MX2012010954A - Derivados de indol triciclico como ligandos de receptor periferico de bensodiazepina (pbr). - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un trazador de PET que tiene propiedades mejoradas para la formación de imágenes del receptor periférico de benzodiacepina (PBR) según comparado con dichos trazadores de PET conocidos. La presente invención también proporciona un compuesto precursor útil en la preparación del trazador de PET de la invención y métodos para la preparación de dicho compuesto precursor y dicho trazador de PET. También la presente invención proporciona una composición radiofarmacéutica que comprende el trazador de PET de la invención. También se proporcionan métodos para utilizar el trazador de PET y la composición radiofarmacéutica.

Description

DERIVADOS DE INDOL TRICILICO COMO LIGANDOS DE RECEPTOR PERIFERICO DE BENZODIAZEPINA (PBR) CAMPO TECNICO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la formación in vivo de imágenes y, en particular, formación de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) de receptores de benzodiacepina periféricos (PBS). Se proporciona un trazador de PET a base de indol que se une con alta afinidad a PBR, tiene buena captación en el cerebro después de administración, y el cual tiene excelente unión selectiva a PBR. La presente invención también proporciona un compuesto precursor útil en la síntesis del trazador de PET de la invención, así como un método para la síntesis de dicho compuesto precursor. Otros aspectos de la invención incluyen un método para la síntesis del trazador de PET de la invención que comprende el uso del compuesto precursor de la invención, un equipo para llevar a cabo dicho método, y un cásete para llevar a cabo una versión automatizada de dicho método. Además la invención proporciona una composición radiofarmacéutica que comprende el trazador de PET de la invención, así como métodos para el uso de dicho trazador de PET.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Se sabe que los receptores de benzodiacepina periféricos (PBR) principalmente se encuentran en tejidos periféricos y células gliales pero su función fisiológica permanece claramente elucidada. Los PBR también denominados como proteínas de translocador (TSPO). Sub-celularmente, se sabe que PBR se localizan en la membrana mitocondrial externa, indicando un papel potencial en la modulación de la función mitocondrial y en el sistema inmune. Además se ha postulado que PBR están involucrados en la proliferación de célula, esteroidogénesis, flujo de calcio y respiración celular.

La expresión anormal de PBR se ha asociado con estados de enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (CNS), incluyendo esclerosis múltiples (Banati et al 2001 Neuroreport; 12(16): 3439-42; Debruyne et al 2002 Acta Neurol Belg; 102(3): 127-35), encefalitis de Rasmeussen (Banati et al 1999 Neurology; 53(9): 2199-203) vasculitis cerebral (Goerres et al 2001 Am J Roentgenol; 176(4): 1016-8), encefalitis por herpes (Cagnin et al 2001 Brain; 124(Pt 10): 2014-27), y demencia asociada con SIDA (Hammoud et al 2005 J Neurovirol; 11(4): 346-55).

También en el CNS, se ha documentado un enlace con PBR en enfermedades digestivas tales como enfermedad de Parkinson (Gerhard et al 2006 Neurobiol Dis; 21 (2): 404-12; Ouchi et al 2005 Ann Neurol; 57(2): 161-2), degeneración corticobasal (Gerhard et al 2004 Mov Disord; 19(10): 1221-6), parálisis supranuclear progresiva (Gerhard et al 2006 Neurobiol Dis; 21(2): 404-12), atrofia multisistémica (Gerhard et al 2003 Neurology; 61 (5): 686-9), enfermedad de Huntington (Pavese et al 2006 Neurology; 66(11): 1638-43; Tai et al 2007 Brain Res Bul I ; 72(2-3): 148-51), esclerosis lateral amiotrófica (Turner et al 2004 Neurobiol Dis; 15(3): 601-9), y enfermedad de Alzheimer (Cagnin et al 2001 Lancet; 358(9283): 766; Yasuno et al 2008 Biol Psychiatry; 64(10): 835-41).

Se ha mostrado que un número de condiciones isquémicas del CNS están relacionadas con la expresión anormal de PBR, incluyendo: accidente cerebrovascular (Gerhard et al 2005 Neuroimage; 24(2): 591-5), daño nervioso periférico (Banati et al 2001 Neuroreport; 12(16):3439-42), epilepsia (Sauvageau 2002 Metab Brain Dis; 17(1): 3-11; Kumar et al 2008 Pediatr Neurol; 38(6)). PBR ha sido postulado como un biomarcador para determinar el grado de daño en daño traumático al cerebro (Toyama et al 2008 Ann Nucí Med; 22(5): 417-24), con un aumento en la expresión de PBR reportado en un modelo animal de daño traumático al cerebro (Venneti et al 2007 Exp Neurol; 207(1): 118-27). De manera interesante, el estrés agudo ha sido correlacionado con un aumento en la expresión de PBR en el cerebro, mientras que el estrés crónico ha sido correlacionado con una baja regulación de PBR (Lehmann et al 1999 Brain Res; 851(1-2): 141-7). Se ha reportado que es posible la desalineación de límites de glioma utilizando [11C]PK11195 para la formación de imagen de PBR (Junck et al 1989 Ann Neurol; 26(6): 752-8). PBR también puede ser asociado con dolor neuropático, Tsuda et al habiendo observado microglías en sujetos con dolor neuropático (2005 TINS 28(2) pp101-7).

En la periferia, la expresión de PBR ha sido enlazada con inflamación de pulmón (Branley et al 2008 Nucí. Med. Biol; 35(8): 901-9), enfermedad pulmonar crónica obstructiva y asma (Jones et al 2003 Eur Respir J; 21 (4): 567-73), enfermedad inflamatoria intestinal (Ostuni et al 2010 Inflamm Bowel Dis; 16(9): 1476-1487), artritis reumatoide (van der Laken et al 2008 Arthritis Rheum; 58(11): 3350-5), fibromialgia primaria (Faggioli et al 2004 Rheumatology; 43(10): 1224-1225), daño nervioso (Durrenberger et al 2004 J Peripher Nerv Syst; 9(1): 15-25), aterosclerosis (Fujimura et al 2008 Atherosclerosis; 201(1): 108-111), cáncer de colon, próstata y mama (Deane et al 2007 Mol Cáncer Res; 5(4): 341-9; Miettinen et al 1995 Cáncer Res; 55(12): 2691-5; Han et al 2003 J Recept Signal Transduct Res; 23(2-3): 225-38), inflamación del riñon (Tam et al 1999 Nephrol Dial Transplant; 14(7): 1658-66; Cook et al 1999 Kidney Int; 55(4): 1319-26), y daño isquém ico-reperfusión (Zhang et al 2006 J Am Coll Surg; 203(3): 353-64).

La formación de imágenes a través de tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando el ligando selectivo de PBR, (R)-[11C] PK11195 proporciona un indicador genérico de inflamación del sistema nervioso central (CNS). Sin embargo, se sabe que (R)-[ 1C] PK11195 tiene una alta unión a proteína, y baja unión específica a no específica. Además, el papel de estos metabolitos radiomarcados es desconocido, y la cuantificación de unión requiere de modelación compleja. Consecuentemente, se han hecho esfuerzos par-desarrollar un agente formador de imágenes, in vivo, para PBR que no presente estos problemas. Un dicho agente formador de imágenes, in vivo, es el derivado indol tricíclico descrito en WO 2010/109007, el cual tiene buena afinidad para PBR, excelente captación del cerebro, y especificidad para PBR, y una alta proporción de radioactividad en el cerebro después de 60 minutos de la inyección, y representa el agente formador de imágenes, in vivo, parental. WO 2010/109007 describe que un agente formador de imágenes, in vivo, especialmente preferido es el siguiente compuesto 18F-marcado: Existe un alcance para un agente formador de imágenes, mejorado adicional para la formación de imágenes de PBR.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona un trazador de PET que retiene las propiedades ventajosas del trazador de PET de indol tricíclico, y también tiene un número de propiedades mejoradas. Se ha demostrado que, en comparación con un trazador de PET tricíclico conocido, el trazador de PET de la invención tiene una afinidad de unión mejorada para PBR, un perfil de metabolismo marginalmente mejorado con una alta proporción de actividad 60 minutos después de la inyección, representando la actividad en el cerebro, y una unión a tejidos que expresan PBR específica, significativamente mejorada. La presente invención también proporciona un compuesto precursor útil en la preparación del trazador de PET de la invención, así como métodos para la preparación de dicho compuestos precursor y dicho trazador de PET. La presente invención también proporciona una composición radiofarmacéutica que comprende el trazador de PET de la invención. También se proporcionan métodos para utilizar el trazador de PET y la composición radiofarmacéutica.

DESCRIPCION DETALLAD DE LA INVENCION Trazador de PET En un aspecto, la presente invención proporciona un trazador de tomografía por emisión de positrones (PET) que tiene la siguiente estructura química: en donde el centro quiral tiene la configuración (S).

Un "trazador de PET" es un compuesto químico que comprende un isótopo de emisión de positrones, en donde el compuesto químico está diseñado para tener por objeto una fisiología o patof isiolog ía particular en un sistema biológico. La presencia del isótopo de emisión de positrones permite que el trazador de PET sea detectado después de la administración al sistema biológico y de esta forma facilita la detección de la fisiología o patofisiología particular.

Se ha mostrado que el trazador de PET de la invención tiene una afinidad de casi 5 veces más que aquella de sus enantiómero alternativo, y casi el doble de aquel de la mezcla racémica. También se ha encontrado que el trazador de PET de la invención trabaje mejor ¡n vivo según comparado con su enantiómero alternativo. El trazador de PET de la invención también trabaja mejor in vivo según comparado con la mezcla racémica que comprende dicho trazador de PET y su enantiómero alternativo.

El enantiómero alternativo del trazador de PET de la invención tiene la siguiente estructura: en donde el centro quiral tiene la configuración (R).

El término "enantiómero", como se utiliza en la presente invención, se refiere a un compuesto enantiopuro, es decir, una de las dos formas de imagen de espejo forma una molécula ópticamente activa. Un enantiómero, por lo tanto, es un compuesto que solo tiene una quiralidad, en donde el término "quiralidad" se refiere a esa propiedad de un compuesto por lo cual carece de un plano interno de simetría y tiene una imagen de espejo que no es capaz de sobre-imponerse. La característica que es más frecuente la causa de quiralidad en compuestos químicos es la presencia de un átomo de carbono asimétrico. Una mezcla equimolar de un par de enantiómeros se denomina aquí como un "racemato" o como ur.a "mezcla racémica".

En el experimento de bio-distribución descrito en el Ejemplo 9, se muestra que el trazador de PET de la invención tiene unión mejorada a un tejido rico en PBR en el cerebro (es decir, bulbo olfatorio) comparado con tanto su enantiómero alternativo como con la mezcla racémica. Los resultados del experimento de bloqueo in vivo descrito en el Ejemplo 11 confirman este hallazgo. Los resultados del experimento descrito en el Ejemplo 10 demuestran que la actividad en el cerebro a 60 minutos debido al compuesto parental se mejoró para el trazador de PET de la invención comparado con la mezcla racémica del trazador de PET y su enantiómero alternativo. Además, en el experimento de auto-radiografía descrito en el Ejemplo 12, se demostró que el trazador de PET de la invención tuvo una unión selectiva más alta a áreas de nuero-inflamación según comparado con la mezcla racémica que comprende dicho trazador de PET y su enantiómero alternativo. También se encontró que el trazador de PET de la invención no se racemiza después de ",a incubación en plasma humano o en una fracción de S9 de rata durante períodos extendidos, como se describe en el Ejemplo 8 más adelante.

