MX2011006926A - Metodos y medios para categorizar una muestra que comprende celulas de cancer colorrectal. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para categorizar células de cáncer colorrectal a través de la determinación de los niveles de ARN de un grupo de genes del perfil. Tal categorización puede utilizarse para pronosticar un riesgo de recurrencia del cáncer colorrectal. La invención además se refiere a un grupo de genes que puede utilizarse para normalizar los niveles de ARN del grupo de genes del perfil, y a un micro-arreglo que comprende el grupo de genes del perfil.

Description

METODOS Y MEDIOS PARA CATEGORIZAR UNA MUESTRA QUE COMPRENDE CELULAS DE CANCER COLORRECTAL Descripción de la Invención La invención se refiere al campo de oncología. Más específicamente, la invención se refiere a un método para categorizar células de cáncer colorrectal. La invención proporciona medios y métodos para diferenciar células de cáncer colorrectal con bajo potencial de metástasis y con un alto potencial metastático.

A nivel mundial se diagnosticaron sobre un millón de nuevos casos de cáncer colorrectal en 2002, representando más del 9% de todos los nuevos casos de cáncer (Ries et al., editores, National Cáncer Institute Bethesda, MD. 2006. 5-3-2006. SEER Cáncer Statistics Review, 1975-2003). El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en el mundo después del de pulmón y de pecho con dos tercios de todos los cánceres colorrectales que ocurren en regiones más desarrolladas. Como con todos los cánceres, las probabilidades de supervivencia son buenas para pacientes cuando el cáncer se detecta en etapa temprana. Los pacientes de la etapa I tienen un grado de supervivencia de aproximadamente 93%, mientras el índice de supervivencia de 5 años cae a aproximadamente 80% en pacientes en la etapa II y a 60% en pacientes en la etapa III (Sobrero et al., 2006. The Ref. 221529 Lancet Oncology 7(6): 515-517).

A pesar de numerosos ensayos clínicos, el beneficio de la quimioterapia adyuvante para pacientes con cáncer de colon en etapa II aún es discutible (Andre et al., 2006. Annals of Surgical Oncology 13(6): 887-898). Se han revisado varios análisis y meta-análisis de ensayos clínicos que comparan la terapia adyuvante con la observación en pacientes con cáncer de colon o colorrectal en la etapa II (para revisión, ver Benson et al., 2004. Journal of Clinical Oncology 22: 3408-3419). Tres cuartos de los pacientes se curan a través de cirugía solamente y por consiguiente, menos de 25% de pacientes se beneficiarían de quimioterapia adicional. Como resultado, el número de pacientes que reciben quimioterapia adyuvante varía significativamente entre los países desarrollados y las instrucciones oficiales no dan una recomendación clara (Van Cutsem et al., 2005. Annals of Oncology 16 (suppl_l) :il8-il9) . Para pacientes en la etapa III, el tratamiento adyuvante es recomendado para todos los pacientes (Gilí et al., 2004. Journal of Clinical Oncology 22: 1797-1806) aunque los pacientes con tumores MO NI TI o T2 (etapa IIIA) tienen significativamente un mejor grado de supervivencia que los pacientes en la etapa IIB lo indica que muchos pacientes no recibirían quimioterapia adicional.

La identificación del sub-grupo de pacientes que es más probable que sufra de una enfermedad recurrente por consiguiente permitiría la identificación de pacientes que es más probable que se beneficien del tratamiento adyuvante después de cirugía. Se ha puesto mucho esfuerzo en la identificación de parámetros clínico-patológicos que predicen el pronóstico. Los factores más importantes para pronosticar el riesgo de recurrencia son la presentación de emergencia, un tumor pobremente diferenciado (grado histológico) y la profundidad de la invasión tumoral y la implicación del órgano adyacente (T4) (Van Cutsem et al., 2005. Annals of Oncology 16 (supl_l) : Í18-Í19; Le Voyer et al., 2003. Journal of Clinical Oncology 21: 2912-2919). La evaluación de un número adecuado de nodos linfoides es un factor de riesgo adicional ya que los bajos números de nodos linfoides examinados están asociados con una disminución en el grado de supervivencia de 5 años. Aunque estos parámetros clínicos han demostrado que se correlacionan con el resultado, los médicos reconocen que son insuficientes para correctamente identificar pacientes con alto riesgo.

Los factores de predicción patológicos actuales no son suficientes para identificar pacientes de "alto riesgo" que tienen un riesgo aumentado para una enfermedad recurrente. Por consiguiente es un objeto de la presente invención proporcionar métodos y medios para permitir la categorización de muestras de cáncer de pacientes que sufren de cáncer colorrectal para identificar tales pacientes de alto riesgo y los pacientes de bajo riesgo.

Por consiguiente, la invención proporciona un método para categorizar una muestra de ARN de un individuo que sufre de cáncer colorrectal o que se sospecha que sufre del mismo, el método comprende proporcionar una muestra de ARN que se prepara de una muestra tisular del individuo, la muestra tisular comprende células de cáncer colorrectal o se sospecha que comprenden células de cáncer colorrectal; determinar los niveles de ARN para establecer los genes en la muestra de ARN; y categorizar la muestra de ARN sobre la base de los niveles de ARN determinados para el grupo de genes; en donde el grupo de genes comprende por lo menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1.

Este estudio describe un perfil de expresión génico robusto que pronostica la reincidencia de la enfermedad y se agregará a la evaluación del riesgo clínico-patológico actual para ayudar al médico a tomar las decisiones con respecto al tratamiento. La identificación del subgrupo de pacientes que es más probable que sufra de una enfermedad recurrente permite la identificación de pacientes que más probablemente que se beneficien de la quimioterapia adyuvante y deberán tratarse después de cirugía.

El perfil de expresión génico de la presente se identificó después de eliminar una gran extensión de muestras de entrenamiento que comprenden células cancerígenas con una mutación activada en B-Raf (BRAFmut) . Las muestras de cáncer de colon BRAFmut se encontró que son altamente variables en los datos de la expresión génica que enmascaran más en general, los datos de expresión génica relacionados con el pronóstico. Sin desear estar unido a ninguna teoría en particular, tal expresión génica variable podría ser causada por un alto grado de inestabilidad micro-satélite (MSI) en muestras de cáncer de colon BRAFmut. El perfil de expresión génica resultante que se identificó después de eliminar las muestras de cáncer de colon BRAFmut se encontró que es más robusta y aplicable a una muestra que comprende células cancerígenas con o sin BRAFmut.

El cáncer colorrectal es un tipo de cáncer que se origina en el intestino grueso o intestinos, que comprende el colon y el recto. El cáncer de colon y el cáncer rectal tienen muchas características en común. La mayor parte de los cánceres colorrectales son adenocarcinomas . Estos son cánceres de las células que forran la capa interna de la pared del colon y el recto. Otros tipos menos comunes de tumores también pueden desarrollarse en el colon y en el recto, tales como los tumores carcinoides, que se desarrollan de células productoras de hormonas especializadas del intestino; tumores de la estroma gastrointestinal o leiomiosarcomas , que se desarrollan de las células del músculo liso en la pared del intestino; y linfornas, que son cánceres de las células del sistema inmunitario que típicamente se desarrollan en los nodos linfoides pero también pueden iniciarse en el colon y el recto u otros órganos .

Los adenocarcinomas usualmente se inician como pólipos colorrectales , una hiperplasia que se define como una protuberancia visible por arriba de la superficie de la mucosa circundante del intestino grueso normal. Los pólipos colorrectales se clasifican ya sea como neoplásicos (pólipos adenomatosos) o no neoplásicos, que comprenden pólipos hiperplásicos , mucosales, inflamatorios, o hamartomatosos que no tienen un potencial maligno. Los pólipos adenomatosos, o adenomas, se unen a la pared del intestino a través de un pedúnculo (pedunculados) o a través de una base plana, amplia (sésil) . Una hiperplasia colorrectal o pólipo puede desarrollarse en un adenocarcinoma maligno.

Utilizando ARN aislado de un grupo de entrenamiento de muestras colorrectales con un gen B-Raf de tipo silvestre y comprendiendo muestras de los cánceres colorrectales que no dieron origen a metástasis en pacientes dentro de la duración del tiempo de seguimiento de cada paciente, los genes se seleccionaron utilizando un método con base en la regresión Cox multivariable (Simón et al., Design and Analysis of DNA Microarray Investigations , Springer-Verlag New York, (2003); Korn et al., Journal of Statistical Planning and Inference 124, 379-398 (2004)). Los genes se seleccionaron, de los cuales los niveles de ARN estuvieron significativamente relacionados con la supervivencia del paciente, independiente de la etapa del paciente, en donde la supervivencia se define como estando libre de recurrencia cancerígena. Cada uno de estos genes enumerados en la Tabla 1 demostró ser predictivo de supervivencia y tener un umbral significativo mínimo de 0.001.

