MX2011008611A - Anticuerpos anti-cd20 humanizados y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos anti-CD20 humanizados que se pueden usar para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con células que expresan CD20. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos, métodos para hacer tales anticuerpos, y composiciones que comprenden tales anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD20 HUMANIZADOS Y METODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a anticuerpos anti-CD20 humanizados y su uso en el tratamiento de varias enfermedades y afecciones. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos, métodos para hacer tales anticuerpos, y composiciones que comprenden tales anticuerpos. I ANTECEDENTES DE LA INVENCION CD20 humano (también llamado antígeno de diferenciación restringido a linfocito B humano así como también Bp35) es una proteína de transmembrana hidrofóbijca con un peso molecular de aproximadamente 35 kilodaltúns ubicada en linfocitos pre-B y B maduros. CD20 no se encuentra I en células madre hematopoyéticas , células pro-B, células 'de plasma normales u otros tejidos normales.

CD20 humano es un buen objetivo para inmunoterapia de neoplasmas de célula B debido a que se expresa en la superficie de alrededor de 90% de células malignas pero nó se expresa en células madre hematopoyéticas, células de plasma normales, células mieloides, de linaje T, endoteliales , u otras no linfoides . CD20 humano también es un buen objetivo para inmunoterapia de enfermedades autoinmunitarias , ¡el REF. : 222769 agotamiento de células B se ha mostrado que es una estrategia efectiva para tratar enfermedades autoinmunitarias . Por ejemplo, rituximab, el anticuerpo anti-CD20 quimérico G2|B8 (disponible comercialmente como RITUXAN® y vendido por Biogen Idee Inc. y Genetech, Inc.), es aprobado para varias indicaciones, incluyendo linfoma no de Hodgkin y artritlis reumatoide.

En el enlace de anticuerpo, CD20 no se modula significativamente ni es quitado. Se ha mostrado que una gran cantidad de funciones efectoras de anticuerpo es reclutada por los anticuerpos anti-CD20, incluyendo la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) por células efectoras mononucleares , lisis dependiente de complemento, e inducción de diferenciación celular. También se ha mostrado que los anticuerpos anti-CD20 inducen lia apoptosis de líneas de células B malignadas, especialmente después de la reticulación intensiva, por ejemplo, por célul;as que expresan receptores para el dominio FC de IgG (FcyR) . : Los anticuerpos monoclonales anti-CD20 rituximab, anti-Bl, y 1F5 tienen efectos apoptóticos similares en las líneas de células B.

Las limitaciones de los anticuerpos murinos quiméricos actuales incluyen la respuesta del anticuerpo anti -ratón humano (HAMA) y la respuesta del anticuerpo anti-quimérico humano (HACA) .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION I En un aspecto, se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende: (a) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (1) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Jla Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ajla Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEC ID NO: 1) en donde Xaa5 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; Xaa70 es Tyr o Phe; y (2) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu AlLa Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEC ID NO: 2) en donde Xaa5 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; y Xaa70 es Tyr o Phe; y (b) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa6s Thr Xaa70 Thr Xaa72 Asp Xaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr pjhe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Vjal Ser Ser (SEC ID NO: 3) en donde XaaS8 es Val o Ala; Xaa70 es Val o Leu; Xaa72 es Arg o Ala; y Xaa7 es Thr o Lys ; | en donde el anticuerpo humanizado enlaza a CD20 humano.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Iieu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe et EÍis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEC ID NO: 1) en donde Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; Xaa70 es Tyr o Phe; y Xaa86 es Tyr o Phe; en donde el anticuerpo humanizado enlaza a CD-20 humano.

En todavía otro aspecto, se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que compréiijde la siguiente secuencia de aminoácido: Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gjln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEC ID NO: 2) en donde Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; y Xaa70 es Tyr o Phe; en donde el anticuerpo humanizado enlaza a CD-20 humano.

En un aspecto adicional, se proporciona jan anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada qüe comprende una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser c s Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ajan Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Apn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 Asp Xaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr P'.ie Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Vkl Ser Ser (SEC ID NO: 3) en donde Xaa68 es Val o Ala; Xaa70 es Val o Leu; Xaa72 es Arg o Ala; y Xaa74 es Thr o Lys ; en donde el anticuerpo humanizado es capaz de enlazar a CD-20 humano .

En todavía un aspecto adicional, se proporciona ün método para tratar un trastorno de células B en un sujeto. Él método comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos en la presente.

En otro aspecto, se proporciona un método pajra prevenir un trastorno de células B en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad profilácticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos en ¡la presente .

En un aspecto adicional, una composición de anticuerpo anti-CD20 humanizado que comprende cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos en la presente, jen donde al menos 90% de los N-glicanos presentes en la composición son GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO) .

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos en la presente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En todavía un aspecto adicional, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos humanizados descritos en la presente.

También se proporcionan células huésped qjue comprenden cualesquiera de los ácidos nucleicos aislados mencionados antes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A proporciona una modalidad de las secuencias de ácido nucleico de las diversas moléculas de ácido nucleico (incluyendo el péptido señal X6210j9, secuencias de armazón (FR) U00570, y regiones determinantes de complementariedad 1F5VH (CDRs) ) usadas para generar la molécula de ácido nucleico lF5RHAss . La Figura IB ilustra las CDRs 1, 2, y 3 de 1F5VH (SEC ID NOS: 77-79, respectivamente , de izquierda a derecha) que fueron injertadas en la FR receptora de U00570 (SEC ID NOS: 80-83, respectivamente, de izquierda a derecha) para generar 1F5RHA. i La Figura 2 proporciona la secuencia de áci'do nucleico (SEC ID NO: 15) y aminoácido (SEC ID NO: 16) del constructo de ácido nucleico 1F5RHA optimizado, que no contiene mutaciones en la región de armazón (FR) .

La Figura 3 proporciona el ácido nucleico (SEC ID NO: 17) y secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 18) del constructo de ácido nucleico 1F5RHB optimizado que contiene retro-mutaciones en los 4 residuos vernier no conservados como sigue: V67A; V69L; R71A; y T73K (numeración Kabat) .

La Figura 4A proporciona secuencias de regiones Jde armazón (FRs) y regiones determinantes de complementariedad (CDRs) usadas para generar un ejemplo de un anticuerpo ant|i-CD20 humanizado, lF5RKAllss. La Figura 4B ilustra las secuencias de aminoácido de la FR (SEC ID NOS: 8 -9?, respectivamente, de izquierda a derecha) y CDRs (SEC ID NOS: 84-86, respectivamente, de izquierda a derecha) usadas para generar 1F5RKA11.

La Figura 5 proporciona la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 30) y secuencia de aminoácido (SEC ÍD NO: 31) de un ejemplo de un anticuerpo optimizado con base en 1F5RKA11SS para generar el constructo 1F5RKA11. Eá^e constructo no contiene mutaciones de FR.

La Figura 6 proporciona la secuencia de ácijdo nucleico (SEC ID NO: 32) y aminoácido (SEC ID NO: 33) de Un ejemplo de un anticuerpo humanizado, 1F5RKB11, basado 'µ? 1F5RKA11, que contiene retro-mutaciones en los 3 residuos vernier no conservados como sigue: L46P; L47W; y F71Y j (numeración Kabat) ; y en el residuo de interfaz VH/VK Y87F (numeración Kabat) . ; La Figura 7A proporciona secuencias de regiones de armazón (FRs) y regiones determinantes de complementariedad (CDRs) usadas para generar un ejemplo de un anticuerpo ant|i- CD20 humanizado, lF5RKA12ss. La Figura 7B ilustra las CDRs 1, 2, y 3 de 1F5VK (SEC ID NOS: 91-93, respectivamente, de izquierda a derecha) que fueron injertadas en la FR aceptora de AY263415 humano (SEC ID NOS: 94-97, respectivamente, de izquierda a derecha) para generar 1F5RKA12.

La Figura 8 proporciona la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 44) y secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 45) de un ejemplo de un anticuerpo optimizado basado en lF5RKA12ss para generar el constructo 1F5RKA12. El constructo no contiene mutaciones de FR.

La Figura 9 proporciona la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 46) y secuencia de aminoácido (SEC jlD NO: 47) de un ejemplo de un anticuerpo anti-CD20 humanizado, 1F5RKB12, basado en 1F5RKA12, que contiene retro-mutacionés en los 3 residuos vernier no conservador como sigue: L46P; L47W; y F71Y (numeración Kabat) .

La Figura 10A proporciona una alineación de secuencia de aminoácido de los ejemplos de variantes de 1F5RHA. La Figura 10B proporciona una alineación de secuencia de aminoácido de los ejemplos de variantes de 1F5RKA11. La Figura 10C proporciona una alineación de secuencia de aminoácido de los ejemplos de variantes de 1F5RKA12. Los residuos de aminoácido CDR se indican por los cuadros etiquetados "CDR1" , "CDR2" , y "CDR3" ; los aminoácidos subrayados indican residuos FW de ratón que fuerpn introducidos en las secuencias humanizadas. ¡ Las Figuras 11A-11E proporcionan secuencias de aminoácido de las regiones variable y constante maduras de las proteínas 1F5RKG11, 1F5RKB11, 1F5RKF12, 1F5RKB12, y 1F5RHA. La Figura 11A proporciona la secuencia de aminoácido de las regiones maduras variable y constante (subrayadas) de 1F5RKG11 (SEC ID NO: 60) . La Figura 11B proporciona ¡la secuencia de aminoácido de las regiones maduras variables constantes (subrayadas) de 1F5RBK11 (SEC ID NO: 61) . ¡La Figura 11C proporciona la secuencia de aminoácido de 1as regiones maduras variables y constantes (subrayadas) 1F5RKF12 (SEC ID NO: 61) . La Figura 11D proporciona !la secuencia de aminoácido de las regiones maduras variabl constantes (subrayadas) de 1F5RKB12 (SEC ID NO: 63) . La Figura 11E proporciona la secuencia de aminoácido de las regiones maduras variables y constantes (subrayadas) de 1F5RHA (SEC ID NO: 64) . Las regiones constantes de las secuencias de aminoácidos son subrayadas.

La Figura 12A proporciona los resultados del ensayo de enlace Raj i para VK x 1F5RHA (RHA) quimérico y VH x (1F5RKA11, 1F5RKA12, o 1F5RKB11) quimérico en comparación cbn el anticuerpo clF5 quimérico (Quimérico) . La Figura 12-B proporciona los resultados de los ensayos de enlace Raj i para 1F5RHA o 1F5RHB (RHB) humanizado en asociación con VK quimérico, en comparación con Rituxan. Las Figuras 12C y 12D proporcionan resultados de ensayos de enlace Raj i paira versiones 1F5VK humanizado (KB11, etc.) en asociación con quimérico, en comparación con el anticuerpo quimérico clF5 Las Figuras 13A y 13B proporcionan ejemplos del enlace de células Raj i de anticuerpos codificados por 1F5RHA humanizado en asociación con las cadenas kappa de 1F5 humanizado indicadas, en comparación con la versión quimérica de 1F5. Las mediciones son promedios de cavidades duplicada^.

La Figura 14 proporciona un enlace de células Ra i ejemplar de los anticuerpos codificados por 1F5RHA humanizado en asociación con las cadenas kappa de 1F5 humanizado, en comparación con la versión quimérica de 1F5. Las mediciones son promedios de cavidades cuadruplicadas. Las barras de error indican la desviación estándar entre los cuadruplicados.

