MX2011005944A

MX2011005944A - Peptidos de epitope wdrpuh y vacunas que los contienen.

Info

Publication number: MX2011005944A
Application number: MX2011005944A
Authority: MX
Inventors: Takuya Tsunoda; Ryuji Ohsawa; Sachiko Yoshimura; Tomohisa Watanabe
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2008-12-05
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2011-07-28
Also published as: AU2009323523A1; KR101705102B1; ZA201104890B; RU2514386C2; TWI539160B; CA3031126A1; KR20110099018A; CN102307891A; BRPI0922844A2; NZ605799A; CA2745408A1; CN102307891B; EP2370454A4; US9745343B2; EP4047009A3; TWI500932B; US20130315942A1; IL212945A0; JP2012510794A; EP3219720A3

Abstract

La presente invención proporciona péptidos que contienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61, así como péptidos que contienen las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente en las cuales 1, 2, o varios aminoácidos son substituidos, eliminados, insertados o agregados, pero todavía tienen la capacidad de inducción de la célula T citotóxica. La presente invención también proporciona fármacos para el tratamiento o prevención de tumores, cuyos fármacos contienen dichos péptidos. Los péptidos de la presente invención también pueden ser utilizados como vacunas.

Description

PÉPTIDOS DE EPÍTOPE WDRPUH Y VACUNAS QUE LOS CONTIENEN Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de las Solicitudes de Patente Provisionales Norteamericanas Nos. 61/200,962, presentada en Diciembre 5, 2008, y 61/209,704, presentada en Marzo 9, 2009, cuyo contenido completo está incorporado a la presente descripción como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de la terapia del cáncer. En particular, la presente invención se refiere a péptidos novedosos que son extremadamente efectivos como vacunas contra el cáncer, y fármacos para el tratamiento y prevención de tumores.

Antecedentes de la Invención Se ha demostrado que los linfocitos CD8 T citotóxicos positivos (CTLs) reconocen péptidos de epítopes derivados de los antígenos asociados con el tumor (TAAs) encontrados en el complejo principal de histocompatibilidad de las moléculas clase I (MHC), y luego exterminan las células del tumor. Debido al descubrimiento de que la familia del antígeno del melanoma (MAGE) como el primer ejemplo de TAAs, muchos otros TAAs han sido descubiertos, principalmente a través de métodos inmunológicos (Boon T, Int J Cáncer 1993 Mayo 8, 54(2): páginas 177 a 180; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Marzo 1, 183(3): páginas 725 a 729). Algunos de estos TAAs están pasando actualmente por el desarrollo clínico como objetivos inmunoterapéuticos.

La identificación de nuevos TAAs, con capacidad de inducir respuestas inmunes potentes y específicas antitumor, garantiza el desarrollo adicional y la aplicación clínica de las estrategias de vacunas de péptidos para diferentes tipos de cáncer (Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Oct 16, 88(20): páginas 1442 a 1455; Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Jul 1, 59(13): páginas 3134 a 3142; Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999 Nov 1, 59(21): páginas 5554 a 5559; van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 Mayo 1, 156(9): páginas 3308 a 3314; Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Oct 15, 57(20): páginas 4465 a 4468; Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Ene 18, 80(2): páginas 169 a 172; Kikuchi M y asociados, Int J Cáncer 1999 May 5, 81(3): páginas 459 a 466; Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81 (3): páginas 387 a 394). Hasta la fecha, han existido varios reportes de ensayos clínicos que utilizan estos péptidos derivados del antígeno asociado con el tumor. Desafortunadamente, solamente una cantidad baja de respuesta del objetivo ha sido observada en estos ensayos de vacuna contra el cáncer, por ejemplo, (Belli F y asociados, J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): páginas 4169 a 4180; Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Oct, 188: páginas 33 a 42; Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Sep, 10(9): páginas 909 a 915).

Como un objetivo para la inmunoterapia, los TAAs indispensables para la proliferación y sobrevivencia de las células cancerosas son adecuados, debido a que el uso de dichos TAAs pueden minimizar el riesgo de escape inmune bien descrito de las células cancerosas que se puede atribuir a la eliminación, mutación, o desactivación de los TAAs como una consecuencia de una selección inmune conducida terapéuticamente.

Los genes WDRPUH fueron identificados como una proteína de repetición novedosa WD que es activada en el carcinoma hepatocelular a través del perfil de expresión del gen utilizando una microadaptación de cADN del tamaño del genoma que contiene 23,040 genes (Silva y asociados, Neoplasia 2005 Abr;7(4): páginas 348 a 355, el documento WO 2003/104276). Las proteínas que contienen la repetición WD han sido reportadas que juegan roles cruciales en un amplio rango de funciones fisiológicas, incluyendo la transducción de señal, el procesamiento de ARN (Bjorn y asociados, Mol Cell Biol. 1989 Sep; 9(9): páginas 3698 a 3709), el remodelado del citoesqueleto (Vaisman y asociados, Mol Gen Genet. 1995 Abr 20; 247(2): páginas 123 a 136), la regulación del tráfico vesicular (Pryer y asociados, J Cell Biol. 1993 Feb; 120(4): páginas 865 a 875), y la división de células (Feldman y asociados, Cell. 1997 Oct 17; 91(2): páginas 221 a 230). El análisis Northern blot demostró que el gen WDRPUH era sobre-expresado en un nivel significativamente alto en la gran mayoría del carcinoma hepatocelular, pero que no era expresado en órganos normales excepto en los testículos. Además, la supresión de la expresión de WDRPUH por el siARN mostró inhibir de manera importante el crecimiento de las líneas de célula del carcinoma hepatocelular humano (Silva y asociados, Neoplasia 2005 Abr; 7(4): páginas 348 a 355, documento WO 2003/104276).

Lista de Referencias Literatura de Patentes [LPT 1] Documento WO 2003/104276 Literatura que no son Patentes [LNP 1] Boon T, Int J Cáncer 1993 Mayo 8, 54(2): páginas 177 a 180 [LNP 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): páginas 725 a 729 [LNP 3] Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Oct 16, 88(20): páginas 1442 a 455 [LNP 4] Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Jul 1, 59(13): páginas 3134 a 3142 [LNP 5] Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999 Nov 1, 59(21): páginas 5554 a 5559 [LNP 6] van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 Mayo 1, 156(9): páginas 3308 a 3314 [LNP 7] Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Oct 15, 57(20): páginas 4465 a 4468 [LNP 8] Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Ene 18, 80(2): páginas 169 a 172 [LNP 9] Kikuchi M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): páginas 459 a 466 [LNP 10] Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): páginas 387 a 394 [LNP 11] Be I i i F y asociados, J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): páginas 4169 a 4180 [LNP 12] Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Oct, 188: páginas 33 a 42 [LNP 13] Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Sep, 10(9): páginas 909 a 915 [LNP 14] Silva y asociados, Neoplasia 2005 Abr; 7(4): páginas 348 a 355 [LNP 15] Bjorn y asociados, Mol Cell Biol. 1989 Sep; 9(9): páginas 3698 a 3709 [LNP 16] Vaisman y asociados, Mol Gen Genet. 1995 Abr 20; 247(2): páginas 123 a 136 [LNP 17] Pryer y asociados, J Cell Biol. 1993 Feb; 120(4): páginas 865 a 875 [LNP 18] Feldman y asociados, Cell. 1997 Oct 17; 91(2): páginas 221 a 230 Breve Descripción de la Invención La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de objetivos adecuados para la inmunoterapia. Debido a que los TAAs generalmente son percibidos por el sistema inmune como "idénticos", y por lo tanto con frecuencia no tienen una inmunogenicidad innata, el descubrimiento de objetivos apropiados es de extrema importancia. Como se observó anteriormente, reconociendo que el WDRPUH (SEQ ID No: 64 codificado por el gen del GenBank Acceso No. NM_145054 (SEQ ID No: 63)) ha sido identificado como activado en el tejido del cáncer del carcinoma hepatocelular, el WDRPUH es un objetivo candidato para la inmunoterapia.

La presente invención está basada, por lo menos en parte, en la identificación de péptidos del epítope específico de los productos del gen de WDRPUH los cuales poseen la capacidad de inducir los CTLs específicos para el WDRPUH. Como se explicará con mayor detalle más adelante, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un donante sano fueron estimuladas utilizando los péptidos candidatos de enlace HLA-A*2402 o HLA-A*0201 derivados de WDRPUH. Las líneas CTL con citotoxicidad específica contra las células objetivo HLA-A24 o HLA-A2 positivo pulsadas con cada uno de los péptidos candidatos entonces fueron establecidas. El resultado demostró que los péptidos son péptidos del epítope HLA-A24 o HLA-A2 restringido que pueden inducir respuestas inmunes potentes y específicas contra células que expresan el gen WDRPUH en la superficie. Además, indicaron que el gen WDRPUH es fuertemente inmunogénico y los epítopes del mismo son objetivos efectivos para la inmunoterapia del tumor.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar péptidos aislados que se enlazan al antígeno HLA, cuyos péptidos consisten del gen WDRPUH (SEQ ID No: 64) o un fragmento del gen WDRPUH. Dichos péptidos se espera que tengan una capacidad de inducción de CTL y puedan ser utilizados para inducir CTLs ex vivo o para la administración a un sujeto para inducir respuestas inmunes contra cánceres tales como el carcinoma hepatocelular. Los péptidos pueden ser nonapéptidos o decapéptidos preferentemente consistentes de la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61, las cuales muestran una capacidad de inducción de CTL fuerte.

Además, la presente invención contempla péptidos modificados, que tienen una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 en donde uno, dos o más aminoácidos son substituidos, insertados, eliminados o agregados, siempre que los péptidos modificados retengan la capacidad de inducción del CTL original.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los péptidos de la presente invención. Estos polinucleótidos pueden ser utilizados para inducir células que expresan el antígeno (APCs) con la capacidad de inducción del CTL o para la administración a un sujeto para inducir una respuesta inmune contra los péptidos presentes y por lo tanto finalmente contra los cánceres.

Cuando son administrados a un sujeto, los péptidos de la presente invención son presentados en la superficie de los APCs y luego inducen el envío al objetivo de CTLs de los péptidos respectivos. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar agentes que contienen cualquiera de los péptidos o polinucleótidos de la presente invención para inducir los CTLs. Estos agentes que contienen cualquiera de los péptidos o polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para el tratamiento y/o la profilaxis de cánceres, tales como el carcinoma hepatocelular, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos. Por lo tanto, todavía es otro objeto de la presente invención proporcionar agentes farmacéuticos para el tratamiento y/o la profilaxis de cánceres, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo, la cual contiene cualquiera de los péptidos o polinucleótidos de la presente invención. Los agentes o agentes farmacéuticos de la presente invención también pueden contener, como el ingrediente activo, APCs o exosomas los cuales presentan cualquiera de los péptidos actuales en vez de o además de los péptidos actuales o polinucleótidos.

Los péptidos o polinucleótidos de la presente invención tienen la capacidad de inducir APCs que están presentes, en su superficie, un complejo de un antígeno HLA y el péptido presente. Por ejemplo, la inducción se puede lograr poniendo en contacto los derivados de APCs de un sujeto con un péptido de la presente invención o introduciendo un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención dentro de los APCs. Dichos APCs tienen alta capacidad de inducción de CTL contra los péptidos objetivo y son útiles para la inmunoterapia del cáncer. Por lo tanto, es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para inducir APCs con capacidad de inducción de CTL y APCs obtenidos por dichos métodos.

Todavía es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para inducir CTLs, cuyos métodos contienen el paso de co-cultivar las células CD8 positivas con APCs o exosomas que presentan un péptido de la presente invención en su superficie o el paso de introducir un polinucleótido en una célula T, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido de una subunidad del receptor de célula T (TCR) que se enlaza a un péptido de la presente invención. Los CTLs obtenidos por los métodos son útiles para el tratamiento y/o la prevención de cánceres, tales como el carcinoma hepatocelular. Por lo tanto, es un objeto adicional de la presente invención proporcionar CTLs obtenidos por cualquiera de los métodos actuales.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos para inducir una respuesta inmune contra el cáncer, cuyos métodos contienen el paso de administrar un agente que contiene cualquiera de los polipéptidos WDRPUH, polinucleótidos que codifican los polipéptidos WDRPUH, exosomas o los APCs que presentan polipéptidos WDRPUH de la presente invención.

La presente invención encuentra uso para aplicación para cualesquiera enfermedades relacionadas con la sobre-expresión del gen WDRPUH, incluyendo pero sin limitarse a, cáncer, particularmente carcinoma hepatocelular.

Deberá quedar entendido que ambas la breve descripción de la invención anterior y la siguiente descripción detallada son de modalidades ejemplificadas, y no restringen la presente invención u otras modalidades alternativas de la invención.

Breve Descripción de los Dibujos Varios aspectos y aplicaciones de la presente invención se podrán apreciar por los expertos en la técnica tomando en consideración la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y las modalidades preferidas siguientes: [Figura 1]. La figura 1 incluye una serie de fotografías que ilustran los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-gama en los CTLs que fueron inducidos con péptidos derivados del WDRPUH. Los CTLs en los depósitos números #3 y #6 estimulados con WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID No: 1) (a), #8 con WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2) (b), #2 y #6 con WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID No: 3) (c), #1, #2 y #5 con WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID No: 4) (d), #2, #3, #4, #6, #7 y #8 con WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID No: 16) (e) y #5, #6 y #8 con WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID No: 17) (f) mostraron una producción potente de IFN-gama comparada con el control, respectivamente. Las células en los depósitos indicados con un cuadro rectangular fueron expandidas para establecer las líneas CTL. En la figura, " + " indica que las células de los depósitos fueron impulsadas con péptidos apropiados, y "-" indica que las células no han sido pulsadas con péptidos algunos.

