MX2012013804A - Deteccion y enumeracion de microorganismos. - Google Patents

Abstract

Se describe un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechosa de contener tales microorganismos. El método consiste en: (1) poner en contacto los microorganismos de la muestra con compuestos de reparación y un medio de crecimiento, y (2) incubar el producto del paso (1), y (3) detectar y cuantificar los microorganismos viables, en el cual los microorganismos son de la especie Legionella pneurnophila y en el cual los compuestos de reparación comprenden: (a) seria; (b) treonina (c) un compuesto que contiene iones de calcio en una dosis de 10-6 hasta 10-2 mM (d) un compuesto que contiene iones magnesio en una dosis de 10-6 hasta 10-2 mM (e) un compuesto que contiene iones potasio (f) ácido glutámico o una sal de éste y (g) ácido pirúvico o una sal de éste. La invención también consiste en un kit para detectar y enumerar con mayor exactitud microorganismos viables de la especie Legionella pneurnophila en una muestra sospechosa de contener tales microorganismos.

Description

DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS La presente invención se refiere a un método para la detección y enumeración de microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra. La invención también incluye un kit adecuado para su uso en tal método. Este método y kit permite a los microorganismos viables ser cuantificados más rápidamente .

Las bacterias Legionella son ubicuas en ambientes húmedos como suelo y hábitats acuáticos no marinos. Estas también pueden encontrarse en instalaciones de agua fría y caliente, torres de enfriamiento de sistemas de aire acondicionado y humidificadores .

La bacteria Legionella , en especial Legionella pneumophila, son patógenos que pueden provocar una neumonía bacteriana aguda, generalmente conocida como " legionelosis o enfermedad de los legionarios", que con frecuencia es letal en individuos infectados.

Tradicionalmente, la detección y enumeración de Legionella pneumophila se logra mediante cultivo celular. Este método se puede lograr midiendo las bacterias cultivables utilizando recuento en placa o medición de micro-colonias empleando un método de filtración por membrana. Estas técnicas evalúan las bacterias viables por su capacidad para formar una colonia o micro-colonia. Desafortunadamente, estos métodos normalmente requieren entre 3 y 10 días para dejar que se formen las colonias o micro-colonias. Donde las instalaciones de agua todavía están funcionando existe un riesgo inaceptable de infección a humanos durante este tiempo.

Otros métodos para la detección total de microorganismos Legionella incluyen las técnicas PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) . La PCR emplea DNA polimerasa para amplificar un trozo de DNA por replicación enzimática in vitro. Durante el progreso de la técnica, el DNA generado se utiliza como un modelo para replicación el cual provoca una reacción en cadena en la que el modelo DNA es amplificado exponencialmente . La PCR permite una sola copia o pocas copias de un trozo de DNA que se va a amplificar para generar millones o más copias de la pieza de DNA. Por lo regular este método se describe por Diederen et al., J Med Microbiol. Ene 2007; 56 (Pt 1):94-101.

Sin embargo un inconveniente de la PCR es que las muestras tienden a contener inhibidores de reacción de polimerización y por tanto no proporcionan resultados cuantitativos uniformes. Además, la técnica se basa en un paso previo de purificación de DNA lo cual puede resultar en pérdida de DNA con la consecuente subestimación de la Legionella presente. Hasta cierto punto estas desventajas se superan por la PCR en tiempo real la cual es cuantitativa. Sin embargo, la técnica no puede distinguir entre células viables y células no viables.

Otra técnica es la hibridación fluorescente in situ (FISH) en la que una sonda de oligonucleótido marcada con una sustancia fluorescente penetra en las células bacterianas .

Donde los ácidos nucleicos ribosomales (rRNA) tienen la secuencia correcta para la sonda conocida como la diana, la sonda se unirá a su diana y no se eliminará por algún paso de lavado subsiguiente. Las bacterias en las que se fija la sonda entonces emitirán una señal fluorescente. Esta señal fluorescente entonces puede ser cuantificada por técnicas como citometria de flujo, citometria de fase sólida o microscopía de epifluorescencia . Una técnica FISH común se describe en Dutil S et al J Appl Microbiol. 2006 Mayo; 100 (5) : 955-63. Sin embargo, utilizando solo la técnica FISH puede detectarse la cantidad total de Legionella pneumophila viable pero desafortunadamente el método no puede identificar exclusivamente solo aquellas bacterias Legionella pneumophila capaces de dividirse y por consecuencia formar una colonia.

