MX2011006024A - Proceso de fermentacion. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un proceso de fermentación en donde los frijoles de vainilla no curados maduros verdes son incubados con Bacillus subtilis en forma aislada para convertir la glucovainillina a vainillina mientras que forman consistentemente un aroma de vainilla bien equilibrado totalmente desarrollados sin malos olores.

Description

PROCESO DE FERMENTACION Campo de la Invención Se describe un proceso de fermentación el cual emplea Bacillus subtilis en donde se incuban los frijoles de vainilla verde (maduros pero no curados) con B. subtilis para convertir la glucovainillina a vainillina, y para convertir otros compuestos precursores de sabor de vainilla enlazados a glucosa a los compuestos de sabor de vainilla no enlazados a glucosa relevantes.

Antecedentes de la Invención Los extractos de vainilla los cuales comprenden vainillina y otros compuestos de sabor de vainilla son producidos por someter los frijoles de vainilla verde maduros a un proceso de curado y extracción. El proceso de curación libera vainillina a partir de la glucovainillina y forma los frijoles de vainilla enteros café negros comercialmente disponibles. Los frijoles curados pueden entonces ser extraídos para formar un extracto de vainilla líquido.

El periodo de curación usualmente dura muchas semanas o meses, implica controles de calidad repetidos y depende de las condiciones ambientales. Mientras el perfil sensorial/sabor de los extractos resultantes puede ser excelente, incluso bajo condiciones óptimas el rendimiento de vainillina es muy bajo y usualmente hasta aproximadamente REF.:2201 10 2.2% en peso seco de los frijoles de vainilla. Los procesos de curación y extracción más cortos conocidos en la técnica ya sea resultan en un rendimiento promedio similarmente bajo de vainillina, y/o el perfil sensorial no es totalmente desarrollado/menos complejo con un perfil de sabor desequilibrado, y/o contiene notas desagradables. Un ejemplo del proceso está en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica 3,663,238, la cual describe un proceso de curación/secado para frijoles de vainilla verde en un tanque de sudado que implica cortar frijoles verdes e incubarlos en 140°F (60°C) por 70-78 horas y secarlos con aire forzado en la misma temperatura para un contenido de humedad de 35-40%, y en una temperatura ambiente a un contenido de humedad final de 20-25%.

El periodo de curación largo de los procesos tradicionales emplea reacciones enzimáticas que ocurren en forma natural. Las reacciones enzimáticas en los frijoles de vainilla a partir de su precursor de glucovainillina a vainillina son creídas para ser provocadas principalmente por enzimas vegetales residuales, en particular enzimas de glucosidasa.

Notablemente, B subtilis no es previamente conocido para estar implicado en o ser útil para la producción de compuestos de sabor de vainilla en frijoles de vainilla. La bacteria es conocida simplemente para ser capaz de expresar varias enzimas, incluyendo, entre muchas otras, la enzima b-glucosidasa .

Sumario de la Invención Se proporciona un proceso de fermentación para producir compuestos de sabor de vainilla, en donde los frijoles de vainilla no curados maduros verdes son incubados con B. subtilis a partir de un cultivo de provisión o con B. subtilis precultivado .

El uso de B. subtilis en un proceso para producir vainillina a partir de glucovainillina y para convertir otros compuestos de sabor de vainilla precursores enlazados a glucosa a los compuestos de sabor de vainilla no enlazados a glucosa relevantes (incluyendo, sin limitación, ácido vainillínico, p-hidroxibenzaldehído, y ácido p-hidroxibenzoico) como se describe en la presente produce un rendimiento comparable o superior que los procesos tradicionales pero con un perfil sensorial complejo desarrollado totalmente más consistente y sin malos olores. Los malos olores con frecuencia presentes en los procesos tradicionales, sin desear unirse a alguna teoría, parecen ser provocados por al menos en parte por varias bacterias y hongos que están presentes en o en los frijoles de vainilla. La adición de B. subtilis reduce o evita los malos olores. El efecto puede ser incluso más mejorado por reducir la cuenta de microorganismos antes a la adición de B. subtilis .

Se proporciona lo siguiente: (1) Un proceso para fermentar frijoles de vainilla el cual comprende la incubación de frijoles de vainilla no curados con Bacillus subtilis en forma aislada, en donde la incubación con B. subtilis dura por aproximadamente 24 horas a aproximadamente 120 horas.

