MX2012008600A - Metodos para la manufactura de paredes celulares vegetales que comprenden quitina. - Google Patents

Abstract

Se proveen métodos y medios para la modificación de la reactividad de paredes celulares secundarias vegetales, particularmente en paredes celulares de algodón encontradas en fibras de algodón; esto se puede lograr de manera consistente al expresar un gen quimérico que codifica una Saprolegnia monoica quitina sintasa en plantas de algodón.

Description

MÉTODOS PARA LA MANUFACTURA DE PAREDES CELULARES VEGETALES QUE COMPRENDEN QUITINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la modificación de la reactividad de las paredes celulares vegetales tales como paredes celulares vegetales secundarias. En particular, la presente invención proporciona fibras de algodón que comprenden polisacáridos cargados positivamente tales como quitina y quitoisán. Estas fibras de algodón tienen una reactividad modificada que se pueden explotar para teñir las fibras con tintes reactivos a la fibra. Además, la reactividad modificada se puede aplicar para mejorar la reactividad de las fibras con reactivos tales como retardantes de flama, agua, aceite y repelentes de aceite, suavizantes, agentes antiestáticos, agentes de blanqueado fluorescentes y lo similar.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La humanidad ha usado fibras, incluyendo celulosa que contiene fibras naturales de plantas, tales como algodón y lino, por miles de años para producir muchos diferentes tipos de textiles. Al incrementar la demanda y mejorar la calidad de la fibra, una industria textil global basada en algodón se desarrolla rápidamente. Hoy en día, el algodón contribuye aproximadamente con un 45 por ciento de la ropa mundial, y muchas de las casas de moda usa textiles elaborados de algodón de alta calidad. La fibra de algodón consiste de celulosa, un polímero natural compuesto de muchas celulosas de la glucosa de azúcar. Su única estructura es adecuada idealmente para la producción de textiles. Cada fibra es básicamente un tubo hueco de unos cuantos centímetros de longitud que, cuando se hilan y tejen, proveen la "sensación" característica muy especial del algodón. La celulosa natural que contiene las fibras, sin embargo, no posee la versatilidad química de fibras sintéticas, debido a la naturaleza inerte relativa de la celulosa que consta de monómeros de glucosa enlazados ß-1-4. Esta naturaleza inerte relativamente es aparente durante el procedimiento de teñido de las fibras y telas de algodón. Los tintes directos y tintes reactivos a la fibra son dos tipos de tintes aniónicos usados para colorear el algodón. El algodón desarrolla una carga aniónica en agua, de modo que sin tratamiento especial, la captación de tinte por la fibra o tela es muy elaborada. Tintes directos crean un enlace de hidrógeno relativamente débil con el polímero de celulosa formando una unión semi-permanente debido a que no resiste bien el lavado. Los tintes reactivos a la fibra son moléculas que combinan cromóforos con un grupo reactivo que forma enlaces fuertes covalentes con la fibra a través de la reacción con grupos hidroxilo. Los enlaces covalentes proveen una buena resistencia de la fibra teñida contra el lavado. Durante el procedimiento de tinción, cantidades grandes de electrolitos se necesitan para proteger los tintes aniónicos de las cargas de fibra aniónicas. Los tintes hidrolizados sin reaccionar (hasta 40%) necesitan removerse con un paso de lavado, generando grandes volúmenes de agua residual, también conteniendo los electrolitos antes mencionados.

Al proporcionar la fibra de celulosa con una carga eléctrica positiva, por ejemplo, mediante la incorporación de compuestos químicos cargados positivamente, por tanto pueden mejorar la capacidad de tinción de fibras de celulosa natural, así como mejorar cualquier reacción química de la fibra de celulosa modificada con compuestos químicos cargados negativamente. Puede hacer posible el uso de tintes ácidos.

Varias publicaciones han descrito el recubrimiento de oligómeros de quitosán sobre fibras de celulosa para hacer mezclas de quitosán/celulosa, filamentos o telas. Quitosán es un polímero cargado positivamente de glucosamina, que se puede obtener por desacetilación de quitina, por ejemplo, por tratamientos alcalinos. Quitina es un polímero de N-acetilglucosamina enlazada ß-1 -4 (GIcNAc).

Liu et al. (Carbohydrate Polymers 44(2003)233-238) describen un método químico para el recubrimiento superficial de fibras de algodón con quitosán. Con este recubrimiento de quitosán, la superficie de fibra de algodón se convierte activa fisiológicamente y biológicamente por la reactividad química del grupo amino que lleva a un potencial más alto de la modificación química posterior de las fibras. Con base en la función fisiológicamente de quitosán en la inhibición, por ejemplo dermatofitos, mucha ropa funcional, telas y fibras emplean fibras de mezcla de celulosa-quitosán, conjugados de fibra de celulosa-quitosán y telas recubiertas con resinas que contienen quitosán.

WO 00/09729 describe la expresión de quitina sintasa y genes de quitina desacetilasa en plantas para alterar la pared celular para usos industriales y resistencia mejorada a la enfermedad. Específicamente usos citados son: proveer una fuente sencilla de plantas de celulosa, quitina y quitosán, para incrementar la resistencia a la tensión e incrementar el rompimiento frágil. Los genes quitina sintasa específicamente sugeridos se derivan de organismos fúngicos. Datos experimentales no se proveen en la producción de quitina o quitosán en plantas, ni en su incorporación en paredes celulares vegetales. WO2006/136351 muestra que la estrategia según se propone en WO00/09729 no lleva a la incorporación funcional de quitina en la pared celular vegetal. En cambio WO 2006/136351 describe que quitina se produce efectivamente en la pared celular secundaria de las fibras de algodón solo cuando la quitina sintasa fúngica (de Neurospora crassa) se restablece activamente al aparato de Golgi. Esto último se logra por medio de fusión operable de esta quitina sintasa fúngica con una secuencia de fijación de señal específica del aparato de Golgi, y por expresión del gen quimérico resultante en plantas. Aunque, quitina se puede producir eficientemente en paredes celulares vegetales de algodón también se observa que las plantas transgénicas permanecen presumiblemente más pequeña debido a la toxicidad de la expresión de la quitina sintasa quimérica en algodón fuera de las fibras de algodón.

De esta manera permanece la necesidad de métodos alternativos para producir paredes celulares vegetales tal como paredes celulares secundarias que comprenden polisacáridos cargados positivamente. En particular existe una necesidad de proveer métodos para producir fibras que se pueden recolectar directamente de plantas y que contienen grupos químicos cargados positivamente y/o grupo que son más reactivos que los grupos hidroxilo de celulosa, que se pueden usar directamente sin la necesidad de tratamiento químico adicional para introducir dichos grupos químicos y en donde las plantas transgénicas no muestran un retardo del crecimiento. Estos y otros problemas se pueden resolver como se describe en lo sucesivo en los diferentes modalidades, ejemplos y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención muestra que la expresión de una quitina sintasa derivada de Saprolegnia monoica, que operablemente no está enlazada a una señal de direccionamiento de Golgi, en las células vegetales provoca la incorporación eficaz de polímeros de N-acetilglucosamina de la pared celular vegetal, en particular la pared celular secundaria vegetal. La invención descrita aquí en las diferentes modalidades, ejemplos y reivindicaciones proporciona quitina sintasas de Saprolegnia y genes quiméricos de los mismos comprendidos en cartuchos de expresión que pueden utilizarse para modificar las paredes celulares vegetales con polisacáridos cargados positivamente. En consecuencia, la invención proporciona en un primer objetivo una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos un 97% idéntica a SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de las mismas. En otra modalidad la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO: 2. En otra modalidad todavía la invención proporciona un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN operablemente enlazaladas a) un promotor vegetal-expresable, b) una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 97% idéntica a SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 y c) una región de terminación y poliadenilación de transcripción. En otra modalidad incluso el gen quimérico comprende un promotor constitutivo. En otra modalidad el gen quimérico comprende un promotor selectivo de fibra. En otra modalidad todavía el gen quimérico comprende un promotor de expansina. En otra modalidad todavía la invención proporciona un gen quimérico tal como se define en cualquiera de las anteriores modalidades. En otra modalidad aún la invención proporciona una planta que consiste fundamentalmente de una célula vegetal que comprende un gen quimérico tal como se define en cualquiera de las modalidades anteriores. En una modalidad particular la planta es una planta de algodón. En otra modalidad la invención proporciona fibras obtenidas de la planta según la invención. En otra modalidad la invención proporciona una semilla transgénica que comprende un gen quimérico tal como se define en cualquiera de las anteriores modalidades. En otra modalidad todavía la invención proporciona un método para la fabricación de una pared celular vegetal que comprende polisacáridos cargados positivamente, dicho método comprende expresar un gen quimérico según cualquiera de las modalidades anteriores en una planta y aislar dicha pared celular vegetal. En una modalidad particular dicho método proporciona una pared celular vegetal de algodón. En otra modalidad particular todavía dicho método proporciona una pared celular vegetal de algodón que está presente en una fibra de algodón.

La figura 1A muestra tricomas maduros no transformados {Arabidopsis thaliana) que se tiñen con una sonda de unión de quitina conjugada con rodamina mientras que la figura 1 B muestra tricomas maduros recombinantes (Arabidopsis thaliana) que comprenden los genes quiméricos SmCHS2 teñidos con una sonda de unión de quitina conjugada con rodamina. Una reacción clara con la sonda de enlace de quitina es observada desde que los tricomas recombinantes (figura 1 B) se tiñen más intensamente que los tricomas derivados de plantas de control (figura 1A). La quitina es atestiguada por la presencia de puntos rojos en los tricomas recombinantes (figura 1 B) mientras que los puntos rojos están ausentes en los tricomas no transformados (figura 1A).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el hallazgo notable que la expresión del gen Saprolegnia monoica de codificación para una quitina sintasa en las células vegetales hacia la incorporación eficaz de polímeros de N-acetilglucosamina (GIcNAc) en las paredes celulares vegetales. El gen Saprolegnia monoica que codifica una quitina sintasa no requiere ser operablemente ligado (o fusionado) con una señal de localización de direccionamiento de Golgi como era requerido con la quitina sintasa de Neurospora crassa en WO2006/136351. En la presente invención se observó que la quitina (es decir, un polímero de N-acetilglucosamina) fue hecha en la pared celular, en particular la pared celular secundaria, de las plantas transgénicas. El gen Saprolegnia monoica que codifica una quitina sintasa puede utilizarse, por ejemplo, para la expresión en las plantas de algodón para la generación de fibras de algodón más reactivas.

Así, la invención proporciona en una primera modalidad una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa en donde dicha secuencia nucleotídica es al menos un 97% idéntica a SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de las mismas. SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de nucleótidos de la quitina sintasa de Saprolegnia monoica 2 (SmCHS2).