En una modalidad preferida, un grupo de por lo menos dos genes comprende MCTPl (SEC ID NO 36) y THNSL2 (SEC ID NO 13) . Más preferida es la determinación de la proporción de expresión de MCTPl (SEC ID NO 36) y THNSL2 (SEC ID NO 13) . Una muestra con una proporción MCTP1/THNSLC2 determinada por arriba de un umbral predeterminado es indicativa de una muestra con un bajo riesgo de recurrencia cancerígena. Las muestras con una alta proporción de MCTPl/THNSLC2 (bajo riesgo) mostraron una metástasis con 5 años de diferencia sin supervivencia (DMSF) de 87%. Las muestras con una baja proporción de MCTP1/THNSLC2 (alto riesgo) demostraron una DMFS de 70%.

En una modalidad preferida, un grupo de genes de acuerdo con la invención comprende por lo menos tres de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos cuatro de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos cinco de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos seis de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos siete de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos ocho de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos nueve de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos ten de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos quince de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos veinte de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos veinticinco de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos treinta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos cuarenta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos cincuenta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos sesenta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos setenta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido por lo menos ochenta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido cien de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido ciento cincuenta de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido doscientos de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido todos de los genes enumerados en la Tabla 1.

Un grupo de genes preferido para utilizarse en un método de la invención comprende los primeros dos genes ordenados por rango enumerados en la Tabla 1, más preferido los primeros tres genes ordenados por rango, más preferido los primeros cuatro genes ordenados por rango, más preferido los primeros cinco genes ordenados por rango, más preferido los primeros seis genes ordenados por rango, más preferido los primeros siete genes ordenados por rango, más preferido los primeros ocho genes ordenados por rango, más preferido los primeros ten genes ordenados por rango, más preferido los primeros quince genes ordenados por rango, más preferido los primeros veinte genes ordenados por rango, más preferido los primeros treinta genes ordenados por rango, más preferido los primeros cuarenta genes ordenados por rango, más preferido los primeros cincuenta genes ordenados por rango, más preferido los primeros sesenta genes ordenados por rango, más preferido los primeros setenta genes ordenados por rango, más preferido los primeros ochenta genes ordenados por rango, más preferido los primeros noventa genes ordenados por rango, más preferido los primeros cien genes ordenados por rango, más preferido los primeros ciento cincuenta genes ordenados por rango, más preferido los primeros doscientos genes ordenados por rango, más preferido todos los doscientos nueve genes enumerados en la Tabla 1.

Un perfil preferido adicional comprende genes referidos en la Tabla 1 como ZBED4 , LIF, PIM3 , IL2RA, PYROXD1, CTSC, EDEM1, M6PRBP1, SLC6A12, TH SL2 , PPARA, ZNF697, LAMA3, CA438802, MCTP1 , HSD3B1, CYFIP2, IL2RB, también referidos como "perfil de 18 genes" .

Un perfil preferido adicional comprende los genes referidos en la Tabla 1 como ZBED4 , LIF, IL18R1, PIM3, IL2RA, PYROXD1, CTSC, EDEM1 , M6PRBP1 , SLC6A12, THNSL2 , KCNJ10, THC2663361, C10orf67, KIAA0040, BC040628, AK096685, PIGW, PPARA, COLQ, A 021427, C15orf27, PRDM4 , LOC165186, ZNF697, CRYGA, EEPD1, LAMA3 , NEDD8 , CA438802, MCTP1 , HSD3B1, CYFIP2 , IL2RB, XKR3 , NT_035113, THC2520461, y THC2662025.

Una muestra celular es una muestra químicamente relevante que comprende una célula de cáncer colorrectal o un producto de expresión que comprende un ácido nucleico de una célula de cáncer colorrectal .

En una modalidad preferida, una muestra de célula de acuerdo con la invención se obtiene directamente del intestino grueso durante la cirugía. En una modalidad alternativa, la muestra celular se prepara de una muestra de biopsia que se toma durante la colonoscopía .

Es además preferido que las biopsias tengan una profundidad de a lo sumo 10 milímetros, más preferido a lo sumo 5 milímetros, con un diámetro preferido de aproximadamente 2 milímetros , más preferido de aproximadamente 3 milímetros , más preferido de aproximadamente 4 milímetros , más preferido de aproximadamente 5 milímetros , más preferido de aproximadamente 6 milímetros , más preferido de aproximadamente 7 milímetros, más preferido de aproximadamente 8 milímetros, más preferido de aproximadamente 9 milímetros, más preferido de aproximadamente 10 milímetros. Sin embargo, también son posibles otras formas que son iguales en tamaño y en volumen total .

En otra modalidad preferida, la muestra tisular comprende la deposición de materia fecal o sangre a través de un paciente que sufre de cáncer colorrectal, la muestra tisular comprende una célula de cáncer colorrectal o un producto de expresión de gen tal como un producto de ácido nucleico de una célula de cáncer colorrectal. Los métodos para purificar células o productos de expresión génica tales como ARN de las muestras de material fecal o sangre humana son conocidas en la técnica y han sido descritas por ejemplo la solicitud de patente O199820355, WO2003068788 , y Yang et al. 2005, Cáncer Lett 226: 55-63, que se incorporan aquí por referencia .

Las muestras pueden procesarse en numerosas formas, como se conoce por un experto en la técnica. Por ejemplo, pueden preparase de manera fresca de células o tejidos en el momento de la cosecha, o pueden prepararse de muestras que están almacenadas a -70°C hasta que se procesan para la preparación de la muestra. Alternativamente, los tejidos, biopsias, muestras de material fecal o sangre, pueden almacenarse bajo condiciones que conservan la calidad de la proteína o ARN. Los ejemplos de esas condiciones conservadoras son fijación utilizando por ejemplo, formalina, inhibidores de ARNasa tales como ARNsin (Pharmingen) o R asecure (Ambion) , soluciones acuosas tales como R Alater (Assuragen; US06204375) , Efecto de Protección de Solvente Orgánico mediado por el regulador de pH de ácido glutámico-Hepes (HOPE; DE10021390) , y RCL2 (Alphelys; WO04083369) , y soluciones no acuosas tales como la de Fijación Molecular Universal (Sakura Finetek USA Inc.; US7138226).

El nivel de ARN de por lo menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1 puede determinarse a través de cualquier método conocido en la técnica. Los métodos para determinar niveles de ARN de genes son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, Northern blotting, PCR cuantitativa, y análisis de microarreglo .

Northern blotting comprenden la cuantificación del producto de expresión de ácido nucleico de un gen específico a través de la hibridación de una sonda marcada que específicamente interactúa con el producto de expresión del ácido nucleico, después de la separación de los productos de expresión del ácido nucleico a través de electroforesis en gel . La cuantificación de la sonda marcada que ha interactuado con el producto de expresión del ácido nucleico sirve como una medida para determinar el nivel de expresión. El nivel de expresión determinado puede normalizarse para diferencias en las- cantidades totales de productos de expresión de ácido nucleico entre dos muestras separadas mediante la comparación del nivel de expresión de un gen que se sabe que difiere en el nivel de expresión entre las muestras .

La Reacción de Cadena de Polimerasa Cuantitativa (qPCR) proporciona un método alternativo para cuantificar el nivel de expresión de ácidos nucleicos. qPCR puede llevarse a cabo a través de PCR en tiempo real (rtPCR) , en donde la cantidad del producto se monitorea durante la reacción, o a través de mediciones del punto final, en donde se determina la cantidad de un producto final. Como se conoce por el experto en la técnica, rtPCR puede llevarse a cabo ya sea a través del uso de un intercalador de ácido nucleico, tal como por ejemplo, bromuro de etidio o el tinte Verde I SYBR®, que interactúa con todos los productos bicatenarios generados que dan como resultado un aumento en la fluorescencia durante la amplificación, o a través del uso de sondas marcadas que reaccionan específicamente con el producto bicatenario generado del gen de interés. Los métodos de detección alternativos que pueden utilizarse son provistos por amplificación de señal de dendrímero, amplificación de señal de hibridación, y modelos moleculares.

Los diferentes métodos de amplificación, conocidos por el experto en la técnica, pueden utilizarse para qPCR, incluyendo pero no limitándose a PCR, amplificación de círculo enrollado, amplificación a base de secuencia de ácido nucleico, transcripción mediada por amplificación, y amplificación de ARN lineal.

Para la detección simultánea de múltiples productos de expresión del gen de ácido nucleico, los métodos qPCR, tales como amplificación dependiente-ligación múltiple-transcriptasa inversa (rtMLPA) , que precisamente cuantifican hasta 45 transcriptos de interés en un ensayo de un tubo (Eldering et al., Nucleic Acids Res 2003; 31: el53) pueden utilizarse .