Compuesto Precursor El trazador de PET de la invención puede ser preparado a través de un compuesto precursor adecuado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un compuesto precursor para la preparación del trazador de PET de la invención, en donde dicho compuesto precursor es de la Fórmula I: en donde R1 es un hidroxilo o es un grupo saliente.

Un "compuesto precursor" comprende un derivado no radioactivo del trazador de PET de la invención, diseñado de manera que la reacción química con una forma química conveniente de 18F ocurre específicamente en el sitio; puede ser conducida en el número mínimo de pasos (idealmente en un solo paso); y sin la necesidad de purificación significativa (idealmente sin purificación adicional), para dar el trazador de PET de la invención. Dichos compuestos precursores son sintéticos y convenientemente pueden ser obtenidos en una buena pureza química.

Un "grupo saliente" en el contexto de la presente invención se refiere a un átomo o grupo de átomos que se desplaza como una especie estable durante una substitución o reacción de radiofluoración de desplazamiento. Ejemplos de grupos salientes adecuados son los halógenos cloro, bromo, y yodo, los sulfonato ésteres mesilato, tosilato nosilato y triflato. De preferencia, dicho grupo saliente se selecciona de mesilato, tosilato y triflato, y y muy preferiblemente es mesilato. Cuando el grupo saliente es mesilato, el compuesto precursor se denomina aquí como "compuesto precursor 1".

Preparación del Compuesto Precursor El compuesto precursor de la invención puede ser obtenido a través de una variedad de diferentes rutas, cada una de las cuales forma un aspecto separado de la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un primer método para preparar el compuesto precursor de la Fórmula I como se define aquí, en donde dicho método comprende: (i) proporcionar una mezcla racémica de dicho compuesto precursor de la Fórmula I, como se define aquí, y un compuesto de la Fórmula II: en donde R2 es como se definió anteriormente para R1, y R1 y R2 son iguales; (ii) separar dicho compuesto precursor de la Fórmula I de dicho compuesto de la Fórmula II.

El paso de "separar" dicho compuesto precursor de la Fórmula I del compuesto de la Fórmula II se realiza a través de una técnica de separación enantiomérica. Las técnicas de separación enantiomérica adecuadas incluyen cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de fluido súper-crítica (SFC), cromatografía de lecho simulado (SBC). Una valoración detallada de las varias técnicas que pueden ser aplicadas para la separación enantiomérica se puede encontrar en "Chiral Separation Techniques: a Practical Approach (2007 Wiley; Subramanian, Ed.).

Esquema 1 6o°C IPA, ZnCla Esquema 1 (cont.) El esquema 1 anterior ilustra un método para obtener una mezcla racémica del compuesto precursor déla Fórmula I y el compuesto de la Fórmula II. En el Esquema 1, PG representa un grupo protector hidroxilo; LG representa un grupo saliente como se define aquí; OTs representa el grupo saliente, tosilato; y, IPA representa alcohol isopropílico. El compuesto g es un compuesto precursor de la invención, en donde R1 es hidroxilo. Los grupos protectores hidroxilo adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen acetilo, bencilo, benzoilo, silil éteres, alquil éteres, y alcoximetil éteres. Los grupos protectores se discuten con más detalle por Theorodora W. Greene and Peter G. M. Wuts en "Protective Groups in Organic Synthesis" (Cuarta Edición, John Wíley & Sons, 2007). En el contexto de la presente invención, un grupo protector hidroxilo es bencilo. El Esquema 1 anterior se basa en los métodos para obtener compuestos similares descritos por Napper et al (J ed Chem 2005; 48: 8045-54) y por Davies et al (J ed Chem 1998; 41: 451-467).

ZnCL Dietilo Reflujo Cromatografía de sílice 10-50% acetato de etilo/petrol Un método alternativo para obtener una mezcla racémica del compuesto precursor de la Fórmula I y el compuesto de la Fórmula II se ilustra en el Esquema 2 anterior. En el Esquema 2, PG es un grupo protector hidroxilo como se definió anteriormente, THF e-3 tetrahidrofurano, KHMDS es bis(trimetilsilil)amida potásica. A partir del compuesto f, el Esquema 2 continúa como se ilustra en el Esquema 1 a partir del compuesto f para obtener la mezcla racémica resultante. El Esquema 2 se basa en el método descrito en WO 2003/014082. En esta ruta sintética, el cloro en la posición inferior en el anillo a mano izquierda fuerza que se presente la ciclización solo de una forma. Sin embargo, cuando los inventores de la presente directamente aplicaron las enseñanzas de WO 2003/014082 para obtener la mezcla racémica del compuesto precursor de la Fórmula I y el compuesto de la Fórmula II, el rendimiento fue bajo. Este problema se superó al cambiar el sistema de solvente usado para el paso de ciclización. En WO 2003/014082, el paso de ciclización se realiza en tolueno, mientras que los inventores de la presente encontraron que se obtuvieron rendimientos óptimos cuando se utilizó éter dietílico en lugar de tolueno. El producto del paso de ciclización se disuelve en éter dietílico, mientras que el compuesto de partida no ciclizado, no. El compuesto de partida no ciclizado, por lo tanto, permanece con ZnCI2 en el fondo de recipiente de reacción, y el producto ciclizado se mueve hacia el éter dietílico en la parte superior del recipiente de reacción.

Un segundo método para obtener el compuesto precursor de !a Fórmula I comprende: (i) proporcionar un compuesto de la Fórmula en donde PG1 es un grupo protector hidroxilo; (ii) convertir dicho compuesto de la Fórmula III a su cloruro ácido correspondiente; (¡ii) hacer reaccionar el cloruro ácido obtenido en el paso (ii) con dietilamida para obtener un compuesto de la Fórmula IV: en donde PG2 es un grupo protector hidroxilo y es igual a PG1; (iv) desproteger el compuesto de la Fórmula IV obtenido en el paso (iii) para obtener el derivado hidroxilo; (v) opcionalmente agregar un grupo saliente como se definió aquí anteriormente.

Tanto el paso (iv) como (v) dan como resultado un compuesto precursor de la Fórmula I como se definió aquí, paso (iv), en donde R1 de la Fórmula I es hidroxilo, y paso (v), en donde R1 de la Fórmula I es un grupo saliente.

El paso (i¡) de "convertir" dicho compuesto de la Fórmula III al cloruro ácido puede ser realizado con un reactivo seleccionado de cloruro de oxalilo, cloruro de tionilo, tricloruro de fósforo, o pentacloruro de fosforo. Se prefiere el cloruro de oxalilo.

El paso de "desproteger" se refiere a la remoción del grupo protector hidroxilo, y puede ser realizado a través de medios bien conocidos pos aquellos expertos en la técnica. El grupo protector hidroxilo, PG1, es como se definió anteriormente para PG en el Esquema 1. El método utilizado se diseñó para el grupo protector hidroxilo, particular. Estrategias típicas para la remoción de grupos protectores hidroxilo incluyen hidrogenolisis, y el tratamiento con un ácido o con una base.

El paso "agregar" el grupo saliente puede ser realizado haciendo reaccionar el compuesto g del Esquema 1 anterior con un derivado halogenuro del grupo saliente deseado bajo condiciones de reacción adecuadas. Por ejemplo, agregar un mesilato, compuesto g en el Esquema 1 anterior, puede hacerse reaccionar con cloruro de metansulfonilo en presencia de una base, por ejemplo, una base amina tal como trietilamina.

En el paso (i) de dicho segundo método para obtener el compuesto precursor de la Fórmula I, el compuesto de la Fórmula III puede ser provisto a través de varias rutas. Por ejemplo, a través de un método que comprende: (a) proporcionar una mezcla racémica de un compuesto de la Fórmula V y un compuesto de la Fórmula VI: en donde: R1 es un alcohol quiral; y PG3 y PG4 son iguales y son cada uno un grupo protector hidroxilo; (b) separar el compuesto de la Fórmula V a partir del compuesto de la Fórmula VI; (c) remover R1 del compuesto separado de la Fórmula V utilizando condiciones ácidas dando como resultado así dicho compuesto de la Fórmula III.

El término "mezcla racémica" es como se definió aquí previamente. El término "alcohol quiral" se refiere a un enantiómero de un alcohol ópticamente activo, en donde el término "enantiómero" es como se definió anteriormente. El término "alcohol" se refiere a un compuesto orgánico que comprenden un grupo hidroxilo unido a un átomo de carbono. Los alcoholes quirales preferidos para usarse en el método anteriormente descrito son mentol y borneol.

El alcohol quiral se separó del compuesto separado de la Fórmula V a través de hidrólisis con ácido. Los ácidos para usarse en este paso incluyen ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, de preferencia ácido clorhídrico 2 molar o ácido sulfúrico 1 molar.

En un aspecto alternativo, el compuesto de la Fórmula III puede ser provisto utilizando un método que comprende: (a) proporcionar una mezcla racémica de dicho compuesto de la Fórmula III y un compuesto de la Fórmula VIII: en donde PG5 es un grupo protector hidroxilo y es igual que PG1 como se definió anteriormente para la Fórmula III; (b) hacer reaccionar la mezcla como se definió en el paso (a) con una amina ópticamente activa para separar dicho compuesto de la Fórmula III de dicho compuesto de la Fórmula VIII.

Una mezcla racémica de dicho compuesto de la Fórmula III y dicho compuesto de la Fórmula VIII puede obtenerse de acuerdo con el método ilustrado en el Esquema 2 anterior, en donde la mezcla racémica deseada es el compuesto p como se ilustra ahí.

Una amina ópticamente activa adecuada para usarse en el método anteriormente descrito puede seleccionarse a partir de 3- Alfa-MetilBencilamina, R-( + )-N-(1-Naftilmetil)-Alfa-Bencilamina, N-(2-Hidroxi) etil-Alfa-metil bencilamina, y 1 ( P-To I i I) Etilamina. Otras aminas ópticamente activas para usarse en el procedimiento anterior están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Aldrich Chemical company.

El paso (b) de hacer reaccionar la mezcla del paso (a) con una amina ópticamente activa para separar dicho compuesto de la Fórmula III a partir de dicho compuesto de la Fórmula IV inicialmente genera dos sales diaestereoméricas. Estas sales diaestereoméricas se separan a través de cristalización a partir de un solvente adecuado tal como acetona, o acetato de etilo. Las sales separadas son tratadas con ácido mineral tal como 2N ácido clorhídrico ó 1 M ácido sulfúrico para regenerar dicho compuesto de la Fórmula III separado de dicho enantiómero de la Fórmula VIII. El compuesto de la Fórmula III después es recuperado a través de extracción en acetato de etilo, separado de la capa acuosa y concentrado al vacío para dar el enantiómero de la Fórmula III.