Por ejemplo, sin limitación, puede ser agregado B. ubtilis a los frijoles de vainilla a partir de un cultivo de rovisión de B. subtilis o como un precultivo de B. subtilis. (2) El proceso como se describe en la presente, incluyendo bajo (1) , en donde la incubación con B. subtilis es realizada en una temperatura de aproximadamente 40°C a aproximadamente 65°C. (3) El proceso como se describe en la presente, incluyendo bajo cualquiera de (1) y (2), en donde los frijoles de vainilla no curados son secados y reconstituidos con agua previo a la incubación con B. subtilis . (4) El proceso como se describe en la presente, incluyendo bajo cualquiera de (1) a (3) , en donde antes a la incubación con B. subtilis, se lavan los frijoles de vainilla no curados. (5) El proceso como se describe en la presente, incluyendo bajo cualquiera de (1) a (4), en donde después de la incubación con B. subtilis, se agregan una o más enzimas que comprenden una enzima beta- glucosidasa . (6) El proceso como se describe en la presente, incluyendo bajo cualquiera de (1) a (5) , en donde después de la incubación con B. subtilis, los frijoles de vainilla son secados a una baja humedad de aproximadamente 30% a 20% en temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 60°C. (7) El proceso como se describe en la presente, incluyendo bajo cualquiera de (1) a (6) , en donde se agrega un solvente al producto resultante para formar un extracto de vainilla. (8) El proceso como se describe en la presente, que incluye bajo cualquiera de (1) a (7), en donde la incubación con B. subtilis se realiza en un recipiente seleccionado del grupo el cual consiste de un tanque de sudado en donde los frijoles de vainilla no se les aplica movimiento, y un tanque agitado. (9) El proceso como se describe en la presente, que incluye bajo (8) , en donde la incubación con B. subtilis se realiza en un sistema cerrado de un tanque de sudado en donde los frijoles de vainilla no se les aplica movimiento y en donde el exudado a partir de los frijoles de vainilla está siendo reciclado. (10) El proceso como se describe en la presente, el cual incluye bajo cualquiera de (1) a (8) , en donde la incubación con B. subtilis se realiza en un sistema abierto. (11) El proceso como se describe en la presente, el cual incluye cualquiera de (1) a (10) , en donde B. subtilis se selecciona del grupo el cual consiste de B. subtilis subtilis , una cepa B. subtilis del tipo silvestre aislada de frijoles de vainilla, y la cepa de B . subtilis subtilis NRRL B-50118. (12) Un producto de frijol de vainilla fermentado en donde en su fermentación B. subtilis es proporcionado en forma aislada. (13) El producto de frijol de vainilla fermentado como se describe en la presente, incluyendo bajo (13), en donde se proporciona B. subtilis a partir de un cultivo de provisión o como un precultivo. (14) El producto de frijol de vainilla fermentado como se describe en la presente, incluyendo bajo (12), seleccionado del grupo que consiste de vainas de vainilla, vainas de vainilla parcialmente trituradas, vainas de vainilla trituradas, polvo de vainas de vainilla molidas, extracto de vainilla. (15) La cepa de B . subtilis subtilis NRRL B-50118.

Descripción Detallada de la Invención En la presente se descubre que la incubación con B . subtilis puede ser usada para asegurar un buen rendimiento de vainillina y proporcionar un perfil de sabor de vainilla complejo bien equilibrado consistentemente de alta calidad sin malos olores en los frijoles de vainilla y sus extractos resultantes. Sin desear unirse a alguna teoría, se cree en la presente que esto es debido a las enzimas microbianas que convierten la glucovainillina a vainillina (y otros compuestos de sabor de vainilla glucoprecursores enlazados a glucosa a los compuestos de sabor vainilla no enlazados a glucosa relevantes) a un grado significativo, en lugar de, o además de, las enzimas vegetales. Otra vez, sin desear unirse a alguna teoría, las propiedades antimibrobianas , antivirales y antifúngicas potenciales de B. subtilis sobre la variedad de microorganismos que ocurren naturalmente en o en frijoles de vainilla puede contribuir a reducir o evitar la formación de malos olores durante la fermentación. Alternativa o adicionalmente , el crecimiento de B. subtilis puede ser tan rápido en comparación con otros microorganismos naturalmente presentes - que los priva de su substrato necesario. Adicionalmente, B. subtilis es un microorganismo muy adaptable resistente que requiere poco y accionará en muchos medios mínimos bajo casi todas las condiciones, incluyendo condiciones aeróbicas y anaeróbicas .

- - Los frijoles de vainilla son incubados con B . subtilis bajo condiciones que permiten el crecimiento bacteriano hasta que se logra el grado deseado de degradación de glucovainillina a vainillina y otros compuestos de sabor de vainillina a partir de sus glucoprecursores . Para formar un extracto, puede ser agregado un solvente. El proceso es descrito en detalle posteriormente.

Hay actualmente tres cultivos principales del género vainilla que crecen globalmente, todos derivados de una especie originalmente encontrada en Mesoamérica: Vanilla planifolia (v. Planifolia, sinónimo V. fragrans) , que se hace crecer en Madagascar, Reunión y otras áreas tropicales a lo largo del océano Indico; V. tahitensis, que se hace crecer en el pacífico sur; y V. Pompona, encontrada en las Indias occidentales, Centro y Sudamérica. La mayoría de la vainilla mundial que es producida es la variedad V. Planifolia, la cual se hace crecer en una región pequeña de la nación africana occidental de Madagascar e Indonesia y la cual cuando se produce en Madagascar es más comúnmente conocida como vainilla de "Madagascar-Bourbon" .

Las especies de vainilla, incluyen, sin limitación, V. planifolia, V. tahitensis, V. pompona, e híbridos de estos u otras especies de plantas de vainilla, por ejemplo, sin limitación, híbridos de V. planifolia y V. pompona.

Los frijoles de vainilla requieren aproximadamente 6 a 9 meses para desarrollarse totalmente en la enredadera, etapa durante la cual los frijoles son verdes en color. En el final de la etapa de crecimiento los frijoles son todavía verdes con una punta amarilla pequeña y algunas veces referida como "amarillo de floración final" o "maduro", lo cual es la etapa en la cual se cosechan los frijoles verdes maduros. Cuando se cura tradicionalmente , cambian de verde a café. Un frijol de vainilla verde por lo tanto es un frijol no curado maduro .

Los frijoles de vainilla incubados con B. subtilis son frijoles no curados, es decir, frijoles que no han sido sometidos a un proceso para liberar vainillina a partir de la glucovainillina . Los frijoles no curados pueden ser frijoles verdes frescos, o frijoles "verdes" (no curados) que han sido secados y entonces reconstituidos con agua (los cuales son cafés en color) . Los últimos usualmente proporcionan un rendimiento de vainilla menor cuando se compara con los frijoles verdes que no han sido secados y reconstituidos. Los frijoles de vainilla pueden ser usados como frijoles enteros, o no molidos o forma molida. Los frijoles de vainilla pueden ser triturados por cualquier medio adecuado para llevarlos a piezas, por ejemplo, sin limitación, de aproximadamente 1-2 cm de largo. Cualquier herramienta adecuada o mecanismo puede ser empleado. Por ejemplo, los frijoles pueden ser cortados o triturados. Los cortes generalmente proceden transversalmente de los ejes largos de los frijoles aunque otras direcciones son posibles también.

