ES2913148T3 - Péptidos con epítopos WDRPUH y vacunas que los contienen - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que se une a HLA-A2 y que tiene inducibilidad por linfocitos T citotóxicos (CTL), consistiendo dicho péptido aislado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos con epítopos WDRPUH y vacunas que los contienen

[Campo técnico]

La presente solicitud reivindica el beneficio de las Solicitudes Provisionales U.S. No. 61/200.962, presentada el 5 de diciembre de 2008, y 61/209.704, presentada el 9 de marzo de 2009.

La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de la terapia del cáncer. En particular, la presente invención se refiere a nuevos péptidos que son extremadamente efectivos como vacunas contra el cáncer y fármacos para tratar y prevenir tumores. La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

[Antecedentes de la técnica]

Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8 positivos reconocen los péptidos epitópicos derivados de los antígenos asociados a tumores (TAA) que se encuentran en las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), y luego destruyen las células tumorales. Desde el descubrimiento de la familia del antígeno del melanoma (MAGE) como el primer ejemplo de TAA, se han descubierto muchos otros TAA, principalmente a través de enfoques inmunológicos (Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Algunos de estos TAA se encuentran actualmente en desarrollo clínico como dianas inmunoterapéuticas.

La identificación de nuevos TAA, capaces de inducir respuestas inmunitarias antitumorales potentes y específicas, justifica un mayor desarrollo y aplicación clínica de estrategias de vacunación con péptidos para varios tipos de cáncer (Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg Sh et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81 (3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81 (3): 387-94). Hasta la fecha, ha habido varios informes de ensayos clínicos que utilizan estos péptidos derivados de antígenos asociados a tumores. Desafortunadamente, hasta ahora solo se ha observado una baja tasa de respuesta objetiva en estos ensayos de vacunas contra el cáncer (Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

Como diana para la inmunoterapia, son adecuados los TAA indispensables para la proliferación y supervivencia de las células cancerosas, porque el uso de tales TAA puede minimizar el riesgo bien descrito de escape inmunitario de las células cancerosas atribuible a la eliminación, mutación o regulación negativa de los TAA como consecuencia de la selección inmunitaria impulsada terapéuticamente.

WDRPUH se identificó como una nueva proteína de repetición WD que se regula positivamente en el carcinoma hepatocelular a través del perfil de expresión génica utilizando una micromatriz de ADNc de todo el genoma que contiene 23.040 genes (Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55, documento WO 2003/104276). Se ha informado que las proteínas que contienen repeticiones WD desempeñan un papel crucial en una amplia gama de funciones fisiológicas, incluida la transducción de señales, el procesamiento de ARN (Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709.), remodelación del citoesqueleto (Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36), regulación del tráfico vesicular (Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75), y división celular (Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30). El análisis de transferencia Northern demostró que WDRPUH se sobreexpresaba a un nivel significativamente alto en la gran mayoría de los carcinomas hepatocelulares, pero no se expresaba en órganos normales excepto en los testículos. Además, se demostró que la supresión de la expresión de WDRPUH por siRNA inhibe significativamente el crecimiento de líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano (Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55, documento WO 2003/104276).

[Lista de citas]

[Bibliografía de patente]

[PTL 1] Documento WO 2003/104276

[Bibliografía no de patente]

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3]Harris CC, J Natl Cáncer Inst 1996 Oct 16, 88(20) 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1,59(13), 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1,59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7]Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81 (3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81 (3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55

[NPL 15] Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709

[NPL 16] Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36)

[NPL 17] Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75

[NPL 18] Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91 (2):221 -30

[Sumario de la invención]

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de dianas adecuadas de inmunoterapia. Debido a que el sistema inmunológico generalmente percibe los TAA como "propios", y por lo tanto a menudo no tienen inmunogenicidad innata, el descubrimiento de dianas apropiadas es de extrema importancia. Como se señaló anteriormente, reconociendo que WDRPUH (SEQ ID NO: 64 codificada por el gen de No. de Acceso GenBank NM_145054 (SEQ ID NO: 63)) se ha identificado como regulado al alza en tejido canceroso de carcinoma hepatocelular, WDRPUH es una diana candidata para inmunoterapia.

La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de péptidos epitópicos específicos de los productos génicos de WDRPUH que poseen la capacidad de inducir CTL específicos de WDRPUH. Como se analiza a continuación, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un donante sano se estimularon usando péptidos candidatos de unión a HLA-A*2402 o HLA-A*0201 derivados de WDRPUH. Después, se establecieron líneas de CTL con citotoxicidad específica frente a células diana positivas para HLA-A24 o HLA-A2 pulsadas con cada uno de los péptidos candidatos. Los resultados demostraron que los péptidos son péptidos epitópicos restringidos por HLA-A24 o HLA-A2 que pueden inducir respuestas inmunitarias potentes y específicas contra las células que expresan WDRPUH en la superficie. Además, indicó que WDRPUH es fuertemente inmunogénico, y sus epítopos son dianas eficaces para la inmunoterapia tumoral.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar péptidos aislados que se unen al antígeno HLA, péptidos los cuales consisten en WDRPUH (SEQ ID NO: 64) o un fragmento de WDRPUH. Se espera que tales péptidos tengan inducibilidad de CTL y se pueden usar para inducir CTL en ex vivo, o para administrarlos a un sujeto para inducir respuestas inmunitarias contra cánceres tales como carcinoma hepatocelular. Para cumplir este objetivo, la presente invención proporciona un péptido aislado que se une a HLA-A2 y que tiene inducibilidad por linfocitos T citotóxicos (CTL), consistiendo dicho péptido aislado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un polinucleótido aislado que codifica el péptido de la presente invención. Este polinucleótido se puede usar para inducir células que expresan antígenos (APC) con inducibilidad de CTL, o para administrarlo a un sujeto para inducir respuestas inmunitarias contra el presente péptido, y de este modo, finalmente contra cánceres.

Cuando se administra a un sujeto, el presente péptido se presenta en la superficie de las APC e induce entonces CTL que se dirigen contra el péptido respectivo. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar agentes que contengan el péptido o polinucleótido de la presente invención para inducir CTL. Estos agentes que contienen el péptido o polinucleótido de la presente invención pueden usarse para el tratamiento y/o profilaxis de cánceres, tal como carcinoma hepatocelular, y/o para la prevención de la recurrencia posoperatoria del mismo. De este modo, es aún otro objeto de la presente invención proporcionar agentes farmacéuticos para el tratamiento y/o profilaxis de cánceres, y/o prevención de la recurrencia posoperatoria de los mismos, que contengan el péptido o polinucleótido de la presente invención.

El péptido o polinucleótido de la presente invención tiene la capacidad de inducir APCs que presentan en su superficie un complejo de un HLA-A*0201 y el presente péptido. Por ejemplo, la inducción puede lograrse poniendo en contacto las APC derivadas de un sujeto con un péptido de la presente invención, o introduciendo en las APC un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención. Tales APC tienen una alta inducibilidad de CTL contra el péptido diana, y son útiles para la inmunoterapia del cáncer. Por lo tanto, es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos in vitro o ex-vivo para inducir APC con inducibilidad de CTL, y APC obtenidas por los métodos.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos in vitro para inducir CTL, métodos los cuales contienen la etapa de cocultivar con APC células positivas para CD8, o exosomas que presentan un complejo de un HLA-A*0201 y el péptido de la presente invención en su superficie, o la etapa de introducir un polinucleótido en una célula T, polinucleótido el cual codifica un polipéptido de la subunidad del receptor de células T (TCR) que se une al péptido de la presente invención. Los CTL obtenidos por los métodos son útiles para tratar y/o prevenir cánceres, tal como carcinoma hepatocelular. Por lo tanto, un objeto adicional de la presente invención es proporcionar CTL obtenidos mediante cualquiera de los presentes métodos.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para inducir respuesta inmune contra un carcinoma hepatocelular en un sujeto cuyo HLA es HLA-A*0201, composición la cual contiene el péptido de la presente invención.