[Figura 2]. La figura 2 incluye una serie de gráficas de línea que ilustran la producción de IFN-gama de las líneas CTL estimuladas con WDRPU H-A24-9-40 (SEQ ID No: 1) (a), WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2) (b), WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID No: 3) (c), WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID No: 4) (d), WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID No: 16) (e) y WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID No: 17) (f) con el ensayo de ELISA de IFN-gama.

Las líneas CTL establecidas mediante el estímulo con cada uno de los péptidos mostraron una producción de IFN-gama potente comparada con el control. En la figura, " + " indica que las células de los depósitos fueron pulsadas con péptidos apropiados, y "-" indica que las células no habían sido impulsadas con péptidos algunos.

[Figura 3]. La figura 3 está compuesta de una gráfica de línea que ilustra la actividad específica del CTL contra las células objetivo que expresan exogenamente el gen WDRPUH y HLA-A*2402. Las células COS7 transfectadas con solamente HLA-A*2402 o con solamente el gen WDRPUH de longitud completa fueron preparadas como control. La línea CTL establecida con WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2) mostró una actividad específica del CTL contra las células COS7 transfectadas con ambos WDRPUH y HLA-A*2402 (pastilla negra). En contraste, la actividad no importante específica del CTL se detectó contra las células objetivo que expresan ya sea HLA-A*2402 (triángulo) o WDRPUH (círculo).

[Figuras de la 4a a la 4h]. Las figuras de la 4a a la 4h incluyen una serie de fotografías que ilustran los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-gama en los CTLs que fueron inducidos con péptidos derivados de WDRPUH. Los CTLs en los depósitos números #2 y #7 estimulados con WD RP U H-A2-9-39 (SEQ ID No: 30) (a), #2 con WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID No: 31) (b), #3 con WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID No: 34) (c), #6 con WDRPUH- A2-9-237 (SEQ ID No: 36) (d), #4 con WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID No: 37) (e), #4 con WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID No: 40) (f), #2 y #8 con WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID No: 41) (g), #5 con WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID No: 45) (h) mostraron una producción potente de IFN-gama comparados con el control, respectivamente. Las células en los depósitos indicaron que un cuadro rectangular era expandido para establecer las líneas CTL. En la figura, " + " indica que las células en el depósito fueron impulsadas con péptidos apropiados, y "-" índica que las células no habían sido impulsadas con péptidos algunos.

[Figuras de la 4¡ a la 41]. Las figuras de la 4i a la 41 incluyen una serie de fotografías que ilustran el ensayo ELISPOT de IFN-gama en CTLs que inducen los péptidos derivados de WDRPUH. Los CTLs en los depósitos números #2 estimulados con WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID No: 49) (i), #6 con WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID No: 55) (j), #7 con WDRPU H-A2-10-287 (SEQ ID No: 57) (k) y #6 con WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID No: 61) (I) mostraron la producción potente de IFN-gama comparada con el control, respectivamente. Las células en los depósitos indicados con un cuadro rectangular fueron expandidas para establecer las líneas CTL. En la figura, " + " indica que las células de los depósitos fueron impulsadas con péptidos apropiados, y "-" indica que las células no habían sido impulsadas con péptidos algunos.

[Figura 5]. La figura 5a y 5b están compuestas de gráficas de líneas que ¡lustran la producción de IFN-gama de las líneas CTL estimuladas con SEQ ID No: 30 (a) y SEQ ID No: 34 (b) detectadas por el ensayo de ELISA de IFN-gama. Las líneas CTL establecidas por el estímulo con cada péptido mostraron una producción potente de IFN-gama comparada con el control. En la figura, " + " indica que las células de los depósitos fueron impulsadas con péptidos apropiados, y "-" indica que las células no habían sido impulsadas con péptidos algunos. Las figuras 5c y 5d ilustran la producción de IFN-gama en los clones de CTL establecidos limitando la dilución de las líneas CTL estimuladas con SEQ ID No: 30 (c) y SEQ ID No: 34 (d). Los resultados ilustrados aquí demuestran que los clones de CTL establecidos mediante el estímulo con SEQ ID No: 30 (c) y SEQ ID No: 34 (d) mostraron una producción potente de IFN-gama comparada con el control. En la figura, " + " indica que las células de los depósitos fueron impulsadas con la SEQ ID No: 30 (c) y la SEQ ID No: 34 (d) y "-" indica que las células no habían sido impulsadas con péptidos algunos. La figura 5e está compuesta de una gráfica de línea que ilustra la actividad específica de CTL contra las células objetivo que expresan de manera exógena el gen WDRPUH y HLA-A*0201. Las células COS7 transfectadas con solamente HLA-A*0201 o con solamente un gen WDRPUH de longitud completa fueron preparadas como controles. El clon CTL establecido con WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID No: 34) mostró una actividad específica de CTL contra las células C0S7 transfectadas con ambos WDRPUH y HLA-A*0201 (pastilla negra). En contraste, la actividad no importante específica de CTL fue detectada contra las células objetivo que expresan ya sea HLA-A*0201 (triángulo) o WDRPUH (círculo).

Descripción Detallada de la Invención Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos en la práctica o prueba de las modalidades de la presente invención, los métodos, aparatos, y materiales preferidos se describirán a continuación. Sin embargo, antes de que sean descritos los presentes materiales y métodos, deberá quedar entendido que la presente invención no está limitada a tamaños, formas, dimensiones, materiales, metodologías, protocolos, etc., particulares aquí descritos, ya que estos pueden variar de acuerdo con la experimentación de rutina y la optimización. También deberá quedar entendido que la terminología utilizada en las descripciones es para propósitos de describir las versiones particulares de las modalidades solamente, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención el cual será limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

La descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente mencionadas en esta descripción está incorporada específicamente como referencia en su totalidad al presente documento. Sin embargo, nada de lo aquí expresado deberá ser interpretado como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a dichas descripciones precedentes en virtud de la invención anterior.

En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones, será la que controle. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

I. Definiciones Las palabras "un", "una", y "el/la" como se usan en la presente descripción significan "por lo menos uno" a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción para referirnos a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos que aplican a los polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es/son un residuo modificado, o un residuo que no ocurre de manera natural, tal como una imitación artificial química de un aminoácido que ocurre de manera natural, así como a los polímeros de aminoácidos que ocurren de manera natural.

El término "aminoácido" como se usa en la presente descripción se refiere a aminoácidos que ocurren de manera natural o sintéticos, así como análogos de aminoácidos e imitaciones de aminoácidos que funcionan de un modo similar a los aminoácidos que ocurren de manera natural. Los aminoácidos que ocurren de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos modificados después de la traducción en las células (por ejemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, y O-fosfoserina). La frase "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un alfa carbono enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino, y un grupo R) como un aminoácido que ocurre de manera natural pero que tiene un grupo R modificado o las estructuras modificadas (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, metionin metil sulfonio). La frase "imitación de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen diferentes estructuras pero funcionan de un modo similar a los aminoácidos generales.

Aquí nos podemos referir a los aminoácidos por sus símbolos de tres letras generalmente conocidos o el símbolo de una letra recomendado por la Comisión de Nomenclatura de Bioquímica IUPAC-IUB.

Los términos "polinucleótidos", "genes", "nucleótidos" y "ácidos nucleicos" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción a menos que se indique específicamente lo contrario.

A menos que se defina de otra manera, el término "cáncer" se refiere a cánceres que sobre-expresan el gen WDRPUH, cuyos ejemplos incluyen, pero no están limitados a, el carcinoma hepatocelular.

A menos que se defina de otra manera, los términos "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica" y "CTL" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción y, a menos que se indique específicamente lo contrario, se refieren a un subgrupo de linfocitos T que tienen la capacidad de reconocer las células que no son iguales (por ejemplo, células de tumor, células infectadas por un virus) e inducir la muerte de dichas células.

A menos que se defina de otra manera, el término "HLA-A2" contiene los subtipos tales como HLA-A0201 o HLA-A0206.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado entendido generalmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención.

II. Péptidos Para demostrar que los péptidos derivados del gen WDRPUH funcionan como un antígeno reconocido por los CTLs, péptidos derivados del gen WDRPUH (SEQ ID No: 64) fueron analizados para determinar si eran epítopes del antígeno restringidos por HLA-A24 los cuales son generalmente encontrados en los alelos de HLA (Date Y, y asociados, Tissue Antigens 47: páginas 93 a 101, 1996; Kondo A y asociados, J Immunol 155: páginas 4307 a 4312, 1995; Kubo RT y asociados, J Immunol 152: páginas 3913 a 3924, 1994). Los candidatos de los péptidos de enlace HLA-A24 derivados del gen WDRPUH fueron identificados basados en sus afinidades de enlace al HLA-A24. Los siguientes péptidos son los péptidos candidatos: WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID No: 1), WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2), WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID No: 3), WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID No: 4), WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID No: 16), y WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID No: 17).

Los candidatos de los péptidos de enlace de HLA-A02 derivados del gen WDRPUH fueron identificados basados en sus afinidades de enlace al HLA-A02. Los siguientes péptidos son los péptidos candidatos: WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID No: 30), WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID No: 31), WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID No: 34), WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID No: 36), WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID No: 37), WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID No: 40), WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID No: 41), WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID No: 45), WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID No: 49), WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID No: 55), WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID No: 57), y WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID No: 61).

Estos CTLs establecidos muestran una actividad potente específica de CTL contra las células objetivo impulsadas con péptidos respectivos. Estos resultados demuestran que el gen WDRPUH es un antígeno reconocido por los CTLs y que los péptidos pueden ser péptidos epítopes del gen WDRPUH restringidos por HLA-A24 o HLA-A2.

Debido a que el gen WDRPUH es sobre-expresado en las células cancerosas de dicho carcinoma hepatocelular y no en la mayor parte de los órganos normales, es un buen objetivo para la inmunoterapia. Por lo tanto, la presente invención proporciona nonapéptidos (péptidos que consisten de nueve residuos de aminoácidos) y decapéptidos (péptidos que consisten de diez residuos de aminoácidos) correspondientes a los epítopes reconocidos por CTL del gen WDRPUH. Los ejemplos particularmente preferidos de los péptidos de la presente invención incluyen aquellos péptidos que consisten de la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61.

Generalmente, los programas de software actualmente disponibles en la Internet, tales como aquellos descritos por Parker KC y asociados, J Immunol 1994 Ene 1, 152(1): páginas 163 a 175, pueden ser utilizados para calcular las afinidades de enlace entre los diferentes péptidos y los antígenos de HLA en el sílice. La afinidad de enlace con los antígenos de HLA puede ser medida como se describió, por ejemplo, en la referencia de Parker KC y asociados, J Immunol 1994 Ene 1, 152(1): páginas 163 a 175; y Kuzushima K y asociados, Blood 2001, 98(6): páginas 1872 a 1881. Los métodos para determinar la afinidad de enlace se describen, por ejemplo, en: Journal of Immunological Methods, 1995, 185: páginas 181 a 190; Protein Science, 2000, 9: páginas 1838 a 1846. Por lo tanto, se pueden seleccionar fragmentos del gen WDRPUH, los cuales tienen una alta afinidad de enlace con los antígenos de HLA utilizando dichos programas de software. Por lo tanto, la presente invención comprende péptidos que consisten de cualesquiera fragmentos derivados del gen WDRPUH, los cuales se enlazan con los antígenos de HLA identificados utilizando dichos programas conocidos. Además, los péptidos de la presente invención también pueden consistir del gen WDRPUH de longitud completa.

Los péptidos de la presente invención pueden ser flanqueados con residuos adicionales de aminoácidos siempre que el péptido resultante retenga su capacidad de inducción de CTL. Los residuos de aminoácidos particulares que flanquean los péptidos de la presente invención pueden estar compuestos de cualquier tipo de aminoácidos siempre que no dañen la capacidad de inducción al CTL del péptido original. Por lo tanto, la presente invención también proporciona péptidos que tienen capacidad de enlace a los antígenos de HLA y que contienen las secuencias de aminoácidos derivadas del gen WDRPUH.

Dichos péptidos generalmente son de menos de aproximadamente 40 aminoácidos, de menos de aproximadamente 20 aminoácidos, y generalmente de menos de aproximadamente 15 aminoácidos.

En general, la modificación de uno, dos o más aminoácidos en un péptido no influirá en la función del péptido, y en algunos casos hasta mejorará la función deseada de la proteína original. De hecho, los péptidos modificados (por ejemplo, los péptidos compuestos de la secuencia de aminoácidos en la cual uno, dos o varios residuos de aminoácidos han sido modificados (por ejemplo, substituidos, eliminados, agregados o insertados comparados con una secuencia de referencia original) se ha conocido que retienen la actividad biológica del péptido original (Mark y asociados, Proc Nati Acad Sci EUA 1984, 81: páginas 5662 a 5666; Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: páginas 6487 a 6500; Dalbadie-McFarland y asociados, Proc Nati Acad Sci EUA 1982, 79: páginas 6409 a 6413). Por lo tanto, en una modalidad, los péptidos de la presente invención pueden tener ambos la capacidad de inducción de CTL y una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61, en donde uno, dos o hasta más aminoácidos son agregados, insertados, eliminados y/o substituidos.

Aquellos expertos en la técnica reconocen que las substituciones individuales a una secuencia de aminoácidos que alteran un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos tienden a resultar en la conversión de las propiedades de la cadena lateral original del aminoácido. Como tales, con frecuencia nos referimos a ellos como "substituciones conservadoras" o "modificaciones conservadoras", en donde la alteración de la proteína da como resultado una proteína modificada que tiene una función análoga a la proteína original. Las tablas de substitución conservadoras que proporcionan la funcionalidad similar a los aminoácidos son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de las características de la cadena lateral de aminoácidos que se desea conservar incluyen, por ejemplo, aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos o características funcionales en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); un grupo hidroxilo que contiene una cadena lateral (S, T, Y); un átomo de azufre que contiene una cadena lateral (C, M); un ácido carboxílico y amida que contienen una cadena lateral (D, N, E, Q); una base que contiene una cadena lateral (R, K, H); y un aromático que contiene una cadena lateral (H, F, Y, W). Además, los siguientes ocho grupos que contienen cada uno aminoácidos que son aceptados en la técnica como substituciones conservadoras entre ellos: 1 ) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Aspargina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W)¡ 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (consultar, por ejemplo, la publicación de Creighton, Proteins 1984).

