MX2011003730A - Metodos y composiciones para el diagnostico y tratamiento de la enfermedad autoinmune secundaria a esclerosis multiple. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para diagnosticar a pacientes con esclerosis múltiple (MS), incluyendo métodos para identificar a pacientes con esclerosis múltiple que están en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos ocasionada, por ejemplo, por el tratamiento con un anticuerpo anti-CD52. También se abarcan métodos para seleccionar regímenes de tratamiento para pacientes con MS, y reactivos útiles en los métodos mencionados anteriormente.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD AUTOINMUNE SECUNDARIA A ESCLEROSIS MÚLTIPLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para identificar un paciente con esclerosis múltiple (MS) que tiene interleucina-21 (IL-21 ) elevada en comparación con la IL-21 en un sujeto sin una enfermedad autoinmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La esclerosis múltiple ("MS") es un trastorno autoinmune inflamatorio del sistema nervioso central (Compston and Coles, Lancet 372, 1502-17 (2008)). Con una prevalencia de alrededor de uno en 1000, la ' MS es la causa más común de incapacidad neurológica en adultos jóvenes (Polman and Uitdehaag, BMJ 321, 490-4 (2000)). La MS implica el compromiso del sistema inmune, la lesión inflamatoria aguda de axones y glla, la recuperación de la función y reparación estructural, gliosis pos-inflamatoria y neurodegeneración (véase, por ejemplo, Compston and Coles, 2008). Estos procesos secuenciales subyacen un curso clínico caracterizado por episodios con recuperación, episodios que dejan déficits persistentes, y progresión secundaria. Ibid.

El objetivo del tratamiento de la MS es reducir la frecuencia y severidad de las recaldas, evitar la incapacidad que surge de la progresión de la enfermedad, y promover la reparación de tejidos (Compston and Coles, 2008). El enfoque primario para el tratamiento de la MS es la modulación o depresión del sistema inmune. Los fármacos disponibles actualmente para MS incluyen interferón-beta 1 a (por ejemplo, AVONEX y REBIF), interferón-beta 1 b (por ejemplo, BETASERON), acetato de glatiramer (por ejemplo, COPAXONE), mitoxantrona (por ejemplo, NOVANTRONE), y natalizumab (por ejemplo, TYSABRI). Otro nuevo fármaco prometedor para MS es alemtuzumab (CAMPATH-1 H).

El alemtuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD52, una proteína extensamente distribuida en la superficie de linfocitos y monocitos, pero con función desconocida. El alemtuzumab se ha utilizado para tratar leucemia linfocítica crónica de células B.

Un solo impulso de tratamiento conduce a una linfopenia rápida, profunda y prolongada. Las cifras celulares se recuperan pero en tasas variables; las células T CD4+ son particularmente lentas para recuperarse, por lo que permanecen agotadas durante por lo menos cinco años (Coles ef al., Journal of Neurology 253, 98-108 (2006)). Un ensayo clínico de fase 2 (grupo de estudio CA MS-223; Coles eí al., N. Engl. J. Med. 359, 1786-1801 (2008)) ha mostrado que el alemtuzumab es altamente efectivo para tratar la esclerosis múltiple temprana recurrente-remitente. Este fármaco reduce el riesgo de actividad de la enfermedad y la acumulación de incapacidad en más de 70%, en comparación con el interferón-beta en pacientes con esclerosis múltiple temprana recurrente-remitente. EL efecto adverso principal es la autoinmunidad, que surge en el esquema de meses a años de linfopenia de células T después de medicar. Alrededor de 20%-30% de los pacientes desarrolla autoinmunidad tiroidea, principalmente enfermedad de Graves (Coles et al., Lancet 354, 1691-1695 (1999)), y 3% tienen trombocitopenia inmune (ITP) (Coles ef al., 2008). Casos individuales de la enfermedad de Goodpasture, neutropenia autoinmune (Coles ef al., Journal of Neurology 253, 98-108 (2006)), y anemia hemolítica autoinmune (observación no publicada) también se han observado. Además, 5.5% adicional de los pacientes desarrolla auto anticuerpos no tiroideos sostenidos sin enfermedad clínica (Coles ef al., 2006). El tiempo y espectro de autoinmunidad después del alemtuzumab es semejante a aquel observado en otros ejemplos de "autoinmunidad de reconstitución" en otros contextos clínicos; por ejemplo, la enfermedad autoinmune de tiroides y citopenias autoinmunes también predominan meses a años después del trasplante de células madre hematopoyéticas o tratamiento antirretroviral de VIH (Chen ef al., Medicine (Baltimore) 84, 98-106 (2005); Daikeler and Tyndall, Sesf. Pracf. Res. Clin. Haematol. 20, 349-360 (2007); Jubault et al., J. Clin. Endocrino!. Metab. 85, 4254-4257 (2000); Ting, Ziegler, and Vowels, Soné Marrow Transpant. 21 , 841-843 (1998); Zandman-Goddard and Shoenfeld, Autoimmun. Rev. 1 , 329-337 (2002)).