Debe entenderse que tanto el sumario anterior de la invención como la siguiente descripción detallada son realizaciones ejemplificadas y no limitativas de la invención u otras realizaciones alternativas de la invención.

[Breve descripción de los dibujos]

[Fig. 1]

La Figura 1 incluye una serie de fotografías que representan los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-gamma en CTL que se indujeron con péptidos derivados de WDRPUH. Los CTL en los pocillos números #3 y #6 estimulados con WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1) (a), #8 con WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) (b), #2 y #6 con WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3) (c), #1, #2 y #5 con WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4) (d), #2, #3, #4, #6, #7 y #8 con WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16) (e), y #5, #6 and #8 con WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17) (f), mostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con el control, respectivamente. Las celdas de los pocillos indicados con un recuadro rectangular se expandieron para establecer líneas CTL. En la figura, "+" indica que las células de los pocillos recibieron pulsos con los péptidos apropiados, y "-" indica que las células no recibieron pulsos con ningún péptido.

[Fig. 2]

La Figura 2 incluye una serie de gráficos lineales que representan la producción de IFN-gamma de líneas CTL estimuladas con WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1) (a), WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) (b), WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3) (c), WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4) (d), WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16) (e) y WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17) (f) con ensayo ELISA de IFN-gamma. Las líneas de CTL establecidas por estimulación con cada uno de los péptidos mostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con el control. En la figura, "+" indica que las células de los pocillos recibieron pulsos con los péptidos apropiados, y "-" indica que las células no recibieron pulsos con ningún péptido.

[Fig. 3]

La Figura 3 se compone de un gráfico de líneas que representa la actividad de CTL específica contra las células diana que expresan exógenamente WDRPUH y HLA-A*2402. Se prepararon células COS7 transfectadas solamente con HLA-A*2402 o con solamente el gen WDRPUH de longitud completa como control. La línea CTL establecida con WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) mostró actividad de CTL específica contra células COS7 transfectadas tanto con WDRPUH como con HLA-A*2402 (pastilla negra). Por el contrario, no se detectó actividad de CTL específica significativa frente a células diana que expresan HLA-A*2402 (triángulo) o WDRPUH (círculo).

[Fig. 4a-h]

La Figura 4a-h incluye una serie de fotografías que representan los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-gamma en CTL que se indujeron con péptidos derivados de WDRPUH. Los CTL en los pocillos números #2 y #7 estimulados con WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO: 30) (a), #2 con WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO: 31) (b), #3 con WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34) (c), #6 con WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO: 36) (d), #4 con WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO: 37) (e), #4 con WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40) (f), #2 y #8 con WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO: 41) (g), #5 con WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO: 45) (h), mostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con el control, respectivamente. Las celdas de los pocillos indicados con un recuadro rectangular se expandieron para establecer líneas CTL. En la figura, "+" indica que las células de los pocillos recibieron pulsos con los péptidos apropiados, y "-" indica que las células no recibieron pulsos con ningún péptido.

[Fig. 4i-l]

La Figura 4i-l incluye una serie de fotografías que representan los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-gamma en CTL que se indujeron con péptidos derivados de WDRPUH. Los CTL en los pocillos números #2 estimulados con WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO: 49) (i), #6 con WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO: 55) (j), #7 con WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO: 57) (k), y #6 con WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO: 61) (l), mostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con el control, respectivamente. Las celdas de los pocillos indicados con un recuadro rectangular se expandieron para establecer líneas CTL. En la figura, "+" indica que las células de los pocillos recibieron pulsos con los péptidos apropiados, y "-" indica que las células no recibieron pulsos con ningún péptido.

[Fig. 5]

Las Figuras 5a y b se componen de gráficos lineales que representan la producción de IFN-gamma de líneas CTL estimuladas con SEQ ID NO: 30 (a) y SEQ ID n O: 34 (b) detectadas por ensayo ELISA de IFN-gamma. Las líneas de CTL establecidas por estimulación con cada péptido mostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con el control. En la figura, "+" indica que las células de los pocillos recibieron pulsos con los péptidos apropiados, y "-" indica que las células no recibieron pulsos con ningún péptido. Las Figuras 5c y 5d representan la producción de IFN-gamma de los clones de CTL establecidos mediante la dilución limitante de las líneas de CTL estimuladas con SEQ ID NO: 30 (c) y SEQ ID NO: 34 (d). Los resultados representados aquí demuestran que los clones de CTL establecidos por estimulación con SEQ ID NO: 30 (c) y SEQ ID NO: 34) (d) mostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con el control. En la figura, "+" indica que las células de los pocillos se pulsaron con SEQ ID NO: 30 (c) y SEQ ID NO: 34 (d), y "-" indica que las células no habían recibido ningún péptido. La Figura 5e se compone de un gráfico de líneas que representa la actividad de CTL específica contra las células diana que expresan exógenamente WDRPUH y HlA-A*0201 . Se prepararon como controles células COS7 transfectadas solamente con HLA-A*0201 o con solamente el gen WDRPUH de longitud completa. El clon de CTL establecido con WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34) mostró actividad de CTL específica contra células COS7 transfectadas tanto con WDRPUH como con HLA-A*0201 (pastilla negra). Por el contrario, no se detectó actividad de CTL específica significativa frente a células diana que expresan HLA-A*0201 (triángulo) o WDRPUH (círculo).

[Descripción de las realizaciones]

En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos, y no pretenden ser limitativos.

I. Definiciones

Las palabras "un", "una" y "el/la", como se usan aquí, significan "al menos uno", a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente aquí para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un resto modificado, o un resto que no se produce de forma natural, tal como un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.

El término "aminoácido", como se usa aquí, se refiere a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los modificados después de la traducción en las células (por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina). La frase "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un carbono alfa unido a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino y un grupo R) como un aminoácido natural pero tienen un grupo R modificado o esqueletos modificados (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, metionina metil sulfonio). La frase "mimético de aminoácidos" se refiere a compuestos químicos que tienen estructuras diferentes pero funciones similares a los aminoácidos generales.

Aquí se puede hacer referencia a los aminoácidos mediante sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o a los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.

Los términos "polinucleótidos", "genes", "nucleótidos" y "ácidos nucleicos" se usan indistintamente aquí, a menos que se indique específicamente lo contrario.

A menos que se defina de otro modo, el término "cáncer" se refiere a los cánceres que sobreexpresan el gen WDRPUH, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, carcinoma hepatocelular.

A menos que se defina lo contrario, los términos "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica" y "CTL" se usan indistintamente aquí, y, a menos que se indique específicamente lo contrario, se refieren a un subgrupo de linfocitos T que son capaces de reconocer células no propias (por ejemplo, células tumorales, células infectadas por virus) e inducir la muerte de dichas células.

A menos que se defina lo contrario, el término "HLA-A2" contiene subtipos tales como HLA-A0201 o HLA-A0206. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

II. Péptidos

Para demostrar que los péptidos derivados de WDRPUH funcionan como un antígeno reconocido por los CTL, se analizaron los péptidos derivados de WDRPUH (SEQ ID NO: 64) para determinar si eran epítopos de antígenos restringidos por HLA-A24 que son alelos de HLA comúnmente encontrados (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Los candidatos de péptidos de unión a HLA-A24 derivados de WDRPUH se identificaron en función de sus afinidades de unión a HLA-A24. Los siguientes péptidos son los péptidos candidatos:

WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1),

WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2),

WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3),

WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4),

WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16), y

WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17).