Dichos péptidos modificados de manera conservadora también son considerados como péptidos de la presente invención. Sin embargo, los péptidos de la presente invención no están restringidos a los mismos y pueden incluir modificaciones no conservadoras, siempre que el péptido modificado retenga la capacidad de inducción de CTL del péptido original. Además, los péptidos modificados no deben excluir los péptidos CTL que se pueden inducir de las variantes polimórficas, homólogos ¡nter-especies, y alelos de WDRPUH.

Para retener la capacidad de inducción de CTL requerida se puede modificar (insertar, eliminar, agregar y/o substituir) un número pequeño (por ejemplo, 1, 2 o varios) o un porcentaje pequeño de los aminoácidos. En este caso, el término "varios" significa 5 o menos aminoácidos, por ejemplo, 4, 3 o menos. El porcentaje de aminoácidos que van a ser modificados preferentemente es del 20% o menor, más preferentemente del 15% o menor, y todavía más preferentemente del 10% o menor, o del 1% al 5%.

Además, los residuos de aminoácidos pueden ser substituidos, insertados, eliminados y/o agregados en los péptidos para producir un péptido modificado que tiene una afinidad de enlace mejorada. Cuando son utilizados en el contexto de la inmunoterapia, los péptidos de la presente invención deben ser presentados en la superficie de una célula o exosoma, preferentemente como un complejo con un antígeno de HLA. Además de los péptidos que son mostrados naturalmente, debido a la regularidad de las secuencias de péptidos mostrados por el enlace a los antígenos de HLA también conocidos como (J Immunol 1994, 152: página 3913; Immunogenetics 1995, 41: página 178; J Immunol 1994, 155: página 4307), las modificaciones basadas en dicha regularidad pueden ser introducidas en los péptidos inmunogénicos de la presente invención. Por ejemplo, se puede desear substituir un segundo aminoácido de la terminal-N substituido por fenilalanina, tirosina, metionina, o triptofano, y/o el aminoácido de la terminal-C con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, o metionina con el objeto de aumentar el enlace al HLA-A24. Por lo tanto, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16 y 17 en donde el segundo aminoácido de la terminal-N de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos es substituido por fenilalanina, tirosina, metionina, o triptofano, y péptidos, y/o en donde la terminal-C de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos es substituida por fenilalanina, Ieucina, isoleucina, triptofano, o metionina están comprendidos por la presente invención. Por otra parte, los péptidos que poseen una alta afinidad de enlace con HLA-A2 tienen su segundo aminoácido de la terminal-N substituido por Ieucina o metionina, y el aminoácido de la terminal-C es substituido por valina o Ieucina. Por lo tanto, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 en donde el segundo aminoácido de la terminal-N es substituido por Ieucina o metionina, y/o en donde la terminal-C es substituida por valina o Ieucina están comprendidos por la presente invención. Las substituciones pueden ser introducidas no solamente en los aminoácidos de las terminales sino también en la posición del receptor de la célula T potencial del reconocimiento de los péptidos (TCR). Varios estudios han demostrado que un péptido con substituciones de aminoácidos puede ser igual a o mejor que el original, por ejemplo, CAP1, p53 (26 -272), Her-2/neu (369-377) o gp100 (209-217) (Zaremba y asociados, Cáncer Res. 57, páginas 4570 a 4577, 1997, T. K. Hoffmann y asociados, J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3): páginas 1338 a 1347., S. O. Dionne y asociados, Cáncer Immunol immunother. (2003) 52: páginas 199 a 206 y S. O. Dionne y asociados, Cáncer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, páginas 307 a 314).

La presente invención también contempla la adición de uno, dos o varios aminoácidos a la terminal N y/o C de los péptidos descritos. Dichos péptidos modificados que tienen una afinidad de enlace alta al antígeno HLA y que retienen la capacidad de inducción del CTL también están incluidos en la presente invención.

Sin embargo, cuando la secuencia de péptidos es idéntica a una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína endógena o exógena que tiene una función diferente, pueden ser inducidos los efectos secundarios tales como enfermedades autoinmunes y/o síntomas alérgicos contra las substancias específicas. Por lo tanto, se prefiere realizar primero búsquedas de homología utilizando las bases de datos disponibles para evitar situaciones en las cuales la secuencia del péptido se acople a la secuencia de aminoácidos de otra proteína. Cuando llega a quedar claro a partir de las búsquedas de homología no existe un péptido con 1 ó 2 diferencias de aminoácidos comparadas con el péptido objetivo, el péptido objetivo puede ser modificado con el objeto de aumentar su afinidad de enlace con los antígenos de HLA, y/o aumentar su capacidad de inducción del CTL sin peligro alguno de dichos efectos secundarios.

Aunque los péptidos que tienen una alta afinidad de enlace con los antígenos de HLA como se describieron anteriormente se espera que sean altamente efectivos, los péptidos candidatos, que son seleccionados de acuerdo con la presencia de una alta afinidad de enlace como indicador, son examinados adicionalmente por la presencia de la capacidad de inducción del CTL. En este caso, la frase "capacidad de inducción del CTL" indica la capacidad del péptido para inducir los CTLs cuando son presentados en las células que presentan el antígeno (APCs). Además, "capacidad de inducción del CTL" incluye la capacidad del péptido para inducir la activación del CTL, proliferación del CTL, promover la lisis del CTL de células objetivo, y aumentar la producción de IFN-gama del CTL.

La confirmación de la capacidad de inducción del CTL se logra induciendo antígenos MHC humanos portadores de los APCs (por ejemplo, B-linfocitos, macrófagos, y células dendríticas (DCs)), y más específicamente los DCs derivados de los leucocitos mononucleares de sangre periférica humana, y después del estímulo con los péptidos, mezclar las células CD8 positivas, y luego medir el IFN-gama producido y liberado por los CTLs contra las células objetivo. Como los sistemas de reacción, se han producido animales transgénicos para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, aquellos que se describen en BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Ags, 61(8): páginas 764 a 779, Related Articles, Books, Inducción de Liberación del enlace de la respuesta de CTL por una vacuna del epítope mínima en ratones transgénicos de HLA A*0201/DR1: se puede utilizar la dependencia del HLA de clase II restringida en su respuesta T(H)). Por ejemplo, las células objetivo pueden ser radio-etiquetadas con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica puede ser calculada a partir de la radioactividad liberada de las células objetivo. Alternativamente, la capacidad de inducción del CTL puede ser evaluada midiendo la IFN-gama producida y liberada por los CTLs en la presencia de APCs que son portadoras de péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en los medios utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-gama.

Como resultado de examinar la capacidad de inducción del CTL de los péptidos que se describieron anteriormente, se descubrieron nonapéptidos y decapéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 que exhiben una capacidad de inducción del CTL particularmente alta así como una alta afinidad de enlace al antígeno de HLA. Por lo tanto, estos péptidos son ejemplificados como modalidades preferidas de la presente invención.

Además, el resultado de análisis de homología mostró que estos péptidos no tienen una homología importante con los péptidos derivados de cualesquiera otros productos del gen humano conocidos. Esto significa que la posibilidad de respuestas inmunes desconocidas o no deseadas que se originan debido al uso de los péptidos presentes en la inmunoterapia es baja. Por lo tanto, también a partir de este aspecto, estos péptidos son preferibles para promover la inmunidad en pacientes de cáncer contra el gen WDRPUH. Por lo tanto, los péptidos particularmente preferidos de la presente invención incluyen aquellos que tienen la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61.

Además de las modificaciones anteriormente descritas, los péptidos de la presente invención también pueden ser enlazados a otros péptidos, siempre que el péptido resultante retenga la capacidad de inducción del CTL requerida del péptido original. Los ejemplos de los péptidos adecuados incluyen, pero no están limitados a: los péptidos de la presente invención o péptidos que pueden inducir el CTL derivados de otros TAAs. Los enlaces que van a ser colocados entre los péptidos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, AAY (P. M. Daftarian y asociados, J Trans Med 2007, 5: página 26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller y asociados, J Immunol. 2000, 165: páginas 7308 a 7315) y K (S. Ota y asociados, Can Res. 62, páginas 1471 a 1476, K. S. Kawamura y asociados, J Immunol. 2002, 168: páginas 5709 a 5715).

Además, los péptidos de la presente invención también pueden ser enlazados a otras substancias, siempre que el péptido resultante retenga la capacidad de inducción requerida del CTL del péptido original. Los ejemplos de las substancias adecuadas incluyen, pero no están limitados a: péptidos, lípidos, azúcares y cadenas de azúcar, grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etc., siempre que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Los péptidos pueden contener modificaciones tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral, y fosforilación, etc., siempre que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Estos tipos de modificaciones se pueden realizar para conferir funciones adicionales (por ejemplo, función de envío al objetivo, y función de administración) o para estabilizar el polipéptido. Por ejemplo, para aumentar la estabilidad in vivo de un polipéptido, es conocido en la técnica introducir D-aminoácidos, imitaciones de aminoácidos o aminoácidos que no son naturales; este concepto también puede ser adaptado a los polipéptidos presentes. La estabilidad de un polipéptido puede ser ensayada de diferentes maneras. Por ejemplo, la peptidasa y diferentes medios biológicos, tales como el plasma y el suero humano, pueden ser utilizados para probar la estabilidad (consultar, por ejemplo, Verhoef y asociados, Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: páginas 291 a 302).

Como se indicó anteriormente, es posible seleccionar los péptidos que son modificados por substitución, inserción, eliminación y/o adición de uno, dos o varios residuos de aminoácidos, pero que todavía tienen la misma actividad o una actividad más alta comparada con el péptido original. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para seleccionar o clasificar un péptido modificado que tiene una actividad igual o más alta comparada con el péptido original. Por ejemplo, dicho método puede estar compuesto de los siguientes pasos: a: modificar por lo menos un residuo de aminoácidos en un péptido de la presente invención por medio de substitución, eliminación, inserción y/o adición; b: determinar la actividad del péptido modificado; y c: seleccionar el péptido el cual se determinó que tiene la misma actividad o una actividad más alta comparada con el péptido original.

En esta descripción, la actividad que va a ser determinada en el paso b puede ser la actividad de enlace de MHC, la capacidad de inducción de APC o CTL, y/o la actividad citotóxica.

En este caso, los péptidos de la presente invención también pueden ser descritos como "péptidos WDRPUH" o "polipéptidos WDRPUH".

III. Preparación de péptidos WDRPUH Los péptidos de la presente invención pueden ser preparados utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden ser preparados sintéticamente, utilizando la tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención pueden ser sintetizados individualmente o como polipéptidos más largos compuestos de dos o más péptidos. Los péptidos pueden entonces ser aislados, por ejemplo, purificados o aislados como para que estén substancialmente libres de otras proteínas y fragmentos de las mismas que ocurren en las células huésped naturales, o en cualquier otras substancias químicas.

Un péptido de la presente invención puede ser obtenido a través de la síntesis química basada en la secuencia de aminoácidos seleccionada. Los ejemplos de los métodos convencionales de síntesis de péptidos que pueden ser adaptados para la síntesis incluyen, pero no están limitados a: (i) "Síntesis de Péptidos" (Peptide Synthesis), Interscience, Nueva York, 1966; (ii) "Las Proteínas, (The Proteins), Vol. 2, Academic Press, Nueva York, 1976; (iii) "Síntesis de Péptidos" (Peptide Synthesis) (en Japonés), Maruzen Co., 1975; (iv) "Síntesis Básica y Experimento de Síntesis de Péptidos" (Basics and Experiment of Peptide Synthesis) (en Japonés), Maruzen Co., 1985; (v) "Desarrollo de Productos Farmacéuticos" (Development of Pharmaceuticals) (segundo volumen) (en Japonés), Vol. 14 (síntesis de péptidos), Hirokawa, 1991; (vi) Documento W099/67288; y (vii) Barany G. & Merrifield R.B., "Péptidos" (Peptides) Vol. 2, "Síntesis de Péptidos de Fase Sólida" (Solid Phase Peptide Synthesis), Academic Press, Nueva York, 1980, páginas 100 a 1 8.

Alternativamente, los péptidos de la presente invención pueden ser obtenidos adaptando cualesquiera métodos de ingeniería genética conocida para la producción de péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: páginas 349 a 351; Clark-Curtiss & Curtiss, "Métodos en Enzimología" (Methods in Enzymology) (eds. Wu y asociados) 1983, 101: páginas 347 a 362). Por ejemplo, primero, un vector adecuado que protege un polinucleótido que codifica el péptido objetivo de una forma que se puede expresar (por ejemplo, descendente de una secuencia regulatoria correspondiente a la secuencia promotora) es preparada y transformada en una célula huésped adecuada. La célula huésped entonces es cultivada para producir el péptido de interés. El péptido puede ser producido también in vitro adaptando un sistema de traducción in vitro. IV. Polinucleótidos La presente invención también proporciona un polinucleótido el cual codifica cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados de la presente invención. Estos incluyen polinucleotidos derivados del gen WDRPUH que ocurre de manera natural (GenBank Acceso No. NM_145697 (SEQ ID No: 34)) así como aquellos que tienen una secuencia de nucleótidos modificada de manera conservadora de los mismos. En este caso, la frase "secuencia de nucleótidos modificada de manera conservadora" se refiere a secuencias las cuales codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un número grande de ácidos nucleicos idénticos funcionalmente codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG, y GCU todos codifican la alanina del aminoácido. Por lo tanto, en cada posición en donde es especificada una alanina por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente descripción que codifica un péptido también describe cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto el AUG, el cual generalmente es el único codón para la metionina, y TGG, el cual generalmente es el único codón para el triptofano) puede ser modificada para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un péptido está descrita implícitamente en cada secuencia descrita.