La Figura 15 proporciona un ejemplo de resultados de termoestabilidad para algunas modalidades de anticuerpos anti-CD20 humanizados. Cada anticuerpo fue diluido a 1 g/ml en medio/PBS, calentado por 10 minutos a la temperatura indicada, luego enfriado a 4°C antes del ELISA de enlajce I células Raj i a temperatura ambiente. Los anticuerpos humanizados (aparte de Rituxan) se codifican por 1F5RHA conjuntamente con el constructo de cadena ligera indicado.

La Figura 16 proporciona un ejemplo de la intensidad de fluorescencia media en un ensayo de enlace de anticuerpo fluorescente en células Raji para diversks modalidades de anticuerpos anti-CD20 humanizados.

La Figura 17 proporciona un ejemplo de un ácido nucleico clF5VK quimérico pre-optimizado (SEC ID NO: 65) secuencia de aminoácido correspondiente (SEC ID NO : 66) .

La Figura 18 proporciona un ejemplo de un ácido nucleico C1F5VK quimérico optimizado (SEC ID NO: 67) y secuencia de aminoácido correspondiente (SEC ID NO: 68) .

La Figura 19 proporciona un ejemplo de un ácido nucleico C1F5VH quimérico pre-optimizado (SEC ID NO: 69) y secuencia de aminoácido correspondiente (SEC ID NO : 70) .

La Figura 20 proporciona un ejemplo de un ácido nucleico C1F5VH quimérico optimizado (SEC ID NO: 71) y secuencia de aminoácido correspondiente (SEC ID NO: 72) .

La Figura 21 muestra la estructura de glicano GO .

La Figura 22 proporciona un ejemplo de Una secuencia de proteína C1F5VH quimérica (región madiira variable y constante) (SEC ID NO : 73) . La región constante de la secuencia de aminoácido es subrayada.

La Figura 23 proporciona un ejemplo de una secuencia de proteína clF5VK quimérica (región madura variable y constante) (SEC ID NO: 74) . La región constante de la secuencia de aminoácido es subrayada.

La Figura 24 muestra los resultados del ensayo CDC de varias concentraciones de los anticuerpos anti-CD20 probados como se explica en el Ejemplo 5.

La Figura 25 muestra los resultados de un ensayo que mide la disociación de anticuerpos anti-CD20 (es decilr, constante de disociación) de células Raji como se explica en el Ejemplo 5.

La Figura 26 muestra una gráfica de barras de la i vida media obtenida de uno de los estudios de velocidad de disociación en anticuerpos anti-CD20 explicados en el Ejemplo 5. l La figura 27 muestra los resultados de un ensayo de . i agotamiento de células B usando anticuerpos anti-CD20 j a varias concentraciones.

La Figura 28 muestra los resultados de un ensayo de agotamiento de células B usando anticuerpos anti-CD20 a varias concentraciones en la presencia de anticuerpo anti-CD16. í DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos 1F5 humanizados que enlazan a, o son capaces enlazar a, CD20, así como también a composiciones que comprenden los anticuerpos. La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos IF5 humanizados. Es decir, se proporcionan anticuerpos anti-CD20 humanizados y moléculas de ácido nucleico que codifican tales anticuerpos anti-CD20.

Los anticuerpos y composiciones de los mismos proporcionados en la presente son útiles en métodos para tratar enfermedades y afecciones asociadas con células que expresan CD20 (tales como células B) , incluyendo linfomas, enfermedades autoinmunitarias , y rechazos de transplante. Las composiciones incluyen los anticuerpos anti-CD20 humanizados, fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos anti-CDj20 humanizados, y composiciones farmacéuticas de tales anticuerpos. Las composiciones también incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los anticuerpos anti-CD20 humanizados discutidos en la presente, vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican ljos anticuerpos anti-CD20 humanizados, células huésped (incluyendo transfectomas e hibridomas) transformadas con los vectores o que incorporan las moléculas de ácido nucleico que expresan los anticuerpos humanizados, formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos humanizados anti-CD20, y métodos para hacer y usar los mismos. También se proporcionan métodos para tratar o prevenir las enfermedades o trastornos asociados con las células que expresan CD20 (tales cojno trastornos por células B) .

Antes de describir la invención con detalle adicional, primero serán definidos los siguientes términos. A menos que se señale de otra forma, todas las secuencias ¡de ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha ;en orientación 5' a 3', y todas las secuencias de aminoácido se escriben de izquierda a derecha en orientación amino-termin¡al a carboxi-terminal .

Definiciones : Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" usan de manera intercambiable y se usan en su sentido amplio en la presente. Específicamente, el término incluye anticuerpos monoclonales , anticuerpos multiespecífieos , fragmentos de anticuerpo, y otros anticuerpos 1 e inmunoglobulinas siempre y cuando exhiban la función y actividad biológica deseadas.

"Fragmentos de anticuerpo" y "fragmento de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, y generalmente incluyen la región variable del mismo.

Como se usa en la presente, un "CD20" o "CD20 humano" (también llamado antígeno de diferenciacíjón restringido a linfocitos B humanos, Bp35) se refiere a Una fosfoproteína de transmembrana con un peso molecular de aproximadamente 35 kilodaltons que se expresa en células B normales y malignas. ¡ Un "anticuerpo anti-CD20" como se usa presente significa un anticuerpo que específicamente CD20 humano.

Como se usa en la presente, un "anticuerpo quimérico" se refiere a cualquier anticuerpo en el cual la región o sitio inmuno-reactivo o de enlace se obtiene o se deriva de una primera especie y la región constante (la cual puede estar intacta, parcial o modificada) se obtiene de una segunda especie. Por ejemplo, el sitio o región de enlJce objetivo se deriva de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante se deriva de ;un anticuerpo humano.

Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un polipéptido que comprende al menos una porción de una región variable modificada de un anticuerpo humano en donde u'na porción de la región variable, preferiblemente una porcijón sustancialmente menor que el dominio variable humano intacto, se ha sustituido por la secuencia correspondiente de üjna especie no humana y en donde la región variable modificada se enlaza a al menos otra parte de otra proteína, preferiblemente la región constante de un anticuerpo humarlo. La expresión "anticuerpos humanizados" incluye anticuerpos humanos en los cuales uno o más residuos aminoácido de región determinante de complementariedad ("CDR") y/o uno o más residuos de aminoácido de región de armazón ("FW" o "FR") se sustituyen por residuos aminoácido de sitios análogos en anticuerpos de roedor u otros no humanos que son capaces de enlazar a CD20. La expresión "anticuerpo humanizado" también incluye una variante de secuencia de aminoácido de inmunoglobulina o fragmento de la misma que es capaz de enlazar a CD20 y que comprende una FR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente lia secuencia de aminoácido de una inmunoglobulina no humana. j Las cadenas pesadas de inmunoglobulina se pueden clasificar como gamma (?) , mu (µ) , alfa (a) , delta (d) , : o i epsilón (e) , con algunas subclases entre los mismos ejemplo, ?1-?4). La clasificación (o "clase") del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, respectivamente, se determina por la naturaleza de la cadena pesada la cual confiere la especialización funcional a la inmunoglobulina. La inmunoglobulina se puede clasificar en subclases (o "isotipos") por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, etc.

Tales isotipos son bien caracterizados y confieren I especializacion funcional adicional a la inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos. Las cuatro cadér.as típicamente se unen por enlaces de disulfuro en una configuración "Y" donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas que inician en la boca de la "Y" y continúan a través de la región variable.

Hay dos tipos de cadenas ligeras: kappa ( ) lambda (?) . Cada clase de cadena pesada se puede unir ya sea con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada se unen covalentemente entre si, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre si por enlaces de disulfuro covalentes y enlaces ¡no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea por hibridomas de células B, células B, o células huésped genéticamente modificadas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácido corren del amino-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y al carboxilo-terminal en la parte inferior de cada cadena.

Tanto las cadenas ligeras como pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional referidas como "regiones constante" y "regiones variables" . Dos términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente . LOS dominios variables de las porciones de cadena tanto ligera (VL o VL) como pesada (VH o VH) determinar el reconocimiento y especificidad del antígeno. A la inversa, los dominijos i constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (<¾?, CH2Í O CÍO) confieren propiedades biológicas importantes taljes como secreción, movilidad transplacentaria, enlace de receptor Fe, enlace de complemento, y similares. Por convención, la numeración de los dominios de región constante incrementa cuando llegan a estar más distantes del sitio de enlace de antígeno o amino-terminal del anticuerpo. La región variable está en el amino-terminal y la región constante está en el carboxilo-terminal ; los dominios CH3 y CL actualmente comprenden el carboxi -terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Las expresiones "región determinante de complementariedad" , "región hipervariable" , y "CDR" se refieren a una o más de las regiones hipervariables 1 o determinantes de complementariedad (CDRs) encontradas en las regiones variables de cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (ver, Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. , (1987)). Estas expresiones incluyen ijás regiones hipervariables como se definen por Kabat et ají. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. et al., US Dept . of Health and Human Services, 1983) o l'os bucles hipervariables en las estructuras de 3 dimensiones de anticuerpos (Chothia and Lesk, J Mol. Biol . 196 901-917 (1987)) . Las CDRs en cada cadena se mantienen en proximidad cercana por las regiones de armazón y, conjuntamente con lias CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sit¡io de enlace de antígeno.

Las expresiones "región de armazón" y "FR" !se refieren a una o más de las regiones de armazón dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo {Ver, Kabat , E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. , (1987) ) . Estas expresiones incluyen aquellás secuencias de aminoácido de cadenas tanto ligera como pesada de un anticuerpo, situadas entre el amino terminal de 'la primera CDR, aquellas impuestas entre las CDRs, y aquellas entre la tercera CDR y el inicio de la región constante.

Los residuos de CDR y FR se pueden determinar de acuerdo con una definición de secuencia estándar (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987) ) , y una definición estructural (como en Chothia. and Lesk, J. Mot . Biol. 196:901-217 (1987)).

Donde se indique en la presente, se hace referencia al esquema de numeración de Kabat, E. A., et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes bf Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991) . Kabat usa un método para asignar un número de residuo a cada aminoácido en una secuencia listada, y este método para asignar números |de 1 residuo ha llegado a ser estándar en el campo. Donde ¡se indique, el esquema de numeración Kabat es seguido en esta descripción. Donde la numeración Kabat no se indica, se usa la numeración de secuencia de aminoácido secuencial tes decir, los aminoácidos en una secuencia son numerados usando 1 números enteros secuenciales (1, 2, 3, etc.) de izquierda a derecha en orientación amino-terminal a carboxi-terminal) .

Un "fragmento de enlace de antígeno" de ¡un anticuerpo se refiere a fragmentos biológicamente activos de los anticuerpos descritos en la presente que funcionan esencialmente igual como un anticuerpo 1F5 de longitud completa para enlazar a CD20. Tales fragmentos comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el enlace de antígeno o región variable del mismo. Ljos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab' )2# y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo el cual contiene un sitio de enlace de antígeno y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste de un dimero de un dominio de región variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociación no covalente estrecha. Del pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos aminoácido para el enlace de antígeno y confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar el antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de enlace completo.