Opcionalmente , los frijoles son lavados antes a la incubación con B. subtilis (por lo mismo reduciendo la cuenta microbiana inicial y reducir los microbios no deseados) que pueden ocurrir naturalmente en los frijoles. El lavado de los frijoles puede ser realizado en agua, en agua y detergente, o en solución de alcohol acuosa, y en una temperatura suficientemente alta por un tiempo suficientemente alto para reducir la cuenta microbiana. Por ejemplo, el lavado puede ser realizado en agua y detergente en temperatura ambiente (aproximadamente 20-30°C) , o en agua caliente (aproximadamente 60-85°C, dependiendo de la longitud de exposición, por ejemplo, aproximadamente 1 minuto en aproximadamente 85 °C, o aproximadamente 5 minutos en aproximadamente 60°C) , o en 70% de alcohol por aproximadamente 5 a 10 minutos.

Para incubación microbiana de los frijoles de vainilla, se usa Bacillus subtilis (B. subtilis) . B. subtilis es una bacteria gram positiva muy bien conocida y bien caracterizada encontrada comúnmente en tierra. Usualmente crece aeróbicamente, pero puede crecer anaeróbicamente también B. subtilis proporciona un rendimiento de vainillina muy buena que otras bacterias de Bacillus no parecen ser capaz de lograr. Un ejemplo de una subespecie muy adecuada de B. ' subtilis es B. subtilis subtilis y cepa de B. subtilis NRRL B-50118, depositado el 20 de marzo de 2008, en la colección de Cultivos de Patente ARS .

Pueden ser usadas otras cepas de B. subtilis subtilis o B. subtilis, en particular, por razones regulatorias , las cepas del tipo silvestre aisladas a partir de los frijoles de vainilla. Los aislamientos primarios de cepas del tipo silvestre pueden ser realizados como es bien conocido en la técnica, por ejemplo en agar de nutriente (peptona 5 g/1, extracto de res 3 g/1, agar 15 g/1, pH 6.8) o placas de agar J (triptona 5 g/1, extracto de levadura 15 g/1, K2HP04 3 g/1, glucosa 2 g/1, agar 20 g/1, pH 7.4).

Varios medios de crecimiento adecuados para B. subtilis son bien conocidos en la técnica. B. subtilis tiene pocos requerimientos para sus condiciones y medios de crecimiento, se hace crecer en un medio mínimo definido sin factores de crecimiento agregados. A. Demain (J Bacteriol . Mayo de 1958; 75(5): 517-722) describe algunos ejemplos de constituyentes adecuados que los medios mínimos deben incluir. Los medios mínimos son particularmente útiles para aislar cepas del tipo silvestre. Para cultivo, se usan usualmente medios nutrientes. Los medios nutrientes contienen una fuente de carbono (por ejemplo, sin limitación, glucosa), agua, varias sales, y una fuente de aminoácidos/nitrógeno. El agar nutriente y caldo nutriente (por ejemplo, el cual comprende como fuente de aminoácido/nitrógeno extracto de peptona y carne, en un pH neutral de aproximadamente 7) son adecuados para cultivar B. subtilis, por ejemplo, el medio LB es un medio estándar adecuado. Una temperatura de cultivo estándar es aproximadamente 30°C a aproximadamente 37°C.

Para un precultivo de B. subtilis, cualquier medio estándar adecuado puede ser usado.

Puede ser cultivado B. subtilis de acuerdo a condiciones de cultivo bien conocidas en una temperatura, pH y contenido de humedad adecuados. Las condiciones adecuadas incluyen, sin limitación, aproximadamente 25°C a aproximadamente 60 °C, con una temperatura óptima en aproximadamente 37°C, un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.5, por ejemplo, sin limitación, pH 5.5 a 6.5, un contenido de humedad de 55% o superior, y opcionalmente un medio para ajustar la presión osmótica. Cuando se incuba con los frijoles de vainilla, las mismas condiciones aplican excepto para una temperatura de cultivo superior a partir de aproximadamente 45°C a aproximadamente 65°C, por ejemplo, sin limitación, de aproximadamente 45°C a aproximadamente 60 °C, o de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C.

Opcionalmente, puede ser agregado oxígeno/suficiente aireación puede ser proporcionada, por ejemplo, sin limitación, por un ventilador, para reducir el crecimiento de las bacterias anaeróbicas no deseadas.

La incubación de los frijoles de vainilla con B. subtilis puede ser hecha en cualquier ambiente o recipiente adecuado, por ejemplo, sin limitación, en un tanque o tanque de sudado, por ejemplo como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 3,663,238.

El exudado ("sudado") de los frijoles de vainilla, por ejemplo en un tanque de sudado, puede opcionalmente ser reciclado, alternativamente, puede ser usado un sistema abierto. El recipiente puede opcionalmente ser agitado para proporcionar mezclado y/o aireación.

Por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 3,663,238, un recipiente de acero inoxidable es equipado con bandejas perforadas apiladas y proporcionado con un control de temperatura y un sistema de recirculación de exudado cerrado. El exudado ("sudado" de los frijoles calentados) es recolectado y puede contener bacterias derivadas de la superficie de los frijoles. El exudado fluye a través de las perforaciones/agujeros en las bandejas a través de todas las bandejas apiladas a una salida en el fondo del recipiente, y es recolectado y reintroducido a los frijoles a partir de la parte superior del recipiente para evitar el secado y para evitar la pérdida de los microorganismos. Los frijoles son colocados en el recipiente en un número de monocapas en las bandejas perforadas para permitir el aire en las bacterias. La recolección y/o reintroduceion del exudado es opcional y depende del grado del desarrollo de exudado.

