aproximadamente 0.01 - 5% (por ejemplo, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 ó 5.0%) en peso. En algunas modalidades, las formulaciones para liofilización contienen un agente de isotonicidad para mantener las formulaciones de pre-liofilización o las formulaciones isotónicas reconstituidas.

Aunque en general las soluciones isotónicas son preferidas para fármacos parenteralmente administrados, el uso de soluciones isotónicas puede cambiar la solubilidad para algunos agentes terapéuticos y en particular algunas proteínas y/o enzimas. Las soluciones ligeramente hipertónicas (por ejemplo, hasta 175 mM de cloruro de sodio en 5 mM de fosfato de sodio a pH 7.0) y soluciones que contienen azúcar (por ejemplo, hasta 2% de sacarosa en 5 mM de fosfato de sodio a pH 7.0) han sido demostradas por ser bien toleradas. La composición de formulación de bolo del CNS aprobada más común es salina (aproximadamente 150mM NaCI en agua).

Agentes Estabilizantes En algunas modalidades, las formulaciones pueden contener un agente de estabilización, o lioprotector, para proteger la proteína. Típicamente, un agente de estabilización adecuado es un azúcar, un azúlcar no reductor y/o un aminoácido. Azúcares ejemplares incluyen, pero no se limitan a dextrano, lactosa, manitol, mañosa, soritol, rafinosa, sacarosa y trehalosa. Aminoácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, arginina, glicina y metionina. Agentes estabilizantes adicionales pueden incluir cloruro de sodio, hidroxietilalmidón y polivinilpirrolidona. La cantidad de agente estabilizante en la formulación liofilizada es en general tal que la formulación será isotónica. Sin embargo, las formulaciones reconstituidas hipertónicas pueden también ser adecuadas. Además, la cantidad de agente de estabilización no debe ser muy baja tal que ocurra una cantidad inaceptable de degradación/agregación del agente terapéutico. Las concentraciones ejemplares del agente de estabilización en la formulación pueden variar dentro del rango desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 400 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 300 mM, y desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 100 mM), o alternativamente, desde 0.1% hasta 5% (por ejemplo, desde 1% hasta 10%, desde 5% hasta 15%, desde 5% hasta 10%) en peso. En algunas modalidades, la proporción de la cantidad de masa del agente de estabilización y el agente terapéutico es aproximadamente 1 :1. En otras modalidades, la proporción de la cantidad de masa del agente de estabilización y el agente terapéutico puede ser aproximadamente 0.1 :1 , 0.2:1 , 0.25:1, 0.4:1, 0.5:1 , 1 :1 , 2:1, 2.6:1, 3:1 , 4:1, 5:1 , 10:1 , ó 20:1. En algunas modalidades, el agente de estabilización adecuado para la liofilización es también un lioprotector.

En algunas modalidades, las formulaciones líquidas adecuadas para la presente invención contienen materiales amorfos. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas adecuadas para la presente invención contienen una cantidad sustancial de materiales amorfos (por ejemplo, formulaciones a base de sacarosa). En algunas modalidades, las formulaciones liquidas adecuadas para la presente invención contienen materiales parcialmente cristalinos/parcialmente amorfos.

Agentes espesantes En algunas modalidades, las formulaciones adecuadas para liofilización pueden además incluir uno o más agentes espesantes. Un "agente espesante" es un compuesto que agrega masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada. Por ejemplo, un agente espesante puede mejorar la apariencia de la torta liofilizada (por ejemplo, una torta liofilizada esencialmente uniforme). Los agentes espesantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, lactosa, manitol, glicina, sacarosa, trehalosa, almidón de hidroxietilo. Las concentraciones ejemplares de los agentes espesantes son desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10% (por ejemplo, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, y 10.0%).

Tensoactivos En algunas modalidades, es deseable agregar un surfactante a las formulaciones. Los surfactantes ejemplares incluyen surfactantes no iónicos tales como los Polisorbatos (por ejemplo, Polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); tritón; docecilsulfato de sodio (SDS); laurel sulfato de sodio; octil glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil-, o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio, o metil ofeil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilen glicol, polipropil glicol, y copolímeros de etilen y propilen glicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc). Típicamente, la cantidad de surfactante agregado es tal que reduce la agregación de la proteína y minimiza la formación de particulados o efervescencias. Por ejemplo, un surfactante puede estar presente en una formulación en una concentración desde aproximadamente 0.001 - 0.5% (por ejemplo, aproximadamente 0.005 -0.05%, ó 0.005 - 0.01%). Particularmente, un surfactante puede estar presente en una formulación en una concentración de aproximadamente 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, ó 0.5%, etcétera. Alternativamente, o además, el tensoactivo puede ser agregado a la formulación liofilizada, formulación pre-liofilizada y/o la formulación reconstituida.

Otros portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) pueden ser incluidos en la formulación (y/o la formulación liofilizada y/o la formulación reconstituida) siempre que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a, agentes amortiguadores adicionales; preservativos; co-solventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones que forman sales tales como sodio.

Formulaciones, en ya sea forma acuosa, pre-liofilizada, liofilizada o reconstituida de confomridad con la presente invención, se pueden evaluar con base en el análisis de la calidad del producto, el tiempo de reconstitución (si está liofilizado), la calidad de la reconstitución (si está liofilizado), el alto peso molecular, la humedad, y la temperatura de transición al vidrio. Típicamente, la calidad de la proteína y el análisis del producto incluyen un análisis de la tasa de degradación del producto utilizando métodos que incluyen, pero no se limitan a, HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC), HPLC de intercambio de cationes (CEX-HPLC), difracción de rayos X (XRD), calorimetría de exploración diferencial modulada (mDSC), HPLC en fase inversa (RP-HPLC), dispersión de la luz multi-ángulo (MALS), fluorescencia, absorción ultravioleta, nefelometría, electroforesis capilar (CE), SDS-PAGE, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la evaluación del producto de conformidad con la presente invención puede incluir una etapa de evaluar la apariencia (ya sea apariencia de líquido o de torta).

Generalmente, las formulaciones (liofilizadas o acuosas) se pueden almacenar durante periodos de tiempo extendidos a temperatura ambiente. La temperatura de almacenamiento típicamente puede variar dentro del rango desde 0°C hasta 45°C (por ejemplo, 4°C, 20°C, 25°C, 45°C, etc.). Las formulaciones se pueden almacenar durante un periodo de meses hasta un periodo de años. El tiempo de almacenamiento generalmente será 24 meses, 12 meses, 6 meses, 4.5 meses, 3 meses, 2 meses o 1 mes. Las formulaciones se pueden almacenar directamente en el recipiente utilizado para la administración, eliminando etapas de transferencia.

Las formulaciones se pueden almacenar directamente en el recipiente de liofilización (si están liofilizadas), el cual también puede funcionar como el recipiente de reconstitución, eliminando etapas de transferencia. Alternativamente, las formulaciones del producto liofilizadas se pueden medir en incrementos más pequeños para el almacenamiento. El almacenamiento generalmente debería evitar circunstancias que conduzcan a la degradación de las proteínas, incluyendo pero no limitado a la exposición a la luz del sol, radiación UV, otras formas de radiación electromagnética, calor o frío excesivo, rápido choque térmico, y choque mecánico.

Liofilización Los métodos inventivos de conformidad con la presente invención pueden ser utilizados para liofilizar algunos materiales, en particular, agentes terapéuticos. Típicamente, una formulación de pre-liofilización además contiene una elección apropiada de excipientes u otros componentes tales como estabilizadores, agentes amortiguadores, agentes espesantes, y tensoactivos para prevenir al compuesto de interés de la degradación (por ejemplo, agregación de proteína, desamidación y/u oxidación) durante el secado por congelación y almacenamiento. La formulación para liofilización puede incluir uno o más ingredientes adicionales que incluyen lioprotectores o agentes estabilizantes, amortiguadores, agentes espesantes, agentes de isotonicidad y tensoactivos.

Después que la sustancia de interés y algunos componentes adicionales son mezclados en conjunto, la formulación es liofilizada. La liofilización en general incluye tres etapas principales: congelación, secado primario y secado secundario. La congelación es necesario para convertir agua en hielo o algunos componentes de formulación amorfos a la forma cristalina. El secado primario es la etapa del proceso cuando el hielo se remueve del producto congelado por sublimación directa a baja presión y temperatura. El secado secundario es la etapa del proceso cuando el agua unida es removida de la matriz del producto utilizando la difusión de agua residual a la superficie de evaporación. La temperatura del producto durante el secado secundario es normalmente superior que durante el secado primario. Véase Tang X. et al. (2004) "Design of congelación-drying processes for pharmaceuticals: Practical advice," Pharm. Res., 21 :191-200; Nail S.L. et al. (2002).. "Fundamentáis of congelación-drying," in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail S.L. editor New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353; Wang et al. (2000) "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals," Int. J. Pharm., 203:1-60; Williams N.A. et al. (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review." J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59. En general, cualquier proceso de liofilización puede ser usado en conjunto con la presente invención.

En algunas modalidades, una etapa de hibridización puede ser introducida durante la congelación inicial del producto. La etapa de hibridización puede reducir el ciclo de tiempo total. Sin desear ser ligado por cualquier teoría, se contempla que la etapa de la etapa de hibridización puede ayudar a promover la cristalización del excipiente yformación de cristales de hielo más grandes debido a la re-cristalización de cristales pequeños formados durante el superenfriamiento, el cual, a su vez, mejora la reconstitución. Típicamente, una etapa de hibridación incluye un intervalo u oscilación en la temperatura durante la congelación. Por ejemplo, la temperatura de congelación puede ser -40 °C, y la etapa de hibridización incrementará la temperatura a, por ejemplo, -10 °C y mantendrá esta temperatura por un segundo periodo de tiempo. El tiempo de la etapa de hibridización puede variar desde 0.5 horas hasta 8 horas (por ejemplo, 0.5, 1.0 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 6, y 8 horas). La temperatura de hibridización puede estar entre la temperatura de congelación y 0 °C.

La liofilización puede ser realizada en un contenedor, tal como un tubo, una bolsa, una botella, una charola, un vial (por ejemplo, un vial de vidrio), jeringa o cualesquiera otros contenedores adecuados. Los contenedores pueden ser desechables. La liofilización también puede ser realizada a una gran escala o escala menor. En algunos casos, puede ser deseable liofilizar la formulación de proteína en el contenedor en el cual la reconstitución de la proteína se lleva a cabo para evitar una etapa de transferencia. El contenedor en este caso puede, por ejemplo, ser un vial de 3, 4, 5, 10, 20, 50 ó 100 ce.

Muchos secadores por congelación diferentes están disponibles para este propósito tales como un secador a escala piloto Hull (SP Industries, USA), secadores por congelación de laboratorio Génesis (SP Industries), o algunos secadores por congelación capaces de controlar los parámetros de procesos de liofilización dados. El secado por congelación se realiza congelando la formulación y subsecuentemente sublimando el hielo del contenido congelado a una temperatura adecuada para secado primario. La congelación inicial lleva la formulación a una temperatura por debajo de aproximadamente -20 °C (por ejemplo, -50 °C, -45 °C, -40 °C, -35 °C, -30 °C, -25 °C, etc.) en típicamente no más de aproximadamente 4 horas (por ejemplo, no más de aproximadamente 3 horas, no más de aproximadamente 2.5 horas, no más de aproximadamente 2 horas). Bajo esta condición, la temperatura del producto está típicamente por debajo del punto eutéctico o la temperatura de colapso de la formulación. Típicamente, la temperatura de anaquel para el secado primario variará desde aproximadamente -30 hasta 25 °C (siempre que el producto permanezca por debajo del punto de fusión durante el secado primario) a una presión adecuada, que varía típicamente desde aproximadamente 20 hasta 250 mTorr. La formulación, tamaño y tipo del sujetador de contenedor de la muestra (por ejemplo, vial de vidrio) y el volumen del líquido principalmente dictará el tiempo requerido para secado, el cual puede variar desde algunas horas hasta varios días. Se lleva a cabo una etapa de secado secundario a aproximadamente 0-60°C, dependiendo principalmente del tipo y tamaño del contenedor y el tipo de proteína terapéutica empleada. Nuevamente, el volumen del líquido principalmente dictará el tiempo requerido para secado, el cual puede variar desde algunas horas hasta varios días.

Como una proposición general, la liofilización resultará en una formulación liofilizada en la cual el contenido de humedad en la misma es menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1%, y menos de aproximadamente 0.5%.

Reconstitución Mientras las composiciones farmacéuticas de la presente invención están en general en una forma acuosa después de la administración a un sujeto, en algunas modalidades las composiciones farmacéuticas de la presente invención son liofilizadas. Tales composiciones deben ser reconstituidas agregando uno o más diluyentes a estas previo a la administración a un sujeto. En la etapa deseada, típicamente en un tiempo apropiado previo a la administración al paciente, la formulación liofilizada puede ser reconstituida con un diluyente de manera que la concentración de proteína en la formulación reconstituida es deseable.

Varios diluyentes pueden ser usados de conformidad con la presente invención. En algunas modalidades, un diluyente adecuado para reconstitución es agua. El agua usada como el diluyente puede ser tratada en una variedad de formas que incluyen osmosis reversa, destilación, desionización, filtraciones (por ejemplo, carbono activado, microfiltración, nanofiltración) y combinaciones de estos métodos de tratamiento. En general, el agua debe ser adecuada para inyección que incluye, pero no se limita a, agua estéril o agua bacteriostática para inyección.

Diluyentes ejemplares adicionales incluyen una solución amortiguada de pH (por ejemplo, salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Elliot, solución de Ringer, o solución de dextrosa. Los diluyentes adecuados pueden contener opcionalmente un preservativo. Los preservativos ejemplares incluyen alcohole aromáticos tales como alcohol bencílico o fenílico. La cantidad de preservativo empleado se determina valorando diferentes concentraciones de preservativos para compatibilidad con la proteína y pruebas de eficacia del preservativo. Por ejemplo, si el preservativo es un alcohol aromático (tal como alcohol bencílico), puede estar presente en una cantidad desde aproximadamente 0.1-2.0%, desde aproximadamente 0.5-1.5%, o aproximadamente 1.0-1.2%.

Diluyentes adecuados para la invención pueden incluir una variedad de aditivos, que incluyen, pero no se limitan a, agentes amortiguadores de pH (por ejemplo, Tris, histidina), sales (por ejemplo, cloruro de sodio) y otros aditivos (por ejemplo, sacarosa) que incluyen aquellos descritos anteriormente (por ejemplo, agentes estabilizantes, agentes de isotonicidad).

De conformidad con la presente invención, una sustancia liofilizada (por ejemplo, proteína) puede ser reconstituida a una concentración de al menos 25 mg/ml (por ejemplo, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/) y en cualquiera de los intervalos entre estos. En algunas modalidades, una sustancia liofilizada (por ejemplo, proteína) puede ser reconstituida a una concentración que varía desde aproximadamente 1 mg/ml hasta 100 mg/ml (por ejemplo, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta 50 mg/ml, desde 1 mg/ml hasta 100 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 30 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml, desde aproximadamente 25 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, desde aproximadamente 25 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 25 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml, desde aproximadamente 50 mg/ml hasta aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 50 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml). En algunas modalidades, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser superior que la concentración en la formulación de pre-liofilización. Las concentraciones altas de proteína en la formulación reconstituida son consideradas por ser particularmente útiles donde se pretende el suministro subcutáneo o intramuscular de la formulación reconstituida. En algunas modalidades, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser aproximadamente 2-50 veces (por ejemplo, aproximadamente 2-20, aproximadamente 2-10 veces, o aproximadamente 2-5 veces) de la formulación pre-liofilizada. En algunas modalidades, la concentración de proteína en la formulación reconstituida puede ser al menos aproximadamente 2 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 3, 4, 5, 10, 20, 40 veces) de la formulación pre-liofilizada.

La reconstitución de conformidad con la presente invención puede ser realizada en cualquier contenedor. Contenedores ejemplares adecuados para la invención incluyen, pero no se limitan a, tales como tubos, viales, jeringas (por ejemplo, cámara única o cámara dual), bolsas, botellas, y charolas. Contenedores adecuados pueden ser elaorados de cualquiera de los materiales tales como vidrio, plásticos, metal. Los contenedores pueden ser deschables o reutilizables. La reconstitución también puede ser realizada a una gran escala o escala pequeña.

En algunos casos, puede ser deseable liofilizar la formulación de proteína en el contenedor en el cual la reconstitución de la proteína se lleva a cabo para evitar una etapa de transferencia. El contenedor en este caso puede ser, por ejemplo, un vial de 3, 4, 5, 10, 20, 50 ó 100 ce. En algunas modalidades, un contenedor adecuado para liofilización y reconstitución es una jeringa de cámara dual (por ejemplo, jeringas Lyo-Ject,® (Verter)). Por ejemplo, una jeringa de cámara dual puede contener tanto la sustancia liofilizada como el diluyente, cada uno en una cámara separada, separado por un tapón (véase Ejemplo 5). Para reconstitución, se puede unir un émbolo al tapón en el lado diluyente y presionar para mover el diluyente en la cámara de producto de manera que el diluyente puede contactar la sustancia liofilizada y la reconstitución puede tomar lugar como se describe en la presente (véase Ejemplo 5).

Las composiciones farmacéuticas, formulaciones y métodos relacionados de la invención son útiles para suministrar una variedad de agentes terapéuticos al CNS de un sujeto (por ejemplo, ¡ntratecalmente, intraventricularmente o intracisternalmente) y para el tratamiento de enfermedades asociadas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para suministrar proteínas y enzimas (por ejemplo, terapia de reemplazo de enzima) a sujetos que sufren de trastornos de almacenamiento lisosomal. Las enferemdades de almacenamiento lisosomal representan un grupo de trastornos metabólicos hereditarios relativamente raros que resultan de defectos en la función lisosomal. Las enfermedades lisosomales son caracterizadas por la acumulación de macromoléculas no digeridas dentro de las lisosomas, lo cual resulta en un incremento en el tamaño y número de tales lisosomas y finalmente en la disfunción celular y anormalidades clínicas.

Suministro al CNS Se contempla que varias formulaciones estables descritas en la presente son en general adecuadas para suministro al CNS de agentes terapéuticos. Formulaciones estables de conformidad con la presente invención pueden ser usadas para suministro al CNS vía varias técnicas y rutas que incluyen, pero no se limitan a, administraciones intraparenquimal, intracerebral, intravetricular cerebral (ICV), intratecal (por ejemplo, IT-Lumbar, IT-cisterna magna) y cualesquiera otras técnicas y rutas para inyección directamente o indirectamente al CNS y/o CSF.

Suministro Intratecal En algunas modalidades, una enzima de reemplazo se suministra al CNS en una formulación descritas en la presente. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo se suministra al CNS administrando en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento. En algunas modalidades, se usa administración intratecal para suministrar una enzima de reemplazo deseada (por ejemplo, una proteína ASA) en el CSF. Como se usa en la presente, la administración intratecal (también referida como inyección intratecal) se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Pueden ser usadas varias técnicas que incluyen, sin limitación, inyección cerebroventricular lateral a través de un trepanado o punción cisternal o lumbar o similar. Los métodos ejemplares se describen en Lazorthes et al., Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 y Omaya et al., Cáncer Drug Delivery, 1 :169-179, el contenido de las cuales se incorpora aquí por referencia.

De conformidad con la presente invención, una enzima puede ser inyectada en cualquier región que rodea el canal espinal. En algunas modalidades, una enzima se inyecta en el área lumbar o la cisterna magna o de manera intraventricular en un espacio del ventrículo cerebral. Como se utiliza aquí, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral. Típicamente, la inyección intratecal por medio de la región lumbar o el área lumbar también se refiere como "suministro IT lumbar" o "administración IT lumbar". El término "cisterna magna" se refiere al espacio alrededor y debajo el cerebelo vía la abertura entre el cráneo y la parte superior de la columna vertebral. Típicamente, la inyección intratecal vía la cisterna magna también se refiere como "suministro por cisterna magna". El término "ventrículo cerebral" se refiere a las cavidades en el cerebro que son continuas con el canal central de la médula espinal. Típicamente, las inyecciones vía las cavidades del ventrículo cerebral se refieren como suministro cerebral intraventricular (ICV).

En algunas modalidades, "administración intratecal" o "suministro intratecal" de conformidad con la presente invención se refiere a administración o suministro IT lumbar, por ejemplo, suministrado entre la tercera y cuarta vértebra lumbar (espalda baja) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la espina. Se contempla que el suministro o administración IT lumbar se distingue sobre el suministro por cisterna magna en que el suministro o administración IT lumbar de acuerdo con esta invención proporciona un suministro mejor y más efectiva al canal espinal distante, mientras que el suministro por cisterna magna, entre otras cosas, típicamente no efectúa el suministro adecuadamente al canal espinal distante.