Aunque la autoinmunidad que surge en el contexto de la linfopenia se reconoce bien en modelos animales, se encuentra raramente y, por tanto, es difícil de estudiar en humanos. La mayor parte de los sujetos linfopénicos no desarrollan autoinmunidad, lo que sugiere que se implican factores adicionales (Krupica ef al., Clin Immunol 120, 121-128 (2006)). Queda poco claro qué son esos factores adicionales. El agotamiento de células T reguladoras se ha considerado como factor, tal como se observa en los modelos de colitis murina y gastritis (Alderuccio ef al., J. Exp Med 178, 419-426 (1993); McHugh ef al., J Immunol 168, 5979-5983 (2002); Powrie ef al., Int. Immunol 5, 1461-1471 (1993); Sakaguchi et al., J Immunol 155, 1151-1164 (1995)). Sin embargo, se ha observado que las células T reguladoras se incrementan después de dar alemtuzumab en pacientes humanos y a partir de entonces regresan a niveles normales (Cox ef al., Eur J Immunol 35, 3332-3342 (2005)). Esta observación se ha reproducido desde entonces (Bloom ef al., Am J Trasplant. 8, 793-802 (2008)) y se ajusta a otros modelos experimentales de linfopenia (de Kleer, I. ef al., Blood 107, 1696-1702 (2006); Zhang, H. et al., Nat Med l l, 1238-1243 (2005)).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Hemos inventado métodos y composiciones nuevos y útiles para mejorar el manejo de riesgos en el tratamiento de la MS. Los métodos y composiciones reducen los efectos secundarios del tratamiento de la MS, tal como la autoinmunidad secundaria, y ayudan a los proveedores de asistencia médica y pacientes a seleccionar los regímenes para el tratamiento y monitoreo posterior al tratamiento de la MS. Los métodos y composiciones de esta invención se basan en nuestro descubrimiento de que, en los pacientes con esclerosis múltiple (MS), la IL-21 elevada, detectable incluso antes de la terapia de agotamiento de linfocitos, tal como la terapia con alemtuzumab, se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar autoinmunidad secundaria después de la terapia. Hemos descubierto además que el nivel de IL-21 de un individuo puede determinarse genéticamente: los genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978 se asocian con IL-21 elevada.

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para identificar un paciente con MS que tiene interleucina-21 (IL-21) elevada en comparación con la IL-21 en un sujeto sin una enfermedad autoinmune. En algunas modalidades, los métodos comprenden la etapa de medir la IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS, con lo cual se identifica un paciente con MS que tiene IL-21 elevada en comparación con el sujeto mencionado. Alternativamente, los métodos comprenden la etapa de genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia en el paciente de un genotipo o genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o de más de los genotipos se asocia con IL-21 elevada.

La invención además proporciona métodos para identificar un paciente con MS que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos. En algunas modalidades, los métodos comprenden la etapa de averiguar (por ejemplo, por medición) el nivel de interleucina-21 (IL-21) en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde un nivel elevado de IL-21 , en comparación con el de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin IL-21 elevada. Alternativamente, los métodos comprenden la etapa de averiguar (por ejemplo, por genotipificación) la presencia o ausencia en el paciente de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs1315196l, G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o más (por ejemplo, dos o tres) de los genotipos mencionados se asocia con un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin el genotipo o genotipos mencionados. Estos métodos comprenden opcionalmente la etapa de informar al paciente, y/o a su proveedor de asistencia médica, de dicho riesgo incrementado, y/o la etapa de registrar el riesgo incrementado.

La invención además proporciona métodos para seleccionar o identificar un paciente con MS en necesidad del monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos. Estos métodos pueden comprender la etapa de medir la IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde la IL-21 elevada en el paciente, en comparación con la de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin IL-21 elevada.

Alternativamente, los métodos pueden comprender la etapa de genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de SNPs asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o de más de los SNPs indica que el paciente está en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin el genotipo o genotipos mencionados. Estos métodos comprenden opcionalmente la etapa de informar al paciente, y/o a su proveedor de asistencia médica, de la necesidad de un monitoreo intensificado, y/o la etapa de registrar la necesidad.