Los candidatos de péptidos de unión a HLA-A02 derivados de WDRPUH se identificaron en función de sus afinidades de unión a HLA-A02. Los siguientes péptidos son los péptidos candidatos:

WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO: 30),

WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO: 31),

WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34),

WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO: 36),

WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO: 37),

WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40),

WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO: 41),

WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO: 45),

WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO: 49),

WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO: 55),

WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO: 57), y

WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO: 61).

Estos CTL establecidos muestran una potente actividad de CTL específica contra células diana pulsadas con los péptidos respectivos. Estos resultados demuestran aquí que WDRPUH es un antígeno reconocido por CTL, y que los péptidos pueden ser péptidos epitópicos de WDRPUH restringidos por HLA-A24 o HLA-A2.

Dado que el gen WDRPUH se sobreexpresa en células cancerosas tales como el carcinoma hepatocelular y no en la mayoría de los órganos normales, es una buena diana para la inmunoterapia. De este modo, la presente invención proporciona un péptido aislado que se une a HLA-A2 y que tiene inducibilidad por linfocitos T citotóxicos (CTL), consistiendo dicho péptido aislado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

Aunque se espera que los péptidos que tienen una alta afinidad de unión a los antígenos HLA como se describe anteriormente sean altamente eficaces, los péptidos candidatos, que se seleccionan según la presencia de una alta afinidad de unión como indicador, se examinan más a fondo para determinar la presencia de inducibilidad de CTL. Aquí, la frase "inducibilidad de CTL" indica la capacidad del péptido para inducir CTL cuando se presenta en células presentadoras de antígeno (APC). Además, la "inducibilidad de CTL" incluye la capacidad del péptido para inducir la activación de CTL, la proliferación de CTL, promover la lisis de CTL de las células diana, y aumentar la producción de IFN-gamma de c Tl .

La confirmación de la inducibilidad de CTL se logra induciendo las APC que portan antígenos MHC humanos (por ejemplo, linfocitos B, macrófagos, y células dendríticas (DC)), o más específicamente DC derivadas de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana, y tras la estimulación con los péptidos, mezclando con células positivas para CD8, y midiendo entonces el IFN-gamma producido y liberado por los CTL contra las células diana. Como sistema de reacción, se pueden usar animales transgénicos que se han producido para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, los descritos en BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Por ejemplo, las células diana se pueden radiomarcar con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica se puede calcular a partir de la radiactividad liberada de las células diana. Alternativamente, la inducibilidad de CTL se puede evaluar midiendo el IFN-gamma producido y liberado por los CTL en presencia de las APC que transportan péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en los medios usando anticuerpos monoclonales anti-IFN-gamma.

Como resultado del examen de la inducibilidad de CTL de los péptidos como se describió anteriormente, se encontró que el péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 exhibe una inducibilidad de CTL particularmente alta, así como una alta afinidad de unión a HLA-A2.

Además, el resultado del análisis de homología mostró que estos péptidos no tienen una homología significativa con los péptidos derivados de cualquier otro producto génico humano conocido. Esto significa que la posibilidad de que surjan respuestas inmunitarias desconocidas o no deseadas debido al uso de los presentes péptidos en inmunoterapia es baja. Por lo tanto, también desde este aspecto, estos péptidos son preferibles para provocar inmunidad contra WDRPUH en pacientes con cáncer.

Aquí, el péptido de la presente invención también se puede describir como "péptido WDRPUH" o "polipéptido WDRPUH".

III. Preparación del péptido WDRPUH

El péptido de la invención se puede preparar usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede preparar sintéticamente, usando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. El péptido de la invención se puede sintetizar individualmente o como polipéptidos más largos compuestos por dos o más péptidos. A continuación, el péptido puede aislarse, es decir, purificarse o aislarse para que esté sustancialmente libre de otras proteínas de células hospedantes naturales y fragmentos de las mismas, o de cualquier otra sustancia química.

El péptido de la presente invención puede obtenerse mediante síntesis química basada en la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos de métodos de síntesis de péptidos convencionales que se pueden adaptar para la síntesis incluyen, pero no se limitan a:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (en japonés), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (en japonés), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (en japonés), Vol. 14 (síntesis de péptidos), Hirokawa, 1991;

(vi) documento WO99/67288; y

(vii) Barany G. y Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Alternativamente, el presente péptido se puede obtener adaptando cualquier método de ingeniería genética conocido para producir péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, en primer lugar, se prepara un vector adecuado que alberga un polinucleótido que codifica el péptido en una forma expresable (por ejemplo, en dirección 3’ de una secuencia reguladora correspondiente a una secuencia promotora), y se transforma en una célula hospedante adecuada. A continuación, la célula hospedante se cultiva para producir el péptido. El péptido también se puede producir in vitro adaptando un sistema de traducción in vitro.

IV. Polinucleótidos

La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención. Estos incluyen polinucleótidos derivados del gen WDRPUH de origen natural (No. de Acceso de GenBank NM_145054 (SEQ ID NO: 63)), así como aquellos que tienen una secuencia nucleotídica del mismo modificada de forma conservativa. Aquí, la frase "secuencia nucleotídica modificada de forma conservativa" se refiere a secuencias que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en la que un codón especifica una alanina, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservativa. Cada secuencia de ácido nucleico aquí que codifica un péptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un péptido se describe implícitamente en cada secuencia descrita.

El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto por ADN, ARN, y derivados de los mismos. Un ADN se compone adecuadamente de bases como A, T, C y G, y T se reemplaza por U en un ARN.

El polinucleótido de la presente invención puede codificar múltiples péptidos de la presente invención con o sin secuencias de aminoácidos intermedios. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos intermedia puede proporcionar un sitio de escisión (por ejemplo, secuencia de reconocimiento de enzima) del polinucleótido o de los péptidos traducidos. Además, el polinucleótido puede incluir cualquier secuencia adicional a la secuencia codificante que codifica el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión del péptido, o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores y similares. En general, tales polinucleótidos recombinantes pueden prepararse mediante la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales, usando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas.

Se pueden usar técnicas tanto de síntesis química como recombinantes para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido se puede producir mediante inserción en un vector apropiado, que se puede expresar cuando se transfecta en una célula competente. Alternativamente, un polinucleótido se puede amplificar usando técnicas de PCR o expresión en hospedantes adecuados (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Alternativamente, un polinucleótido se puede sintetizar usando las técnicas de fase sólida, tal como se describe en Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801 -5.

V. Exosomas

La presente invención emplea además vesículas intracelulares denominadas exosomas, las cuales presentan complejos formados entre el péptido de esta invención y HLA-A*0201 en su superficie. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, usando los métodos detallados en las Publicaciones Kohyo de Solicitud de Patente Japanesa Nos. Hei 11-510507 y WO99/03499, y pueden prepararse usando APC obtenidas de pacientes que están sujetos a tratamiento y/o prevención. Los exosomas empleados según esta invención pueden inocularse como vacunas, de manera similar al péptido de esta invención.

El tipo de antígenos HLA contenidos en los complejos debe coincidir con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, HLA-A24 y HLA-A2, particularmente HLA-A2402 y HLA-A0201 o HLA-A0206, son predominantes, y por lo tanto serían apropiados para el tratamiento de pacientes japoneses. El uso del tipo A24 o del tipo A2, que está muy expresado entre los japoneses y caucásicos, es favorable para obtener resultados efectivos, y también encuentran uso los subtipos tales como A2402, A0201 o A0206. Normalmente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga de antemano, lo que permite la selección adecuada de péptidos que tienen altos niveles de afinidad de unión al antígeno particular, o que tienen inducibilidad de CTL por presentación de antígeno.