Dispositivo para la Suministro intratecal Diversos dispositivos se pueden utilizar para la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención. En algunas modalidades, un dispositivo para la administración intratecal contiene un puerto de acceso de fluido (por ejemplo, un puerto inyectable); un cuerpo hueco (por ejemplo, un catéter) que tiene un primer orificio de flujo en comunicación fluida con el puerto de acceso de fluido y un segundo orificio de flujo configurado para la inserción en la médula espinal; y un mecanismo de aseguramiento para asegurar la inserción del cuerpo hueco en la médula espinal. Como un ejemplo no limitante mostrado en la Figura 62, un mecanismo de aseguramiento adecuado contiene uno o más pernos o nudos montados en la superficie del cuerpo hueco y un anillo suturado ajustable sobre los uno o más pernos o nudos para prevenir que el cuerpo hueco (por ejemplo, el catéter) se deslice fuera de la médula espinal. En diversas modalidades, el puerto de acceso de fluido comprende un depósito. En algunas modalidades, el puerto de acceso de fluido comprende una bomba mecánica (por ejemplo, una bomba de infusión). En algunas modalidades, se conecta un catéter implantado a ya sea un depósito (por ejemplo, para el suministro del bolo), o una bomba de infusión. El puerto de acceso de fluido se puede implantar o puede ser externo.

En algunas modalidades, la administración intratecal se puede realizar mediante ya sea punción lumbar (es decir, bolo lento) o por medio de un sistema de suministro de catéter con puerto (es decir, infusión o bolo). En algunas modalidades, el catéter se inserta entre las láminas de las vértebras lumbares y la punta se rosca hasta el espacio tecal al nivel deseado (generalmente L3-L4) (Figura 63).

Con relación a la administración intravenosa, un volumen de dosis única adecuado para la administración intratecal es típicamente pequeño. Típicamente, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención mantiene el balance de la composición del CSF así como la presión intracraneal del sujeto. En algunas modalidades, la suministro intratecal se realiza sin la remoción correspondiente de CSF a partir de un sujeto. En algunas modalidades, un volumen de dosis única adecuado puede ser por ejemplo, menor que aproximadamente 10 mi, 8 mi, 6 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2 mi, 1.5 mi, 1 mi, o 0.5 mi. En algunas modalidades, un volumen de dosis única adecuado puede ser aproximadamente 0.5-5 mi, 0.5-4 mi, 0.5-3 mi, 0.5-2 mi, 0.5-1 mi, 1-3 mi, 1-5 mi, 1.5-3 mi, 1-4 mi, o 0.5-1.5 mi. En algunas modalidades, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención involucra una etapa de remover primero una cantidad deseada de CSF. En algunas modalidades, primero se remueven menos de aproximadamente 10 mi (por ejemplo, menos de aproximadamente 9 mi, 8 mi, 7 mi, 6 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2 mi, 1 mi) de CSF antes de la administración IT. En esos casos, un volumen de dosis única adecuado puede ser por ejemplo, mayor que aproximadamente 3 mi, 4 mi, 5 mi, 6 mi, 7 mi, 8 mi, 9 mi, 10 mi, 15 mi, o 20 mi.

Diversos otros dispositivos se pueden utilizar para efectuar la administración intratecal de una composición terapéutica. Por ejemplo, las formulaciones que contienen enzimas deseadas se pueden administrar utilizando un depósito de Ommaya que es de uso común para administrar de manera intratecal fármacos para la carcinomatosis meníngea (Lancet 2: 983-84, 1963). Más específicamente, en este método, un tubo ventricular se inserta a través de un agujero formado en el cuerno anterior y se conecta a un depósito de Ommaya instalado bajo el cuero cabelludo, y el depósito se pincha subcutáneamente para suministrar de manera intratecal la enzima particular que se reemplaza, que se inyecta en el depósito. Otros dispositivos para la administración intratecal de formulaciones o composiciones terapéuticas a un individuo se describen en la Patente Norteamericana No. 6,217,552, incorporada aquí por referencia. Alternativamente, el fármaco se puede administrar por vía intratecal, por ejemplo, mediante una inyección sencilla, o una infusión continua. Se debe entender el tratamiento de la dosis puede estar en la forma de una sola administración de la dosis o múltiples dosis.

Para la inyección, las formulaciones de la invención se pueden formular en soluciones líquidas. Además, la enzima se puede formular en forma sólida y se puede re-disolver o suspender inmediatamente antes del uso. También se incluyen las formas liofilizadas. La inyección puede ser, por ejemplo, en la forma de una inyección en bolo o infusión continua (por ejemplo, utilizando bombas de infusión) de la enzima.

En una modalidad de la invención, la enzima se administra mediante inyección cerebroventricular lateral en el cerebro de un sujeto. La inyección se puede hacer, por ejemplo, a través de un trepanado hecho en el cráneo del sujeto. En otra modalidad, la enzima y/u otra formulación farmacéutica se administra a través de una derivación quirúrgicamente insertada en el ventrículo cerebral de un sujeto. Por ejemplo, la inyección se puede hacer en los ventrículos laterales, que son mayores. En algunas modalidades, la inyección también se puede hacer en los tercer y cuarto ventrículos menores.

En todavía otra modalidad, las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención se administran mediante inyección en la cisterna magna, o el área lumbar de un sujeto.

En otra modalidad del método de la invención, la formulación farmacéuticamente aceptable proporciona un suministro sostenida, por ejemplo, una "lenta liberación" de la enzima u otra composición farmacéutica utilizada en la presente invención, a un sujeto durante al menos una, dos, tres, cuatro semanas o periodos de tiempo más largos después de que la formulación farmacéuticamente aceptable se administra al sujeto.

Como se utiliza aquí, el término "suministro sostenido" se refiere al suministro continuo de una formulación farmacéutica de la invención in vivo durante un periodo de tiempo después de la administración, preferiblemente al menos varios días, una semana o varias semanas. El suministro sostenida de la composición se puede demostrar mediante, por ejemplo, el efecto terapéutico continuado de la enzima con el paso del tiempo (por ejemplo, el suministro sostenida de la enzima se puede demostrar por la cantidad reducida continuada de gránulos de almacenamiento en el sujeto). Alternativamente, el suministro sostenido de la enzima se puede demostrar detectando la presencia de la enzima in vivo con el paso del tiempo.

Suministro a los Tejidos Objetivo Como se discute anteriormente, una de las características sorprendentes e importantes de la presente invención es que los agentes terapéuticos, en particular, las enzimas de reemplazo administradas utilizando los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención son capaces de difundirse efectivamente y extensivamente a través de la superficie del cerebro y penetrar varias capas o regiones del cerebro, incluyendo regiones profundas del cerebro. Además, los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención suministran efectivamente los agentes terapéuticos (por ejemplo, una enzima de ASA) a diversos tejidos, neuronas o células de la médula espinal, incluyendo la región lumbar, que es difícil de tener como objetivo por los métodos de suministro al CNS existentes tales como la inyección ICV. Además, los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención suministran una cantidad suficiente de agentes terapéuticos (por ejemplo, una enzima de ASA) al torrente sanguíneo y a diversos órganos periféricos y tejidos.

De esta manera, en algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de ASA) se suministró al sistema nervioso central de un sujeto. En algunas modalidades, una proteíná terapéutica (por ejemplo, una enzima de ASA) se suministro a uho o más de los tejidos objetivo del cerebro, médula espinal, y/u órganos periféricos. Como se utiliza aquí, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que sea afectado por el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado o cualquier tejido en que la enzima lisosómica deficiente sea normalmente expresada. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales hay una cantidad detectable o anormalmente alta de sustrato de la enzima, por ejemplo almacenada en los lisosomas celulares del tejido, en pacientes que sufren de o susceptibles al padecimiento por almacenamiento -lisosómico. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que despliegan una característica, síntoma o patología asociada al padecimiento. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales la enzima lisosómica deficiente es normalmente expresada en un nivel elevado. Como se utiliza aquí, un tejido objetivo puede ser un tejido objetivo del cerebro, un tejido objetivo de la médula espinal y/o un tejido objetivo periférico. Los tejidos objetivo ejemplares se describen en detalle debajo.

Tejidos Objetivo del Cerebro En general, el cerebro se puede dividir en diferentes regiones, capas y tejidos. Por ejemplo, el tejido meníngeo es un sistema de membranas que envuelve el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro. Las meninges contienen tres capas, incluyendo la duramadre, aracnoides y piamadre. En general, la función primaria de las meninges y del fluido cerebroespinal es proteger el sistema nervioso central. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a una o más capas de las meninges.

El cerebro tiene tres subdivisiones primarias, incluyendo el cerebro, el cerebelo, y el tallo cerebral. Los hemisferios cerebrales, que están situados por encima de la mayoría de las otras estructuras del cerebro y que están cubiertos con una capa cortical. Debajo del cerebro yace el tallo cerebral, el cual se parece a un tallo en el cual está adjunto el cerebro. En la parte trasera del encéfalo, debajo del cerebro y detrás del tallo cerebral, está el cerebelo.

El diencéfalo, que se localiza cerca de la línea media del cerebro y por encima del mesencéfalo, contiene el tálamo, el metatálamo, el hipotálamo, el epitálamo, el pretálamo, y el pretectum. El mesencéfalo, también llamado cerebro medio, contiene el tectum, tegumentum, mesocoelia ventricular, y pedúnculos cerebrales, el núcleo rojo, y el núcleo del nervio craneal III. El mesencéfalo se asocia con la vista, el oído, el control motor, el sueño/despertar, el estado de alerta, y la regulación de la temperatura.

Las regiones de tejidos del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, se pueden caracterizar con base en la profundidad de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos del CNS (por ejemplo, el cerebro) se pueden caracterizar como tejidos superficiales o poco profundos, tejidos de profundidad media, y/o tejidos profundos.

De acuerdo con la presente invención, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) se puede suministrar a cualquier tejido(s) objetivo del cerebro apropiado asociado con un padecimiento particular a ser tratado en un sujeto. En algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro superficial o poco profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro de profundidad media. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a una combinación de tejido objetivo del cerebro superficial o poco profundo, tejido objetivo del cerebro de profundidad media, y/o tejido objetivo del cerebro profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a un tejido del cerebro profundo al menos 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm o más abajo (o interno a) la superficie externa del cerebro.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos superficiales o poco profundos del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se localizan dentro de 4 mm de la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se seleccionan a partir de tejidos de la piamadre, tejidos de la cinta cortical cerebral, hipocampo, espacio de Virchow-Robin, vasos sanguíneos dentro del espacio VR, el hipocampo, porciones del hipotálamo en la superficie inferior del cerebro, los tractos y nervios ópticos, las proyecciones y el bulbo olfatorio, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos profundos del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se localizan 4 mm (por ejemplo, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, o 10 mm) debajo de (o interno a) la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos profundos que se tienen como objetivo del cerebro incluyen la cinta cortical cerebral. En algunas modalidades, los tejidos profundos que se tienen como objetivo del cerebro incluyen uno o más del diencéfalo (por ejemplo, el hipotálamo, tálamo, pretálamo, subtálamo, etcétera), metencéfalo, núcleo Ientiforme, ganglios básales, núcleo caudado, putamen, amígdala, globo pálido, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos del cerebelo. En ciertas modalidades, los uno o más tejidos que se tienen como objetivo del cerebelo se seleccionan a partir del grupo que consiste de tejidos de la capa molecular, tejidos de la capa de células de Purkinje, tejidos de la capa celular Granular, pedúnculos cerebelosos, y combinación de los mismos. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos profundos del cerebelo incluyendo, pero no limitado a, tejidos de la capa de células de Purkinje, tejidos de la capa celular Granular, tejido de la sustancia blanca cerebelosa profunda (por ejemplo, profunda con relación a la capa celular Granular), y tejido del núcleo cerebeloso profundo.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos del tallo cerebral. En algunas modalidades, los uno o más tejidos que se tienen como objetivo del tallo cerebral incluyen tejido de la sustancia blanca del tallo cerebral y/o tejido del núcleo del tallo cerebral.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a diversos tejidos del cerebro incluyendo, pero no limitado a, la materia gris, sustancia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoides, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región del núcleo caudado/putamen, cerebro medio, regiones profundas del puente de Varolio o la médula, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a diversas células en el cerebro incluyendo, pero no limitado a, las neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meníngeas. En algunas modalidades, una proteína terapéutica se suministra a los oligodendrocitos de la sustancia blanca profunda.

Médula Espinal En general, las regiones o tejidos de la médula espinal se pueden caracterizar con base en la profundidad de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos de la médula espinal se pueden caracterizar como tejidos superficiales o poco profundos, tejidos de profundidad media, y/o tejidos profundos.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos superficiales o poco profundos de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido superficial o poco profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal se localiza dentro de 4 mm desde la superficie de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido superficial o poco profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal contiene piamadre y/o los tractos de la sustancia blanca.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a uno o más tejidos profundos de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal se localiza interno a 4 mm desde la superficie de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal contiene materia gris de la médula espinal y/o células ependimarias.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas) se suministran a las neuronas de la médula espinal.

Tejidos Periféricos Objetivo Como se utiliza aquí, los órganos o tejidos periféricos se refieren a cualquier órgano o tejido que no sea parte del sistema nervioso central (CNS). Los tejidos periféricos objetivo pueden incluir, pero no se limitan a, el sistema sanguíneo, hígado, riñón, corazón, endotelio, médula ósea y células derivadas de la médula ósea, bazo, pulmón, nodo linfático, hueso, cartílago, ovario y testículo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) de conformidad con la presente invención se suministro a uno o más de los tejidos periféricos objetivo.

Biodistribución y biodisponibilidad En diversas modalidades, una vez que se suministro al tejido objetivo, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de ASA) se localiza intracelularmente. Por ejemplo, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima) se puede localizar en los exones, axones, lisosomas, mitocondria o vacuolas de una célula objetivo (por ejemplo, las neuronas tales como las células de Purkinje). Por ejemplo, en algunas modalidades, las enzimas administradas por vía intratecal demuestran una dinámica de translocación tal que la enzima se mueve dentro del espacio perivascular (por ejemplo, mediante mecanismos convectivos asistidos por pulsaciones). Además, los mecanismos de transporte axónico activos referentes a la asociación de la proteína o enzima administrada con los neurofilamentos, también pueden contribuir a o de otra manera pueden facilitar la distribución de las enzimas o proteínas administradas por vía intratecal en los tejidos más profundos del sistema nervioso central.

En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de ASA) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr actividades o niveles terapéuticamente o clínicamente efectivos en diversos tejidos objetivo aquí descritos. Como se utiliza aquí, una actividad o nivel terapéuticamente o clínicamente efectivo es una actividad o nivel suficiente para conferir un efecto terapéutico en un tejido objetivo. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por cualquier prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). Por ejemplo, una actividad o nivel terapéuticamente o clínicamente efectivo puede ser una actividad o nivel enzimático que es suficiente para mejorar los síntomas asociados con el padecimiento en el tejido objetivo (por ejemplo, almacenamiento GAG).

En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático que es al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de la actividad o nivel normal de la enzima lisosómica correspondiente en el tejido objetivo. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático que se incrementa por al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces según se compara a un control (por ejemplo, las actividades o niveles endógenos sin el tratamiento). En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático incrementado al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg o 600 nmol/hr/mg en un tejido objetivo.

En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para tener como objetivo la región lumbar. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemp!o; una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático incrementado en la región lumbar de al menos aproximadamente 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, o 10,000 nmol/hr/mg.

En general, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de reemplazo) suministrados de acuerdo con la presente invención tienen una vida media suficientemente larga en el CSF y los tejidos objetivo del cerebro, la médula espinal, y los órganos periféricos. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede tener una vida media de al menos aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, hasta 3 días, hasta 7 días, hasta 14 días, hasta 21 días o hasta un mes. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede retener una actividad o nivel detectable en el CSF o el torrente sanguíneo después de 12 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas, 96 horas, 102 horas, o una semana después de la administración. La actividad o el nivel detectable se puede determinar utilizando diversos métodos conocidos en el arte.

En ciertas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención logra una concentración de al menos 30 g/ml en los tejidos del CNS y las células del sujeto después de la administración (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos, después de la administración intratecal de la composición farmacéutica al sujeto). En ciertas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención logra una concentración de al menos 20 pg/ml, al menos 15 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 7.5 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 2.5 pg/ml, al menos 1.0 pg/ml o al menos 0.5 g/ml en los tejidos o células que se tienen como objetivo del sujeto (por ejemplo, los tejidos del cerebro o las neuronas) después de la administración a tal sujeto (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos después de la administración intratecal de tales composiciones farmacéuticas al sujeto).

Tratamiento de La Enfermedad por Leucodistrofia Metacromática (MLD) La Enfermedad por Leucodistrofia Metacromática (MLD), es un trastorno recesivo autosómico que resulta de una deficiencia de la enzima Arilsulfatasa (ASA). La ASA, la cual se codifica por el gen ARSA en los humanos, es una enzima que descompone el cerebrosido 3-sulfato o la espingolipido 3-O-sulfogalactosilceramida (sulfatidos) en cerebrosido y sulfato. En ausencia de la enzima, los sulfatidos se acumulan en el sistema nervioso (por ejemplo, las fundas de mielina, las neuronas y las células gliales) y en menor extensión en los órganos viscerales. La consecuencia de estos eventos moleculares y celulares es la desmielinación progresiva y la pérdida axonal dentro del CNS y el PNS, lo cual está acompañado clínicamente por disfunción motora y cognoscitiva severa.

Una característica clínica definitoria de este trastorno es la degeneración del sistema nervioso central (CNS), la cual resulta en el deterioro cognoscitivo (por ejemplo, retardo mental, trastornos nerviosos, y ceguera, entre otros).

La MLD se puede manifestar en niños pequeños (forma infantil tardía), donde los niños afectados típicamente comienzan a mostrar los síntomas justo después del primer año de vida (por ejemplo, aproximadamente a los 15-24 meses), y por lo general no sobreviven más allá de la edad de 5 años. La MLD se puede manifestar en niños (forma Juvenil), donde los niños afectados típicamente muestran deterioro cognoscitivo aproximadamente a la edad de 3-10 años, y la esperanza de vida puede variar (por ejemplo, en el rango de 10-15 años después del inicio de los síntomas). La MLD se puede manifestar en adultos (forma de inicio en Adultos) y puede aparecer en individuos se cualquier edad (por ejemplo, típicamente a la edad de 16 años y más) y la progresión de la enfermedad puede variar de forma importante.

Composiciones y métodos de la presente invención pueden ser usados para tratar efectivamente individuos que sufren de o son susceptibles a MLD. Los términos, "trata" o "tratamiento" como se usan en la presente, se refieren al alivio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, prevención o retardo del comienzo de uno o más síntomas de la enfermedad y/o disminución de la severidad o frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad. Síntomas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, presión intracraneal, hidrocéfalo ex vacuo, glicolípidos sulfatados acumulados en las vainas de mielina en el sistema nervioso periférico y central y en órganos viscerales, desmielinación progresiva, pérdida axonal dentro del CNS y PNS, y/o disfunción motora y cognitiva En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a mitigación, mejoramiento, alivio, inhibición, retardo de comienzo, reducción de severidad y/o incidencia de deterioro neurológico en un paciente con MLD. Como se usa en la presente, el término "deterioro neurológico" incluye varios síntomas asociados con el deterioro del sistema nervioso central (por ejemplo, el cerebro y médula espinal). En algunas modalidades, varios síntomas de MLD están asociados con el deterior del sistema nervioso periférico (PNS). En algunas modalidades, el deterioro neurológico en un paciente con MLD se caracteriza por decline en la función motora gruesa. Se apreciará que la función motora gruesa puede ser valorada por cualquier método apropiado. Por ejemplo, en algunas modalidades, la función motora gruesa se mide como el cambio de una línea base en la función motora usando el registro puro total de Medición-88 de la Función Motora Gruesa (GMFM-88).