Los análisis a base de microarreglo involucran el uso de biomoléculas seleccionadas que se inmovilizan en la superficie. Un microarreglo usualmente comprende moléculas de ácido nucleico, sondas designadas, que son capaces de hibridar los productos de expresión de ácido nucleico. Las sondas se exponen al ácido nucleico de la muestra marcada, se hibridan y se determina la abundancia del producto de expresión del ácido nucleico en la muestra que es complementario a la sonda. Las sondas en un microarreglo pueden comprender secuencias de ADN, secuencias de ARN, o secuencias de copolímero de ADN y ARN. Las sondas también pueden comprender análogos de AND y/o ARN tales, por ejemplo, análogos de nucleótido o moléculas de ácido nucleico de péptido (PNA) , o sus combinaciones. Las secuencias de las sondas -pueden ser fragmentos completos o parciales de ADN genómico. Las secuencias también pueden ser secuencias de nucleótido sintetizadas in vitro, tales como las secuencias de oligonucleótido sintético.

Se prefiere que los niveles de ARN se determinen simultáneamente. Los análisis simultáneos pueden llevarse a cabo, por ejemplo, a través de qPCR múltiple y análisis de microarreglo . Los análisis de microarreglo permiten la simultánea determinación de los niveles de ácido nucleico de expresión de un gran número de genes, tales como más de 50 genes, más de 100 genes, más de 1000 genes, o aún más de 10,000 genes, que permiten el uso de un gran número de datos de expresión génica para la normalización de los genes que comprenden el perfil de expresión colorrectal.

En una modalidad preferida, por consiguiente, los niveles de ARN se determinan a través de análisis de microarreglo .

La sonda es específica para un gen enumerado en la Tabla 1. Una sonda puede ser específica cuando comprende un alargamiento continuo de los nucleótidos que son completamente complementarios a la secuencia de nucleótido de un producto de ARN del gen, o uno de sus productos de ADNc . Una sonda también puede ser específica cuando comprende un alargamiento continuo de nucleótidos que son parcialmente complementarios a una secuencia de nucleótido de un producto de ARN de tal gen, o uno de sus productos de ADNc . Parcialmente significa que un máximo de 5% de los nucleótidos en un alargamiento continuo de por lo menos 20 nucleótidos difiere de la secuencia de nucleótido correspondiente de un producto de ARN del gen. El término complementario es conocido en la técnica y se refiere a una secuencia que se relaciona a través de reglas a base de pares a la secuencia que se va a detectar. Se prefiere que la secuencia de la sonda se designe cuidadosamente para minimizar la hibridación no específica de la sonda. Se prefiere que la sonda sea o imite una molécula de ácido nucleico monocatenaria . La longitud del alargamiento continuo complementario de los nucleótidos puede variar entre 15 bases y varios kilobases, y se prefiere entre 20 bases y 2 kilobase, más preferido entre 40 y 100 bases, y más preferido 60 nucleótidos. Una sonda más preferida comprende un alargamiento continuo de 60 nucleótidos que son idénticos a una secuencia de nucleótido de un producto de ARN de un gen, o uno de sus productos de ADNc.

Para determinar el nivel de ARN de por lo menos dos genes enumerados en la Tabla 1, la muestra de ARN preferiblemente se marca, ya sea directa o indirectamente, y se pone en contacto con sondas en el arreglo bajo condiciones que favorecen la formación doble entre una sonda y una molécula complementaria en la muestra de ARN marcada. La cantidad de marcación que permanece asociada con una sonda después de lavar el microarreglo puede determinarse y utilizarse como una medición para el nivel de ARN de la molécula de ácido nucleico que es complementaria a la sonda.

Los niveles de ARN determinados para al menos dos genes enumerados en la Tabla 1 pueden normalizarse para corregir la desviación sistémica. La desviación sistémica da como resultado la variación a través de las diferencias inter-arreglo en el rendimiento global, que puede deberse a por ejemplo a inconsistencias en la fabricación del arreglo, tinción y exploración, y la variación entre las muestras de ARN marcadas, que puede deberse por ejemplo a variaciones en pureza. La desviación sistémica puede introducirse durante el manejo de la muestra en un experimento de microarreglo. Para reducir la variación sistémica, los niveles de ARN determinados preferiblemente se corrigen para hibridación no específica de fondo y normalizarse utilizando, por ejemplo, el software de extracción de características (Agilent Technologies) . Otros métodos que son o serán conocidos para un experto en la técnica, tales como el experimento de intercambio de colorante (Martin-Magniette et al., Bioinformatics 21:1995-2000 (2005)) también pueden aplicarse para normalizar diferencias introducidas por la desviación del tinte. La normalización de los niveles de expresión da como resultado valores de expresión normalizados.

Los métodos convencionales para la normalización de los datos del arreglo incluyen análisis global, que se basa en la suposición de que la mayoría de los marcadores genéticos en el arreglo no están diferencialmente expresados entre las muestras [Yang et al., Nucí Acids Res 30: 15 (2002)] . Alternativamente, el arreglo puede comprender sondas específicas que se utilizan para normalización. Estas sondas preferiblemente detectan productos de ARN de genes de mantenimiento tales como gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y los niveles de 18S ARNr de los cuales el nivel del ARN se cree que es constante en una célula dada e independiente de la etapa de desarrollo o el pronóstico de la célula.

Por consiguiente, un método preferido de acuerdo con la invención además comprende normalizar los niveles de ARN determinados del grupo de por lo menos dos de los genes enumerados en Tabla 1 en la muestra. .

La normalización preferiblemente comprende centrar el término medio, en donde los "centros" de los datos del arreglo se traen al mismo nivel bajo la suposición de que la mayor parte de los genes están sin cambiar entre las condiciones. La normalización preferiblemente comprende la normalización de regresión local de Lowess (LOcally WEighted Scatterplot Smoothing) para corregir ambas desviaciones de la aguja y dependiente de la intensidad.

En una modalidad preferida, los genes se seleccionan de los cuales los niveles de ARN son más constantes entre las diferentes muestras tisulares que comprenden células colorrectales de un individuo, y entre las muestras tisulares que comprenden células colorrectales de diferentes individuos. Además se prefiere que los niveles de ARN del grupo de genes de normalización difieran entre los genes. Por ejemplo, se prefiere seleccionar genes con un bajo nivel de ARN en la muestra tisular, y los genes con un alto nivel de ARN. Más preferido es seleccionar genes con un bajo nivel de ARN en la muestra tisular, genes con un nivel de ARN moderado, y genes con un alto nivel de ARN. Será claro para un experto en la técnica que los niveles de ARN del grupo genes de normalización preferiblemente permiten la normalización sobre un amplio intervalo de niveles de ARN. Un método preferido además comprenden multiplicar cada uno de los valores de expresión normalizados con una constante predeterminada para el gen para obtener un valor ponderado para el nivel de ARN relativo del gen, y por tanto un grupo de valores ponderados para el grupo de genes, el método además comprende categorizar la muestra sobre la base del grupo de valores ponderados .

El grupo de valores ponderados puede sumarse y compararse a un grupo sumado de valores ponderados de una muestra de referencia. Se prefiere que tal grupo sumado de valores ponderados se compare con un umbral de clasificación, que se determina a través de los valores obtenidos de las muestras de ARN de las cuales se conoce la categorización.

Los cánceres colorrectales tales como los adenocarcinomas son dependientes de la etapa en invasión visible del tejido circundante. Un sistema de organización es provisto por el sistema de organización TNM, que combina los datos acerca del tumor (T) , la extensión de los nodos linfoides (N) , y la existencia de metástasis distanciada (M) . Un cáncer colorrectal de la etapa I TNM se define como un cáncer que empezó a extenderse y que ha invadido la submucosa y la capa muscular en la subserosa, o en los tejidos pericólico o perirectal, pero no ha llegado a los nodos linfoides. Una etapa III se define como un cáncer que se ha extendido hacia los nodos linfoides en la ausencia de metástasis distanciada. Una etapa IV define un cáncer que se ha extendido a sitios distantes.

En una modalidad preferida, la invención proporciona un método para categorizar a un individuo que sufre de cáncer colorrectal, en donde el cáncer colorrectal comprende la etapa I TNM, la etapa II TNM, o la etapa III TNM de cáncer colorrectal como se determina por el sistema de organización TNM, en donde la etapa II TNM y la etapa III TNM son cánceres colorrectales preferidos.

Se prefiere que tal categorización en un método de acuerdo con la invención permita la diferenciación de las células cancerígenas con un bajo potencial de metástasis o riesgo de recurrencia de cáncer y células cancerígenas con un alto potencial de metástasis o un riesgo de recurrencia cancerígena .