Alternativamente, la incubación de los frijoles de vainilla con B. subtilis puede ser realizada en bolsas cerradas y venteadas, por ejemplo, sin limitación, bolsas de plástico, o en una caja, cuarto u otro ambiente contenido (por ejemplo en estantes), o incluso en un sistema abierto, por ejemplo, afuera expuesto al aire ambiente, con la condición de que el contenido de humedad del aire sea apropiadamente alto (aproximadamente 55% de humedad o superior) .

La temperatura de incubación es de aproximadamente 40°C a aproximadamente 65°C, por ejemplo, sin limitación, de aproximadamente 45° a aproximadamente 60 °C, o de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C.

Dependiendo del recipiente usado para incubación, y dependiendo de si se usa la agitación, puede haber un gradiente de temperatura en el recipiente y debe tenerse cuidado para asegurar no solamente una temperatura promedio adecuada sino también que la temperatura máxima no sea excedida significativamente por mucho, con el fin de evitar la esporulación y asegurar suficiente crecimiento o por lo menos proporciones de sobrevivencia de B. subtilis .

La duración de incubación de los frijoles de vainilla con B . subtilis dependerá de los varios parámetros incluyendo temperatura, pH, etc, y si se usa un precultivo o B. subtilis es agregado directamente a partir de un cultivo de provisión (el último requiere más tiempo) . La incubación debe ser detenida una vez que se alcanza el rendimiento de vainillina y compuesto de sabor de vainilla óptimos. El tiempo de incubación debe ser aproximadamente 24 horas a aproximadamente 120 horas. Usualmente 2 a 4 días son suficientes. La incubación más superior, especialmente en las temperaturas superiores, comenzará a degradar los compuestos de vainillina y otros sabores de vainilla, menor incubación especialmente en el final inferior del intervalo de temperatura y especialmente cuando los frijoles son estacionarios promocionará el crecimiento de hongos y otros microorganismos no deseables que pueden contaminar el producto y provocar los malos olores. La incubación más corta no permitirá una degradación completa de los glucósidos (glucovainillina y otros compuestos de sabor de vainilla enlazados a glucosa) y el producto no tendrá un perfil de sabor bien equilibrado totalmente desarrollado.

Después de la incubación con B. subtilis, los frijoles de vainilla pueden ser secados, o un extracto de vainilla puede ser formado- -directamente .

Secado Opcional Antes a la Extracción Cualquier método adecuado puede ser usado para secar los frijoles a un contenido bajo en humedad de aproximadamente 30% a aproximadamente 20% en la temperatura de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 60°C. Los métodos adecuados incluyen, sin limitación, venteado secado al sol o en temperatura ambiente bien venteado, y secado en un horno venteado.

Para desarrollar además los compuestos de sabor de vainilla no precursor de glucosa/no vainillina parte del aroma que incluye la parte debido a las reacciones de Maillard, el secado lento usualmente dará mejores resultados. Un programa de secado adecuado es secar 2-5 días a aproximadamente 30% de humedad, entonces por 3 a 9 meses a aproximadamente 20 a aproximadamente 25% de humedad (almacenamiento en sacos venteados en un cuarto bien venteado para la etapa anterior) .

Para formar un extracto de vainilla, puede ser agregado un solvente al recipiente de incubación, por ejemplo, sin limitación, un tanque, para formar un extracto de vainilla. Los recipientes adecuados incluyen, sin limitación, un extractor cónico/tanque agitado, y un extractor de cuadro en donde los frijoles son estacionarios.

Después de la extracción, el extracto resultante puede ser concentrado o diluido como se desea. La temperatura de extracción no debe exceder un máximo de aproximadamente 45°C para evitar cualquier degradación parcial de vainillina u otros compuestos de sabor de vainilla.

Un extracto de vainilla consiste substancialmente de materia extractiva de frijoles de vainilla a partir de plantas de vainilla y opcionalmente un solvente. Por ejemplo, ciertos azúcares pueden ser agregados en algunos países. Los solventes incluyen, sin limitación, alcohol/etanol , y agua. Los solventes que son no grado alimento tienen que ser removidos o suficientemente reducidos en concentración para formar el producto final vendido al consumidor de acuerdo a los requerimientos regulatorios que difieren nacionalmente.

Opcionalmente, el solvente grado alimento puede ser agregado para ajustar la concentración o así llamado diluido del extracto de vainilla y producto como se desee.

Cualquier solvente capaz de llevar a la vainillina y/o sabores de vainilla adicionales en la solución puede ser usado. Los solventes útiles incluyen agua y alcoholes, incluyendo sin limitación alcoholes orgánicos. Los alcoholes orgánicos incluyen, sin limitación, alcandés que tienen hasta 4 átomos de carbono, por ejemplo, etanol, isopropanol, propanol, glicoles de peso molecular bajo y polioles incluyendo, sin limitación, propilenglicol , butilenglicol , o glicerina, o mezclas de los mismos.

Los solventes adecuados incluyen, sin limitación, los solventes de alcohol acuosos que contienen por lo menos un alcohol miscible con agua en las proporciones empleadas. El solvente de alcohol acuoso adecuado incluye, sin limitación, mezclas de etanol y agua, por ejemplo, etanol/agua (50:50).

Si se usa un solvente grado alimento no necesita ser removido después de esto, lo cual es más eficiente particularmente en las etapas de proceso finales. Los solventes grado alimento incluyen, sin limitación, etanol, agua, mezclas de etanol y agua, etanol/agua (50:50), y mezclas de los mismos. Otra alternativa puede ser extracción de fluido supercrítico .