VI. Células presentadoras de antígenos (APC)

La presente invención también proporciona una APC aislada que presenta en su superficie un complejo formado entre HLA-A*0201 y el péptido de esta invención. Las APC pueden derivar de pacientes que están sujetos a tratamiento y/o prevención, y pueden administrarse como vacunas por sí mismas o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos de esta invención, exosomas, o los CTL.

Las APC no se limitan a un tipo particular de célula, e incluyen DC, células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, que se sabe que presentan antígenos proteicos en su superficie celular para ser reconocidos por los linfocitos. Dado que la DC es una APC representativa que tiene la acción inductora de CTL más fuerte entre las APC, las DC encuentran uso como las APC de la presente invención.

Por ejemplo, una APC de la presente invención puede obtenerse induciendo las DC a partir de monocitos de sangre periférica, y poniéndolas entonces en contacto (estimulándolas) con los péptidos de esta invención in vitro o ex vivo. La frase "induciendo las APC" incluye poner en contacto (estimular) una célula con el péptido de esta invención, o un nucleótido que codifica el péptido de esta invención, para presentar en la superficie de la célula un complejo formado entre HLA-A*0201 y el péptido de esta invención. La APC de esta invención se puede obtener poniendo en contacto una APC recolectada de un sujeto con el péptido de esta invención.

Según un aspecto de la presente invención, la APC tiene un alto nivel de inducibilidad de CTL. En la expresión "alto nivel de inducibilidad de CTL", el alto nivel es con respecto al nivel alcanzado por las APC en contacto sin péptido o con péptidos que no pueden inducir CTL. Tal APC que tiene un alto nivel de inducibilidad de CTL se puede preparar mediante un método que incluye la etapa de transferir a una APC in vitro genes que contienen el polinucleótido de esta invención. Los genes introducidos pueden estar en forma de ADN o ARN. Los ejemplos de métodos para la introducción incluyen, sin limitaciones particulares, varios métodos llevados a cabo convencionalmente en este campo, tales como la lipofección, la electroporación, y el método del fosfato de calcio. Más específicamente, se puede realizar como se describe en Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; traducción japonesa publicada de la Publicación Internacional No. 2000-509281. Al transferir el gen a una APC, el gen experimenta transcripción, traducción, etc., en la célula, y entonces la proteína obtenida es procesada y presentada por MHC Clase I o Clase II a través de una ruta de presentación.

VII. Linfocitos T citotóxicos (CTL)

Un CTL inducido contra el péptido de la presente invención fortalece la respuesta inmunitaria dirigida a las células cancerosas in vivo, y de este modo puede usarse como vacuna, de manera similar a los péptidos per se. De este modo, la presente invención también proporciona CTL aislados que son específicamente inducidos o activados por el presente péptido.

Dichos CTL pueden obtenerse (1) poniendo en contacto (estimulando) APC y células CD8-positivas derivadas del sujeto, o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro, con el péptido de la presente invención, y aislando entonces los CTL; (2) poniendo en contacto células CD8 positivas o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con las APC o exosomas que presentan un complejo de un HLA-A*0201 y un péptido de la presente invención sobre su superficie, y aislando entonces los CTL; o (3) introduciendo en una célula T un gen que codifica un polipéptido de la subunidad del receptor de células T (TCR) que se une a un péptido de esta invención. Las APC o exosomas se pueden preparar mediante los métodos descritos anteriormente, y el método de (3) se detalla a continuación en la sección de "VIII. Receptor de células T (TCR)".

Los CTL de esta invención, que han sido inducidos por estimulación con una APC que presenta un péptido de esta invención, pueden derivar de pacientes que estén sujetos a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar solos o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos de esta invención o exosomas, con el fin de regular los efectos. El CTL obtenido actúa específicamente contra las células diana que presentan el péptido de esta invención, por ejemplo el mismo péptido usado para la inducción. Las células diana pueden ser células que expresan endógenamente WDRPUH, por ejemplo carcinoma hepatocelular, o células que se transfectan con el gen WDRPUH; y las células que presentan un péptido de esta invención en la superficie celular debido a la estimulación por el péptido también pueden servir como dianas del ataque de CTL activados.

VIII. Receptor de células T (TCR)

La presente invención también emplea una composición que contiene ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son capaces de formar una subunidad de un receptor de células T (TCR), y métodos para usar la misma. Las subunidades de TCR tienen la capacidad de formar TCR que confieren especificidad a las células T frente a las células tumorales que presentan el péptido específico de la presente invención. Mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, se pueden identificar los ácidos nucleicos de las cadenas alfa y beta como las subunidades TCR de los CTL inducidos con uno o más péptidos de esta invención (documento WO2007/032255 y Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Por ejemplo, se prefiere el método de la PCR para analizar el TCR. Los cebadores de la PCR para el análisis pueden ser, por ejemplo,

cebadores 5'-R (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') como cebadores laterales 5' (SEQ ID NO: 65) y cebadores 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') específicos de la región C de la cadena alfa de TCR (SEQ ID NO: 66),

cebadores 3-TRb-Cl (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') específicos de la región C1 de la cadena beta del TCR (SEQ ID NO: 67), o

cebadores 3-TRbeta-C2 (5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3') específicos de la región C2 de la cadena beta de TCR (SEQ ID NO: 68) como cebadores laterales 3',

pero no se limitan a ellos. El TCR derivado se puede unir con gran avidez a las células diana que muestran el péptido WDRPUH, y opcionalmente puede mediar en la destrucción eficaz de las células diana que presentan el péptido WDRPUH in vivo e in vitro.

Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades de TCR pueden incorporarse en vectores adecuados, por ejemplo vectores retrovirales. Estos vectores son bien conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los contienen pueden transferirse útilmente a una célula T, por ejemplo una célula T de un paciente. Ventajosamente, la invención proporciona una composición lista para uso que permite la modificación rápida de las propias células T de un paciente (o las de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que tienen excelentes propiedades para destruir células cancerosas.

El TCR específico es un receptor capaz de reconocer específicamente un complejo de un péptido de la presente invención y una molécula HLA, dando una actividad específica de células T contra la célula diana cuando el TCR está en la superficie de la célula T. Un reconocimiento específico del complejo anterior se puede confirmar mediante cualquier método conocido, y los métodos preferidos incluyen, por ejemplo, análisis de tetrámero usando la molécula HLA y el péptido de la invención, y el ensayo ELISPOT. Al realizar el ensayo ELISPOT, se puede confirmar que una célula T que expresa el TCR en la superficie celular reconoce una célula por el TCR, y que la señal se transmite intracelularmente. La confirmación de que el complejo mencionado anteriormente puede proporcionar una actividad citotóxica de células T cuando el complejo existe en la superficie de las células T también se puede llevar a cabo mediante un método conocido. Un método preferido incluye, por ejemplo, la determinación de la actividad citotóxica frente a una célula diana positiva para HLA, tal como el ensayo de liberación de cromo. Además, la presente invención proporciona CTL que se preparan por transducción con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de las subunidades TCR que se unen al péptido WDRPUH de SEQ ID NO: 34. Los CTL transducidos son capaces de dirigirse a células cancerosas in vivo, y pueden ser expandidos por métodos de cultivo bien conocidos in vitro (por ejemplo, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). El CTL de la invención se puede usar para formar una composición inmunogénica útil en el tratamiento o la profilaxis del cáncer en un paciente que necesita terapia o protección (documento WO2006/031221).