En otra modalidad la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO 2 representa la secuencia de aminoácidos de la quitina sintasa de Saprolegnia monoica 2 (SmCHS2). En otra modalidad específica la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos un 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95% o al menos el 98% o incluso al menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 2. Todavía en otra modalidad la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa en donde dicha secuencia de nucleótidos es idéntica al menos en un 90% a SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de las mismas. En una modalidad específica la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos el 95%, por lo menos 98 o incluso al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de las mismas. SEQ ID NO: 3 es la quitina sintasa de Saprolegnia monoica 1 (SmCHSI ). En otra modalidad la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO: 4. En una modalidad específica la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos el 85%, por lo menos 90 idéntica, al menos el 95%, al menos el 98% o incluso al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la quitina sintasa áeSaprolegnia monoica 1 (SmCHSI ). Ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, de doble cadena o cadena sencilla. Ácidos nucleicos pueden ser sintetizados químicamente o producidos por la expresión biológica in vitro o incluso in vivo. Ácidos nucleicos pueden ser sintetizados químicamente usando fosforamiditas de ribonucleósido adecuadamente protegidas y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Suministrados de reactivos de síntesis de ARN son Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA), y Cruachem (Glasgow, RU).

En relación con el gen quimérico de la presente descripción, ADN incluye ADNc y ADN genómico.

En enzimología, una quitina sintasa (EC 2.4.1.16) es una enzima que cataliza la reacción química: UDP-N-acetil-D-glucosamina + [1 ,4-(N-acetil-beta-D-glucosaminil)]n -.? UDP + [1 ,4-(N-acetil-beta-D-glucosaminil)]n+1 De esta manera, los dos sustratos de esta enzima son UDP-N-acetil-D-glucosamina y [[[1 ,4-(N-acetil-beta-D-glucosaminil)]n]], mientras sus dos productos son UDP y [[[1 ,4-(N-acet¡l-beta-D-glucosam¡nil)]n+1]]. Esta enzima pertenece a la familia de glicosiltransferasas, específicamente las hexosiltransferasas. El nombre sistemático de esta clase de enzima es UDP-N-acetil-D-glucosamina:quitina 4-beta-N-acetilglucosaminil-transferasa. Otros nombres de uso común son quitina-UDP N-acetilglucosaminiltransferasa, quitina-uridina difosfato acetilglucosaminiltransferasa, quitina sintetasa, sintasa quitina y trans-N-acetilglucosaminosilasa. Esta enzima participa en el metabolismo de amino-azúcares. Así, la quitina es un polímero de beta-1 ,4-enlazado N-acetil-D-glucosamina (GIcNAc).

Las quitina sintasas 1 y 2 (respectivamente representadas en SEQ ID NO: 3 y 1 ) se derivan de Saprolegnia monoica. El género Saprolegnia pertenece a la familia de Oomycetes. Basándose en su morfología general y estilos de vida, este grupo fue tradicionalmente clasificado como hongos. Sin embargo, una clasificación cladística basada en ideas modernas, admite una relación relativamente estrecha con los organismos fotosintéticos como algas pardas y diatomeas, dentro del grupo eucariota - los heterokontes. Las secuencias de las quitina sintasas 1 y 2 derivadas de S. monoica comprenden un dominio aminoterminal conservado de aproximadamente 70 aminoácidos, también conocido como un dominio MIT. Un dominio MIT es un dominio conservado compuesto por aproximadamente 70 aminoácidos, con áreas hidrofóbicas alternantes conservadas y polares y una estructura secundaria helicoidal predicha, identificada por primera vez en las proteínas implicadas en el enlace de microtúbulos y en el transporte intracelular. Tal dominio es designado como un dominio MIT (contenido en las moléculas de interacción y tráfico de microtúbulos). El dominio MIT también se encuentra en la clasificación de nexinas, la nuclear tiol proteasa PalBH, las proteínas AAA de espastina y proteínas arcaebacteriales con arquitectura de dominio similar, proteínas de clasificación vacuolar y otras. Se desconoce la función molecular precisa del dominio MIT. Sin intención de limitar la invención a un modo particular de acción, se cree que el dominio MIT presente en la quitina sintasas de S. monoica es responsable de la eficiente síntesis de quitina en las paredes celulares de las plantas transgénicas. Previamente fue mostrado en WO2006/136351 que quitina sintasas de origen fúngico (como una quitina sintasa de Neurospora crassa) tuvieron que ser adaptadas por medio de un acoplamiento operable de la quitina sintasa fúngica con una señal de localización de Golgi, para obtener una eficiente síntesis de quitina en la pared celular de las plantas transgénicas. Ya que un dominio MIT está presente en algunas otras quitina sintasas, en particular en algunas quitina sintasas derivadas de oomycetes, la invención proporciona el uso de quitina sintasas naturalmente que comprenden un dominio MIT para la fabricación de quitina en la pared celular secundaria vegetal. Tales quitina sintasas naturalmente comprendiendo un dominio MIT incluyen las de Saprolegnia parasítica que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24 o codificada por las secuencias de ácido nucleico representadas en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad la invención proporciona el acoplamiento operable de un dominio MIT con una quitina sintasa, como un quitina sintasa fúngica, que no comprende un dominio MIT, por ejemplo un no oomycete quitina sintasa para generar una quitina sintasa quimérica para la producción eficiente de quitina en la pared celular secundaria vegetal. En otras palabras, se describe un gen quimérico que comprende una región de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa que no comprende un dominio MIT operablemente vinculado a una región de ADN de codificación de un dominio MIT tal que, en la expresión, se realiza una proteína de fusión, un promotor expresable vegetal y una región de terminación y poliadenilación de transcripción. También se describe un método para la fabricación de una pared celular vegetal que comprende polisacáridos cargados positivamente que comprenden a) expresar un gen quimérico que comprende una región de ADN que codifica un polipéptido de quitina sintasa que no comprende un dominio MIT operablemente vinculado a una región de ADN de codificación de un dominio MIT tal que, durante la expresión, se realiza una proteína de fusión, un promotor expresable vegetal y una región de terminación y poliadenilación de transcripción; y b) aislar la pared celular vegetal obtenida en a).