Los solventes que no son grado alimento, o no grado alimento en todas las legislaciones o en todas las concentraciones para todos los productos finales, por ejemplo, sin limitación, hexano, etilmetilcetona, acetato de metilo, diclorometano, aceite de fusel, o mezclas de los mismos, tienen que ser ya sea removidos completamente o por lo menos removidos parcialmente (a una concentración baja específica que varía usualmente de acuerdo a las regulaciones nacionales alimentarias) para formar el producto final vendido al consumidor. El término "aceite de fusel" designa un líquido concentrado destilado obtenido en pequeñas cantidades como un subproducto de la fermentación alcohólica y destilación que consiste de una mezcla principalmente de alcoholes, como alcohol isopentílico, alcohol amílico, alcohol isobutílico, alcohol isopropílico, y alcohol propílico .

Opcionalmente, el extracto de vainilla resultante puede ser concentrado por al menos remover parcialmente el solvente .

Opcionalmente, cualquier glucovainillina residual (y otros compuestos de sabor de vainilla precursores enlazados a glucosa) en el producto resultante o extracto puede ser convertido a vainillina (o el compuesto de sabor de vainilla enlazado a no glucosa relevante) por agregar beta-glucosidasa (comercialmente disponible de varias fuentes incluyendo Biocatalysts Limited, Cardiff, UK) o una mezcla que contiene una enzima de beta-glucosidasa y opcionalmente enzimas adicionales. La cantidad de la enzima beta-glucosidasa depende de los parámetros de incubación incluyendo duración, temperatura, cantidad y concentración de substrato y de solvente. Mucha enzima no tendrá un beneficio adicional y puede introducir malos sabores. Si una mezcla de enzimas que contienen 5 unidades por g de beta-glucosidasa es usada, entonces una cantidad de enzima 0.005 a 0.2 veces el peso de carga de frijol de vainilla es usualmente suficiente, por ejemplo, sin limitación, 0.02 a 0.1, ó 0.035 a 0.15 veces.

Un solvente adecuado para usar en la incubación de enzimas incluye agua y mezclas de agua con otro solvente compatible con la enzima. Por ejemplo, el etanol debe ser menor a 25% para reacción enzimática óptima.

La enzima es incubada dentro de un intervalo de temperatura adecuado, por ejemplo, 20°C a 80°C ó 40°C a 60°C, por ejemplo, sin limitación, casi su temperatura óptima en aproximadamente 55°C a 60°C y mantenida en esta temperatura por un tiempo suficiente para convertir la glucovainillina al rendimiento de vainillina deseado. La agitación continua asegurará una temperatura y concentraciones constantes. Los volúmenes más pequeños pueden no requerir agitación.

El tiempo de incubación dependerá de la cantidad y concentración de la enzima y substrato, solvente presente, temperatura elegida, por ejemplo, sin limitación, 1 hora a 2 días o más. Usualmente, 24 horas son suficientes.

Preferentemente, la mezcla debe ser agitada durante la reacción enzimática para asegurar suficiente mezclado, temperatura constante en todo el recipiente de reacción, y acceso de la enzima al substrato.

Después de la incubación enzimática, opcionalmente , el extracto de vainilla puede ser concentrado y/o puede ser agregado solvente grado alimento como se describe anteriormente .

Los frijoles dé vainilla y sus extractos descritos en la presente proporcionan un perfil de sabor desarrollado totalmente y bien equilibrado que comprende los compuestos de sabor de vainilla principales. Los compuestos de sabor de vainilla principales incluyen, sin limitación, los compuestos fenólicos, compuestos de furano, compuestos de ácidos grasos, compuestos formados por reacción con etanol, y acetaldehído dietil acetal .

Los compuestos de sabor de vainilla fenólicos incluyen, sin limitación, acetovainillona alfa-etoxi-p-cresol, ácido benzoico, guaiacol, 4-metil-guaiacol, p-hidroxibenzaldehído, metilparabeno, vainillato de metilo, 2-metoxi -4 -vinilfenol-5-metoxivainillina, fenol, vainillina, ácido vainillico, alcohol de vainillina, éter etilo de vainillina, y p-vinilfenol .

Estos compuestos de sabor de vainilla fenólicos, en particular guaiacol, pueden estar presentes en una concentración baja de tal forma que no dominan, resultando en un sabor desequilibrado.

Los compuestos de sabor de vainillina de furano incluyen, sin limitación, 2-furfural, 2-furfurol 5- (hidroximetil) -2-furfural, 5 -metil -2 -furfural , 2-hidroxifuraneol , gamma-butirolactona (dihidro 2 ( 3H) - furanona .

Los compuestos de sabor de vainillina de ácidos grasos incluyen, sin limitación, ácido linoleico, y ácido palmítico .

Los compuestos de sabor de vainillina que son formados por la reacción con etanol incluyen, sin limitación, acetato de etilo, glicolito de etilo, lactato de etilo, linoleato de etilo, pirovato de etilo, levulinato de etilo y dietilsuccinato .

Ej emplos A menos que se indique otra cosa, los porcentajes son dados como peso/peso y todos los ingredientes y solventes son grado alimento. Los frijoles de vainilla son de plantas de Vanilla planifolia . Los extractos de vainilla anteriores usan la unidad "dilución" US, por ejemplo un extracto de vainilla de una dilución es uno el cual contiene la materia extractiva de la unidad de frijoles de vainilla (13.35 onzas (378.5 g) de vainas de vainilla con un contenido de humedad máximo de 25%) en un galón (4.54 1) US (35% de alcohol) del producto. De esta forma, un extracto de vainilla de diez diluciones es uno el cual contiene la materia extractiva de diez unidades de frijoles de vainilla por galón US de producto terminado de acuerdo a la FDA, título 21.