La prevención y la profilaxis incluyen cualquier actividad que reduzca la carga de mortalidad o morbilidad de la enfermedad. La prevención y la profilaxis pueden ocurrir "a niveles de prevención primaria, secundaria, y terciaria". Mientras que la prevención y la profilaxis primarias evitan el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención y profilaxis abarcan actividades destinadas a la prevención y profilaxis de la progresión de una enfermedad y la aparición de síntomas, así como a reducir el impacto negativo de una enfermedad ya establecida mediante la restauración de la función y la reducción de las complicaciones relacionadas con la enfermedad. Alternativamente, la prevención y la profilaxis incluyen una amplia gama de terapias profilácticas destinadas a aliviar la gravedad del trastorno particular, por ejemplo reduciendo la proliferación y metástasis de tumores, reduciendo la angiogénesis.

El tratamiento y/o la profilaxis del cáncer y/o la prevención de la recurrencia posoperatoria del mismo incluye cualquiera de las siguientes etapas, tales como la extirpación quirúrgica de las células cancerosas, la inhibición del crecimiento de las células cancerosas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de la remisión y supresión de la aparición de cáncer, regresión tumoral, y reducción o inhibición de metástasis. El tratamiento eficaz y/o la profilaxis del cáncer disminuye la mortalidad y mejora el pronóstico de los individuos que padecen cáncer, disminuye los niveles de marcadores tumorales en la sangre, y alivia los síntomas detectables que acompañan al cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejora de los síntomas constituye un tratamiento y/o profilaxis eficaz, y dicha reducción o mejora de los síntomas incluye una reducción del 10%, 20%, 30% o más, o mantener un estado de enfermedad estable.

IX. Agentes o composiciones farmacéuticas

Dado que la expresión de WDRPUH está específicamente elevada (regulada al alza) en el carcinoma hepatocelular en comparación con el tejido normal (Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55), el péptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar para el tratamiento y/o profilaxis del carcinoma hepatocelular, y/o la prevención de la recurrencia posoperatoria del mismo. De este modo, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento y/o profilaxis del carcinoma hepatocelular y/o para la prevención de la recurrencia posoperatoria del mismo, que incluye el péptido o polinucleótido de esta invención como ingrediente activo.

Las presentes composiciones farmacéuticas encuentran uso como vacuna. En el contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (también denominada composición inmunogénica) se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad antitumoral tras la inoculación en animales.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención pueden ser para uso en el tratamiento y/o profilaxis del carcinoma hepatocelular, y/o la prevención de la recurrencia posoperatoria del mismo en sujetos o pacientes, incluyendo seres humanos y cualquier otro mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, ratones, rata, conejillo de Indias, conejo, gato, perro, oveja, cabra, cerdo, vaca, caballo, mono, babuino y chimpancé, particularmente un animal comercialmente importante o un animal domesticado.

Según la presente invención, se ha encontrado que un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 es un péptido epítopo restringido por HLA-A2 que puede inducir una respuesta inmunitaria potente y específica. Por lo tanto, la presente composición farmacéutica que incluye un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 es particularmente adecuada para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A*0201. Lo mismo se aplica a una composición farmacéutica que incluye un polinucleótido que codifica el péptido de esta invención (es decir, el polinucleótido de esta invención).

El cáncer a tratar por las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención es carcinoma hepatocelular.

Las presentes composiciones farmacéuticas para uso pueden contener, además de los ingredientes activos mencionados anteriormente, otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTL contra células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, o similares. Aquí, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTL contra células cancerosas se ejemplifican mediante antígenos específicos de cáncer (por ejemplo, los TAA identificados), pero no se limitan a ellos.

Si es necesario, las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras sustancias terapéuticas como ingrediente activo, siempre que la sustancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, por ejemplo cualquiera de los presentes péptidos. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes antiinflamatorios, analgésicos, quimioterapéuticos, y similares. Además de incluir otras sustancias terapéuticas en el propio medicamento, los medicamentos de la presente invención también se pueden administrar secuencial o simultáneamente con uno o más de los otros agentes farmacológicos. Las cantidades de medicamento y agente farmacológico dependen, por ejemplo, de qué tipo de agente(s) farmacológico(s) se usa(n), la enfermedad que se trata, y el calendario y vías de administración.

Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados aquí, las composiciones farmacéuticas para uso de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica, teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión.

En una realización de la presente invención, las presentes composiciones farmacéuticas para uso pueden incluirse en artículos de fabricación y kits que contienen materiales útiles para tratar las afecciones patológicas de la enfermedad a tratar, por ejemplo cáncer. El artículo de fabricación puede incluir un recipiente de las presentes composiciones farmacéuticas con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen botellas, viales, y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta del envase debe indicar que la composición se usa para tratar o prevenir una o más afecciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar instrucciones de administración, etc.

Además del recipiente descrito anteriormente, un kit que incluye una composición farmacéutica para uso de la presente invención puede incluir opcionalmente además un segundo recipiente que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso.

Las composiciones farmacéuticas a usar pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas monodosis que contengan el ingrediente activo. El envase puede incluir, por ejemplo, láminas de metal o plástico, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para su administración.

(1) Composiciones farmacéuticas que contienen el péptido como ingrediente activo

El péptido de esta invención se puede administrar directamente como una composición farmacéutica o, si es necesario, que se haya formulado mediante métodos de formulación convencionales. En el último caso, además del péptido de esta invención, se pueden incluir vehículos, excipientes y similares, que se usan normalmente para fármacos, según sea apropiado, sin limitaciones particulares. Ejemplos de dichos vehículos son agua esterilizada, disolución salina fisiológica, amortiguador de fosfato, fluido de cultivo, y similares. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener, según sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos, y similares.

La composición farmacéutica para uso en el tratamiento y/o prevención de carcinoma hepatocelular, que incluye un péptido de esta invención como ingrediente activo, también puede incluir un adyuvante conocido por establecer de manera eficaz la inmunidad celular. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas para uso pueden administrarse con otros ingredientes activos, o administrarse mediante formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a un compuesto que potencia la respuesta inmunitaria contra la proteína cuando se administra junto (o sucesivamente) con la proteína que tiene actividad inmunológica. Los adyuvantes contemplados en este documento incluyen los descritos en la bibliografía (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alumbre, toxina del cólera, toxina de salmonela, y similares, pero no se limitan a ellos.

Además, pueden usarse convenientemente formulaciones de liposomas, formulaciones granulares en las que el péptido se une a perlas de unos pocos micrómetros de diámetro, y formulaciones en las que un lípido se une al péptido.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención pueden incluir además un componente que ceba los CTL. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de cebar los CTL in vivo contra antígenos víricos. Por ejemplo, los restos de ácido palmítico pueden unirse a los grupos épsilon- y alfa-amino de un resto de lisina, y después pueden unirse a un péptido de la presente invención. A continuación, el péptido lipidado puede administrarse directamente en una micela o partícula, incorporarse a un liposoma, o emulsionarse en un adyuvante. Como otro ejemplo de respuestas de CTL cebados de lípidos, las lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS), se pueden usar para cebar CTL cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

El método de administración puede ser oral, intradérmico, subcutáneo, inyección intravenosa, o similar, y administración sistémica o administración local en la vecindad de los sitios diana. La administración puede realizarse mediante administración única, o puede potenciarse mediante múltiples administraciones. La dosis de los péptidos de esta invención puede ajustarse apropiadamente según la enfermedad a tratar, la edad del paciente, el peso, el método de administración, etc., y normalmente es de 0,001 mg a 1000 mg, por ejemplo 0,001 mg a 1000 mg, por ejemplo 0,1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez en unos pocos días a unos pocos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar apropiadamente una dosis adecuada.