Los términos "rituximab" o "RITUXAN®" se refieren; a un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico genéticamente modificado dirigido contra CD20 que tiene la secuencia de aminoácido del anticuerpo designado "C2B8" en la Patente de Estados Unidos No. 5,736,137.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (por ejemplo células Asesinas Naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el í anticuerpo unido en una célula objetivo y posteriormente causan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcyRII y F RII "Afinidad" de un anticuerpo para un antígeno o epítopo es un término bien entendido en el arte y significa el grado, o resistencia, de enlace de un anticuerpo a ún epítopo. La afinidad se puede medir y/o expresar en un número de formas conocidas en el arte, incluyendo, pero no limitado a, constante de disociación de equilibrio (KD o ¾, la cual se puede definir como la relación de la velocidad de disociación y velocidad de asociación del anticuerpo, es decir, Koff/Kon) , constante de disociación de equilibrio aparente (KD. o Ka< ) , e IC50 (cantidad necesaria para efectuar el 50% de inhibición en un ensayo de competición) ; la afinidad relativa de j anticuerpos humanizados también se puede determinar en comparación con, por ejemplo, anticuerpos murinos o quiméricos relacionados. Se entiende que, para propósitos de esta invención, una afinidad es una afinidad promedio para una población dada de anticuerpos los cuales enlazan a un antígeno o epítopo. Afinidad (o afinidad relativa) para los anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la presente ¡se puede medir usando ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA) o un ensayo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) como se describe en los Ejemplos en la presente.

"Velocidad de disociación" significa la constante de velocidad de disociación (Koff) de un anticuerpo de un complejo de anticuerpo/antígeno . Por consiguiente, los anticuerpos con velocidades de disociación menores permanecen unidos al anticuerpo más tiempo que los anticuerpos con velocidades de disociación mayores.

"Velocidad de asociación" significa la constante de d velocidad de asociación (Kon) de un anticuerpo a un antíg'e?no para formar un complejo de anticuerpo/antígeno.

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico ' o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de ¡un anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquiera de los efectos tóxicos o nocivos del anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificación y por períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de i o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva puede ser menor que la cantidjad terapéuticamente efectiva.

"Trastornos de células B" incluye una variedad 'de trastornos, incluyendo, pero no limitados a, malignidades de células B, trastornos autoinmunitarios , linfornas de célul s B, leucemias de células B, y otros trastornos.

Un "trastorno autoinmunitario" o "enfermedad autoinmunitaria" como se usa en la presente se refiere a uha enfermedad o trastorno no maligno que surge de y se dirige contra unos tejidos propios del individuo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel incluyendo psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica) ; escleroderma sistémica y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad Crohn y colitis ulcerativa) ; síndrome de insuficiencia respiratoria (incluyendo síndrome de insuficiencia respiratoria jen adultos; ARDS) ; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis ; afecciones alérgicas tales como eczema y asma y otras afecciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; ateroesclerosis ; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémijco (SLE) ; diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus Tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina) ; esclerosjis i múltiple; síndrome de Raynaud; tiroiditis autoinmunitaria; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjógren; diabetes de juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda o retrasada mediada por citocinas y linfocitos T típicamente encontrados en la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis , granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran la diapédesis leucocitaria ; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (CNS) ; síndrome de lesión de múltiples órganos; anemia hemolítica (incluyendo, pero no limitada a crioglobinemia o anemia Coombs positiva) ; miastenia grave; enfermedades mediadas por complejo de antígeno-anticuerpo ; enfermedad de membrana de basamento anti-glomerular ; síndrome antifosfolípidos ; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lamert-Eaton; penfigoide buloso pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunitarias ; enfermedad de Reiter; síndrome del homb're rígido; enfermedad de Behcet; arteritis de célula gigante; nefritis de complejo inmunitario; nefropatía de IgA; polineuropatías de IgM; púrpura trombocitopénica inmunitaria (ITP) o trombocitopenia autoinmunitaria, etc.

Anticuerpos 1F5 Humanizados La invención proporciona anticuerpos 1F5 humanizados y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos que son capaces de enlazar a CD20 humano (es decir, anticuerpos anti-CD20 humanizados) .

En una modalidad, se proporciona un anticuerpo humanizado (incluyendo fragmentos de enlace de antígeno del mismo) , que comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuenqia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: I (1) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa6 lie Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEC ID NO: 1) Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; Xaa70 es Tyr o Phe; (2) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glü liéu Lys (SEC ID NO: 2) en donde : Xaa45 es Pro o Leu; Xaa6 es Trp o Leu; y I Xaa70 es Tyr o Phe .

En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo humanizado (incluyendo fragmentos de enlace de antígeno del mismo) que comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaaga Thr Xaa 70 Thr Xaa72 Asp Xa¼.74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEC ID NO: 3) en donde : Xaa68 es Val o Ala; Xaa70 es Val o Leu; Xaa72 es Arg o Ala; y Xaa es Thr o Lys .

Por consiguiente, las regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos anti-CD20 pueden tener varijas secuencias de aminoácido, incluyendo las siguientes secuencias de aminoácido descritas en las Figuras 10B y 10C: SEC ID NOS: 28, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 42, 55, 56, 57, 58, y 59. En un ejemplo, la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 49. En otro ejemplo, la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID. NO: 54. En aún otro ejemplo, la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 59. En todavía otro ejemplo, la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NÓ : 55.

Las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos anti-CD20 pueden tener varias secuencias de aminoácido, incluyendo las siguientes secuencias de aminoácido descritas en la Figura 10A: SEC ID NO: 13 y SEC ID NO : 48.

En una modalidad, se proporciona un anticuerpo humanizado (incluyendo fragmentos de enlace de antígeno del mismo) que comprende (a) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (1) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala ? Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEC ID NO: 1) en donde : Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; Xaa 0 es Tyr o Phe; y Xaa86 es Tyr o Phe; y (2) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln T:rp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEC ID NO : 2 ) en donde : Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; y Xaa70 es Tyr o Phe; y (b) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia Jde aminoácido: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val | Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 Asp Xaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr P e Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEC ID NO : 3 ) en donde : Xaa6s es Val o Ala; Xaa70 es Val o Leu; Xaa72 es Arg o Ala; y En una modalidad, el anticuerpo anti-CD20 puede comprende (1) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEC ID NO: 13 y (2) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEC ID NO: 49.

En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD20 puede comprender (1) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido descrita en SEC ID NO: 13 y (2) una cadena lige!ra que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido descrita en SEC ID NO: 54.

En todavía otra modalidad, el anticuerpo anti-CD20 puede comprender (1) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia e aminoácido descrita en SEC ID NO: 13 y (2) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido descrita en SEC ID NO: 55.

En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-CD>20 humanizado puede comprender (1) una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido descrita en SEC ID NO: 13 y (2) utia cadena ligera que comprende una región variable de cadeha ligera que tiene la secuencia de aminoácido descrita en skl ID NO: 59.

Los anticuerpos anti-CD20 humanizados en la presente son capaces de enlazar a CD20 humano. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad similar a aquella del anticuerpo 1¡F5 (es decir, con la afinidad similar a aquella de la afinidad que el anticuerpo 1F5 tiene para CD20 humano) . En otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad al menos tan grande como aquella del anticuerpo 1F5. En todavía otra modalidad, los anticuerpjos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad mayor que aquella del anticuerpo 1F5. Como se usa en la presente una "afinidad similar a aquella del anticuerpo 1F5" signifijca una afinidad de grado de similitud suficientemente alto a (la afinidad del anticuerpo 1F5 de modo que uno de experiencia en el arte podría considerar la diferencia entre las afinidades de poco o ningún significado biológico.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CDj20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad similar a aquella del anticuerpo quimérico clF5 descrito en los Ejemplos en la presente (es decir, con una afinidad similar a aquella de la afinidad que el anticuerpo quimérico clF5 tiene para CD^O humano). En otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad al menos tan grande como aquella del anticuerpo quimérico clF5. En todavía otra modalidad, los anticuerpos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad mayor que aquella del anticuerpo quimérico clF5. Como se usa en la presente una "afinidad similar a aquella del anticuerpo quimérico clF5" significa una afinidad de grado de similitud suficientemente alto a la afinidad del anticuerpo quimérico clF5 de modo que uno de experiencia en el arte podría considerar la diferencia entre las afinidades de poco o ningún significado biológico" .

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una velocidad de disociación menor que aquella del anticuerpo quimérico clF5. En otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados no menorjas que aquellos del anticuerpo quimérico clF5.

En modalidades adicionales, los anticuerpos anti- í CD20 humanizados enlazan a CD20 con una afinidad mayor que aquella de rituximab. En otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados enlazan a CD20 con una velocidad de disociación menor que aquella de rituximab.

Los anticuerpos anti-CD20 pueden comprender regiones constantes de cadena pesada (o porciones de las mismas) y/o regiones constantes de cadena ligera (o porciones de las mismas) de cualquier isotipo, alotipo, e idiotipó. Tales regiones constantes pesadas y ligeras se pueden presentar naturalmente o pueden contener mutaciones por supresión, sustitución, o adición. Las secuencias de ADN de región constante humana son conocidas y se pueden aislar de una variedad de células humanas . Cuando están presentes en I las cadenas pesada y/o ligera, las regiones constantes se pueden unir al extremo carboxilo terminal de las regiones variables de las cadenas pesada y/o ligera.

Fragmentos de Anticuerpo En algunas modalidades, se proporcionan fragmentjos de los anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la presente, antes que anticuerpos completos.

Cualquier método disponible se puede usar para la producción de tales fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos fueron derivados vía digestión proteolítica de anticuerpos intactos. Sin embargó, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por células huésped recombinantes . Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar en y secretar de E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpo. Alternativamente, los fragmentos Fab' -SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formkr fragmentos F(ab' )2- De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. En otras modalidades, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fv de cadena única (scFv) .

El fragmento de anticuerpo puede ser fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la presente. Cualquier fragmento de ün anticuerpo completo se puede usar siempre y cuando el fragmento enlace a CD20.

Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos an i-CD20 humanizados también se pueden usar en la producción de anticuerpos biespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes epítopos. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlazar a dos diferentes epítopos de la proteína CD20. Otros anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace de CD20 con un sitio de enlace para otra proteína. Alternativamente, un sitio de enlace de anti-CD20 se puede combinar con un dominio o brazo el cual enlaza a una molécula de objetivo en un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD3), o receptores Fe para IgG (FcyR) , tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcvRIII (CD16) , o NKG2D u otro ligando activador de células NK, para enfocar y localizar lós mecanismos de defensa celular a la célula que expresa CD20 . Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar pai a localizar los agentes citotóxicos a células las cuales expresan CD20. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace cjle CD20 y un brazo el cual enlaza el agente citotóxico (ppr ejemplo, saporina, anti-interferón-a, vinca alcaloide, cadena de ricina A, metotrexato o isótopo radioactivo hapteno) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíf icos F{ab')2) -Anticuerpos multivalentes Los anticuerpos anti-CD20 humanizados también se I pueden usar en la producción de anticuerpos multivalentes. un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se enlazan los anticuerpos. Los anticuerpos anti-CD20 humanizados pueden ser anticuerpos multivalentes (los cuales son diferentes de jla clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antígeno (pbr ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , los cuales se pueden producir fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender ün dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace de antígeno amino-terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de enlace de antígeno. Él anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y puede comprender dos cadenas de polipéptido) , en donde las cadenas de polipéptido comprenden dos o más dominios variables.

Métodos de Producción Recombinante Los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden producir por cualquier método disponible, tal como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena i ligera y pesada, opcionalmente enlazados a regiones constantes, se pueden insertar en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada se pueden clonar en los diferentes vectores de expresión. Los segmentos de codifican cadenas de inmunoglobulina se pueden enlazar operativamente a secuencias de control en los vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores naturalmente asociados o heterólogos) , secuencias de señal, elementos mej oradores, y secuencias de terminación de transcripción. En una modalidad, las secuencias de control de expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótido, y la colección y purificación de los anticuerpos.