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a acumulación reducida de sulfátida en varios tejidos. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a acumulación reducida de sulfátida en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal, y/o tejidos periféricos objetivos. En ciertas modalidades, la acumulación de sulfátida se reduce por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más comparada con un control. En algunas modalidades, la acumulación de sulfátida se reduce por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control. Se apreciará que el almacenamiento de sulfátida puede ser valorado por cualquier método apropiado. Por ejemplo, en algunas modalidades, el almacenamiento de sulfátida se mide por teñido de azul Alcian. En algunas modalidades, el almacenamiento de sulfátida se mide por teñido de LAMP-1.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a vacuolización reducida En neuronas (por ejemplo, neuronas que contienen células Purkinje). En ciertas modalidades, la vacuolización en neuronas se reduce por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más comparada con un control. En algunas modalidades, la vacuolización se reduce por al menos -vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere una actividad incrementada de enzima ASA en varios tejidos. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere una actividad incrementada de enzima ASA en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la actividad de la enzima ASA se incrementa por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% o más comparada con un control. En algunas modalidades, la actividad de la enzima ASA se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control. En algunas modalidades, la actividad enzimática ASA incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg o más. En algunas modalidades, la actividad enzimática ASA se incrementa en la región lumbar. En algunas modalidades, actividad enzimática ASA incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 10,000 nmol/hr/mg, o más.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la progresión reducida de la pérdida de la actividad cognoscitiva. En ciertas modalidades, la progresión de la pérdida de la habilidad cognoscitiva se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la reducción en el retardo del desarrollo. En ciertas modalidades, el retardo del desarrollo se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la supervivencia aumentada (por ejemplo, tiempo de supervivencia). Por ejemplo, el tratamiento puede resultar en una esperanza de vida aumentada de los pacientes. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una esperanza de vida aumentada de los pacientes en más de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, aproximadamente 115%, aproximadamente 120%, aproximadamente 125%, aproximadamente 130%, aproximadamente 135%, aproximadamente 140%, aproximadamente 145%, aproximadamente 150%, aproximadamente 155%, aproximadamente 160%, aproximadamente 165%, aproximadamente 170%, aproximadamente 175%, aproximadamente 180%, aproximadamente 185%, aproximadamente 190%, aproximadamente 195%, aproximadamente 200%, o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos de control con enfermedades similares, sin tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una esperanza de vida aumentada de los pacientes en más de aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años, aproximadamente 10 años, o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos de control con enfermedades similares, sin tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en la supervivencia a largo plazo de los pacientes. Como se usa aquí, el término "supervivencia a largo plazo" se refiere a un tiempo se supervivencia o esperanza de vida mayor a aproximadamente 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, o más.

Los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir" como se usan aquí, indican valores que son relativos a los controles. En algunas modalidades, un control adecuad son las mediciones de los niveles de referencia, como por ejemplo las mediciones en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito aquí, o una medición en un individuo de control (o en varios individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito aquí. Un "individuo de control" es un individuo que padece la misma enfermedad de MLD (por ejemplo, forma infantil-tardía, juvenil o comienzo de adulto), quién tiene aproximadamente la misma edad y/o el género que el individuo que está siendo tratado (para garantizar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el o los individuos de control, sean comparables).

El individuo (conocido también como "paciente" o "sujeto") que está siendo tratado es un individuo (un humano fetal, infante, niño, adolescente, o adulto) que tiene MLD o que tiene el potencial de desarrollar MLD. El individuo puede tener expresión y/o actividad ASA endógena residual, o no tiene actividad mensurable. Por ejemplo, los individuos que tienen MLD pueden tener niveles de expresión de ASA que son menores a aproximadamente 30-50%, menores a aproximadamente 25-30%, menores a aproximadamente 20-25%, menores a aproximadamente 15-20%, menores a aproximadamente 10-15%, menores a aproximadamente 5-10%, menores a aproximadamente 0.1-5% de los niveles de expresión normales de ASA.

En algunas modalidades, el individuo es un individuo quien ha sido diagnosticado recientemente con la enfermedad. Típicamente, el tratamiento temprano (comienza el tratamiento tan pronto como sea posible después del diagnóstico) es importante para minimizar los efectos de la enfermedad y maximizar los beneficios del tratamiento.

Tolerancia Inmunológica Por lo general, la administración intratecal de un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de remplazo) de acuerdo con la presente invención, no resulta en efectos adversos seros en el sujeto. Como se usa aquí, los efectos adversos severos inducen, pero no se limitan a, respuesta inmunológica sustancial, toxicidad, o muerte. Como se usa aquí, "respuesta inmunológica sustancial" se refiere a respuestas inmunológicas severas o serias, tales como respuestas inmunológicas de células T adaptativas.

Por lo tanto, en muchas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran terapia inmunosupresora concurrente (es decir, cualquier terapia inmunosupresora usada como pre-tratamiento/pre-condicionamiento o en paralelo con el método). En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran una inducción de la tolerancia inmunológica en los sujetos que están siendo tratados. En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran un pre-tratamiento o pre acondicionamiento de los sujetos usando agentes inmunosupresores de células T.

En algunas modalidades, la administración intratecal de agentes terapéuticos puede desarrollar una respuesta inmunológica contra estos agentes. Por lo tanto, en algunas modalidades, puede ser útil hacer que los sujetos que reciben la enzima de reemplazo, se vuelvan tolerantes a la terapia de remplazo de enzimas. La tolerancia inmunológica puede ser inducida usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un régimen inicial de 30-60 días de un agente inmunosupresor de células T, tal como ciclosporina A (CsA) y un agente anti proliferativo, tal como azatioprina (Aza), combinada con infusiones intratecales semanales de dosis bajas de una enzima de remplazo.

Cualquier agente inmunosupresor conocido por los especialistas experimentados puede ser empleado junto con una terapia de combinación de la invención. Tales agentes inmunosupresores incluyen pero no se limitan a ciclosporina, FK506, rapamicina, CTLA4-lg, y agentes anti-TNF tales como etanercept (véase, por ejemplo, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kulberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51 , 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret et al., 1999, Ann. N. Y. Acad. Sci 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1:24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283). El anticuerpo del receptor anti-IL2 (subunidad alfa), daclizumab (por ejemplo, Zenapax.TM.), el cual ha demostrado resultar efectivo en los pacientes de trasplante, también puede ser usado como un agente inmunosupresor (véase, por ejemplo, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1 , 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159). Los agentes inmunosupresores adicionales incluyen, pero no se limitan a anti-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantations 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 238-152), y el ligando anti-CD40 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235).

Administración Los métodos inventivos de la presente invención contemplan administraciones individuales así como múltiples de una cantidad efectiva terapéuticamente de los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de remplazo) descritos aquí. Los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de remplazo) pueden ser administrados a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, la severidad y la extensión de la condición del sujeto (por ejemplo, una enfermedad por almacenamiento lisosómico). En algunas modalidades, una cantidad efectiva terapéuticamente de los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de remplazo) de la presente invención, puede ser administrada periódicamente de forma intratecal, a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bimensualmente (una vez cada dos meses), mensualmente (una vez al mes), bisemanalmente (una vez cada dos semanas), semanalmente).

En algunas modalidades, la administración intratecal puede ser usada en conjunción con otras rutas de administración (por ejemplo, de forma intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, transdérmicos, o a través de las mucosas (por ejemplo, oralmente o nasalmente)). En algunas modalidades, esas otras rutas de administración (por ejemplo, la administración intravenosa) puede ser llevada a cabo no más frecuentemente que la administración bisemanalmente, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses.

Como se usa aquí, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" se determina en gran medida con base en la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En general, una cantidad efectiva terapéuticamente es suficiente para lograr un beneficio significativo a los sujetos (por ejemplo, tratar, modular, curar, evitar y/o aliviar la enfermedad o la condición subyacente). Por ejemplo, una cantidad efectiva terapéuticamente puede ser una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico suficiente, tal como una cantidad suficiente para modular los receptores de la enzima lisosómica o sus actividad para tratar por ello tal enfermedad por almacenamiento lisosómico o los síntomas de la misma (por ejemplo, una reducción o eliminación de la presencia o la incidencia de "los cuerpos cebra" o la vacuolización celular enseguida de la administración de las composiciones de la presente invención a los sujetos). En general, la cantidad un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima lisosómica recombinante) administrada a los sujetos en necesidad de la misma, dependerá de las características de los sujetos. Tales características incluyen la condición, la severidad de la enfermedad, la salud general, la edad, el sexo y el peso corporal de los sujetos. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica serán capaces de determinar fácilmente las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos tanto objetivos y subjetivos para identificar los rangos de dosificación óptimos.

Una cantidad efectiva terapéuticamente se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender varias dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad efectiva terapéuticamente (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad efectiva terapéuticamente (y/o la dosis unitaria), para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el trastorno que está siendo tratado y la severidad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y/o la tasa de expresión o de metabolismo de la proteína de fusión específica empleada; la duración del tratamiento; y los factores similares que son bien conocidos en las técnica médicas.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente varía desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 500 mg/kg en peso del cerebro, por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 400 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente O.005 mg/kg en peso del cerebro a 300 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 200 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 100 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 90 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 80 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 70 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 60 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 50 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 40 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 30 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 25 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 20 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 15 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 10 mg/kg en peso del cerebro.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente es mayor a aproximadamente 0.1 mg/kg, mayor a aproximadamente 0.5 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 1.0 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 3 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 5 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 10 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 15 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 20 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 30 mg/kg en peso del cerebro, mayos a aproximadamente 40 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 50 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 60 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 70 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 80 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 90 mg/kg en peso del cerebro, mayor a 100 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 150 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 200 mg/kg en peso del cerebro, mayor a 250 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 300 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 350 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 400 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 450 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 500 mg/kg en peso del cerebro.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente también puede ser definida por los mg/kg en peso del cerebro. Como apreciaran las personas experimentadas en la técnica, el peso del cerebro y el peso corporal pueden estar correlacionados. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights", Ann Neurol 1978; 4:345-56. Por lo tanto, en algunas modalidades, las dosis pueden ser convertidas como se muestra en la Tabla TABLA 5 En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente también puede ser definida por mg/15 ce de CSF. Como apreciarán las personas experimentadas en la técnica, las dosis efectivas terapéuticamente con base en los pesos del cerebro y los pesos corporales, pueden ser convertidas a mg/15 ce de CSF. Por ejemplo, el volumen de CSF en humanos adultos es aproximadamente 150 ml_ (Johanson CE, et al., "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease", Cerebrospinal Fluid Res. 2008 Mayo 14; 5:10). Por lo tanto, las inyecciones de dosis unitarias de 0.1 mg a 50 mg de proteína a adultos, serían dosis de aproximadamente 0.01 mg/15 ce de CFS (0.1 mg) a 5.0 mg/15 ce de CSF (50 mg) dosis en adultos.

Se debe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados en el transcurso del tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de las personas que administran o que supervisan la administración de la terapia de remplazo de enzimas y aquellos rangos de dosificación establecidos aquí, son solo ejemplificantes y no tienen la intención de limitar el ámbito o la práctica de la invención reivindicada.

Kits La presente invención proporciona además kits y otros artículos de fabricación, los cuales contienen la formulación de la presente invención y proporcionan instrucciones para su reconstitución (si están liofilizadas) y/o uso. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir un recipiente, un IDDD, un catéter y cualquier otro artículo, dispositivo o kit útiles en la administración intratecal y la cirugía asociada. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas (por ejemplo, jeringas pre llenadas), ampolletas, cartuchos, depósitos o lyo-jects. El recipiente puede ser formado de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. En algunas modalidades, los recipientes son jeringas pre-llenadas. Las jeringas pre-llenadas incluyen, pero no se limitan a, jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona horneada, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona rociada, o jeringas de resina plástica sin silicona.

Típicamente los recipientes contienen formulaciones y una etiqueta sobre, o asociada con el recipiente que puede indicar las instrucciones para la reconstitución y/o el uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación se reconstituye a las concentraciones de la proteína como se describen anteriormente. La etiqueta puede indicar además que la formulación es útil o deseada para, por ejemplo, la administración IT. En algunas modalidades, los recipientes pueden contener una dosis única de una formulación estable que contiene un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de remplazo). En varias modalidades, una dosis única de la formulación estable está presente en un volumen menor a aproximadamente 15 mi, 10 mi, 5.0 mi, 4.0 mi, 3.5 mi, 2.5 mi. 2.0 mi, 1.5 mi, 1.0 mi, 0 0.5 mi. Alternativamente, los recipientes que contiene la formulación pueden ser frascos de usos múltiples, los cuales hacen posible la administración repetida (por ejemplo, de 2-6 administraciones) de la formulación. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI, solución salina, solución salina amortiguada). Después del mezclado del diluyente y la formulación, la concentración final de proteína en la formulación reconstituida será por lo general de al menos 1 mg/ml (por ejemplo, al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml). Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen, otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, IDDDs, catéteres, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso.

La invención se entenderá de forma más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Los cuales no deben, sin embargo, ser considerados como limitantes del ámbito de la invención, todas las citas de la literatura se incorporan como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Estudio toxicológico de la arilsulfatasa A administrada de forma IT Para evaluar la habilidad de otras enzimas recombinantes administradas de forma intratecal para distribuirse en las células y los tejidos del CNS, se llevo a cabo el estudio GLP para evaluar la administración intratecal (IT) de dosis repetidas de arilsulfatasa A humana preparada de forma recpmbinante (rhASA) desde una perspectiva toxicológica y de seguridad farmacológica durante un periodo de un mes en monos cinomólogos juveniles (menos de 12 meses de edad). La formulación de rhASA se preparó y se formuló en un vehículo de NaCI 154 mM, 0.005% de polisorbato 20 a un pH de 6.0.

Para lograr esto, nueve monos cinomólogos juveniles, hembras, se asignaron al azar por peso corporal a uno de tres grupos de tratamiento como se muestra en la siguiente Tabla 6. Los animales (con la excepción de 1 animas macho para la Dosis 1 ) recibieron 0.6 mL de infusión IT a corto plazo de 0, 3 ó 31 mg/mL de rhASA (dosis total de 0, 1.8 ó 18.6 mg) cada tercer semana para un total de tres dosis por animal. Se evaluaron los pesos corporales, las observaciones clínicas, los exámenes neurológicos y físicos, la patología clínica, exámenes oftalmológicos, y el muestreo toxicocinético. Todos los animales fueron sacrificados el Día 29, 30, ó 31 (-24 horas después de la última dosis IT). Se recolectaron los tejidos seleccionados, se guardaron y se examinaron microscópicamente.

TABLA 6 Las concentraciones de rhASA detectadas en los tejidos del CNS de los monos cinomólogos se analizaron mediante ELISA y se compararon con un objetivo terapéutico de 10% de las concentraciones de rhASA humanas, correspondientes a aproximadamente 2.5 ng/mg de tejido. Las muestras o bocados de tejido se extrajeron de diferentes áreas de los cerebros de los monos cinomólogos y posteriormente se analizaron por la presencia de la rhASA. La Figura 24 ilustra los tejidos de los cuales se extrajeron los bocados. Las muestras de tejido extraídas reflejan un aumento en las concentraciones de la rhASA, como se refleja en la Figuras 25A-G, con un gradiente de deposición de la corteza cerebral a la materia blanca profunda y la materia gris profunda.

Las concentraciones de rhASA detectadas usando los mismos bocados tanto de las mitas de suministro IT e ICV para seis monos a los que se administró la dosis de 18.6mg de rhASA, se ilustran en la Figuras 26A-B. Las concentraciones de rhASA detectadas en los tejidos cerebrales de la materia blanca profunda (Figura 25) y en la materia gris profunda (Figura 26B) de monos cinomólogos adultos y juveniles de rhASA administrada de forma intratecal (IT) o de modo cerebroventricular (ICV) fueron comparables.

Las muestras de tejido extraídas de los cerebros de monos cinomólogos adultos y juveniles se analizaron entonces para determinar las concentraciones de la rhASA depositada en la muestra de tejido extraída, y para comparar tales concentraciones con la concentración terapéutica objetivo de 2.5ng de rhASA por mg de proteína (correspondiente a 10% de la concentración normal de rhASA en un sujeto saludable). Como se ilustra en la Figura 27A, en cada muestra de tejido extraída analizada, la dosis de 18.6 mg de tasa administrada de forma IT resulta en una concentración de rhASA la cual excede la concentración terapéutica objetivo de 2.5ng/mg de proteína. De forma similar, cuando se administró de forma IT una dosis de 1.8mg de rhASA a monos cinomólogos juveniles, cada muestra de tejido extraída analizada demostró una concentración de rhASA que fue o que excedió la concentración terapéutica de 2.5ng/ml de proteína y las medianas de las concentraciones de rhASA fueron superiores al objetivo terapéutico para todos los bocados de tejido evaluados (Figura 27B).

Para determinar si la rhASA administrada de forma IT se distribuyo a las células relevantes, se analizó el tejido de la materia blanca profunda de monos cinomólogos a los que se administraron de forma IT 1.8 mg de rhASA, del área ilustrada en la Figura 28A. El inmunoteñido de la materia blanca profunda reveló la distribución de la rhASA en los monos cinomólogos en las células oligodendríticas, como se ilustra por la Figura 28B. De forma similar, la Figura 28C ilustra que la rhASA administrada de forma IT demuestra co-localización en los tejidos de la materia blanca profunda de los monos cinomólogos. En articular, es evidente (Figura 28C), la sub co-localización de teñido en los organelos objetivo, tales como las lisosomas, lo que sustenta la conclusión de que la rhASA administrada de forma IT es capaz de distribuirse a las célula, los tejidos y los organelos relevantes del CNS incluyendo los lisosomas de los oligodendrocitos. Los anterior apoya la conclusión de que la diferencia entre suministro ICV e IT se encontró por ser mínimo para el suministro de rhASA.

EJEMPLO 2 Bodistribución con proteína radio-etiquetada RhASA etiquetada con el emisor de positrones 124l se preparó y se formuló en un vehículo de NaC1 154 mM, 0.005% de polisorbato 20 a un pH de 6.0. Un volumen de la formulación equivalente a 3mg de rhASA /correspondiente a aproximadamente 38mg/kg del cerebro) se administró a monos cinomólogos adultos vía las rutas de administración intracerebroventricular (ICV) e intratecal (IT). Los monos cinomólogos se sometieron a estudios de formación de imágenes por exploración PET de alta resolución (microPET P4) para determinar la distribución de la rhASA etiquetada con 12 l administrada.

Los datos de la formación de imágenes PET (Figura 29) ilustran que tanto la rhASA etiquetada con 124l administrada de forma ICV e IT se distribuye de forma efectiva a los tejidos del CNS, y en particular la rhASA etiquetada con 124l administrada a través del catéter lumbar IT se distribuye de forma inmediata y uniforme al fluido cerebroespinal (CSF) sobre toda la longitud de la espina. En particular, como se representa en la Figura 29, enseguida de la administración ICV e IT, las concentraciones terapéuticas de la rhASA etiquetada con 12 l se detectaron en los tejidos del CNS de los monos cinomólogos, incluyendo el cerebro la médula espinal y el CSF. Las concentraciones de rhASA detectadas en tales tejidos del CNS, y en particular en los tejidos del cerebro, exceden la concentración terapéutica objetivo de 2.5ng/mg de proteína.

Aunque la distribución de la rhASA fue comparable tanto para las rutas de suministro IT e ICV, la ICV resultó en notablemente menos deposición dentro de la columna espinal, como se evidencia por la Figura 29.

Veinticuatro horas enseguida de la administración de la formulación, la ASA etiquetada con 124l administrada tanto de forma ICV e IT se distribuyó de forma efectiva a los tejidos del CNS. En particular, veinticuatro horas enseguida de la administración IT, 12.4% de la dosis administrada estaba en la región craneal, en comparación con 16.7% de la dosis administrada de forma ICV. Por consiguiente, las concentraciones de rhASA detectadas en tales tejidos del CNS, y en particular en los tejidos del cerebro, cuando la rhASA se administró de forma IT se aproximan a aquellas concentraciones detectadas enseguida de la administración ICV de la misma dosis.

La inyección ICV de la rhASA etiquetada con 124l resulta en la transferencia inmediata del volumen inyectado a la cisterna magna, la cisterna pontis, la cisterna interpeduncularis, y la espina próxima, como se ilustra en la Figura 30. Como se ilustra también en la Figura 30, en un periodo de 2.5 hr de la administración IT suministra la rhASA etiquetada con 1 4l a los mismos compartimientos iniciales (las cisternas y la espina próxima) como se muestra para la administración ICV. Veinticuatro horas enseguida de la administración tanto ICV e IT, la distribución de la rhASA etiquetada con 124l fue comparable en el área de la cisterna y la espina próxima, como se ilustra en la Figura 31. Por consiguiente, distinto de fármacos de moléculas pequeñas, los resultados anteriores sugieren que la administración ICV ofrece mínimas ventajas sobre la administración IT de rhASA.

Estos resultados confirman que la rhASA puede ser administrada a los sujetos usando la ruta de administración IT menos invasiva y por ello se logran las concentraciones terapéuticas en las células y los tejidos objetivos.