Dominios MIT han sido asignados el número de la familia PF04212 Pfam. Actualmente, 495 proteínas son conocidas o se prevé que conformen un dominio MIT. Las secuencias de estas proteínas pueden ser recuperadas por ejemplo desde el servidor UniProt (http://www.uniprot.org/) bajo los siguientes números de acceso UniProt que son seguidos por la posición del dominio MIT (previsto) dentro de la secuencia. Todas las secuencias y en particular aquellas de los dominios MIT (previstas) se incorporan por referencia en su totalidad: C5L7B3/6-74; C5K7I8/6-74; B9PJ69/9-77; B6K9M2/9-77; B9QA65/9-77; A7ASR9 /7-74; B6AJD9/4-72; Q5CFS7/1 -69; Q5CSB4/3-71 ; Q4UC87/4-82; B3L9J0/6-74; A5K3I1/6-74; Q8IKQ5/6-74; Q4Z291/6-74; Q4X5E3/6-74; Q7RRP6/6-74; A8IAJ1/7-74; Q6ETH5/5-73; B8AI60/5-73; B9SG62/5-73; B9HVY7/5-73; B9HL02/5-73; B9NGD1/5-73; Q3EDG2/1-41 ; Q9SGD4/1-41 ; Q8LKV4/5-73; B6TLN7/5-73; B8A2I4/5-73; B6T3Y2/5-73; A2WKH8/5-73; A2ZP36/5-73; B8A2W9/5-73; A2WKI0/5-73; Q5ZEN9/5-73; Q8LAK9/5-73; Q9ZNT0/5-73; Q9SEA8/5-73; Q1W2L1/5-73; B9HQW8/5-73; B9H1 R8/5-73; A5BIG1/5-73; A7R0D5/5-73; A9SGM2/5-73; A9TBU2/5-73; A9P2N 1/5-73; B9SCR4/5-73; A4S3E8/8-75; C1 ECR7/11-78; C1 NA06/1 1-78; C1 E2F 1/103-169; B6K5C2/6-74; Q09803/6-74; A8PSV3/1-33; Q5KC30/6-74; Q4PDZ4/6-74; A8N0F3/6-74; B0DXQ0/6-74; A7F3H9/6-74; Q7S0H4/6-74; Q2GQ74/6-74; B2AFE6/6-74; C5FLK6/6-74; C5JDP2/6-74; C5GXE6/6-74; C0NGS1/6-74; C0SHS5/6-74; C1 H9G7/6-74; C1GCX1/6-74; C4JW95/6-74; Q1 E6C4/6-74; B6QQZ4/6-74; B8M727/6-74; Q2UQD2/6-74; B8MZP8/6-74; A1 D7B7/7-75; B0XY62/7-75; Q4WXF8/7-75; Q5B8R9/6-74; Q0CXN9/6-74; B6GYF9/6-74; A2R7C 1/6-74; A1 CK47/6-74; B2VXZ4/6-65; Q0U7R6/6-74; Q6CEE2/6-74; Q5YKJ0/7-75; C4R134/4-72; Q6FQG5/6-74; Q9C1 F4/6-74; B3LKD3/6-74; A6ZX48/6-74; P52917/6-74; B5VTV5/1 -34; C5DUT4/6-74; Q6CVM8/6-74; C5DBA6/6-74; A7TH89/6-74; Q758U9/6-74; C4Y9U8/7-75; Q5AGH7/7-75; Q5AG40/7-75; B9WHM5/7-75; A5E2L0/55-123; C5MHK4/5-73; A5DQ68/6-74; A3LVF1/7-75; Q6BPY2/7-75; A9V5Z2/5-73; Q57V58/5-74; Q4E658/5-74; Q4D9C2/5-74; Q4FXF2/5-74; A4I4W4/5-74; A4HHP9/5-74; Q54PT2/6-74; Q4RKZ3/1-69; A8QBQ7/7-76; C3YEH0/5-74; C3ZYE4/31-98; C4Q408/2-71 ; Q5DBH6/2-71 ; A8Y1 H3/5-74; Q9BL83/5-74; B3RJ28/5-74; A7SK75/5-74; B3MXW2/6-75; Q29H77/6-75; B4NPI4/6-75; B4L2B2/6-75; B3NWZ3/6-75; B4M6S6/6-75; B4R6Q7/6-75; B4I6L5/6-75; Q9Y162/6-75; B4Q2M1/6-75; Q7QFR0/6-75; B0XJH8/6-75; Q17GP3/6-75; B7PVD7/6-75; Q66IY7/5-74; B2GUK1/3-72; B2RCB7/5-74; Q9UN37/5-74; Q08BZ6/5-74; Q4SKA0/1 -69Q2HJB1/5-74; Q793F9/5-74; Q8VEJ9/5-74; Q6IRG3/5-74; Q3TDX2/5-74; Q5U4Y4/7-76; Q6DJK7/7-76; Q8AVB9/7-76; B5X7N 1/5-74; VPS4B/7-76; A8K4G7/7-76; Q69HW4/7-76; A8K5D8/7-76; 075351/7-76; Q3TN07/7-76; Q6PJZ4/7-76; P46467/7-76; Q4KLL7/7-76; Q3U8P5/7-76; Q0VD48/7-76; Q4RVG5/6-75; Q5ZMI9/4-73; C0H991/95-164; B5X1 U4/6-75; Q7SXY0/6-75; A7YYH5/6-75; B2GU12/6-75; A5WWM0/6-75; C0H991/9-78; Q8T127/7-75; B7P0K9/283-324; C3Z907/321-389; A7S4I8/283-324; Q4S8A8/285-352; A4IG43/277-345; A4IID6/279-347; Q4V7Q6/279-347; Q5ZJH6/280-348; B4DFS6/190-258; B4DRQ7/280-348; B2RXK3/280-348; B4DDG2/163-231 ; B4DQN3/163-231 ; B4DFT0/291-359; Q3U3Q1/280-348; B2RXB9/280-348; B3RSI2/276-344; B4GNS6/275-343; Q29BD1/275-343; B4NAJ4/275-343; B3M073/275-343; Q86P98/275-343; Q8T0L6/275-343; Q9VHF6/275-343; B3P1 R4/275-343; B4QX75/275-343; B4HKF5/275-343; B4PUL9/275-343; B4K4Y3/275-343; B4LW06/275-343; B4JYT0/275-343; BOXAEO/178-246; Q7QEQ2/275-343; Q5C111/163-221 ; C4Q8U0/273-338; B0E7C2/4-72; C4LYN8/4-72; A3DP09/6-74; B8D2W2/9-77; A9A4K6/8-76; B3TCM2/8-75; A0RVT9/8-75; Q877H3/7-75; Q972B3/7-75; Q97ZJ7/7-75; C3MPU4/7-75; C3NE34/7-75; C3NHM9/7-75; C4KH36/7-75; C3MUV6/7-75; C3N5H0/7-75; A4YHC5/7-75; A2BKZ1/9-75; Q9YDF3/7-75; C4LZH7/3-71; A8BSU6/8-77; Q8T6L4/8-77; B8C9Z5/5-73; B8LD11/5-73; B7GCY6/5-73; Q54CX7/4-72; Q22143/5-70; A8XST3/5-70; Q54CX7/246-316; Q55GN8/5-73; A4QZC1/8-77; A2D8M7/10-80; Q54RJ5/10-79; C4LYH7/2-70; Q8I8X1/16-84; Q54CX7/120-188; Q0UZT0/375-444; C4JEZ5/18-85; Q1E904/19-86; C5FCB8/23-90; C1GDJ4/63-130; C0SAK1/19-86; C1HDA2/19-86; C5JPG7/78-145; C5G855/19-86; A6RHR0/1-68; C0NMG2/1-68; A2QKF2/239- 307; B6H2K6/100-168; Q0CFY4/216-284; B0XW44/210-278; A1DG63/193- 261; Q4X270/211-279; A1CSH7/266-334; B8NC13/82-150; Q2TZ95/233-301; Q5B0X3/178-246; B8M0Z2/44-113; B6Q8T3/44-113; A7EZ31/1-69; A6S2Q3/293-361; Q7S0P7/402-470; B2ADU 1/368-424; Q2GTY0/352-420; C1E4H7/3-68; C1 MPZ7/3-69; C3ZZL4/6-70; B7P5B6/8-73; Q9R1S8/6-71; Q499T5/6-71; Q9Y6W3/6-71; B2RAM2/6-71; Q7Z479/6-71; A0FKG7/6-71; B0FGU2/6-71; B4F6P1/6-71; C0H9M1/6-71; Q4S467/6-71; B3RQK1/8-73; A7RRP77-70; Q54JG4/13-81; Q55GN8/176-244; C4LYH7/369-438; Q8I8X1/383-452; B0EV39/371-440; A9V3C1/6-74; A7URZ9/6-72; B0X0P8/1-69; Q16FL8/1-69; Q0IFG1/1-69; B4KNS6/15-76; B4MS07/21-82; B3M8E0/5- 71; B4IZ41/4-72; B4KXT 1/5-71; B4MFW3/3-71; B4MLA7/3-71; Q29EY7/4-71; B3NG09/3-71; B4PH91/3-71; Q9VZK1/3-71; Q7YU93/3-71; B4QQ18/3-62; B4HTX3/3-71; B3RKL7/450-515; Q7T332/322-390; A9JT54/322-390; A4IIB7/268-336; Q28CB9/261-329; Q63ZH0/269-337; Q0P3R2/270-338; A7SVK8/274-341 ; Q20821/252-320; A8Y3X4/266-339; Q148E7/275-343; B3KU31/268-336; B2RDR2/268-336; Q9NRS6/268-336; B0CM75 /268-33T; Q4V896/269-337; Q91WE 1/268-336; Q9CW22/63-131 ; Q6NU31/257-325; KS6C 1/239-307; B1APS8/227-295; B3KVM4/239-307; B4DRK0/58-126; Q5R5U6/239-307; KS6C 1/238-306; B8JLT3/232-300; Q4RR16/253-353; B4NG93/233-301 ; B3MTR0/236-304; B3NZ90/246-314; Q9VEA9/242-310; B4QUH5/242-310; B4IB83/242-310; B4PL88/246-314; B4GLM4/255-323; Q293U2/255-323; B4JI50/203-271 ; B4K7H6/227-295; B4M0W2/21 1-279; Q7PYF1/252-320; B0X4C2/216-284; Q16ZH6/224-292; Q4RLU8/6-73; Q8R2S 1/49-1 7; B4DSP6/49-1 17; Q5RA67/49-1 17; Q9Y6S9/49-117; Q32PG2/49-1 7; A9RII8/29-104; B8B1Z6/49-124; Q658G8/49-124; B4FVB5/49-124; Q944N4/90-165; A8MRR2/55-130; Q0WMJ4/55-130; O64630/55-130; B9RDF4/52-127; B9IC21/13-88; A7PY13/56-131 ; A5BB69/56-13 ; A5BIC4/76-120; A9V1 R3/29-100; B3S0V7/15-93; C3XZ15/1 - 79; C3ZJS8/19-88; B7PXE3/98-174; B4NBP4/237-313; B4M0H8/223-299; B4K799/217-293; B4J 110/234-310; B4G437/239-315; B4QSF0/232-308; B3M301/235-311 ; B4HGG6/232-308; B3P8A3/232-308; Q298L4/239-315; B4PL32/232-308; Q8IOP1/232-308; Q16IA7/179-255; Q7QBW0/230-306; B0X289/2-60; Q4TCF6/6-91 ; Q4TCD9/16-91 ; Q6NW58/83-158; Q6AZT2/110- 185; Q05AS3/1 3-188; Q9QYY8/1 17-193; Q9UBP0/ 19-195; A2VDN5/1 7- 193; Q719N1/1 16-192; Q5ZK92/1 16-192; B2RYN7/1 17-192; C3XW83/29-96; B7Q7T2/7-83; A7RQX2/15-88; Q4RRG4/9-85; C0H9Y4/20-96; Q0P3W0/20-96; Q4SG05/1 -87; A8WFZ3/ 15-90; B3DLA2/21-97; Q8R1X6/19-95; Q3TVW1/19-95; A0JNJ3/ 9-95; Q4R7V2/19-95; Q8N0X7/19-95; B3KMI3/19-95 A8K6Q9/19-95; A2Q8K6/7-77; Q00204/6-77; B8MY71/5-77; Q9Y6Z8/5-77 Q0CUT6/6-77; A1 CRW2/6-77; Q1 DXZ5/5-72; B6QNP8/12-76; B0DXY2/1 1 -78 Q7QGN5 7-67; B0WDD1/4-67; Q179Z1/4-67; Q179Z0/4-67; B7P5B6/89-157 Q5DBL1/86-142; A8P1 B5/37-127; Q9R1 S8/86-154; Q7Z479/86-154 B2RAM2/86-154; Q9Y6W3/86-154; A0FKG7/86- 54; B0FGU2/86- 54 Q499T5/86-154; C0H9M1/86-154; B4F6P1/86-154;Q4S467/86- 149;Q6NVT4/42-1 10; C1 BMZ4/1 1 -74 ;A8PMC 5/4-73; Q5D999/6-77 Q5D9R4/6-77; C4Q8N9/35-106; A7RL55/2-70; Q5I0J5/12-79; Q8VDV8/12-79 Q8WV92/12-79; B8ZZL5/12-79; A8YXZ4/12-79; Q6DJ62/7-75; C3XWE6/1-69 B0S8J9/9-77; B5XBB0/7-75; Q4S0N8/9-77; Q54KQ7/168-232; B3RXW5/5-72 A8PZJ 1/282-350; C3Z907/423-490; Q4V7Q6/374-442; Q3U3Q1/375-444 B2RXB9/375-444; B4DFT0/386-455; B4DRQ7/375-444; B4DDG2/258-327 B4DFS6/285-354; B4DQN3/258-327; B2RXK3/375-444; A4IG43/372-441 Q5ZJH6/375-444; Q7QEQ2/417-485; B0XAE0/287-363; B3M073/404-479 B4HKF5/399-474; B3P1 R4/399-474; B4PUL9/399-474; B4QX75/399-474 B4JYT0/404-479; Q86P98/399-474; Q9VHF6/399-474; Q8T0L6/399-464 Q29BD 1/399-474; B4NAJ4/403-478; B4LW06/400-475; B4K4Y3/397-472. Además los dominios MIT incluyen aquellos descritos en Ciccarelli et al. (2003 Genomics 81 : 437-41 ) o Patel et al. (2002; Nature Genetics 31 : 347-8) o en los archivos (banco de datos de proteínas) pdb (o publicaciones relacionadas): 1wfd (Suetake et al.; estructura de solución de dominio MIT de ratón ); 1wr0 (Takasu et al. (2005). Biochem Biophys Res Commun, 334, 460-465.), 1yxr (Scott et al. (2005) Proc Nati Acad Sci U S A. 102:13813-13818), 2cpt (Suetake et al.; estructura de solución de dominio MIT de skdl humano), 2dl1 (Suetake et al.; estructura de solución de dominio MIT de la espartina humana), 2jq9 y 2jqh (Stuchell-Brereton et al. (2007). Nature, 449, 740-744.), 2k3w (C.Kieffer et al. (2008). Dev Cell, 15, 62-73.), 2v6x, 2v6y (T.Obita et al. (2007). Nature, 449, 735-739.), 2w2u (Samson et al. (2008). Science, 322, 1710-1713.), 2zam, 2zan, 2zao (todos Inoue et al. (2008). Traffic, 9, 2180-2189.) o 3eab (Yang et al. (2008). Nat Struct Biol, 15, 1278-1286.).