En una alternativa adicional, el compuesto de la Fórmula III puede ser obtenido utilizando un método que comprende: (a) proporcionar una mezcla racémica de un compuesto de la Fórmula IX y un compuesto de la Fórmula X: (X) en donde PG6 y PG7 son iguales y cada uno es un grupo protector hidroxilo; (b) hacer reaccionar la mezcla como se definió en e paso (a) con una enzima estéreo selectiva para obtener dicho compuesto de la Fórmula III, en donde dicha enzima estéreo selectiva efectúa hidrólisis con éster del compuesto de la Fórmula IX.

La mezcla racémica de dicho compuesto de la Fórmula IX y dicho compuesto de la Fórmula X puede ser obtenida de acuerdo con el método ilustrado en el Esquema 2 anterior, en donde la mezcla racémica deseada es el compuesto o como se ilustra ahí.

Una enzima estéreo selectiva adecuada para usarse en el método anteriormente descrito se puede seleccionar de Candida antárctica lipasa B, esterasa de hígado porcino, lipasa pancreática de porcino, u otras enzimas estéreo selectivas conocidas que actúan en una forma similar.

Preparación del Trazador de PET En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar el trazador de PET de la invención, en donde dicho método comprende la reacción del compuesto precursor de la Fórmula I con una fuente adecuada de 18F. La reacción con 18F puede lograrse a través de desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente presente en la posición R1 del compuesto precursor de la Fórmula I. El compuesto precursor puede ser marcado en un paso a través de la reacción con una fuente adecuada del ion [18F]-fluoruro (18F'), el cual normalmente se obtiene como una solución acuosa a partir de la reacción nuclear de 190(p,n)18F y se hace reactivo a través de la adición de un contraión catiónico y la subsecuente remoción de agua. Los contraiones catiónicos adecuados deben poseer una suficiente solubilidad dentro del solvente de reacción anhidro para mantener la solubilidad de 18F". Por lo tanto, los contraiones que han sido utilizados incluyen iones metálicos grandes pero suaves tales como rubidio o cesio, potasio en complejo con un criptando, tal como Kryptofix™, o sales de tetraalquilamonio. Un contraión preferido es potasio en complejo con un criptando, tal como Kryptofix™, debido a su buena solubilidad en solventes anhidros y actividad de 18F' mejorada. 18F también puede ser introducido mediante O-alquilación de un grupo hidroxilo en la posición R1 en el compuesto precursor con 8F(CH2)3-LG, en donde LG representa un grupo saliente tal como se definió anteriormente.

Una discusión más detallada de técnicas de marcación de 18F bien conocidas se puede encontrar en el Capítulo 6 de "Handbook of Radiopharmaceuticals" (2003; John Wiley and Sons: M.J. Welch and C.S. Redvanly, Eds.).

En una modalidad preferida, el método para preparar el trazador de PET de la invención es automático. Convenientemente se pueden preparar radio-trazadores de [18F] en una forma automática a través de un aparato de radio-síntesis automático. Existen varios ejemplos comercialmente disponibles de dichos aparatos, incluyendo Tracerlab™ y Fastlab™ (ambos de GE Healthcare Ltd.). Dicho aparato comúnmente comprende un "cásete", por lo regular desechable, en donde se realiza la radioquímica, el cual está fijado al aparato con el fin de realizar una radio-síntesis. El cásete normalmente incluye trayectorias de fluido, un vaso de reacción, y puertos para recibir frascos de reactivo así como cualquiera de los cartuchos de extracción de fase sólida usados en los pasos de limpieza pos-radio-sintéticos.

La presente invención por lo tanto proporciona, en otro aspecto, un cásete para la síntesis automática del trazador de PET como se define aquí, que comprende: i) un recipiente que contiene el compuesto precursor de la Fórmula I como se define aquí; y, ii) medios para eluir el recipiente del paso (i) con una fuente adecuada de 18F como se define aquí.

Para el cásete de la invención, las modalidades adecuadas y preferidas del compuesto precursor de la Fórmula I, y la fuente adecuada de 18F, como se definió previamente aquí.

El cásete además puede comprender: ii¡) un cartucho de intercambio iónico para la remoción del exceso de 18F.

Composición Radiofarmacéutica En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición radiofarmacéutica que comprende el trazador de PET como se define aquí junto con un vehículo biocompatible adecuado para administración a mamíferos.

El "vehículo biocompatible" es un fluido, especialmente un líquido, en donde el trazador de PET está suspendido o disuelto, de manera que la composición radiofarmacéutica es fisiológicamente tolerable, por ejemplo, puede ser administrada al cuerpo de un mamífero sin toxicidad o incomodidad indebida. El vehículo biocompatible es convenientemente un vehículo líquido inyectable tal como agua libre de pirógeno, estéril para inyección; una solución acuosa tal como salina (la cual ventajosamente puede ser equilibrada de manera que el producto final para inyección es ya sea isotónico o no hipotónico); una solución acuosa de una o más substancias de ajuste de tonicidad (por ejemplo, sales de cationes de plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sacarosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbítol o manitol), glícoles (por ejemplo, glicerol), u otros materiales de poliol ni iónico (por ejemplo, polietilen glicoles, propilen glicoles, y similares). El vehículo biocompatible también puede comprender solventes orgánicos biocompatibles tales como etanol. Dichos solventes orgánicos son útiles para solubilízar compuestos o formulaciones más lipofílicas. De preferencia, el vehículo biocompatible es agua libre de pirógeno para inyección, salina isotónica o una solución acuosa de etanol. El pH del vehículo biocompatible para inyección intravenosa está convenientemente en la escala de 4.0 a 10.5.

La composición radiofarmacéutica puede ser administrada parenteralmente, es decir, a través de inyección, y muy preferiblemente una solución acuosa. Dicha composición opcionalmente puede contener ingredientes adicional tales como reguladores de pH; solubilizantes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ciclodextrinas o agentes tensoactivos tales como Pluronic, Tween o fosfolípidos); estabilizadores o antioxidantes farmacéuticamente aceptables (tales como etanol, ácido ascórbico, ácido gentísico o ácido para-aminobenzoico). Cuando el trazador de PET de la invención se proporciona como una composición radiofarmacéutica, el método para la preparación de dicho trazador de PET además puede comprender los pasos de obtener una composición radiofarmacéutica, por ejemplo, la remoción del solvente orgánico, la adición de un regulador de pH biocompatible y cualquier ingrediente adicional opcional. Para administración parenteral, también se necesitan tomar pasos para asegurar que la composición radiofarmacéutica sea estéril y apirogénica. Dichos pasos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Método de Formación de Imágenes de PET El trazador de PET déla invención es útil para la detección in vivo de la expresión del receptor PBR en un sujeto. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la formación de imágenes de PET para determinar la distribución y/o el grado de expresión de PBR en un sujeto, en donde dicho método comprende: i) administrar a dicho sujeto el trazador de PET como se define aquí; permitir que dicho trazador de PET se una a PBR en dicho sujeto; ¡ii) detectar señales emitidas por el 18 F comprometido en dicho trazador de PET unido; iv) generar una imagen representativa de la ubicación cantidad de dichas señales; y, v) determinar la distribución y el grado de expresión de PBR en dicho sujeto, en donde dicha expresión está directamente correlacionada con dichas señales.

El paso de "administrar" el trazador de PET de preferencia se realiza parenteralmente, y con mayor preferencia de forma intravenosa. La ruta intravenosa representa la forma más eficiente de suministrar el trazador de PET a través de todo el cuerpo del sujeto, y, por lo tanto, a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y en contacto con PBR expresado en el sistema nervioso central (CNS) de dicho sujeto. La administración intravenosa ni representa una intervención física substancial ni un riesgo de salud substancial al sujeto. El trazador de PET de la invención preferiblemente se administra como la composición radiofarmacéutica de la invención, como se define aquí. El paso de administración no es requerido para una definición completa del método de formación de imágenes de PET de la invención. Como tal, se puede también entender que el método de formación de imágenes de PET de la invención comprende los pasos (ii)-(v) antes definidos, en donde dicho sujeto del paso (ii) es uno al que se pre-administró el trazador de PET de la invención.

Después del paso de administración y precedente al paso de detección, el trazador de PET se deja unir a PBR. Por ejemplo, cuando el sujeto es un mamífero intacto, el trazador de PET dinámicamente se moverá a través de del cuerpo del mamífero, poniéndose en contacto con varios tejidos ahí. Una vez que el trazador de PET se pone en contacto con PBR, se presenta una interacción específica de manera que la eliminación del trazador de PET del tejido con PBR toma más tiempo que del tejido sin, o con menos PBR. Un cierto punto en el tiempo será alcanzado cuando la detección del trazador de PET específicamente unido a PBR se habilita como resultado de la relación entre el trazador de PET unido al tejido con PBR contra aquel unido en tejido sin, o con menos PBR.

El paso de "detectar" del método de la invención involucra la detección de señales emitidas por el 8F comprometido en el trazador de PET a través de un detector sensible a dichas señales, es decir, una cámara de PET. También se entiende que este paso de detección es como la detección de datos de señal.

El paso de "generar" del método de la invención se realiza por una computadora que aplica un algoritmo de reconstrucción a la señal adquirida para producir un grupo de datos. Este grupo de datos después es manipulado para generar imágenes que muestran la ubicación y/o cantidad de señales emitidas por el 18F. Las señales emitidas directamente se correlacionan con la expresión de PBR de manera que el paso de "determinar" puede hacerse al evaluar la imagen generada.

El "sujeto" de la invención puede ser cualquier sujeto humano o animal. De preferencia, el sujeto de la invención es un mamífero. Muy preferiblemente, dicho sujeto es el cuerpo de un mamífero intacto, in vivo. En una modalidad especialmente preferida, el sujeto de la invención es un ser humano. El método de formación ce imágenes in vivo puede ser utilizado para estudiar el PBR en sujetos saludables, o en sujetos que se sabe o que tienen sospecha de tener una condición patológica asociada con la expresión anormal de PBR (de aquí en adelante una "condición de PBR"). De preferencia, dicho método se refiere a la formación de imágenes in vivo de un sujeto que se sabe o que tiene sospecha de tener una condición de PBR, y, por lo tanto, tiene utilidad en un método para el diagnóstico de dicha condición.

Ejemplos de dichas condiciones de PBR, en donde la formación de imágenes in vivo podría ser de uso, incluyen esclerosis múltiples, encefalitis de Rasmeussen, vasculitis cerebral, encefalitis por herpes. Demencia asociada con SIDA, enfermedad de Parkínson, degeneración corticobasal , parálisis supranuclear progresiva, atrofia multisistémica, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, daño nervioso periférico, epilepsia, daño cerebral traumático, estrés agudo, estrés crónico, dolor neuropático, inflamación de pulmón, enfermedad pulmonar crónica obstructiva, asma, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide, fibromialgia, daño a nervios, aterosclerosis, inflamación del riñon, daño por isquemiá-reperfusión, y cáncer, en particular, cáncer del colon, próstata, o mama. El trazador de PET de la invención es particularmente adecuado para la formación de imágenes in vivo del sistema nervioso central debido a su buena captación del cerebro.