Para diferenciar células cancerígenas con un bajo potencial de metástasis y células cancerígenas con un alto potencial metastático, los niveles de ARN de por lo menos de dos genes enumerados en la Tabla 1 pueden compararse con los niveles de ARN de tales genes en una muestra de referencia.

Una muestra de referencia es preferiblemente una muestra de ARN aislada de tejido colorrectal de un individuo sano, o una muestra de ARN de una línea celular relevante o mezcla de líneas celulares. Tal muestra de referencia también puede ser una muestra de ARN de un cultivo cancerígeno de un individuo que sufre de cáncer colorrectal . Tal individuo que sufre de cáncer colorrectal puede tener un riesgo aumentado de recurrencia cancerígena o un bajo riesgo de recurrencia cancerígena .

Se prefiere que la muestra de referencia sea una muestra de ARN de un individuo que sufre de un cáncer colorrectal que tiene un bajo riesgo de recurrencia cancerígena. En una modalidad más preferida, tal muestra de referencia es una muestra de ARN agrupada de múltiples muestras tisulares que comprenden células colorrectales de individuos que sufren de cáncer colorrectal y tienen un bajo riesgo de recurrencia cancerígena. Se prefiere que la muestra de tejido tisular múltiple comprenda más de 10 muestras de tejido, más preferido más de 20 muestras de tejido, más preferido más de 30 muestras de tejido, más preferido más de 40 muestras de tejido, y más preferido más de 50 muestras de tejido. Una muestra de referencia más preferida comprende ARN agrupado de múltiples muestras de tejido que comprenden células de cáncer colorrectal de individuos que tienen un bajo riesgo de recurrencia cancerígena y de individuos que tienen un alto riesgo de recurrencia cancerígena.

Una muestra de referencia preferida adicional comprende ARN aislado y agrupado de tejido de colon de individuos sanos, o del denominado tejido adyacente normal de pacientes con cáncer de colon o ARN de una línea celular genérica o mezcla de línea celular. El ARN de una línea celular o una mezcla de línea celular pueden producirse en el laboratorio u obtenerse de una fuente comercial tal como por ejemplo, ARN de referencia humana de Stratagene .

La categorización de una muestra puede llevarse a cabo en varias formas. En un método, se determina un coeficiente que es una medición de una similitud o disimilitud de una muestra con la muestra de referencia. Se puede utilizar un número de diferentes coeficientes para determinar una correlación entre el nivel de expresión de ARN en una muestra de ADN de un individuo y una muestra de referencia. Los métodos preferidos son métodos paramétricos que asumen una distribución normal de los datos. Uno de estos métodos es el coeficiente de correlación de productos-momento de Pearson, que se obtiene midiendo la co-variación de dos variables por el producto de sus desviaciones estándar. Los métodos preferidos comprenden una correlación no centrada, coseno-ángulo, más preferido una correlación de coseno (Fan et al., Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc . 5:4810-3 (2005)).

Preferiblemente, la correlación con una muestra de referencia se utiliza para producir una calificación de similitud general para el grupo de genes que se utilizan. Una calificación de similitud es una medición de la correlación promedio de los niveles de ARN de un grupo de genes en una muestra de ARN de un individuo de una muestra de referencia. Tal calificación de similitud puede, por ejemplo, ser un valor numérico entre +1, que indica una alta correlación entre el nivel de expresión de ARN del grupo de genes en una muestra de ARN del individuo y la muestra de referencia, y -1, que indica una correlación inversa y por consiguiente indica que tiene un riesgo incrementado de referencia cancerígena (van t Veer et al., Nature 415: 484-5 (2002)).

En otro aspecto, la invención proporciona un método para clasificar un individuo que sufre de. cáncer colorrectal, que comprende clasificar al individuo como que tiene un mal pronóstico o un buen pronóstico a través de un método que comprende determinar un valor de similitud entre los niveles de ARN y un grupo de por lo menos dos genes enumerados en la Tabla 1 en una muestra de ARN del individuo y el nivel de expresión del grupo de genes en una muestra de ARN de un paciente que no tiene una enfermedad recurrente dentro de 5 años del diagnóstico inicial, y clasificar al individuo como que tiene un mal pronóstico si el valor de similitud está por debajo de un valor de umbral de similitud, y clasificar al individuo como que tiene un buen pronóstico si tal valor de similitud excede un valor de umbral de similitud.

La presente invención proporciona un grupo de marcadores útiles para distinguir muestras de pacientes con cáncer colorrectal con un buen pronóstico de muestras de pacientes con cáncer colorrectal con un mal pronóstico. En un método de la invención el nivel de expresión de estos marcadores se utiliza para determinar si un individuo afligido con cáncer de colon tendrá un buen o un mal pronóstico clínico. En una modalidad, la invención proporciona un método para determinar si un individuo afligido con cáncer de colon probablemente experimentará una recaída dentro de los 5 años de un diagnóstico inicial (es decir, si el individuo tiene un mal pronóstico) que comprende (1) comparar el nivel de expresión de por lo menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1 en una muestra tomada del individuo para el nivel de los niveles marcadores en un control, en donde los niveles marcadores en un control, en donde los niveles del control representan los encontrados en un individuo con un mal pronóstico; y (2) determinar si el nivel de la expresión de cada gen de al menos dos genes en la muestra del individuo son significativamente diferentes del control. Si no se encuentran diferencias sustanciales, el paciente tiene un mal pronóstico, y si se encuentra una diferencia sustancial, el paciente tiene un buen pronóstico. El experto en la técnica fácilmente verá que tales niveles de control pueden alternativamente representar los encontrados en un individuo con un buen pronóstico. En una modalidad más específica, se corren ambos controles. En el caso en donde el grupo no tiene un "buen pronóstico" o "mal pronóstico" , puro, un grupo de experimentos de individuos con un resultado conocido deberá hibridarse contra el grupo para definir los niveles de control de expresión para el grupo de buen pronóstico y mal pronóstico. Cada individuo con un resultado desconocido se híbrida contra el mismo grupo y el perfil de expresión resultante se compara con las plantillas para pronosticar su resultado.

Un mal pronóstico de cáncer de colon puede indicar que un tumor es relativamente agresivo, mientras un buen pronóstico puede indicar que un tumor es relativamente no agresivo .

Por consiguiente, la invención proporciona un método para determinar un curso de tratamiento de un paciente con cáncer de colon, que comprende determinar si el nivel de expresión de por lo menos dos genes de Tabla 1 se correlacionan con el nivel de esos genes en una muestra que representa un patrón de expresión de un buen pronóstico o un patrón de un mal pronóstico; y determinar un curso de tratamiento, en donde si la expresión se correlaciona con el patrón de un mal pronóstico, el tumor se trata como un tumor agresivo .

Un método preferido para clasificar una muestra ya sea como de alto riesgo o bajo riesgo para recurrencia de enfermedad involucra el uso de una plantilla de clasificación, derivada del entrenamiento de la Máquina de Vector de Soporte (SVM) utilizando todos los genes identificados como estando correlacionados con el avance de la enfermedad. Cada gen en la plantilla (perfil) tiene un factor de ponderación correspondiente, determinado a través de la implementación SVM de Chang & Lin (Chih-Chung Chang and Chih-Jen Lin, LIBSVM: a library for support vector machines, 2001, http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm). Este algoritmo analiza la información contenida en el perfil de los genes a través de todas las muestras del grupo de entrenamiento y construye una plantilla de clasificación que separa mejor a los pacientes con recurrencia de los que no tienen recurrencia. LIBSVM, desarrollado por Chih-Chung Chang y Chih-Jen Lin, es un software integrado para analizar muchos problemas en clasificación supervisada o estructuras de regresión .

Un valor de umbral de similitud es un valor arbitrario que permite la discriminación entre las muestras de ARN de pacientes con un alto riesgo de recurrencia de cáncer, y muestras de ARN de pacientes con un bajo riesgo de recurrencia de cáncer.

Tal valor de umbral de similitud se establece a un valor en el cual un número aceptable de pacientes con formación de metástasis conocida dentro de 5 años después del diagnóstico inicial tendrían una calificación falsa negativa por arriba del valor de umbral, y un número aceptable de pacientes sin formación de metástasis conocida dentro de 5 años después del diagnóstico inicial tendrían una clasificación de falsos positivos por debajo del valor de umbral .

Una calificación de similitud preferiblemente se despliega o se produce en un dispositivo de interfase de usuario, un medio de almacenamiento legible por computadora, o un sistema de computadora local o remoto.