La invención también proporciona métodos para informar un tratamiento para un paciente con MS, que comprenden medir la IL-21 en una muestra de sangre del paciente, o genotipificar al paciente para la presencia o ausencia de los tres fenotipos de SNP mencionados anteriormente, y seleccionar un régimen de tratamiento apropiado para la medición de IL-21 o genotipo.

La invención proporciona métodos para tratar la MS, en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, que comprenden las etapas de (a) obtener o averiguar información sobre (i) IL-21 en una muestra de sangre del paciente (por ejemplo, al medir IL-21 en la muestra); o (ii) la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978 (por ejemplo, al genotipificar al paciente); (b) administrar un agente terapéutico para la esclerosis múltiple al paciente, y (c) monitorear opcionalmente al paciente para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria. En algunas modalidades, los métodos de tratamiento se utilizan en pacientes que se encuentran con niveles normales de IL-21 y/o que no tienen ninguno de los tres genotipos de SNP' de IL-21 mencionados anteriormente. También se abarcan por la invención los anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab o un agente biológicamente similar), o porciones de unión a antígenos de los mismos, que se utilizan en estos métodos de tratamiento, y los usos de estos anticuerpos o porciones de unión a antígenos en la elaboración de un medicamento para su uso en estos métodos de tratamiento. Además se abarcan por la invención los regímenes terapéuticos que utilizan estos métodos de tratamiento.

La invención proporciona métodos para reducir la ocurrencia o severidad de una enfermedad autoinmune secundaria en un paciente con esclerosis múltiple que se ha tratado o se tratará con una terapia de agotamiento de linfocitos, en donde la enfermedad autoinmune secundaria se presenta después del tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende la etapa de administrar un antagonista de IL-21 , por ejemplo, antes, durante, o subsecuente al tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos. También se abarcan por la invención los antagonistas de IL-21 para su uso en estos métodos (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 o anti-receptor de IL-21 , o una porción de unión a antlgenos del mismo; o un receptor de IL-21 soluble), y los usos de estos antagonistas de IL-21 en la elaboración de un medicamento para su uso en los métodos.

La invención proporciona métodos para valorar la capacidad de respuesta de las células T al tratamiento con una terapia de agotamiento de linfocitos en un paciente con esclerosis múltiple, que comprende medir la caspasa-3 en células T obtenidas del paciente después de la terapia, en donde un incremento en la caspasa-3 en las células T, en comparación con las células T de un paciente con MS que no recibe la terapia, es indicativo de la capacidad de respuesta de las células T a la terapia. La medición puede implicar determinar la cantidad o concentración de caspasa-3 o del ácido nucleico que codifica caspasa-3.

La invención proporciona métodos para informar a un paciente con MS de un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende las etapas de obtener o averiguar información sobre la interleucina-21 (IL- 21) en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde la IL-21 elevada, en comparación con la de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria en comparación con pacientes con MS sin IL-21 elevada; e informar al paciente de un riesgo incrementado o la ausencia del mismo. Alternativamente, los métodos comprenden obtener o averiguar información sobre la presencia o ausencia de uno o más de los genotipos de IL-21 mencionados anteriormente, en lugar de información sobre el nivel de IL-21 en sangre. Por consiguiente, la invención también proporciona métodos para informar a un paciente con MS de una necesidad, o ausencia de una necesidad, de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos, con base en el nivel de IL-21 del paciente, o la presencia o ausencia de los genotipos de IL-21 descritos anteriormente.

La invención proporciona métodos para informar un régimen para monitorear a un paciente con MS después de la terapia de agotamiento de linfocitos, que comprenden las etapas de obtener o averiguar información sobre (i) IL-21 en una muestra de sangre del paciente; o (ii) la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961, G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y seleccionar un régimen de monitoreo apropiado para el paciente con base en la información. Un régimen de monitoreo apropiado puede incluir, por ejemplo, medir auto-anticuerpos en el paciente.

La presente invención proporciona ventajas en el manejo de riesgos en el tratamiento de la MS. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para distribuir un fármaco para agotamiento de linfocitos a un paciente para tratar la esclerosis múltiple, que comprende las etapas de asesorar al paciente sobre el riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del tratamiento con el fármaco, en donde el riesgo incrementado se asocia con (i) IL-21 elevada; o (ii) la presencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como. los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y proporcionar el fármaco al paciente después del consejo, y opcionalmente después de obtener el consentimiento informado del paciente.