En una modalidad alternativa, el método de formación de imágenes de PET de la invención puede ser realizado repetidamente durante el curso de un régimen de tratamiento para dicho sujeto, dicho método comprende la administración de un fármaco para combatir una condición de PBR. Por ejemplo, el método de formación de imágenes de PET de la invención puede ser realizado antes, durante o después del tratamiento con un fármaco para combatir una condición de PBR. De esta manera, el efecto de dicho tratamiento puede ser verificado con el tiempo. La PET es particularmente bien adecuada para esta aplicación ya que tiene una excelente sensibilidad y resolución, de manera que con el tiempo se pueden observar cambios aún relativamente pequeños, una ventaja particular para la verificación del tratamiento.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico de una condición en donde PBR está sobre-regulado, en donde dicho método comprende el método de formación de imágenes de PET como se definió anteriormente, junto con un paso (vi) adicional para atribuir la distribución y el grado de expresión de PBR a una imagen clínica particular.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el trazador de PET como se define aquí para usarse en el método de formación de imágenes de PET anteriormente definido y el método para diagnóstico antes definido. La presente invención también proporciona un trazador de PET como se define aquí para usarse en la elaboración de la composición radiofarmacéutica como se define aquí para usarse en el método de formación de imágenes de PET anteriormente definido y el método para diagnóstico antes definido.

Los aspectos adecuados y preferidos de cualquier aspecto de la presente en múltiples aspectos de la presente invención son como se definió para dichos aspectos en el primer aspecto en donde se describen aquí. La invención ahora se ilustrará a través de una sene de ejemplos no limitantes.

BREVE DESCRIPCION DE LOS EJEMPLOS El Ejemplo 1 describe la síntesis de la mezcla racémica que comprende el compuesto precursor de la Fórmula I y el enantiómero de la Fórmula II.

El Ejemplo 2 describe la síntesis de la mezcla racémica no radioactiva que comprende el análogo no radioactivo del trazador de PET de la invención junto con su enantiómero alternativo.

El Ejemplo 3 describe la síntesis del compuesto precursor 1 /enantiómero activo.

El Ejemplo 4 describe la síntesis del agente formador de imágenes 1 /enantiómero activo.

El Ejemplo 5 describe la síntesis del agente formador de imágenes no radioactivo 1 /enantiómero activo.

El Ejemplo 6 describe el método usado para determinar '.a estereoquímica absoluta.

El Ejemplo 7 describe un ensayo in vitro usado para la valoración de la unión del Racemato 1 no radioactivo y sus dos enantiómeros.

El Ejemplo 8 describe el método usado para investigar la estabilidad quiral del rastreador de PET de la invención in vitro.

El Ejemplo 9 describe un método usado para valorar la bio-distribución in vivo del trazador de PET de la invención, su enantiómero alternativo, y la mezcla racémica de los dos.

El Ejemplo 10 describe un experimento para evaluar el metabolismo del trazador de PET de la invención, y la mezcla racémica que comprende dicho trazador de PET y su enantiómero alternativo.

El Ejemplo 11 describe un ensayo de bloqueo in vivo usado para evaluar el trazador de PET de la invención, y la mezcla racémica que comprende dicho trazador de PET y su enantiómero alternativo.

El Ejemplo 12 describe un un modelo de inflación en un animal usado para evaluar al trazador de PET de la invención, y la mezcla racémica que comprende dicho trazador de PET y su enantiómero alternativo.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 y 4 se refieren al Ejemplo 4 y muestran las trazas de HPLC radiactivas (superior) y de UV (inferior) obtenidas usando el método semi-preparativo para el trazador de PET de la invención y su enantiómero alternativo, respectivamente.

Las Figuras 2 y 5 se refieren al Ejemplo 4 y muestran las trazas de HPLC obtenidas usando el método aquiral analítico para el trazador de PET de la invención y su enantiómero alternativo, respectivamente.

Las Figuras 3 y 6 se refieren al Ejemplo 4 y muestran las trazas de HPLC obtenidas usando el método de HPLC quiral para el trazador de PET de la invención y su enantiómero alternativo, respectivamente.

La Figura 7 se refiere al Ejemplos 8 y muestra cromatogramas de cubierta del trazador de PET y enantiómero alternativo, disuelto en acetonitrilo a una concentración de 0.1 mg/ml.

La Figura 8a se refiere al Ejemplo 8 y muestra un cromatograma del trazador de PET disuelto en acetonitrilo a una concentración de 0.1 mg/ml.

La Figura 8b se refiere al Ejemplo 8 y muestra un cromatograma del trazador de PET (0.1 mg/ml) agregado a plasma humano y extraído antes de la incubación.

La Figura 8c se refiere al Ejemplo 8 y muestra un cromatograma del trazado de PET (0.1 mg/ml) incubado con plasma humano y se extrajo.

Lista de abreviaturas usadas en los Ejemplos AUFS escala completa de unidades de absorbancia aq acuoso DCM diclorometano DFT teoría funcional de densidad DMAP 4-dimetolaminopiridina DMF dimetilformamida EDC clorhidrato de 1 -etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida EOS fin de la síntesis EtOAc acetato de etilo FNA axotomía del nervio facial IPA alcohol isopropílico IR infrarrojo LC-MS cromatografía de líquido-espectroscopia masiva MeCN acetonitrilo MeOH metano NMR resonancia magnética nuclear OBn benciloxi OMs mesilato OTs tosilato PET tomografía de emisión por positrones QMA metil amonio cuaternario RT temperatura ambiente SFC cromatografía de fluido sú per-crítica SPE extracción de fase sólida TLC cromatografía de capa delgada Tol tolueno VCD dicroísmo circular de vibración Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de una Mezcla Racémica del Compuesto Precursor. Mesilato, de la Invención ("Compuesto Precursor") y su Enantiómero Alternativo Ejemplo 1(a): Cloruro de benciloxi-acetilo (1) A ácido benciloxi-acético (10.0 g, 60.0 mmoles, 8.6 mi) en diclorometano (50 mi) se agregó cloruro de oxalilo (9.1 g, 72.0 mmoles, 6.0 mi) y DMF (30.0 mg, 0.4 mmoles, 32.0 µ?) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Existió una rápida evolución de gas a mediad que la reacción prosigue pero la evolución cesó a medida que la reacción se completaba. La solución de diclorometano se concentró al vacío para dar una goma. Esta goma se trató con más cloruro de oxalilo (4.5 g, 35.7 mmoles, 3.0 mi), diclorometano (50 mi), y una gota de DMF. Se presentó una rápida evolución de gas y la reacción se agitó durante 2 horas más. la reacción después se concentró al vacío para dar 11.0 g (cuantitativa) de cloruro de benciloxi-acetilo (1) como una goma. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz, CDCI3) d 73.6, 74.8, 128.1, 128.4, 128.6, 130.0, y 171.9.

Ejemplo 1(b): 2-Benc¡loxi-N-(2-cloro-5-metoxi-fenil) acetamida (2) Se agitaron cloruro de benciloxi-acetilo (1) (11.0 g, 60.0 mmoles) y clorhidrato de 2-cloro-5-metoxianilina (11.7 g, 60.2 mmoles) en diclorometano (100 mi) a 0°C, y se agregó lentamente trietilamina (13.0 g 126.0 mmoles, 18.0 mi) durante 15 minutos. La reacción agitada se dejó calentar a temperatura ambiente durante 18 horas. Se presentó una precipitación pesada de clorhidrato de trietilamina. La solución de diclorometano se lavó con 10% carbonato de potasio acuoso (50 mi), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 18.9 g (cuantitativa) de 2-Benciloxi-N-(2-cloro-5-metoxi-fenil) acetamida (2) como una goma. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz, CDCI3): d 55.6, 69.6, 73.6, 106.2, 111.1, 114.1, 127.7, 128.3, 128.6, 129.2, 134.6, 136.5, 158.9, y 167.7.

Ejemplo 1(c): (2-Benciloxi-etil)-(2-cloro-5-metoxifenH) amina (3) Se agitó 2-benciloxi-N-(2-cloro-5-metoxi-fenil) acetamida (2) (18.9 g, 62.0 mmoles) en THF (100 mi) y se agregó lentamente hidruro de litio-aluminio (4.9 g, 130.0 mmoles) durante 15 minutos. Se presentó una rápida evolución de gas hidrógeno a medida que primero se añadía hidruro de litio-aluminio. La reacción después se calentó a reflujo durante 4 horas y se dejó reposar a temperatura ambiente durante el fin de semana. La reacción después se extinguió a través de la adición gota a gota de agua (50 mi) a la solución agitada. Se presentó una violenta evolución de hidrógeno haciendo que la mezcla de reacción se llevara a reflujo. La reacción después se concentró al vacío a una lechada. Se agregaron agua (200 mi) y acetato de etilo (200 mi) y la mezcla se agitó vigorosamente. La reacción después se filtró a través de celite para remover el hidróxido de aluminio precipitado y la solución de acetato de etilo se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 18.4 g (cuantitativa) de (2-Benciloxi-etil)-(2-cloro-5-metoxifenil) amina (3) como una goma. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 Hz, CDCI3) d 43.3, 55.3, 68.2, 73.0, 98.1, 101.8, 111.6, 127.6, 127.7, 128.4, 129-3, 137-9, 144-8, y 159.5.

Ejemplo 1(d): éster etílico del ácido 5-bromo-2-hid roxi-ciclohex-1 -en-carboxílico (4) Se disolvió 2-oxociclohexan-carboxilato de etilo (30 g, 176 mmoles, 28 mi) en éter dietílico (30 mi) y se enfrió a 0°C bajo nitrógeno. Se agregó gota a gota bromo (28 g, 176 mmoles, 9.0 mi) durante 15 minutos y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 90 minutos. La mezcla se vació lentamente en carbonato de potasio acuoso saturado enfriado con hielo (250 mi) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 mi). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron, se concentraron al vacío y se secaron en la línea a vacío durante 18 horas para dar 41.4 g (94%) de éster etílico de ácido 3-bromo-2-hidroxi-1 -en-carboxílico (4) como un aceite amarillo. La estructura se confirmó a través de 3C NMR (75 MHz, CDCI3): d 14.1, 17.7, 21.8, 32.0, 60.0, 60.8, 99.7, 166.3, y 172.8.

Ejemplo 1(e): éster etílico del ácido 3r(2-benciloxi-etil)-(2-cloro-5-metoxi-fenil-amino1-2-hidroxi-ciclohex-1 -en-carboxílico (5) Se agitó (2-benciloxi-etil)-(2-cloro-5-metoxifenil) amina (3) (10.0 g, 34.2 mmoles) en THF seco (100 mi) a -40°C bajo nitrógeno y se agregó bis(trimetilsilil) amida de potasio (143.0 mi de una solución de 0.5 M en tolueno, 72.0 mmoles) durante 30 minutos. Después se agregó éster etílico del ácido 3-bromo-2-hidroxiciclohex-1 -en-carboxílico (4) (8.5 g, 34.2 mmoles) en THF seco (10 mi) y se dejó calentar a temperatura ambiente durante un período de 1.5 horas. Se agregó ácido acético (10.0 g, 166 mmoles, 10.0 mi) y se concentró al vacío para remover el THF. Se agregaron acetato de etilo (200 mi) y 10% carbonato de potasio acuoso (100 mi) y la mezcla se agitó vigorosamente. La solución de acetato de etilo se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 16.5 g (cuantitativa) de éster etílico del ácido 3[(2-benciloxi-etil)-(2-cloro-5-metoxi-fenil)-amino]-2-hidroxi-ciclohex-1 - en-carboxílico (5) como una goma que se utilizó cruda en el siguiente paso. HPLC (Gemini 150 x 4.6 mm, 50-95% metanol/ agua durante 20 minutos) de la mezcla de reacción cruda, 18.9 minutos (38%), 19.2 minutos (25%), 23.1 minutos 28%).