Las enfermedades por almacenamiento lisosómico representan una familia de trastornos genéticos provocados por la pérdida o enzimas defectuosas, lo cual resulta en acumulación anormal de sustratos. Aunque los síntomas periféricos asociados con varias de estas enfermedades, pueden ser mitigados de forma efectiva por la administración intravenosa de enzimas recombinantes, no se espera que la administración intravenosa de tales enzimas recombinantes tenga un impacto significativo sobre las manifestaciones del CNS asociados con la mayoría de las enfermedades por almacenamiento lisosómico. Por ejemplo, la iduronato-2-sulfatasa humana recombinante (Idursulfasa, Elaprase®; Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lexigton, MA) está aprobada para el tratamiento de los síntomas somáticos del síndrome de Hunter, pero no hay terapias farmacológicas para el tratamiento de las manifestaciones neurológicas, las cuales pueden incluir desarrollo retrasado y deterioro mental progresivo. Esto se debe en parte a la naturaleza de la I2S, la cual es una enzima grande, altamente glicosilada con un peso molecular de aproximadamente 76kD y que no atraviesa la barrera hematoencefálica enseguida de la administración intravenosa.

Los presentes inventores han emprendido por lo tanto un programa para investigar la administración intratecal (IT) de formulaciones intratecales de enzimas humanas recombinantes, tales como, por ejemplo, la iduronato-2-sulfatasa (I2S), arilsulfatasa A (rhASA) y alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu). Los resultados presentados aquí, representan los primeros en demostrar que la administración lumbar IT de proteínas lisosómicas recombinantes resulta en la administración de una fracción significativa de la proteína administrada al cerebro, y en particular resulta en la deposición generalizada de tales proteínas en las neuronas del cerebro y la médula espinal, tanto en monos cinomólogos y en perros. Los análisis inmunohistoquímicos de los tejidos del CNS demuestran que las proteínas se focalizan en los lisosomas, el sitio de la acumulación patológica de los glicosaminoglicanos en los trastornos por acumulación lisosómica. Además, las mejorar morfológicas demostradas en el modelo de ratón IKO del síndrome de Hunter. El modelo de ratón con deficiencia de Naglu del síndrome de Sanfilippo tipo B, y el modelo de ratón sin información genética para ASA de leucodistrofia metacromática (MLD) refuerza la observación de que las enzimas administradas de forma IT se distribuyen a los tejidos apropiados y se transportan a los compartimientos celulares y los organelos apropiados.

Las similitudes observadas en los patrones de distribución en el cerebro, detectados después de la administración IT lumbar e ICV de la I2S, sugiere un flujo global y un remezclado activo del CSF. Por lo tanto, en un entorno clínico, las rutas de administración tanto IT de ICV son potencialmente factibles, sin embargo, la deposición observada de la I2S en la médula espinal seguida de la administración IT proporciona una ventaja clara para tratar las secuelas de la médula espinal y los componentes de las enfermedades por almacenamiento lisosómico tales como el síndrome de Hunter. Además, los puertos de inyección espinal son menos invasivos y se espera que sean más adecuados para el uso clínico en sujetos pediátricos.

La evidencia del teñido de células perivasculares y la dinámica de translocación de proteínas observada por los estudios por formación de imágenes PET anteriores indica que las enzimas de mueven dentro del espacio perivascular, presumiblemente por medio de mecanismos de convección asistida por las pulsaciones. Un mecanismo de transporte adicional se sugiere por la asociación observada de la I2S con los neurofilamentos, lo que indica el transporte axonal activo. Esto última comienza presumiblemente con la interacción de las proteínas con la los receptores neuronales de manosa-6-fosfato (M6P), los cuales se expresan ampliamente sobre las células de la médula espinal y el cerebro y los cuales, después de la administración directa al parénquima del cerebro, pueden, pueden hacer que la enzima I2S sea fácilmente absorbida por las células objetivo. (Begley et al., Curr Pharm Des (2008) 14: 1566-1580).

Aunque el transporte axonal de las enzimas lisosómicas ya ha sido implicado previamente por métodos indirectos in vivo y por medio de formación de imágenes in vitro, los estudios actuales proporcionan la primera evidencia directa del transporte axonal de enzimas no virales o esperadas, administradas vía el CSF. Por lo tanto la administración de proteínas por el CSF a la superficie del cerebro y a los tejidos del cerebro más profundos parece depender de procesos de transferencia activos, ninguno de los cuales ha sido descrito elucidado previamente para la administración de proteínas o enzimas a las células, los tejidos y los organelos del cerebro.

Contrario al punto de vista prevaleciente, de que la dinámica de flujo de los intersticios del parénquima y el CSF evitaría la distribución de las proteínas Administradas de forma IT lumbar a la materia blanca del cerebro, los presentes estudios demuestran claramente que la administración IT de una enzima lisosómica resulta en la distribución de las proteínas y la acumulación en todos los tejidos del cerebro y la deposición en el compartimiento lisosomico de las células objetivo, las cuales son el sitio de la acumulación patológica de glicosaminoglicanos. (Véase, por ejemplo, Fenstermacher et al., Ann N Y Acad Sci (1988) 531 :29-39 y DiChiro et al., Neurology (1976) 26:1-8). Junto con la naturaleza menos invasiva de la administración IT lumbar, esta ruta ofrece un medio clínicamente relevante para administrar agentes terapéuticos biológicos al cerebro, en particular en niños.

EJEMPLO 1 Formulaciones de arilsulfatasa A para su administración IT Este ejemplo resume el trabajo para establecer una forma de dosificación líquida de alta concentración de rhASA (arilsulfasa A) y la formulación de sustancia de fármaco y producto de fármaco para el tratamiento de Leucodistrofia Metacromática (MLD) vía la ruta de administración intratecal (IT).

Los datos de estabilizad demuestran que la formulación salina de sustancia de fármaco y producto de fármaco (sin PBS 20) es estable después de 18 meses a < -65 grados C y 18 meses a 2-8 grados C. Durante el desarrollo farmacéutico de esta proteína, la solubilidad y estabilidad de rhASA se investigó bajo condiciones limitadas de excipiente y amortiguador debido a su suministro propuesto al CNS. Previamente, se han conducido estudios de desarrollo de formulación para desarrollar una formulación intravenosa (IV). Con base en los resultados de estos experimentos, una formulación que contiene 30 mg/ml de rhASA en 10mM de amortiguador de citrato-fosfato, pH 5.5 con 137 mM de NaCI y 0.15% de poloxómero 188 se seleccionó como la formulación líder IV. La rhASA también se formuló para suministro IT en tres formulaciones y los datos de estabilidad para esta proteína se investigaron bajo estas condiciones. Lotes de rhASA derivados de producto de materia corriente arriba en un sitio fueron utilizados. Los resultados demuestran que la rhASA fue estable en 154 mM de solución de cloruro de sodio con 0.005% de polisorbato 20 (P20), pH 6.0 por al menos 18 meses a 2 - 8 grados C. Además, se han realizado estudios para demostrar la estabilidad hacia degradación inducida por agitación y congelación-descongelación.

Lotes de desarrollo se purificaron, ultrafiltraron y diafiltraron (UF/DF) en 10mM de citrato/fosfato, 137mM de NaCI, pH 5.5 con subsecuente UF/DF en solución salina final a una concentración de aproximadamente 40 mg/mL. Las operaciones de UF/DF se resumen en la Tabla 7.

TABLA 7 Formulaciones seleccionadas para operaciones de UF/DF derivadas de Xcellerex rhASA rhASA formulada a 40 mg/mL rhASA en 10mM de citrato fosfato de sodio con 137mM de NaCI, a pH 5.6 se dializó en cinco formulaciones las cuales se utilizaron para estudios de preformulación de IT (Tabla 8).

TABLA 8 Amortiguadores seleccionados para Selección de Formulación Compatible IT Métodos Para determinación de temperatura de fusión (Tm) por Calorimetría de Exploración Diferencias (DSC), se empleó un microcalorímetro DSC capilar (MicroCal) a una velocidad de barrido de 60°C/hr y a un intervalo de temperatura de 10-110°C. Las líneas base de amortiguador fueron sustraídas de los barridos de proteína. Los barridos se normalizaron para la concentración de proteína de cada muestra (medidos por absorbencia ultravioleta a 280 nm y usando un coeficiente de extinción de 0.69 (mg/mL)-1.cm-1 ). Para experimentos de estabilidad a corto plazo inicial, se sometió una sustancia de fármaco de rhASA a ya sea dos semanas a 40°C o un mes a 40°C. Se colocaron muestras adicionales en estabilizad a plazo corto a 2-8 °C por 3 meses. Las muestras se filtraron (Millipore, P/N SLGV033RS) y se dispensaron alícuotas de 0.5 mi en 2 mL con tapones Fluorotec de 13 mm.

El efecto de la composición de formulación (Tabla 8) en la Tm (punto medio de temperatura de la termalmente induce desnaturalización) se investigó usando DSC. Los valores de Tm para las diferentes composiciones de formulación se muestran en la Figura 5. Los valores de TM exhiben temperaturas no desplegadas similares para la mayoría de las formulaciones, excepto donde se observaron valores de Tm bajos para la rhASA formulada en ya sea 5mM de fosfato de sodio con 154mM de NaCI a pH 7.0 ó ImM de fosfato de sodio con 2mM de CaCI2 y 137mM de NaCI a pH 7.0.

El efecto de degradación térmica inducida de rhASA en las cinco formulaciones seleccionadas (Tabla 8) también se investigó. Las muestras fueron almacenadas ya sea por 2 semanas o un mes a 40 °C o por 3 meses a 2-8 °C. El análisis de SDS-PAGE (Coomassie) de las muestras almacenadas por 2 semanas a 40 °C detectó fragmentación de rhASA formulada en 5mM de fosfato de sodio con 154mM de NaCI a pH 7.0 así como también en 1mM de fosfato de sodio con 2mM de CaCI2 y 137m de NaCI a pH 7.0 (Figura 6). No se observó tal degradación para las otras formulaciones.

La presencia de productos de rompimiento es consistente con el porcentaje inferior de pico principal observado por RP-HPLC para los mismos puntos de tiempo (Tabla 0). También se observó que la rhASA formulada en 1 mM de PBS con 2mM de CaC a pH 7.0 no mantiene su pH al comienzo y después de la exposición a corto plazo a condiciones de estrés térmico.

Se usaron sistemas de HPLC Waters para análisis de fase inversa y exclusión de tamaño. Para análisis de SEC-HPLC iniciales, se inyectaron 50 pg de rhASA en una columna Agilent Zorbax GF-250 (4.6mm x 250mm) y corrieron ¡socráticamente a 0.24 mL min usando una fase móvil de 100 mM de citrato de sodio a pH 5.5 (detección de octómero) con una longitud de onda de detección de 280 nm. Los análisis se repitieron usando las condiciones de fase móvil de 100 mM de citrato de sodio, pH 7.0 (detección de dímero).

Todos los estudios de concentración e intercambio de amortiguador se realizaron usando Centricon-Plus 20 (Millipore, 10 kDa MWCO).

Estudios de Selección de Preformulación -Efecto de Especies Amortiguadoras y pH Debido al número limitado de composiciones de solución aprobadas usadas para administración al CNS, solamente cinco composiciones de solución isotónica, como se listan en la Tabla 8, fueron escogidas para la selección.

Memoria de pH Previo a la selección de amortiguadores para estabilidad a largo plazo, se realizaron dos experimentos de "memoria de pH" para investigar si el amortiguador de proteína intercambiado en solución salina fue capaz de mantener el pH del amortiguador original. En el experimento inicial, rhASA a aproximadamente 8 mg/mL, fue primero dializada en 10 mM de citrato-fosfato con 137 mM de NaCI, a ya sea un valor de pH de 5.5 o 7.0, seguido por una segunda diálisis en solución salina. En el segundo experimento, se dializó rhASA en 10 mM de citrato-fosfato con 137 mM de NaCI, a ya sea valores de pH de 5.5 o 7.0 y subsecuentemente se intercambió de amortiguador y concentró en soluciones de salina hasta aproximadamente 35 mg/mL.

Cuando se formuló rhASA en 10 mM de citrato-fosfato con 137 mM de NaCI a ya sea valores de pH de 5.5 o 7.0 se dializó en solución salina, no se observó turbidez incrementada. El pH de la solución salina final fue similar al pH del amortiguador de citrato-fosfato previo al cual se expuso. Cuando se formuló rhASA en amortiguadores a base de citrato-fosfato, a ya sea valores de pH de 5.5 o pH 7.0 fueron dializados en salina y después concentrados hasta aproximadamente 35 mg/mL usando un Centricon, el pH de las soluciones salinas de la proteína cambió de pH 5.5 a 5.8 o de pH 7.0 a 6.8, respectivamente. Ambas soluciones de rhASA concentradas en salina fueron ligeramente opalescentes y tienen valores OD320 en el intervalo de 0.064 (pH 6.8) a 0.080 (pH 5.5).

Selección de Excipiente Se incluyó Polisorbato 20 (P20) en las cinco composiciones de solución seleccionadas a una concentración final de 0.005%. La elección de tensoactivo se hizo con base en la experiencia previa de la tolerabilidad in vivo de P20 a 0.005% para suministro al CNS de otras proteínas Shire. Se preparó una solución de 5% de P20 (v/v) y el volumen apropiado se agregó a cada formulación de proteína para obtener una concentración final de 0.005%.

Estudios de Robustez de Formulación - Estudio de Estabilidad Con base en los resultados iniciales obtenidos de la selección de diferentes amortiguadores y valores de pH, se seleccionaron tres composiciones de solución para estudios de estabilidad a largo plazo (preparación de muestra como en la Tabla 8. Se inició un estudio de un año en las formulaciones propuestas (Tabla 9). Las muestras de estabilidad en cada punto de tiempo se analizaron por SEC-HPLC, RP-HPLC, OD320, concentración de proteína, pH, actividad específica, SDS-PAGE (Coomassie), y apariencia.

TABLA 9 Formulaciones para Estudios de Estabilidad a Largo Plazo TABLA 10 Estabilidad de Formulaciones seleccionadas después de 2 Semanas a 40±2°C No se observó cambio significante en la actividad específica para las muestras de estrés (Tabla 10). El análisis por HPLC de exclusión de tamaño detectó alguna degradación para la muestra térmica estresada de 2 semanas formulada en 5mM de fosfato de sodio con 154mM de NaCI a pH 7.0. La degradación fue más evidente por SEC-HPLC usando una condición de fase móvil a pH 5.5 la cual induce asociación de rhASA a un octámero. Bajo estas condiciones de fase móvil, la rhASA formulada a pH 7.0 en 1mM PBS con 2mM de CaC^ también exhibe degradación significante.

Después de la exposición de 1 mes a 40°C, las muestras formuladas en 5mM de PBS, pH 7.0 y 1m de PBS, pH 7.0 con 2 mM de CaC demostraron fragmentación por SDS-PAGE (datos no mostrados). Consistente con esta observación, también se observó una reducción en el porcentaje de pico principal por RP-HPLC y SEC-HPLC para muestras almacenadas en estas dos formulaciones de pH 7 (Tabla 11). Un decremento en la actividad específica, sin embargo, fue solamente observado para rhASA formulada en 5 mM de PBS, pH 7.0.

TABLA 11 Estabilidad Formulaciones IT Seleccionadas Después de 1 Mes a 40±2°C Después de 3 meses de almacenaje a 2-8°C, la rhASA retiene su actividad en todas las formulaciones (Tabla 12). Adicionalmente, la rhASA mantiene >99.8% de su área pico principal como valorada por SEC-HPLC bajo ambas condiciones de fase móvil. Los datos de estabilidad para 3 meses a 2-8°C se resumen en la Tabla 12.

TABLA 12 Estabilidad Amortiguadores IT Seleccionados después de 3 Meses a 2- Las RhASAs formulada en salina, pH 7.0 y 1 mM de PBS, pH 7.0 con 2 mM de CaCfe también se evaluaron después de 3 meses de almacenaje a la condición acelerada de 25°C. Como se muestra en la figura 7, rhASA sufre una ligera cantidad de fragmentación en estas formulaciones (con intensidad aproximadamente aquella del pico de impureza de BSA al 0.5%).

Colectivamente, los estudios de preformulación demostraron que la estabilidad de rhASA se mantiene a valores de pH en el rango de 5.5 6.0. En todos los estudios usando soluciones de formulación a pH 7.0, rhASA demostró fragmentación como una de sus trayectorias de degradación. Los resultados de estrés térmico obtenidos para la formulación IT candidata a pH 7.0, fueron similares a los resultados de estrés térmico obtenidos para las formulaciones IV (10 mM de citrato de sodio-fosfato con 137 mM de NaCI) a pH 7.0, donde también se observó fragmentación. Con base en estos estudios, tres formulaciones siguientes, como en la Tabla 9, se seleccionaron para estudios de estabilidad a largo plazo.

Estudios de Congelación-Descongelación Se condujeron experimentos de congelación-descongelación realizando tres ciclos de congelación-descongelación controlada, de ambiente a -50°C a 0.1 °C /min en los estantes de un liofilizador Vertís Génesis 35EL. Alícuotas de un mL de sustancia de fármaco formulada a 30 mg/mL en cada una de las cinco composiciones de solución (Tabla 8) se dispensaron en viales de vidrio de 3 mL para este estudio.

Se usó sustancia de fármaco (38± 4 mg/mL) para todos los estudios de congelación-descongelación. Para experimentos de congelación-descongelación en rata controlados de escala pequeña, alícuotas de 2 mL de sustancia de fármaco fueron dispensadas en viales de vidrio de 5 mL con 20 mm de tapones Fluorotect. Los experimentos de estrés por congelación-descongelación se condujeron ya sea en los estantes de un liofilizador Virtis Génesis 35EL o en los estantes de un congelador de velocidad controlada (Tenney Jr Upright Test Chamber, Modelo: TUJR-A-VERV). Se realizaron tres ciclos de congelación a -50°C y descongelación a 25°C a ya sea una velocidad de congelación y descongelación de 0.1 °C /min (usando un congelador de velocidad controlada) o una velocidad de congelación de 0.1 °C /min y velocidad de descongelación de 0.03°G /min (usando liofilizador). Para estudios de congelación-descongelación a volumen, 90 mL de sustancia de fármaco se dispensaron en botellas de policarbonato de 250 mL. Para estudios de congelación-descongelación en hielo seco, 3 mL de sustancia de fármaco se dispensaron en viales de policarbonato de 5 mL (Biotainer P/N 3500-05) con y sin tapa rosca de polipropleno. Las muestras fueron congeladas durante la noche a= -65°C y después colocadas en hielo seco en una cubeta cerrada. Para estos experimentos, los viales de vidrio tapados que contienen el mismo volumen de muestra se usaron como un estudio de control. Para estudios de congelación-descongelación de la sustancia de fármaco diluida, alícuotas de 1 mL de 1 y 5 mg/mL se dispensaron en tubos de polipropileno de 2 mL y se congelaron a= -65°C. Las muestras congeladas fueron subsecuentemente descongeladas en la parte superior del banco. El ciclo se repitió hasta 10 veces para imitar cualquier estrés potencial el cual podría ocurrir con la manipulación de las alícuotas estándares de referencia.

El efecto de congelación-descongelación en la calidad de rhASA en las formulaciones propuestas en 0.005% de P20 se determina después de 3 ciclos de congelación y descongelación a velocidad controlada (0.1°C/min). No se observó cambio en la apariencia de rhASA y se identificaron degradantes y agregados no solubles usando ya sea métodos de SEC o RP-HPLC. Adicionalmente, no se observaron agregación o fragmentación en los análisis de SDS-PAGE reducidos (datos no mostrados). La Tabla 13 resume los resultados de estos estudios.

TABLA 13 Efecto de Congelación-Descongelación a Escala Pequeña en la Calidad de la Sustancia de fármaco de rhASA *No probado Los resultados de los estudios de congelación-descongelación de velocidad controlada a escala menor realizados por triplicado en alícuotas de 2 mL de sustancia de fármaco se resumen en la Tabla 14. No se observó cambio en la calidad de la sustancia de fármaco. La apariencia de la sustancia de fármaco congelada y descongelada fue comparable con la apariencia de la muestra de línea base. No se observó reducción en la concentración de proteína o la pureza del material.

TABLA 14 Efecto de Congelación-Descongelación a Escala Pequeña en la Calidad de la Sustancia de Fármaco de rhASA Todos los experimentos demostraron que rhASA mantiene sus atributos de calidad después de la congelación-descongelación. Se debe notar que se observó una tendencia decreciente pequeña en la actividad y el porcentaje de pico principal de fase inversa para muestras de 1 mg/mL de rhASA después de diez ciclos de congelación-descongelación como se muestra en la Tabla 15.