En una modalidad alternativa la invención proporciona un método para clasificar a un individuo que sufre de cáncer colorrectal, que comprende clasificar al individuo como que tiene un mal pronóstico o un buen pronóstico a través del método que comprende (a) proporcionar una muestra de ARN del individuo que se prepara de una muestra tisular del individuo, la muestra tisular comprende células cancerígenas o se sospecha que comprende células de cáncer colorrectal; (b) determinar un nivel de ARN para un grupo de genes que comprende por lo menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1 en la muestra; (c) determinar un valor de similitud entre un nivel de expresión del grupo de genes en el individuo y un nivel de expresión del grupo de genes en un paciente que no tiene una enfermedad recurrente dentro de 5 años después del diagnóstico inicial; (d) clasificar al individuo como que tiene un mal pronóstico si tal valor de similitud está por debajo de un primer valor de umbral de similitud, y clasificar al individuo como que tiene un buen pronóstico si el valor de similitud excede el primer valor de umbral de similitud.

En un método preferido de la invención, se normaliza, el nivel de ARN para el grupo de genes que comprende por lo menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1 en la muestra. La normalización puede llevarse a cabo a través de cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo el análisis global y el uso de sondas específicas .

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para asignar el tratamiento a un individuo que sufre de cáncer colorrectal, que comprende clasificar al individuo como que tiene un mal pronóstico o un buen pronóstico de acuerdo con el método de la invención, y asignar una quimioterapia adyuvante si el individuo se clasifica como que tiene un mal pronóstico.

Un tratamiento de rutina para cáncer colorrectal es cirugía, que es seguido por el tratamiento adicional si el individuo se clasifica como que tiene un mal pronóstico. Tal tratamiento adicional se selecciona de quimioterapia y radioterapia adyuvante. La quimioterapia comprende el uso de compuestos naturales o no naturales para eliminar la rápida división, y por consiguiente las células cancerígenas, susceptibles. Los compuestos quimioterapéuticos comprenden agentes de alquilación tales como decarbazina y ciclofosfamida ; agentes de entrelazamiento de ADN tales como cisplatina y carboplatina ; agentes antimetabolíticos tales como metotrexato, 5-fluorouracilo (5FU) , y mercaptopurina; agentes alcaloídicos tales como taxanos tal como paclitaxel y docetaxel, vincristina y vinblastina ; inhibidores de topoisomerasa tales como camptotecinas y amsacrina; antibióticos tales como antraciclina, glicosidas tales como doxorubicina, daunorubicina , idarubicina, pirarubicina, epirubicina; mitomicina; inhibidores de la biosíntesis de poliaminas tales como eflornitina ; ácido micofenólico y otros inhibidores de inosin monofosfato deshidrogenasa ; y antrapirazoles tales como mitoxantrona, piroxantrona, y losoxantrona .

El tratamiento adyuvante quirúrgico estándar actual para cáncer colorrectal que comprende la etapa III de TNM modificada o mayor, es FOLFOX 4. FOLFOX combina oxaliplatina, leucovorina, y 5FU infusional. Leucovorina es un fármaco que se utiliza para mejorar el efecto anti -cancerígeno de la quimioterapia, y especialmente 5FU. Otros usos terapéuticos son XELOX, una terapia de combinación que comprende oxaliplatina y capecitabina ; y FOLFIRI, que combina 5 -FU, leucovorina, e irinotecan, un inhibidor de topoisomerasa 1. Estos pueden combinarse con terapéuticos a base de anticuerpos que incluyen pero no se limitan a bevacizumab, que inhibe la angiogénesis , cetuximab, un inhibidor de Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico, y panitumumab, un Inhibidor del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico .

Un cáncer que se origina en colon o en el recto se denomina un cáncer colorrectal o cáncer de intestino. Tal cáncer comprende cáncer de colon y cáncer rectal . En una modalidad preferida, un cáncer colorrectal de acuerdo con la invención se refiere a un cáncer de colon. En otra modalidad preferida, un cáncer colorrectal de acuerdo con la invención se refiere a un cáncer rectal.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para categorizar células de cáncer colorrectal de acuerdo con la invención para seleccionar pacientes que tienen una probabilidad aumentada de responder a la terapia. Un método de la invención puede ser instrumental para identificar subgrupos de pacientes con cáncer colorrectal que están en riesgo de ciertas complicaciones o que preferencialmente se benefician de tratamientos específicos. La información acerca de los subtipos colorrectales también podría sustancialmente mejorar el diseño de futuros estudios clínicos colorrectales mejorando la selección del paciente, reduciendo la variabilidad, y enfocándose en mediciones de resultados relevantes .

En un aspecto más, la invención proporciona un método para desarrollar un perfil génico colorrectal para categorizar una muestra de ARN de un individuo que sufre de cáncer colorrectal o que se sospecha que sufre del mismo, que comprende determinar un grupo de genes asociados con un periodo se supervivencia libre de metástasis distanciada en muestras de ARN obtenidas de cánceres colorrectales con inestabilidad no de microsatélite (no MIS) , por lo tanto el periodo libre de metástasis distanciada de 2 años, más preferido 3 años, más preferido 4 años, más preferido 5 años, más preferido más de 5 años. Tales cánceres colorrectales no de MSI preferiblemente no comprenden un bajo nivel de muestras colorrectales de inestabilidad microsatélite (MSI-L) . MSI por lo general es causada por mutaciones en uno de los genes de reparación no coincidentes MLH1 , MSH2 , MSH6 , o PMS2 y da como resultado un alto nivel de inestabilidad microsatélite (MSI-alta) en tumores de pacientes. Una prueba MSI se basa en análisis de mutación en los genes de reparación no coincidente. La invención preferiblemente proporciona un método para desarrollar un perfil del gen colorrectal para categorizar una muestra de ADN en un individuo que sufre de cáncer colorrectal o que se sospecha que sufre del mismo, que comprende determinar un grupo de genes asociados con un periodo de supervivencia libre de metástasis distanciada en muestras de ARN obtenidas de muestras de cáncer colorrectal que tienen una valina en la posición 600 de B-Raf, por lo tanto el periodo libre de metástasis distanciada 2 años, más preferido 3 años, más preferido 4 años, más preferido 5 años, más preferido más de 5 años .

En aún otro aspecto, la invención proporciona un arreglo, que comprende entre 5 y 12,000 moléculas de ácido nucleico que comprenden un primer grupo de moléculas de ácido nucleico en donde cada molécula de ácido nucleico del primer grupo comprende una secuencia de nucleótido que es capaz de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1. El primer grupo de secuencias de nucleótido preferiblemente comprende dos secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido tres secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido cuatro secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido cinco secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido seis secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido diez secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido dieciocho secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido treinta y ocho secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido cuarenta y cuatro secuencias de nucleótido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido cincuenta secuencias de nucleotido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido cien secuencias de nucleotido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, más preferido doscientas nueve secuencias de nucleotido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1. En una modalidad más preferida, el arreglo comprende por lo menos las 18 secuencias de nucleotido que son capaces de hibridar un gen diferente seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 1, y que se indican como perteneciendo al perfil dé 18 genes.

En una modalidad preferida, un arreglo de acuerdo con la invención además comprende un segundo grupo de moléculas de ácido nucleico en donde cada molécula de ácido nucleico del segundo grupo comprende una secuencia de nucleótido que es capaz de hibridar para normalización del gen, por lo tanto se prefiere que los niveles de AR de los genes normalizados sean disimilares.

En aún otro aspecto, la invención proporciona el uso de un arreglo de acuerdo con la invención para obtener un perfil de expresión colorrectal.

Figura 1: Análisis sin supervisión que identifica tres subclases de colon.

Figura 2: Calificación de genes para su asociación con la supervivencia libre de metástasis de 5 años distanciada (DMFS) .

Figura 3 : Análisis de Kaplan Meier del tiempo de recurrencia para el perfil de 18 genes.

Figura 4: Análisis de Kaplan Meier del tiempo para la recurrencia del perfil de 18 genes en muestras de colon de la etapa II y III.

Figura 5 : Análisis de Kaplan Meier de tiempo de recurrencia para el perfil de 18 genes en muestras de colon tratadas y no tratadas.

Figura 6: Beneficio del tratamiento en pacientes con bajo riesgo y alto riesgo dentro del cohorte de validación.

Figura 7 : Diferenciación entre las muestras clasificadas como de bajo riesgo y alto riesgo a través del perfil de 18 genes.

Figura 8: Uso de la proporción MCTP1/THNSL2 para pronóstico del colon.

Figura 9: Análisis de Kaplan Meier de tiempo de recurrencia en muestras de colon en la etapa I utilizando el perfil de 18 genes.

Ej emplos Ejemplo 1 Generación del clasificador Pacientes La información clínica y patológica documentada en el momento de la cirugía incluyó etapa, grado, tamaño y localización de tumores. Adicionalmente , el número de nodos linfoides evaluados para la participación nodal se describe en 95% de los casos. Los tumores se organizaron de acuerdo el sistema de Organización TMN. Todas las muestras tisulares se recolectaron de pacientes con consentimiento informado apropiado. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los estándares éticos de la Declaración de Helsinki y se aprobó por el Consejo de Etica Médica de los centros y hospitales médicos participantes. Los pacientes se monitorearon para supervivencia y recurrencia hasta por 270 meses.