Un componente de la reacción se aisló 13C NMR (75 MHz, CDCI3) d 14.3, 20.6, 21.8, 26.4, 38.6, 43-0, 55-8, 60.5, 68.7, 73-3, 93,4, 106.3, 108.2, 119.3, 121.5, 127-5, 127-6, 128.3, 135-7, 137-0, 137-9, 155-7, y 175-0.

Ejemplo 1(f): éster etílico del ácido 9-(2-benciloxi-et¡l)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9.-tetrahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (6) Se agregó cloruro de zinc (7.1 g, 52.0 mmoles) a éster etílico del ácido 3[(2-benciloxi-etil)-(2-cloro-5-metoxi-fenil)-amino]-2-hidroxi-ciclohex-1 -en-carboxílico (5) (8.0 g, 17.0 mmoles) en éter dietílico seco (150 mi) bajo nitrógeno y se calentó a reflujo durante 5.5 horas. A medida que la reacción se llevaba a reflujo, se formó un aceite denso, espeso de color café en la reacción. La reacción después se enfrió y el sobrenadante éter dietílico se decantó, se agregó acetato de etilo (100 mi), se lavó con 2 N HCI (50 mi) y con 10% carbonato de potasio acuoso (50 mi). La capa de éter dietílico se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar un aceite (2.0 g). El material crudo se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A): acetato de etilo (B) (10-40% (B), 340 g, 22 CV, 150 mi/minutos) para dar 1.8 g de éster etílico del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (6). La capa densa espesa de color café se trató con acetato de etilo (100 mi) y 2 N HCI (50 mi). La solución de acetato de etilo se separó, se lavó con 10% carbonato de potasio acuoso (50 mi), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar un aceite (5.2 g). Se agregaron éter dietílico (100 mi) y cloruro de zinc anhidro (7.0 g). La mezcla se calentó a reflujo durante 5 días más. La capa de éter se decantó a partir de la goma oscura, se lavó con 2 N HCI (50 mi), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar una goma (2.8 g). Esta goma se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A): acetato de etilo (B) (5-35% (B), 340 g, 150 ml/minutos) para dar 2.1 g de éster etílico del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (6). El material total obtenido fue 4.1 g (50%) de éster etílico del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (6). La estructura se confirmó a través de 13C N R (75 MHz, CDCI3): d 14.4, 20.5, 22.3, 27.5, 40.2, 43.9, 55.0, 60.2, 70.7, 73-3, 100.2, 107.5, 108.4, 120.1, 122.8, 127.4, 127.5, 128.2, 132.0, 137.4, 138.1, 152.6, y 175.8.

Ejemplo 1(g): ácido 9-(2-benciloxi-etil-8-cloro-5-metoxi-2.3,4.9, -te ta hidro-1H-carbazol -4 -carboxílico (7) A éster etílico del ácido 9-(2-benciloxi-et¡l)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (6) (2.0 g, 4.1 mmoles) en etanol (50 mi) se agregó hidróxido de sodio (1.1 g, 27.1 mmoles) y agua (5 mi) y se calentó a 80°C durante 18 horas. El etanol después se removió a través de evaporación al vacío y el residuo se dividió entre éter dietílico (50 mi) y agua (50 mi). La capa de éter dietílico se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar una goma (71.0 mg). La capa acuosa se acidificó a un pH de 1 con 2N HCI (20 mi) y se extrajo con diclorometano (2 x 100 mi). La capa de diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 1.6 g (87%) de ácido 9-(2-bencilox¡-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (7) como una espuma. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz; CDCI3): d 20.2, 22.2, 27.1, 39.7, 44.0, 55.1, 70.7, 73-3, 100.6, 106.3, 108.9, 123-0, 127.4, 127-5, 128.3, 132.0, 138.0, y 152.0.

Ejemplo 1(h): cloruro de 9-(2-benciloxi-etil-8-cloro-5;-metox¡-2.3,4,9,-tetahidro-1H-carbazol-4-carbonilo (8) Se disolvió ácido 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2, 3,4,9, -tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (7) (1.5 g, 3.7 mmoles) en diclorometano (50 mi) y se agregaron cloruro de oxalilo (700 mg, 5.5 mmoles, 470 µ?) y DMF (1 gota) y la reacción se agitó a 20°C durante 2 horas. Se presentó una moderada evolución de gas durante aproximadamente 30 minutos a medida que la reacción proseguía. La reacción después se concentró al vacío para dar cloruro de 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1 H -car bazo I -4-carbonilo (8) como una goma, el cual se utilizó en el siguiente paso sin purificación. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz; CDCI3): d 20.8, 22.1, 26.4, 44.2, 51.8, 55.1, 70.7, 73.3, 100.7, 106.0, 108.6, 119.5, 123-4, 127-3, 127-7, 128.3, 131-9, 138.0, 138.2, 152.0, y 176.3.

Ejemplo 1(i): dietilamida del ácido 9-(2-benciloxi-etil-8-cloro-5-metoxi-2.3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (9) Después se disolvió cloruro de 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9,-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carbonilo (8) (1.6 g, 3.7 mmoles) en diclorometano (50 mi), se enfrió a 0°C, se agitó y se agregó gota a gota dietilamina (810 mg, 11.0 mmoles, 1.1 mi). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante un período de 18 horas. La mezcla de reacción después se lavó con 10% carbonato de potasio acuoso (50 mi), se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío a una goma. El material crudo se cristalizó a partir de éter dietílico para dar 1.2 g (71%) de dietilamida del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2, 3,4,9-tetrah idro- 1 H-carbazol-4-carboxílico (9) como un sólido cristalino blanco. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz; CDCI3): d 13.0, 14.5, 19-8, 22.2, 27.9, 36.4, 40.4, 41-9, 43-8, 55-0, 70.8, 73-3, 100.2, 108.5, 108.6, 119.9, 122.5, 127-4, 127-5, 128.3, 131.5, 137-8, 138.2, 152.4, y 174.5.

Ejemplo dietilamina del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (10) Se agitó dietilamida del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-8-cloro-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (9) (1.0 g, 2.1 mmoles) en metanol (100 mi) con paladio sobre carbón al 10% (1.0 g), trietilamina (2.9 mg, 2.9 mmoles, 4 µ?) bajo una atmósfera de gas hidrógeno durante 18 horas a 55°C. La reacción después se filtró a través de una almohadilla de celite y el filtrado se concentró al vacío para dar una goma (908 mg). La goma después se recogió en diclorometano (100 mi) y se lavó con una solución de 5% carbonato de potasio acuoso (50 mi). La solución de diclorometano después se separó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar una goma. La goma después se cristalizó a partir de éter dietílico (50 mi) y los cristales se recolectaron a través de filtración para dar 523 mg (57%) de dietilamina del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (10). La estructura se confirmó a través de 3C NMR (75 MHz; CDCI3): d 13.1, 14-6, 20.1, 22.0, 28.1, 36.4, 40.5, 42.0, 43.0, 54.7, 68.8, 73-3, 99-4, 102.4, 107.8, 116.4, 121.2, 127.6, 127.6, 128.3, 135-6, 137-8, 138.0 153-6, y 175.0.

Ejemplo 1(k): dietilamina del ácido 9-(2-hidroxietil-5-metoxi-2.3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (11) Se agitó dietilamina del ácido 9-(2-benciloxi-etil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (10) (1.0 g, 2.1 mmoles) en metanol (50 mi) con paladio sobre carbón al 10% (300 mg), y exceso de gas hidrógeno durante 18 horas a 55°C. La reacción después se filtró a través de una almohadilla de celite y el filtrado se concentró al vacío para dar 578 mg (100%) dietilamina del ácido 9-(2-hidroxietil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (11) como una espuma. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz; CDCI3): d 13.0, 14.4, 20.0, 22.0, 28.0, 36.4, 40.6, 42.0, 54.7, 60.6, 99.2, 102.6, 107.0, 116.7, 121.1, 136.1, 137-5, 138.0 153.5, y 175.7.

Ejemplo 1(1): éster 2-(4-dietilcarbamil-5-metoxi-1 ,2.3.4-tetrahidro-carbazol-9-il) etílico del ácido metansulfónico Se enfrió dietilamina del ácido 9-(2-hidroxietil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (11) (478 mg, 1.4 mmoles) en diclorometano (30 mi) a 0°C y se agregaron cloruro de metansulfonilo (477 mg, 4.2 mmoles, 324 µ?) y trietilamina (420 mg, 4.2 mmoles, 578 µ?) y se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se lavó con una solución de 5% carbonato de potasio acuoso. Las capas se separaron. Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío para dar una goma (696 mg). El material crudo se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A): acetato de etilo (B) (75-100% B, 22 CV, 120 g, 85 ml/minutos) para dar 2-(4-dietilcarbamil-5-metoxi-1,2,3,4-tetrahidro-carbazol-9-il) etílico éster del ácido metansulfónico como una goma que se cristalizó a partir de éter dietílico para dar 346 mg (59%) de un sólido incoloro. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz; CDCI3): d 13.1, 14-5, 20.0, 21.9, 28.0, 36.3, 36.7, 40-3, 41-8, 41-9, 54-7, 68.1, 100.0, 102.0, 109.0, 116.4, 122.0 135.1, 137.3, 153-8, y 174.6.

Ejemplo 2: Síntesis de una Mezcla Racémica del Trazador de PET no radioactivo de la Invención y su Enantiómero Alternativo Ejemplo 2 (a): Tosilato de fluoroetilo (12) Se disolvió 2-fluoroetanol (640 mg, 10 mmoles, 0.6 mi) en piridina (10 mi) bajo nitrógeno. La solución se agitó a 0°C y se agregó en porciones cloruro de tosilo (4.2 g, 21.8 mmoles) a la solución durante un período de 30 minutos, manteniendo la temperatura por abajo de 5°C. La reacción se agitó a 0°C durante 3 horas. Se agregó lentamente hielo seguido por agua (20 mi). La mezcla de reacción se extrajo en acetato de etilo y se lavó con agua. El exceso de piridina se removió lavando con una solución de 1N HCI hasta que la capa acuosa se hizo ácida. El exceso de cloruro de tosilo se removió lavando con 1 M carbonato de sodio acuoso. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 2.1 g (98%) de tosilato de fluoroetilo (12) como un aceite incoloro. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz, CDCI3): d 21.6 (CCH3), 68.5 (d, JCF = 173 Hz, OCH2CH2F), 80.6 (d, JCF = 173 Hz, OCHjCHzF), 128.0, 129.9, 132.6, y 145.1.