El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto de ADN, ARN, y derivados de los mismos. Un ADN es compuesto de manera adecuada de bases tales como A, T, C, y G, y T es reemplazado por U en un ARN.

El polinucleótido de la presente invención puede codificar péptidos múltiples de la presente invención con o sin que intervengan entre ellas las secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que interviene puede proporcionar un sitio de disociación (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de la enzima) del polinucleótido o los péptidos traducidos. Además, el polinucleótido puede incluir cualesquiera secuencias adicionales a la secuencia de codificación que codifican el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye las secuencias regulatorias requeridas para la expresión del péptido o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores y similares. En general, dichos polinucleótidos recombinantes pueden ser preparados mediante la manipulación de los polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales utilizando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas.

Ambas técnicas de síntesis recombinante y química pueden ser utilizadas para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser producido mediante la inserción en un vector apropiado, el cual puede ser expresado cuando es transfectado en una célula competente. Alternativamente, un polinucleótido puede ser amplificado utilizando las técnicas PCR o la expresión en huéspedes adecuados (consultar, por ejemplo, el libro de Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989). Alternativamente, un polinucleótido puede ser sintetizado utilizando técnicas de fase sólida, como lo describen Beaucage SL & lyer RP, en Tetrahedron 1992, 48: páginas 2223 a 2311; Matthes y asociados, EMBO J 1984, 3: páginas 801 a 805.

V. Exosomas La presente invención proporciona además vesículas ¡ntracelulares denominadas exosomas, las cuales presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y el antígeno HLA en su superficie. Los exosomas pueden ser preparados, por ejemplo, utilizando los métodos detallados en la Solicitud de Patente Japonesa en las Publicaciones de Kohyo Nos. Hei 11-510507 y el documento WO99/03499, y pueden ser preparadas utilizando APCs obtenidos de pacientes quienes son sometidos al tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención pueden ser inoculados como vacunas, de un modo similar a los péptidos de la presente invención.

El tipo de antígenos de HLA contenido en los complejos debe de coincidir con el del sujeto que requiere el tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población Japonesa, el HLA-A24 y HLA-A2, particularmente el HLA-A2402 y HLA-A0201 o HLA-A0206 es prevalente y por lo tanto sería apropiado para el tratamiento de un paciente Japonés. El uso del tipo A24 o el tipo A2 que es altamente expresado entre los Japoneses y Caucásicos es favorable para obtener resultados efectivos, y también encuentran uso los subtipos tales como A2402, A0201 o A0206. Generalmente, en la clínica, el tipo del antígeno de HLA del paciente que requiere el tratamiento es investigado por anticipado, lo cual hace posible la selección apropiada de los péptidos que tienen altos niveles de afinidad de enlace al antígeno particular, o que tienen una capacidad de inducción del CTL por la presentación del antígeno. Además, con el objeto de obtener péptidos que tienen tanto una alta afinidad de enlace como capacidad de inducción del CTL, substitución, inserción, eliminación y/o adición de 1, 2, o varios aminoácidos se puede realizar basada en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial WDRPUH que ocurre de manera natural.

Cuando se utiliza un antígeno HLA de tipo A24 para el exosoma de la presente invención, encuentran uso los péptidos que tienen las secuencias seleccionadas entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, y 17. Alternativamente, cuando se usa un antígeno de HLA de tipo A2 para el exosoma de la presente invención, encuentran uso los péptidos que tienen una secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41 , 45, 49, 55, 57 y 61.

VI. Células que presentan el antí eno (APCs) La presente invención también proporciona APCs aislados que presentan complejos formados entre los antígenos HLA y los péptidos de la presente invención en la superficie. Los APCs pueden ser derivados de pacientes que son sometidos al tratamiento y/o prevención, y pueden ser administrados como vacunas por ellos mismos o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de la presente invención, exosomas, o CTLs.

Los APCs no están limitados al tipo particular de células e incluyen células DCs, células de Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, las cuales se sabe que presentan antígenos proteináceos en su superficie celular como para ser reconocidos por los linfocitos. Debido a que el DC es un APC representante que tiene la acción de inducción más fuerte del CTL entre los APCs, los DCs encuentran uso en los APCs de la presente invención.

Por ejemplo, un APC de la presente invención puede ser obtenido induciendo los DCs de los monocitos de sangre periférica y luego poniendo en contacto (estimulándolos) con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. La frase "APCs de inducción" incluye poner en contacto (estimular) una célula con el péptido de la invención, o los nucleotidos que codifican los péptidos de la presente invención para presentar complejos formados entre los antígenos HLA y los péptidos de la presente invención en la superficie de la célula. Cuando los péptidos de esta invención son administrados a un sujeto, los APCs que presentan los péptidos de la presente invención son inducidos en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, los APCs de la presente invención pueden ser obtenidos recolectando los APCs de un sujeto después de la administración de un péptido de la invención al sujeto. Alternativamente, los APCs de la presente invención pueden ser obtenidos poniendo en contacto los APCs recolectados de un sujeto con el péptido de la presente invención.

Los APCs de la presente invención pueden ser administrados a un sujeto induciendo una respuesta inmune contra el cáncer en el sujeto por ellos mismos o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos, exosomas o CTLs de la presente invención. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir los pasos de: a: recolectar los APCs del primer sujeto; b: poner en contacto los APCs del paso a con el péptido; y c: administrar los APCs cargados con el péptido del paso b al segundo sujeto.

El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser individuos diferentes. Los APCs obtenidos por el paso b pueden ser administrados como una vacuna para el tratamiento y/o prevención del cáncer incluyendo el carcinoma hepatocelular. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para la manufactura de una composición farmacéutica que induce las células que presentan el antígeno, en donde el método contiene el paso de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los APCs tienen un alto nivel de capacidad de inducción del CTL. En el término "alto nivel de capacidad de inducción del CTL", el alto nivel es relativo al nivel logrado por los APCs puestos en contacto sin el péptido o péptidos los cuales no pueden inducir CTLs. Dichos APCs que tienen un alto nivel de capacidad de inducción del CTL pueden ser preparados por un método el cual incluye el paso de transferir genes que contienen los polinucleótidos de la presente invención a los APCs in vitro así como por métodos mencionados anteriormente. Los genes introducidos pueden ser en la forma de ADNs o ARNs. Los ejemplos de los métodos para la introducción incluyen, sin limitaciones particulares, varios métodos convencionalmente realizados en este campo, que pueden ser utilizados tales como la lipofección, electroporación, y método de fosfato de calcio. Más específicamente, se puede realizar como se describe en Cáncer Res 1996, 56: páginas 5672 a 5677; J Immunol 1998, 161: páginas 5607 a 5613; J Exp Med 1996, 184: páginas 465 a 472; la Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional No. 2000-509281. Transfiriendo el gen dentro de los APCs, el gen padece la transcripción, traducción, y similares en la célula, y luego la proteína obtenida es procesada y presentada por MHC de Clase I o Clase II a través de una trayectoria de presentación.

VII. Linfocitos T Citotóxicos (CTLs) Un CTL inducido contra cualquiera de los péptidos de la presente invención fortalece el envío al objetivo de la respuesta inmune de las células de cáncer in vivo y por lo tanto puede ser utilizado como vacuna, de un modo similar a los péptidos por ellos mismos. Por lo tanto, la presente invención también proporciona CTLs aislados que son inducidos o activados específicamente por cualquiera de los péptidos presentes.

Dichos CTLs pueden ser obtenidos mediante (1) administrar los péptidos de la presente invención a un sujeto, recolectar los CTLs del sujeto; (2) poner en contacto (estimular) los APCs y células CD8 positivas derivadas del sujeto, o los leucocitos mononucíeares de sangre periférica in vitro con los péptidos de la presente invención y luego aislar los CTLs; (3) poner en contacto las células CD8 positivas o los leucocitos mononucíeares de sangre periférica in vitro con los APCs o los exosomas que presentan un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención en su superficie y luego aislando los CTLs; o (4) introduciendo dentro de la célula T, un gen que codifica un polipéptido de subunidad (TCR) del receptor de la célula T el cual se enlaza a un péptido de la presente invención. Los APCs o exosomas pueden ser preparados por métodos descritos anteriormente, y los métodos de (4) se detallan a continuación en la sección de "VIII. Receptor de la célula T (TCR)".

Los CTLs de la presente invención, que han sido inducidos por el estímulo con APCs que presentan un péptido de la presente invención, pueden ser derivados de pacientes que son sometidos al tratamiento y/o prevención, y pueden ser administrados por ellos mismos o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de la presente invención o exosomas para propósitos de efectos de regulación. Los CTLs obtenidos actúan específicamente contra las células objetivo presentando los péptidos de la presente invención, por ejemplo, los mismos péptidos utilizados para la inducción. Las células objetivo pueden ser células que expresan endógenamente el gen WDRPUH, por ejemplo, células de carcinoma hepatocelular, o células que son transfectadas con el gen WDRPUH; y células que presentan un péptido de la presente invención en la superficie celular debido al estímulo por el péptido también pueden servir como objetivos para el ataque al CTL activado. VIII. Receptor de célula T (TCR1) La presente invención también proporciona una composición que contiene ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen la capacidad de formar una subunidad del receptor de la célula T (TCR), y métodos de uso de los mismos. Las subunidades TCR tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a las células T contra las células del tumor que presentan el péptido específico de la presente invención. Utilizando métodos conocidos en la técnica, los ácidos nucleicos de las cadenas alfa- y beta- como subunidades del TCR inducido con el CTL con uno o más péptidos de la presente invención pueden ser identificados (documento WO2007/032255 y publicación de Morgan y asociados, en J Immunol, 171, página 3288 (2003)). Por ejemplo, el método PCR es preferido para analizar el TCR. Los cebadores PCR para el análisis pueden ser, por ejemplo, cebadores 5'-R (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') como cebadores laterales 5' (SEQ ID No: 65) y cebadores 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') específicos para la región C de cadena TCR alfa (SEQ ID No: 66), cebadores 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') específicos para la región C1 de la cadena TCR beta (SEQ ID No: 67) o cebadores 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3') específicos de la región C2 de la cadena TCR beta (SEQ ID No: 68) como cebadores del lado 3', pero no están limitados. El TCR derivado puede enlazar las células objetivo que exhiben el péptido WDRPUH con una avidez alta, y opcionalmente ser portadores del exterminio eficiente de las células objetivo que presentan el péptido WDRPUH in vivo e ¡n vitro.

Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades TCR pueden ser incorporados en vectores adecuados, por ejemplo, vectores retrovirales. Estos vectores son bien conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los contienen generalmente pueden ser transferidos en las células T, por ejemplo, las células T de un paciente. Provechosamente, la presente invención proporciona una composición fuera del almacén que permite la modificación rápida de las propias células T del paciente (o aquellas de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que tienen excelentes propiedades de exterminio de las células del cáncer.

El TCR específico es un receptor con capacidad para reconocer específicamente un complejo de un péptido de la presente invención y una molécula HLA, dándole una actividad específica a la célula T contra la célula objetivo cuando el TCR se encuentra en la superficie de la célula T. Un reconocimiento específico del complejo anterior puede ser confirmado por cualesquiera métodos conocidos, y los métodos preferidos incluyen, por ejemplo, el análisis de tetrámero utilizando la molécula HLA y el péptido de la invención, y el ensayo ELISPOT. Realizando el ensayo ELISPOT, se puede confirmar que una célula T que expresa el TCR en la superficie de la célula reconoce una célula por el TCR, y que la señal es transmitida intracelularmente. La confirmación de que el complejo anteriormente mencionado puede dar una actividad citotóxica de la célula T cuando existe el complejo en la superficie de la célula T también puede ser llevada a cabo por métodos conocidos. Un método preferido incluye, por ejemplo, la determinación de la actividad citotóxica contra la célula objetivo HLA positiva, tal como un ensayo de liberación de cromo. También, la presente invención proporciona CTLs los cuales son preparados mediante la transducción con ácidos nucleicos, que codifican los polipéptidos de las subunidades TCR que se enlazan a los péptidos WDRPUH de, por ejemplo, las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16 y 17 en el contexto de las células HLA-A2, y también los péptidos de las SEQ ID Nos: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 en el contexto de las células HLA-A24. Los CTLs transducidos tienen la capacidad de alojar las células de cáncer in vivo, y pueden ser expandidos por métodos de cultivo bien conocidos in vitro (por ejemplo, Kawakami y asociados, J Immunol., 142, páginas 3452 a 3461 (1989)). Los CTLs de la presente invención pueden ser utilizados para formar una composición inmunogénica útil en el tratamiento o profilaxis del cáncer en un paciente que necesita la terapia o protección (consultar el documento La prevención y profilaxis incluyen cualquier actividad que reduce la carga de mortalidad o morbidez de una enfermedad. La prevención y profilaxis pueden ocurrir "en niveles de prevención primarios, secundarios y terciarios." Aunque la prevención y profilaxis primaria evitan el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundarios y terciarios de prevención y profilaxis comprenden actividades que tienen por objetivo la prevención y profilaxis del progreso de una enfermedad y la emergencia de los síntomas así como la reducción del impacto negativo de una enfermedad ya establecida restaurando la función y reduciendo las complicaciones relacionadas con la enfermedad. Alternativamente, la prevención y profilaxis incluyen un amplio rango de terapias profilácticas con el objetivo de aliviar la severidad de la enfermedad particular, por ejemplo, reduciendo la proliferación y las metástasis de tumores, y reduciendo la angiogénesis.