Análisis de mutación El análisis de mutación se llevó a cabo en todas las muestras, incluyendo el grupo de entrenamiento y el grupo de validación, utilizando un método de secuenciación . Las mutaciones B-Raf se analizaron en exón 15 después de la amplificación de ADNc para detectar una mutación activada V600E. Los iniciadores utilizados fueron (iniciador 1) 5'-tgatcaaacttatagatattgcacga y (iniciador 2) 5'-tcatacagaacaattccaaatgc . Los productos amplificados se purificaron utilizando un kit de purificación Macherey-Nagel NucleoFast®. Las muestras que comprenden una mutación activada V600E en B-Raf fueron eliminadas en gran extensión a partir del grupo de muestras de entrenamiento.

Estado de Inestabilidad MicroSatélite (MSI) El estado MSI se determinó para 145 pacientes (n=90 en el Grupo de Entrenamiento y n=55 en el Grupo de Validación) como se describe previamente (Gonzalez-Garcia et al. 2000. J Nati Cáncer Inst 92: 5423). En resumen, se amplificaron seis regiones de ADN microsatélite por reacción de cadena de polimerasa (PCR) de tejidos normales y de tumor por pares, y los productos se resolvieron en geles de secuenciación de poliacrilamida de desnaturalización. La estabilidad de cada microsatélite se calificó de acuerdo con la ausencia (estable) o la presencia (no estable) de bandas cambiadas en movilidad o bandas adicionales en ADN de tumor comparado con ADN normal . Cuando el patrón de banda fue difícil de interpretar o no se obtuvo el producto de amplificación o ADN de tumor, la muestra se calificó como no analizada. Las muestras de 22 pacientes se clasificaron como MSI -Alto (MSI-H) .

Hibridación de microarreglo Las alícuotas del ARN total de muestras tumorales congeladas estuvieron disponibles para este estudio. Se amplificaron 200 nanogramos de ARN total utilizando el Kit de Marcación Fluorescente de Captura de Bajo ARN (Agilent Technologies). Se incorporó directamente 3-CTP o Cianina 5-CTP (GE Health Care) en el ARNc durante transcripción in vitro. Se co-hibridó un total de 750 ng de ARN marcado con Cianina con una referencia estándar a los microarreglos de oligo nucleótido Agilent 44k a 60 grados Celsius por 17 hrs y posteriormente se lavaron de acuerdo con el protocolo de hibridación estándar Agilent (Agilent Oligo Microarray Kit, Agilent Technologies) .

La referencia estándar (grupo de referencia de colon) comprendió 44 muestras de cáncer de colorrectal, de las cuales 13 se obtuvieron de pacientes que desarrollaron metástasis dentro de 5 años después de la cirugía y 31 se obtuvieron de pacientes que no desarrollaron metástasis dentro de 5 años después de cirugía.

Análisis de imagen de microarreglo Se cuantificaron las intensidades de imágenes escaneadas, los valores se corrigieron para hibridación no específica de fondo, y se normalizaron utilizando el software de Extracción de Características Agilent (Versión 9.5.1.3) de acuerdo con la configuración recomendada por los fabricantes para el microarreglo de Genoma Completo 44k Agilent. El procedimiento de normalización por omisión para este microarreglo incluye un componente lineal y uno Lowess, que corrigen cualquier diferencia en la incorporación del colorante Cy3/5 y centran el perfil final a 0 (escala loglO, Cy5/Cy3) . Este proceso se describe en la Guía de Referencia de Extracción de Características Agilent.

Otros procedimientos de normalización comunes tales como, por ejemplo, provistos en el software R/Bioconductor también pueden utilizarse.

Pre-procesamiento de datos Las proporciones de expresión génica normalizada de cada hibridación se combinaron para producir un solo perfil de expresión génica, por paciente, utilizando el software Agendia XPrint (versión 1.5.1), o utilizando los procedimientos de análisis de datos disponibles en el software R/Bioconductor. Para obtener un solo valor de proporción de expresión para cada uno de los genes del perfil en el arreglo, un valor medio ponderado de error se calculó para las sondas que pertenecen al mismo gen como proporciones loglO o log2. Para establecer pesos relativos apropiados, se utilizó el modelo de error de Rosetta, que corrige .las ambigüedades en mediciones de sonda individuales (Weng L et al, Bioinformatics 22:1111-21 (2006) ) . Se generó un archivo de texto conteniendo las proporciones log ponderadas de error, que después se utilizaron para análisis adicional. Los datos después se cargaron en BRB ArrayTools (Simón et al., Cáncer Informatics 2: 11-17 (2007)). Para obtener el valor de la proporción de expresión individual para cada sonda única en el arreglo, se calculó un valor de proporción medio para todas las sondas presentes más de una vez. Alternativamente, los datos de expresión se cargaron y analizaron en el software R/Bioconductor.

Selección del gen de pronóstico El agrupamiento jerárquico no supervisados se basó en la medición de la expresión génica del genoma completo que indicó la existencia de 3 subclases moleculares de colon principales (ver Figura 1) . El análisis de supervivencia de las tres cases mostró que un subtipo tuvo un la resultado relativo (subtipo C) s un subtipo (subtipo A) mostró un buen resultado (proporción A de peligro de supervivencia libre de metástasis distante de 5 años contra C de 1.8, P=0.15) . La investigación adicional de estos subtipos indicó que ambos subtipos A y B asociados con la supervivencia, estuvieron enriquecidos para muestras con un estado de mutación BRAF activado (BRAFmut) , especialmente para la clase de buen resultado (clase de buen resultado A: 52% de BRAFmut, clase de mal resultado C: 22% de BRAFmut, comparado con 4% de la subclase B restante) . Este hallazgo sugiere que las muestras dentro de las clases A y C mostraron un patrón de expresión génica diferente que probablemente esté enlazado al fenotipo de la mutación BRAF activado. Las subclases BRAFmut aparentemente estuvieron enriquecidas para muestras de colon con inestabilidad micro-satélite (MSI) . El agrupamiento de colon observado por consiguiente podría representar las dos trayectorias de desarrollo tumoral de color diferentes conocidas: MSS (subtipo B) y derivado de MSI (subtipo A y quizás también el m subtipo C) .

Un conjunto A y B puede discriminarse con base en el agrupamiento sin supervisión del genoma completo, las diferencias entre las muestras BRAFmut con un bueno y malo resultado son relativamente grandes. Esta gran diferencia dentro de las muestras BRAFmut podría enmascarar la expresión del gen relacionada con el pronóstico general que es evidente para todos los subtipos de colon, incluyendo el subtipo B, que consiste de 96% (100/104) de muestras BRAF de tipo silvestre con un resultado de pronóstico mixto. Para evadir las fuertes diferencias de expresión génica relacionadas con BRAFmut la expresión génicas relacionada con el pronóstico además se investigó dentro de las muestras del subtipo B solamente (n=104) y posteriormente de aplicó a todas las muestras (n=188) .

Utilizando el procedimiento de validación recíproca de "dejar uno fuera", todos los genes se calificaron por su asociación con la supervivencia libre de metástasis de 5 años (DMFS) . Un grupo de 209 genes mostró una fuete asociación DMFS en al menos una repetición (Tabla 1) , mientras 38 sondas no redundantes (de un grupo total de 44 sondas) mostraron una fuerte asociación DMFS sobre 50% de todas las repeticiones (ver Figura 2) .

Para asegurar que los genes seleccionados sean óptimamente adecuados para uso diagnóstico y den como resultado lecturas iguales utilizando ,un tipo de arreglo y/o referencia diferente, se confirmó la expresión medida en HD contra la referencia CRP con la de un tipo de arreglo de baja densidad diferente (LD) y utilizando una referencia diferente (línea de células humanas universal, UHR) . Dieciocho de las 38 sondas podrían compararse con LD y mostraron una lectura de expresión génica altamente "correlacionada (R2>0.50) a través de 128 muestras de entrenamiento que habían sido analizadas utilizando ambas plataformas. Estas 18 sondas, correspondientes a 18 genes u ORF, se utilizaron para el posterior desarrollo del perfil (ver Figura 7) .