Ejemplo 2(b): 2-cloro-5-metoxi-fenil) (2-fluoroetil) amina (13) Se disolvió clorhidrato de 2-cloro-5-metoxianilina (5.0 g, 26.0 mmoles) en DMF (50 mi) y se agregó hidruro de sodio (2.3 g, 60% en aceite, 57.0 mmoles). La reacción se agitó durante 30 minutes a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se agregó gota a gota tosilato de fluoroetilo (12) (6.7 g, 31.0 mmoles) en DMF (5 mi) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción después se calentó a 0°C durante 18 horas. La reacción se dejó enfriar y el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 mi) y se lavó con agua (2 x 100 mi). Las capas orgánicas se recolectaron, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío para dar un aceite café, el cual se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A): acetato de etilo (B) (5 - 30% (B), 330 g, 18.1 CV, 120 ml/minutos) para dar 1.3 g (25%) de 2-cloro-5-metoxi-fenil) (2-fluoroetil) amina (13) como un aceite amarillo. La estructura se confirmó a través de 3C NMR (75 MHz; CDCI3): d 43-8 (d, JCF = 23 Hz), 55.3, 82.0 (d, JCF = 165 Hz), 98.1, 102.2, 111.6, 129.5, 144.1, y 159.5.

Ejemplo 2(c): éster etílico del ácido 3-f(2-cloro-5-metoxi-fenil)-(2-fluoroetil) amino1-2-hidroxi-ciclohexil-1 -en-carboxílico (14) Una solución de 2-cloro-5-metox¡-fenil) (2-fluoroetil) amina (13) (6.1 g, 30.0 mmoles) en THF (170 mi) se enfrió a -40°C. Se agregó gota a gota bis(trimetilsilil)amida potásica (126.0 mi de una solución de 0.5 M en tolueno, 63.0 mmoles) y la reacción se agitó durante 30 minutos a -40°C.) Se agregó gota a gota éster etílico del ácido 3-bromo-2-hidroxi-ciclohex-1 -en-carboxílico (4; preparado de acuerdo con el Ejemplo 1(d)) (7.4 g, 30.0 mmoles) en THF (30 mi) a -40°C. El baño de enfriamiento se removió y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se extinguió con salmuera (300 mi) y se extrajo en acetato de etilo (2 x 400 mi), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 12.0 g (cuantitativa) de éster etílico del ácido 3-[(2-coro-5-metoxi-fenil)-(2-fluoroetil)amino]-2-hidroxi-ciclohexil-1 -en-carboxílico (14) como un aceite café que se utilizó crudo en el siguiente paso. La estructura como una mezcla de isómeros se confirmó a través de 1H NMR (300 MHz, CDCI3): d? 1.08 (0.8H, t, J = 9 Hz, C02CH2CH3), 1.22-1.33 (2.2 H, m, C02CH2CH3), 1.40-2.60 (7H, m, 4-, 5-, y 6-CH2, CHN), 3.20-4.50 (10H, m, NCH2CH2F, NCH2Cj±2F, OCH3, CHCOzCH^CHa), 6.50-6.70 (1H, m, CHC(OCH3)CHCH), 6.95 (0.5H, dd, J = 3 y 6 Hz, CHC(OCH3)CHCH), 7.08 (0.5H, d, J= s Hz, CHC(OCH3)CHCH), y 7.20-7.30 (1 H, m, CHC(OCH3)CHCH).

Ejemplo 2(d) éster etílico del ácido 8-cloro-9-(2-f luoroetil-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (15) La síntesis de éster etílico del ácido 8-cloro-9-(2-f luoro-etil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (15) se intentó inicialmente utilizando las condiciones descritas en WO 2003/014082. Se enfrió una solución de 2-cloro-5-metoxi-fenil) (2-fluoroetil) amina (13; preparada de acuerdo con el Ejemplo 2(b)) (600 mg, 3.8 mmoles) en THF seco (20 mi) en un baño de hielo y se trató con bis(trimetil silil) amida potásica (16 mi de una solución de 0.5 M en tolueno, 8.0 mmoles). Después de 30 minutos se agregó éster etílico del ácido 3-bromo-2-hidroxi-ciclohex-1-en-carboxílico (4; preparado de acuerdo con el Ejemplo 1(d)) (1.04 g, 4.2 mmoles) en THF (4 mi) y la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se extinguió con una solución de cloruro de amonio saturado y se extrajo dos veces con éter. Los extractos se lavaron con agua, salmuera, se secaron y se concentraron al vacío. El material crudo se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A) y acetato de etilo (B) (2.5-50 % B, 50 g, 25 CV, 40 ml/minutos). La mancha principal fue una mezcla de tres compuestos. Esta mezcla se llevó a reflujo en tolueno (20 mi) con cloruro de zinc seco (1.7 g, 12.6 mmoles) durante la noche. La reacción se concentró al vacío y el residuo se dividió entre 1N HCI (25 mi) y acetato de etilo (25 mi) y después se extrajo una vez más con acetato de etilo. Las capas orgánicas se lavaron con agua y salmuera, se secaron y se concentraron al vacío para dar un aceite café. 1H NMR indicó que fue una mezcla de varios compuestos. La TLC sobre sílice en una escala de solventes no pudo separar esta mezcla en manchas separadas. La comparación de la H NMR de la mezcla con una muestra auténtica indicó que la mezcla contuvo un estimado de 25% de éster etílico del ácido 8-cloro-9-(2-fluoro-etil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (15).

Después se llevó a cabo un método modificado. Se disolvió éster etílico del ácido 3-[(2-cloro-5-metoxi-fenil)-(2-fluoroetil)amino]-2-hidroxi-ciclohexil-1 -en-carboxílico (14) (12.2 g, 30.0 mmoles) en éter dietílico (250 mi) y se agregó zinc cloruro de (16.4 g, 120.0 mmoles). La reacción se calentó a reflujo durante 16 horas. Se agregó acetato de etilo (500 mi) para disolver todo y se lavó con 2N HCI (200 mi), agua (200 mi), 10% carbonato de potasio acuoso (200 mi), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío. ?: material crudo se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A): acetato de etilo (B) (5-20% B, 12 CV, 10 g, 100 ml/minutos) para dar 5.3 g (50% en 2 pasos) de éster etílico del ácido 8-cloro-9-(2-fluoroetil)-5-metoxi-2,3,4,9-te rahidro-1H-carbazol-4-carboxílico (15) como un sólido amarillo. La estructura se confirmó a través de 3C NMR (75 MHz, CDCI3): d 14.4, 20.4, 22.2, 27.4, 40.1, 44.2 (d, JCF = 23 Hz), 55.1, 60.2, 83.9 (d, JCF = 173 Hz), 100.6, 107.9, 108.2, 119.8, 123.1, 131.9, 137.2, 152.7, y 175.7.

Ejemplo 2(e); éster etílico del ácido 9-(2-Fluoroetil-5-metoxi-2.3.4.9-tetrahidro-1 H-carbazol -4-carboxílico (16) Se disolvió éster etílico del ácido 8-cloro-9-(2-fluoroetil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (15) (5.3 g, 15.0 mmoles) en metanol (180 mi) y se agregaron trietilamina (1.8 g, 18.0 mmoles, 2.5 mi) y Pd/C al 10% (2 g en metanol (20 mi)). La mezcla se colocó en el hidrogenador de Parr y se agitó durante 18 horas bajo una atmósfera de hidrógeno. La reacción se filtró a través de una almohadilla de celite, se lavó con metanol y el solvente se removió al vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo (300 mi) y se lavó con 10% carbonato de potasio acuoso (200 mi), se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para dar 4.2 g (88%) de éster etílico del ácido 9-(2-fluoroetil)-5-metox¡-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (16) como un sólido café claro. La estructura se confirmó a través de 3C NMR (75 MHz, CDCI3): d 14-3, 20.6, 21.8, 27.6, 40.3, 43.3 (d, JCF= 23 Hz), 54.9, 60.1 , 82.0 (d, JCF = 165 Hz), 99.8, 102.1 , 107.3, 117-2, 121.8, 134.9, 137.6, 153.8, y 176.0.

HPLC (Gemini 150 x 4.6 mm, 50-95% metanol/agua durante 20 minutos) 13.6 minutos (94%).

Ejemplo 2(f): ácido 9-(2-fluoroetil-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (17) Se disolvió éster etílico del ácido 8-cloro-9-(2-fluoroetil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico (16) (380 mg, 1.2 mmoles) en etanol (4 mi). Se agregó una solución de hidróxido de sodio (580 mg, 14.5 mmoles) disuelto en 6 mi de agua. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche. El solvente se removió al vacío y la mezcla cruda se diluyó con agua, se acidificó con 2 N HCI hasta hacerse ácida, y se lavó con diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío para dar 347 mg (cuantitativa) de ácido 9-(2-fluoroetil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H -car bazo I-4-carboxílico (17) como un sólido blanquecino, el cual se utilizó crudo en el siguiente paso. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz; CDCI3): d 20.4, 21.9, 27.2, 39.9, 43.3 (d, JCF = 23 Hz), 55.1 , 81.9 (d, JCF = 173 Hz), 100.3, 102.8, 106.2, 117.1 , 122.2, 135.6, 137.8, 153.3, y 180.8.

Ejemplo 2(g): cloruro de 9-(2-fluoroet¡l)-5-metox¡-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-4-carbonilo (18) Una solución de ácido 9-(2-fluoroetil)-5-metoxi-2, 3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxíllco (17) (347 mg, 1.2 mmoles) en diclorometano seco (2 mi) se agitó bajo nitrógeno. Se agregó cloruro de oxalilo (453 mg, 3.6 mmoles, 300 µ?.) seguido por una gota de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas después se evaporó al vacio para dar 371 mg (cuantitativa) de cloruro de 9-(2-f luoroetil)-5-metox¡-2 , 3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carbonilo como una goma, la cual se utilizó en el siguiente paso sin purificación. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz, CDCI3): d 20.2, 21.7, 26.4, 43.3 (d, JCF = 23 Hz), 54.9, 80.5, 83.1, 100.2, 102.2, 105.8, 116.7, 122.4, 135.5, 137.4, 153-5, y 176.6.

Ejemplo 2(h): dietilamida del ácido 9-(2-f I uoroetil-5-metoxi-2,3,4,9-tetahidro-1H-carbazol-4-carboxílico Se disolvió cloruro de 9-(2-fluoroetil)-5-metoxi-2,3,4,9-tetrahidro-1 H -carbazol-4-carbonilo (18) (371 mg, 1.2 mmoles) en diclorometano (2 mi) y se enfrió a 0°C. Después se agregó dietilamina (177 mg, 2.4 mmoles, 250 µ?) y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se extinguió con 10% carbonato de potasio acuoso (2 mi). La capa de diclorometano se recolectó a través de un separador de fase, después se concentró al vacío. El material crudo se purificó a través de cromatografía de gel de sílice eluyendo con petrol (A): acetato de etilo (B) (50-100% (B), 50 g, 35.2 CV, 40 ml/minutos) para dar un sólido amarillo pálido. El sólido después se tituló con una cantidad mínima de éter dietílico para dar 240 mg (58%) de dietilamida del ácido 9-(2-fluoroetil)-5-metoxi- 2,3,4,9-tetrahidro-1 H-carbazol-4-carboxílico. La estructura se confirmó a través de 13C NMR (75 MHz, CDCI3): d 13-0, 14.6, 19.9, 21.9, 28.0, 36.3, 40.5, 41.9, 43.1 (d, JCF = 23 Hz), 54.7, 82.0 (d, JCF = 173 Hz), 99.7, 102.1, 108.3, 117.0, 121.5, 135-3, 137.4, 153.3, y 174.8.