En las quitina sintasas identificadas en este documento, el dominio MIT está situado en un tramo de aminoácido de la posición 103 a 171 en SEQ ID NO: 4 (CHS1 ), correspondiente a SEQ ID NO: 19 y desde la posición 141 a 209 SEQ ID NO: 2 (CHS2), correspondiente a SEQ ID NO: 20.

Dominios MIT ejemplares adicionales muestran al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, por lo menos 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o incluso 100% de identidad de secuencia a los dominios MIT presentes en CHS1 (SEQ ID NO: 4), correspondiente a SEQ ID NO: 20, y CHS2 (SEQ ID NO: 2), correspondiente a SEQ ID NO: 19, o cualquiera de los dominios MIT presentes en las secuencias UniProt o en las referencias mencionadas antes. Todos los dominios MIT descritos aquí tienen la función biológica de los dominios MIT presentes en CHS1 (SEQ ID NO: 4) y CHS2 (SEQ ID NO: 2). Dicha función biológica puede, por ejemplo, evaluarse verificando la ubicación de una proteína de fusión que comprende dicho dominio MIT en una célula vegetal como se indica en los ejemplos.

Como se utiliza en el presente, el término "% de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de nucleótidos idénticos entre dos segmentos de una ventana de ADN óptimamente alineado. Óptima alineación de secuencias para alinear una ventana de comparación son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica y puede llevarse a cabo con herramientas como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, M. S. Chapman & Hall. Londres, 1995), el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970), la búsqueda de método de similitud de Pearson y Lipman (1988) y preferiblemente por implementaciones computarizadas de estos algoritmos como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA disponible como parte de GCG (marca registrada ), paquete de Wisconsin (marca registrada de Accelrys Inc., San Diego, California). Una "fracción de identidad" para segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que son compartidos por las dos secuencias alineadas divididas por el número total de componentes en el segmento de secuencia de referencia, es decir, la secuencia de referencia completa o una menor parte definida de la secuencia de referencia. La identidad de secuencia porcentual está representada como la fracción de identidad 100 veces. La comparación de una o más secuencias de ADN puede ser una secuencia de ADN de longitud completa o una porción de la misma, o a una secuencia de ADN más larga.

Un dominio MIT puede, por ejemplo unirse operablemente con cualquiera de las siguientes quitina sintasas (quitina UDP-acetil-glucosaminil transferasas) que pueden encontrarse en las diferentes bases de datos incluyendo secuencias de aminoácidos con los siguientes identificadores (números de acceso): CHS1_AJECA (P30576) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1) (Clase-I quitina sintasa 1 ) de Ajellomyces capsulata (Histoplasma capsulatum); CHS1_AJEDE (P30579) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-I quitina sintasa 1) de Ajellomyces dermatitidis (Blastomyces dermatitidis); CHS1_ASPNG (P30581 ) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-I quitina sintasa 1 ) de Aspergillus niger; CHS1_BOTCI (P49603) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-I quitina sintasa 1 ) de Botrytis cinérea (hongo de raíz Noble) (Botryotinia fuckeliana); CHS1_CANAL (P23316) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) de Candida albicans (levadura); CHS1_CRYNV (013356) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-IV quitina sintasa 1 ). {GEN: Nombre=CHS1} - Cryptococcus neoformans var. grubii (Filobasidiella neoformans var. grubii); CHS1_EMENI (P30583) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-I quitina sintasa 1) (Fragmento). {GEN: Nombre=chs1} -Emericella nidulans (Aspergillus nidulans); CHS1_EXODE (P30600) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1) (Clase-II quitina sintasa 1 ). {GEN: Nombre=CHS1} - Exophiala dermatitidis (Wangiella dermatitidis); CHS1_EX0JE (P30585) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-I quitina sintasa 1 ) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1} - Exophiala jeanselmei; CHS1_NEUCR (P29070) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-lll quitina sintasa 3). {GEN: Nombre=c s-1 ; ORFNombres=B1 1 H24.170, NCU03611.1} - Neurospora crassa; CHS1_PHAEX (P30590); Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1} -Phaeococcomyces exophialae; CHS1_PHYBL (P87073) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-ll quitina sintasa 1). {GEN: Nombre=chs1} - Phycomyces blakesleeanus; CHS1_RHIAT (P30592) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-I quitina sintasa 1) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1} - Rhinocladiella atrovirens; CHS1_RHIOL (P30594) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1). {GEN: Nombre=CHS1} - Rhizopus oligosporus; CHS1_RHIRA (Q12632) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Clase-ll quitina sintasa 1 ). {GEN: Nombre=CHS1} - Rhizomucor racemosus (Mucor circinelloides f. lusitanicus); CHS1_SCHCO (P30596); Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1} - Schizophyllum commune (hongo Bracket); CHS1_SCHPO (P30597) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ). {GEN: Nombre=chs1 ; ORFNombres=SPAC13G6.12c, SPAC24B1 1.01c} - Schizosaccharomyces pombe (levadura Fission); CHS1_TUBUN (P55003) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1} - Tuber uncinatum (trufa Burgundy); CHS1JJSTMA (P30598) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1 } - Ustilago maydis (hongo Smut); CHS1_XYLBA (P30603) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS1} - Xylohypha bantiana; CHS1_LEVADURA (P08004) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ). {GEN: Nombre=CHS1 ; Saccharomyces cerevisiae (levadura Baker); CHS2_AJECA (P30577) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-lll quitina sintasa 2) Ajellomyces capsulata (Histoplasma capsulatum); CHS2_AJEDE (P30580) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-ll quitina sintasa 2) {GEN: Nombre=CHS2} -Ajellomyces dermatitidis (Blastomyces dermatitidis) CHS2_ASPNG (P30582); Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-ll quitina sintasa 2) (Fragmento). {GEN: Nombre=chs2} - Aspergillus niger; CHS2_CANAL (P30572) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2). {GEN: Nombre=CHS2} - Candida albicans (Levadura); CHS2_EXODE (P30601 ) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-I quitina sintasa 2). {GEN: Nombre=CHS2} - Exophiala dermatitidis (Wangiella dermatitidis); CHS2_EX0JE (P30586) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS2} - Exophiala jeanselmei; CHS2_NEUCR (P30589); Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2). {GEN: Nombre=chs-2; ORFNombres=NCU05239.1} - Neurospora crassa; CHS2_PARBR (Q92444) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-ll quitina sintasa 2). {GEN: Nombre=CHS2} - Paracoccidioides brasiliensis; CHS2_PHAEX (P30591); Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-ll quitina sintasa 2) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS2} - Phaeococcomyces exophialae; CHS2_RHIAT (P30593) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-lll quitina sintasa 2) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS2} - Rhinocladiella atrovirens; CHS2_RHIOL (P30595) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2). {GEN: Nombre=CHS2} - Rhizopus oligosporus; CHS2_SCHPO (074756) proteína 2 tipo quitina sintasa. {GEN: Nombre=chs2; ORFNombres=SPBC1709.01 , SPBC1734.17} - Schizosaccharomyces pombe (levadura Fission); CHS2JJSTMA (P30599) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS2} - Ustilago maydis (hongo Smut); CHS2_XYLBA (P30604) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2) (Clase-ll quitina sintasa 2) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS2} - Xylohypha bantiana; CHS2_YEAST (P14180); Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2). {GEN: Nombre=CHS2; OrderedLocusNombres=YBR038W; ORFNombres=YBR0407} - Saccharomyces cerevisiae (levadura de Baker); CHS3_AJECA (P30578) Quitina sintasa 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 3) (Clase-ll quitina sintasa 3) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS3} - Ajellomyces capsulata (Histoplasma capsulatum); CHS3_CANAL (P30573) Quitina sintasa 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 3) (Clase-IV quitina sintasa 3). {GEN: Nombre=CHS3} - Candida albicans (levadura); CHS3_EXODE (P30602) Quitina sintasa 3 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 3) (Clase-lll quitina sintasa 3). {GEN: Nombre=CHS3} - Exophiala dermatitidis (Wangiella dermatitidis); CHS3_EXOJE (P30587); Quitina sintasa 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 3) (Clase-lll quitina sintasa 3) (Fragmento). {GEN: Nombre=CHS3} - Exophiala jeanselmei; CHS3_NEUCR (P30588) Quitina sintasa 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 3). {GEN: Nombre=chs-3; ORFNombres=G65A3.040} -Neurospora crassa; CHS3_LEVADURA (P29465) Quitina sintasa 3 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 3) (Clase-IV quitina sintasa 3). {GEN: Nombre=CHS3; Sinónimos=CAL1 , CSD2, DIT101 , KIT2; Nombres de locus ordenados =YBR023C; ORFNombres=YBR0305} -Saccharomyces cerevisiae (levadura de Baker); CHS4_MAGGR (013353); Quitina sintasa 4 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 4) (Clase-IV quitina sintasa 4). {GEN: Nombre=CHS4} - Magnaporthe grísea (hongo de añublo del arroz) (Pyricularia grísea); CHS4_NEUCR (Q01285) Quitina sintasa 4 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 4) (Clase-IV quitina sintasa 4). {GEN: Nombre=chs-4; ORFNombres=NCU09324.1} - Neurospora crassa; CHS5JJSTMA (013394) Quitina sintasa 5 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 5) (Clase-IV quitina sintasa 5). {GEN: Nombre=CHS5} - Ustilago maydis (Hongo Smut); CHS6JJSTMA (013395) Quitina sintasa 6 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 6) (Clase-V quitina sintasa 6). {GEN: Nombre=CHS6} - Ustilago maydis (Smut fungus); CHSA_AMPQU (Q12564); Quitina sintasa A (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa A) (Clase-I quitina sintasa A). {GEN: Nombre=CHSA} - Ampelomyces quisqualis; CHSA_EMENI (P30584) Quitina sintasa A (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa A) (Clase-ll quitina sintasa A). {GEN: Nombre=chsA; Synonyms=chs2} - Emericella nidulans (Aspergillus nidulans); CHSB_EMENI (Q00757) Quitina sintasa B (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa B) (Clase-lll quitina sintasa B). {GEN: Nombre=chsB} - Emericella nidulans (Aspergillus nidulans); CHSC_ASPFU (Q92197) Quitina sintasa C (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa C) (Clase-lll quitina sintasa C). {GEN: Nombre=chsC} - Aspergillus fumigatus (Sartorya fumigata); CHSD_ASPFU (P78746) Quitina sintasa D (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa D) (Clase-VI quitina sintasa D). {GEN: Nombre=chsD} - Aspergillus fumigatus (Sartorya fumigata); CHSD_EMENI (P7861 1 ) Quitina sintasa D (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa D) (Clase-V quitina sintasa D). {GEN: Nombre=chsD; Synonyms=chsE} - Emericella nidulans (Aspergillus nidulans); CHSG_ASPFU (P54267); Quitina sintasa G (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa G) (Clase-lll quitina sintasa G). {GEN: Nombre=chsG} - Aspergillus fumigatus (Sartorya fumigata); CHSXJJSTMA (Q99126) Quitina sintasa 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 1 ). {GEN: Nombre=CHS1} -Ustilago maydis (hongo Smut); or CHSYJJSTMA (Q99127) Quitina sintasa 2 (EC 2.4.1 .16) (Quitina-UDP acetil-glucosaminil transferasa 2). {GEN: Nombre=CHS2} - Ustilago maydis (hongo Smut). Todas las secuencias se incorporan aquí por referencia.