Los vectores de expresión pueden ser replicables én cualquier organismo huésped, ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal huésped. En una modalidad, los vectores de expresión contienen marcadores de seleccijón (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia j a higromicina, resistencia a tetraciclina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de aquellas céluljas transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

Los vectores de expresión se pueden usar para expresar los anticuerpos anti-CD20 humanizados de cualquier célula huésped, incluyendo células huésped procariotas (^or ejemplo, E. coli) , células huésped de levadura, células huésped de mamífero, células huésped de plantas, y céluljas huésped de insectos.

En una modalidad, E. coli se usa para la producción de los anticuerpos humanizados. Otros huéspedes procariotas adecuados para tal uso incluyen bacilos, tal como Bacillus subtilus, y otras enterobacterias , tal como Sal onella, Serratia , y varias especies Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden producir vectores de expresión, los cuales típicamente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación) . Además, cualquiera núm ro de una variedad de promotores bien conocidos estará presente, tal como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotjor de triptofano (trp) , un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de enlace de ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción.

Otros microbios, tal como levadura, también son útiles para la expresión de los anticuerpos humanizados. Por ejemplo, Saecharomyees se puede usar como un huésped de levadura, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores) , un origen de replicación, secuencias de terminación y similares como |se desee. Los promotores para uso en las técnicas de expresión de levadura incluyen 3 -fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenaba, isocitocromo C, y enzimas responsables de la utilización ide maltosa y galactosa.

En otra modalidad, se puede usar el cultivo celular i de tejido de mamífero para expresar y producir los anticuerpos anti-CD20 humanizados (por ejemplo, polinucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) . Cualquier célula de tejido de mamífero Jse puede usar en tales métodos, y un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) se han desarrollado en el arte, e incluyen líneas de células CHO, varias línejas de células Cos, células HeLa, preferiblemente, líneas de células de mieloma, o células B transformadas o hibridomas .

En una modalidad, las células son no humanas. Los vectores de expresión para las células de mamífero puede incluir secuencias de control de expresión, tal como un origen de replicación, un promotor, y un mejorador, y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras transcripcionales . En una modalidad, las secuencias de control de expresión son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus de papiloma bovino, citomegalovirus y similares. J Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótido de interés (por ejemplo, las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera y secuencias |de control de expresión) se pueden transferir en la célula huésped por métodos bien conocidos, los cuales varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, ¡la transfección por cloruro de calcio es comúnmente utilizada para células procariotas, mientras que el tratamiento clon fosfato de calcio, electroporación, lipofección, transfeccipn basada en biolística o viral se pueden usar para otros huéspedes celulares. Otros métodos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación, y microinyección . Para la producción de animales transgénicos , los transgenes se pueden microinyectar en oocitos fertilizados, o se puedLn incorporar en el genoma de células madre embriónicas, y los núcleos de tales células transferidos en oocitos enucleados.

Cuando las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera humanizadas son clonadas en vectores de expresión separados, los vectores pueden ser co-transfectados para obtener la expresión y montaje de inmunoglobulinas intactas. Una vez expresados, ljos anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesaba individuales, u otras formas de inmunoglobulina de los anticuerpos se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándares del arte, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, purificación por HPLC, electroforesis en gel y similares., Las inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad se pueden preparar para usos farmacéuticos. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados sustancialmente puros de al menos aproximadamente 98 a 99% o más homogeneidad se pueden producir para uso en las formulaciones farmacéuticas y métodos.

Por consiguiente, también se proporciona un método para expresar los anticuerpos anti-CD20 humanizados g_ue comprenden: (a) transformar una célula huésped con una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo antji-CD20 humanizado descrito en la presente, y (b) cultivar Ijas células huésped transformadas bajo condiciones que permiten la expresión de los anticuerpos anti-CD20 humanizados. Jse pueden usar técnicas conocidas que incluyen un marcador de i selección en el vector de modo que las células huésped cjue expresan los anticuerpos humanizados y quiméricos y el marcador se pueden seleccionar fácilmente.

En una modalidad preferida para producir los anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la presente, se usan cultivos de nodulos de lenteja de agua o planta de lenteja de agua para la expresión y la secreción de los anticuerpos. Las técnicas genéticas para transformar la lenteja de agua y optimizar la secuencia de nucleótido de los casetes de expresión que codifican el anticuerpo se descrifcjen en la Patente de Estados Unidos No. 6,815,184, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. I Gl ieosilación Los anticuerpos anti-CD20 descritos en la presente pueden ser glicosilados o no glicosilados . Cuando los anticuerpos anti-CD20 son glicosilados, las estructuras de glicano que están presentes pueden variar como se desee. Ejor ejemplo, usando diferentes células huésped para la producción recombinante de los anticuerpos anti-CD20 humanizados variarán las estructuras de glicano de los anticuerpos.

Las estructuras de glicano de los anticuerpos también se pueden optimizar usando técnicas conocidas tal como interferencia de AR , antisentido, y tecnologías agénicas, etc. en la línea celular huésped. Por ejemplo, cuando se usan células de plantas y/o plantas para producir los anticuerpos anti-CD20, el patrón de N-glicosilación nativo de los anticuerpos se pueden alterar usando métodos para inhibir la expresión de al , 3 - fucosiltransferasa y ß?,2-xilosiltransferasa (por ejemplo, usando constructos de interferencia de ARN) . Los ejemplos de tal tecnología y plantas se describen en la Publicación Internacional No. O 2007/084926, la totalidad de la cual se incorpora en jla presente .

Por consiguiente, en una modalidad, los anticuerpos anti-CD20 se pueden preparar en plantas de modo que el patrón de N-glicosilación tiene al,3-fucosa y pi,2-xilosa reducidas en comparación con tales anticuerpos producidos en plantas sin usar métodos para inhibir la expresión de al,j fucosiltransferasa y ß? , 2 -xilosiltransferasa .

En otra modalidad, los anticuerpos anti-CD20 pueden tener un patrón de glicosilación que está libre de fucosa y xilosa.

En todavía otra modalidad, los anticuerpos anti-CD20 pueden tener un patrón de N-glicosilación que jes predominantemente glicano GO . "Glicano GO" significa él glicano N-enlazado complejo que tiene la estructura GlcNAc2Man3GlcNAc2 como se muestra en la Figura 21, en doride GlcNAc es N-acetilglucosamina y Man es mañosa, y en donde un GlcNAc se une tanto al brazo de 1,3 mañosa como el brazo de 1,6 mañosa del núcleo, que se une a un residuo aminoácido del anticuerpo. Por consiguiente, por ejemplo, la composición ¡de anticuerpo anti-CD20 puede tener un perfil de N-glicosilación sustancialmente homogéneo en donde al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99% de la cantidad total de los N-glicanos en la composición de anticuerpo anti-CD20 se representa por las especies glicano GO .

Algunas inmunoglobulinas tienen glicosilación N-enlazada conservada de las regiones Fe de las cadenas pesadas. Por ejemplo, las inmunoglobulinas tipo IgG tienien I dominios CH2 glicosilados que tienen oligosacáridos N-enlazados en asparaginas 297. Los anticuerpos con contenido reducido de fucosa en los oligosacáridos unidos a las asparaginas en la posición 297 de la región Fe pueden mej la afinidad de Fe para FCYRIII, que a su vez puede incrementar la ADCC de los anticuerpos.

Por consiguiente, los anticuerpos que tienen un perfil de N-glicosilación que es predominantemente GO pueden tener actividad ADCC incrementada con relación a los anticuerpos producidos en plantas que no tienen expresión o función inhibida de al , 3 - fucosiltransferasa (y fior consiguiente producen anticuerpos con más al , 3 - fucosa) .

Métodos de Tratamiento Los anticuerpos anti-CD20 humanizados de, incluyendo fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, se pueden usar en el tratamiento de sujetos que tienen alguna enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD20, tales como células B normales y malignas que expresan antígeno CD20. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD20 humanizados son útiles para el tratamiento de trastornos |de células B.

Por célula B "maligna" se incluye cualquier células B neoplásica, incluyendo pero no limitado a células B derivadas de linfornas incluyendo linfornas de células B de bajo, intermedio, y alto grado, linfomas inmunoblástice s , linfornas no de Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, linfomas inducidos por Virus de Epstein-Barr (EBV) , y linfomas relacionados con el SIDA, así como también leucemdjas linfoblásticas agudas de células B, mielomas, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias mieloblásticas agudas, ! y similares.

Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD|20 humanizados son útiles para tratar un número de enfermedades malignas y no malignas incluyendo enfermedades autoinmunitarias y afecciones relacionadas, y cáncérjes positivos a CD20 incluyendo linfomas de células B y leucemias. Las células madre (progenitores de células B) en la médula ósea carecen de antígeno CD20, permitiendo que las células B saludables se regeneren después del tratamiento; y regresen a niveles normales dentro de varios meses.

Las enfermedades autoinmunitarias o afecciones relacionadas autoinmunitarias que se pueden tratar usando los anticuerpos anti-CD20, incluyen artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis , artritis psoriática) , psoriasis, dermatitis incluyenjdo dermatitis atópica, urticaria autoinmunitaria crónica, polimiositis/dermatomiositis , necrolisis epidérmicas tóxica, escleroderma sistémico y esclerosis, respuestas asociadas cjon enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (enfermedad, de Crohn, colitis ulcerativa) , síndrome de insuficiencia respiratoria, síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS) , meningitis, rinitis alérgica, encefalitis, uveítis, colitis, glomerulonefritis , afecciones alérgicJs, eczema, asma, afecciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, ateroesclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (SLE) , lupus (incluyendo nefritis, no renal, discoide, alopecia), diabetes juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielit is alérgica, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de egener, agranulocitosis , vasculitis (incluyendo ANCA) , anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica inmunitaria incluyendo anemia hemolítica autoinmunitarria (AIHA) , anemia perniciosa, aplasia de células rojas puras (PRCA), deficiencia del Factor Vííjl, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopeñia, leucopenia, enfermedades que involucran diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del CNS, síndrome de lesión de múltiples órganos, miastenia grave, enfermedácjes mediadas por complejo de antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana de basamento anti -glomerular, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad de Bechét, síndrome de Castleman, Síndrome de Goodpasture, Síndrome Miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo de transplairnitte de órganos sólidos (incluyendo pre-tratamiento para tituladores de anticuerpos reactivos de alto panel, depósito de IgA en tejidos, etc.), enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , penfigoide buloso, pénfigo (todos incluyendo vulgar, foliáceo), poliendocrinopatías autoinmunitaria^ , enfermedad de Reiter, síndrome de hombre rígido, arteritis de célula gigante, nefritis de complejo inmunitario, nefropatlía de IgA, polineuropatías de Ig o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) , púrpura trobocitopénica trombótica (TTP) , trombocitoperiia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovarios incluyendo ooforitis y orquitis autoinmunitaria, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (Tiroiditis de Hashimoto) , tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de AddiSón, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular) , diabetes Tipo I (también referida cc>mo diabetes mellitus dependiente de insulina ( IDDM) ) , síndróme de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (HIV) , bronquiolitis obliterante (sin transplante) contra NSIP, Síndrome de Guillain-Barr , Vasculitis de Bazos Grandes (incluyendo Polimialgia Reumática y Arteritis de Célula Gigante (Takayasu' s) ) , Vasculitis |de Bazos Medianos (incluyendo Enfermedad de Kawasaki y Poliarteritis Nodosa) , espondilitis anquilosante, Enfermedad de Berger (nefropatía de IgA) , Glomerulonefritis Rápidamente Progresiva, cirrosis biliar primaria, esprúe celíáco (enteropatía por sensibilidad al gluten) , crioglobulinemia, ALS, enfermedad de arteria coronaria. | i Los cánceres positivos a CD20 que se pueden trat¡ar usando los anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la i presente incluyen aquellos que comprenden proliferacijón anormal de células que expresan CD20 en la superficie de |la célula. Los neoplasmas de célula B positivos a CD20 incluyen enfermedad de Hodgkin positiva a CD20, incluyendo enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD) ; linfoma no de Hodgkin (NHL) ; linfornas de célula central folicular (FCCj) leucemia linfocítica aguda (ALL) ; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; y leucemia de células capilares. Los linfornas i no de Hodgkins incluyen linfoma no de Hodgkins folicular de bajo grado (NHL) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , NHL folicular grado intermedio, NHL difuso grado intermedio, N-HL inmunoblástico grado alto, NHL linfoblástico grado alto, NHL de célula no escindida pequeña grado alto, NHL de enfermedad voluminosa, linfoma linfocítico plasmacitoide , linfoma de células del manto, linfoma relacionado con SIDA, j y macroglobulinemia de Waldenstrom. También se contemplan tratamientos de recaídas de estos cánceres.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden usar para tratar linfoma no de Hodgkin (NHL) , enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia linfocítica crónica, artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE) , enfermedad de egener, enfermedad inflamatoria del intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) , púrpura í trobocitopénica trombótica (TTP) , trombocitopénia autoinmunitaria, esclerosis múltiples, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia grave, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógréjn, y glomerulonefritis .