Otro método para la enumeración de Legionella pneumophila viable implica Chem-Chrome V6 y se describe en Delgado-Viscogliosi et al Appl Environ Microbiol. 2005 Jul; 71 (7):4086-96. Este método permite la cuantificación de Legionella pneumophila asi como la discriminación entre bacterias viables y no viables. Combina la detección especifica de células de Legionella utilizando anticuerpos y un marcador de la viabilidad bacteriana (Chem-Chrome V6) y empleando microscopía de epifluorescencia para la enumeración. Sin embargo, aunque esta técnica distingue entre células viables y no viables no es capaz de identificar por separado aquellas bacterias formadoras de colonias.

US 20070218522 describe métodos y composiciones para la detección y cuantificación de Legionella viable y otras bacterias aerobias heterótrofas, el método incluye el uso de indicadores Dipslides que incluye un medio absorbente, promotor del crecimiento y sustancias selectivas de crecimiento para la rápida detección y cuantificación de micro-colonias de Legionella. Esta técnica no enumeraría bacterias.

EP 1329515 se refiere a un método para detectar la presencia de microorganismos en un ambiente gaseoso que contenga peróxido de hidrógeno poniendo en contacto el ambiente gaseoso con un medio de crecimiento de agar que contenga una sal de ácido pirúvico y permitiendo el desarrollo de colonias de microorganismos.

En general, se considera que las técnicas más exactas son las técnicas impliquen el crecimiento de colonias sobre un medio de crecimiento, como una placa de agar nutriente. Por consiguiente, el método de recuento en placa sigue siendo el método elegido para la obtención del recuento viable total. En general esto significa la aplicación de una muestra que se sospecha contenga el microorganismo en una placa conteniendo una fuente de nutriente sólido o medio de crecimiento. Esta técnica en general se conoce como plaqueo o sembrado. Por recuento viable total nos referimos a la cantidad total de bacterias capaces de producir una población apreciable para el observador. Normalmente esto significa una colonia visible sobre la superficie del medio de crecimiento como placa de agar nutriente.

Sin embargo, microorganismos como Legionella pneumophila en el ambiente pueden ser objeto de una o más condiciones de estrés que evitan que el microorganismo crezca y se multiplique en esta condición ambiental. Este microorganismo en condición de estrés no se dividiría formaría una colonia visible en condiciones normales de cultivo. En el entorno, una proporción de células de microorganismos generalmente se someterá a estrés debido a condiciones ambientales como inanición, presencia de biocida, choque térmico y desecación. Además, estas células pueden estar en un estado fisiológico vulnerable en el cual la técnica plaqueo los microorganismos pueden exacerbar la inanición de aquellos microorganismos ya sometidas a estrés debido a la presencia de oxígeno atmosférico. Además esto podría conducir a muerte engañosa o artificiosa de las bacterias sometidas a estrés dando lugar a una subestimación del recuento viable total.

Además, la subestimación de Legionella pneumophila viable con el método de plaqueo podría volverse riesgoso con respecto a su patogenicidad.

Desde 1970 se ha reportado que depuradores de especies de oxígeno reactivo (ROS) se deben utilizar para limitar el efecto de estrés oxidativo durante el proceso de plaqueo. Esto fue reportado por Speck et al, Repair and enumeration of injured coliforms by a plating procedure, Appl Microbiol 29, 549-50 (1975); Martin et al Catalase: its effect on microbial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4 (1976) ; Brewer et al Beneficial effects of catalase or pyruvate in a most-probable-number technique for the detection of Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977); McDonald et al, Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 (1983); Marthi et al) Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991); Busch and Donnelly Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Appl Environ Microbiol 58, 14-20 (1992) ; and Dukan et al, Oxidative stress defense and deteriorat ion of growth-arrested Escherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999) .

Sin embargo, en todos los casos antes mencionados los inventores de la presente invención piensan que las ROS podrían reducirse por una vía directa en la cual el compuesto reaccione químicamente con las ROS.