El tratamiento y/o profilaxis del cáncer, y/o prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo incluye cualquiera de los siguientes pasos, tales como la remoción quirúrgica de las células cancerosas, la inhibición del crecimiento de células cancerosas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de la remisión y supresión de ocurrencia del cáncer, la regresión del tumor, y la reducción o inhibición de las metástasis. El tratamiento efectivo y/o la profilaxis del cáncer disminuye la mortalidad y mejora el pronóstico de los individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de marcadores de tumores en la sangre, y alivia los síntomas que se pueden detectar que acompañan el cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejora de los síntomas constituye un tratamiento efectivo y/o profilaxis, y dicha reducción o mejora de los síntomas incluyen el 10%, 20%, 30% o una reducción mayor, o el sostenimiento de una condición estable de la enfermedad.

IX. Agentes o composiciones farmacéuticas Debido a que la expresión del gen WDRPUH es específicamente elevada (activada) en el carcinoma hepatocelular comparada con el tejido normal (Silva y asociados, Neoplasia 2005 Abr; 7(4): páginas 348 a 355), los péptidos o polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer o tumor, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente o composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer o los tumores, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos, la cual incluye uno o más de los péptidos, o polinucleótidos de la presente invención como ingredientes activos. Alternativamente, los péptidos de la presente invención pueden ser expresados en la superficie de cualquiera de los exosomas anteriores o células, tales como APCs para el uso como agentes o composiciones farmacéuticas.

Además, los CTLs anteriormente mencionados los cuales tienen por objetivo cualquiera de los péptidos de la presente invención también pueden ser utilizados como ingredientes activos de las composiciones y agentes farmacéuticos de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC de un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) un CTL de la presente invención en la manufactura o composición o agente farmacéutico para el tratamiento o prevención del cáncer o tumores.

Alternativamente, la presente invención proporciona además un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC de un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) un CTL de la presente invención para utilizarse en el tratamiento o prevención del cáncer o tumores.

Alternativamente, la presente invención proporciona además un método o proceso para la manufactura de una composición o agente farmacéutico para el tratamiento o prevención del cáncer o tumores, en donde el método o proceso incluye el paso de formular un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC de un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) un CTL de la presente invención como ingredientes activos.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método o proceso para la manufactura de una composición o agente farmacéutico para tratar o prevenir el cáncer o los tumores, en donde el método o proceso incluyen el paso de mezclar un ingrediente activo con un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo es seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC de un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) un CTL de la presente invención.

Alternativamente, la composición o agente farmacéutico de la presente invención pueden ser utilizados para cualquiera o ambos de la profilaxis del cáncer o tumor y la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención encuentran uso en la forma de una vacuna. En el contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (a la que también nos referimos como una composición inmunogénica) se refiere a una substancia que tiene la función de inducir la inmunidad contra el tumor al momento de la inoculación en los animales.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser utilizados para tratar y/o prevenir cánceres o tumores, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos en sujetos o pacientes incluyendo humanos y cualquier otro mamífero incluyendo, pero sin limitarse a, ratones, ratas, cobayos, conejos, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, ganado, caballos, monos, babuinos, y chimpancés, particularmente un animal comercialmente importante o un animal domesticado.

De acuerdo con la presente invención, los péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 se han encontrado que son péptidos de epítope de HLA-A24 o HLA-A2 restringidos o candidatos, respectivamente, que pueden inducir respuesta inmune específica y potente. Por lo tanto, los agentes farmacéuticos de la presente invención que incluyen cualquiera de estos péptidos tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 y son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A24 o HLA-A2. Especialmente, los agentes que contienen los péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16 y 17 son adecuados para la administración a sujetos con el HLA de tipo A24, y aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 son convenientes para la administración a sujetos del HLA de tipo A2. Lo mismo es aplicable a los agentes o composiciones farmacéuticas que incluyen polinucleótidos que codifican cualquiera de estos péptidos (por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención).

Los cánceres o tumores que van a ser tratados por los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención no están limitados e incluyen todo tipo de cánceres o tumores en donde está comprendido el gen WDRPUH, por ejemplo, el carcinoma hepatocelular.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener además de los ingredientes activos anteriormente mencionados, otros péptidos que tienen la capacidad de inducir los CTLs contra las células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, y similares. En este caso, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir los CTLs contra las células cancerosas son ejemplificados por los antígenos específicos del cáncer (por ejemplo, TAAs identificados), pero no están limitados a los mismos.

Si es necesario, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras substancias terapéuticas como ingrediente activo, siempre que la substancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, por ejemplo, cualquiera de los péptidos presentes. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes anti-inflamatorios, exterminadores del dolor, agentes quimioterapéuticos, y similares. Además de incluir otras substancias terapéuticas en el medicamento mismo, los medicamentos de la presente invención también pueden ser administrados consecutiva o concurrentemente con el uno o más de otros agentes farmacológicos. Las cantidades del medicamento y el agente farmacológico dependen, por ejemplo, del tipo de agente farmacológico que es/son utilizados, la enfermedad que está siendo tratada, y la programación y rutas de administración.

Deberá quedar entendido que además de los ingredientes particularmente mencionados en esta descripción, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión.

En una modalidad de la presente invención, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser incluidos en artículos de manufactura y equipos que contienen materiales útiles para el tratamiento de padecimientos patológicos de la enfermedad que va a ser tratada, por ejemplo, el cáncer. El artículo de manufactura puede incluir un contenedor de cualquiera de los agentes farmacéuticos de la presente invención con una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen botellas, frascos, y tubos de prueba. Los contenedores pueden ser formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el contenedor debe indicar el agente o composición que es utilizado para el tratamiento o prevención de uno o más padecimientos de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar instrucciones de administración y así sucesivamente.

Además del contenedor descrito anteriormente, un equipo que incluye un agente o composición farmacéutica de la presente invención puede incluir opcionalmente de manera adicional un segundo contenedor que aloja un diluyente farmacéuticamente aceptable. Además se pueden incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaques con instrucciones para el uso.

Los agentes o composiciones farmacéuticas pueden, si así se desea, ser presentados en un paquete o aparato abastecedor el cual puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El empaque puede, por ejemplo, incluir lámina de metal o plástico, tal como un paquete blister. El paquete o aparato abastecedor puede ser acompañado por instrucciones para la administración. (1) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como ingrediente activo Los péptidos de la presente invención pueden ser administrados directamente como un agente o composición farmacéutica, o si es necesario, que ha sido formulado mediante los métodos de formulación convencionales. En este último caso, además de los péptidos de la presente invención, los vehículos, excipientes, de modo que sean utilizados de manera normal para los fármacos pueden ser incluidos como apropiados sin limitaciones particulares. Los ejemplos de dichos vehículos son agua esterilizada, solución salina fisiológica, regulador de fosfato, fluido de cultivos y similares. Además, los agentes o composiciones farmacéuticas pueden contener según sea necesario, estabilizadores, suspensiones, conservadores, tensioactivos y similares. Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser utilizados para propósitos contra el cáncer.

Los péptidos de la presente invención pueden ser preparados como una combinación compuesta de dos o más de los péptidos de la presente invención, para inducir los CTLs in vivo. La combinación de péptidos puede tomar la forma de un cocktail o pueden ser conjugados entre ellos utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos pueden ser enlazados o expresados químicamente como una sola secuencia de fusión de polipéptidos. Los péptidos en la combinación pueden ser iguales o diferentes. Administrando los péptidos de la presente invención, los péptidos son presentados en una densidad alta por los antígenos HLA en las APCs, entonces los CTLs que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido mostrado y el antígeno de HLA es inducido. Alternativamente, las APCs que están presentes en cualquiera de los péptidos de la presente invención en su superficie celular, las cuales pueden ser obtenidas estimulando las APCs (por ejemplo, DCs) derivadas de un sujeto con los péptidos de la presente invención pueden ser administrados al sujeto, y como resultados, son inducidos los CTLs en el sujeto y puede ser aumentada la agresividad contra las células cancerosas.

Los agentes o composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer o tumores, los cuales incluyen un péptido de la presente invención como el ingrediente activo, pueden también incluir un adyuvante conocido que establece de manera efectiva la inmunidad celular. Alternativamente, los agentes o composiciones farmacéuticas pueden ser administrados con otros ingredientes activos o administrados mediante la formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a un compuesto que mejora la respuesta inmune contra la proteína cuando es administrado junto (o sucesivamente) con la proteína que tiene la actividad inmunológica. Los adyuvantes aquí contemplados incluyen aquellos descritos en la literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: páginas 277 a 289). Los ejemplos de los adyuvantes adecuados incluyen fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alum, toxina de cólera, toxina de salmonella, y similares, pero no están limitados a los mismos.

Además, pueden ser utilizadas de manera conveniente las formulaciones de liposoma, las formulaciones granulares en las cuales el péptido es enlazado a cuentas de diámetro de pocos micrómetros, y formulaciones en las cuales el lípido está enlazado al péptido.

En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir además un componente el cual prepara los CTLs. Los lípidos han sido identificados como agentes con capacidad para preparar los CTLs in vivo contra los antígenos virales. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico pueden ser enlazados a los grupos epsilon- y alfa-amino de un residuo de Usina y luego enlazados a un péptido de la presente invención. El péptido lipidado puede entonces ser administrado ya sea directamente en una micela o partícula, incorporado en un liposoma, o emulsificado en un adyuvante. Como otro ejemplo de la preparación de las respuestas del lípido a los CTLs, las lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS) puede ser utilizado para preparar CTL cuando son enlazados covalentemente a un péptido apropiado (consultar, por ejemplo, la publicación de Deres y asociados, en Nature 1989, 342: páginas 561 a 564).

El método de administración puede ser oral, por medio de inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y la administración sistémica o administración local en la cercanía de los sitios que son objetivos. La administración puede ser realizada mediante una sola administración o reforzada por administraciones múltiples. La dosis de los péptidos de la presente invención puede ser ajustada de manera correcta de acuerdo con la enfermedad que va a ser tratada, la edad del paciente, el peso, método de administración, y similares, y es generalmente de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.1 mg a 10 mg, y puede ser administrada una vez en unos cuantos días o unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar de manera correcta la dosis adecuada. (2) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener ácidos nucleicos que codifican los péptidos aquí descritos en una forma que se puede expresar. En esta descripción, la frase "en una forma que se puede expresar" significa que el polinucleótido, cuando es introducido en una célula, será expresado ¡n vivo como un polipéptido que induce una inmunidad antitumor. En una modalidad ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye elementos regulatorios necesarios para la expresión del polinucleótido. Los polinucleótidos pueden estar equipados de modo que logran la inserción estable en el genoma de la célula objetivo (consultar, por ejemplo, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: páginas 503 a 512 para una descripción de los vectores del cassette de recombinación homologa). Consultar, por ejemplo, la publicación de Wolff y asociados, en Science 1990, 247: páginas 1465 a 1468; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; y el documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basados en ADN incluyen "ADN desnudo", administración facilitada (portada por el péptido, polímeros, bupivacaína), complejos de lípido catiónico, y administración portada por presión o portada por partículas ("pistola de genes") (consultar, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,922,687).

Los péptidos de la presente invención también pueden ser expresados mediante vectores virales o bacteriales. Los ejemplos de los vectores de expresión incluyen huéspedes virales atenuados, tales como vacunas o viruelas. Este método comprende el uso del virus de la vacuna, por ejemplo, como un vector para expresar las secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. Al momento de la introducción en un huésped, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico y de esta manera promueve una respuesta inmune. Los vectores de vacuna y métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,722,848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover y asociados, Nature 1991, 351: páginas 456 a 460. Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica, por ejemplo, los vectores de adenovirus y asociados con adeno, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax destoxificada, y similares, podrán ser apreciados. Ver, por ejemplo, las publicaciones de Shata y asociados, en Mol Med Today 2000, 6: páginas 66 a 71; Shedlock y asociados, en J Leukoc Biol 2000, 68: páginas 793 a 806; Hipp y asociados, In Vivo 2000, 14: páginas 571 a 585.

La administración de un polinucleotido en un sujeto puede ser ya sea directa, en cuyo caso el sujeto es expuesto directamente a un vector portador del polinucleotido, o indirecta, en la cual las células son transformadas primero con el polinucleotido de interés in vitro, y luego las células son transplantadas al sujeto. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapias genéticas in vivo y ex vivo.

Para revisiones generales de los métodos de la terapia de genes, consultar las publicaciones de Goldspiel y asociados, en Clinical Pharmacy 1993, 12: páginas 488 a 505; Wu y Wu, en Biotherapy 1991, 3: páginas 87 a 95; Tolstoshev, en Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: páginas 573 a 596; Mulligan, en Science 1993, 260: páginas 926 a 932; Morgan & Anderson, en Ann Rev Biochem 1993, 62: páginas 191 a 217; Trends in Biotechnology 1993, 11 (5): páginas 155 a 215). Los métodos conocidos generalmente en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que también pueden ser utilizados para la presente invención se describen en los libros "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology) de Ausubel y asociados, John Wiley & Sons, NY, 1993; y "Transferencia y Expresión Genética, Un Manual de Laboratorio" (Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual) de Krieger, Stockton Press, NY, 1990.

Los métodos de administración pueden ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y administración sistémica o administración local que encuentran su uso en la cercanía de los sitios objetivo. La administración puede ser realizada por una sola administración o reforzada por administraciones múltiples. La dosis del polinucleótido en el vehículo adecuado o células transformadas con el polinucleótido que codifica los péptidos de la presente invención puede ser ajustada correctamente de acuerdo con la enfermedad que va a ser tratada, la edad del paciente, el peso, método de administración, y similares, y es generalmente de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.1 mg a 10 mg, y puede ser administrada cada vez unos pocos días o una vez cada unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar de manera correcta la dosis adecuada.