Ejemplo la Fermentación de frijoles de vainilla verdes con Bacillus subtilis Reducción de microbios residuales: Los frijoles verdes son expuestos a agua caliente (aproximadamente 85°C) por aproximadamente 1 a 4 minutos.

Los frijoles de vainilla verde son frijoles de vainilla verde frescos con un porcentaje de humedad que es usualmente aproximadamente 85% (peso/peso), o (ver el ejemplo Ib) frijoles de vainilla verde secos con humedad de menos de 10% (tan bajo como aproximadamente 5%, lo cual corresponde a frijoles secos completamente- el 5% de agua residual no puede ser removido por sol convencional o secado en horno) . El porcentaje de humedad es determinado usando un horno de infrarrojo (Moisture Analyzer, Computrac, Modelo Max-1000, por Arizona Instruments) y pesar los frijoles antes y después del secado.

B . subtilis subtilis en 0.9% de NaCl Un tubo de aproximadamente 1 g de un cultivo liofilizado de una cepa de B . subtilis subtilis NRRL B-50118, aislado de frijoles de vainilla y depositados el 20 de Marzo de 2008 con la Colección de cultivos de patente ARS, es disuelto en 20 mi de caldo nutriente estéril (Bacto™ caldo nutriente deshidratado por cultivo de microorganismos no demandantes, Difco, Laboratories Detroit, MI, USA, 8 g/1 de agua destilada) . Se incuba el cultivo en 37°C en 200 rpm por 2 a 3 días hasta que se desarrollan las esporas (las esporas son determinadas ópticamente con un microscopio) . 500 mi de caldo nutriente es inoculado con el total de este cultivo, el cultivo resultante es incubado en 37 °C por además 2 a 3 días hasta que se desarrollan las esporas. Las células son precipitadas por centrífuga y se vuelve a disolver el precipitado en 5 litros de NaCl al 0.9% estéril. 12 kg de frijoles de vainilla verde son cortados en piezas de 2 cm y se incuban por 1 hora en temperatura ambiente en 5 litros de B. subtilis subtilis en NaCl al 0.9% preparado como se describe anteriormente. Con estos frijoles expuestos a B. subtilis subtilis son llenados un recipiente de tanque de curación en 2 kg de frijoles/capa (para dar casi una monocapa) y 6 capas profundas en placas metálicas perforadas. El recipiente de tanque de curación (también conocido como tanque de sudado) es un recipiente de gran escala hecho a la medida como se describe por McCormick 1973 en la Patente de los Estados Unidos de Norteamericana 3,663,238. Los frijoles expuestos a B. subtilis son curados en una temperatura promedio de aproximadamente 50 °C por 72 horas, con una temperatura máxima de 60°C, no se recolecta el exudado .

El recipiente de tanque de curación es vaciado y los frijoles son dejados secar lentamente. Los frijoles de vainilla son secados con aire caliente en aproximadamente 50 °C hasta que 60% de humedad es alcanzado (por aproximadamente 12 horas) , entonces a 38% de humedad en 40°C (por aproximadamente 5 horas) , y en temperatura ambiente de aproximadamente 20°C hasta 30% de humedad (por aproximadamente 10-20 horas) .

Los frijoles de vainilla resultantes con contenidos de humedad de 25 a 30% (peso/peso) son empacados en bolsas de plástico y almacenados en temperatura ambiente evitando la exposición a luz solar por aproximadamente 3 meses.

Se extraen 1.59 kg (ó 3.5 libras) de frijoles de vainilla molidos y se concentran para dar 1 vez el peso de carga de frijol de vainilla del extracto resultante. Los frijoles de vainilla son extraídos cinco veces con 50/50 (peso/peso) de agua corriente y etanol 2.27 kg ó 5 libras de solvente por extracción. Se agrega el etanol para ajustar a aproximadamente 40% (v/v) de etanol (aproximadamente 0.3 veces el peso de carga de frijol de vainilla) para lograr un peso final del extracto de vainilla de diez diluciones resultante igual a 1 vez el peso de carga de frijol de vainilla.

Ejemplo Ib Fermentación de frijoles de vainilla verde rehidratados secado con Bacillus subtilis Preparación de frijoles de vainilla verde secos: Los frijoles de vainilla totalmente maduros verdes con una alta concentración (aproximadamente 6% en base al peso seco de frijoles; usualmente son usados los frijoles verdes tienen aproximadamente 16% de substancia seco, y después del secado, aproximadamente 90% de substancia seca) de glucovainillina determinado por inspección visual (frijol verde con punta amarilla) . Se realiza el secado por cortar los frijoles en piezas de aproximadamente 2.5 cm de longitud, y después de incubar en aproximadamente 85°C (80°C a 90°C) en un horno hasta que una concentración de humedad de menos de 10% es alcanzado. El porcentaje de humedad es determinado usando un horno de infrarrojo ( oisture Analyzer, Computrac, Model Max-1000, por Arizona Instruments) y pesar los frijoles antes y después del secado. El procedimiento de secado toma de aproximadamente 10 a 20 horas. Sin desear unirse a alguna teoría, esto puede contribuir para reducir microorganismos a un nivel aceptable de tal forma que la vainillina formada no es significativamente degradada durante la fermentación. 0.400 kg de los frijoles secos y molidos son rehumedecidos con 2.0 litros de B. subtilis subtilis en 0.9% de NaCl preparado como se describe en el ejemplo la en un tanque agitado. Se agita la mezcla resultante por 96 horas en 50°C. Se agrega etanol a esta mezcla para formar un extracto de vainilla simple duplicado y mezclado por 12 horas en 50°C después de se enfría a 25°C. Un extracto de vainilla sencillo igual a 0.1 veces el peso de carga de frijol de vainilla es preparado.