Bérubé et al, "Rapid detection and Identification of Legionella pneumophila by membrane immunoassay" , Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641 describe la detección e identificación de Legionella pneumophila mediante un ensayo de inmunoabsorción utilizando un anticuerpo monoclonal. No se proporcionan medios para tratar el problema de las bacterias lesionadas .

Un articulo de Pine et al (Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986)) describe la necesidad de adicionar cetoácidos y enzima depuradora de oxigeno reducido para optimizar el crecimiento de Legionella pneumophila y sugirió el uso de estos materiales en el medio utilizado para la enumeración normal de este microorganismo.

Sin embargo el simple uso de cetoácidos y enzima depuradora de oxigeno reducido es insuficiente para reparar las células de Legionella pneumophila sometidas a estrés y permitir la enumeración exacta. Esto es especialmente asi cuando se utiliza un medio de crecimiento especifico para Legionella pneumophila, como puede ser medio de agar con extracto de levadura, carbón, amortiguado (BCYE) . De hecho, no hay datos disponibles referentes a la optimización de un medio normalizado útil para la enumeración exacta de Legionella pneumophila .

WO 2009 121726 describe un método para la detección y enumeración de microorganismos Legionella pneumophila viables en una muestra poniendo en contacto los microorganismos con al menos un compuesto de reparación y un medio de crecimiento seguido por los pasos de incubación y detección y cuantificación de microorganismos viables. El compuesto de reparación provoca directa o indirectamente un efecto sobre el metabolismo para disminuir el estrés oxidativo del microorganismo. Se sugiere que los compuestos de reparación incluyan piruvato y ácido glicólico. El método proporciona medios excelentes para la enumeración más exacta de Legionella pneumophila viable dentro de un tiempo más corto que los métodos anteriores.

Sin embargo, seria deseable proporcionar un método mejorado para la enumeración aún más exacta de Legionella pneumophila viable e incluso más rápidamente. Además, también seria deseable lograr esto a través de un espectro más amplio de cepas de Legionella pneumophila .

Asi, de acuerdo con la presente invención proporcionamos un método para la detección y enumeración de microorganismos viables en una muestra que se sospecha contenga dichos microorganismos (1) poner en contacto los microorganismos de los compuestos de reparación de la muestra y un medio de crecimiento, e (2) incubar el producto del paso (1), y (3) detectar y cuantificar los microorganismos viables, en el cual los microorganismos son de las especies Legionella pneumophila, y en el cual los compuestos de reparación contienen (a) serina; (b) treonina; (c) un compuesto que contiene iones calcio a una dosis de 10"6 a 10"2 mM; (d) un compuesto que contiene iones magnesio a una dosis de 1CT6 a 10"2 mM; (e) un compuesto que contiene iones potasio, (f) ácido glutámico o una sal de éste, y (g) ácido pirúvico o sal de éste.

Hemos encontrado que el uso de estos compuestos en conjunto como compuestos de reparación en el método presente disminuye significativamente el periodo de latencia de microorganismos Legionella pneumophila . De hecho, hemos encontrado que esto se logra a través de un espectro más amplio de cepas de Legionella pneumophila.

Sin limitarse a la teoría se considera que la combinación de piruvato, glutamato y concentraciones específicas de iones calcio y magnesio provoca un efecto benéfico en forma directa o indirecta para eliminar o disminuir de estrés oxidativo y se pensó que los iones potasio disminuyen el choque osmótico mientras que serina y treonina mejoran el metabolismo. Se cree que esta combinación especial de los compuestos de reparación proporciona un mejoramiento sinérgico en la eliminación o disminución de estrés oxidativo, disminuyendo el choque osmótico y mejorando del metabolismo, logrando con ello los objetivos de la presente invención.