TABLA 15 Efecto de congelación-descongelación a escala pequeña en sustancia de fármaco rhASA diluida a 1 mg/ml Estudios de Agitación Alícuotas de 1.0 mL de proteína filtrada estéril formulada a 30 mg/mL en cada una de las cinco composiciones de solución seleccionadas (Tabla 8) con P20 se dispensaron en viales de vidrio de 3 mL con tapones Fluorotec de 13 mm. Los viales se colocaron en su lado en un Sacudidor Orbital Labline y se sacudieron por 24 horas a 100 rpm. La sedimentación se incrementó entonces a 200 rpm por las siguientes 24 horas del periodo de sacudimiento.

Para valorar la susceptibilidad de rhASA a agitación, se realizaron estudios de sacudimiento y agitación para tanto sustancia de fármaco como producto de fármaco a concentraciones de 35.4 y 30 mg/mL, respectivamente. Para estos estudios, alícuotas de 1.0 mL de sustancia de fármaco se dispensaron en viales de vidrio de 3 mL con tapones Fluorotec de 13 mm. Los viales agitados se inspeccionaron cada hora por las primeras 8 horas y posteriormente de 24 y 48 horas. Los viales se removieron en el primer signo de turbidez y analizaron. La apariencia de las muestras se documentó y las muestras se sometieron a ensayo usando pH, SEC-HPLC, actividad específica, y OD320. Se condujeron estudios de agitación de producto de fármaco por triplicado (en 154 mM de NaCI, pH 6.0 con 0.005% P20) y compararon con una réplica de la sustancia de fármaco (en 154 mM de NaCI, pH 6.0). También se repitieron estudios de sacudimiento sin inclusión de P20 en formulación de salina. Para estos estudios, alícuotas de ya sea 1 mL ó 3 mL del producto de fármaco a 30 mg/mL se dispensaron en viales de 3 ml_ para investigar el efecto de sacudimiento así como también el volumen de espacio de cabeza en la calidad de rhASA. Para estos estudios de sacudimiento, se usó una velocidad de 220 rpm.

Los estudios de sacudimiento inicial de rhASA para estudios de desarrollo de formulación IV realizados demostraron la ventaja potencial de la presencia de un tensoactivo. Para desarrollo de formulación IT, se seleccionó P20 al 0.005% e incluyó en formulaciones para los estudios de sacudimiento. Después de 15-24 horas of sacudimiento a 100 rpm, no se observaron cambios visuales para cualquiera de las formulaciones y la velocidad de sacudimiento se incrementó a 200 rpm. No se observó cambio en la apariencia de las muestras sacudidas en las formulaciones candidato propuestas después de un total de 48 horas de sacudimiento a 100 y 200 rpm. Las muestras se analizaron después de este periodo y los resultados se resumen en la Tabla 16. No se observaron cambios para cualquiera de los ensayos. El SDS-PAGE de Coomassie también no presentó bandas de peso molecular altas o bajas adicionales para las muestras sacudidas (datos no mostrados).

TABLA 16 Resultados de estudios de sacudimiento de formulaciones seleccionadas *Debido a problemas de columna el perfil de SEC de la forma dimérica, no se obtuvo una fase móvil a pH de 7.0.

"No probado No se observó cambio en la apariencia de sustancia de fármaco (en 154 mM de NaCI a pH 6.0) o producto de fármaco (en 154 mM de NaCI, pH 6.0, con 0.005% P20) para las primeras 4 horas de agitación. Después de 6 horas de agitación, tanto la sustancia de fármaco como producto de fármaco llegaron a ser ligeramente turbios (datos no mostrados). La turbidez fue más pronunciada después de 48 horas de agitación cuando no estuvo presente P20 en la formulación. Adicionalmente, la sustancia de fármaco y producto de fármaco expuesto a sacudimiento llegó a ser turbio después de 24 horas. Las Figuras 8A-8B demuestran las observaciones de agitación después de 48 horas.

La Tabla 17 y Tabla 18 resume las observaciones del estudio de agitación.

TABLA 17 Apariencia de la sustancia de fármaco de rhASA y producto de fá (con p20) después de agitación TABLA 18 Apariencia de la sustancia de fármaco de rhASA y producto de fármaco (con p20) después de sacudimiento Las muestras agitadas también se analizaron por OD320, pH, actividad específica, RP-HPLC, y SEC-HPLC. Los resultados se presentan en la Tabla 19 y Tabla 20. En total, no se observó cambio significante en la calidad de rhASA después de agitación y sacudimiento, con la excepción de la apariencia.

TABLA 19 Efecto de 48 horas of sacudimiento en sustancia de fármaco y producto de fármaco Después de agitar el producto de fármaco después de 6 horas, con 0.005% P20, una de las tres réplicas llegó a ser turbia. Esta muestra se removió y las otras dos muestras se agitaron hasta 48 horas. La Tabla 20 demuestra los datos promediados para muestras duplicadas.

TABLA 20 Efecto de 48 horas de agitación en sustancia de fármaco y producto de fármaco Con base en los resultados y las observaciones visuales, la sustancia de fármaco y producto de fármaco no son fácilmente susceptibles a degradación inducida por agitación puesto que toma ~4 horas de agitación continua (a número de sedimentación 5) y 8 horas de sacudimiento vigoroso continuo (a 220 rpm) para que ocurra un cambio en la apariencia.

Los estudios de sacudimiento se repitieron con producto de fármaco en la ausencia de P20. Para estos estudios, cada vial se llenó con ya sea 1 mL ó 3 mL de producto de fármaco para investigar el efecto de sacudimiento así como también el volumen de espacio de cabeza en la calidad de rhASA. Para 1 mL lleno en viales de 3 mL, no se observó cambio en la apariencia del producto de fármaco a través de 8 horas de sacudimiento a 220 rpm (n=2, datos no mostrados). Los viales sin espacio de cabeza (n=1) demostraron la formación de pequeñas escamas, algunas fibras, y materia floculenta a una velocidad más rápida cuando se compara con los viales en un espacio de cabeza más grande. Las observaciones de 48 horas son presentadas en la Figura 9.

Los resultados visuales también se resumen en la Tabla 21 y Tabla 22.

TABLA 21 Apariencia del producto de fármaco en la ausencia de polisorbato 20 después de 48 horas de sacudimiento con 1 mi lleno en un vial de 3 mi TABLA 22 Apariencia del producto de fármaco en la ausencia de polisorbato 20 después de 48 horas de sacudimiento con 3 mi lleno en vial de 3 mi No se observó cambio en la concentración de proteína. Adicionalmente, no se detectaron agregados solubles usando SEC-HPLC para ya sea los volúmenes llenos de 1 mL ó 3 mL (Tabla 23 y Tabla 24). El ensayo de SDS-PAGE (Coomassie) reducido no se detecta en cualquier banda de peso molecular bajo o alto (datos no mostrados).

TABLA 23 Resultados de 48 horas de sacudimiento en el producto de fármaco en la ausencia de polisorbato 20 con 1 mi lleno en vial de 3 mi TABLA 24 Resultados de 48 horas de sacudimiento en el producto de fármaco en la ausencia de polisorbato 20 con 3 mi Heno en vial de 3 mi Estudios de Capacidad Amortiguadora Para determinación de la capacidad amortiguadora de rhASA, el producto se tituló por triplicado, con ya sea ácido diluto o base diluta. Se colocaron alícuotas de 10 mL de sustancia de fármaco a ya sea 38 ó 30 mg/mL (el último para imitar el producto de fármaco) en un vial de vidrio de 20 mL al cual se agregó barra micro agitadora. Se agregaron alícuotas de 1 pide ácido clorhídrico (HCI) 1N a la solución de proteína, los contenidos se mezclaron y el pH se registró. El experimento continuó con la adición de picos de HCI 1 uL, sin enjuagar la sonda de pH entre las mediciones para evitar cualquier dilución, hasta que se logró un pH aproximado de 5.5. El experimento se realizó por triplicado y 5 mM de amortiguador de fosfato que contiene 150 mM de cloruro de sodio, pH 6.0, se tituló lado por lado para comparación. De manera similar, la sustancia de fármaco a ambas concentraciones se tituló con hidróxido de sodio 1M (NaOH) hasta que se logró un pH final de aproximadamente 6.5. Para investigar la presencia de cualquier fosfato residual en rhASA, la sustancia de fármaco se analizó acoplando inductivamente espectroscopia de masa en plasma (ICP-MS). La capacidad amortiguadora de rhASA diluida en la sustancia de fármaco también se investigó para asegurar que el valor de pH de la solución no cambia después de la dilución de la solución de proteína. Las muestras diluidas que varían de 30 mg/ml hasta 1 mg/mL se prepararon en tubos eppendorf de 1.5 mL y los valores de pH se midieron al comienzo de la dilución y después de una semana de almacenaje a 2-8°C.

Los estudios de titulación de base diluta y ácido diluto demostraron la capacidad amortiguadora adecuada de las soluciones de rhASA. Para estudios de titulación usando HCI, inicialmente la adición de aproximadamente 2 µ?_ de 1 de ácido no alteró el pH de ya sea la sustancia de fármaco o el amortiguador de control. Volúmenes incrementados de ácido, sin embargo, demostraron un decline dramático en el pH del amortiguador comparado con la sustancia de fármaco rhASA. Después de la adición de 13 µ?_ de HCI 19 M, el pH del amortiguador de control fue más de 2 unidades de pH inferior que el pH de la sustancia de fármaco. Una concentración de la sustancia de fármaco de 30 mg/mL también se incluyó en este experimento para imitar la concentración del producto de fármaco. La Figura 10 ilustra la capacidad amortiguadora de la sustancia de fármaco de rhASA comparado con 5 mM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 6.3 con 150 mM de cloruro de sodio cuando se titula con ácido.

La titulación de la sustancia de fármaco de rhASA con hidróxido de sodio demostró resultados relativamente diferentes (Figura 11 ) con respecto a mantener el pH. La velocidad de cambio de pH no difiere sustancialmente entre la sustancia de fármaco y el amortiguador de control.

Con base en los resultados observados, y sin desear ser ligado por cualquier teoría, es probable que la rhASA esté contribuyendo a la capacidad amortiguadora de la solución puesto que las cadenas laterales de ácido aspártico, ácido glutámico, e histidina tienen la capacidad para actuar como aceptores/donadores de protones para mantener el pH de la solución.

La capacidad amortiguadora de esta proteína también se observó previamente durante los estudios de preformulación cuando se descubrió el efecto de "memoria de pH". La retención del pH ha sido demostrada varias veces tanto en operaciones a la escala de laboratorio como a gran escala. Colectivamente, los resultados de estos dos experimentos sugieren que la capacidad amortiguadora de rhASA en salina es más predominante en la dirección acídica. De conformidad con la literatura, la capacidad amortiguadora para los valores de pH inferiores es una indicación directa de números más grandes de residuos de ácido aspártico y ácido glutámico dentro de una proteína dada comparado con los residuos de histidina. Mientras no se desee ligar por cualquier teoría, este puede sin embargo ser el caso para arilsulfatasa A donde existen un total de 45 residuos de ácido glutámico así como también aspártico, comparado con 18 residuos de histidina.

La capacidad amortiguadora de sustancia de fármaco también puede ser atribuible al fosfato de unión residual el cual se mostró por estar presente en la sustancia de fármaco usando ICP-MS. La Tabla 25 demuestra la cantidad de fosfato residual presente en tres diferentes lotes de sustancia de fármaco LSDL. Estos datos también confirman la consistencia de las etapas de ultrafiltración y diafiltración para el proceso a escala piloto.

TABLA 25 Cantidad residual de Fosfato en la sustancia de fármaco Producida en LSDL Para entender además la capacidad amortiguadora de esta proteína, también se investigó el efecto de dilución en pH. Después de la dilución de la sustancia de fármaco de rhASA con salina a concentraciones inferiores de proteína, no se observó cambio los valores de pH de la sustancia de fármaco. Subsecuentemente, las sustancias de fármaco diluidas fueron almacenadas a 2-8°C por una semana, después de lo cual se registraron las mediciones de pH. La Tala 26 resume los datos. Los resultados demuestran que la dilución y almacenamiento a 2-8°C no tienen efecto en los valores de pH de la sustancia de fármaco diluida. Estas sustancias además soportan la conclusión de los estudios de titulación de ácido y base los cuales demostraron adecuada capacidad amortiguadora de la sustancia de fármaco de rhASA formulado en salina.

TABLA 26 Valores de ph de la sustancia de fármaco rhASA diluida Durante la dilución de rhASA y pH, se observó que la apariencia de muestras diluidas demostraron un decremento de concentración dependiente en opalescencia, es decir muestras de rhASA con concentraciones superiores fueron más opalescentes comparadas con las muestras a concentraciones inferiores las cuales tienen una apariencia casi más clara. La Figura 12 exhibe la apariencia observada de rhASA diluida. Los 1 mg/mL de solución de rhASA demostraron una apariencia similar al agua mientras que con 30 mg/mL la apariencia fue valorada por estar entre ya sea las suspensiones de referencia II y III o III y IV.

Estudios de Patentabilidad Para estudios de patentabilidad, se formuló la sustancia de fármaco a 38±4 mg/mL en 154 mM de NaCI, pH 6.0 y el producto de fármaco se formuló a 30±3 mg/mL en 154 mM de NaCI, pH 6.0 en la presencia y ausencia de 0.005% de polisorbato 20. Alícuotas de 1 mL de sustancia de fármaco se dispensaron en botellas de policarbonato de 5 mL con cierres de rosca de polipropileno y almacenaron de < -65°C, -15°C a -25°C, y 2-8°C. Alícuotas de 1.0 a 1.1 mL de producto de fármaco se dispensaron en viales de vidrio de 3 mL con tapones Fluortec de 13 mm y almacenaron a 2-8°C, 25±2°C, y 40±2°C. Los viales de producto de fármaco se almacenaron en la orientación vertical para estudios de estabilidad inicial y cambiaron a la orientación invertida para los últimos estudios usando un producto de fármaco sin P20. En cada punto de tiempo, las muestras de estabilidad se probaron por SEC-HPLC, RP-HPLC, OD320, concentración de proteínas, pH, actividad específica, SDS-PAGÉ (Coomassie), y apariencia. El mapeo peptídico, mapeo de glicano y porcentaje de formilglicina se realizaron anualmente. Adicionalmente, los últimos ensayos también se realizaron para las condiciones acelerada y estresada.

Colectivamente, los estudios de resultados de preformulación, congelación-descongelación, y agitación sugieren que solamente tres formulaciones fueron adecuadas para desarrollo adicional. Se iniciaron estudios de estabilidad a largo plazo en estas tres formulaciones en la presencia de 0.005% de P20. La Tabla 27, Tabla 28, y Tabla 29 resumen los datos de estabilidad para tres formulaciones en puntos de tiempo seleccionados.

TABLA 27 Estabilidad a largo plazo para rhASA en 154 mm de nací, ph 5.9 TABLA 28 Estabilidad a largo plazo a 2-8°c para rhASA en 154 mm de nací, ph 7.0 TABLA 29 Estabilidad a largo plazo a 2-8°C para rhASA en 5 mm de amortiguador de fosfato con 145 mm de NaCI. ph 6.0 Estudios de estabilidad, realizados por hasta 11 meses a 2-8°C, sugieren que la calidad de rhASA se mantiene en las formulaciones de prototipo. Los perfiles de HPLC de exclusión de tamaño representativo de rhASA en salina, pH 5.9 se muestran en las Figuras 13 y 14. La HPLC de exclusión de tamaño no detectó algunos cambios significantes en el estado de asociación de rhASA después de 1 1 meses de almacenaje a 2-8°C.

En total, la calidad del producto de fármaco en tres formulaciones candidatas se mantuvo después de 11 meses de almacenaje a 2-8°C.

EJEMPLO 4 Toxicoloqía Este ejemplo ilustra la administración intratecal (IT) de dosis repetidas de rhASA desde una perspectiva farmacológica de la toxicología y la seguridad durante un periodo de seis meses. El artículo de prueba de IT para estudio fue la rhASA. Treinta y seis monos cinomólogos machos y 36 hebras se asignaron al azar a cinco grupos de tratamiento. Los animales del Grupo 1 fueron el control para el dispositivo de control sin tratamiento (puerto y catéter) y no fueron dosificados con el vehículo o el artículo de prueba; sin embargo, estos animales se dosificaron con 0.6 mL de PBS en un programa que corresponde al programa de dosificación del artículo de prueba. Los animales en los Grupos 2-5 recibieron 0.6 mL de infusión IT de 0, 3, 10 ó 31 mg/mL de rhASA (dosis total de 0, 1.8, 6.0, ó 18.6 mg) cada tercer semana (es decir, un total de 12 dosis). Los animales se sacrificaron a los 6 meses (24 horas después de la última dosis IT), y los 4 animales/sexo/grupos se sacrificaron al final de un periodo de recuperación de 4 semanas. Se recolectaron los tejidos seleccionados, se guardaron y se examinaron microscópicamente.

En general, los cambios relacionados con el artículo de prueba podrían ser clasificados en dos tipos principales, y se presentaron a todos los niveles de dosificación (1.8, 6.0 y 18.6 mg/dosis). El aumento de las infiltraciones (de glóbulos blancos, usualmente con componentes eosinofílicos prominentes) en las meninges, el parénquima del cerebro, el parénquima de la médula espinal, los ganglios trigeminales, y ocasionalmente las raíces/ganglios de los nervios espinales (o el epineurio que rodea esas estructuras). Sin desear ser ligado por teoría, este aumento se interpretó como debido a la presencia del artículo de prueba (una proteína) en el espacio intratecal y en los tejidos del sistema nervioso. Pequeño aumento focal de las células microgliales en la médula espinal y/o el cerebro en animales ocasionales (no se observó la microgliosis en los animales de ninguna dosis alta). Sin desear ser ligado por cualquier teoría, ambas categorías de cambios morfológicos se interpretaron como una respuesta a la presencia del artículo de prueba. No hubo evidencia de necrosis neuronal en ningún animal. Ninguno dé los cambios relacionados con el artículo de prueba se relacionó con ninguna de las reacciones biológicas adversas en el cerebro, la médula espinal, las raíces o los ganglios de los nervios espinales. Específicamente, no hubo evidencia de necrosis neuronal o una respuesta glial biológicamente importante. No hubo lesiones relacionadas con el artículo de prueba en los tejidos de los sistemas no nerviosos.

Enseguida de un periodo de recuperación de un mes (un periodo sin dosificación), los cambios relacionados con el artículo de prueba habían sido completamente resueltos o estuvieron limitados a remanentes del aumento previo en ia respuesta inflamatoria asociada con la presencia del artículo de prueba. No hubo efectos morfológicos adversos en los animales en recuperación. Con base en un examen microscópico a ciegas, que asigna una puntuación de teñido semi-cuantitativo, el teñido inmunohistoquímico para la Arilsulfatasa A (rhASA; el artículo de prueba) se incrementó en el cerebro y la médula espinal en varios tipos de células, excepto para las neuromas, para todos los grupos tratados con el artículo de prueba en el sacrificio terminal. Este aumento también fue aparente en las células de Kupffer del hígado. Enseguida del periodo de recuperación de 1 mes, el teñido de la rhASA en los animales tratados con el artículo de prueba (todos los grupos de dosificación) había regresado a los niveles de control (el control de dispositivo y/o de vehículo). En un macho en recuperación de dosis baja, hubo múltiples focos de astrocitosis y pérdida neuronal, lo que indica múltiples áreas de isquemia previa, en la corteza cerebral. Aunque la patogénesis exacta de estas lesiones en este animal no fue aparente, la carencia de lesiones similares en todos los otros animales tratados con el artículo de prueba, incluyendo los animales de dosis altas que recibieron 10X la dosis, indica que estas lesiones no estuvieron relacionadas con el artículo de prueba.

El artículo de prueba de IT para este estudio fue la rhASA. Treinta y seis monos cinomólogos machos y 36 hembras se asignaron al azar a cinco grupos de tratamiento. Los animales en el Grupo 1 fueron controles del dispositivo de implante no tratados (puerto y catéter) y no fueron dosificados con el vehículo o el artículo de prueba; sin embargo, estos animales fueron dosificados con 0.6 ml_ de PBS en un programa similar al programa de dosificación del articulo de prueba. Los animales en los Grupos 2-5 recibieron 0.6 mL de infusión IT de 0, 3, 10 ó 31 mg/mL de rhASA (dosis total de 0, 1.8, 6.0, ó 18.6 mg) cada tercer semana (es decir, un total de 12 dosis). Los animales se sacrificaron a los 6 meses (24 horas después de la última dosis IT), y los 4 animales/sexo/grupo se sacrificaron al final de un periodo de recuperación de 4 semanas. Se recolectaron los tejidos seleccionados, se guardaron y se examinaron microscópicamente. La tabla siguiente refleja el diseño del estudio como perteneciente a los aspectos patológicos de este estudio.