Ejemplo 2 Entrenamiento del Clasificador Los 18 genes identificados se utilizaron para construir un clasificador del pronóstico del colon que es análogo a un perfil de pronóstico de cáncer de pecho, definido previo (WO2002103320 ; que se incorpora aquí por referencia) . Para cada muestra, se calculó una calificación de bajo riesgo y una calificación de alto riesgo con base en el patrón de expresión de los 18 genes en esa muestra. Ambas calificaciones se combinaron en un índice final. El umbral óptimo para la calificación del índice clasificador se determinó en tal forma que alcanzó la sensibilidad y especificidad óptima. Si el índice de una muestra excedió un umbral (-0.05) se considera como muestras de alto riesgo, y viceversa. El análisis de supervivencia del resultado de perfil en el cohorte de entrenamiento (utilizando un procedimiento de validación recíproca de Dejar Uno Fuera) indicó una proporción de peligro (HR) de 3.41 (P=1.4e-5) con un grado DMFS de 5 años de 82% (95CI, 76-89%) para las muestras de bajo riesgo y 50% (95%CI, 38-66%) de las muestras de alto riesgo. La supervivencia libre de enfermedad es relativamente baja para ambas clases de alto y bajo riesgo, probablemente debido a que la gran parte de las muestras dentro del cohorte de entrenamiento no recibieron quimioterapia adyuvante. El análisis separado para las muestras de BRAF de tipo silvestre y BRAFmut confirmó que el perfil de 18 genes es independiente del estado de la mutación de BRAF (Figura 3) .

Ejemplo 3 Evaluación del Clasificador El perfil de 18 genes se validó en un cohorte independiente de 178 muestras de colon de la etapa II y III. El perfil se clasificó 61% de las muestras de validación como de bajo riesgo y 39% como de alto riesgo. Las muestras de bajo y alto riesgo mostraron una significativa diferencia en DMFS con un HR de 3.19 (P=8.5e-4). Los grados de DMFS de 5 años fueron 89% (95CI, 93-95%) para muestras de bajo riesgo y 62% (95CI, 50-77%) para alto riesgo.

En el sub-análisis de pacientes en la etapa II solamente, el perfil de 18 genes tuvo un HR de 3.61 (0=0.01)- los grados DMFS de cinco años fueron 91% (95CI, 84 -98%) para pacientes de bajo riesgo y 71.8% (95CI, 57-87%) para pacientes de alto riesgo. En el sub-análisis de pacientes de la etapa III solamente, el perfil de 18 genes tuvo un HR de 2.72 (0=0.045) - los grados DMFS de cinco años fueron 84.3% (95CI, 71.4 -97.2%) para pacientes de bajo riesgo y 49.4% (95CI, 27.4-71.3%) para pacientes de alto riesgo.

Después, se investigó si el perfil de 18 genes mostró un poderoso pronóstico para muestras de pacientes no tratados solamente, o también para pacientes tratados con quimioterapia. El perfil de 18 genes mostró un rendimiento significativo para ambas muestras sin tratar (P=0.0082), y paciente tratados (P=0.016) indicando que el rendimiento del perfil no es causado debido a los beneficios del tratamiento (Figura 5) .

Se encontró que los pacientes con MSI-H tuvieron una alta frecuencia de mutación B-Raf (50%) y fue principalmente el perfil de 18 genes de bajo riesgo (19/22 = 86%) lo que indica que el buen pronóstico de pacientes MSI-H se identificó por el clasificador génico.

Para comparación del clasificador con otros factores clínicos, solamente se utilizaron los valores del Grupo de Validación. En el análisis sin variación, el perfil de 18 genes fue el pronosticador más fuerte de DMFS. Solamente la etapa y el estado de los nodos linfoides mostraron una magnitud similar de significancia estadística. En el análisis multivariable de todas las muestras, o solamente de pacientes de la etapa II o etapa II, el perfil de 18 genes permaneció como el factor de pronóstico independiente más significativo (Tabla 2) . Para el análisis multivariable , todos los parámetros clínicos con un valor p de 0.1 o mejor en el análisis no variable se incluyeron.

Cuando los resultados del perfil de 18 genes se compararon con la evaluación del riesgo actualmente utilizada con base en la recomendación ASCO (referida como riesgo ASCO) , el perfil de 18 genes superó la evaluación de riesgo clínica (Tabla 3). El análisis multivariable para pacientes en la etapa II muestra que el perfil de la expresión génica es el pronosticador más fuerte para desarrollar metástasis distante independientemente de los factores enumerados en la recomendación ASCO analizada ya sea sola (H = 3.56, 95%CI 1.35-9.39, p= 0.010) o combinada (HR= 3.6452, 95%CI 1.3337-9.3365, p= 0.011). Existe un alto grado de discordancia en estratificación de riesgo entre el perfil de 18 genes y el criterio ASCO lo que indica que el perfil de 18 genes puede complementar y mejorar la evaluación del riesgo clínico.

En el sub-grupo de pacientes en la etapa II, entre los 41 pacientes (36%) que recibieron quimioterapia adyuvante, 28 (68%) se clasificaron como índice de bajo riesgo y 13 (32%) como alto riesgo mediante el índice del perfil de 18 genes, y la administración de la quimioterapia no fue un factor de pronóstico significativo tampoco.

Ejemplo 4 Beneficio del tratamiento en pacientes de bajo riesgo y alto riesgo dentro de cohorte de validación.

Se determinó un beneficio de tratamiento de quimioterapia mediante el análisis de los grados de desarrollo DM de 5 años de pacientes de bajo riesgo y alto riesgo tratados contra no tratados. El beneficio del tratamiento estuvo ausente en pacientes clasificados como bajo riesgo (etapa II/III, -0% DM; etapa II, +2.7% DM) . El beneficio del tratamiento en pacientes de alto riesgo se observó (etapa II/III, -10.4% DM; etapa II, -9.5% DM) . Estos resultados (Figura 6) indican que los pacientes de alto riesgo es más probable que se beneficien de la quimioterapia.

Ejemplo 5 Proporción de MCTP1/THNSL2 para el pronóstico de colon El poder del pronóstico de un modelo de pronóstico de dos genes se ejemplifica utilizando los genes MCTP1 y THNSL2. Se determinó un umbral para la proporción MCTP1/THNSLC2 en las 188 muestras de entrenamiento y mostró un rendimiento significativo con un HR de 3.1 (P=6.8e-5) . Las muestras con una alta proporción de MCTP1/THNSLC2 por arriba del umbral se clasificaron como de bajo riesgo. El modelo de la proporción de MCTP1/THNSLC2 se confirmó en 178 muestras de validación independientes y mostró un HR significativo de 2.3 (P=0.017) (Figura 8) . Las muestras de validación con una alta proporción MCTP1/THNSLC2 (bajo riesgo) mostraron un DMFS de 5 años de 87% (95CI, 80-95%) y las muestras con una proporción de MCTP1/THNSLC2 baja (alto riesgo) mostraron una DMFS de 70% (95CI, 60-82%) .