En la invención, la dosis deseada de serina o treonina puede ser entre 0.01 y 5% con base en el peso del compuesto de reparación en el volumen de la muestra. Deseablemente esto será normalmente en el intervalo de entre 0.05 y 2.5%, por ejemplo, entre 0.1 y 2%, a menudo entre 0.5 y 1%. El ácido glutámico (o la sal de éste) y/o ácido pirúvico (o sal de éste) se utilizan a una dosis deseada de entre 0.01 y 5% con base en el peso del compuesto de reparación en el volumen de la muestra. Deseablemente esto es a menudo entre 0.05 y 2.5%, por ejemplo, entre 0.1 y 2%, frecuentemente en el intervalo de 0.5 y 1%.

Cada uno de los compuestos que contiene los iones calcio, iones magnesio o iones potasio pueden ser cualquiera de las sales adecuadas. Deseablemente estos deben ser solubles en agua al menos suficientemente para permitir obtener la dosis requerida. Las sales pueden tener cualquiera de los contraiones adecuados. La persona experta en la técnica se dará cuenta en cualquier caso que los contraiones no deben ser toxinas conocidas para microorganismos como Legionella pneumophila . Por lo regular, los contraiones incluirán, más no se limitarán a cloruro, sulfato, nitrato, etcétera.

Como se indicó antes, los compuestos que contienen iones calcio deben utilizarse a una dosis de 10"6 a 10"2 mM, preferentemente esto será en el intervalo de 10"5 a 10"3 mM, más preferentemente 5xl0~4 a 5xl0~3, en especial alrededor de 10~4. Con respecto a un compuesto que contiene iones magnesio como ya se indicó, la dosis debe ser 1CT6 a 10~2 mM, preferentemente esto será en el intervalo de 10"5 a 10~3 mM, más preferentemente 5xl0~4 a 5xlCT3 mM, en especial alrededor de 1CT4 mM.

El compuesto de reparación que contiene iones potasio deseablemente se utilizará a una dosis que puede ser 1 a 10~4 mM, por ejemplo, entre 10"1 a 10"3 mM, más preferentemente entre 5xl0_1 a 5xl0~2 mM, en especial alrededor de 1CT2 mM.

Los compuestos de reparación se utilizan juntos, lo que significa que estos pueden utilizarse al mismo tiempo o en secuencia. Por secuencia se entiende la adición de cada compuesto prácticamente uno después del otro. Por mismo tiempo se entiende la adición de dos o más compuestos de reparación a la muestra al mismo tiempo. También puede ser deseable combinar dos o más de los compuestos de reparación en una formulación y con ello evitar adiciones separadas de los compuestos de reparación .

Consideramos que los compuestos de reparación que contienen piruvato, glutamato, calcio y magnesio actúan directa o indirectamente sobre el metabolismo de los microorganismos en tal forma que reducen el estrés oxidativo del microorganismo. De esta manera, consideramos creemos que los compuestos de reparación que contienen piruvato, glutamato, calcio y magnesio actúan endógenamente sobre los microorganismos.

Por estrés oxidativo se entiende un desequilibrio entre la concentración de las ROS (producción endógena o aducción exógena) y la capacidad de los microorganismos para desintoxicar fácilmente los productos intermedios reactivos o reparar eficientemente el daño resultante.

Tal disrupción del proceso metabólico normal del microorganismo puede provocar efectos tóxicos debido a la formación de radicales libres y agentes oxidantes, como peróxidos, los cuales pueden conducir a daño a los componentes de las células de los microorganismos, por ejemplo DNA, proteínas o lípidos.

Provocar un efecto sobre el metabolismo del microorganismo significa lograr cambios a los procesos químicos internos, naturales que se llevan a cabo dentro de la célula del microorganismo.

En lo que se refiere a endógenamente, significa cambios que son provocados dentro de la célula del microorganismo para reducir el estrés oxidativo. Por ejemplo estos podrían ser cambios a los procesos metabólicos dentro del microorganismo. Esto también puede incluir la eliminación de las ROS dentro de la célula del microorganismo .

Además, se considera que los iones piruvato, glutamato, calcio y magnesio pueden inhibir directa o indirectamente la formación de y/o degradar las ROS. Este compuesto que ejerce un efecto indirecto sobre las ROS puede hacer esto al interferir con el metabolismo del microorganismo. Esta combinación de compuestos de reparación puede considerarse como reductor indirecto de las ROS endógenamente por ejemplo durante la respiración aeróbica .