El enlace de manera operable puede resultar en el dominio MIT, que está presente en el N-término, en el C-término o dentro de una secuencia de quitina sintasa mientras conforme esta posición esencialmente no afecta la actividad de quitina sintasa de la proteína resultante. En este sentido "esencialmente no perjudicial" significa que la quitina sintasa es todavía suficientemente activa para proporcionar una cantidad detectable de polisacáridos cargados positivamente en una pared celular vegetal, cuando se expresa en la célula vegetal. Esto significa que la quitina sintasa tiene al menos un 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100% de la actividad de quitina sintasa de CHS1 o CHS2. Métodos de determinación de la actividad de quitina sintasa son conocidos en la técnica y también se describen en la presente solicitud.

En una modalidad particular la invención también proporciona secuencias de variantes de SmCHSI y SmCHS2 que pueden obtenerse por generación inducida de variación in vitro o ¡n vivo. Varios métodos para la generación inducida in vitro de secuencias de nucleótidos variantes están disponibles en la técnica incluyendo pero sin limitarse a transposiciones de ADN o técnicas de evolución dirigidas como se describe en patente de E.U.A. 5605793, patente de E.U.A. 5,81 1 ,238 y patente de E.U.A 5,830,721. Métodos para la generación inducida in vivo de secuencia de nucleótidos variante también son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la exposición de Saprolegnia monoica a mutagenes tal como radiación de ionización, EMS, MMS o lo similar, después de aislamiento de la quitina sintasa 1 o 2 que codifica ácidos nucleicos, por ejemplo, como en otros lugares descritos aquí. En otra modalidad particular el SmCHSI y SmCHS2, en particular los ácidos nucleicos que codifican estos, se pueden modificar al adaptar el uso de codón para la expresión específica en plantas. Tales métodos para modificación de codón (o codón-adaptación, que es un texto equivalente) para la expresión en plantas específicas son bien conocidos en la técnica. SEQ ID NO: 18 representa una secuencia de nucleótidos SmCHS2 variante que es una variante modificada de codón optimizada para expresión en algodón. SEQ ID NO: 18 codifica para el polipéptido de quitina sintasa representado en SEQ ID NO: 2.

En otra modalidad la invención proporciona un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN enlazadas de manera operable: 1) un promotor expresable de planta, 2) una región de ADN que codifica para un polipéptido de quitina sintasa en donde la secuencia de nucleótidos de la región de ADN es por lo menos 97% idéntica a SEQ ID NO: 1 , o en donde la secuencia de nucleótidos de la región de ADN es por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 3, o en donde la secuencia de nucleótidos de la región de ADN comprende de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa, que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 o en donde la secuencia de nucleótidos de la región de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 4 y 3) una terminación de transcripción y región de poliadenilación.

Los genes quiméricos de acuerdo con la invención comprenden un promotor expresable de planta. Como se utiliza aquí, el término "promotor" denota cualquier ADN que es reconocido y unido (directa o indirectamente) por una ARN-polimerasa dependiente de ADN durante la iniciación de la transcripción. Un promotor incluye el sitio de iniciación de transcripción y sitios de unión para factores de iniciación de transcripción y polimerasa de ARN, y puede comprender varios de otros sitios (por ejemplo, potenciadores), en cuyas proteínas reguladoras de expresión del gen se pueden unir.

Como se usa aquí, el término " promotor expresable de planta" significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciación) la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal que es capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal, es decir, algunos promotores de origen viral o bacteriano tal como CaMV35S, el promotor de virus de trébol subterráneo No. 4 o No. 7, o promotores de genes T-ADN y lo similar.

Un promotor expresable de planta que controla la iniciación y mantenimiento de transcripción preferentemente en las células de fibra es un promotor que impulsa la transcripción de la región de ADN enlazada de manera operable a un nivel superior en células de fibra y las células de epidermis subyacentes que en otras células o tejidos de la planta. Un nivel superior puede ser por ejemplo una transcripción de al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o al menos 500 veces más en células de fibra y opcionalmente las células de epidermis subyacentes, que en otras células o tejidos de la planta. Dicha definición también aplica el término "promotor selectivo de fibra". En otras palabras, el término incluye un promotor que impulsa al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces más transcripción en células de fibra y, opcionalmente, las células de epidermis subyacente que en otras células o tejidos de la planta. Tales promotores incluyen el promotor de algodón de un gen de ß- tubulina específico de fibra (como se describe en WO0210377), el promotor de algodón de un gen de actina específico de fibra (como se describe en WO02104 3), el promotor de un gen de la proteína de transferencia de lípidos específicos de fibra de algodón (como se describe en US5792933), un promotor de un gen de expansina de algodón (WO9830698) o un promotor de un gen de quitinasa en algodón (US2003106097) o los promotores de los genes específicos de fibra descrito en US6259003 o US6166294 o los promotores derivados de la familia E6 como se describe en US6096950. En una modalidad particular el promotor expresable de planta es un promotor constitutivo. Como se discute en el ejemplo 3, últimas 6 líneas, que expresan la quitina sintasa de la invención no causa diferencias en el crecimiento de planta en comparación con las plantas transformadas.

En una modalidad particular la invención proporciona una célula vegetal que comprende un gen quimérico aquí descrito anteriormente.

El gen quimérico puede introducirse en una célula vegetal por métodos bien conocidos en la técnica. "Que introduce" en conexión con la presente solicitud se refiere a la colocación de información genética en una célula vegetal o plantas por medios artificiales. Esto puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica para introducir ARN o ADN en las células vegetales, tejidos, protoplastos o plantas enteras.

Un número de métodos son disponibles para transferir ADN en células vegetales o plantas. Transformación mediada por Agrobacterium de algodón se ha descrito por ejemplo, en Patente de E.U.A. 5,004,863, en patente de E.U.A. 6,483,013 o en WO2000/71733.

Plantas o células vegetales también pueden ser transformadas por bombardeo de partículas: partículas de oro o tungsteno se recubren con ADN y luego se disparan en las células vegetales jóvenes o embriones vegetales. Este método también permite la transformación de plástidos vegetales. Transformación de algodón por bombardeo de partículas se reporta por ejemplo en WO 92/15675.

Transformación viral (transducción) puede utilizarse para expresión transitoria o estable de un gen, dependiendo de la naturaleza del genoma del virus. El material genético deseado está empaquetado en un virus vegetal adecuado y el virus modificado está permitido para infectar la planta o célula vegetal. La progenie de las plantas infectadas es libre de virus y también libre del gen insertado. En un protocolo de transformación viral ejemplar, ADN tal como ADN que comprende el gen quimérico descrito aquí así como un virus auxiliar, puede introducirse en plantas enteras por inoculación mecánica con ADN que comprende el gen quimérico descrito aquí solo o con los viriones que contienen dicho ADN. La selección del mejor protocolo de transformación adecuado que incluye la manera y parámetros de transformación, programación de transformación, etc., está bien dentro del conocimiento de las personas con experiencia ordinaria en la técnica. Métodos adecuados se describen o detallan además por ejemplo en WO 90/12107, WO 03/052108 o WO 2005/098004.

En otra modalidad particular la invención proporciona una planta que consiste fundamentalmente en las células vegetales que comprenden un gen quimérico aquí descrito anteriormente. En una modalidad particular la planta es una planta de algodón transgénica.

Aparte de los métodos para introducir el gen quimérico descrito anteriormente, dicho gen quimérico también puede ser ¡ntrogresado en una planta. "Introgresión" significa la integración de un gen en un genoma de planta por medios naturales, es decir por cruzar una planta que comprende el gen quimérico descritos aquí con una planta que no comprende dicho gen quimérico. La descendencia puede seleccionarse para aquellos que comprenden el gen quimérico.

La planta puede ser cualquier planta que produce fibra tal como algodón. Otros ejemplos incluyen otras plantas que producen fibra tal como cáñamo, yute, lino y plantas leñosas, incluyendo pero sin limitarse a Pinus spp., Populus spp., Picea spp, Eucalyptus spp. etc.

En otra modalidad particular la invención proporciona una semilla transgénica que comprende un gen quimérico como aquí se describe anteriormente.

En aún otra modalidad la invención proporciona un método para la fabricación de una pared celular vegetal que comprende polisacáridos cargados positivamente, dicho método comprende 1 ) expresar un gen quimérico tal como se resume aquí anteriormente en una planta o célula vegetal y 2) aislar dicha pared celular vegetal. Dicho aislamiento es de la planta obtenida después de realizar el paso 1 ).

En una modalidad específica dicho método para fabricación (o producción que es un texto equivalente) produce polisacáridos cargados positivamente en una pared celular secundaria vegetal. En otra modalidad particular dicho método para fabricación produce quitina en una pared celular secundaria vegetal. En otra modalidad particular dicho método para la fabricación produce quitosán en una pared celular secundaria vegetal, por ejemplo debido a la presencia y la expresión de un gen quimérico adicional que comprende una quitina desacetilasa como se describe además posteriormente. En una modalidad particular dicha pared celular vegetal, o en dicha pared celular secundaria vegetal es una pared celular vegetal de algodón o una pared celular secundaria vegetal de algodón. En una modalidad particular dicha pared celular vegetal de algodón, o dicha pared celular secundaria de algodón está presente en una fibra de algodón.