Ejemplo 3: Síntesis del Compuesto Precursor 1 y su Enantiómero Compuesto Precursor 1 La mezcla racémica del Compuesto Precursor 1 y su enantiómero alternativo (obtenido como se describió en el Ejemplo 1 ) se separó en sus enantiómeros utilizando cromatografía de fluido súper-crítica quiral (C02) en una columna de Kromasil Amycoat, 250x10 mm, 5 µ??, 100 A utilizando IPA al 30% a 40°C a 13 mi un minuto con un tiempo de operación de 6 minutos. Se disolvieron 60 mg del racemato en 1,4-dioxano (2 mi) y hasta 200 µ? a la vez se inyectaron para cada operación. Se logró una separación de línea de base entre los dos enantiómeros. La determinación de HPLC analítica de la pureza enantiomérica de los dos enantiómeros separados en una IC de Chiral Technologies, 250 x 4.6 mm, 5 µ??, operación ¡socrática, 890:20 - MeOH:IPA a 0.5 ml/minuto a temperatura ambiente indicó una pureza enantiomérica de 99.5% de cada uno los enantiómeros.

Ejemplo 4: Síntesis del Trazador de PET de la Invención y su Enantiómero Alternativo El compuesto precursor 1 y su enantiómero obtenido de acuerdo con el Ejemplo 3 se marcaron con 18F utilizando un cásete de FASTLab™ (GE Healthcare).

El [18F]fluoruro suministrado de GE Healthcare en un ciclotrón GE PETrace se atrapó en un cartucho QMA. Se agregaron K222 (8 mg), KHC03 (200 µ?, 0.1M ac.) y Me(CN) (1 mi) al frasco de elución 1. Se utilizaron 0.6 mi del producto eluido del frasco de elución 1 para eluir el cartucho QMA. El secado del producto eluido 18F se llevó a cabo a 100°C durante 20 minutos, seguido por enfriamiento a 86°C antes de la adición del precursor.

Se disolvieron 3 mg de cada compuesto precursor en 1.6 mi de CH3CN. Se agregó 1 mi de esta solución al recipiente de reacción. El recipiente de reacción se calentó a 100°C durante 15 minutos. El recipiente de reacción después se enjuagó con 2 mi de agua.

La HPLC de semi-preparación se llevó a cabo como sigue: La HPLC quiral analítica se llevó a cabo como sigue: El rendimiento de EOS para el trazador PET de la invención fue %, y para su enantiomero fue de 19%.

Ejemplo 5: Síntesis del Análogo no radioactivo del Trazador de PET de la Invención y su Enantiomero Alternativo Trazador de PET no radioactivo La mezcla de reacción del trazador de PET no radioactivo de la invención y su enantiomero alternativo (obtenido como se describió en el Ejemplo 2) se separó en sus enantiómeros utilizando cromatografía de fluido súper-crítica (C02) quiral (SFC) en una columna Kromasil Amycoat, 250x10 mm, 5 pm, 100 A utilizando IOA al 20% a 40°C a 14 mi por minuto con un tiempo de operación de 6 minutos. Se disolvieron 100 mg de la mezcla racémica en 1,4-dioxano (2.5 mi) y hasta 200 µ? a la vez se inyectaron para cada operación. Las fracciones se cortaron en un momento para asegurar que no se recolectaran fracciones mezcladas. La determinación de HPLC analítica de la pureza enantiomérica de los dos enantiómeros separados en una IC de Chiral Technologies, 250x4.6 mm, 5 pm, operación ¡socrática, 80:20 - MeOH:IPA a 0.5 ml/minuto y temperatura ambiente indicó una pureza enantiomérica del 99.5% de cada uno de los enantiómeros.

Ejemplo 6: Determinación de Estereoquímica Absoluta a través de Dicroísmo Circular de Vibración El análogo no radioactivo del trazador de PET de la invención y su enantiómero, así como el Compuesto Precursor 1 y su enantiómero fueron probados. Cada compuesto de prueba se disolvió en CDCI3 (5 mg/0.12 mi, para el trazador de PET y su enantiómero; 5 mg/0.15 mi para el Compuesto Precursor 1 y su enantiómero) y se colocaron en una celda con una longitud de trayectoria de 100 µ?? con ventanas de BaF2. Se registraron los espectros de IR y VCD en un espectrómetro ChiralIRTM VCD (BioTools, Inc.) equipado con un accesorio DualPEM, con una resolución de 4 cm'1, 11 h recolección para cada muestra, y un instrumento optimizado a 1400 cm'1. La IR del solvente se recolectó para 150 escaneos. Se recolectaron la IR substraída del solvente y los espectros de VCD substraídos del enantiómero. La rotación óptica (OR) de cada compuesto de prueba se midió utilizando un Jasco DIP-370 Polarimeter a 590 nm y 25°C.

La configuración (R) en cada caso, se desarrolló con Hyperchem (Hypercube, Inc., Gainesville, FL). Se llevó a cabo una investigación de conformación con Hyperchem para toda la estructura al nivel mecánico molecular. Se realizaron cálculos de la geometría, frecuencia, y de intensidad de IR y VCD a nivel DFT (B3LYP funcional/ fijo base 6-31G(d)) con Gausiano 09 (Gaussian Inc., Wallingford, CT). Las frecuencias calculadas se escalaron por 0.97 y las intensidades de IR y VCD se convirtieron a bandas de Lorentzian con anchura media de 6 cm"1 para comparación de experimento.

Con respecto al trazador de PET y su enantiómero, los cálculos gausianos de 36 conformeros dieron como resultado diez conformeros que tuvieron energías dentro de 1 kcal/mol a partir del conformero de energía más baja. Se calcularon las geometrías optimizadas de los cuatro conformeros calculados de energía más baja para la configuración (R), y se hizo una comparación de los espectros de VDC e IR observados con aquellos de los diez conformeros calculados de energía más baja. Basándose en el acuerdo general en el patrón de VCD para la suma observada y la Botlzmann de los espectros calculados de los diez conformeros de energía más baja, la configuración absoluta del análogo no radioactivo del trazador de PET de la invención se asignó como (S) y su enantiómero se asignó como (R). La asignación se evaluó mediante el programa CompareVOD (Biotools), y el nivel de confidencia de la asignación es de 100% basándose en la base de datos actual que incluye 89 asignaciones correctas previas para diferentes estructuras quirales.

Con respecto al Compuesto Precursor 1 y su enantiómero, los cálculos Gausianos de 36 conformeros dieron como resultado 9 conformeros que tuvieron energías dentro de 1 kcal/mol a partir del conformero de energía más baja. Basándose en el acuerdo general en el patrón de VCD para la suma observada y la Botlzmann de los espectros calculados de los nueve conformeros de energía más baja, la configuración absoluta del compuesto precursor 1 se asignó como (S) y su enantiómero se asignó como (R). La asignación se evaluó mediante el programa CompareVOD, y el nivel de confidencia de la asignación es de 96% basándose en la base de datos actual que incluye 89 asignaciones correctas previas para diferentes estructuras quirales. Esta asignación está de acuerdo con la asignación de la configuración del análogo no radioactivo del trazador de PET de la invención.

Ejemplo 7: Ensayo de Potencia In Vitro Se analizó la afinidad para PBR utilizando un método adaptado de Le Fur et al (Life Sci. 1983; USA 33: 449-57). Se probaron análogos no radioactivos del trazador de PET de la invención y el racemato asociado. Cada compuesto de prueba (disuelto en 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 10 mM MgCI2 conteniendo 1% DMSO) compitió para unión ya sea a PBR de corazón de rata Wistar o a PBR humano contra 0.3 nM [3H] PK-11195. La reacción se realizó en 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 10 mM MgCI2 durante 15 minutos a 25°C. cada compuesto de prueba se analizó a 6 diferentes concentraciones sobre una escala de 300 veces de concentraciones alrededor de K¡ estimado. Se observaron los siguientes datos: Ejemplo 8: Ensayo de Estabilidad Quiral In Vitro El trazador de PET no radioactivo de la invención obtenido de acuerdo con el Ejemplo 2 se incubó (37°C) en plasma humano o en la fracción S9 de hígado de rata hasta 4 horas. Los enantiómeros se extrajeron del material biológico a través de la precipitación de proteínas. El precipitados sólidos e separó de la fase líquida, que se evaporó a sequedad. El residuo seco se disolvió en acetonitrilo.

En este estudio se aplicó un sistema Dionex Ultímate 3000 HPLC consistiendo de dos bombas (micro-bomba LPG-3000 y bomba Ultímate 3000), un detector de UV/visible, un auto-muestreador y dos válvulas de conmutación. Una válvula de conmutación conectó las dos bombas y el auto-muestreador. Esto hizo posible utilizar cualquiera de las dos bombas para inyección en la columna. La bomba usada para la inyección se conectó solo a la columna SPE. Después de la inyección y la elución, la columna SPE se lavó utilizando la bomba de inyección. El sistema estuvo listo para una nueva inyección mientras continuaba el análisis quiral.

La otra válvula de conmutación conectó la columna analítica y la columna SPE. Después de que la substancia se retuvo en la columna SPE, la válvula se conmutó y la bomba analítica eluyó la substancia desde la columna SPE en la columna quiral analítica. La dirección de flujo de la elución se invirtió a aquella de la retención. La bomba analítica se conectó solo al sistema analítico y esperó los analitos hasta el inicio de la elución. Tanto el tiempo de operación de la retención en la columna SPE como el tiempo de elución desde esta columna se variaron para optimizar el procedimiento de dos pasos.

Columna analítica: Chiralpak IC 0.46 x 25 cm con la pre-columna del mismo material 0.4 x 1 cm.

Columna SPE: LiChrospher ADS RP-4 25 x 4 mm (columna RAM), partículas de 25 µ?t?. Corte de MW: 15 kDa (Merck).

Fase móvil: A: acetato de amonio 10 mM, pH 7; B: 1:1 MeCN:MeOH. La velocidad de flujo fue de 300 µ?/minuto.

Detección: detección UV a 230 nm.

Retención en la columna SPE: cuando se retiene en analito en la columna SPE, se aplicó el modo ¡socrático utilizando MeCN al 10% en 50 mM de acetato de amonio. La retención duró 4 minutos y después la válvula se conmutó.