Los compuestos de potasio ayudan a disminuir el choque osmótico. Por choque osmótico nos referimos al desequilibrio de la concentración de solutos entre el ambiente que rodea una célula y dentro de la célula. Este desequilibrio provoca un cambio rápido en el movimiento del agua a través de la membrana celular y podría conducir a daño celular. Las células lesionadas o alteradas son mucho más sensibles al estrés osmótico y podrían perder viabilidad debido a este tipo de estrés.

Se considera que la serina y treonina modifican el metabolismo del microorganismo. Por lo anterior se entiende que serina y treonina están implicadas en una vía metabólica que se piensa induce directa o indirectamente una velocidad metabólica mejorada en las células que tienen un metabolismo limitado o disminuido. Mediante el uso de estas dos moléculas las células pueden presentar un crecimiento mejorado.

Deseablemente la combinación antes mencionada de compuestos de reparación de acuerdo con la presente invención mejora sinérgicamente la combinación de reducción o eliminación de las ROS, la reducción del choque osmótico y el mejoramiento del metabolismo. Esto es especialmente cierto en un espectro más amplio de cepas de Legionella pneumophila de lo que anteriormente era posible.

Hemos encontrado que el presente método induce la reparación de células de Legionella pneumophila sometidas a estrés a través de un espectro más de cepas de Legionella pneumophila y de este modo proporciona más exactitud para un recuento de células viables totales. Inesperadamente también hemos encontrado que el método además reduce la cantidad de tiempo de incubación requerido. En general hemos encontrado que el método-puede reducir el tiempo de incubación por muchas horas y en algunos casos al menos uno o dos días.

Inesperadamente también hemos encontrado que el método inventivo puede provocar una reducción de microorganismos interferentes, es decir, aquellos microorganismos diferentes de Legionella pneumophila.

El método de la presente invención que implica poner en contacto adecuadamente células de Legionella pneumophila sometidas a estrés con la combinación de los compuestos de reparación de acuerdo con la presente invención deseablemente inhiben la formación de y/o disminuye y/o elimina las ROS, reduce el choque osmótico y mejora el metabolismo y esto tiende a inducir la reparación de las células sometidas a estrés.

El microorganismo Legionella pneumophila puede ponerse en contacto directamente con el compuesto de reparación durante la recolección de la muestra. Asi, el envase en el cual se recolecta la muestra de agua, en la que se considera contiene el microorganismo y ya' puede contener los compuestos de reparación. De otro modo, una vez que una muestra de agua que contiene Legionella pneumophila ha sido recolectada, ésta puede diluirse con agua para dilución que contenga los compuestos de reparación, con el propósito de análisis. En otra alternativa, la muestra, que opcionalmente haya sido diluida, puede ponerse en contacto con el medio de crecimiento que contiene los compuestos de reparación o los compuestos de reparación pueden ser aplicados después de poner en contacto el microorganismo con el medio de crecimiento. Una vez que la muestra ha sido recolectada, deseablemente ésta puede ponerse en almacenamiento hasta que sea conveniente llevar a cabo el método de acuerdo con la presente invención. También puede ser deseable incorporar todos los compuestos de reparación durante el almacenamiento.

Preferentemente todos los compuestos de reparación utilizados juntos de acuerdo con la presente invención deben ser puestos en contacto con los microorganismos durante el paso de dilución o durante el almacenamiento de la muestra.

Una forma de esta invención deseablemente implica poner en contacto la muestra con un medio de reparación, preferentemente un medio de reparación no selectivo, que contenga el compuesto de reparación y luego poniendo éste en contacto con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento selectivo. Preferentemente, el medio de reparación es un liquido, y más preferentemente un caldo. Cuando el medio de reparación es un liquido, se hace referencia a éste adecuadamente como un método de reparación líquido. Normalmente en un método de reparación líquido, la muestra primero se introduce en un medio líquido que contiene la combinación de acuerdo con la presente invención. En teoría, el método de reparación líquido permite a las bacterias sometidas a estrés repararse en un medio líquido no selectivo. Preferentemente, el método de reparación líquido empleará un caldo como el medio líquido. En general, el medio líquido que contiene los microorganismos Legionella pneumophila luego será transferido a un medio de crecimiento. Los microorganismos sometidos a estrés habían sido reparados antes de la transferencia al medio de crecimiento o se repararían luego del contacto con el medio de crecimiento. Más preferentemente, el medio de crecimiento es un medio de crecimiento selectivo. Normalmente, el medio líquido que contiene los microorganismos será plaqueado en la placa del medio de crecimiento selectivo como puede ser una placa de medio de crecimiento agar selectivo.