Ejemplo 2 Cepa de B. subtilis - caracterización en base a 16 S ARNr, identificación como B. subtilis subtilis La cepa B . subtilis subtilis NRRL B-50118, aislada de frijoles de vainilla de Vanilla planifolia cultivados en Madagascar y depositados el 20 de Marzo de 2008 con la Colección de cultivos de Patente ARS , es identificada por secuenciación de 16S ARNr sobre 500 pb como a continuación.

El gen 16S ARNr es amplificado por PCR a partir de ADN genómico aislado de colonias bacterianas puras. Los cebadores usados para la amplificación corresponde a posiciones de E. coli 005 y 531 (> 500 pb de empaque) . Los productos de amplificación son purificados a partir de cebadores en exceso y dNTP usando membranas de corte de peso molecular Microcon 100 (Millipore) y se checa para calidad y cantidad por correr una porción de los productos en un gel de agarosa.

La secuenciación de ciclo de los productos de amplificación 16S ARNr es realizada usando AmpliTaq FS DNA polimerasa y terminadores de tinte de dRhodamin. Los terminadores etiquetados con tinte en exceso son removidos de las reacciones de secuenciación usando una columna de giro Sephadex G-50. Los productos son recolectados por centrifugación, secados bajo vacío y congelados en -20°C hasta que sean fáciles de cargar. Las muestras son suspendidas en una solución de formamida/dextranoazul/EDTA y desnaturalizados antes a la carga. Las muestras son llevadas a electroforesis en un secuestrador de ADN ABI Prism 377. Se analiza los datos usando edición de Applied Biosystems DNA y software de ensamble y comparaciones de secuencia son obtenidos usando el software Microseq.

La secuencia analizada muestra un 0% de desacoplamiento (ó 100% de acoplamiento) sobre el analizado >500 pb para B. subtilis subtilis.

Ejemplo 3 Evaluación Sensorial 0.15 mi de dilución decimal del ejemplo la y 1 mi de los extractos de vainilla de una dilución de ejemplo Ib y como control extracto de dilución decimal y una dilución de frijoles de vainilla curados tradicionalmente comercialmente disponible (sometidos a un proceso de curación estándar sobre varios meses) son agregados a 100 mi de leche edulcorada (5% de sacarosa) y comparado en una evaluación sensorial por panelistas entrenados.

Los panelistas entrenados comparan las muestras y el control .

Todos los panelistas notan un perfil de vainilla bien equilibrado muy limpio sin malos olores y una nota vainillina muy fuerte en la muestra la, lo cual es mucho más fuerte que en el extracto de vainilla de dilución decimal estándar. El impacto de la vainillina es inferior en la muestra Ib pero los panelistas encuentran el edulcorante de muestra.

Los panelistas encuentran que todas las muestras tienen un aroma de vainilla bien equilibrado bien desarrollado.

Ejemplo 4 Perfil de Sabor Consistente Se producen 5 lotes como se describe en el ejemplo la, con la misma cantidad y concent ación de B. subtilis , pero con variaciones ligeras en temperatura de incubación (40°C a 65°C) y longitud, o etapas de lavado (calentamiento o enjuague con 70% de alcohol) .

Los extractos de vainilla resultantes son probados por 5 panelistas entrenados.

Las muestras son evaluadas en base a una escala de preferencia 1-10, con una referencia de control de extracto de frijol de vainilla bourbon de alta calidad ( tradicionalmente curado) con una concentración de por lo menos 1.5%, buen sabor de vainilla y sin malos olores detectables (8) .

Los extractos de vainilla de las fuentes comerciales ya sea curados tradicionalmente puede estar en el intervalo de 1 (por lo menos preferido, sin sabor de vainilla de cuerpo completo, perfil de sabor desequilibrado, presencia de notas de frijol, verdes, ácido graso, mohoso o ahumado) a 10 (sabor de vainilla perfectamente equilibrado con baja concentración de malos olores fenólicos/de guaiacol, y sin presencia de cualesquiera malos olores) . Un extracto de vainilla comercialmente disponible de buena calidad usualmente está en el intervalo de 5 a 8. Los extractos de vainilla formados no a través de curado tradicional sino a través de varios procesos alternativos se comportan significativamente menos y necesitan ser mezclados con extractos de mejor calidad para ventas comerciales .

A pesar de que los lotes varían ligeramente en temperatura etc, todos los 5 lotes caen dentro de un intervalo estrecho en el extremo superior de la escala 1-10 (8-10), demostrando una calidad de sabor de vainilla consistentemente alta.

Ejemplo 5 Efecto de carencia de secado/ temperatura y concentración de B. subtilis Se prepara un extracto de frijol de vainilla como se describe en el ejemplo la. Se compara con un extracto formado de frijoles no secos curados naturalmente en 20 a 25°C (temperatura ambiente) en la enredadera y sin B. subtilis agregada aparte de la población bacteriana que se encuentra en forma natural. Se realiza la evaluación sensorial como se describe en el ej emplo 4.

El extracto del ejemplo 1 clasifica en 9, los frijoles curados naturalmente en 1 (a pesar de que tienen una alta concentración de vainillina de 3%) .

Ejemplo 6 Conversión de Compuestos Precursores de Sabor de Vainilla a sabor de Vainila por B. subtilis Se agrega glucovainillina a un cultivo de cepa de B . subtilis subtilis NRRL B-50118, aislado de frijoles de vainilla y depositado el 20 de marzo de 2008 en la Colección de cultivos de patente ARS . Se prepara el cultivo B. subtilis en caldo nutriente (caldo nutriente Bacto™ deshidratado por cultivo de microorganismos no demandantes, Difco, Laboratories Detroit, MI, USA, 8 g/1 de agua destilada) y crecido en una OD600 de 0.6-2.0 antes a la adición de glucovainillina .