X. Métodos de uso de péptidos. exosomas, APCs y CTLs Los péptidos y polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para inducir las APCs y los CTLs. Los exosomas y las APCs de la presente invención también pueden ser utilizados para inducir los CTLs. Los péptidos, polinucleótidos, exosomas y APCs pueden ser utilizados en combinación con cualesquiera otros compuestos siempre que los compuestos no inhiban su capacidad de inducción del CTL. Por lo tanto, cualquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas de la presente invención pueden ser utilizados para inducir CTLs, y además de ellos, aquellos que incluyen los péptidos y poli nucleótidos también pueden ser utilizados para inducir APCs como se explicará más adelante. (1) Método para inducir las células que presentan el antígeno (APCs) La presente invención proporciona métodos para inducir APCs con una capacidad alta de inducción de CTL utilizando los péptidos o polinucleótidos de la presente invención.

Los métodos de la presente invención contienen el paso de poner en contacto las APCs con los péptidos de la presente invención ¡n vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, el método hace contacto con las APCs con los péptidos ex vivo que puede incluir los pasos de: a: recolectar APCs de un sujeto; y b: poner en contacto las APCs del paso a con el péptido. Las APCs no están limitadas a un tipo particular de células e incluyen DCs, células de Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, las cuales es sabido que presentan antígenos proteinaceos en su superficie celular como para que sean reconocidos por los linfocitos. Preferentemente, pueden ser utilizadas las DCs ya que tienen una capacidad de inducción del CTL más fuerte entre las APCs. Cualesquiera péptidos de la presente invención pueden ser utilizados por ellos mismos o con otros péptidos de la invención.

Alternativamente, las APCs pueden ser inducidas mediante la administración de un péptido de la presente invención a un sujeto para poner en contacto el péptido con las APCs in vivo, y posteriormente, inducir las APCs con una alta capacidad de inducción del CTL en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, la presente invención también contempla administrar los péptidos de la presente invención a un sujeto para inducir las APCs. Como otro método, se puede administrar a un sujeto un polinucleótido de la presente invención en una forma que se puede expresar para expresar un péptido de la presente invención y hacer contacto el péptido con las APCs in vivo. De un modo similar a la administración de un péptido de la presente invención, las APCs con una alta capacidad de inducción del CTL son inducidas en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, la presente invención también contempla la administración de polinucleótidos de la presente invención a un sujeto para inducir las APCs. Para la explicación de la frase "forma que se puede expresar", ver la sección "IX. Agentes farmacéuticos (2), Agentes farmacéuticos que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo".

Además, la presente invención también contempla introducir un polipéptido de la presente invención en una APC para inducir la APC con la capacidad de inducción del CTL. Por ejemplo, el método puede incluir los pasos de: a: recolectar una APC de un sujeto; y b: introducir un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención en la APC recolectada.

El paso b puede ser realizado como se describió anteriormente en la sección "VI. Células que presentan el antígeno". (2) Método de inducción de CTLs Además, la presente invención proporciona métodos para inducir los CTLs utilizando los péptidos, polinucleótidos, y exosomas o las APCs de la presente invención.

Al momento de la administración de los péptidos, los polinucleótidos, APCs, o exosomas de la presente invención a un sujeto, los CTLs son inducidos en el cuerpo del sujeto para fortalecer la respuesta inmune teniendo como objetivo las células cancerosas. Por lo tanto, es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para inducir los CTLs, cuyo método puede incluir el paso de administrar los péptidos, los polinucleótidos, las APCs o exosomas de la presente invención a un sujeto.

Alternativamente, también pueden ser inducidos los CTLs ex vivo, y después de la inducción, se pueden regresar los CTLs activados al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir los pasos de: a: recolectar las APCs de un sujeto; b: poner en contacto las APCs del paso a con un péptido de la presente invención; y c: co-cultivar las APCs del paso b con las células CD8 positivas.

Las APCs para ser co-cultivadas con las células CD8 positivas en el paso c anterior también pueden ser preparadas transfiriendo un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención en APCs como se describieron anteriormente en la sección "VI. Células que presentan el antígeno"; pero no están limitados a los mismos y cualesquiera APCs que se presenten efectivamente, en su superficie, un complejo del antígeno HLA y un péptido de la presente invención pueden ser utilizados por el método presente.

En lugar de dichas APCs, también pueden ser utilizados exosomas que presentan en su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención. Es decir, el método de la invención actual para inducir CTLs puede incluir el paso de co-cultivar exosomas que presentan en su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención. Dichos exosomas pueden ser preparados por los métodos descritos anteriormente en la sección "V. Exosomas".

Además, los CTLs pueden ser inducidos introduciendo un polinucleótido que codifica el enlace de una subunidad TCR a un péptido de la presente invención en las células CD8 positivas. Dicha transducción se puede llevar a cabo como se describió anteriormente en la sección "VIII. Receptor de célula T ( ? C R ) " . (3) Método para inducir la respuesta inmune La presente invención proporciona además métodos para inducir una respuesta inmune contra el cáncer en un sujeto. Los métodos incluyen la administración de una vacuna de la presente invención, la cual contiene: (a) uno o más péptidos de la presente invención, o un fragmento inmunológicamente activo de los mismos; (b) uno o más polinucleótidos que codifican los péptidos o el fragmento inmunológicamente activo de (a); (c) uno o más CTLs aislados de la presente invención; o (d) una o más células que presentan el antígeno aislado de la presente invención.

En la presente invención, el cáncer que sobre-expresa el gen WDRPUH puede ser tratado con estos ingredientes activos. Por consiguiente, antes de la administración de las vacunas o composiciones farmacéuticas que comprenden los ingredientes activos, se prefiere confirmar si el nivel de expresión del gen WDRPUH en las células o tejidos cancerosos que van a ser tratados es mejorado comparado con las células normales del mismo órgano. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar el cáncer que expresa el gen WDRPUH, cuyo método puede incluir los pasos de: i) determinar el nivel de expresión del gen WDRPUH en las células o tejidos cancerosos obtenidos de un sujeto con el cáncer que va a ser tratado; ¡i) comparar el nivel de expresión del gen WDRPUH con el control normal; y iii) administrar por lo menos un componente seleccionado del grupo consistente de los puntos del (a) al (d) descritos anteriormente a un sujeto con un cáncer que sobre-expresa el gen WDRPUH comparado con el control normal.

Alternativamente, la presente invención también proporciona una vacuna o composición farmacéutica que comprende por lo menos un componente seleccionado del grupo consistente de los puntos del (a) al (d) descritos anteriormente, para utilizase en la administración a un sujeto que tiene un cáncer que sobre-expresa el gen WDRPUH. En otras palabras, la presente invención proporciona además un método para identificar a un sujeto que va a ser tratado con el polipéptido WDRPUH de la presente invención, cuyo método puede incluir el paso de determinar un nivel de expresión del gen WDRPUH en las células o tejidos del cáncer derivadas del sujeto, en donde un aumento del nivel comparado con el nivel de control normal del gen indica que el sujeto tiene cáncer el cual puede ser tratado con el polipéptido WDRPUH de la presente invención. El método de tratamiento del cáncer de la presente invención se describirá con mayor detalle más adelante.

Un sujeto que va a ser tratado por el método de la presente invención preferentemente es un mamífero. Los mamíferos de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, humanos, primates no humanos, ratones, ratas, perros, gatos, caballos, y vacas.

De acuerdo con la presente invención, es determinado el nivel de expresión del gen WDRPUH en las células o tejidos cancerosos obtenidos de un sujeto. El nivel de expresión puede ser determinado en el nivel del producto de transcripción (ácido nucleico) utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el mARN del gen WDRPUH puede ser cuantificado utilizando muestras mediante métodos de hibridación (por ejemplo, la hibridación Northern). La detección puede ser llevada a cabo en un chip o en una adaptación. El uso de una adaptación es preferible para detectar el nivel de expresión del gen WDRPUH. Aquellos expertos en la técnica pueden preparar dichas muestras utilizando la información de las secuencias del gen WDRPUH. Por ejemplo, el cADN del gen WDRPUH puede ser utilizado como muestra. De ser necesario, la muestra puede ser etiquetada con una etiqueta adecuada, tal como con tintes, substancias o isótopos fluorescentes, y el nivel de expresión del gen puede ser detectado como la intensidad de las etiquetas hibridadas.

Además, el producto de transcripción del gen WDRPUH (SEQ ID No: 63) puede ser cuantificado utilizando cebadores mediante métodos de detección basados en la amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Dichos cebadores también pueden ser preparados basados en la información disponible de la secuencia del gen.

Específicamente, una muestra o cebador utilizado para el método actual híbrida bajo condiciones severas, moderadamente severas, o poco severas al mARN del gen WDRPUH. Como se usa en la presente descripción, la frase "condiciones severas (hibridación)" se refiere a condiciones bajo las cuales una muestra o cebador hibridará a su secuencia objetivo, pero no a otras secuencias. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes bajo circunstancias diferentes. La hibridación específica de secuencias más largas es observada en temperaturas más altas que en las secuencias más cortas. Generalmente, la temperatura de una condición severa es seleccionada para que sea de aproximadamente 5°C más baja que el punto de fusión térmica (Tm) para una secuencia específica en una fuerza iónica definida y pH. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) en la cual el 50% de las muestras complementarias para la secuencia objetivo hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio. Debido a que las secuencias objetivo generalmente están presentes en exceso, en la Tm, el 50% de las muestras son ocupadas en equilibrio. Generalmente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente un ión de sodio de 1.0 M, generalmente de un ión de sodio de aproximadamente 0.01 M a 1.0 M (u otras sales) en un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30°C para muestras o cebadores cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos de aproximadamente 60°C para muestras o cebadores más largos. Las condiciones severas también pueden ser logradas mediante la adición de agentes de desestabilización, tales como formamida.

Alternativamente, el producto de traducción puede ser detectado para la diagnosis de la presente invención. Por ejemplo, puede ser determinada la cantidad de proteína WDRPUH (SEQ ID NO: 64). Los métodos para determinar la cantidad de la proteína como el producto de la traducción incluyen métodos de inmunoensayo que utilizan un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Además, se puede utilizar cualquier fragmento o modificación del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etc.) para la detección, siempre que el fragmento o anticuerpo modificado retenga la capacidad de enlace a la proteína WDRPUH. Los métodos para preparar estos tipos de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método puede ser empleado en la presente invención para preparar dichos anticuerpos o equivalentes de los mismos.

Como otro método para detectar el nivel de expresión del gen WDRPUH basado en su producto de traducción, la intensidad de la tinción puede ser observada por medio del análisis inmunohistoquímico utilizando un anticuerpo contra la proteína WDRPUH. Es decir, la observación de una tinción fuerte indica una presencia aumentada de la proteína y, al mismo tiempo, un nivel de expresión alto del gen WDRPUH.

El nivel de expresión del gen objetivo que incluye el gen WDRPUH en las células de cáncer puede ser considerado que es aumentado si aumenta de nivel de control del gen objetivo correspondiente, por ejemplo, en un 10%, 25%, o 50%; o aumenta a más de 1.1 veces, más de 1.5 veces, más de 2.0 veces, más de 5.0 veces, más de 10.0 veces, o mayor. El nivel de control puede ser determinado al mismo tiempo con las células de cáncer utilizando una muestra anteriormente recolectada y almacenada de un sujeto/sujetos cuya condición de enfermedad (cancerosa o no cancerosa) es/son conocidas. Además, las células normales obtenidas de las regiones no cancerosas de un órgano que tiene el cáncer que va a ser tratado pueden ser utilizadas como control normal. Alternativamente, el nivel de control puede ser determinado por un método estadístico basado en los resultados obtenidos analizando previamente el nivel de expresión determinado del gen WDRPUH en las muestras de sujetos cuyas condiciones de enfermedad son conocidas. Además, el nivel de control puede ser una base de datos de patrones de expresión de células probadas anteriormente.

Además, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, el nivel de expresión del gen WDRPUH en una muestra biológica puede ser comparado con niveles de control múltiples, cuyos niveles de control son determinados de muestras de referencia múltiples. Se prefiere utilizar un nivel de control determinado de una muestra de referencia derivada de un tipo de tejido similar al de la muestra biológica derivada del sujeto. Además, se prefiere utilizar un valor estándar de los niveles de expresión del gen WDRPUH en una población con una condición de enfermedad conocida. El valor estándar puede ser obtenido con cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un rango de un promedio +/- 2 D.E. o promedio +/- 3 D.E., puede ser utilizado como el valor estándar.

En el contexto de la presente invención, el nivel de control determinado de una muestra biológica que es conocida que no es cancerosa es al que nos referimos como un "nivel de control normal". Por otra parte, si el nivel de control es determinado de una muestra biológica cancerosa, nos referimos a ella como un "nivel de control canceroso".

Cuando el nivel de expresión del gen WDRPUH es aumentado comparado con el nivel de control normal o es similar al nivel de control canceroso, el sujeto puede ser diagnosticado con el cáncer que va a ser tratado.

La presente invención también proporciona un equipo para determinar a un sujeto que sufre de cáncer el cual puede ser tratado con el polipéptido WDRPUH de la presente invención, el cual también puede ser útil para evaluar y/o monitorear la eficacia de una inmunoterapia del cáncer. Preferentemente, el cáncer es un carcinoma hepatocelular. Más particularmente, el equipo preferentemente incluye por lo menos un reactivo para detectar la expresión del gen WDRPUH en una célula de cáncer derivada del sujeto, cuyo reactivo puede ser seleccionado del grupo de: (a) un reactivo para detectar el mARN del gen WDRPUH; (b) un reactivo para detectar la proteína WDRPUH; y (c) un reactivo para detectar la actividad biológica de la proteína WDRPUH.