En una forma alternativa preferida, el paso (1) consiste en poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento no selectivo conteniendo la combinación de compuestos de reparación, y luego poner ésta en contacto con un medio de reparación que también contenga el compuesto de reparación. Preferentemente, el medio de reparación es un medio de reparación no selectivo, más preferentemente un sólido, y particularmente de preferencia un medio de crecimiento selectivo de agar. Cuando el medio de reparación es un sólido éste podría denominarse como un método de reparación sólido. Normalmente el método de reparación sólido implicará poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento no selectivo conteniendo la combinación de los compuestos de reparación de acuerdo con la presente invención. Posteriormente, éste se puede poner en contacto con un medio de crecimiento selectivo que contenga el compuesto de reparación o combinación de los compuestos de reparación. En esta forma, los ingredientes selectivos y el compuesto o los compuestos, que previenen la formación, disminuyen o eliminan las ROS, se difundirán a lo largo del medio no selectivo.

Deseablemente, el medio de crecimiento no selectivo puede ser un medio de crecimiento no selectivo de agar. Adecuadamente en esta forma la muestra puede ser plaqueada sobre cualquier medio de crecimiento de agar no selectivo, luego un medio de crecimiento de agar selectivo que contenga el compuesto o los compuestos que previenen la formación, disminuye o elimina las ROS se superpone en el medio de crecimiento no selectivo de agar .

En otra forma alternativa, la muestra puede aplicarse a un medio de crecimiento selectivo el cual ya contiene la combinación de compuestos de reparación. Tal medio de crecimiento selectivo puede ser un medio de crecimiento selectivo de agar. El plaqueo de la muestra puede llevarse a cabo como se describe anteriormente.

En otra forma alternativa la muestra puede ser recolectada de agua en forma de un aerosol. Normalmente el aerosol puede ser ubicado en una torre de enfriamiento o acondicionador de aire. Deseablemente el agua se condensa del aerosol antes de hacer las pruebas de acuerdo con el método de la presente invención. En una forma preferida, alternativa, el paso (1) consiste en poner en contacto la muestra del aerosol con agua para dilución conteniendo un medio de reparación, preferentemente un medio de reparación no selectivo que contenga la combinación de compuestos de reparación, y luego poniendo éste en contacto con un medio de crecimiento que también contenga la combinación de los compuestos de reparación.

En todas las formas antes mencionadas de la invención, el medio de crecimiento debe ser adecuado para el crecimiento de Legionella pneumophila . Los tipos de medio de crecimiento adecuados se documentan en la literatura y son bien conocidos por la persona experta. Normalmente, el medio de crecimiento debe contener carbono activado y cisteina.

Se prefiere que el medio de crecimiento selectivo sea un medio de crecimiento selectivo de agar y más preferentemente un medio de crecimiento de agar extracto de levadura carbón amortiguado (BCYE) . El medio de crecimiento BCYE se vuelve selectivo mediante la adición del suplemento de antibióticos. Un medio de crecimiento BCYE altamente deseable con antibióticos es conocido como GVPC (Glicina, Vancomicina, Polimixina B, Cicloheximida) .

El método de plaqueo se documenta en la literatura y es bien conocido por la persona experta. Normalmente el método implicará la aplicación de una cantidad de estas muestras de agua sobre el gel de agar que haya sido colocado en una placa de Petri. Este puede denominarse como método de placa de Petri o un método de plaqueo en agar. El objetivo del plaqueo en agar es dispersar una alícuota, normalmente 100 yL, de agua que se sospecha que contiene el microorganismo, denominada una suspensión bacteriana, en un medio sólido en una placa de Petri. Se pueden utilizar perlas de vidrio o raspador de células para dispersar la suspensión bacteriana en la placa de agar. Después del esparcimiento, la mayor parte del líquido es absorbida por el agar y permanece una capa delgada con bacterias en la superficie del agar. Por incubación, se desarrolla el crecimiento bacteriano en forma de colonias sobre la superficie de agar. La incubación ocurrirá a la temperatura más adecuada para el microorganismo, la cual está documentada en la literatura y es conocida por la persona experta. Normalmente la temperatura será entre 30°C y 50°C, por ejemplo, alrededor de 37 °C.