(2) Composiciones farmacéuticas que contienen el polinucleótido como ingrediente activo

Las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención también pueden contener ácidos nucleicos que codifican el péptido de la presente invención en una forma expresable. Aquí, la frase "en una forma expresable'' significa que el polinucleótido, cuando se introduce en una célula, se expresará in vivo como un polipéptido que induce inmunidad antitumoral. En una realización ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye elementos reguladores necesarios para la expresión del polinucleótido. Los polinucleótidos pueden equiparse para lograr una inserción estable en el genoma de la célula diana (véase, por ejemplo, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12, para una descripción de vectores de casetes de recombinación homóloga). Véanse, por ejemplo, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; Patentes U.S. Nos. 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; y documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basadas en ADN incluyen "ADN desnudo", administración facilitada (bupivacaína, polímeros, mediada por péptidos), complejos de lípidos catiónicos, y administración mediada por partículas ("pistola de genes") o mediada por presión (véase, por ejemplo, Patente U.S. No. 5.922.687).

El péptido de la invención también puede expresarse mediante vectores virales o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen hospedantes virales atenuados, tales como el virus de la vacuna o la viruela aviar. Este enfoque implica el uso del virus de la vacuna, por ejemplo, como vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican el péptido. Tras la introducción en un hospedante, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de ese modo provoca una respuesta inmunitaria. Los vectores del virus de la vacuna y los métodos útiles en los protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4.722.848. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Será evidente una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización, por ejemplo vectores de adenovirus y virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax desintoxicada, y similares. Véanse, por ejemplo, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

La administración de un polinucleótido a un sujeto puede ser directa, en cuyo caso el sujeto se expone directamente a un vector portador de polinucleótido, o indirecta, en cuyo caso las células se transforman primero con el polinucleótido de interés in vitro, y después las células se trasplantan al sujeto. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapias génicas in vivo y ex vivo.

Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante que también se pueden usar para la presente invención se describen en eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; y Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

La administración puede ser oral, intradérmico, subcutáneo, inyección intravenosa, o similar, y encuentran uso la administración sistémica o la administración local en la vecindad de los sitios diana. La administración puede realizarse mediante administración única, o puede potenciarse mediante múltiples administraciones. La dosis del polinucleótido en el vehículo adecuado o en las células transformadas con el polinucleótido que codifica el péptido de esta invención se puede ajustar adecuadamente según la enfermedad a tratar, la edad del paciente, el peso, el método de administración, etc., y normalmente es 0,001 mg a 1000 mg, por ejemplo 0,001 mg a 1000 mg, por ejemplo 0,1 mg a 10 mg, y puede administrarse una vez cada pocos días a una vez cada pocos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar apropiadamente la dosis adecuada.

X. Métodos que utilizan péptidos, exosomas, APC y CTL

El péptido y el polinucleótido de la presente invención se pueden usar para inducir APC y CTL. Los exosomas y APC empleados según la presente invención también se pueden usar para inducir CTL. El péptido, el polinucleótido, el exosoma y la APC se pueden usar en combinación con cualquier otro compuesto siempre que los compuestos no inhiban su inducibilidad de CTL. De este modo, cualquiera de las composiciones farmacéuticas antes mencionadas se puede usar para inducir CTL, y además de las mismas, las que incluyen el péptido y el polinucleótido también se pueden usar para inducir APC como se analiza a continuación.

(1) Método de inducción de células presentadoras de antígeno (APC)

La presente invención proporciona métodos in vitro o ex vivo para inducir APC con alta inducibilidad de CTL usando el péptido o polinucleótido de esta invención.

Los métodos de la presente invención contienen la etapa de poner en contacto una APC con el péptido de esta invención in vitro o ex vivo.

Las APC no se limitan a un tipo particular de célula, e incluyen DC, células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, que se sabe que presentan antígenos proteicos en su superficie celular para ser reconocidos por los linfocitos. Preferiblemente, se pueden usar DC, ya que tienen la inducibilidad de CTL más fuerte entre las APC. Cualquier péptido de la presente invención puede usarse solo o con otros péptidos de esta invención.

Además, la presente invención también contempla la introducción de un polipéptido de esta invención en una APC para inducir APC con inducibilidad de CTL.

(2) Método de inducción de CTL

Además, la presente invención proporciona métodos in vitro para inducir los CTL, que comprenden cocultivar células T CD8-positivas con un exosoma o APC, que presenta en su superficie un complejo de un HLA-A*0201 y el péptido de esta invención.

Además, los CTL pueden inducirse introduciendo un polinucleótido que codifica una subunidad del TCR que se une a un péptido de esta invención en células CD8-positivas. Tal transducción se puede llevar a cabo como se describe anteriormente en la sección "VIII. Receptor de células T (TCR)".

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y ayudar a un experto en la realización y uso de la misma. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención.

[EJEMPLOS]

Materiales y métodos

Líneas celulares

La línea celular linfoblastoide A24 (A24LCL) se estableció por transformación con el virus de Ep-stein-bar en linfocitos B humanos positivos para HLA-A24. T2 (HLA-A2), COS7, línea celular de riñón de mono verde africano, se adquirieron de ATCC.

Selección de candidatos de péptidos derivados de WDRPUH

Los péptidos 9-meros y 10-meros derivados de WDRPUH que se unen a moléculas HLA-A*2402 y HLA-A*0201 se predijeron usando el software de predicción de unión "BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75), Kuzushima et al.(Blood 2001,98(6): 1872-81)). Estos péptidos se sintetizaron por Sigma (Sapporo, Japón) o Biosíntesis Inc. (Lewisville, TX) según un método estándar de síntesis en fase sólida, y se purificaron mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de fase inversa. La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos se determinaron mediante HPLC analítica y análisis de espectrometría de masas, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml, y se almacenaron a -80 grados C.

Inducción de CTL in vitro

Se usaron células dendríticas derivadas de monocitos (DC) como células presentadoras de antígeno (APC) para inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra péptidos presentados en antígeno leucocitario humano (HLA). Las DC se generaron in vitro como se describe en otra parte (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). Específicamente, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un voluntario normal (HLA-A*2402 positivo y HLA-A*0201 positivo) por disolución de Ficoll-Plaque (Pharmacia) se separaron por adherencia a una placa de cultivo tisular de plástico (Becton Dickinson), para enriquecerlas como la fracción de monocitos. La población enriquecida con monocitos se cultivó en presencia de 1000 U/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (R&D System) y 1000 U/ml de interleucina (IL)-4 (R&D System) en Medio AIM-V (Invitrogen) que contiene 2% de suero autólogo (AS) inactivado por calor. Después de 7 días de cultivo, las DC inducidas por citocinas se pulsaron con 20 micro-g/ml de cada uno de los péptidos sintetizados, en presencia de 3 micro-g/ml de beta 2-microglobulina durante 3 horas a 37 grados C en Medio AIM-V. Las células generadas parecían expresar moléculas asociadas a DC, tales como CD80, CD83, CD86 y HLA clase II, en sus superficies celulares (datos no mostrados).