En el momento del sacrificio, el cerebro se cortó en una matriz del cerebro a rebanadas coronales de 3 mm de espesor. La primera rebanada y cada segunda rebanada se fijaron en formalina para su evaluación histopatológica y el análisis inmunohistoquímico. El cerebro se proceso como secciones coronales completas. Estas secciones incluían como mínimo las siguientes regiones del cerebro.

• Neocorteza (incluyendo la corteza frontal, parietal, temporal y occipital): las secciones del cerebro 1 a 8 (y la rebanada 9 cuando está presente) · Paleocorteza (bulbos olfativos y/o lóbulo piriforme): secciones del cerebro 1 a 3 • Ganglio basal (incluyendo la cauda y el putamen): secciones del cerebro 3 y 4 • Sistema límbico (incluyendo el hipocampo y la circunvolución del cuerpo calloso): secciones del cerebro 4 y 4 • Tálamo/hipotálamo y las regiones del cerebro medio incluyendo la sustancia negra: secciones del cerebro 4 y 5 · Cerebelo, puente troncoencefálico, bulbo raquídeo: secciones del cerebro 6 a 8 (y rebanada 9 cuando está presente).

Las secciones del cerebro se listan en las tablas de datos como las secciones 1 a 8/9 (una sección 9 se proporciona para facilitar la evaluación para algunos animales). El seccionamiento varía ligeramente entre los animales. Las secciones del cerebro (1 a 8/9) proporcionadas arriba fueron la posición aproximada de las varias áreas anatómicas. Las secciones del cerebro se listan en las tablas de datos como secciones individuales, con los diagnósticos pertinentes a esa sección, para facilitar la revisión adicional futura, potencial de las rebanadas (si hay alguna). Durante la interpretación de los datos, los sitios anatómicos individuales del cerebro (como se listan arriba) se compararon con el fin de identificar cualquier efecto único el artículo (es decir, único para una región particular del cerebro). En TPS, todas las secciones del cerebro de todos los animales se sumergieron en parafina, se seccionaron a 5 mieras, se tiñeron con hematoxilina y eosina (HyE) y se examinaron microscópicamente. Además, los cerebros de los animales de control de dosis altas se tiñeron con Fluoro-Jade B (un tinte que aumenta la sensibilidad para la evaluación del cerebro para la degeneración neuronal) y un tinta plata de Bielschowsky (un procedimiento que permite la visualización directa de los axones, las dendritas, y los filamentos neuronales) y se examinaron.

La médula espinal (cervical, torácica y lumbar) se cortó en secciones de un centímetro. La primera sección y las otras secciones posteriores se fijaron en formalina para su evaluación histopatológica y el análisis inmunohistoquímico. Las secciones de la médula espinal (cervical, torácica (incluyendo la punta el catéter) y lumbar) de todos los animales, se cortó en secciones de aproximadamente 5 micrones, se tiñeron con HyE y se examinaron con secciones transversales y oblicuas tomadas en cada nivel. Las secciones de la médula espinal de los grupos de control y de dosis altas se tiñeron adicionalmente con tinte plata de Bieischowsky y anti-GFAP (un tinte inmunohistoquímico que permite la visualización directa de los atrocitos y sus procesos).

Las raíces de los nervios espinales y los ganglios (tomados a la mitad de la longitud cervical, la mitad de la longitud torácica y I mitad de la longitud lumbar) se sumergieron en parafina, con secciones seriales teñidas con HyE. Además, las secciones seriales de los grupos de control y de dosis alta se tiñeron con tinte plateado de Bieischowsky.

Para las secciones de los nervios ciático, de la tibia y sural de todos los animales: Una sección longitudinal de cada nervio se sumergió en parafina, se cortó en secciones de aproximadamente 5 mieras y se tiñó con HyE. Una sección transversal de cada nervio se fijó posteriormente en osmio, se sumergió en resina de Spurr, se cortó en secciones de aproximadamente 1 a 2 mieras y se tiñó con azul de toluidina. La fijación posterior en osmio y la inmersión en resina proporciona una preservación superior de la mielina en los nervios periféricos y por lo tanto un examen más detallado de los nervios.

Todos los tejidos recolectados y las lesiones grandes recolectadas durante la necropsia de todos los animales también se sumergieron en parafina, se tiñeron con HyE y se examinaron microscópicamente. El procesamiento histopatológico y los análisis ¡nmunohistoquímicos se llevaron a cabo por TPS.

Teñido con Arilsulfatasa A (rhASA) Las rebanadas de control positivo se suministraron por el patrocinador del estudio. Las rebanadas fueron secciones del hígado de ratones inyectados con rhASA. Todas las muestras de control positivo mostraron amplias evidencias de rhASA en las células de Kupffer (macrofagos sinusoidales) en el hígado. Las rebanadas de control positivo se almacenaron con las otras rebanadas de este estudio. Todas las evaluaciones de las secciones teñidas con rhASA se llevaron a cabo inicialmente cegando al grupo de tratamiento de los animales. Esto se logró haciendo que los patólogos leyeran inicialmente las rebanadas teñidas con rhASA con el número del animal en la etiqueta oscurecido (por un asistente con conocimiento del animal actual que está siendo evaluado), dictando la puntuación (grado de severidad) durante la evaluación, y haciendo que el mismo asistente registre inmediatamente la puntuación del teñido (grado de severidad) en las tablas de datos. La ID del animal se verificó entonces tanto por el neuropatólogo del estudio y el asistente para garantizar el registro preciso de los datos. Este procedimiento se llevó a cabo para no introducir ningún sesgo en el juicio de la intensidad global del teñido con el teñido inmunohistoquímico para la detección de la rhASA intracelular. El grado relativo de teñido de las neuronas, los macrófagos meníngeos, los macrófagos perivasculares, y las células gliales (astrocitos y células microgliales pero probablemente predominantemente las células microgliales) se calificaron en todas las secciones del cerebro y la médula espinal. Las puntuaciones promedio de la severidad en cada nivel del cerebro y la médula espinal para cada grupo se totalizaron (por grupo) y se registraron como un total bajo el Titulo de Cerebro, General, Teñido con rhASA y Médula Espinal, General, Teñido con rhASA.

En general, el teñido con rhASA en las neuronas del cerebro fue una medida de las neuronas en la corteza cerebral y otras áreas nucleares en el cerebro. El teñido con rhASA en los macrófagos meníngeos fue evidencia de la asimilación del artículo de prueba por los macrófagos meníngeos y/o la rhASA endógena en los macrófagos meníngeos. El teñido por rhASA en los macrófagos perivasculares fue una medida de la asimilación de la rhASA por los macrófagos en el cerebro/médula espinal (o la rhASA endógena), aunque se debe otra que el espacio perivascular en el cerebro y la médula espinal (el espacio de Virchow-Robins) es continuo con las meninges. En general, la calificación del teñido con rhASA en las células gliales fue predominantemente una medición de la asimilación del artículo de prueba/penetración del artículo de prueba en la materia gros y/o blanca, en especial de la corteza cerebral (la corona radiata es la materia blanca debajo de la corteza cerebral). El teñido por rhASA en la materia blanca parece estar en los astrocitos y las células microgliales.

El siguiente esquema de calificación se uso para calificar el grado de teñido por rhASA de los varios tipos de células (neuronas, células gliales, macrófagos).

Explicación de la Calificación (% de las células posibles teñidas) 1 Menos del 10% 2 Más del 10 a 25% 3 Más del 25 a 50% 4 Más de 50 a 75% 5 Más del 75% Nótese que este esquema no es estrictamente cuantitativo. Este se uso como un método semicuantitativo eficiente pare avaluar el cerebro y la médula espinal en cuanto al grado de teñido con rhASA. El Neuropatólogo del Estudio notó que no todas las áreas neuronales tenían un teñido de rhASA igual. También se notó que hubo teñido neuronal endógeno en algunos animales de control y que las células del plexo coroideo y las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal tienden a teñirse intensamente para la rhASA aun en los animales de control. El teñido del plexo coroideo y los ganglios de la raíz dorsal no se calificaron pero el neuropatólogo del estudio notó que eran prominentes, aun en los animales de control.

Nota: Todos los grupos de dosificación: Dosis Baja =1.8 mg/dosis; Dosis media = 6.0 mg/dosis¡ Dosis alta=18.6 mg/dosis. No hubieron lesiones relacionadas con el artículo de prueba en los tejidos distintos al sistema nervioso, excepto para el teñido por rhASA aumentada en el hígado de todos los grupos de dosificación (machos y hembras; véase a continuación).

Animales de Sacrificio Terminal (6 meses de dosificación EOW): Secciones Teñidas con rhASA No hubo un incremento del teñido de rhASA en los siguientes tipos de tejidos/células. Cuando se considera un efecto del artículo de prueba sobre el grado de teñido de rhASA en un tipo particular de células en un grupo de dosificación particular, los niveles de teñido en el control de vehículo concurrente y el control del dispositivo (sacrificados con los animales de sacrifico de recuperación) se conservaron para comparación.

Cerebro, Meninges, Macrófagos (todos los grupos de dosificación, machos y hembras) · Cerebro, Perivascular, Macrófagos (todos los grupos de dosificación, machos y hembras) • Cerebro, Células Gliales (todos los grupos de dosificación, machos y hembras) • Médula espinal, Meninges, Macrófagos (todos los grupos de dosificación, machos y hembras) • Médula Espinal, Perivascular, Macrófagos (todos los grupos de dosificación, mechos y hembras) · Médula Espinal, Células Gliales (dosis media y alta machos y hembras) • Hígado, Células de Kupffer (todos los grupos de dosificación, machos y hembras) Debido al teñido endógeno, los niveles de teñido de rhASA en las neuronas del cerebro y la médula espinal fueron los más difíciles de definir específicamente. El teñido de rhASA demostró niveles consistentemente crecientes de rhASA en los macrófagos meníngeos y del cerebro/médula espinal y también dentro de las células gliales. No hubo diferencias detectables del teñido de rhASA en las neuronas entre los animales de control y tratados con el artículo de prueba.

Animales de Sacrificio de Recuperación (6 meses de dosificación EOW seguido por 1 mes sin dosificación) En general, los cambios relacionados con el artículo de prueba se resolvieron totalmente o bien fueron disminuidos en aquellos animales a los que se les permitió un periodo de un mes sin dosificación antes de la necropsia. Los siguientes cambios microscópicos de presentaron con una incidencia y/o severidad que indicó una posible relación con el artículo de prueba.

Cambios Microscópicos Relacionados con el Artículo de Prueba (Recuperación de los Animales) • Cerebro, Meninges, Infiltrados (grupos de dosificación media y alta, ambos sexos)(Figura 16 y Figura 17) • Cerebro, Meninges, Infiltrados, % de Eosinófilos (machos de dosis media; hembras de dosis alta) • Cerebro, Perivascular, Infiltrados (machos de dosis media; hembras de dosis alta) (Figura 18) · Cerebro, Perivascular, Infiltrados, % de Eosinófilos (mechos de dosis media; Hembras de dosis alta) • Cerebro, Materia Gris, Infiltrados (todos los grupos de dosificación, ambos sexos) • Cerebro, Infiltrados de la Materia Gris, % de Eosinófilos (machos de dosis baja) • Cerebro, Materia Gris, Eosinófilos, Necrosis (machos de dosis baja) • Médula Espinal, Meninges, Infiltrados (machos de dosis media y alta; Hembras de dosis baja y alta) · Médula Espinal, Meninges, Infiltrados, % de Eosinófilos (machos de dosis media; hembras de dosis baja) • Médula Espinal, Materia Gris, Infiltrados (hembras dosis baja) • Médula Espinal, Materia Gris, Infiltrados, % de Eosinófilos (hembras dos se baja) • Ganglios y Raíces de la Raíz Dorsal, Epineurio, Infiltrados (hembras dosis media) • Raíces y Ganglios del Nervio Espinal, Infiltrados, Eosinófilos (machos de dosis media y alta; hembras de todas las dosis) • Ganglio del Trigémino, Infiltrados, Eosinófilos (machos y hembras de dosis media) Todos estos cambios se interpretaron remanentes de los cambios inflamatorios aumentados notados en los animales de sacrifico terminales. Como en los animales del sacrifico terminales, no hubo evidencia de que el aumento de los infiltrados de células inflamatorias aun presentes en algunos animales en recuperación representa los cambios morfológicos que podrían provocar cualquier efecto adverso. No hubo lesiones relacionadas con el artículo de prueba en los tejidos ajenos al sistema nervioso.

Animales de Sacrificio de Recuperación (6 meses de dosificación EOW seguido por 1 mes sin dosificación): Teñido con rhASA No hubo indicación de teñido de rhASA aumentada en los machos o las hembras en recuperación, en comparación con los controles de dispositivo y/o de vehículo. En el cerebro de los machos en recuperación con dosis baja, media y alta, hubo realmente una indicación de teñido de rhASA reducida en algunos tipos de células, (esto varía entre los grupos de tratamiento) en comparación con los controles de dispositivo y/o de vehículo.

La razón para esto, incluyendo si este fue un efecto real, no fue aparente. Una posible explicación seria que la administración de rhASA exógena puede provocar alguna reducción en la producción de rhASA endógena. No se presentó un descubrimiento similar en la médula espinal de los machos. En los machos y las hembras en recuperación, la teñido en el hígado fue similar a aquella notada en los controles.

En general, los cambios relacionados con el artículo de prueba podrían ser clasificados en dos tipos principales y se presentaron en todos los niveles de dosificación (1.8, 6.0 y 18.6 mg/dosis).

El aumento de los infiltrados (de glóbulos blandos, usualmente con un componente eosinofílico prominente) en la meninges, el parénquima del cerebro, el parénquima de la médula espinal, el ganglio del trigémino, y ocasionalmente las raíces/ganglios del nervio espinal (o el epineurio que rodea esas estructuras) este aumento se interpretó como debido a la presencia del artículo de prueba (una proteína) en el espacio intratecal y en los tejidos el sistema nervioso.

Un pequeño aumento focal de las células microgliales en la médula espinal y el cerebro en animales ocasionales (no se observó microgliosis en los animales de ninguna dosis). Ambas categorías de cambios morfológicos de interpretaron como una respuesta a la presencia el artículo de prueba. No hubo evidencia de necrosis neuronal en ningún animal. Ninguno de los cambios relacionados con el artículo de prueba se relacionó con ninguna reacción biológicamente adversa en el cerebro, la médula espinal, las raíces o los ganglios del nervio espinal. Específicamente, no hubo evidencia de necrosis neuronal o respuesta glial biológicamente importante. No hubo lesiones relacionadas con el artículo de prueba en los tejidos ajenos al sistema nervioso. Enseguida de un periodo de recuperación de un mes (un periodo sin dosificación), los cambios relacionados con el artículo de prueba habían sido resueltos completamente o se limitaban a remanentes del aumento previo en la respuesta inflamatoria asociada con la presencia del artículo de prueba. No hubo efectos morfológicos adversos en los animales en recuperación.

Con base en un examen microscopio a ciegas que asigna una calificación de teñido semicuantitativa, la teñido inmunohistoquímica para la Arilsulfatasa A (rhASA; el artículo de prueba) se aumento en el cerebro y la médula espinal en varios tipos de células, excepto las neuronas, para todos los grupos tratados con el artículo de prueba. Este aumento también fue aparente en las células de Kupffer del hígado. Enseguida del periodo de recuperación de un mes, la teñido de rhASA en los animales tratados con el artículo de prueba (todos los grupos de dosificación) había regresado a los niveles de control (control de dispositivo y/o de vehículo). En un macho en recuperación a dosis baja, hubo múltiples focos de astrocitosis y pérdida neuronal, indicando múltiples áreas de isquemia previa, en la corteza cerebral. Aunque la patogénesis precisa de estas lesiones en ese animal no fue aparente, la carencia de lesiones similares en todos los otros animales tratados con el artículo de prueba, incluyendo los animales de dosis alta, que recibieron 10X la dosis, indica que estas lesiones no estaban relacionadas con el artículo de prueba. Basado estrictamente en los descubrimientos brutos y microscópicos (en las secciones sumergidas en parafina, y teñidas con hematoxilina y eosina) de este estudio, el nivel en el que no se observaron efectos adversos (NOAEL) fue de 18.6 mg.

EJEMPLO 5 Datos de farmacocinéticas Datos de los Animales de 6 Meses Este ejemplo proporciona el análisis interpretativo para concentraciones en el suero y el CSF de la rhASA y los anticuerpos de suero anti rhASA de Northern Biomedical Research, Inc.

El objetivo del ejemplo fue evaluar la administración intrateca! (IT) de dosis repetidas de rhASA desde una perspectiva farmacológica de la toxicología y la seguridad en monos cinomólogos juveniles (<12 meses de edad). Se administró un total de 12 dosis en un periodo de seis meses. Los animales se sacrificaron 24 horas o un mes después de la última dosis. El diseño dei estudio se muestra en la Tabla 30.

TABLA 30 Diseño del Estudio iNO. ae No. de animales, Concentración Animales, Número Dosis Sacrifico Nominal de la Sacrificio de Administrada después de Dosis después Animales 1 Mes de (mg/mL) (mg) de 6 Recuperaci meses ón 1 4M, 4F DC 0 - 4M, 4F 2 8M, 8F 0 0 4M, 3Fa 4 , 4F 3 8M, 8F 3 1.8 4M. 4F 4M, 4F 4 8M, 8F 10 6.0 4M. 4F 4M, 4F 5 8M, 8F 31 18.6 4M, 4F 4 , 4F DC= Control de Dispositivo; animales en el Grupo 1 no fueron dosificados con el artículo de prueba. aEI animal de Control de Vehículo No. 044 se sacrificó primero el Día 50 debido a un catéter faltante Métodos de Ensayo- Análisis de los Anticuerpos La cuantificación de los anticuerpos anti-rhASA en el suero y el CSF de los monos cinomólogos se llevó a cabo usando y método validado. En resumen, el ensayo comienza bloqueando una placa revestida con estreptavidina de MSD, seguido por incubación con rhASA etiquetada con biotina. Después de una etapa de lavado, las muestras diluidas, los calibradores y los QCs se agregan a la placa y se incuban. Después de la etapa de lavado adicional, el fármaco etiquetado con SULFO TAG se agregó y se incubó. Se llevó a cabo una etapa final de lavado y se agregó amortiguador de lectura MSD. Las placas se leyeron inmediatamente. Los datos de la señal en unidades de luminiscencia relativa (RLU) se analizaron usando plantillas SOFTMax Pro.

Concentración en Suero y CSF La cuantificación de la rhASA en el suero y el CSF de monos cinomólogos se llevó a cabo usando un método validado. El método se basa en la tecnología del Ensayo Inmunosorbente Enlazado a una Enzima (ELISA). En pocas palabras, una placa de microtitulación se reviste con un anticuerpo policlonal de conejo (SH040) construido contra la Arilsulfatasa A (ASA). Después de la incubación con los estándares de referencia de ASA y las muestras de prueba, la proteína con ASA enlazada se detecta mediante el anticuerpo monoclonal anti-ASA (clon 19-16-3) conjugado a peroxidasa de rábano (HRP). La placa se incuba entonces con un sustrato para HRP, peroxidasa TMB. Esta reacción de enzima-sustrato se detiene mediante la adición de ácido sulfúrico 2N (H2SO4) y la absorbancia de cada pozo se midió a la longitud de absorbancia de 450 nm con una longitud de referencia de 655 nm. Las concentraciones de la ASA en las muestras se calculan usando la curva de calibración de rhASA en la misma placa.

El resumen de las concentraciones en el suero de la rhASA, concentraciones en el CSF de la rhASA, concentraciones de anticuerpo anti-rhASA en el suero y concentraciones del anticuerpo anti-rhASA en el CSF e incidencia de los anticuerpos por grupo y sexo se presentan en las Tablas 33-39.