La combinación de compuestos de reparación debe ser adicionada en una cantidad eficaz para reducir el estrés oxidativo del microorganismo. Preferentemente, será una cantidad eficaz para reducir o prácticamente eliminar las ROS en la célula del microorganismo.

De hecho, hemos encontrado que utilizando una combinación de compuestos de reparación provoca una reducción significativa de la fase de latencia durante el desarrollo de Legionella pneumophila, en particular en un medio liquido. Esta reducción de la fase de latencia en medio liquido da como resultado una reducción del tiempo necesario para obtener una colonia visible sobre la placa de agar.

También puede ser deseable incluir un ceto ácido y/o una enzima depuradora de oxigeno reducido con el medio de reparación y/o medio de crecimiento. Un ceto ácido y/o una enzima depuradora de oxigeno reducido no se considera un compuesto de reparación de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, puede ser benéfico incluir uno o ambos compuestos con cualquier combinación de compuestos de reparación antes mencionados.

La detección y cuantificación de microorganismos viables puede llevarse a cabo por cualquiera de las técnicas conocidas que se documentan en la literatura.

Normalmente esto significa el recuento de colonias visibles de la superficie del medio de crecimiento, como puede ser la placa de agar nutriente.

El método de acuerdo con la presente invención facilita la determinación cuantitativa exacta para la existencia de Legionella pneumophila . Además, el tiempo de incubación puede disminuirse significativamente. El método es adecuado para la detección de Legionella pneumophila en muestras obtenidas de cualquiera de los grupos seleccionados de aguas de enfriamiento industrial, aguas potables y aguas naturales.

La presente invención también incorpora un kit para detectar y enumerar más exactamente los microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra que se sospecha contiene los microorganismos, que contiene: (1) compuestos de reparación, (2) un medio de crecimiento, (3) un medio para incubación (4) medios para la detección y cuantificación de microorganismos, en el que los microorganismos son de las especies Legionella pneumophila y en el que los compuestos de reparación contienen: (a) serina; (b) treonina; (c) un compuesto que contiene iones calcio; (d) un compuesto que contiene iones magnesio; (e) un compuesto que contiene iones potasio (f) ácido flutámico o una sal de éste, y (g) ácido pirúvico o sal de éste.

El kit también puede contener cualquiera de las modalidades descritas en lo que respecta al primer aspecto de la invención.

El kit es adecuado para utilizarlo con el método de la presente invención y permite la enumeración más exacta de Legionella pneumophila , especialmente con respecto a un espectro más amplio de cepas de Legionella pneumophila .

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ej emplos Selección de compuestos y determinación de sus concentraciones óptimas Con el fin de medir los efectos de diferentes compuestos, se comparan 2 criterios: la latencia y la velocidad de crecimiento se observan con el medio de cultivo y el medio suplementado cultivo no suplementado [sic] . Por simplicidad, la latencia se estima por el tiempo necesario para obtener una densidad óptica de 0.1 a 600 nm.

Para todos los compuestos analizados, la ganancia de latencia (indicada por GT) se obtiene por la diferencia entre las latencias obtenidas en el medio de referencia (YEC) y obtenidas en el medio suplementado. En las mismas condiciones, la relación de la velocidad de crecimiento (indicada por RVC) se define como la relación entre la velocidad de crecimiento obtenida en el medio de referencia y la obtenida sobre el medio suplementado (YEC + X) . En el medio de referencia (YEC) , las cepas de L. pneumophila tienen un retardo de tiempo entre 5h y 15h y requiere aproximadamente 10 horas para alcanzar la densidad óptica (indicada como OD) entre 0.1 y 0.3.