Los anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la presente son útiles como un tratamiento de agente únido, por ejemplo, para NHL de célula B positivo a CD20 recaído o refractario de bajo grado o folicular, o se pueden administrar a pacientes en conjunto con otros fármacos en ¡un régimen de múltiples fármacos. J Dependiendo de la indicación que se trata ! y factores relevantes para la dosificación con los que un médico de experiencia en el campo podría estar familiarizado, los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden administrar; a una dosificación que es eficaz para el tratamiento de esta indicación mientras se minimiza la toxicidad y efectos secundarios. Para el tratamiento de un cáncer positivo a CD20 o una enfermedad autoinmunitaria, la dosificación terapéuticamente efectiva puede estar en el intervalo de aproximadamente 100 mg/m2 a aproximadamente 600 mg/m2, aunque también se pueden usar dosis mayores o menores. En diferentes modalidades, la dosificación puede ser 100 mg/dosis, 125 mg/dosis , 150 mg/dosis , 175 mg/dosis , 200 mg/dosis , mg/dosis , 250 mg/dosis , 275 mg/dosis, 300 mg/dosis, 25 mg/dosis , 350 mg/dosis , 375 mg/dosis , 400 mg/dosis , mg/dosis , 450 mg/dosis , 475 mg/dosis , 500 mg/dosis , mg/dosis , 550 mg/dosis 575 mg/dosis , 600 mg/dosis . as cantidades, regímenes, e intervalos de dosificación tambijen se pueden usar.

En el tratamiento de la enfermedad, los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden administrar al paciente crónicamente o intermitentemente, como se determina por el médico de experiencia en la enfermedad.

En algunas modalidades, un paciente puede recibir una dosis de acondicionamiento inicial del anticuerpo seguido por una dosis terapéutica para aliviar o minimizar cualquiéra de los eventos adverso. Las dosis de acondicionamiento serán menores que la dosis terapéutica para acondicionar al paciente para tolerar dosificaciones mayores.

Los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden administrar usando cualquier vía de administración disponible, incluyendo por administración intravenosa (por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante ¡un período de tiempo), o por vías subcutáneas, intramusculares, intraperitoneales , intracerebroespinales, intra-articularejs , intrasinoviales , intratecales , o inhalación. ! En una modalidad, los anticuerpos anti-CD20 humanizados se administran por infusión intravenosa con 9% solución de cloruro de sodio como un vehículo de infusión En el tratamiento de los neoplasmas de células B descrito anteriormente, el paciente también se puede trat'ar con anticuerpos anti-CD20 humanizados descritos en la presente en conjunto con uno o mási agentes terapéuticos tal como un agente quimioterapéutico en un régimen de múltiples fármacos. Los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden administrar concurrentemente, consecutivamente, o alternados con el agente quimioterapéutico, o después de ninguna respuesta con otra terapia. La quimioterapia estándar para el tratamiento de linfoma puede incluir ciclofosfamida, citarrabina, melfalan y mitoxantrona más melfalan. En otra modalidad, el anticuerpo CD20 humanizado se puede usar Jen conjunto con CHOP, el cual es uno de los regímenes de quimioterapia más comunes para tratar linfoma No de Hodgkin. Los siguientes son los fármacos usados en el régimen CHQP: ciclofosfamida (nombres de marca citoxan, neosar ; adriamicina (doxorrubicina/hidroxidoxorrubicina) ; vincristina (Oncovin) ; y prednisolona (algunas veces llamadas Deltasona u Orasona) . En modalidades particulares, los anticuerpos anti-CD20 humanizados se administran a un paciente en necesidad del mismo en combinación con uno o más de los siguientes agentes quimioterapéuticos : doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, y prednisolona. En una modalidad específica, un paciente que sufre de un linfoma (tal como un linfoma no !de Hodgkin) se puede tratar con los anticuerpos anti-CE)20 descritos en la presente en conjunto con terapia de CPÍOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona) . ¡En otra modalidad, el paciente con cáncer se puede tratar con el anticuerpo anti-CD20 humanizado en combinación con quimioterapia de CVP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona) .

En el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias o afecciones relacionadas autoinmunitarias descritas anteriormente, el paciente se puede tratar con los anticuerpos anti-CD20 humanizados en conjunto con un segurido agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor (tal como en un régimen de múltiples fármacos) . El anticuerpo anti-CD20 humanizado se puede administrar concurrentemente, consecutivamente, o alternado con el agente inmunosupresor o en ninguna respuesta con otra terapia. | Los agentes inmunosupresores para el uso en la terapia adjunta incluyen cualquiera de las sustancias due actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario |de un paciente. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, sustancias que suprimen la producción de citocina, bajo regulan o suprimen la expresión de auto-antígeno, o enmascaran los antígenos de MHC . Los ejemplos de tales agentes incluyen esteroides tales como glucocorticoesteroides (por ejemplo, prednisona, met ilprednisolona, y dexametasona) ; pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas, azatiopriria ; bromocript ina ; glutaraldehído; anticuerpos anti-idiotípiCós para antígenos de MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A; í citocina o antagonistas del receptor de citocina incluyendo anticuerpos anti-interferón-?, -ß, -a; anticuerpos ariti-factor de necrosis de tumor-a; anticuerpos anti-factor ¡de necrosis de tumor-ß; anticuerpos anti-interleucina-2 anticuerpos anti -receptor de IL-2; anticuerpos anti-L3T;4; globulina anti -lifocitos ; anticuerpos pan-T; péptido soluble que contiene un dominio de enlace LFA-3; estreptocinasa ; TGF-ß; estreptodornasa; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de células T; fragmentos de receptor de células T; ? y anticuerpos de receptor de células T.

Para el tratamiento de artritis reumatoide, el paciente se puede tratar con un anticuerpo anti-Cl20 humanizado en conjunto con uno o más de los fármacjos siguientes: DMARDS (fármacos anti-reumáticos modificadores de la enfermedad (por ejemplo, metotrexato) ) , NSAI o NSÁID (fármacos anti - inflamatorios no esteroides) , HUMIRÁ (adalimumab; Abbot Laboratories) , ARAVA® (leflunomida) , REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., de Malvern, Pa.), ENBREL (etanercept, Immunex, Wash. ) , e inhibidores de COX-2. Formulaciones Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden preparar para almacenamiento o uso mezclando un anticuerpo que tiene un grado de pureza deseado con portadores, excipientes, o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales en la forma de fomulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables son no i tóxicos para los receptores a las dosificaciones 1 y concentraciones empleadas, e incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencentonio; fenojl, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol ; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinajs ; polímeros hidrofílieos tal como olivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagin , histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinate; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales cojmo TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .

Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo como sea necesario pára la indicación particular que se trata. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, citocina, o agentes inmunosupresor . La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. ' Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, i liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , náno-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones .

También se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida que comprenden los anticuerpos anti-CD20 humanizados. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi -permeables ¡de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen los antagonistas, las matrices están en la forma de artículos t conformados; por ejemplo, películas, o microcápsulas . Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroximetil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilactidos , copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamáto de etilo, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros. de ácido láctico-ácido glicólico degradables, y ácido poli-I)-(-) -3-hidroxibutírico.

Anticuerpos conjugados y otros métodos Los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden conjugar con uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico.

Los anticuerpos humanizados descritos en ¡la i presente se pueden usar en métodos terapéuticos y de diagnóstico. Por consiguiente, los anticuerpos humanizados se pueden administrar solos como un anticuerpo desnudo , o administrar como una terapia multimodal, temporalmente de acuerdo con un régimen de dosificación, pero no necesariamente conjugados con un agente terapéutico. En una modalidad, la eficacia de los anticuerpos quiméricos ¡ y humanizados desnudos se puede mejorar suplementando los anticuerpos * desnudos con uno o más otros anticuerpos desnudos, es decir, anticuerpos monoclonales a antígen s específicos, tales como CD4, CD5, CD8, CD14 , CD15, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD4!6, CD52, CD54, CD74 , CD80, CD126, B7 , MUC1, la, HM1.24, o HL|A-DR, tenascina, VEGF, PIGF, un oncogen, un producto de oncogen, o una combinación de los mismos con uno o más inmunoco jugados de anti-CD20, o anticuerpos para estos antígenos. citados, conjugados con agentes terapéuticos, incluyendo fármacos, toxinas, inmunomoduladores , hormonas, radionúclidos terapéuticos, etc. con uno o más agentes terapéuticos, incluyendo fármacos, oligonucleótidos , toxinajs, inmunomoduladores , hormonas, radionúclidos terapéuticcjs , etc., administrados concurrentemente o consecutivamente o de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito, con los anticuerpos humanizados.

Los inmunoconjugados se pueden administrar para usos de diagnóstico y terapéutico en linfomas de células B, enfermedades autoinmunitarias , rechazos de transplante, y otra enfermedad o trastornos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CD20 humanizados se pueden conjugar con un agente citotóxico tal como una toxina o un isótopo radioactivo. En algunas modalidades, la toxina es caliqueamicina, un maytansinoide , una dolastatirla , auristatina E y análogos o derivados de los mismos.

Una amplia variedad de agentes de diagnóstico ( y terapéuticos se pueden conjugar a los anticuerpos anti-CD20 humanizados. Tales agentes terapéuticos también se pueden usar para administración separadamente con el anticuerpo desnudo como se describió anteriormente. Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos tales como vinca alcaloides, antraciclinas , epidofilotoxina, taxanos, antimetabolitos , agentes alquilantes, agentes anticinasa, antibióticos, inhibidores de Cox-2, antimitóticos , agentes antiangiogénicos y apoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexatio, taxol, CPT-11, camptotecans , y otros de estas y otras clames de agentes anticáncer, y similares. Otros fármacos quimioterapéuticos contra cáncer útiles para la preparación de inmunoconjugados y proteínas de fusión de anticuerpo incluyen mostazas de nitrógeno, alquil sulfonatos, i nitrosoureas , triazenos, análogos de ácido fólido, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos jde purina, complejos de coordinación de platino, hormonas, ; y similares.