TABLA 33 Resumen de la Concentración de rhASA en el Suero, en Monos Cinomólogos TABLA 33(CONTINUACIÓN) Resumen de la Concentración de rhASA en l Suero, en Monos Cinomólogos TABLA 33ÍCONTINUACIÓN) Resumen de la Concentración de rhASA en el Suero, en Monos Cinomólo os TABLA 34 Resumen de la Concentración de rhASA en el CSF, en Monos Cinomóloqos TABLA 34ÍCONTINUACIÓN) Resumen de las Concentración en el CSF, en Monos Cinomóloqos TABLA 34(CONTINUACIÓN) Resumen de la Concentración en el CSF, en Monos Cinomóloqos TABLA 35 Resumen de la Concentración de Anticuerpo Anti-rhASA en el Suero TABLA 35(CONTINUACIÓN) Resumen de la Concentración de Anticuerpo Anti-rhASA en el Suero TABLA 36 Resumen de la Concentración del Anticuerpo Anti-rhASA en el CSF TABLA 36 (CONTINUACIÓN) Resumen de la Concentración del Anticuerpo Anti-rhASA en el CSF TABLA 37 Concentraciones de rhASA en el Suero y el CSF. Machos y Hembras Combinados (ng/mü TABLA 37 (CONTINUACIÓN) Concentraciones de rhASA en el Suero y el CSF, Machos y Hembras Combinados (ng/mL) TABLA 37 (CONTINUACIÓN) Concentraciones de rhASA en el Suero y el CSF. Machos y Hembras Combinados (ng/mL) TABLA 38 Anticuerpo Anti-rhASA en el Suero y el CSF. Machos y Hembras Combinados (ng/mL) TABLA 38 (CONTINUACIÓN) Anticuerpo Anti-rhASA en el Suero y el CSF. Machos v Hembras Combinados (ng/mL) TABLA 38 (CONTINUACIÓN) Anticuerpo Anti-rhASA en el Suero y el CSF. Machos y Hembras Combinados (ng/mL) TABLA 39 Incidencia de los Anticuerpos Anti-rhASA después de la Necropsia El límite de cuantificación para la rhASA en el suero de monos cinomólogos es de 39.1 ng/mL, y todas las muestras de suero de los Grupos 1 y 2 estuvieron debajo del límite de cuantificación (BQL), véase la Tabla 33. Los niveles en suero de la rhASA se evaluaron antes y a las 24 horas después de las Dosis 2, 4, 6, 8, 10, y 12 (necropsia después de 6 meses), a la mitad de periodo de recuperación, y antes de la necropsia después de la recuperación. Los niveles de rhASA fueron indetectables en el Grupo 3 (1.8 mg/dosis), Grupo 4 (6.0 mg/dosis), y Grupo 5 (18.6 mg/dosis) antes de las Dosis 2, 4, 6, 8, 10, y 12. Después de la Dosis 12, a la mitad del periodo de recuperación, y antes de la necropsia después de la recuperación. Después de la Dosis 2, los niveles de rhASA en el suero estaban relacionados con la dosis. Después de la Dosis 4 (Grupo 3), la Dosis 6 (Grupos 3 y 4), y las Dosis 8 y 10 (machos de los Grupos 3 y 4 el Grupo 5), los niveles de rhASA fueron indetectables. Los niveles de suero de la rhASA declinaron en el Grupo 4 (6.0 mg/dosis) después de la Dosis 4 y en el Grupo 5 (18.6 mg/dosis) después de las Dosis 4 y 6 para los machos y las dosis 4, 6, 8 y 10 para las hembras. Esta declinación aparente en los niveles del rhASA del suero puede estar relacionada con la concentración creciente de anticuerpos anti-rhASA. No hay diferencias aparentes por sexo en los niveles en suero de la rhASA, dada la variabilidad de las muestras y los números de grupos pequeños en este estudio.

El límite de cuantificación para la rhASA en el CSF de monos cinomólogos es de 19.5 ng/mL, y todas las muestras de CSF de los Grupos 1 y 2 estaban BQL, véase la Tabla 34. La rhASA fue detectable en el CSF antes y después de las Dosis 2, 4, 6, 8, 10, y 12 (necropsia después de 6 meses) en todos los grupos dosificados. Estos niveles fueron más altos después de la dosis (aproximadamente 24 horas después de la dosis) y no estaban relacionados con la dosis. Los niveles en el CSF fueron mucho mayores que aquellos en el suero. No hubo diferencias aparentes por sexo en los niévales de rhASA en el CSF, dada la variabilidad de las muestras y los números de grupos pequeños en este estudio. La rhASA no fue detectable a mitad del periodo de recuperación y antes de la necropsia después del periodo de recuperación en todos los grupos de dosificación. Los niveles en CSF para las recolecciones de la Dosis 12 (necropsia) para los grupos tratados con rhASA fueron menores que los niveles posteriores a la dosis 8 y 11. Las razones potenciales para los niveles de rhASA más bajos durante la necropsia incluyen el mayor volumen tomado (~2.25 mL en total para los conteos de células, química, rhASA y anticuerpo anti-rhASA) durante la necropsia vs aquel tomado en el intervalo de dosificación in vivo (hasta 0.5 mL antes o después de la dosis para la concentración de la rhASA). Adicionalmente algunos animales no tenían catéteres aparentes durante la necropsia, y las muestras se tomaron vía una cinta CM en lugar del catéter. Esta ruta dio consistentemente concentraciones menores de la rhASA en comparación con el muestreo por medio del catéter. Esto se debe probablemente a la dirección rostrocaudal limitada del flujo global del SCF que como se sabe ocurre en animales orientados verticalmente tales como monos y humanos (por ejemplo, es bien sabido que los constituyentes del CSF exhiben gradientes rostrocaudales marcados durante el tiempo de vida de los individuos).

Los anticuerpos anti-rhASA en el suero se detectaron en todos los animales tratados con la rhASA en algún punto de tiempo, véase la Tabla 35. Los animales se definen como positivos para los anticuerpos anti-rhASA si el nivel del anticuerpo anti-rhASA fue superior al límite de cuantificación (78.1 ng/mL). Los animales permanecieron positivos para los anticuerpos anti-rhASA una vez que estos se sero convirtieron. No hubo animales positivos para los anticuerpos anti-rhASA en el punto de tiempo antes de la dosis 2. Todos los animales rhASA excepto el Macho No. 026 (Grupo 4; 6.0 mg/dosis) fueron positivos para los anticuerpos anti-rhASA en el suero en el punto de tiempo anterior a la dosis 4. El Macho No. 026 fue positivo para los anticuerpos del suero en el punto de tiempo previo a la dosis 6. En el Grupo 5 (18.6 mg/kg), las muestras el anticuerpo durante la necropsia tenían niveles inferiores del anticuerpo. Esta reducción aparente se puede deber a la presencia de la. rhASA que interfiere con el ensayo. El título fue por lo general más alto en los grupos a dosis media y alta (6.0 y 18.6 mg/dosis) que los animales a dosis baja (1.8 mg/dosis). La Presencia de los anticuerpos anti-rhASA es un resultado esperado del tratamiento de monos cinomólogos con una proteína humana recombinante. Dada la variabilidad en los resultados, no hubo diferencias aparentes por sexo.

Todos los animales con anticuerpos anti-rhASA detectables en el CSF tuvieron anticuerpos contra rhASA detectables también en el suero, con la excepción de las Hembras Nos. 049 (Grupo 3; 1.0 mg/dosis) y 057 (Grupo 4; 6.0 mg/dosis). La variabilidad en la concentración de los anticuerpos y la incidencia imposibilita la determinación de una respuesta a la dosis. Los animales se definen como positivos para los anticuerpos anti-rhASA si el nivel de anticuerpo anti-rhASA fue superior al límite de cuantificación (78.1 ng/mL).

Los valores combinados para los machos y las hembras en cuanto a los niveles de rhASA en el suero y el CSF y para los anticuerpos anti-rhASA se muestran en la Tabla 36 y la Tabla 37. Los resultados combinados de los machos y las hembras son similares a los sexos individuales discutidos anteriormente.

EJEMPLO 6 Eficacia En este ejemplo, 1 1 ratones de control tipo nativo (mASA +/+ hASA -/-) se asignaron al Grupo A y no recibieron tratamiento, treinta y cuatro (34) ratones hASAC69S/ASA -/- se asignaron a cada grupo de 5 dosis y recibieron el vehículo (Grupo B) o rhASA a dosis de 20 mg/kg (intravenoso [IV]; Grupo C) ó 0.04, 0.12 y 0.21 mg (Grupos D, E y F, respectivamente) en los días 1 , 9, 15/16 y 22. Todas las dosis IV se administraron por medio de la vena de la cola. Todas las dosis intratecal (IT) se administraron como una infusión en un volumen de 12 µ? a un intervalo aproximado de 2 µ?/20 segundos (Tabla 40).

TABLA 40 Diseño del Estudio N/A 0 no aplicable; IT = intratecal; IV = intravenoso. a Pero del cerebro para ratones es aproximadamente 0.0004 kg b Grupos C, D y E son dosificados en el Día 15; Grupos B y E son dosificados en Dia 16.

El ratón agénico ASA hASAC69S/ASA (-/-) es un modelo aceptado de MDL, y se ha usado para probar potenciales tratamientos para esta enfermedad. La ruta intratecal es la ruta planeada de administración en humanos. La ruta intravenosa de administración se ha probado para este compuesto y un compuesto similar en ratones MLD. Se ha agregado un grupo de control intravenoso como un control positivo para cambios histológicos esperados en órganos periféricos. Loa animales recibieron 100, 300 ó 520 mg/kg en peso del cerebro (004, 0.12, 0.21 mg, respectivamente) de rhASA. Los niveles de dosis normalizados para peso del cerebro seleccionado para este estudio corresponden a dosis que son planeadas para uso en humanos o se han usado en estudios toxicológicos o en modelos de eficacia previos de enfermedades de almacenaje lisosómico. Estas dosis no son esperadas para tener cualquier toxicidad.

Recepción Especies Ratones (Mus musculus) Cepa ratones hASAC69S/ASA (-/-) y controles de tipo nativo Edad aproximadamente 14-17 meses al llegar No. de Grupos 6 No. de animales 34 ratones agónicos + 11 controles tipo nativo Después de la llegada, cada animal se examinó para valorar su estado de salud.

Alojamiento Los animales son alojados en grupo en jaulas de filtro en la parte superior de policarbonato de alta temperatura, con lecho de papel CareFresh y botellas de agua. Cada jaula es claramente etiquetada con una tarjeta para jaula indicando el proyecto, grupo y número de animal, y sexo. Cada animal es identificado únicamente usando un sistema de punción de la oreja. Los animales se trataron en cumplimiento con los lineamientos federales.

Las condiciones objetivo para el animal en medio ambiente y fotoperiodo son como sigue: Temperatura 22°C ± 3°C Humedad 50% ± 20% Ciclo luz 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad Durante y después de la administración de la dosis, el fotoperiodo puede haber sido temporalmente interrumpido por actividades programadas. Tales interrupciones no son consideradas por afectar el resultado o calidad de esta investigación.

Todos los animales de tipo nativo disponibles (11 ) son asignados al Grupo A y son numerados de 35 hasta 45. Los animales ASA (-/-) hASA (+/-) son asignados con números consecutivos (1 hasta 34) son removidos de sus jaulas, pesaos y perforados en la oreja durante la aclimatación. Los animales entonces son asignados a los grupos de tratamiento usando Investigación Aleatorizada (www.randomizer.org) en Enero 3 de 2011 , los primeros 9 números son asignados al Grupo B, los siguientes 5 al Grupo C, los siguientes 5 al Grupo D, los siguientes 5 al Grupo E, y los finales 10 al Grupo F. Los animales son asignados como sigue en la Tabla 41.

TABLA 41 Asignación del Anima) a Animal No. 19 no pude ser localizado al tiempo de dosificación b Animal No. 3 murió antes del inicio de la dosificación Artículo y Vehículo de Prueba Artículo de Prueba Identidad rhASA Descripción Arilsulfatasa A (ARSA) recombinante humana Condiciones de Almacenaje Aproximadamente 4°C Vehículo Identidad Vehículo rhASA (NaCI 154 mM, polisorbato 20 al 0.005%, pH 6.0) Condiciones de Almacenaje Aproximadamente 4°C Preparación del Vehículo El vehículo se usó como se proporcionó. El vehículo se calentó sobre la mesa (ambiente). Una vez que el vehículo es calentado, el material se mezcló girándolo e invirtiéndolo suavemente. Las botellas no son sometidas a vórtice o agitación. La botella se secó antes de dar acceso al material. Cualquier material restante se regresó al refrigerador (1°C-8°C).

Preparación de Formulación de Dosis Se diluyó rhASA con el vehículo para lograr las concentraciones necesarias. El artículo de prueba se calentó sobre la mesa (ambiente). Una vez que el artículo de prueba es calentado, el material se mezcló girándolo e invirtiéndolo suavemente. Las botellas no son sometidas a vórtice o agitadas.

Tintes para el Seguimiento de Invecciones: Se utilizó un tinte infrarrojo (tal como IRDye®, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) para el seguimiento de inyecciones. Los tintes tales como este se han usado en inyecciones intratecal como un procedimiento de supervivencia después de la administración intratecal. El tinte se mezcló con el artículo de prueba antes de la administración; 1 nmol de tinte en 1 µ? se agregó al artículo de prueba. Además al tinte infrarrojo, se usó 1 µ? de azul #1 FD&C (0.25%) para seguimiento de inyecciones. Este tinte azul es un aditivo alimenticio común y es generalmente considerado seguro y no tóxico.

Inyección IT Lumbosacra de rhASA o vehículo Los animales en los Grupos B, D, E y F recibieron inyecciones intratecal en los Días 1, 9, 15 ó 16 y 22.

Se anestesiaron ratones adultos usando 2,2,2 tribromoetanol al 1.25% (Avertina) a 200-300 µ?/10 gramos de peso corporal (250-350 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Se removió pelo dorsal entre la base de la cola y omóplatos usando tijeras. El área afeitada se limpio fregándola con povidina/betadina seguido por alcohol isopropílico. Se realizó una pequeña incisión en la piel media (1-2 cm) sobre la espina lumbosacra, y se identificó la intersección de de la línea media dorsal y el aspecto craneal de las alas del íleo (íleo singular). El músculo en la fosa iliaca (mitad de glúteos) es un músculo en forma de corazón. Los dos lados de la parte superior del "corazón" próximos a la ubicación de las alas del íleo. Se insertó una aguja de calibre 32 unida a una jeringa Hamilton de vidrio de 10-20 µ? hermética a gases hasta que se sintió la resistencia del hueso subyacente. Se realizó la inyección de 10 µ? del artículo de prueba, 1 µ? de tinte infrarrojo y 1 µ? de azul #1 FD&C (volumen de inyección total de 12 µ?) a una velocidad aproximada de 2 µ?/20 segundos (12 µ?/2 minutos). La incisión de la piel se cerró usando grapas para herida. El éxito de esta inyección se juzgó mediante formación de imágenes para determinar si el tinte infrarrojo es distribuido a través del CNS, así como también el tinte azul visible. Después de la formación de imagen, el animal se dejó recuperar en una cámara de recuperación.

Invección Intravenosa de rhASA Los animales en el Grupo C recibieron inyecciones intravenosas en los Días 1 , 9, 15 y 22.

Para inyecciones IV, los animales se anestesiaron usando isoflurano, si es requerido, y se colocaron en un contenedor. La vena de la cola se dilató por calentamiento accionando la cola suavemente con el dedo. El sitio de inyección entonces se limpio con etanol al 70%. Alternativamente, el animal se colocó en una cámara caliente (40°C) por 1-1.5 minutos. Se usó una aguja de calibre 28 a 30 para inyectar el material de prueba. El volumen de la inyección fue 5-10 ml/kg.

Aproximadamente 24 horas después de la cuarta dosis, los animales en los Grupos B-F son sacrificados. Los animales son sometidos a diferentes procedimientos de recolección de tejidos, como se detalla debajo. Los animales del Grupo A no fueron tratados; sin embargo, son sacrificados en Enero 27 ó 28 de 2011 y se sometieron a procedimientos de recolección de tejido, como se detalla debajo.

Suero (todos los animales) Se recolectó una muestra de sangre terminal (aproximadamente 0.5 mi) de todos los animales (Grupos A-F) por medio de punción retroorbital bajo anestesia de isoflurano. Se colocó un tubo de vidrio en la órbita, penetrando suavemente el área detrás del ojo y así interrumpiendo el drenaje venoso localizado detrás del ojo. Se recolectó sangre por acción de capilaridad y/o flujo por gravedad. Después de la recolección de sangre, se aplicó presión a la órbita para detener el sangrado.

Las muestras de sangre completa se procesaron a suero y se congeló a < -80°C. El suero se almacenó a -80°C y se analizó para anticuerpos.

Tejidos para Investigación en Microscopio de Luz (Grupos A-F; 5 ratones por grupo) Después de la recolección de sangre, los animales se sacrificaron por medio de asfixia con C02. Se recolectó un recorte de la cola antes de la perfusión y congelamiento para posible genotipado. La cavidad de pericardiaca se expuso. Tres (3) ratones por grupo se perfundieron transcardiacamente con solución salina heparinizada (1 U/ml de heparina de sodio en NaCI al 0.9%, estéril filtrada) enfriada con hielo y entonces con paraformaldehído al 4% a aproximadamente 4°C. El cerebro se removió, y se cortó el abdomen para exponer los órganos internos adicionales. El cerebro y cadáver se colocaron en paraformaldehído, excepto para el recorte de la cola el cual se congeló.

Tejidos para Análisis de Lípido (Grupos A, B v F: 6. 4 v 5 animales, respectivamente) Después de la recolección de sangre, los animales se sacrificaron por medio de asfixia con CO2. Se recolectó un recorte de la cola antes de la perfusión y congelamiento para posible genotipado. La cavidad pericardiaca se expuso. Para análisis de lípido, 4-6 ratones por grupo se perfundieron transcardiacalmente con solución salina heparinizada (1 U/ml de heparina de sodio en NaCI al 0.9%, estéril filtrada) enfriada con hielo. Tejidos ejemplares recolectados para análisis lipidos se presentan en la Tabla 42.

TABLA 42 Tejidos Recolectados para Análisis de Lípido En la recolección, los tejidos se pesaron y entonces congelaron, ya sea en hielo seco o colocándolos en un congelador a -80°C. El cerebro se separó en hemisferios izquierdo y derecho. El derecho es utilizado para análisis de lípido por MS. El izquierdo puede ser analizado para posible análisis de N-acetil-L-aspartato (NAA). Los tejidos se almacenaron a -80°C hasta el análisis (véase Tabla 43).

TABLA 43 Condiciones de Almacenaje de la Muestra Almacenamiento de sulfátida reducido en rhASA en la médula espinal de ratones MLD, particularmente en la materia blanca, Figura 19. El análisis de morfometría de la médula espinal demostró que la densidad óptica del teñido con azul alcián estadísticamente reducido significantemente después de la dosificación de rhASA, Figura 20. Los ratones MLD tratados con rhASA también exhiben actividad lisosómico reducida en el cerebro, Figura 21. Esta reducción es estadísticamente significante en el grupo de dosis alta (0.21 mg-520 mg/kg de peso del cerebro) comparado con los animales tratados con el vehículo, Figura 22.

Ratones MLD inmunotolerantes (hASAC69S/ASA(-/-) de 1 año de edad recibieron administración intratecal-lumbar de rhASA una vez cada semana por 4 semanas (un total de 4 dosis). Las dosis son vehículos (NaCI a 154 mM, polisorbato 20 al 0.005%, pH -6.0), 0.04, 0.12, 0.21 mg/dosis (las dosis normalizadas son 100, 300 y 520 mg/kg de peso del cerebro, respectivamente). Se evaluó la eficacia de puntos de tiempo terminales por valoración de inmunohistoquímica de la actividad de separación de sulfátida y lisosoma dentro del cerebro y médula espinal. Las secciones de la médula espinal y cerebro se tiñeron usando sulfátidas dirigidos a teñido con azul alcián en tejidos. Las secciones del cerebro también se tiñeron para la presencia de proteína de membrana lisosomal asociada (LAMP), un indicador de procesos lisosomales. Adicionalmente, se realizó el análisis de morfometría en azul alcián y secciones teñidas con LAMP de la médula espinal (cervical, torácica y lumbar) y cerebro.

Estos resultados preliminares demuestran la eficacia de la administración intratecal lumbar de rhASA. Comparado a los ratones control con el vehículo, los ratones tratados con rhASA exhiben evidencia de mejoramiento dentro de los marcadores histológicos de enfermedad, tal como almacenamiento de sulfátida reducido (notado por teñido azul alcián) y actividad lisosomal en el cerebro. Estos cambios histopatológicos se observaron cerca del sitio de administración (médula espinal), así como también en las porciones distales del cerebro.

EJEMPLO 7 Biodistribución 2 Descripción En este estudio, se asignaron monos cinomólogos juveniles 36 hembras y 36 machos (< 12 meses al inicio) a cada uno de los 5 grupos de dosis y recibieron rhASA en dosis de 0 (control de dispositivo; los animales se dosificaron con 0.6 mi de PBS), 0 (control con vehículo), 1.8, 6.0 ó 18.6 mg (Grupos 1 , 2, 3, 4 y 5, respectivamente) cada semana por 6 meses para un total de 12 dosis. Todas las dosis se administraron como una infusión en un volumen de 0.6 mi, seguido por un enjuague de 0.5 mi de PBS durante aproximadamente 10 minutos (Tabla 44).