La invención además proporciona las paredes celulares vegetales incluyendo las paredes celulares obtenidas de células vegetales usando los métodos de acuerdo con la invención, y fibras que comprenden dichas paredes celulares. Dichas paredes celulares vegetales comprenden polisacáridos cargados positivamente, tal como polímeros de N-acetilglucosamina o quitina, incrustados en la celulosa. Estas paredes celulares vegetales pueden ser modificadas adicionalmente, por ejemplo, parcialmente o completamente desacetiladas tal que oligómeros que comprenden residuos de glucosamina se obtienen. El grupo amino de las glucosaminas resultantes es químicamente más reactivo que el grupo aminoacetilo de N-acetilglucosamina o el grupo hidroxilo de celulosa. En una modalidad particular paredes celulares vegetales, en particular paredes celulares secundarias vegetales, que comprenden quitina pueden modificarse adicionalmente por medio de un paso de desacetilación química. En otra modalidad particular el método de fabricación de polisacáridos cargados positivamente en una pared celular vegetal se puede llevar a cabo expresando dos genes quiméricos en una planta o célula vegetal, un gen quimérico es una quitina sintasa de la invención junto con una quitina desacetilasa quimérica. Una quitina deacetilasa en enzimología, es una enzima (EC 3.5.1.41 ) que cataliza la reacción química: quitina + H20 quitosán + acetato Así, los dos sustratos de esta enzima son quitina y H20, mientras que sus dos productos son quitosán y acetato. Esta enzima pertenece a la familia de hidrolasas, quienes actúan en enlaces carbono-nitrógeno diferentes de enlaces peptídicos, específicamente en amidas lineales. El nombre sistemático de esta clase de enzima es quitina amidohidrolasa.

En una modalidad particular la pared celular vegetal obtenida de acuerdo con la invención, especialmente aquellas que han sido sometidas a un paso de desacetilación, por ejemplo in vivo como se describe anteriormente, o después de recolectarse de la pared celular, pueden ser modificadas químicamente adicionalmente. Productos que contienen dichas paredes celulares vegetales, tal como fibras, hilos o telas tienen calidades semejantes a aquellas de mezclas de celulosa-quitosán descritas en la técnica, incluyendo capacidad de tinción mejorada, inhibición mejorada de por ejemplo dermatofitos, liberación de fármaco controlada etc.

En una modalidad específica, la invención proporciona fibras de algodón obtenidas o que pueden ser obtenidas de plantas de algodón de acuerdo con los métodos de la invención. En otras palabras, fibras de algodón son proporcionadas de plantas de algodón que comprenden en el genoma, tal como el genoma nuclear, de sus células un gen quimérico que comprende un promotor expresadle de planta enlazado de manera operable a una región de ADN que codifica para una quitina sintasa 1 o 2 de acuerdo con la invención o una combinación de dos genes quiméricos de codificación para los genes de quitina sintasa 1 y 2 de acuerdo con la invención. Modalidades particulares de regiones o promotores de codificación de ADN comprendidos en los genes quiméricos transferidos en plantas de algodón son como se describe en otro sitio en este documento.

Las fibras de algodón de acuerdo con la invención pueden distinguirse de fibras de algodón de origen natural, es decir, fibras de algodón obtenidas de una línea isogénica que no comprende un gen quimérico de acuerdo con la invención, por la capacidad de dichas fibras para tinción incrementada con tintas aniónicas (incluyendo por ejemplo, rojo Congo), por la capacidad de dichas fibras para tinción incrementada con tintas reactivas a aminas (incluyendo por ejemplo, éster tetrafluorofenilico). Las fibras de algodón de acuerdo con la invención también tienen la capacidad de unión de aglutinina de germen de trigo que une la quitina. Las fibras de algodón de acuerdo con la invención también pueden ser distinguidas de fibras de algodón de origen natural por detección directa de N-acetilglucosamina y polímeros GIcNAc, opcionalmente después del tratamiento de los materiales de la pared celular de fibra con quitinasa. Las fibras de algodón de acuerdo con la invención también pueden distinguirse por su contenido de nitrógeno incrementado.

Fibras de algodón de acuerdo con la invención también pueden distinguirse de las fibras recubiertas de quitosán de la técnica previa, en que los polímeros cargados positivamente se distribuyen uniformemente en las paredes celulares vegetales secundarias que componen las fibras como opuestas a las fibras de quitosán recubiertas de superficie de la técnica previa. En consecuencia, en secciones microscópicas de las fibras de algodón, teñidas por ejemplo con WGA o con rojo congo o con tetrafluorofenilo como se describe posteriormente, las tintas serán distribuidas uniformemente a través de las paredes celulares que conforman las fibras de algodón, mientras que en las fibras recubiertas de quitosán, la tinción será concentrada en la cubierta de quitosán ubicada como una hoja en la superficie de las fibras tratadas.

La tinción incrementada del material de pared celular vegetal de acuerdo con la invención, por tintas aniónicas tal como Rojo congo pueden cuantificarse, por ejemplo, al teñir una cantidad uniforme de material bajo condiciones estándar, esparciendo el material sobre un área estandarizada (tal como un pozo en una placa de pozos múltiples) que digitaliza una imagen del área para la escala de grises de la capa coloreada del material. Entre menos gris, el material de pared celular vegetal es más teñido. De esta manera, fibras de algodón y material de pared celular de acuerdo con la invención muestran un incremento de al menos aproximadamente 5% en tinción por rojo congo comparado para controlar material de pared celular de control o fibras de lineas vegetales isogénicas sin un gen de codificación de quitina sintasa. En una modalidad particular el material celular vegetal obtenido de acuerdo con la invención puede ser teñido con tintas comerciales incluyendo tintas reactivas al algodón (por ejemplo, rojo reactivo 120, azul Levafix CA), tintas ácidas (naranja ácido 7, azul ácido 281 ) y tintas reactivas a la lana (por ejemplo, Rojo reactivo 1 16, ámbar Realan EHF). En un ejemplo, las fibras de algodón y el material de pared celular de acuerdo con la invención muestran un incremento de al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50% al menos 60, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o incluso al menos 100% tal como 2 veces, 5 veces o 10 veces en tinción en comparación con dichas fibras y material que no comprende un gen de codificación de quitina sintasa.

La capacidad de las fibras de algodón novedosas para unir específicamente aglutina de germen de trigo (detectable por el grupo fluorofórico acoplado) es una clara característica distintiva de las fibras de algodón novedosas provistas sobre las fibras de algodón de origen natural. Excepto para una fluorescencia de fondo muy baja, fibras de algodón de origen natural no teñidas/fluorescentes cuando se tratan con WGA -alexa flúor 488 o 555. La fluorescencia de fibras de algodón aumenta por lo menos 5 veces cuando polímeros de quitina están presentes. En consecuencia, la invención proporciona fibras de algodón que son capaces de específicamente unir aglutinina de germen de trigo, o WGA acoplado a un fluroforo, tal como WGA Alexa 488 o WGA Alexa 555 o que, cuando se trata con WGA Alexa 488 o WGA Alexa 555 proporciona una fluorescencia brillante bajo la luz ultravioleta. Esta fluorescencia no se limita a la superficie de la fibra de algodón, pero se distribuye a través de la pared celular de las células de fibra.

Fibras de algodón de acuerdo con la invención pueden distinguirse también de sólo fibras recubiertas con quitosán al aplicar el método de detección descrito en WO2010/015423 y verificando para la presencia del gen quiméricos de la invención en las fibras.

Cuando los métodos de la invención están dirigidos a la introducción de un gen quimérico en una célula vegetal, estará claro que dichos métodos también pueden aplicarse en casos mediante los cuales la célula vegetal se incorpora en una planta madura. Por ejemplo, las células transgénicas pueden ser regeneradas en plantas transgénicas de acuerdo con los métodos establecidos.

Métodos para transformar las células de plantas y plantas son bien conocidos en la técnica. Los métodos para transformar las plantas de algodón son bien conocidos en la técnica. Transformación mediada por Agrobacterium de algodón se ha descrito por ejemplo en patente de E.U.A. 5,004,863 o en Patente de E.U.A. 6,483,013 y transformación de algodón por bombardeo de partículas se reporta por ejemplo en WO 92/15675.

Los genes quiméricos pueden introducirse por transformación en plantas de algodón de los cuales callo embriogénico puede derivarse, tal como Coker 312, Coker310, Coker 5Acala SJ-5, GSC251 10, FiberMax 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1 , Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991 , Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1 , Acala C1 , Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, variedad no Acala "selector" Siokra, "separador" FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61 , DP90, DP77, DES1 19, McN235, HBX87, HBX191 , HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1 , CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1 , CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1 , CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 y ORO BLANCO PIMA, Fibermax® FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 y FM958, FM989, FM958, FM832, FM991 , FM819, FM800, FM960, FM966, FM981 , FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 o FM5024 y plantas con sus derivados de genotipos.

"Algodón" como se utiliza aquí incluye Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, Gossypium arboreum y Gossypium herbaceum o progenie de cruza de dichas especies con otras especies o cruzas entre dichas especies.

Los métodos y medios de la actual invención pueden emplearse también para otras especies de plantas, tal como cáñamo, yute, lino y plantas leñosas, incluyendo pero sin limitarse a, Pinus spp., Populus spp., Picea spp., Eucalyptus spp. etc.

La planta transformada obtenida puede utilizarse en un esquema de mejoramiento convencional para producir más plantas transformadas con las mismas características o para introducir el gen quimérico de acuerdo con la invención en otras variedades de las mismas o especies vegetales relacionadas, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas de las plantas transformadas, contienen los genes quiméricos de la invención como un inserto genómico estable, y también están abarcadas por la invención.

El gen quimérico de la invención se combina ventajosamente en plantas con otros genes que codifican proteínas o ARN que confieren propiedades agronómicas útiles a dichas plantas. Entre los genes que codifican proteínas o ARN que confieren propiedades agronómicas útiles en las plantas transformadas, puede hacerse mención de las proteínas de codificación de secuencias de ADN que confieren tolerancia a uno o más herbicidas, y otros que confieren tolerancia a ciertos insectos o aquellos que confieren tolerancia a ciertas enfermedades.

Dichos genes se describen por ejemplo en solicitudes de patentes PCT publicadas WO 91/02071 y WO95/06128.

Entre las proteínas de codificación de secuencias de ADN que confieren tolerancia a ciertos herbicidas en las células vegetales transformadas y plantas, puede hacerse mención de un bar o gen PAT o gen Streptomyces coelicolor descrito en WO2009/152359 que confiere tolerancia a herbicidas de glufosinato, un gen que codifica un EPSPS adecuado que confiere tolerancia a herbicidas que tienen EPSPS como un objetivo, tal como el glifosato y sus sales (US 4,535,060, US 4,769,061 , US 5,094,945, US 4,940,835, US 5, 188,642, US 4,971 ,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061 , US 5,633,435, US 6,566,587 y WO 97/04103), un gen que codifica glifosato oxidoreductasa (US 5,463,175), o un gen que codifica la enzima HPPD para tolerancia a los herbicidas inhibidores de HPPD tal como isoxazoles (WO 96/38567).