Las toxinas adicionales para uso en conjugación don los anticuerpos humanizados incluyen cualquiera de las toxinas farmacéuticamente aceptables, e incluyen, pero no se limitan a agentes que dañan el ADN, inhibidores de polimerización o despolimerización de microtúbulos j y antimetabolitos . Las clases de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, los inhibidores de enzima tales como inhibidores de dihidrofolato reductasa, e inhibidores de timidiláto sintasa, intercaladores de ADN, cortadores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, la familia de fármacos antraciclina , los fármacos vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de fármacos pteridina, diinenos, las podofilotoxinas e inductores de diferenciación.

Los anticuerpos anti-CD20 humanizados también |se pueden conjugar con un isótopo radioactivo. Por ejemplo, para la destrucción selectiva de un tumor, el anticuerpo pue'de comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-CD20 radioconjugados . Cuando el conjugado se usa para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, o una etiqueta de spin para formación de imagen de resonancia magnética nuclear (NMR) .

Las etiquetas se pueden incorporar en el conjugado usando cualquier método. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar por síntesis química de aminoácido usando precursores de aminoácido adecuados qjue involucran, por ejemplo, fluoro-19 en lugar de hidrógeno.

Un oligonucleótido , tal como una molécula antisentido, también se puede conjugar a o se administra con los anticuerpos anti-CD20 humanizados.

Los siguientes ejemplos son ofrecidos por vía ele ilustración y no por vía de limitación.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de Anticuerpos 1F5 Humanizados Se prepararon vectores de expresión quimérieps usando las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo de ratón 1F5 (Press et al. Blood, 69 (2) : 584-591 (1987) ) . El número de acceso de Genbank AY058906 proporciona la secuencia de 1F5 VK, la cadena ligera de anticuerpo de ratón 1F5. Este VK usa el gen V de línea germinal AJ231219 para cuya secuencia de ADN es 98% idéntica. El número de acceso de GenBank AY058907 es la secuencia de 1F5 VH, la i cadena pesada del anticuerpo de ratón 1F5. Este VH usa el gpn V de línea germinal AC090843 para cuya secuencia de AD es 95% idéntica.

La construcción de los vectores de expresión quiméricos incluyó agregar una secuencia guía adecuada paira el VH y VK de ratón, precedida por un sitio de restricción HindIII y una secuencia Kozak. La secuencia Kozak asegura la traducción eficiente de la secuencia de región variabljs. Define el codón AUG correcto del cual un ribosoma puede comenzar la traducción. Una base importante en la secuencia Kozak es la adenina en la posición -3, en dirección 5' del inicio de AUG. Se predijo que la secuencia guía 1210 VK humana se corta correctamente por la proteasa señal cuando está contigua con 1F5 VK. Se predijo que la secuencia guía 1210 VH humana se corta correctamente por la proteasa señal cuando está contigua con 1F5 VH. Las secuencias guías 1210 apropiadas por lo tanto fueron clonadas en dirección 5' de las regiones codificantes 1F5 VH y VK.

La construcción de los vectores de expresión quiméricos también incluyó introducir un fragmento 5' de la región constante ?? humana, hasta un sitio de restricción Apal natural, contigua con el extremo 3' de la región J de 1F5. La región constante ?? humana se codifica en el vector de expresión, en dirección 3 ' de la secuencia VH insertada pero, diferente del constructo kappa, carece de un intrón V-C. Para la cadena kappa, el sitio donador de empalme natural y un sitio BamHI se agrega en dirección 3 ' de la región V. Jl_a t secuencia donadora de empalme facilita el empalme del intrón V-C kappa, el cual es útil para la unión en armazón de VKj a la región constante kappa.

Los genes 1F5 VH y VK de ratón se analizaron para identificar cualquiera de los sitios de restricción extra los cuales pueden interferir con la subclonación . Un sitio de restricción se encontró en la secuencia de 1F5VK pre-optimizada (Figura 17) pero ninguno se identificó en la secuencia de 1F5VH (Figura 19) . Estas secuencias de ADN se optimizaron para la expresión, removiendo los cuadros internos TATA, sitios chi y sitios de entrada ribosomal, estiramientos de secuencia ricos en AT o ricos en GC; elementos de secuencia ARE, INS, CRS; secuencias de repetición y estructuras secundarias de ARN; sitios de donador y aceptor de empalme (críptico) , puntos de ramificación; adaptando el uso de codón a la desviación de codón de Cricetulus griseus/homo sapiens; e incrementando el contenido de GC para mejorar la estabilidad del AR m. Las secuencias de constructo de ADN optimizadas clF5VK (Figura 18) y clF5VH (Figura 20) se sintetizaron y clonaron en el vector de clonación pGA4 (Geneart AG, Regensburg, Alemania) . Los insertos VK y VH fueron extirpados con (BamHI + Hindlll) o (Hindlll + Apal) respectivamente. Los fragmentos extirpados luego fueron purificados en gel, ligados en pKNlOO o pGlD200, respectivamente, los cuales se han cortado de manera similar, y digerido en fosfatasa. Los constructos ligados se transformaron en bacterias TOP10 competentes. Las colonias de clon de expresión fueron seleccionadas por PCR para la presencia de un inserto del tamaño correcto usando cebadores gl0545 (5' -TGTTCCTTTCCATGGGTCTT) (SEC ID NO: 75) y g23070 (5' -GTGTGCACGCCGCTGGTC) (SEC ID NO: 76). Se generarjon minipreparaciones de los clones de expresión correctos usados para transformar células HEK293T.

La Figura 22 muestra la secuencia de aminoácido |de la cadena pesada del anticuerpo 1F5 quimérico maduro con región constante subrayada. La Figura 23 muestra la secuencia de aminoácido de la cadena ligera del anticuerpo 1F5 quimérico maduro con región constante subrayada.

Las secuencias de cadena pesada y ligera quiméricas del anticuerpo monoclonal murino 1F5 luego se humanizaron identificando las secuencias FR humanas apropiadas de comparaciones de secuencias a inmunoglobulinas humanas y de ratón. Las secuencias de proteína de inmunoglobulinas humanas y de ratón de la Base de Datos Internacional de Inmunogenética 2006 (Lefranc, M.P., Nucí. Acids Res., 31:307-310(2003)) y la Base de Datos de Kabat (Kabat, E.A., et al . ( NIH National Technical Information Service, 1-3242(1991)) Liberación 5 de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (última actualización 17 de Noviembre de 1999) se utilizaron para compilar una base de datos de secuencias de proteína de inmunoglobulina en la alineación Kabat. La base de datos contuvo secuencias 9322 VH humanas y 2689 VK humanas. Se utilizó un programa de análisis de secuencia, Gibbs, para preguntar a las bases de datos VH y VK humanos con secuencias de proteína 1F5 VH y VK.

Generación de 1F5RHA y 1F5RHB Para generar una secuencia VH humanizada, se identificaron secuencias VH humanas en la base de datos que tienen la identidad más alta a 1F5VH en residuos Vernier, Canónicos e l!nterfaz VH-VK (VCI) , ubicados dentro del armazón de región V. De las secuencias VH identificadas, el número ¡de acceso U00570 se eligió como el donador FR humano p¿ra 1F5RHA. El gen V de línea germinal humana más idéntico U00570 es el gen de familia VHI X62109 (VI-3B) , del cual ¡se extrajo el péptido señal. El algoritmo SignalP predijo que podría cortarse apropiadamente con la peptidasa señal . ¡La Figura 1A muestra las secuencias usadas en la generación de la secuencia de ADN lF5RHAss de las secuencias de ADN naturales de la señal X62109, CDRs 1F5VH y U00570 FR. Las CDRs 1, 2 y 3 de 1F5VH se injertaron en la FR aceptora ,de U00570 para generar 1F5RHA (Figura IB) . La secuencia de ADN se optimizó por mutagénesis silenciosa (GeneArt) para remover los cuadros internos TATA, sitios chi y sitios de entráda ribosomal, estiramientos de secuencia ricos en AT o ricos en GC; elementos de secuencia ARE, INS, CRS, secuencias de repetición y estructuras secundarias de AR ; sitios de donador y aceptor de empalme (críptico) y puntos de ramificación. El ADN de constructo 1F5RHA optimizado y secuencia de proteína se muestran en la Figura 2. Es^te constructo no contiene mutaciones en la región de armazón.

Un segundo constructo, 1F5RHB (Figura 3) , se balso en la secuencia de 1F5RHA, para contener 4 retro-mutaciones en los residuos vernier no conservados como sigue: V67Á; V69L; R71A y T73K (numeración Kabat) (Figura 10A) Generación de 1F5RKA11 y 1F5RKA12 Se generaron secuencias de VK humanizadas con base en las comparaciones de secuencia a las secuencias de VK humanas con la identidad más alta a 1F5VK en residuos VCi'l , ubicados dentro del armazón de región V. De las comparaciones de secuencia, no hay genes VK humanos identificados con la misma longitud de CDR1 como 1F5VK (10 aminoácidos) . Luego se analizaron dos grupos de FRs humanas con las longitudes de CDR1 más cercanas (11 y 12 aminoácidos) que tienen longitudes idénticas de CDR 2 y 3 como 1F5VK.

Para las 11 secuencias de CDR1 de aminoácidos, 'el número de acceso AB064140 se eligió como el donador de F en el cual basar 1F5RKA11. La Figura 4A muestra la generación de 1F5RKA11SS de las secuencias de ADN naturales de 1F5 VK, la secuencia de VK humana AB064140 y la secuencia señal Z00013 humana. Esta secuencia también se optimizó para generar el constructo 1F5RKA11 (Figura 5) , el cual no contiene mutaciones de FR. La Figura 4B proporciona las secuencias de aminoácido de la FR y CDRs usadas para generar 1F5RKA11.

Las CDRs 1, 2 y 3 de 1F5VK se injertaron en la FR aceptora de AB064140 humana para generar 1F5RKA11. El gen V de línea germinal más cercano a AB064140 es Z00013 (Vd/L8) , del cual se obtuvo el péptido señal. El algoritmo SignalP predijo el corte apropiado de este péptido señal.

Un segundo constructo, 1F5RKB11 (Figura 6) , ¡se generó de 1F5RKA11 introduciendo cuatro retromutaciones jen los tres residuos vernier no conservados: L46P; L47W y F7jlY (numeración Kabat) ; junto con el residuo de interfaz VH/VK Y87F (numeración Kabat) (Figura 10B) . Versiones adicionales: 1F5RKB11; 1F5RKD11; 1F5RKE11 y 1F5RKF11 se basaron en 1F5RKB11, cada uno contiene una diferente inversión de una e estas 4 mutaciones (Figura 10B) .

Un segundo conjunto de secuencias de VK humanizadas también se preparó con base en una secuencia kappa humana con secuencias CDR1 que contienen 12 aminoácidos. El número de acceso AY263415 se seleccionó como el donador FR en el cual basar a 1F5RKA12. ¡ La Figura 7A muestra las secuencias de ácido nucleico usadas para generar lF5RKA12ss de la secuencia de ADN natural de 1F5 VK, la secuencia de VK humana AY263415 y la secuencia señal humana X12686. Las CDRs 1, 2 y 3 de 1F5VK se injertaron en la FR aceptora de AY263415 humana para generar 1F5RKA12 (Figura 7B) . El gen V de línea germinal más i cercano al AY263415 de acceso es el miembro de la familia VKIII, X12686 (A27), del cual se obtuvo el péptido señal. El algoritmo SiganlP predijo el corte apropiado de este péptido señal. El ADN de constructo 1F5RKA12 optimizado y secuencia de proteína se muestran en la Figura 8. Este constructo no contiene mutaciones de FR. Un segundo constructo 1F5RKB12 (Figura 9) se generó de 1F5RKA12 introduciendo tres retro mutaciones en los tres residuos vernier no conservados: L46P; L47W y F71Y (numeración Kabat) . Versiones adicionales: 1F5RKC12; 1ERKD12 y 1F5RKE12 se basaron en 1F5RKB12, cada uno contiene una diferente inversión de una de estas ' 3 mutaciones .