TABLA 44 Diseño de Estudio Diseño de Estudio No. de Concentraci No. de Dosis Animales, No. de ón de Dosis Animales, Grupo Administrad Sacrificio de Animales Nominal Sacrificio 6 a (mg) recuperación 1 (mg/mL) meses Mes 1 4 , 4F DC 0 - 4M. 4F 2 8M, 8F 0 0 4 M, 3 Fa 4M. 4F 3 8M, 8F 3 1.8 4 M, 4 F 4M. 4F 4 8 , 8F 10 6.0 4 M, 4 F 4M. 4F 5 8 , 8F 31 18.6 4 M, 4 F 4M. 4F DC = Control de Dispositivo; Animales en el Grupo 1 no se dosificaron con el vehículo o artículo de prueba. a Control con vehículo Animal No. 044 se sacrificó tempranamente en el Día 50 debido a un catéter que gotea.

Materiales y métodos Recolección de Tejido Los cerebros se cortaron en una matriz del cerebro en espesor de corte coronal de 3 mm de grueso. Cada cerebro se seccionó en cortes coronales completos que incluyen, neocorteza (que incluye corteza frontal, parietal, temporal y occipital), paleocorteza (bulbos olfatorios y/o lóbulo piriforme), ganglio basal (que incluye caudal y putamen), sistema límbico (que incluye hipocampo y gyrus cingulado), tálamo/hipotálamo, regiones mesencéfalas (que incluyen sustantia nigra), cerebelo, puente de Valorio y bulbo raquídeo. Se obtienen las localizaciones de estas muestras de tejido individual (por medio de punción de biopsia de 4 mm) se muestran en las Figuras 32-37. Las imágenes en las Figuras 32-37 son de la Universidad de Wisconsin y de Colecciones de Cerebro de Mamífero Comparativas del Estado de Michigan, (también del Museo Nacional de Salud y Medicina). La punción número 22 no se recolectó, esta estructura no está presente durante la necropsia. Todas las muestras del cerebro se congelaron y almacenaron a -60°C o menos antes del análisis para rhASA usando un ensayo inmunosorbente unido a la enzima.

El primer corte del cerebro y cada segundo corte después de esto se fijaron en formalina para evaluación histopatológica e inmunohistoquímica. El segundo corte del cerebro y cada segundo corte después de esto se congelaron para análisis de concentración del artículo de prueba. Antes del congelamiento, las muestras del cerebro se tomaron de la porción derecha de los cortes del cerebro para análisis del artículo de prueba, incluso numerados para análisis de biodistribución. La ubicación de las muestras del cerebro son fotografiadas en la necropsia y el número de corte del cerebro se registró. Las muestras se obtienen usando ya sea una punción o corte circular de 4 mm con un bisturí para optimizar la cantidad de materia blanca recolectada. Todas las punciones se congelaron y almacenaron a - 60°C o por debajo para análisis del artículo de prueba. El resto del corte del cerebro se congeló y almacenó a -60°C o por debajo para posible análisis del artículo de prueba. Las ubicaciones de las perforaciones se muestran en el Apéndice B.

La médula espinal (cervical, torácica y lumbar) se cortó en secciones de un centímetro. El primer corte y cada segundo corte después de esto se fijaron en formalina para análisis histopatológico o inmunohistoquímica. El segundo corte de la médula espinal y cada segundo corte después de esto se congelaron almacenaron a -60°C o debajo para análisis del artículo de prueba. La distribución de los cortes se ajustó de forma que el corte con la punto del catéter intratecal (Corte 0) se fijó en formalina y se analizó para histopatología.

Preparación de Extractos de Cerebro, Hígado y Espinal y Determinación de Concentración de rhASA Se analizaron punciones del cerebro, muestras de médula espinal e hígado usando un método validado en cumplimiento con las regulaciones de la Buena Práctica de Laboratorio (GLP) de la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA) 21 CFR, Parte 58 y con procedimientos de operación estándar BioResearch Midwest aplicables. Las muestras de tejido se homogenizaron en amortiguador de lisis, se centrifugaron para remover cualquier desecho del tejido, y se almacenaron a -80°C hasta el ensayo. La concentración de rhASA es las fracciones solubles de lo homogenado se determinó por un ELISA usando anticuerpo SH040 de conejo monoclonal como el anticuerpo de captura y anticuerpo 19-16-3 monoclonal anti-ASA conjugado con HRP (peroxidasa de rábano picante) como en anticuerpo de detección. Después de una etapa de lavado para remover materiales no unidos, la solución del sustrato tetrametilbenzidina (TMB) reaccionó con el peróxido en la presencia del anticuerpo conjugado con HRP para producir una señal colorimétrica que es proporcional a la cantidad de ASA unida por el anticuerpo anti ASA en la etapa inicial. La cantidad resultante de rhASA en cada homogenado de tejido es interpolada a partir de una curva estándar.

Las muestras también se analizaron por un análisis de determinación de proteína de ácido bicinconínico (BCA) para obtener la concentración de proteína en una muestra desconocida. La concentración de proteína para cada muestra se determinó por interpolación de una curva estándar de albúmina. Los resultados de concentración rhASA entonces se normalizaron a proteína total en extractos de tejido, como se determinó por el ensayo de ácido bicinconínico.

Se muestran los niveles de ASA de todas las punciones para el vehículo, 1.8 mg/dosis, 6.0 mg/dosis y 18.6 mg/dosis por grupos en la Figura 23, Figura 24, Figura 25 y Figura 26, respectivamente. Los niveles de ASA de todas las punciones para los animales en recuperación para el control de dispositivo, vehículo, grupos de 1 .8 mg/dosis, 6.0 mg/dosis y 18.6 mg/dosis se muestran en la Figura 27, Figura 28, Figura 29, Figura 30 y Figura 31 , respectivamente.

Los niveles de ASA para punciones seleccionadas que se toman cerca de la superficie (meninges) del cerebro se muestran en la Figura 32. Los niveles de ASA para punciones seleccionadas que son consideradas por contener materia blanca del cerebro muy profunda se muestran en la Figura 33. La materia blanca está compuesta de paquetes de procesos celulares del nervio mielinado (o axones). Punciones seleccionadas las cuales contienen en su mayoría material de la materia gris del cerebro profunda se muestran en la Figura 34. La materia gris contiene cuerpos de célula neural, en contraste a la materia blanca. Los valores de ASA en punciones seleccionadas de la superficie, blanco profundo y gris profundo se muestran para cada grupo de dosis en la Figura 35.

Los datos de concentración de la médula espinal se muestran en la Figura 36.

Los datos de concentración de hígado se muestran en la Figura 37.

Los niveles de concentración de ASA en el hígado, médula espinal y cerebro de los grupos control dosificados con el dispositivo y vehículo son en algunos casos medibles. Los niveles en hígado y médula espinal son tan bajo como en cualquiera de los grupos tratados con rhASA (Figura 23, Figura 32, y Figura 33). El nivel de rhASA medido en los animales dosificados con el control de dispositivo y vehículo representa una reactividad cruzada entre el anticuerpo anti-rhASA usado en el ELIS con proteína de mono cinomólogo nativo. Los valores reportados en el control de dispositivo y tejidos de vehículo no representan valores cuantitativos para rhASA de mono cinomólogo en los tejidos, porque el grado de reactividad cruzada entre el anticuerpo y ASA de cinomólogo no se conoce, y el hecho que los estándares de ensayo usan ASA humana. Sin embargo, sin desear ser ligado por cualquier teoría, la variación en los niveles de ASA detectados entre tejidos dosificados con vehículo y control de dispositivo puede ser interpretada como variabilidad demostrada en las cantidades relativas de ASA de cinomólogo en diferentes tejidos y regiones anatómicas.

Los niveles de ASA en cortes de médula espinal varía de 160- 2352, 1081-6607 y 1893-9252 ng/ml proteína en machos y 0-3151 , 669-6637 y 1404-16424 ng/mg de proteína en hembras para los grupos de 1.8, 6.0 y 18.6 mg/dosis, respectivamente (Figura 32). Los niveles de ASA son mayores en la región lumbar de la espina que en la región cervical. Los niveles de proteína ASA detectados en el hígado son dosis responsables en los grupos tratados con ASA y son muy bajos en el grupo de vehículo. Los niveles de ASA medios son 88, 674 y 2424 en machos y 140, 462 y 1996 ng/mg de proteína en hembras para los grupos 1.8, 6.0 y 18.6 mg/dosis, respectivamente (Figura 33).

En conjunto, el nivel de ASA parece estar relacionado con la dosis en muestras preparadas de cortes de la médula espinal e hígado de los grupos dosificados con rhASA. Muchas de las regiones del cerebro probadas demuestran una clara relación de dosis entre niveles ASA y administración de ASA, mientras otras son equivocadas. En general, los niveles de rhASA en el cerebro se incrementan con dosis de rhASA.

EJEMPLO 8 Estudio de farmacocinética (PK) y biodistribución El objetivo de este estudio es evaluar la farmacocinética (PK) y biodistribución de varia enzimas de reemplazo terapéuticas después de administración intratecal (IT) e intravenosa (IV) a monos cinomólogos.

En este estudio, se asignaron al zar monos cinomólogos, un total de doce machos y doce hembras con catéteres intratecal-lumbar (IT-L) e intratecal-cisterna magna (IT-CM) de patente por peso en cuatro grupos de tratamiento para la Fase 1a (administración de I2s) y Fase 1b (administración de ASA).

Se recolectaron sangre y CSF (del catéter IT-CM) en intervalos específicos después de la dosificación para ambas fases. Después que la última muestra se recolectó de la Fas 1a, los animales se dejaron por un periodo de lavado por 7 días antes del inicio de la Fase 1b.

Después que las últimas muestras se recolectaron de la Fase 1b, los animales se pueden dejar por un periodo de 7 días de lavado antes del inicio de la Fase 2. Un total de 12 machos y hembras de monos cinomólogos de la Fase 1b se asignaron al azar por peso corporal en 12 grupos de tratamiento de I2S (Grupos 1a-6a) y ASA (Grupos 1b-6b).

La biodisponibilidad absoluta de ASA en suero después de la administración IT-L es -30 a 40%. En contraste, solo el 0.5% de la dosis IV es biodisponible en CSF.

La exposición a ASA en suero incrementa en una forma más proporciona después de la administración IT-L.

Después de la administración IT-L, la exposición a ASA en CSF incrementa en una forma menos proporcional como la dosis disminuye. Sumarios de parámetros de PK de rhASA en suero, parámetros de PK de rhASA en suero en CSF y biodisponibilidad se muestran en las Tablas 45-47.

TABLA 45 Sumario de parámetros PK de ASA en suero de monos cinomólogos TABLA 46 Sumario de parámetros PK de ASA de monos cinomologos TABLA 47 Biodisponibilidad de ASA en suero y csf La biodisponibilidad de ASA en suero después de la administración IT-L es -30-40%. En contraste, solamente el 0.5% de la dosis administrada por ruta IV es biodisponible en CSF. Las divisiones de suero en CSF se muestran en la Tabla 48.

TABLA 48 División de CSF:suero EJEMPLO 9 Tratamiento de pacientes MLD Se puede usar la administración al CNS directa a través, por ejemplo, de suministro IT para tratar efectivamente pacientes MLD. Este ejemplo ilustra un estudio de ascenso de dosis multicéntrica diseñado para evaluar la seguridad de hasta 3 niveles de dosis cada semana (EOW) para un total de 40 semanas de rhASA administrada por medio de un dispositivo de suministro del fármaco ¡ntratecal (IDDD) en paciente con MLD infantil tardío. Varios ejemplares de dispositivos de suministro del fármaco intratecal adecuados para tratamiento humano se describen en las Figuras 45-48.

Hasta 20 pacientes pueden ser matriculados: Cohorte 1 : 5 pacientes (Dosis más Baja) Cohorte 2: 5 pacientes (Dosis Intermedia) Cohorte 3: 5 pacientes (Dosis más Alta) 5 pacientes pueden ser aleatorizado para no recibir tratamiento.

Se seleccionaron pacientes para el estudio en base a la inclusión del siguiente criterio: (1) aparición de los primeros síntomas antes de 30 meses de edad; (2) ambulatorio en el tiempo de selección (definido como la capacidad de ponerse de pie solo y caminar 10 pasos ayudado con una mano); (3) presencia de signos neurológicos en tiempo de la selección. Típicamente, la historia de pacientes de trasplante de célula trocal hematopoyética son excluidos.

Se determinó la seguridad de dosis ascendentes de rhASA administrado por inyección IT por 40 semanas en niños con MLD infantil tardío. Además, se valoraron la actividad clínica de rhASA en la función motora gruesa y farmacocinéticos de dosis única y repetida en suero y concentraciones en fluido cerebroespinal (CSF).

Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente han sido descritos con especificidad de conformidad.con ciertas modalidades, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos de la invención y no están propuestos para limitar los mismos.

Los artículos "un" y "uno" como se usan en la presente en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben ser entendidos por incluir los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo son consideradas satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o de otro modo sea evidente del contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, empleado en, o de otro modo relevante a un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las cuales más de uno, o los miembros del grupo completo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado. Además, se entiende que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las cuales una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones listadas se introducen en otra reivindicación dependiente en la misma reivindicación base (o, como sea relevante, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique de otro modo o amenos que podría ser evidente para uno de habilidad ordinaria en la técnica que una contradicción o consistencia podría originarse. Donde los elementos están presentes como listas (por ejemplo, en un grupo Markush o formato similar) se entiende que cada subgrupo de los elementos también se describe, y cualesquiera de los elementos pueden ser removidos del grupo. Se entiende que, en general, donde la invención, o aspectos de la invención, es/son referidos como que comprenden elementos particulares, características, etc., ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente de: tales elementos, características, etc. Para propósitos de simplicidad estas modalidades no han sido en cualquier caso específicamente expuestas en así muchas palabras en la presente. Se debe entender también que cualquier modalidad o aspecto de la invención puede ser explícitamente excluido de las reivindicaciones, con respecto de si la exclusión específica se menciona en la especificación. Las publicaciones, sitios de red y otros materiales de referencia aquí referenciados para describir el antecedente de la invención y proporcionar detalle adicional con respecto a su práctica están de este modo incorporados por referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una formulación estable útil para administración intratecal que comprende una proteína ariisulfatasa A (ASA), sal, y un tensoactivo de polisorbato.

2. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína ASA está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0-100 mg/ml.

3. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque la proteína ASA está presente en una concentración seleccionada de 10 mg/ml, 30 mg/ml, 50 mg/ml, ó 100 mg/ml.

4. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la proteína ASA comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:1.

5. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada además porque la proteína ASA se produce a partir de una línea de células humanas.

6. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada además porque la proteína ASA se produce a partir de células CHO.

7. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la sal es NaCI.

8. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el NaCI está presente como una concentración que varía desde aproximadamente 0-300 mM.

9. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el NaCI está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 137-154 mM.

10. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el NaCI está presente en una concentración de aproximadamente 154 mM.

11. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el tensoactivo de polisorbato se selecciona del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80 y combinaciones de los mismos.

12. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el tensoactivo de polisorbato es polisorbato 20.

13. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el polisorbato 20 está presente a una concentración que varía desde aproximadamente 0-0.2%.

14. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el polisorbato 20 está presente en una concentración de aproximadamente 0.005%.

15. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la formulación estable además comprende un agente amortiguador.

16. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste de fosfato, acetato, histidina, succinato, citrato, Tris, y combinaciones de los mismos.

17. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el agente amortiguador es fosfato.

18. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el fosfato está presente en una concentración no mayor de 50 mM.

19. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el fosfato está presente en una concentración no mayor de 20 mM.

20. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 3-8.0.

21. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0-6.5.

22. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0.

23. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación es una formulación líquida.

24. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada además porque la formulación es formulada como polvo seco liofilizado.

25. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque la formulación además comprende un agente estabilizante.

26. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol, PEG 4000, histidina, arginina, lisina, fosfolípidos y combinaciones de los mismos.

27. Una formulación estable útil para administración intratecal, que comprende una proteína arilsulfatasa A (ASA), sal, y un agente amortiguador.

28. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque la proteína ASA está a una concentración que varía desde aproximadamente 0-100 mg/ml.

29. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizada además porque el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste de fosfato, acetato, histidina, succinato, citrato, Tris, y combinaciones de los mismos.

30. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque el agente amortiguador es fosfato.

31. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque el fosfato está a una concentración de no mayor de aproximadamente 20 mM.

32. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque el fosfato está a una concentración de no mayor de aproximadamente 50 mM.

33. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-31 , caracterizada además porque la formulación además comprende un tensoactivo de polisorbato.

34. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el tensoactivo de polisorbato se selecciona del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80 y combinaciones de los mismos.

35. La formulación estable de conformidad con la reivindicación 33 ó 34, caracterizada además porque el tensoactivo de polisorbato está presente a una concentración que varía aproximadamente 0-0.2%.

36. La formulación estable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-35, caracterizada además porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0-6.5.

37. Un contenedor que comprende una forma de dosificación única de una formulación estable de cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

38. El contenedor de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el contenedor se selecciona de una ampolleta, un vial, un cartucho, un reservorio, una lio-ject o jeringa pre-llenada.

39. El contenedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 38, caracterizado además porque el contenedor es una jeringa pre-llenada.

40. El contenedor de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la jeringa pre-llenada se selecciona de jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona al horno, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona rociada, o jeringas de resina plástica sin silicona.

41. El contenedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-40, caracterizado además porque la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 50.0 ml_.

42. El contenedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-40, caracterizado además porque la formulación estable está presente en un volumen de menos de aproximadamente 5.0 ml_.

43. El uso de una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-29, en la preparación de un medicamento para tratar enfermedad de leucodistrofia metacromática (MLD) en un sujeto que lo necesita, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable intratecalmente.

44. El uso como se reclama en la reivindicación 43, en donde el medicamento está adaptado para no mostrar efectos adversos sustanciales en el sujeto.

45. El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde el medicamento está adaptado para no mostrar respuesta inmune mediada por células-T adaptivas sustanciales en el sujeto.

46. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-45, en donde el medicamento está adaptado para suministrar la proteína ASA a oligodend rocitos de materia cerebral blanca profunda.

47. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-46, en donde la proteína ASA en el medicamento está adaptada para ser suministrada a neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales.

48. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-47, en donde la proteína ASA en el medicamento está adaptada para ser suministrada además a las neuronas en la médula espinal.

49. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-48, en donde el medicamento está adaptado para el suministro sistémico de la proteína ASA en tejidos periféricos objetivos.

50. El uso como se reclama en la reivindicación 49, en donde los tejidos periféricos objetivos son seleccionados de hígado, riñon y/o corazón.

51. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-50, en donde el medicamento está adaptado para la localización lisosomal en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos.

52. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-51 , en donde el medicamento está adaptado para reducir el almacenamiento de sulfátida en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos.

53. El uso como se reclama en la reivindicación 52, en donde el almacenamiento de sulfátida se reduce por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-vez, 1.5-veces, ó 2-veces comparada con un control.

54. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-53, en donde el medicamento está adaptado para reducir la desmielinación progresiva y pérdida axonal dentro del CNS y PNS.

55. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-54, en donde el medicamento está adaptado para aumentar la actividad enzimática ASA en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos.

56. El uso como se reclama en la reivindicación 55, en donde la actividad enzimática ASA en el medicamento se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control.

57. El uso como se reclama en la reivindicación 55 ó 56, en donde la actividad enzimática ASA incrementada en el medicamento es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg ó 600 nmol/hr/mg.

58. El uso como se reclama en la reivindicación 55, en donde la actividad enzimática ASA en el medicamento se incrementa en la región lumbar.

59. El uso como se reclama en la reivindicación 58, en donde la actividad enzimática ASA incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, ó 10,000 nmol/hr/mg.

60. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-59, en donde el medicamento está adaptado para reducir la intensidad, severidad o frecuencia o comienzo retardado de al menos un síntoma o característica de la enfermedad de MLD.

61. El uso como se reclama en la reivindicación 60, en donde al menos un síntoma o característica de la enfermedad de MLD es presión intracraneal incrementada, hidrocéfalo ex vacuo, glicolípidos sulfatados acumulados en las vainas de mielina en el sistema nervioso central y periférico y en órganos viscerales, desmielinación progresiva y pérdida axonal dentro del CNS y PNS, y/o disfunción motora y cognítiva.

62. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-61 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable una vez cada dos semanas.

63. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-61 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable una vez cada mes.

64. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-61 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable una vez cada dos meses.

65. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-64, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en conjunto con administración intravenosa.

66. El uso como se reclama en la reivindicación 65, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable no más frecuente que una vez cada mes.

67. El uso como se reclama en la reivindicación 65, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable no más frecuente que una vez cada dos meses.

68. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-64, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable intratecalmente en ausencia de administración intravenosa.

69. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 43-68, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable intratecalmente en ausencia de terapia inmunosupresora concurrente.