Estas DC pulsadas con péptido se inactivaron entonces con mitomicina C (MMC) (30 micro-g/ml durante 30 min) o radiación X (20 Gy), y se mezclaron en una relación 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidas por selección positiva con CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Estos cultivos se establecieron en placas de 48 pocillos (Corning); cada pocillo contenía 1,5 x 104 DC pulsadas con péptidos, 3 x 105 células T CD8+, y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0,5 ml de medio AIM-V/2% AS. Tres días después, estos cultivos se complementaron con IL-2 (CHIRON) hasta una concentración final de 20 UI/ml. Los días 7 y 14, las células T se estimularon adicionalmente con las DC autólogas pulsadas con péptido. Las DC se prepararon cada vez siguiendo las mismas etapas descritas anteriormente. Los CTL se ensayaron contra células A24LCL o T2 pulsadas con péptido después de la 3a ronda de estimulación con péptido el día 21 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052­ 7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Procedimiento de expansión de CTL

Los CTL se expandieron en cultivo usando un método similar al descrito por Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Se suspendió un total de 5 x 104 CTL en 25 ml de medio AIM-V/5% AS con 2 tipos de líneas celulares linfoblastoides B humanas, inactivadas con mitomicina C, en presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de iniciar los cultivos, se añadieron a los cultivos 120 UI/ml de IL-2. Los cultivos se alimentaron con medio AIM-V/5% AS reciente, que contenía 30 UI/ml de IL-2, los días 5, 8 y 11 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Establecimiento de clones de CTL

Las diluciones se prepararon para tener 0,3, 1 y 3 CTL/pocillo en una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 (Nalge Nunc International). Los CTL se cultivaron con 1 X 104 células/pocillo de 2 tipos de líneas celulares linfoblastoides B humanas, 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2, en un total de 150 micro-l/pocillo de medio AIM-V que contiene 5% AS. Se añadieron al medio 50 micro-l/pocillo de IL-2 10 días después, para alcanzar una concentración final de 125 U/ml de IL-2. La actividad de CTL se evaluó el día 14, y los clones de CTL se expandieron usando el mismo método descrito anteriormente (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506). Actividad específica de CTL

Para examinar la actividad específica de CTL, se llevó a cabo el ensayo de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT) de interferón (IFN)-gamma y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de IFN-gamma. Específicamente, como células estimuladoras, se preparó A24LCL (1 x 104/pocillo) o T2 (1 x 104/pocillo) pulsadas con péptido. Como células respondedoras, se usaron células cultivadas en 48 pocillos. El ensayo ELISPOT de IFN-gamma y el ensayo ELISA de IFN-gamma se llevaron a cabo según el procedimiento recomendado por el fabricante.

Transfección de plásmidos

Los ADNc que codifican los marcos de lectura abiertos de los genes diana, HLA-A24 y HLA-A*0201, se amplificaron mediante PCR. El producto amplificado por PCR de genes diana y HLA-A24 o HLA-A*0201 se clonaron en el vector pIRES (Clontech Laboratories, Inc., Cat. No. 631605). Los plásmidos se transfectaron en COS7, que es una línea celular de genes diana y de células sin HLA-A24, usando lipofectamine 2000 (Invitrogen), según los procedimientos recomendados por el fabricante. Después de 2 días desde la transfección, las células transfectadas se recolectaron con versene (Invitrogen), y se usaron como células diana (5 x 104 células/pocillo) para el ensayo de actividad de CTL. Resultados

Predicción de péptidos de unión a HLA-A24 y HLA-A2 derivados de WDRPUH

La Tabla 1 muestra los péptidos de unión a HLA-A24 de WDRPUH en orden de mayor afinidad de unión. Para determinar los péptidos epitópicos, se seleccionó y examinó un total de 25 péptidos con capacidad potencial de unión a HLA-A24 (Tabla 1). La Tabla 2 muestra los péptidos 9meros y 10meros de WDRPUH que se unen a HLA-A2 en orden de mayor afinidad de unión. Para determinar los péptidos epitópicos, se seleccionó y examinó un total de 37 péptidos con capacidad potencial de unión a HLA-A2 (Tabla 2).

T l 1

Tabla 2

Inducción de CTL con los péptidos predichos de WDRPUH restringidos con HLA-A*2402, y establecimiento de líneas de CTL estimuladas con péptidos derivados de WDRPUH

Los CTL para aquellos péptidos derivados de WDRPUH se generaron según los protocolos descritos en "Materiales y métodos". La actividad de CTL específica de los péptidos se determinó mediante el ensayo ELISPOT de IFN-gamma (Figura 1 a-f). Se mostró que #3 y #6 estimulados con WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1) (a), #8 con WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) (b), #2 y #6 con WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3) (c), #1, #2 y #5 con WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4) (d), #2, #3, #4, #6, #7 y #8 con WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16) (e), y #5, #6 and #8 con WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17) (f), demostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con los pocillos del control.

Además, las células en los pocillos positivos números #6 estimuladas con SEQ ID NO: 1, #8 con SEQ ID NO: 2, #2 con SeQ ID NO: 3, #5 con SEQ ID NO: 4, #4 con SEQ ID NO: 16 y #6 con SEQ ID NO: 17 se expandieron y establecieron como líneas de CTL. La actividad de CTL de estas líneas de CTL se determinó mediante el ensayo ELISA de IFN-gamma (Figura 2a-f). Todas las líneas de CTL demostraron una potente producción de IFN-gamma contra las células diana pulsadas con los péptidos correspondientes, en comparación con las células diana sin pulso peptídico. Por otro lado, no se pudieron establecer líneas de CTL mediante estimulación con otros péptidos que se muestran en la Tabla 1, a pesar de que se predijo que los péptidos tendrían una actividad de unión con HLA-A*2402 (datos no mostrados). Como resultado, se seleccionaron 6 péptidos derivados de WDRPUH como péptidos que pueden inducir líneas de CTL potentes.

Actividad de CTL específica contra células diana que expresan exógenamente WDRPUH y HLA-A*2402

Las líneas de CTL establecidas generadas contra los péptidos de la presente invención se examinaron en cuanto a su capacidad para reconocer células diana que expresan endógenamente WDRPUH y la molécula HLA-A*2402. La actividad específica de CTL contra células COS7 transfectadas tanto con la longitud completa de genes de WDRPUH y de la molécula HLA-A*2402 (un modelo específico para las células diana que expresan exógenamente el gen de WDRPUH y HLA-A*2402) se ensayó usando las líneas CTL generadas por los péptidos correspondientes como las células efectoras. Como controles, se prepararon células COS7 transfectadas con la longitud completa de gen de WDRPUH o HLA-A*2402. En la Figura 3, los CTL estimulados con SEQ ID NO: 2 mostraron una potente actividad de CTL contra células COS7 que expresan tanto WDRPUH como HLA-A*2402. Por el contrario, no se detectó ninguna actividad de CTL específica significativa frente a los controles. De este modo, estos datos demuestran claramente que WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2) se procesó de forma natural y se presentó en la superficie de la célula diana con molécula HLA-A*2402, y fue reconocido por los CTL. Estos resultados indicaron que este péptido derivado de WDRPUH puede ser aplicable como vacunas contra el cáncer para pacientes con tumores que expresan WDRPUH.

Inducción de CTL con los péptidos predichos de WDRPUH restringidos con HLA-A*0201

Los CTL que reconocen péptidos derivados de WDRPUH se generaron según los protocolos descritos en "Materiales y métodos". La actividad de CTL específica de los péptidos se determinó mediante el ensayo ELISPOT de IFN-gamma (Figura 4a-1). Los pocillos #2 y #7 estimulados con WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO: 30) (a), #2 con WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO: 31) (b), #3 con WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34) (c), #6 con WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO: 36) (d), #4 con WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO: 37) (e), #4 con WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40) (f), #2 y #8 con WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO: 41) (g), #5 con WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO: 45) (h), #2 con WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO: 49) (i), #6 con WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO: 55) (j), #7 con WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO: 57) (k), y #6 con WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO: 61) (l), demostraron una potente producción de IFN-gamma en comparación con los pocillos del control. Por otro lado, no se pudo detectar una producción potente de IFN-gamma mediante la estimulación con otros péptidos que se muestran en la Tabla 2, a pesar de que se predijo que estos péptidos tenían una actividad de unión con HLA-A*0201 (datos no mostrados).