Se prepararon vectores de expresión que incluyeron, para las cadenas pesadas, una región constante ?? humana unida a la región variable, y para las cadenas ligeras, úna región constante kappa unida a la región variable. i Las Figuras 11A-11E proporcionan las secuencias de aminoácido de las regiones variable y constante maduras de proteínas 1F5RKG11, 1F5RKB11, 1F5RKF12, 1F5RKB12 , y 1F5RHA, respectivamente. Las Figuras 22 y 23 proporcionan ljas secuencias de aminoácido para una secuencia de protelna quimérica de regiones variable y constante maduras pajra clF5VH y clF5VK, respectivamente. Las regiones constantes 'de las secuencias de aminoácido son subrayadas.

Las preparaciones de plásmido de expresión que codifican cadenas pesadas y ligeras (humanizadas j o quiméricas) se usaron para transfectar células HEK293t. Para la transfección, las células inicialmente crecieron en D EM más GlutaMax suplementado con 10% FCS , penicilina, y estreptomicina en un matraz y se incubaron en una cámara de cultivo celular gasificada con C02. Los cultivos celulares se dividieron 1:3 para cada dos días o 1:4 o 1:5 cada 3-4 días. Se utilizó tripsinizacion por luz para separar las células de los matraces durante el paso. Un día antes de la transfección, se prepararon placas de 6 cavidades agregando 2 mi de medio de cultivo a cada cavidad, seguido por la adición de células (2xl05 células/cavidad) . Las células se verificaron al siguiente día para asegurar al menos 80% Jde confluencia y el medio se reemplazó con 2 ml/cavidad. Para la transfección, se tomaron alícuotas de 96 µ? de OPtiPRO SFM jen un tubo de 1.5 mi estéril y 6 µ? de Fugeno 6 se adicionaron directamente al medio, y se incubaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Se agregó ADN (1 µg total; vector de 0.5 ug de cadena pesada y 0.5 de cadena ligera) y se incubó i a temperatura ambiente por 15 minutos. Una mezcla del Fugeno A, ADN, y OptiPro SFM se agregó, por goteo, alrededor de la cavidad, y las placas luego se incubaron por 4 días en un incubador de cultivo celular. El medio acondicionado se recolectó después de 4 días, la IgG se cuantificó, y se realizaron ensayos de enlace de antígeno.

Se midió IgG en este medio acondicionado por ELISA para medir el enlace de células Raj i (Ejemplo 2) . Las concentraciones del anticuerpo lgGlK en todos los medios acondicionados con células 293 transfectadas usados jse muestran en la Tabla 1. Los anticuerpos humanizados , y quiméricos se expresaron a niveles buenos a excelentes, y se utilizaron para los Ejemplos 2-4 adicionales posteriores.

Tabla 1 Constructos usados para IgG transfeccion de 293 VH VK ng/ml quimérico quimérico 3685 5580 quimérico quimérico 4335 5084 quimérico quimérico 8714 8479 quimérico B11 847 1576 quimérico KC11 4603 6381 quimérico KD11 2352 4940 quimérico KE11 1537 1543 quimérico KF11 1730 1730 quimérico KB12 813 1062 quimérico KC12 1861 1498 quimérico KD12 2772 2684 quimérico KE12 2964 2964 RHA quimérico 3222 4215 RHB quimérico 4876 3306 RHA quimérico 6291 6895 RHA RKB12 1960 2146 RHA RKC12 447 494 RHA RKD12 4789 4651 RHA RKE12 2517 2375 RHA RKF12 3773 3394 RHA RKB11 6258 2267 RHA RKC11 6258 6609 RHA RKD11 8600 8366 RHA RKE11 9182 7957 RHA RKF11 8517 5529 RHA RKG11 8516 8184 Ejemplo 2: Enlace Raji por Anticuerpos 1F5 Humanizados Los ensayos fueron realizados para medir el enlace de los anticuerpos 1F5 quiméricos y humanizados a células Raji (una línea de células B humana que expresa CD20) . Las células Raji (80 µ?; 1-2?106 células/ml en 24 mi con medio de crecimiento fresco diluido con 0.11 vol de lOx PBS (MPBS) y 8 mi de 8% paraformaldehído (en PBS) ) se agregaron a placa revestida con poli-D-lisina de 96 cavidades y se centrifugó! a 2500 rpm (Beckman 6L) a 25°C por 60 minutos. Las pelotillas se lavaron 4 veces con 400 µ? de PBS, Tween 20 (0.02% v/v) . 50 µ? de MPBS se agregaron a cada cavidad después del lavado final, y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente, y el amortiguador de bloqueo luego se desechó. Las diluciones ^n amortiguador de PBS. Kappa anti-humana de cabra (Sigma A7164) se preparó diluyendo la solución madre de anticuerpo 1:2000 en MPBS, se agregó a las cavidades lavadas, y se incubó de nuevo a temperatura ambiente por 1 hora. Las placas de nuevo se lavaron 6 veces en 400 µ? de amortiguador PBS. 100 µ? jde solución K-blue TMB se agregaron a cada cavidad. Las reacciones se detuvieron al agregar 50 µ? de red stop después de 30 minutos, y la absorbancia se leyó a 650 nm.

Como se ilustra en la Figura 12, el enlace a células Raj i de los anticuerpos codificados por clF5;VH quimérico, en asociación con VKs humanizados: 1F5RKA11, 1F5RKA12; 1F5RKC11 o 1F5RKC12 se redujo en comparación con aquel del anticuerpo clF5 quimérico (Figuras 12A, 12C, 12D) . En contraste, el enlace de células Raj i por anticuerpos codificados por C1F5VK quimérico en combinación ya sea con 1F5RHA o 1F5RHB fue indistinguible, y similar a aquel de Rituxan (Figura 12B) . Otras versiones de VK: 1F5RKB11; 1F5RKD11; 1F5RKE11; 1F5RKF11 (Figura 12D) ; 1F5RKB12; 1F5RKD12; 1F5RKE12 (Figura 12C) , en combinación con clFSVH quimérico, se unieron a células Raj i de manera similar a, o mejor que, el anticuerpo quimérico.

A la luz de la baja potencia de enlace de las versiones 1F5RKC11 y 1F5RKC12, en las cuales la retromutación i L46P vernier (numeración Kabat) fue invertida, 1F5RKG11 y 1F5RKF12 fueron designados (Figura 10B y 10C, respectivamente) con base en 1F5RKA11 o 1F5RKA12, respectivamente, con la única introducción de la retromutacion L46P (numeración Kabat) .

Ensayos adicionales (Figuras 13A-15) investigaron anticuerpos completamente humanizados codificador por 1F5R|HA junto con varias cadenas kappa humanizadas. Las Figuras 13¡A-13B muestran que el enlace de células Raj i por anticuerpos completamente humanizados codificados por 1F5RHA, en asociación con todos los constructos de cadena kappa excepto las versiones 1F5RKC, es similar a aquel del anticuerpo quimérico. El enlace de células Raji por anticuerpos codificados por los constructos kappa 1F5RKC12 y 1F5RKC11 (no mostrado) de nuevo fue pobre. La Figura 14 confirma que la potencia de enlace de células Raji del anticuerpo codificado por 1F5RHA en asociación con 1F5RKF12 parece ser ligeramente superior a aquel del anticuerpo codificado por 1F5RKG11, y que sus potencias son similares a aquellas del anticuerpo quimérico.

Ejemplo 3: Ensayo de Enlace FACS El enlace de células Raji por los anticuerpos 1F5 humanizados también se analizó con un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson, San José CA) . Procedimientos FACS estándares (clasificación de células activada or fluorescencia) se utilizaron para el análisis. Para la medición del enlace de células, residuos y grupos de células se regularon con base en la dispersión frontal contra lateral. Las células muertas se excluyeron del análisis ("regulación") con base en la captación de PI . 5,000 a 10,000 células viables se analizaron por muestra y la media geométrica de la distribución de fluorescencia (intensidad de fluorescencia media, o MFI) se determinó usando software de instrumento (CellQuest, Becton-Dicknson) . Los valores de MFI se reportan para todos los estudios. Se realizaron dos estudios para cada uno de los anticuerpos humanizados HA x RKF12; RHA x RKB11; y RHA x RKG11. Los resultados del ensayo de enlace FACS se proporcionan en la Figura 16. Comó se muestra en la figura, todos los anticuerpos humanizados que se probaron (RHA x RKF12; RHA x RKB11 ; y RHA x RKGl ) tuvieron afinidad de enlace mayor que el 1F5 quimérico.

Ejemplo 4: Termo-estabilidad Para investigar si los dos anticuerpos (1F5RKG11 x 1F5RHA y 1F5RKF12 x 1F5RHA) fueron de estabilidad estructural similar, diluciones de 1 µg/ml de cada anticuerpo en medio de cultivo, amortiguado por PBS, se calentaron por 10 minutos a siete temperaturas entre 50 y 80°C (55°, 60°, 65°, 70°, 75°, y 80°C) . Después del enfriamiento rápido a 4°C, el análisis de enlace Raj i se realizó como se describió anteriormente.

Los resultados del ensayo de enlace Raji (Figura 15) I indicaron que el anticuerpo 1F5RKG11 x 1F5RHA retuvo ¡la potencia de enlace a una temperatura mayor que como lo hizo el anticuerpo 1F5RKF12 x 1F5RHA. A 75°C el anticuerpo 1F5RKG11 retuvo una mayor potencia residual que Rituxan, el cual se inactivo por 10 minutos a esta temperatura.

Ejemplo 5: Actividad ADC, Velocidad de Disociación, agotamiento de células B de anticuerpos 1F5 humanizados Cuatro de los anticuerpos 1F5 humanizados descritos anteriormente (RHA x RKB11 (Variante D) ; RHA x RKQ11 (Variante E) ; RHA x RKB12 (Variante F) ; y RHA x RKF12 (Variante G) ) así como también el anticuerpo quimérico clF5 se produjeron en plantas Lemna transgénicas que proporcionan principalmente glicosilación GO . El análisis de los anticuerpos quiméricos y humanizados (por ejemplo, por análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI -TOF MS) ) confirmó que los anticuerpos tuvieron predominantemente glicosilación GO (datos no mostrados) . I El propósito del presente ejemplo fue evaluar diversos aspectos de la actividad in vitro de estos anticuerpos, incluyendo la actividad citotóxica dependiente de complemento (CDC) usando células Raj i como objetivos, disociación del enlace ("velocidad de disociación") de células B, y actividad de agotamiento de células B in vitro en sangre entera. Los valores para rituximab (RTX) también se midieron y compararon con los valores determinados para los anticuerpos 1F5 humanizados y quiméricos.

Actividad de CDC La citotoxicidad dependiente de complemento (CÉC) de anticuerpos variantes se midió en células Raj i de Linfoma de Burkitt (Número de Acceso ATCC CCL-86) usando citometría de flujo para enumerar las células muertas. Brevemente, las células se trataron con concentraciones variadas de diferentes anticuerpos en 90 microlitos de PBS seguido por la adición de 10 microlitros de suero humano normal para dar u:a concentración final de 10% suero. Las células se incubaron por 30 minutos a 37°C y luego se colocaron en hielo, ge agregó PBS frío (4°C) que contiene yoduro de propidio (PI) a las células y la frecuencia de células positivas de PI pe determinó por FACS .