Como se usa aquí "que comprende" debe interpretarse como especificar la presencia de características establecidas, enteros, pasos o componentes contemplados, pero no excluye la presencia o la adición de una o más características, enteros, pasos o componentes o sus grupos. Así, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que las actualmente citadas, es decir, ser incrustado en un ácido nucleico grande o proteína. Un gen quimérico que comprende una región de ADN, que está funcional o estructuralmente definida, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.

Los siguientes ejemplos no limitantes describen los métodos para alterar las paredes celulares vegetales. A menos que se indique de otra manera en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con los protocolos estándar que se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiales estándar y métodos para trabajo molecular de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax ( 993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications, UK.

Las células vegetales transformadas y plantas obtenidas mediante los métodos descritos en este documento pueden utilizarse además en los procedimientos de reproducción bien conocidos en la técnica, tal como el cruce, auto-fecundación y retro-cruzamiento. Programas de reproducción pueden implicar el cruce para generar una F1 (primera filial) generación, seguido por varias generaciones de auto-fecundación (generación F2, F3, etc.). El programa de reproducción puede implicar también pasos de retro-cruzamiento (BC), según el cual las crías se retro-cruzan a una de las líneas parentales, denominadas el padre recurrente.

Las células de la planta transgénica y plantas obtenidas por los métodos descritos aquí pueden ser utilizadas además en procedimientos de transformación posteriores, por ejemplo para introducir un gen quimérico adicional.

Las plantas que comprenden el gen quimérico descrito aquí además pueden ser tratadas con herbicidas de algodón como Diuron, Fluometuron MSMA, Oxifluorfen, prometrina, trifluralina, carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butil, glifosato, norflurazon, pendimetalina, Pirithiobac sódico, Trifloxisulfuron, tepraloxidim, glufosinato, Flumioxazin, Tidiazurón; insecticidas de algodón como acefato, Aldicarb, Clorpírifos, cipermetrina, deltametrina, abamectina, Acetamiprid, benzoato de emamectina, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-cihalotrina, Spinosad, Thiodicarb, Gamma-cihalotrina, Spiromesifen, Piridalilo, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Spirotetramat, Clotianidin, Tiamethoxam, tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, gamma cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il) metil](2,2-difluoretil) amino] furan-2(5H)-on, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalil, Spiromesifen, Sulfoxaflor; y fungicidas de algodón como azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, carbendazima, clorotalonil, cobre, ciproconazol, difenoconazol, Dimoxistrobin, Epoxiconazol, fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluxapiroxad, iprodiona, Isopirazam, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metominostrobina, Pentiopirad, picoxistrobina, Propineb, Protioconazol, piraclostrobina, quintoceno, Tebuconazol, Tetraconazol, tiofanato-metilo, Trifloxistrobina.

A través de la descripción y los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias representadas en el listado de secuencias: SEQ ID NO: 1 : secuencia de nucleótidos del gen de Saprolegnia monoica quitina sintasa 2 SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos del gen de Saprolegnia monoica quitina sintasa 2 SEQ ID NO: 3: secuencia de nucleótidos del gen de Saprolegnia monoica quitina sintasa 1 SEQ ID NO: 4: secuencia de aminoácidos del gen de Saprolegnia monoica quitina sintasa 1 SEQ ID NOs: 5-17 son iniciadores sintéticos para los cuales las secuencias se presentan en el cuadro 1.

SEQ ID NO: 18: secuencia de nucleotidos modificada de Saprolegnia monoica quitina sintasa 2 (codón optimizado para la expresión en algodón) SEQ ID NO: 19: secuencia de aminoácidos del dominio MIT de Saprolegnia monoica quitina sintasa 1 SEQ ID NO: 20: secuencia de aminoácidos del dominio MIT de Saprolegnia monoica quitina sintasa 2 SEQ ID NO: 21 : secuencia de nucleotidos de un gen Saprolegnia parasítica quitina sintasa SEQ ID NO: 22: Secuencia de aminoácidos codificada por el gen de Saprolegnia parasítica quitina sintasa de SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23: secuencia de nucleotidos de un gen Saprolegnia parasítica quitina sintasa SEQ ID NO: 24: Secuencia de aminoácidos codificada por el gen de Saprolegnia parasítica quitina sintasa de SEQ ID NO: 23 EJEMPLOS 1 . Clonación de genes de quitina sintasa de Saprolegnia monoica El oomycete Saprolegnia monoica Pringsheim 53-967 Dick fue obtenido de la "Centraal Bureau voor Schimmel Culturen" (CBS, Baarn, Holanda) y se mantiene la Papa Dextrosa Agar en cajas Petri de 90 mm. El micelio utilizado para los experimentos se cultiva en el medio líquido de Machlis (Machlis L. (1953) de a. Latina J. Bot. 40, 449-460) durante 3-5 días a 25°C en la oscuridad.

ARN total se extrajo de 100 mg de micelio S. monoica de 3 días de edad, utilizando el Kit ini planta RNeasy (Qiagen), junto con la digestión de DNasel en la columna. Transcripción inversa se llevó a cabo con 4.5 pg ARN total usando el kit de síntesis de ADNc de superíndice III primera cadena (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. 1 µ? del ADNc sintetizado fue utilizado en las reacciones de PCR con los iniciadores CHS2Fwd y CHS2Rev que fueron diseñados basados en la secuencia depositada bajo el número de acceso U 19946 (esta secuencia también es descrita en Mort-Bontemps M. et al (1997) Microbiology 143, 2009-2020 donde una secuencia de quitina síntasa 2 (CHS2) se representa en la figura 3 de dicha referencia), para la amplificación de la secuencia de CHS2. El kit RACE mediado por ligasa del RNA (RLM-RACE, Ambion) fue utilizado para aislar y determinar la secuencia del extremo 3' de CHS2. El extremo 3' de CHS2 se obtuvo con los iniciadores, CHS2Fwd1 y CHS2Fwd2. La secuencia de codificación CHS2 de longitud completa (representada en SEQ ID NO: 1 ) fue amplificado de ADNc de micelio S. monoica usando los iniciadores CHS2Fwd y CHS2FLRev. Esta secuencia resultante fue clonada en pENTR-D-TOPO (Invitrogen) utilizando la tecnología Gateway según las instrucciones del fabricante. El constructo se transformó en células químicamente competentes One Shot TOP10 (Invitrogen) y se determinó la secuencia de nucleótidos (MWG, Alemania). Se observó que la secuencia codificante descrita de S. monoica S. CHS2 (número de acceso U 19946) es sólo un 96% idéntica a la secuencia de CHS2 aislada representada en SEQ ID NO: 1 . Las diferencias en la secuencia de nucleótidos son debido a una serie de pequeñas supresiones en la secuencia codificante de la quitina sintasa 2 descrita con el número de acceso U19946. Como consecuencia la traducción de la secuencia codificante representada en SEQ ID NO: 1 es sólo un 79% idéntica a la secuencia de codificación traducida de número de acceso U19946. Este último es causado por pequeñas supresiones en la secuencia de nucleótidos de U 19946, lo que conduce a cambios de estructura respecto de la traducción de SEQ ID NO: 1 , en la traducción de la secuencia codificante de U19946. Es evidente que SEQ ID NO: 2 comprende el dominio de molécula de interacción y tráfico de microtúbulos (dominio MIT) que está ausente en la proteína de quitina sintasa traducida desde el acceso U 19946.

Las secuencias fueron editadas con el software BioEdit (BioEdit TA Hall (1999): un editor de alineación de secuencias biológicas de suer-amistoso y análisis - http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). La alineación se realiza utilizando ClustalW (Larkin MA et al (2007) bioinformatics 23, 2947-2948). Secuencias de longitud completa de SmCHSI y SmCHS2 se utilizaron para realizar una búsqueda de BLASTp contra la base de datos de proteína no redundante desde el Centro Nacional de biotecnología (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

CUADRO 1 Representa la secuencia de los iniciadores Dos iniciadores (CHSI Fwd y CHSI Rev) fueron diseñados en función de la secuencia parcial de la S. monoica quitina sintasa 1 (CHS1 ), correspondiente al número de acceso U42304, para la amplificación de una región conservada de CHS1. El kit RACE mediado por ARN ligasa (RLM-RACE, Ambion) fue utilizado para amplificar los extremos 5' y 3' de CHS1. Los siguientes conjuntos de iniciadores inversos anidados se utilizaron para obtener el extremo 5' de CHS1 : CHS1 Rev1 y CHS1 Rev2. Los iniciadores directos anidados CHSFwdl y CHS1 Fwd2 fueron utilizados para aislar el extremo 3'. CHS1 de longitud completa fue amplificado de ADNc micelio S. monoica para confirmar la secuencia completa utilizando los iniciadores CHSI FLFwd y CHSI FLRev para la amplificación de la secuencia codificante del gen CHS1. El gen de longitud completa fue clonado en pENTR-D-TOPO (Invitrogen) utilizando la tecnología Gateway según las instrucciones del fabricante. El constructo se transformó en células químicamente competentes One Shot TOP10 (Invitrogen) y la secuencia de nucleótidos se determinó mediante secuenciación (MWG, Alemania). Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando Phusion de alta fidelidad ADN polimerasa (Finnzymes), según las instrucciones del fabricante. La región de codificación de la secuencia de nucleótidos de quitina sintasa 1 está representada en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos de la quitina sintasa 1 se representa en SEQ ID NO: 4. 2. Construcción de genes de plantas expresables-planta quiméric de codificación de un Saprolegnia monoica proteina quitina sintasa 2 (CHS2) Usando técnicas estándar de ADN recombinante, una planta expresable gen Saprolegnia monoica CHS2 quimérico se construyó conteniendo los siguientes fragmentos de ADN enlazados operablemente: · una región de promotor 35S de CaMV • un fragmento de ADN de codificación para una secuencia líder sin traducir (5'Cab22L) • un fragmento de ADN de codificación de CHS2 de Saprolegnia monoica (representado en SEQ ID NO: 1 ) · una señal de terminación y poliadenilación de transcripción del gen de octopina sintasa Brevemente, este constructo se generó por PCR-clonación del gen CHS2 en el vector de entrada Gateway pENTR/D/TOPO, utilizando el kit de clonación TOPO direccional (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. La reacción de PCR se realizó usando ADN polimerasa Pushion (Finnzymes). El vector resultante de entrada se recombina en el vector de destino pEarleyGate 103 usando la mezcla de enzima Gateway LR Clonase (Invitrogen) (Earley KW et al (2006) Plant J. 45: 616-629). Todos los constructos son verificados para la secuencia por análisis de la secuencia. El marcador de selección para la transformación de la planta es el gen bar proporcionando resistencia a fosfinotricina. El vector binario recombinante pEarleyGate 103 integrado por el gen SmCHS2 se usó para transformar la cepa de Agrobacterium C58C1 (Voinnet O. et al (2003) Plant J. 33: 949-956) que fue utilizado para transformar Arabidopsis thaliana mediante el método de inmersión floral (Clough SJ y Bent AF (1998) Plant J. 16: 735-743). Las plantas transformadas A. thaliana que comprende la Saprolegnia monoica quitina sintasa 2 quimérica no difieren en el crecimiento comparado con las plantas no transformadas A. thaliana. Esto está en contraste con la reducción del crecimiento de las plantas transgénicas A. thaliana comprendiendo la Neurospora crassa quitina sintasa operablemente enlazada con una señal de localización de Golgi (como se describe en WO2006/136351 , ver ejemplo 9). 3. Análisis histoquímico de los tricomas de Arabidopsis thaliana recombinante Tricomas (pelos de planta) en Arabidopsis thaliana son células epidérmicas grandes no secretoras con una estructura tridimensional característica. Porque los tricomas son fácilmente accesibles a una combinación de genética, métodos biológicos y moleculares celulares se utilizaron tricomas maduros derivados de plantas recombinantes A. thaliana producidas en ejemplo 2 para el análisis de las paredes celulares vegetales de plantas transformadas SmCHS2 A. thaliana. Durante nuestras investigaciones recientes observamos que el análisis de la pared celular de cultivos de raíz peluda (ver ejemplo 2, WO2006/136351) conduce a resultados similares como el análisis de la pared celular de tricomas maduros (estos últimos son también menos problemáticos para establecer y más fáciles de aislar que cultivos de raíz peluda).