Cuando se utiliza serina o treonina como los compuestos de reparación, en cada caso se observan mejoramientos en la latencia y/o velocidad de crecimiento para una variedad de cepas de Legionella pneumophila . Se observa mejoría en un intervalo de dosis, por ejemplo entre 0.01 y 5% con base en el peso del compuesto sobre el volumen de la muestra con la dosis óptima alrededor de 1 g por litro.

Se observa mejoría en la latencia y/o velocidad de crecimiento para numerosas cepas de Legionella pneumophila cuando se utiliza cloruro de calcio o cloruro de magnesio a las dosis de entre 10"6 a 10"2 mM, en especial 10~4 mM.

Se observa mejoría en la latencia y/o velocidad de crecimiento para un número de cepas de Legionella pneumophila cuando se utiliza cloruro de potasio a las dosis de entre 1 a 10~4 mM, en especial alrededor de 10"2 mM.

Las combinaciones particularmente eficaces de compuestos de reparación incluyen: Combinación A 1 g por litro de piruvato, 1 g por litro de serina, 1 g por litro de treonina, 1 g por litro de ácido glutámico, cloruro de calcio 10~4 m , cloruro de magnesio 1CT4 mM.

Combinación B 1.5 g por litro de piruvato, 1.5 g por litro de serina, 1.5 g por litro de treonina, 1 g por litro de ácido glutámico, cloruro de calcio 10~4 mM, cloruro de magnesio 10"4 mM.

Combinación C 2 g por litro de piruvato, 2.5 g por litro de serina, 1 g por litro de treonina, 1 g por litro de ácido glutámico, cloruro de calcio 10~4 mM, cloruro de magnesio 10~4 mM y cloruro de potasio 1.16 xl0~2 mM.

Los resultados mostrarán que varias combinaciones son benéficas para el crecimiento, especialmente en medio liquido conteniendo cepas diferentes.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección y enumeración de microorganismos viables en una muestra sospechosa de contener tales microorganismos que consiste en: (1) poner en contacto los microorganismos de la muestra con compuestos de reparación y un medio de crecimiento, e (2) incubar el producto del paso (1), y (3) detectar y cuantificar los microorganismos viables , en el cual los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila y en el cual los compuestos de reparación contienen: (a) serina; (b) treonina (c) un compuesto que contiene iones calcio en una dosis de 1CT6 hasta 1CT2 mM; (d) un compuesto que contiene iones magnesio en una dosis de 1CT6 hasta 10"2 mM (e) un compuesto que contiene iones potasio (f) ácido glutámico o una sal de éste, y (g) ácido pirúvico o una sal de éste.

2. El método de acuerdo con la reivindicación anterior en el cual el paso (1) consiste en poner en contacto la muestra con un medio de reparación, preferentemente un medio de reparación no selectivo, que contenga el compuesto de reparación y luego poner éste en contacto con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento selectivo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el medio de reparación es un liquido, preferentemente un caldo.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el paso (1) consiste en poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento, preferentemente un medio de crecimiento no selectivo, y luego poner éste en contacto con un medio de reparación que contenga el compuesto de reparación.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el medio de reparación es un medio de reparación selectivo, preferentemente un sólido, y más preferentemente un medio de crecimiento selectivo de agar.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el paso (1) consiste en poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento que contenga el compuesto de reparación .

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual que el medio de crecimiento es un medio de crecimiento de agar extracto de levadura carbón, amortiguado (BCYE) o GVPC.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el medio de reparación y/o medio de crecimiento incluye un ceto ácido y/o una enzima depuradora de oxigeno reducido.

9. El kit para la detección y enumeración más exacta de microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra sospechosa de contener tales microorganismos, contiene: (1) compuestos de reparación, (2) un medio de crecimiento, (3) medios para incubación (4) medios para la detección y cuantificación de microorganismos , en el cual los microorganismos son de las especies Legionella pneumophila , y en el cual los compuestos de reparación contienen: (a) serina; (b) treonina; (c) un compuesto que contiene iones calcio; (d) un compuesto que contiene iones magnesio; (e) un compuesto que contiene iones potasio (f) ácido glutámico o una sal de éste, y (g) ácido pirúvico o la sal de éste.