Los reactivos adecuados para detectar el mARN del gen WDRPUH incluyen ácidos nucleicos que se enlazan específicamente a o identifican el mARN del gen WDRPUH, tales como oligonucleótidos los cuales tienen una secuencia complementaria a una parte del mARN del gen WDRPUH. Estos tipos de oligonucleótidos son ejemplificados por los cebadores y muestras que son específicas para el mARN del gen WDRPUH. Estos tipos de oligonucleótidos pueden ser preparados basados en métodos bien conocidos en la técnica. De ser necesario, el reactivo para detectar el mARN del gen WDRPUH puede ser inmovilizado en una matriz sólida. Además, se pueden incluir en el equipo más de un reactivo para detectar el mARN del gen WDRPUH.

Por otra parte, los reactivos adecuados para detectar la proteína WDRPUH incluyen anticuerpos para la proteína WDRPUH. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Además, cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etc.) del anticuerpo puede ser utilizado como el reactivo, siempre que el fragmento o anticuerpo modificado retenga la capacidad de enlace a la proteína WDRPUH. Los métodos para preparar estos tipos de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y se puede emplear cualquier método en la presente invención para preparar dichos anticuerpos y equivalentes de los mismos. Además, el anticuerpo puede ser etiquetado con moléculas generadoras de señal por medio del enlace directo o una técnica de etiquetación indirecta. Las etiquetas y métodos para la etiquetación de anticuerpos y la detección del enlace de los anticuerpos a sus objetivos son bien conocidos en la técnica, y cualesquiera etiquetas y métodos pueden ser empleados para la presente invención. Además, puede ser incluido en el equipo más de un reactivo para detectar la proteína WDRPUH.

El equipo puede contener más de uno de los reactivos anteriormente mencionados. Por ejemplo, las muestras de tejido obtenidas de sujetos que sufren de cáncer o pueden o no servir como reactivos de control útiles. Un equipo de la presente invención puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque (por ejemplo, cintas escritas, CD-ROM, etc.) con instrucciones para el uso. Estos reactivos como tales pueden ser retenidos en un contenedor con una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen botellas, frascos, y tubos de prueba. Los contenedores pueden ser formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico.

Como una modalidad de la presente invención, cuando el reactivo es una muestra contra el mARN del gen WDRPUH, el reactivo puede ser inmovilizado en una matriz sólida, tal como una tira porosa, para formar por lo menos un sitio de detección. La región de medición o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios, conteniendo cada uno un ácido nucleico (muestra). Una tira de prueba puede contener también sitios para los controles negativo y/o positivo. Alternativamente, los sitios de control pueden estar localizados en una tira separada de la tira de prueba. Opcionalmente, los sitios de detección diferentes pueden contener cantidades diferentes de ácidos nucleicos inmovilizados, por ejemplo, una cantidad más alta en el primer sitio de detección y cantidades menores en los sitios subsecuentes. Al momento de la adición de la muestra de prueba, el número de sitios que muestran una señal detectable proporcionan una indicación cuantitativa de la cantidad del mARN del gen WDRPUH presente en la muestra. Los sitios de detección pueden ser configurados de cualquier forma detectable adecuada y son generalmente en la forma de una barra o punto que se expande por el ancho de la tira de prueba.

El equipo de la presente invención puede incluir además una muestra de control positivo o una muestra estándar del gen WDRPUH. La muestra de control positivo de la presente invención puede ser preparada recolectando muestras positivas del gen WDRPUH y luego son probados aquellos niveles del gen WDRPUH. Alternativamente, la proteína o polinucleótido del gen WDRPUH purificadas pueden ser agregadas a las células que no expresan el gen WDRPUH para formar una muestra positiva o el estándar del gen WDRPUH. En la presente invención, el gen WDRPUH purificado puede ser una proteína recombinante. El nivel del WDRPUH de la muestra de control positivo es, por ejemplo, más del valor del corte.

Los ejemplos siguientes son presentados para ilustrar la presente invención y para ayudar a los expertos en la técnica para la elaboración y uso de la misma. Los ejemplos no pretenden de modo alguno limitar de otro modo el alcance de la presente invención.

Ejem píos Materiales v Métodos Líneas de Células Las líneas de células A24 linfoblastoides (A24LCL) fueron establecidas por la transformación con el virus de Epstein-bar en el linfocito HLA-A24 positivo humano B. T2 (HLA-A2), COS7, las líneas de célula de riñon de mono verde Africano, fueron compradas en ATCC.

Selección de candidato de péptidos derivados del gen WDRPUH Los péptidos 9-mer y 10-mer derivados del gen WDRPUH que se enlazan a las moléculas HLA-A*2402 y HLA-A*0201 fueron pronosticados utilizando el software de predicción de enlace "BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker y asociados (J Immunol 1994, 152(1 ): páginas 163 a 175), Kuzushima y asociados (Blood 2001, 98(6): páginas 1872 a 1881)). Estos péptidos fueron sintetizados por Sigma (Sapporo, Japón) o Biosynthesis Inc. (Lewisville, TX) de acuerdo con el método de síntesis de fase sólida y purificados mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (HPLC). La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos fue determinada mediante HPLC analítica y el análisis de espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DIVISO) en una cantidad de 20 mg/ml y almacenados a una temperatura de -80°C.

Inducción del CTL in vitro Las células dendríticas derivadas de monocitos (DCs) fueron utilizadas como células de presentación del antígeno (APCs) para inducir las respuestas citotóxicas de los T I i nfocitos (CTL) contra los péptidos presentados en el antígeno de leucocitos humanos (HLA). Las DCs fueron generadas in vitro como se describe en alguna parte de la publicación (Nakahara S y asociados, Cáncer Res 2003 Jul 15, 63(14): páginas 4112 a 4118). Específicamente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de voluntarios normales (HLA-A*2402 positivas y HLA-A*0201 positivas) por medio de una solución Ficoll-Plaque (Pharmacia) fueron separadas mediante la adherencia a un plato de cultivo de tejidos plásticos (Becton Dickinson) como para enriquecerlas como la fracción de monocito. La población enriquecida con monocitos fue cultivada en la presencia de 1000 U/ml del factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) (R&D System) y 1000 U/ml de interleucina (IL)-4 (R&D System) en un Medio AIM-V (Invitrogen) que contiene un suero autólogo inactivado por calor al 2% (AS). Después de 7 días de cultivo, las DCs inducidas por citocina fueron impulsadas con 20 micro-g/ml de cada uno de los péptidos sintetizados en la presencia de 3 micro-g/ml de beta 2-microglobulina durante 3 horas a una temperatura de 37°C en el Medio AIM-V. Las células generadas parecieron expresar moléculas asociadas con los DC, tales como CD80, CD83, CD86 y HLA clase II, en sus superficies de la célula (datos no mostrados).

Estas DCs impulsadas por péptidos entonces fueron desactivadas mediante Mitomicina C (MMC) (30 micro-g/ml durante 30 minutos) o irradiación-X (20 Gy) y mezcladas en una proporción de 1:20 con las células CD8+ T autólogas, obtenidas mediante la selección positiva con el Equipo de Aislamiento de CD8 Positivo (Dynal). Estos cultivos fueron preparados en placas de 48 depósitos (Corning); conteniendo cada depósito 1.5 x 104 de DCs impulsados por los péptidos, 3 x 105 células CD8+ T y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0.5 mi de un medio AS de AIM-V/al 2%. Tres días después, estos cultivos fueron suplementados con IL-2 (CHIRON) a una concentración final de 20 lU/ml. En los días 7 y 14, las células T fueron estimuladas adicionalmente con las DCs impulsadas por el péptido autólogo. Las DCs fueron preparadas cada vez siguiendo los mismos pasos que se describieron anteriormente. Las CTLs fueron probadas contra las células A24LCL o T2 impulsadas por el péptido después de la tercera ronda de estimulo del péptido en el día 21 (Tanaka H y asociados, Br J Cáncer 2001 Ene 5, 84(1): páginas 94 a 99; Umano Y, y asociados, Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): páginas 1052 a 1057; Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Ags, 96(8): páginas 498 a 506).

Procedimiento de Expansión del CTL Los CTLs fueron expandidos en cultivo utilizando el método similar al descrito por Riddell y asociados. (Walter EA y asociados, N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): páginas 1038 a 1044; Riddell SR y asociados, Nat Med 1996 Feb, 2(2): páginas 216 a 223). Se suspendieron un total de 5 x 104 CTLs en 25 mi de medio AS de AIM-V/al 5% con 2 tipos de líneas de células B-linfoblastoides humanas, desactivadas por Mitomicina C, en la presencia de 40 ng/ml del anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de iniciar los cultivos, se agregaron a los cultivos 120 lU/ml de IL-2. Los cultivos fueron alimentados con un medio AS fresco de AIM-V/al 5% con un contenido de 30 lU/ml de IL-2 en los días 5, 8 y 11 (Tanaka H y asociados, Br J Cáncer 2001 Ene 5, 84(1): páginas 94 a 99; Umano Y, y asociados, Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): páginas 1052 a 1057; Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 8586; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Ags, 96(8): páginas 498 a 506).

Establecimiento de clones de CTL Se hicieron diluciones para tener 0.3, 1, y 3 CTLs/depósito en 96 placas de microtitulación de fondo redondo (Nalge Nunc International). Los CTLs fueron cultivados con 1 X 104 células/depósito de 2 tipos de líneas de células B-linfoblastoides humanas, 30 ng/ml del anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en un total de 150 micro-l/depóstito del Medio AS con un contenido de AIM-V al 5%. Se agregaron 50 micro-l/depósito de IL-2 al medio 10 días después como para alcanzar una concentración final de 125 U/ml de IL-2. La actividad del CTL fue probada en el día 14, y los clones del CTL fueron expandidos utilizando el mismo método descrito anteriormente (Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Ags, 96(8): páginas 498 a 506).

Actividad específica del CTL Para examinar la actividad específica del CTL, se realizaron el ensayo (ELISPOT) de interferón (IFN)-gama de ¡nmunotinción enlazado a la enzima y el ensayo de (ELISA) inmunoabsorbente enlazado a la enzima de IFN-gama. Específicamente, las células A24LCL (1 x 104/depósito) impulsadas por el péptido o T2 (1 x 10 /depósito) fueron preparadas como células estimulantes. Las células cultivadas en 48 depósitos fueron utilizadas como células respondedoras. El ensayo ELISPOT de IFN-gama y el ensayo de ELISA de IFN-gama fueron realizados de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante.

Transfección del plásmido Los cADNs que codifican los cuadros de lectura abierta de los genes objetivo, HLA-A24 y HLA-A*0201 fueron amplificados por PCR. El producto amplificado por PCR de los genes objetivo y HLA-A24 o HLA-A*0201 fueron clonados en el vector pIRES (Clontech Laboratories, Inc., Catálogo. No. 631605). Los plásmidos fueron transfectados en células COS7, los cuales son genes objetivos y las líneas de célula HLA-A24-nulas, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Después de 2 días de la transfección , las células transfectadas fueron recolectadas con verseno (Invitrogen) y utilizadas como las células objetivo (5 X 104 células/depósito) para el ensayo de actividad del CTL.

Resultados Predicción de péptidos de enlace HLA-A24 y HLA-A2 derivados del gen WDRPUH La Tabla 1 muestra los péptidos de enlace HLA-A24 del gen WDRPUH en orden de afinidad de enlace más alta. Un total de 25 péptidos que tienen una capacidad de enlace potencial de HLA-A24 fueron seleccionadas y examinadas para determinar los péptidos del epítope (Tabla 1). La Tabla 2 muestra los péptidos 9-mer y 0-mer de enlace a HLA-A2 del gen WDRPUH en orden de la afinidad de enlace más alta. Un total de 37 péptidos que tienen capacidad de enlace potencial al HLA-A2 fueron seleccionados y examinados para determinar los péptidos del epítope (Tabla 2).

[Tabla 1] Péptidos de enlace HLA-A24 derivados del gen WDRPUH pronosticados por BIMAS La posición del inicio indica el número de residuos de aminoácidos de la terminal-N del gen WDRPUH. La calificación de enlace es derivada de "BIMAS".

[Tabla 2] Péptidos de enlace de HLA-A2 derivados del gen WDRPUH pronosticados por BIMAS Nombre del Péptido Posición Inicial Secuencia de Aminoácido Calif. de Enlace SEQ ID NO.

\VDPRUII-A2-9mer 59 FLQGHGNNV 319.939 26 499 ILANTLFQC 11 .664 27 553 ITQEGVHFV 85.173 28 231 KMNPRTKLL 53.999 29 39 MIYPLGCTV 52.025 30 407 RLMYV1NNA 42.278 31 264 LLVGSGAGL 36.316 32 193 KI PTECQT 29.766 33 288 QLQGG1TSI 23.995 34 116 ALAFSPNDL 21.362 35 237 KLLTDVGPA 19.236 36 543 SLSGS1NGM 11.426 37 VVDPRLIU-A2-10mcr 94 ILWDyK REL 247.167 38 499 ILANtLFQCV 224.653 39 570 KVWDyNEGEV 94.23 40 263 GLLVgSGAGL 79.041 41 155 GLNVgNATNV 69.552 42 498 MILAnTLFQC 57.318 43 305 FLVGtEESHI 47.991 44 78 YIASgQVTFM 39.75 45 610 AlLRwKYPYT 31.277 46 86 FMGFkADIIL 29.098 47 325 TLIAtCHFDA 28.814 48 10 QVAE1ELDAV 28.121 49 560 FVTGgNDHLV 27.995 50 108 SLHKgKTEAL 24.075 51 374 NMTChGIDFM 22.24 52 221 YLGTtTGDIL 19.742 53 231 KNdNPrTKLLT 18.837 54 411 VINNaHRJGV 16.258 55 51 AINTkEQNFL 16.155 56 287 IQLQgGITSI 15.303 57 326 LIATcHFDAV 15.136 58 437 GEGEvRVWQI 14.347 59 338 IVFPfGTAEL 11.757 60 265 LVGSgAGLLV 10.346 61 117 LAFSpNDLYL 10.264 62 La posición del inicio indica el número de residuos de aminoácidos de la terminal-N del gen WDRPUH. La calificación de enlace es derivada de "BIMAS".