Tricomas histoquímicamente fueron teñidos para visualizar diferentes compuestos de las células y se analizaron microscópicamente.

N-acetilglucosamina puede ser detectada por ejemplo después de una reacción inmunológica con anticuerpos monoclonales de IgM a N-acetilglucosamina (BIODESIGN). Quitina puede detectarse por ejemplo usando germen de trigo Agglutin-Alexa Fluor 555 o alternativamente utilizando una sonda de unión de quitina conjugada con rodamina. Esta última es una proteína recombinante de fusión que se une específicamente a la quitina. La proteína de fusión comprende un pequeño dominio unión-quitina (5 kDa) (CDB) derivado de la región C-terminal de quitinasa A1 de Bacillus circulans WL-12 fusionada con C-terminal de la proteína de unión a maltosa (43kDa) de E. coli. La proteína de fusión está etiquetada con isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) siguiendo los métodos estándar. Se adquirió la sonda de enlace de quitina conjugada con rodaminade New England BioLabs (número de catálogo P 5210).

Los tricomas histoquímicamente manchados se examinaron mediante microscopía de fluorescencia, usando un microscopio de Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Alemania) equipado con Apotome (Zeiss) para permitir secciones ópticas. Axio Vision 4.2 (Zeiss) fue utilizado para el procesamiento de la imagen.

La tinción de Calcoflúor de las paredes celulares vegetales pueden llevarse a cabo con el siguiente protocolo. Blanco de calcoflúor (o fluorescentes abrillantador 28) es un compuesto orgánico incoloro que emite fluorescencia en un color claro azulado bajo radiación ultravioleta kmax = 350 nm). La muestra (es decir, el tricoma) para ser teñido se sumerge durante 15 a 30 minutos en medio de cultivo o PBS (solución amortiguadora) que comprende abrillantador fluorescente 28 a una concentración final de 50 µg/ml. La muestra se lava con medio o regulador de pH y muestras se examinan utilizando un microscopio equipado para microscopía de fluorescencia utilizando el conjunto de filtro Zeiss 18. Paredes celulares tienen fluorescencia en un color claro azulado. Tricomas maduros recombinantes, que comprenden los genes quiméricos de SmCHS2 son inmunohistoquímicamente teñidos por la presencia de N-acetilglucosamina y posteriormente teñidos con calcoflúor para visualizar las paredes celulares. Como se puede observar desde la superposición de las secciones ópticas, la presencia de N-acetilglucosamina se detecta exclusivamente en las paredes celulares de tricomas recombinantes.

Método para tinción de germen de trigo aglutinina-Alexa Fluor 555 o tinción con la sonda de enlace de guitina rodamina conjugado: Hojas maduras que comprenden tricomas fueron aisladas después de unas tres semanas de plantas transgénicas de Arabidopsis in vitro generadas (es decir, plantas recombinantes compuestas por SmCHS2 según el ejemplo 2) y también de plantas Arabidopsis control (es decir, plantas no transformadas). Las hojas primero se fijaron en un fijador (10% formalina, glutaraldehido 0.25% en PBS) durante 1 hora. La muestra fue infiltrada en vacío y el fijador se refresca y se incubó con las hojas durante 3 horas. Finalmente, después de la fijación las hojas podrían ser más tratadas o almacenadas a 4°C durante algunos días. En un siguiente paso las hojas fijadas se lavaron (durante 60 minutos) con PBS seguido de lavado con PBT durante 60 minutos (es decir, PBS + 0.1 % Tween20). Las hojas se incubaron posteriormente con germen de trigo aglutinina-Alexa Fluor 555 (Alexa flúor 555 TFP está disponible como un kit de la compañía Molecular Probes) en PBT (3 mg/ml) durante 4 a 6 horas. O alternativamente las hojas se incubaron con la sonda de unión de rodamina-quitina durante 16 horas. Después de la incubación el fluorocromo o la sonda de unión de rodamina-quitina se lavó (dos veces con PBT y una vez con PBS).

Se examinaron los tricomas recombinantes teñidos en los bordes de las hojas mediante microscopía de fluorescencia, por ejemplo, con filtro Zeiss 38. Se observó que el material de la pared celular de tricomas recombinantes se tiñe de manera reproducible más intenso que el material de la pared celular de las plantas de control (ver figuras 1A-1 B). 4. Expresión específica de fibra de una quitina sintasa en algodón Plantas de algodón transgénico que comprenden un gen de quitina sintasa 2 quimérico como se indica en el ejemplo 2, bajo control del promotor selectivo de fibra F286 (que se describe en US2003/106097), así como de plantas transgénicas que comprenden dos genes quiméricos, es decir, dicho gen de quitina sintasa 2 quimérico bajo control del promotor F286 y un gen glutamina: fructosa-6-fosfato amidotransferasa (gfa) bajo control de dicho promotor F286, o dicho gen de quitina sintasa 2 quimérico bajo el control del promotor E6 y un gen de gfa bajo control del promotor E6, han sido generados usando el método de transformación como se describe en US6483013. Fibras de estas plantas de algodón transgénico son aisladas y utilizadas para producir hilados y telas con reactividad mejorada, tal como capacidad de tinción mejorada. Fibras aisladas de bellotas de algodón de plantas transgénicas tienen una cantidad incrementada de polímeros de N-acetilglucosamina que se distribuyen uniformemente a lo largo de la pared celular. 5. Fibras de algodón con reactividad incrementada Plantas de algodón transgénico que comprenden una región de codificación de SmCHS2 quimérica en lazada de manera operable a un promotor específico de fibra se han generado como se describe en el ejemplo 4. Fibras de algodón maduro son cosechadas de estas plantas y pueden ser teñidas con rojo Congo o pueden hacerse reaccionar con WGA-Alexa flúor 555. Además, las fibras de algodón maduro resultante pueden ser teñidas con tintes comerciales incluyendo colorantes reactivos de algodón (por ejemplo, Rojo reactivo 120, Azul Levafix CA), tintas ácidas (naranja ácido 7, azul ácido 281 ) y tintas reactivas a la lana (por ejemplo, Rojo reactivo 1 16, ámbar Realan EHF).

Tinción con WGA-Alexa 555 Fibras de algodón no es necesario ser deshidratadas o permeabílizadas. En cambio, lípidos y ceras se remueven por el tratamiento de fibras durante 10 minutos 3 veces en un cloroformo: mezcla de metanol (1 :1 ), siga por dos veces un tratamiento de 10 minutos en acetona y dos veces 5 minutos en éter. Las fibras se dejan secar al aire.

Fibras pueden ser teñidas con WGA-Alexa555, WGA-Alexa488 o WGA-tetrametilrodamina.

Las fibras se colocan en solución de bloqueo (150 mM NaCI, 10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio pH 7.4; 0.1 % de Tween 20 y 1 % de albúmina de suero bovino) y se incuban durante una hora. Posteriormente, el regulador de pH se remplaza por el mismo regulador de pH que contiene WGA-fluorocromo y se incuba durante 4 horas. La solución de WGA-fluorocromo se sustituye por la solución de bloqueo, se lava 10 minutos, seguido de 3 veces 10 minutos de lavado con solución de bloqueo sin BSA, y 2 veces 5 minutos de lavado con solución de bloqueo sin BSA y sin Tween. Las fibras teñidas se montan sobre un portaobjetos de microscopio y se evalúan por medio de microscopía de fluorescencia (Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Alemania) con Filterset 38 (excitación: BP470/40; emisión: BP525/50) para Alexa flúor 488 conjugado o Filterset 20 (excitación: BP546/12; emisión: BP575-640) para Alexa flúor 555 o conjugado de tetrametilrodaminá. Considerando que no puede ser detectada fluorescencia específica en fibras de algodón de las plantas de algodón no transgénico, una fluorescencia brillante es detectable en fibras de algodón de las plantas de algodón transgénico que comprende un gen SmCHS2 quimérico. Secciones microscópicas virtuales de las fibras de algodón muestran que WGA-flúor555 es distribuido uniformemente a lo largo de la pared celular secundaria de las células de fibra de algodón.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos un 97% idéntica a SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de las mismas. 2. - Una molécula de ácido nucleico aislada compuesta por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de quitina sintasa que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO: 2. 3. - Un gen quimérico que comprende las siguientes regiones de ADN operablemente enlazadas: a) un promotor vegetal-expresable, b) una región de ADN que codifica para un polipéptido de quitina sintasa de la reivindicación 1 ó 2, c) una región de terminación y poliadenilación de transcripción. 4. - El gen quimérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor constitutivo. 5. - El gen quimérico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor selectivo de fibra. 6. - Una célula vegetal que comprende un gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 7. - Una planta que consiste esencialmente de las células vegetales de la reivindicación 6. 8. - La planta de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque es algodón. 9.- Fibras obtenibles de la planta de la reivindicación 7 u 8. 10 - Una semilla transgénica que comprende el gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 1 1 - Un método para la manufactura de una pared celular vegetal que comprende polisacáridos cargados positivamente, dicho método comprendiendo a) expresar un gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 5 en una planta, b) y aislar dicha pared celular vegetal. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque dicha pared celular vegetal es una pared celular vegetal de algodón. 13 - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha pared celular vegetal de algodón está presente en una fibra de algodón.