Después de la adición de la glucovainillina, el cultivo de B. subtilis es incubado por 120 horas en una temperatura de 37°C.

Las muestras son tomadas como se indica en la tabla posterior para detectar vainillina y varios intermediarios de la conversión de glucovainillina a vainillina.

Los resultados son indicados en la tabla posterior. compuesto lh 2h 5h 7h 9h 26h 48h 120h [ppra] [ppm] [ppm] [ppm] [ppm] [ppm] [ppm] [ppm] Gluco3300 3200 3000 2900 1300 100 0 0 vainillina Guaiacol 1.35 1.90 6.48 14.3 306 139.6 207 295 Ácido 0 0 0 0 20.2 20.9 27.3 19.0 benzoico 4-metil- 0.23 0.10 0.07 0.07 2.97 10.2 13.3 25.0 guaiacol Alcohol 55.3 18.8 20.2 35.4 31.3 107.2 192.9 144. S vainillilo Ácido 0 142 141 163 200 200 300 800 vainillico vainillina 50 80 200 210 40 80 70 30 La glucovainillina es digerida completamente a vainillina dentro de 26 horas. La concentración de vainillina se incrementa a 210 ppm en 7 horas, y entonces disminuye otra vez. La concentración de 4 -metilguaiacol , ácido benzoico, alcohol vainillilo y ácido vainillico se incrementa relativa y constantemente sobre el tiempo de medición, excepto para algunas fluctuaciones menores, especialmente para las concentraciones menores o superiores (por ejemplo guaiacol y alcohol vainillilo) .

En un segundo experimento, la misma cepa de B. subtilis es- incubada como se describe anteriormente con el glucósido de p-glucobenzaldehído .

El fenol puede ser formado a partir- de p-glucobenzaldehído (p-GBA) enzimáticamente , por ejemplo por beta-glucosidasa lo cual forma p-hidroxibenzaldehído (p-HBA) , y entonces p-hidroxibenzaldehídodeshidrogenasa lo cual forma ácido p-hidroxibenzoico (p-HBAc) , y en la última etapa p- hidroxibenzoatodescarboxilasa lo cual forma fenol.

El caldo de fermentación es analizado en intervalos regulares por cromatografía de líquidos de alta resolución /HPLC (no volátiles), o cromatografía de gases/GC (volátiles, fenol) como se indica en la tabla posterior.

Los resultados son indicados en la tabla posterior Los resultados muestran que sobre el paso del tiempo la concentración del fenol se incrementa, mientras que p-glucobenzaldehido disminuye rápidamente a 0 dentro de 24 horas (excepto para un punto de medición) . Al mismo tiempo los intermediarios (p-hidroxibenzaldehído y ácido p- hidroxibenzoico) han formado, y con formación continua de fenol, p-HBA disminuye otra vez. Las mediciones del fenol analizadas por GC no son directamente comparables pero muestran que el fenol se forma e incrementa al paso del tiempo, mientras que sus precursores e intermediarios disminuyen.

Aunque los procesos y productos han sido descritos arriba en conexión con ciertas modalidades ilustrativas, es para ser entendido que otras modalidades similares pueden ser usadas o modificaciones y adiciones pueden ser hechas a las modalidades descritas para realizar la misma función. Además, todas las modalidades descritas no son necesariamente alternativas, ya que varias modalidades pueden ser combinadas para proporcionar las características deseadas. Las variaciones pueden ser hechas por un experto ordinario en la técnica sin alejarse del espíritu y alcance de la descripción. Por lo tanto, los procesos y productos no deben ser limitados a cualquier modalidad sencilla, sino más bien construidos en amplitud y alcance de acuerdo con la descripción de las reivindicaciones anexadas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso para fermentar los frijoles de vainilla caracterizado porque comprende la incubación de frijoles de vainilla no curados con Bacillus subtilis en forma aislada, en donde la incubación con B. subtilis dura de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 120 horas.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación con B. subtilis se realiza en una temperatura de aproximadamente 40°C a aproximadamente 65°C.

3. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque los frijoles de vainilla no curados son secados y reconstituidos con agua previos a la incubación con B. subtilis .

4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque antes de la incubación con B. subtilis, los frijoles de vainilla no curados son lavados .

5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque después de la incubación con B . subtilis, son agregadas una o más enzimas que comprenden una enzima beta-glucosidasa .

6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque después de la incubación con B. subtilis, los frijoles de vainilla son secados a una baja humedad de aproximadamente 30% a 20% en temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 60°C.

7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se agrega un solvente al producto resultante para formar un extracto de vainilla .

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la incubación con B . subtilis es realizada en un recipiente seleccionado del grupo que consiste de un tanque de sudado en donde los frijoles de vainilla son estacionarios, y un tanque agitado .

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la incubación con B. subtilis es realizado en un sistema cerrado de un tanque de sudado en donde los frijoles de vainilla son estacionarios y en donde el exudado de los frijoles de vainilla se reciclan.

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la incubación con B . subtilis es realizada en un sistema abierto .

11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque B. subtilis es seleccionado del grupo que consiste de B. subtilis subtilis, una cepa de B . subtilis del tipo silvestre aislada a partir de frijoles de vainilla, y cepa de B. subtilis subtilis NRRL B-50118.

12. Un producto de frijol de vainilla fermentado caracterizado porque en su fermentación se proporciona B. subtilis en forma aislada.

13. El producto de frijol de vainilla fermentado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque B. subtilis es proporcionado a partir de un cultivo de provisión o como un precultivo.

14. El producto de frijol de vainilla fermentado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque se selecciona del grupo el cual consiste de vainas de vainilla, vainas de vainilla parcialmente trituradas, vainas de vainilla trituradas, polvo de vaina de vainilla molido, extracto de vainilla.

15. La cepa de B . subtilis subtilis NRRL B-50118.