Inducción del CTL con los péptidos pronosticados del gen WDRPUH restringidos con HLA-A*2402 y el establecimiento de las líneas del CTL estimuladas con péptidos derivados de WDRPUH Los CTLs para aquellos péptidos derivados del gen WDRPUH fueron generados de acuerdo con los protocolos como se describen en "Materiales y Métodos". La actividad CTL específica del péptido fue determinada por el ensayo ELISPOT de IFN-gama (figura de la 1a a la 1f). Se mostró que el #3 y el #6 estimulados con el gen WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID No: 1) (a), el #8 con el gen WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2) (b), el #2 y el #6 con el gen WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID No: 3) (c), el #1, el #2 y el #5 con el gen WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID No: 4) (d), el #2, el #3, el #4, el #6, el #7 y el #8 con el gen WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID No: 16) (e) y el #5, el #6 y el #8 con el gen WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID No: 17) (f) demostraron una producción potente de IFN-gama comparada con los depósitos de control.

Además, las células en los depósitos positivos de los números #6 estimulados con la SEQ ID No: 1, el #8 con la SEQ ID No: 2, el #2 con la SEQ ID No: 3, el #5 con la SEQ ID No: 4, el #4 con la SEQ ID No: 16 y el #6 con la SEQ ID No: 17 fueron expandidos y establecidos como líneas CTL. La actividad del CTL de estas líneas CTL fue determinada por el ensayo de ELISA de IFN-gama (figuras de la 2a a la 2f). Todas las líneas CTL demostraron una producción potente de IFN-gama contra las células objetivo impulsadas con los péptidos correspondientes comparados con las células objetivo sin el impulso del péptido. Por otra parte, no se pudieron establecer líneas CTL mediante el estímulo con otros péptidos mostrados en la Tabla 1, a pesar del hecho de que los péptidos fueron pronosticados que tenían una actividad de enlace con el HLA-A*2402 (datos no mostrados). Como resultado, 6 péptidos derivados del gen WDRPUH fueron seleccionados como péptidos que pueden inducir líneas CTL potentes.

Actividad CTL específica contra las células objetivo que expresan exóaenamente el WDRPUH v el HLA-A*2402 Las líneas CTL establecidas originadas contra los péptidos de la presente invención fueron examinadas por su capacidad para reconocer las células objetivo que expresan endógenamente la molécula WDRPUH y HLA-A*2402. La actividad específica del CTL contra las células COS7 transfectadas tanto con el WDRPUH de longitud completa y los genes de la molécula HLA-A*2402 (un modelo específico para las células objetivo que expresan exógenamente los genes WDRPUH y HLA-A*2402) fueron probadas utilizando las líneas CTL originadas por los péptidos correspondientes como las células efectuadoras. Las células COS7 tra nsfectadas con cualquiera del gen WDRPUH o el HLA-A*2402 de longitud completa fueron preparadas como control. En la figura 3, los CTLs estimulados con las SEQ ID No: 2 mostraron una actividad CTL potente contra las células COS7 expresando ambos el WDRPUH y el H LA- A*2402. En contraste, no se detectó actividad CTL específica importante contra los controles. De este modo, estos datos demuestran claramente que el WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2) fue procesado de manera natural y presentado en la superficie de las células objetivo con la molécula HLA-A*2402 y fue reconocido por los CTLs. Estos resultados indicaron que este péptido derivado del WDRPUH puede ser aplicable como vacunas contra el cáncer para pacientes con tumores que expresan el WDRPUH.

Inducción de CTL con los péptidos pronosticados del WDRPUH restringidos con HLA-A*0201 Los péptidos que reconocen los CTLs derivados de WDRPUH fueron generados de acuerdo con los protocolos descritos en "Materiales y Métodos". La actividad CTL específica del péptido fue determinada por el ensayo ELISPOT de IFN-gama (figuras de la 4a a la 41). Los números de depósito #2 y #7 estimulados con el gen WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID No: 30) (a), #2 con el gen WDRPU H-A2-9-407 (SEQ ID No: 31) (b), #3 con el gen WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID No: 34) (c), #6 con el gen WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID No: 36) (d), #4 con el gen WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID No: 37) (e), #4 con el gen WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID No: 40) (f), #2 y #8 con el gen WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID No: 41) (g), #5 con el gen WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID No: 45) (h), #2 con el gen WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID No: 49) (i), #6 con el gen WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID No: 55) (j), #7 con el gen WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID No: 57) (k) y #6 con el gen WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID No: 61) (I) demostraron una producción potente de IFN-gama comparada con los depósitos de control. Por otra parte, no se podría detectar producción potente de IFN-gama mediante el estímulo con otros péptidos mostrados en la Tabla 2, a pesar del hecho de que estos péptidos se pronosticó que tendrían una actividad de enlace con las células HLA-A*0201 (datos no mostrados).

Establecimiento de las líneas CTL y clones contra los péptidos específicos de WDRPUH Las células que mostraron una actividad CTL específica del péptido por el ensayo ELISPOT de IFN-gama en los depósitos números #7 estimulados con la SEQ ID No: 30 y #3 con la SEQ ID No: 34 se expandieron y establecieron como líneas CTL. La actividad de CTL de estas líneas CTL fue determinada mediante el ensayo de ELISA de IFN-gama (figuras 5a y 5b). Ambas líneas CTL demostraron una producción potente de IFN-gama contra las células objetivo impulsadas con los péptidos correspondientes comparados con las células objetivo sin el impulso del péptido. Además, los clones de CTL fueron establecidos limitando la dilución de las líneas CTL, y la producción de IFN-gama de los clones de CTL contra las células objetivo impulsadas con los péptidos correspondientes fue determinado por el ensayo de ELISA de IFN-gama. Las producciones potentes de IFN-gama de los clones CTL estimulados con SEQ ID No: 30 y SEQ ID No: 34 son demostrados en las figuras 5c y 5d.

Actividad CTL específica contra células objetivo que expresan exóaenamente WDRPUH v HLA-A*0201 Los clones CTL establecidos originados contra los péptidos de la presente invención fueron examinados por su capacidad para reconocer las células objetivo que expresan endógenamente la molécula WDRPUH y HLA-A*0201. La actividad CTL específica contra las células COS7 transfectadas tanto con los genes de la molécula WDRPUH de longitud completa como la molécula HLA-A*0201 (un modelo específico para las células objetivo que expresan endógenamente el gen WDRPUH y HLA-A*0201 ) fueron probadas utilizando las líneas CTL originadas por los péptidos correspondientes como las células efectuadoras. Las células COS7 transfectadas ya sea con los genes WDRPUH o H LA-A* 0201 de longitud completa fueron preparadas como controles. En la figura 5e, los CTLs estimulados con la SEQ ID No: 34 mostraron una actividad CTL potente contra las células COS7 expresando ambos WDRPUH y HLA-A*0201. En contraste, no se detectó actividad CTL específica importante contra los controles. Estos datos demuestran claramente que los péptidos de los WDRPU H-A02-9-288 (SEQ ID No: 34) fueron procesados endógenamente y presentados en la superficie de las células objetivo con la molécula HLA-A*0201 y fueron reconocidos por los CTLs. Estos resultados indicaron que los WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID No: 34) pueden ser aplicables como vacunas contra el cáncer para pacientes con tumores que expresan el WDRPUH.

Análisis de homología de los péptidos del antíqeno Los CTLs estimulados con WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID No: 1), WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2), WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID No: 3), WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID No: 4), WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID No: 16), WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID No: 17), WDRPUH-A02-9-39 (SEQ ID No: 30), WDRPUH-A02-9-407 (SEQ ID No: 31), WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID No: 34), WDRPUH-A02-9-237 (SEQ ID No: 36), WDRPUH-A02-9-543 (SEQ ID No: 37), WDRPUH-A02-10-570 (SEQ ID No: 40), WDRPUH-A02-10-263 (SEQ ID No: 41), WDRPUH-A02-10-78 (SEQ ID No: 45), WDRPUH-A02-10-10 (SEQ ID No: 49), WDRPUH-A02-10-411 (SEQ ID No: 55), WDRPUH-A02-10-287 (SEQ ID No: 57) y WDRPUH-A02-10-265 (SEQ ID No: 61) mostraron una actividad importante del CTL importante y específica. Este resultado puede ser debido al hecho de que estas secuencias del péptido son homologas a los péptídos derivados de otras moléculas que se conoce que se sensibilizan con el sistema inmune humano.

Para excluir esta posibilidad, los análisis de homología se realizaron para estas secuencias de péptidos utilizando como preguntas el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) el cual no reveló secuencias con homología importante. Los resultados de los análisis de homología indican que las secuencias de WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID No: 1), WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID No: 2), WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID No: 3), WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID No: 4), WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID No: 16), WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID No: 17), WDRPUH-A02-9-39 (SEQ ID No: 30), WDRPUH-A02-9-407 (SEQ ID No: 31), WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID No: 34), WDRPUH-A02-9-237 (SEQ ID No: 36), WDRPUH-A02-9-543 (SEQ ID No: 37), WDRPUH-A02-10-570 (SEQ ID No: 40), WDRPUH-A02-10-263 (SEQ ID No: 41), WDRPUH-A02-10-78 (SEQ ID No: 45), WDRPUH-A02-10-10 (SEQ ID No: 49), WDRPUH-A02-10-411 (SEQ ID No: 55), WDRPUH-A02-10-287 (SEQ ID No: 57) y WDRPUH-A02-10-265 (SEQ ID No: 61) son únicos y por lo tanto, existe otra posibilidad, a lo mejor de nuestro entender, de que estas moléculas originen respuestas inmunológicas no pretendidas para algunas moléculas no relacionadas.

En conclusión, los péptidos del epítope HLA-A24 y A2 nuevos fueron identificados y demostraron que eran aplicables para la inmunoterapia del cáncer.

Aplicabilidad Industrial La presente invención describe nuevos TAAs, particularmente aquellos derivados del gen WDRPUH los cuales inducen respuestas inmunes antitumor potentes y específicas y tienen la aplicabilidad para los tipos de cáncer tales como el carcinoma hepatocelular. Dichos TAAs garantizan el desarrollo adicional de la aplicación clínica de una estrategia de vacunas de péptidos en el cáncer.

Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle con referencia a modalidades específicas de la misma, deberá quedar entendido que la descripción anterior es de ejemplo y de naturaleza explicatoria y no pretende ilustrar la invención y sus modalidades preferidas. A través de la experimentación de rutina, un experto en la técnica fácilmente reconocerá que se pueden hacer varios cambios y modificaciones a los mismos sin salirse del espíritu y alcance de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención pretende ser definida no por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un enlace péptido aislado de un antígeno HLA y que tiene una capacidad de inducción del linfocito T citotóxico (CTL), caracterizado porque el péptido consiste de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 64 o es un fragmento de la misma.

2. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno de HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

3. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque es un nonapéptido o un decapéptido.

4. El péptido aislado tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41 , 45, 49, 55, 57 y 6 .

5. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61 en donde 1, 2, o varios aminoácidos son substituidos, eliminados, insertados y/o agregados.

6. El péptido tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 16 y 17, en donde el péptido, cuando el antígeno de HLA es HLA-A24, tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal-N es seleccionado del grupo de fenilalanina, tirosina, metionina y triptofano; y (b) el aminoácido de la terminal-C es seleccionado del grupo de fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano y metionina.

7. El péptido tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID Nos: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 y 61, en donde el péptido, cuando el antígeno de HLA es HLA-A2, tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal-N es seleccionado del grupo de leucina y metionina; y (b) el aminoácido de la terminal-C es seleccionado del grupo de valina y leucina.

8. Un polinucleótido aislado que codifica un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

9. Un agente para inducir el CTL, caracterizado porque el agente contiene uno o más péptidos tal y como se describen en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, o uno o más polinucleotidos tal y como se describen en la reivindicación 8.

10. Un agente farmacéutico para el tratamiento y/o profilaxis del cáncer, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo, caracterizado porque el agente comprende uno o más péptidos tal y como se describen en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, o uno o más polinucleotidos tal y como se describen en la reivindicación 8.

11. El agente farmacéutico tal y como se describe en la reivindicación 10, formulado para la administración a un sujeto cuyo antígeno de HLA es HLA-A24 o HLA-A2.

12. Un método para inducir una célula que presenta el antígeno (APC) con la capacidad de inducción del CTL, caracterizado porque el método comprende un paso seleccionado de: (a) poner en contacto una APC con un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 in vitro, ex vivo o in vivo; y (b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 dentro de una APC.

13. Un método para inducir el CTL, caracterizado porque el método comprende el paso seleccionado de: (a) co-cultivar células CD8 T positivas con APCs, las cuales presentan en su superficie un complejo de un antígeno de HLA y un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7; (b) co-cultivar células CD8 T positivas con exosomas, las cuales presentan en su superficie un complejo de un antígeno de HLA y un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7; y (c) introducir un polinucleótido que codifica un enlace del polipéptido de la subunidad del receptor de la célula T (TCR) a un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 dentro de una célula T.

14. Una APC aislada que presenta en su superficie un complejo de un antígeno de HLA y un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

15. La APC tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizada porque es inducida mediante el método tal y como se describe en la reivindicación 12.

16. Un CTL aislado que tiene como objetivo cualquier péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

17. El CTL tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque es inducido mediante el método tal y como se describe en la reivindicación 13.

18. Un método para inducir una respuesta inmune contra un cáncer en un sujeto, comprendiendo dicho método los pasos de administrar al sujeto un agente que comprende un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, un fragmento activo inmunológicamente del mismo, o un polinucleotido que codifica el péptido o el fragmento.