Elución desde la columna SPE y separación. La elución se inició utilizando la mezcla de fase móvil de MeCN al 10% y 10 mM acetato de aluminio al 90%. Después de 5 minutos, la válvula se conmutó de regreso a la columna SPE, la cual se lavó con MeCN/MeOH al 90% en regulador de pH. El gradiente en la columna analítica inició a 6 ½ de fase orgánica en regulador de pH y se cambió a 85% de fase orgánica en regulador de pH durante 26.5 minutos. La columna analítica se lavó durante 3 minutos utilizando MeCN/MeOH al 70% y después se estabilizó a MeCN/MeOH al 10% para hacer que el sistema de separación quede listo para la siguiente inyección. El tiempo de operación total fue de 40 minutos.

El trazador de PET en el plasma no mostró ningún cambio cromatográfico después de incubación durante 4 horas. Los resultados cromatográficos fueron comparados con una muestra no incubada en el plasma y una solución de referencia del trazador de PET de la invención. No se observó ninguna racemización.

El trazador de PET de la invención en la fracción S9 de hígado de rata no se racemizó después de una incubación de 4 horas.

Ejemplo 9: Bio-distribución In Vivo El trazador de PET de la invención, su enantiómero alternativo, y la mezcla racémica de los dos, fueron probados en un modelo de bio-distribución in vivo.

Se inyectaron ratas Wistar macho adultas (200-300 g) con 1-3 MBq del compuesto de prueba a través de la vena lateral de la cola.

Después de 2, 10, 30 ó 60 minutos (n = 3) de la inyección, las ratas fueron sacrificadas y los tejidos o fluidos fueron muestreados para medición radioactiva en un contador gama.

Se observaron los siguientes datos: Ejemplo 10: Estudio de Metabolismo In Vivo La cantidad de actividad de cerebro o plasma que hubo debido al compuesto de prueba parental se probó una hora después de la administración. El trazador de PET de la invención y su racemato asociado fueron los compuestos de prueba.

Se inyectaron ratas macho Wistar adultas (150-200 g) con aproximadamente 20 MBq del compuesto de prueba. Las muestras de cerebro y plasma se analizaron a través de HPLC a 10, 30 y 60 minutos pi. Se emplearon las siguientes condiciones de HPLC: Ejemplo 11: Ensayo de Bloqueo In Vivo Las bio-distribuciones in vivo del trazador de PET de la invención comparadas con su racemato asociado se trataron después de la pre-administración de sus análogos no radioactivos respectivos, o la pre-administración del ligando PBR específico conocido, PK11195.

Se inyectaron ratas macho Wistar adultas (200-300 g) con aproximadamente 3-4 MBq del compuesto de prueba a través de la vena lateral de la cola. Se administró PK11195 ó un análogo no radioactivo (ambos a 3 mg/kg) 5 minutos antes del compuesto de prueba radiomarcado. Después de 30 minutos de la inyección, las ratas fueron sacrificadas y los tejidos o fluidos se muestrearon para medición radioactiva en un contador gama.

Se observaron los siguientes datos: Ejemplo 12: Modelo de Inflamación de Axotomía de Nervio Facial Se probó, a través de auto-radiografía, la unión a un sitio focal neuroinflamación. Los compuestos de prueba fueron el trazador de PET de la invención y su racemato asociado.

Se utilizaron ratas macho Wistar (200-300 g) ya sea r.c afectadas o que experimentaron una axotomía del nervio facial de acuerdo con el procedimiento descrito por Graeber y Kreutzberg (J Neurocytol 1986; 15: 363-373). Se removieron varios tejidos incluyendo tallo cerebral y bulbo olfativo de los animales y rápidamente se congelaron en isopentano y después se almacenaron a -70°C hasta usarse. Los tejidos se cortaron en secciones (12 µ??) y se montaron descongelados sobre portaobjetos Superfrost Plus. Los portaobjetos se almacenaron a -70°C hasta usarse.

Los portaobjetos se secaron con aire antes de la pre-incubación en regulador de pH de Tris-HCI (179 mM, pH 7.4) durante 4 minutos a temperatura ambiente. Se agregó un exceso de 1000 veces de PK 11195 no radioactivo a 1 µ?, o trazador de PET no radioactivo de la invención a 1 µ? antes de la incubación con regulador de pH de Tris-HCI (170 mM, pH 7.4) conteniendo 8GBq/ml del compuesto de prueba durante 60 minutos. La reacción después se terminó al enjuagar las secciones dos veces durante 5 minutos cada vez en regulador de pH enfriado con hielo (Tris-HCI, 170 mM, pH 7.4) y después los portaobjetos se sumergieron brevemente en agua destilada para enjuagar. Después, los portaobjetos se secaron con aire y se expusieron a una película de rayos x. cuando se expusieron a la película de rayos x, se incluyó un estándar de referencia, para la auto-radiografía in vitro, se tomó una muestra de referencia (20 µ) de la solución y se colocó sobre un papel filtro (colocado sobre un vidrio) y se expuso junto con las secciones. La película se expuso durante 24 horas y los datos fueron analizados al extraer regiones de interés alrededor de las estructuras anatómicas específicas así como alrededor de las muestras bloqueadas, referencias y antecedentes utilizando el software MCID usando una escala de gradiente de densidad como una curva de calibración ajustada a la muestra de referencia.

Se observaron los siguientes datos:

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. UN trazador de tomografía de emisión por positrones (PET) que tiene la siguiente estructura química:

2. Un compuesto precursor para la preparación del trazador de PET de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho compuesto precursor es de la Fórmula I: en donde R1 es hidroxilo o es un grupo saliente.

3. El compuesto precursor de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho grupo saliente se selecciona de mesilato, tosi lato, y triflato.

4. El compuesto precursor de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho grupo salientes es mesilato.

5. Un primer método para preparar el compuesto precursor de la Fórmula I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde dicho método comprende: (i) proporcionar una mezcla racémica de dicho compuesto precursor de la Fórmula I y un compuesto de la Fórmula II: en donde R2 es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 2-4, y R1 y R2 son iguales; (ii) separar dicho compuesto precursor de la Fórmula I de dicho compuesto de la Fórmula II.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho paso de preparar comprende una cromatografía de líquido de alto rendimiento, cromatografía de fluido súper-crítica, cromatografía de lecho simulado.

7. Un segundo método para preparar el compuesto precursor de la Fórmula I como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde dicho método comprende: (i) proporcionar un compuesto de la Fórmula III: en donde PG1 es un grupo protector hidroxilo; (ü) convertir dicho compuesto de la Fórmula III a su cloruro ácido correspondiente; (iii) hacer reaccionar el cloruro ácido obtenido en el paso (ii) con dietilamida para obtener un compuesto de la Fórmula IV: en donde PG2 es un grupo protector hidroxilo y es igual a PG1; (iv) desproteger el compuesto de la Fórmula IV obtenido en el paso (iii) para obtener el derivado hidroxilo; (v) opcionalmente agregar un grupo saliente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2-4 para la Fórmula I; en donde un compuesto precursor de la Fórmula I resulta ya sea del paso (iv) o paso (v).

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho paso (i) de proporcionar dicho compuesto de la Fórmula III, comprende: (a) proporcionar una mezcla racémica de un compuesto de la Fórmula V y un compuesto de la Fórmula VI: en donde: R1 es un alcohol quiral; y PG3 y PG4 son ¡guales y son cada uno un grupo protector hidroxilo; (b) separar el compuesto de la Fórmula V a partir del compuesto de la Fórmula VI; (c) remover R del compuesto separado de la Fórmula V utilizando condiciones ácidas dando como resultado así dicho compuesto de la Fórmula III.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho paso (i) de proporcionar dicho compuesto de la Fórmula III, comprende: (a) proporcionar una mezcla racémica de dicho compuesto de la Fórmula III y un compuesto de la Fórmula VIII: (VIII) en donde PG5 es un grupo protector hidroxilo y es igual que PG como se define en la reivindicación 7; (b) hacer reaccionar la mezcla como se definió en el paso (a) con una amina ópticamente activa para separar dicho compuesto de la Fórmula III de dicho compuesto de la Fórmula VIII.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha amina ópticamente activa se selecciona de Alfa- etilBencilamina, R-( + )-N-(1-Naftilmetil)-Alfa-Bencilamina, N-(2-Hidroxi) etil-Alfa-metil bencilamina, y 1 ( P-To I i I ) Etilamina.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho paso (i) de proporcionar dicho compuesto de la Fórmula II comprende: (a) proporcionar una mezcla racémica de un compuesto de la Fórmula IX y un compuesto de la Fórmula X: en donde PG6 y PG7 son iguales y cada uno es un grupo protector hidroxilo; (b) hacer reaccionar la mezcla como se definió en e paso (a) con una enzima estéreo selectiva para obtener dicho compuesto de la Fórmula III, en donde dicha enzima estéreo selectiva efectúa hidrólisis con éster del compuesto de la Fórmula IX.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha enzima estéreo selectiva se selecciona de Candida antárctica lipasa B, esterasa de hígado porcino, o lipasa pancreática de porcino.

13. Un método para preparar el trazador de PET de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método comprende la reacción del compuesto precursor de la Fórmula I de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4 con una fuente adecuada de 18F.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde para dicho compuesto precursor de la Fórmula I, R es un grupo saliente, y dicha fuente adecuada de 18F comprende 18F-fluoruro y un contraión catiónico.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho contraión catiónico se selecciona de rubidio, cesio, potasio en complejo por un criptando, y una sal de tetraalquilamonio.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, el cual es automático.

17. Un cásete para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende: i) un recipiente que contiene el compuesto precursor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4; y, ii) medios para eluir el recipiente del paso (i) con una fuente adecuada de 18F como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-15.

18 El cásete de acuerdo con la reivindicación 17, el cual además comprende (iii) un cartucho de intercambio iónico para ía remoción del exceso de 18F.

19. Una composición radiofarmacéutica que comprende el trazador de PET de acuerdo con la reivindicación 1 junto con un vehículo biocompatible adecuado para administración a mamíferos.

20. Un método de formación de imágenes de PET para determinar la distribución y/o el grado de expresión de PBR en un sujeto, en donde dicho método comprende: i) administrar a dicho sujeto el trazador de PET como se define en la reivindicación 1; ii) permitir que dicho trazador de PET se una a PBR en dicho sujeto; iii) detectar señales emitidas por el 18F comprometido en dicho trazador de PET unido; iv) generar una imagen representativa de la ubicación y/o cantidad de dichas señales; y, v) determinar la distribución y el grado de expresión de PBR en dicho sujeto, en donde dicha expresión está directamente correlacionada con dichas señales.

21. El método de formación de imágenes de PET de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho trazador de PET se administra como la composición radiofarmacéutica como se define en la reivindicación 19.

22. El método de formación de imágenes de PET de acuerdo con la reivindicación 20 ó reivindicación 21, el cual se realiza repetidamente durante el curso de un régimen de tratamiento para dicho sujeto, dicho régimen de tratamiento comprendiendo la administración de un fármaco para combatir una condición de PBR.

23. Un método para el diagnóstico de una condición en donde PBR está sobre-regulado, en donde dicho método comprende el método de formación de imágenes de PET como se define la reivindicación 20 ó reivindicación 21, junto con un paso adicional (vi) de atribuir la distribución y el grado de expresión de PBR a una imagen clínica particular.