La Figura 24 muestra los resultados del ensayo de CDC de varias concentraciones de los anticuerpos probados Como se muestra en la Figura, los anticuerpos 1F5 humanizados glicosilados con G0 tuvieron mucha menor citotoxicidad dependiente de complemento que rituximab, con la CDC del anticuerpo E siendo aproximadamente 10 veces menor que rituximab .

En términos de EC50, los anticuerpos se clasificaron como sigue: RTX < Variante G < Variante F < Variante D < quimérico < Variante E (Tabla 2) .

Tabla 2 Variante Variante Variante Variante Variante RTX quimérico D E F G LogEC50 -1.726 -0.7810 -1.063 -0.773 -1.133 -1.146 EC50 0.01879 0.1656 0.08642 0.1685 0.07368 0.07138 Velocidades de Disociación de Anticuerpo de Células La velocidad a la cual los anticuerpos fluorescentemente etiquetados se disocian de células Raj i se comparó con RTX durante un período de tiempo de 4 horas. El formato de ensayo usado siguió aquel descrito en Golderiberg D.M et al. (2009, Blood, Vol 113(5) :1062) y se resume brevemente posteriormente .

Todos los anticuerpos se conjugaron a un fluoróforo I tipo fluoresceína, DyLight 488, de acuerdo con las instrucciones del vendedor (Pierce Cat . No. 53025). Después j de la conjugación, el anticuerpo etiquetado se separó del tinte libre usando columnas de cromatografía proporcionadas en el kit de etiquetado. La concentración de proteína después del etiquetado se midió espectrofotométricamente y las concentración se encontró que variaron entre 0.93 y 1.1 mg/ml . Los anticuerpos etiquetados purificados se almacenaron a 4°C en PBS protegidos de la luz.

Para medir la disociación del anticuerpo de las células, 106 células Raj i se suspendieron en PBS que contiene 1% albúmina de suero bovino (PBS/BSA) . El anticuerpo etiquetado se agregó a una concentración final de 5 ug/ml jen un volumen de 1.0 mi. Después de una incubación de 30 minutos a 37°C, el anticuerpo no etiquetado ("frío") se agregó a üna concentración final de 1000 ug/ml. Las células etiquetadas mezcladas con anticuerpo frío se regresaron a 37°C por 4 horas. A intervalos de 20 minutos, alícuotas de 100 ul de células se retiraron de cada muestra, se agregaron 400 uL de PBS/BSA frío que contiene yoduro de propidio y la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la población de células excluyendo las células muertas (PI+) se determinó por FAlS. Se presume con este protocolo que el etiquetado no incluye en la afinidad del anticuerpo.

Se observó que los anticuerpos 1F5 humanizados tuvieron velocidades de disociación significativaméhte reducidas con relación a rituximab (Figura 25) . Como se muestra en la Figura 25, está claro que los anticuerpos 1;F5 humanizados mostraron aproximadamente un incremento de 2-3 veces de vida media con relación a rituximab.

Los resultados de los estudios de velocidad de disociación se resumen en la Tabla 3. Aunque las Variantes D y F del anticuerpo mostraron alguna variación de vida media en los dos estudios, en general las vidas medias fueron similares. Todos los anticuerpos 1F5 humanizados tuvieron velocidades de disociación significativamente reducidas en comparación con rituximab (es decir, los anticuerpos 1F5 humanizados se unieron -2-3 veces más tiempo que rituximab) .

Tabla 3. Valores de vida media para anticuerpos anti-CD20: La Figura 26 muestra una gráfica de barras de vidas medias obtenidas de los anticuerpos anti-CD20 en el Estudio 1.

Agotamiento de Células B en Sangre Entera Se evaluó la actividad de agotamiento de célul B de los anticuerpos 1F5 humanizados. Brevemente, os anticuerpos de prueba se agregaron a 100 ul de sangre entera fresca a concentraciones específicas y se incubaron por horas a 37°C. La frecuencia de células B se determinó usando CD19, un anticuerpo específico de células B que enlájza células independientemente de la expresión del receptor de CD20. Se realizaron dos estudios, uno en el cual CD16 no fue bloqueado con un anticuerpo anti-CD16 antes de la exposición al anticuerpo de prueba y uno en el cual CD16 fue pre bloqueado.

En el primer conjunto de experimentos sin ántji-CD16, la citotoxicidad de los anticuerpos 1F5 humanizados |se observó que es mayor que aquella de rituximab (Figura 27) i. |Es decir, los anticuerpos 1F5 humanizados agotan las células B más efectivamente que rituximab. La Figura 27 muestra los resultados del primer conjunto de experimentos para el 1F5 quiméricos, variantes D-G, rituximab, y un control de isotipo (es decir, una IgGl de control, anticuerpo GO sin propiedades de enlace de antígeno de células B) .

En el segundo conjunto de experimentos, el receptar de CD16 en células efectoras se pre-bloqueó con anticuerjpo anti-CD16. Cuando las variantes E y G del anticuerpo humanizado luego se probaron en el ensayo de agotamiento de células B, se mostró que la actividad de agotamiento de células B de los anticuerpos anti-CD20 fue inhibida bloqueando CD16 en las células efectoras con un anticuerpo anti-CD16 (Figura 28) . El efecto de anti-CD16 fue reducir la actividad de agotamiento de células B casi completamente, implicando ADCC como el modo de acción principal para los anticuerpos 1F5 humanizados. El anticuerpo anti-CD16 inhibió el agotamiento de células B para las variantes E y G jde manera similar a rituximab.

Conclusión I. Los anticuerpos 1F5 humanizados tienen mücjho menor actividad de CDC que rituximab.

II. La velocidad a la cual todos los anticuerdos 1F5 humanizados se disocian de las células (es decir, la velocidad de disociación) fue reducida significativamente con relación a la velocidad de disociación de rituximab.

III. Todos los anticuerpos 1F5 humanizados fueron más eficientes que rituximab en el agotamiento de células B de sangre entera .

IV. Para las dos variantes de anticuerpo 1F5 humanizado probadas, el agotamiento de células B en sangre entera fue casi completamente inhibido por el tratamiento con un anticuerpo de bloqueo de CD16.

Mientras que la invención se ha descrito en detalle y con referencia a las modalidades específicas de la misma, será evidente para un experto en el arte que se pueden hacer I varios cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu} y alcance de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar la práctica 'la citada invención, es el que resulta claro la presente descripción de la invención.

Claims (51)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: |

1. Un anticuerpo humanizado, caracterizado porque comprende : (a) una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (1) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lié Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser C^ly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr †yr Xaa86 Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys (SEC ID NO: 1) en donde Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; Xaa70 es Tyr o Phe; y Xaa86 es Tyr o Phe; y I (2) Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr ijeu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Sjer Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Éjhe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEC [ID NO: 2) en donde Xaa45 es Pro o Leu; Xaa46 es Trp o Leu; y Xaa70 es Tyr o Phe; y (b) una cadena pesada que comprende una régión variable de cadena pesada que comprende la siguiérjte secuencia de aminoácido: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Gys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Árg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa70 Thr Xaa72 Asp Xaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr E>he Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEC ID NO: 3) en donde ; en donde el anticuerpo humanizado enlaza a CD20 humano.

2. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC |ID NO : 13.

3. El anticuerpo humanizado de conformidad con ¡la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 54.

4. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 49.

5. El anticuerpo humanizado de conformidad con la 1 87 reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 59. ;

6. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 55.

7. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ¡ID NO: 13 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 49, 54, 55, y 59.

8. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 13 y 48.1

9. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable ¡de j cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 28, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 42, 55, 56, 57, 58 y 59.

10. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácijdo seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 28, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 42, 55, 56, 57, 58 y 59.

11. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a i CD20 humano con una afinidad similar a aquella del anticuerpo quimérico clF5.

12. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza! a CD20 humano con una afinidad mayor que aquella del anticuerpo quimérico clF5

13. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una velocidad de disociación menor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

14. El anticuerpo humanizado de conformidad con !la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena ligera adicionalmente comprende una región constante de cadena ligera humana.

15. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 60 , 61 , 62 , y 63.

16. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena pesada adicionalmente comprende una región constante de cadena pesada humana .

17. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64.

18. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cadena pesajda adicionalmente comprende una región constante de cadena pesada humana .

19. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64 y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID N0¡S 60, 61, 62, y 63.

20. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64 y ila cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 60.

21. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID i NO: 61.

22. El anticuerpo humanizado de conformidad con 'la reivindicación 19, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SÉC -ID NO: 62.

23. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 64 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ¡ID NO: 63.

24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 7 y un excipiente farmacéuticamente i aceptable . !

26. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se produce en una célula huésped seleccionada del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula de levadura, y una célula de planta.

27. Un anticuerpo humanizado, caracterizado porgue I comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la siguiente secuencia de aminoácido : Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa45 Xaa46 He Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gjly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Xaa86 Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys (SEC ID NO: 1) en donde Xaa5 es Pro o Leu; Xaa es Trp o Leu; Xaa70 es Tyr o Phe, Xaa86 es Tyr o Phe; en donde el anticuerpo humanizado enlaza a CD-20 humano.

28. El anticuerpo humanizado de conformidad con ¡la reivindicación 27, caracterizado porque la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: í 54.

29. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 49.

30. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 28, 49, 50, 51, 52, 53, y 54.

31. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una afinidad similar a aquella del anticuerpo quimérico clF5.

32. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una afinidad mayor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

33. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una velocidad de disociación menor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

34. Un anticuerpo humanizado, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la siguiente secuencia de aminoácido : Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser íjéu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa45 Xaa46 lie Tyr Ala Thr Ser Ajsn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa70 Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys (SEC ID NO: 2) en donde Xaa45 es Pro o Leu; aa es Trp o Leu; y Xaa70 es Tyr o Phe; en donde el anticuerpo humanizado enlaza a CD-20 humano.

35. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ¡ID NO: 59.

36. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC !lD NO: 55.

37. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS: 42, 5|5 , 56, 57, 58 y 59. ,

38. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una afinidad similar a aquella del anticuerpo quimérico clF5.

39. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una afinidad mayor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

40. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una velocidad de disociación menor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

41. Un anticuerpo humanizado, caracterizado porque I comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe ¿ys Gly Arg Xaa68 Thr Xaa7o Thr Xaa72 Asp Xaa74 Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEC ID NO: 3) i en donde Xaa70 es Val o Leu; Xaa72 es Arg o Ala; y Xaa74 es Thr o Lys ; en donde el anticuerpo humanizado es capaz de enlazar a CP-20 humano .

42. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una afinidad similar a aquella del anticuerpo quimérico clF5.

43. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD20 humano con una afinidad mayor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

44. El anticuerpo humanizado de conformidad con la I reivindicación 41, caracterizado porque el anticuerpo enla;za a CP20 humano con una velocidad de disociación menor que aquella del anticuerpo quimérico clF5.

45. El anticuerpo humanizado de conformidad con :1a reivindicación 41, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13.

46. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la región variable ¡de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 48.

47. Un método para tratar un trastorno de células B en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 27, 34, o 41.

48. Un método para prevenir un trastorno de células B en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar lal sujeto una cantidad profilácticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 27, 34, o 41.

49. Una composición de anticuerpo anti-GD20 humanizado, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 27, 34, o 41, en donde al menos 90% de los N-glicanos presentes en la composición son GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G0) .

50. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica jel anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 27, 34, 41.

51. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 50.