Establecimiento de líneas y clones de CTL contra péptidos específicos de WDRPUH

Las células que mostraron actividad de CTL específica de péptidos mediante el ensayo ELISPOT de IFN-gamma en los pocillos #7 estimulados con SEQ ID NO: 30 y #3 con SEQ ID NO: 34 se expandieron y establecieron como líneas de CTL. La actividad de CTL de estas líneas de CTL se determinó mediante el ensayo ELISA de IFN-gamma (Figura 5a y b). Ambas líneas de CTL demostraron una potente producción de IFN-gamma contra las células diana pulsadas con los péptidos correspondientes, en comparación con las células diana sin pulso peptídico. Además, los clones de CTL se establecieron limitando la dilución de las líneas de CTL, y la producción de IFN-gamma de los clones de CTL contra las células diana pulsadas con los péptidos correspondientes se determinó mediante el ensayo ELISA de IFN-gamma. Las producciones potentes de IFN-gamma a partir de clones de CTL estimulados con SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 34 se demuestran en la Figura 5c y d.

Actividad de CTL específica contra células diana que expresan exógenamente WDRPUH y HLA-A*0201

Los clones de CTL establecidos generados contra los péptidos de la presente invención se examinaron en cuanto a su capacidad para reconocer células diana que expresan endógenamente WDRPUH y la molécula HLA-A*0201. La actividad específica de CTL contra células COS7 transfectadas tanto con la longitud completa de genes de WDRPUH y de la molécula HLA-A*0201 (un modelo específico para las células diana que expresan endógenamente el gen de WDRPUH y HLA-A*0201) se ensayó usando las líneas CTL generadas por los péptidos correspondientes como células efectoras. Como controles, se prepararon células COS7 transfectadas con la longitud completa de genes de WDRPUH o HLA-A*0201. En la Figura 5e, los CTL estimulados con SEQ ID NO: 34 mostraron una potente actividad de CTL contra células COS7 que expresan tanto WDRPUH como HLA-A*0201. Por el contrario, no se detectó ninguna actividad de CTL específica significativa frente a los controles. Estos datos demuestran claramente que los péptidos de WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34) se procesaron endógenamente y se presentaron en la superficie de la célula diana con molécula HLA-A*0201, y fueron reconocidos por los CTL. Estos resultados indicaron que WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34) puede ser aplicable como vacunas contra el cáncer para pacientes con tumores que expresan WDRPUH.

Análisis de homología de péptidos antigénicos

Los CTL estimulados con

WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1),

WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2),

WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3),

WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4),

WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16),

WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17),

WDRPUH-A02-9-39 (SEQ ID NO: 30),

WDRPUH-A02-9-407 (SEQ ID NO: 31),

WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34),

WDRPUH-A02-9-237 (SEQ ID NO: 36),

WDRPUH-A02-9-543 (SEQ ID NO: 37),

WDRPUH-A02-10-570 (SEQ ID NO: 40),

WDRPUH-A02-10-263 (SEQ ID NO: 41),

WDRPUH-A02-10-78 (SEQ ID NO: 45),

WDRPUH-A02-10-10 (SEQ ID NO: 49),

WDRPUH-A02-10-411 (SEQ ID NO: 55),

WDRPUH-A02-10-287 (SEQ ID NO: 57) y

WDRPUH-A02-10-265 (SEQ ID NO: 61)

mostraron una actividad de CTL significativa y específica. Este resultado puede deberse al hecho de que estas secuencias peptídicas son homólogas a péptidos derivados de otras moléculas que se sabe que sensibilizan el sistema inmunitario humano.

Para excluir esta posibilidad, se realizaron análisis de homología para estas secuencias peptídicas usando como consulta el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), que no reveló ninguna secuencia con homología significativa. Los resultados de los análisis de homología indican que las secuencias de

WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO: 1),

WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO: 2),

WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3),

WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO: 4),

WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16),

WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17),

WDRPUH-A02-9-39 (SEQ ID NO: 30),

WDRPUH-A02-9-407 (SEQ ID NO: 31),

WDRPUH-A02-9-288 (SEQ ID NO: 34),

WDRPUH-A02-9-237 (SEQ ID NO: 36),

WDRPUH-A02-9-543 (SEQ ID NO: 37),

WDRPUH-A02-10-570 (SEQ ID NO: 40),

WDRPUH-A02-10-263 (SEQ ID NO: 41),

WDRPUH-A02-10-78 (SEQ ID NO: 45),

WDRPUH-A02-10-10 (SEQ ID NO: 49),

WDRPUH-A02-10-411 (SEQ ID NO: 55),

WDRPUH-A02-10-287 (SEQ ID NO: 57) y

WDRPUH-A02-10-265 (SEQ ID NO: 61)

son únicas, y de este modo, hay pocas posibilidades, hasta donde sabemos, de que estas moléculas provoquen respuestas inmunológicas no deseadas contra algunas moléculas no relacionadas.

En conclusión, se identificaron nuevos péptidos epítopos HLA-A24 y A2, y se demostró que son aplicables para la inmunoterapia contra el cáncer.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que se une a HLA-A2 y que tiene inducibilidad por linfocitos T citotóxicos (CTL), consistiendo dicho péptido aislado en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

2. Un polinucleótido aislado que codifica el péptido de la reivindicación 1.

3. Una composición para inducir CTL, en la que la composición contiene el péptido de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2.

4. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento y/o profilaxis del carcinoma hepatocelular, y/o en la prevención de la recurrencia posoperatoria del mismo, en la que la composición comprende el péptido de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2.

5. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 4, en la que la composición farmacéutica se formula para la administración a un sujeto cuyo HLA-A2 es HLA-A*0201.

6. Un método in vitro o ex vivo para inducir una célula presentadora de antígeno (APC) con inducibilidad de CTL, en el que el método comprende una etapa seleccionada de:

(a) poner en contacto una APC con el péptido de la reivindicación 1; y

(b) introducir en una APC un polinucleótido que codifica el péptido de la reivindicación 1.

7. Un método in vitro para inducir CTL, en el que el método comprende la etapa seleccionada de:

(a) cocultivar células T CD8-positivas con una APC, que presenta en su superficie un complejo de un HLA-A*0201 y el péptido de la reivindicación 1;

(b) cocultivar células T CD8-positivas con un exosoma, que presenta en su superficie un complejo de un HLA-A*0201 y el péptido de la reivindicación 1; y

(c) introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido de la subunidad del receptor de células T (TCR) que se une a un péptido de la reivindicación 1 en una célula T.

8. Una APC aislada que presenta en su superficie un complejo de un HLA-A* 0201 y el péptido de la reivindicación 1.

9. La APC de la reivindicación 8, que es inducida por el método de la reivindicación 6.

10. Un CTL aislado que se dirige contra el péptido de la reivindicación 1.

11. El CTL de la reivindicación 10, que es inducido por el método de la reivindicación 7.

12. Una composición para uso en la inducción de una respuesta inmune contra un carcinoma hepatocelular en un sujeto cuyo HLA es HLA-A*0201, en la que dicha composición comprende el péptido de la reivindicación 1.