Ejemplo 6 Adicionalmente , se investigó el perfil de 18 genes en un cohorte de 30 pacientes con cáncer de colon en etapa I. Un paciente mostró desarrollo de metástasis distante. Este paciente se identificó correctamente como de alto riesgo por el perfil de 18 genes (Figura Tabla 1 Gpo.8 Gpo. SEC Nombre del Nombre 38/4 Secuencia ID gen sistemático NO y y nAGAAGAGATGGCTTATTAACAGGGAAGAAGCTTGTTATATTCCAGTTGTAAGAATAGC 2BED4 NM_014838 1 y y CATTTCCCTGCAGATGGTACAGATGTTCCTGCCTTAGAGTCATCTCTAGTTCCCCACCTC LIF NM_002309 2 y GGGAGCCTTCTTGATGATCTCAAAAATAATAGCTATTCAAGAAAATCACCAAGTGACTGT IL18R1 N _003855 3 y y AGCCTGAGCGTTTAATTTATTCAGTACCTGTGTTTGTGTGAATGCGGTGTGTGCAGGCAT PIM3 NM_001001852 4 TTTTGAAGAAAAAGTCCTTCACTTTTCCAAGAGACCATACGTCAGTTACAACTAATACAG PYROXD1 NM_024854 5 TCCATATCTTTGTTTTAACCAGTACTTCTAAGAGCATAGAACTCAAATGCTGGGGGAGGT PPARA L02932 6 y y AGAGAGGTTTCCGCAGAATAAAAAGCGGGTCACTCTATATGCTCTGTACAGGAAACTCTA IL2RA NM_000417 7 y y TTTTGAAGAAAAAGTCCTTCACTTTTCCAAGAGACCATACGTCAGTTACAACTAATACAG PYROXD1 NM_024854 8 y y AGTCGAAAAATCCCAAGGCCCAAACCTGCACCACTGACTGCTGAAATACAGCAAAAGATT CTSC NM_001814 9 y y ATTACCACCTGTAATTCCTCTTTGGATTGTGTAGACTCAACATGAGACATTCCTTTCTGC EDEM1 N _014674 10 y y TCTCTATAATGCAGCTGTGCTCTGGAGTCCTCAACCCGGGGCTCATTTCAAACTTATTTT M6PRBP1 NM_005817 11 y y GGAAGTGACAACTGAACACACTGTGTTGGATCGGAGGTTCCGTTAGGGGATCCTTCCTTA SLC6A12 NM_003044 12 y y ????t????a?ß???aat??a???t?ß???at??t??pe?????????p???????p THNSL2 NM_018271 13 y AGGGACCTAGTGAAATCAATGAAACTCTTGAGTCTTGCTTAGGCTCGCAAACAAGAAGTG KCNJIO NM_0022 1 14 y AACAGAGGGCAGAAGGTCTATACGTCCTGAGGCCTTTTATGCAACGTTTGTTTGTGGAAT THC2663361 THC2663361 15 y TGAAAAGCATTATCAACAGAATGAGGATAAGATGAGAAAATCCTTCAATCAGCAGTTAGC C10orfó7 NMJ53714 16 y ?ß?????????????p???????????????p??????p????p?????p????? IAA0040 XR_0 1165 17 ACCCTGATGCGGAGAGGTGACAACTGGATGCTGATGCTTCGGGACACCATTGAGGACCTT THNSL2 NM_018271 18 y AGAGGCCTTGAATACTCAGAAAATGGGAGATTGTGAATGGGTGTAGAGGATATCTATGAA BC040628 BC040628 19 y A 096685 AK096685 20 y GAAGCTTTTGTCAGTAACCTCAATGGAACCACCGTGCTGGAAATCACCCAGGGATTGTGC PIGW N J785 I7 21 AGCCTGAGCGTTTAATTTATTCAGTACCTGTGTTTGTGTGAATGCGGTGTGTGCAGGCAT PIM3 N _001001852 22 y y ACGGTTATTGACCCCATAGACTAGGGTAAGAATAAAGGCAATAAATTTGGTCTGACTCAG PPARA NM_005036 23 Secuencia ????????p???????a?????????a???????????????????????????????? t?p? ??ßtp?tßpT???aap??????????aatpßaat?tata?taap?tt? AAAGAGGAATCGGGAAACCCTGGGTAAAAGTCGTCCAAGTGGAACnCCTTTGGTCGGGG ??t?p????a??????at??????????p?t????p?et???ta???t??t???a?t ?a??tp? a????t?tp??t?p????????????????????p???t??pt?at Gpo.8 Gpo. SEC Nombre del Nombre 38/4 Secuencia ID gen sistemático NO ?? ??p?t??e?????t?p?t?t?t?t?t?????tp??tapt????a???????? H G2L1 NM_005487 160 TCAGAAGGCTCTTCTGACTACTGGGCAAAGAGTGTAGATCAGAGCAGCAGTGAAAACAAT CXCR6 NM_006564 161 ENST0000036 ENST0000036073 ACTAGGAAGTATATGCCCCCAAATTATGAAATTCCATTTCAAACAGAATTAACAGAATTT 162 0738 8 TTTGGGGATTTTGTTTTCCCnGGTCTMTGGAGAGAMGACATTTTGGTTTTCTTTTTC MYT1 NM_004535 163 GGTTTATTGACATGGAATGATTTGACCAAGGTGATATAGTGGTTAAGCAGTTAAGTGATT THC2699065 THC2699065 164 CTGAGATGCTGATGTCATGGAGAGTAAACGACCACAAGTTTACCCCACTTCTCTGTGAAA NR1 H4 NM_005123 165 ???????????????? ???p??????????????ß??????p??p?????p???? FH0D3 N _025135 1 6 CTTTAGACCTTTGTCCCCGTCACTGCCAGCGCTTGGGCTGAAGGAAGCTCCAGACTCAAT FXYD2 NM_021603 167 GGGACATGGGAGGAGCCATATTGAGAAAGTAGCATGGGTACTTGGCTTCACAGAGTGTGG LOC72 170 XM_001 129548 168 ??t??p?p???????ta???p?t??t??t???p?p?????????t????p??? LOC654433 A 126431 169 AAGGTTCCATGGTAGCTAAGTGTGGACAAGCTAATCACTGAAGTTCCCTGATGCAGAGTT NT .006713.14 NT_006713.14 170 ????????ß??????a??????t?????????p??a?????p ?ep???at?p??? 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La Recomendación ASCO define los pacientes en la etapa II a alto riesgo si el número total de nodos linfoides evaluado es menor de 12 y/o si el tumor está en la etapa T4 y/o si el Grado histológico es de 3 y/o si el paciente tuvo una presentación de emergencia u obstrucción.

Tabla 3A: Pacientes definidos como de Bajo o Alto Riesgo por el perfil de 18 genes o Recomendación ASCO: 45% de los pacientes tienen una evaluación discordante. perfil de 18 genes perfil de 18 genes de Bajo Riesgo de Alto Riesgo Bajo Riesgo ASCO 43 27 Alto Riesgo ASCO 29 16 Tabla 3B : Análisis ultivariable Variable valor p HR 95% CI perfil de 18 0.009 3.639 1.373-9.644 genes ASCO* 0.263 1.696 0.672-4.282 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para categorizar una muestra de ARN de un individuo que sufre de cáncer colorrectal o que se sospecha que sufre de éste, caracterizado porque comprende: a. proporcionar una muestra de ARN que se prepara de una muestra tisular del individuo, la muestra tisular comprende células de cáncer colorrectal o se sospecha que comprende células de cáncer colorrectal; b. determinar los niveles de ARN de un grupo de genes en la muestra de ARN; y c. categorizar la muestra de ARN sobre las bases de los niveles de ARN determinados para el grupo de genes; en donde el grupo de genes comprende al menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo de genes comprende al menos diez de los genes enumerados en la Tabla 1.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo de genes comprende MCTP1, LAMA3, CTSC, PYROXD1, EDEM1, IL2RB, ZNF697, SLC6A12 , IL2RA, CYXIP2, PIM3, LIF, M6PRBP1, CA438802, HSD3B1, ZBED4 , PPARA, THNSL2.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los niveles de ARN se determinan a través de análisis de microarreglo .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende los niveles de ARN determinados del grupo de genes en la muestra.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cáncer colorrectal comprende un cáncer de la etapa I TNM, etapa II TNM o etapa III TNM de acuerdo con el Sistema de Organización TNM.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la categorización diferencia las células cancerígenas con un bajo potencial de metástasis y las células cancerígenas con un alto potencial metastático.

8. Un método para clasificar un individuo que sufre de cáncer colorrectal, caracterizado porque comprende: clasificar al individuo como que tiene un mal pronóstico o un buen pronóstico a través de un método que. comprende : (a) proporcionar una muestra de ARN del individual que se prepara de una muestra tisular del individuo, la muestra tisular comprende células de cáncer colorrectal o se sospecha que comprende células de cáncer colorrectal; (b) determinar un nivel de AR de un grupo de genes que comprende al menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1 en la muestra; (c) determinar un valor de similitud entre un nivel de expresión del grupo de genes en el individuo y un nivel de expresión del grupo de genes en un paciente que no tiene una enfermedad recurrente dentro de cinco años del diagnóstico inicial; y (d) clasificar el individuo como que tiene un mal pronóstico si el valor de similitud está por debajo de un primer valor de umbral de similitud, y clasificar el individuo como que tiene un buen pronóstico si el valor de similitud excede el primer valor de umbral de similitud.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el nivel de ARN determinado para el grupo de genes está normalizado.

10. Un método para asignar tratamiento a un individuo que sufre de cáncer colorrectal, caracterizado porque comprende : (a) clasificar el individuo como que tiene un mal pronóstico o un buen pronóstico de conformidad con la reivindicación 8 o la reivindicación 9; (b) asignar quimioterapia si el individuo se clasifica como que tiene un mal pronóstico.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cáncer colorrectal comprende cáncer de colon.

12. Un método para desarrollar un perfil del gen colorrectal para categorizar una muestra de ARN de un individuo que sufre de cáncer colorrectal o que se sospecha que sufre de éste, caracterizado porque comprende determinar un grupo de genes asociados con un período de supervivencia libre de metástasis distante en muestras de ARN obtenidas de cánceres colorrectales no MSI .

13. Un método para desarrollar un perfil del gen colorrectal para categorizar una muestra de ARN de un individuo que sufre de cáncer colorrectal o que se sospecha que sufre de éste, caracterizado porque comprende determinar un grupo de genes asociados con un período de supervivencia libre de metástasis distante en muestras de ARN obtenidas de muestras de cáncer colorrectal que tienen una valina en la posición 600 de B-Raf.

14. Un microarreglo de nucleótido, caracterizado porque comprende un total de entre 100 y 12,000 moléculas de ácido nucleico, al menos dos de las moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar a un grupo de genes que comprenden al menos dos de los genes enumerados en la Tabla 1.

15. El uso de un arreglo de conformidad con la reivindicación 14 para diferenciar células de cáncer colorrectal con un potencial metastático bajo contra uno alto.