La invención además proporciona métodos para identificar a un individuo que es propenso a tener interleucina-21 (IL-21 ) elevada, en comparación con un sujeto sin ningún padecimiento inflamatorio conocido, que comprende la etapa de genotipificar al individuo para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o de más de los genotipos se asocia con IL-21 elevada.

En el contexto de esta invención, el agotamiento de linfocitos puede inducirse por un tratamiento que se orienta a CD52, por ejemplo, un tratamiento con un anticuerpo anti-CD52 (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) o una porción de unión a antígenos del mismo. El anticuerpo anti-CD52 puede ser alemtuzumab o un agente biológicamente similar, tal como un anticuerpo que compite con el alemtuzumab por la unión a CD52.

En los métodos de esta invención, la medición de IL-21 puede implicar medir (por ejemplo, averiguar/cuantificar) la cantidad o concentración de IL-21 o el ácido nucleico que codifica IL-21 en una muestra, o la cantidad o concentración de mRNA que codifica IL-21 en células que producen IL-21 (por ejemplo, células Th17) en la muestra. En algunas modalidades, la medición es de IL-21 intracelular, utilizando, por ejemplo, tinción de citocinas y citometría de flujo. En algunas modalidades, la medición es de IL-21 sérica, utilizando, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción asociada a enzimas (ELISA). También se abarcan por la invención los equipos de ELISA para detectar niveles de IL-21 en un sujeto humano, que comprenden un anticuerpo anti-IL-21 , o una porción de unión a anttgenos del mismo, o un receptor de IL-21 soluble. Los equipos además pueden incluir una instrucción que se dirige a un usuario para tomar una muestra de sangre de un sujeto humano.

En los métodos de esta invención, la información de IL-21 (incluyendo la medición o genotipificación) puede obtenerse antes, durante, o subsecuente a la terapia de MS. Los métodos de esta invención pueden utilizarse en el contexto de cualquier forma de MS incluyendo, pero sin limitarse a, la esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva secundaria.

La invención también proporciona equipos para tratar la esclerosis múltiple, que comprenden un agente terapéutico de agotamiento de linfocitos (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD52 tal como alemtuzumab); y una instrucción escrita para informar a un paciente o proveedor de asistencia médica sobre el potencial de un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del tratamiento con el agente, en donde el riesgo incrementado se indica por o se asocia con (i) IL-21 elevada, o (ii) la presencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) asociados con IL-21 elevada, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978.

La invención además proporciona equipos para identificar a un paciente con MS que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende un anticuerpo anti-interleucina-21 (IL-21) y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo a IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS. La invención también proporciona equipos para identificar a un paciente con MS que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende uno o más reactivos adecuados para identificar el genotipo de uno o más polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: SNP rs13151961 , SNP rs6822844, y SNP rs6840978, en una muestra obtenida de un individuo.

Otros atributos y ventajas de la invención serán obvios a partir de las siguientes figuras y descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 A es una gráfica que muestra la frecuencia del precursor (PF) de células T que provienen de controles sanos (HC), pacientes sin tratamiento (Pre) y en intervalos de 3 meses posteriores al alemtuzumab, sin estimular (Unstim), o después del cultivo con proteína básica de mielina (MBP) o el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHr). (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001) La Figura 1 B es una gráfica que muestra el índice de proliferación (Pl) de células T que provienen de controles sanos (HC), pacientes sin tratamiento (Pre) y en intervalos de 3 meses posteriores al alemtuzumab, sin estimular (Unstim), o después del cultivo con proteína básica de mielina (MBP) o el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHr). (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001) La Figura 1C es una gráfica que muestra el número total de células T viables, después de 10 días en cultivo, que provienen de controles sanos (HC), pacientes sin tratamiento (Pre) y en intervalos de 3 meses posteriores al alemtuzumab, sin estimular (Unstim), o después del cultivo con proteina básica de mielina (MBP) o el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHr). (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) La Figura 1 D es una gráfica que muestra el porcentaje de células T en apoptosis, en respuesta a ningún estímulo o después del cultivo con MBP o TSHr, en cultivo, que provienen de controles sanos (HC), pacientes sin tratamiento (Pre) y en intervalos de 3 meses posteriores al alemtuzumab. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) La Figura 1 E son esquemas y una gráfica que muestran la apoptosis pasiva de células T que provienen de controles sanos y de pacientes antes y después del alemtuzumab en intervalos de 3 meses. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) La Figura 1 F son esquemas y una gráfica que muestran la apoptosis mediada por Fas de células T que provienen de controles sanos y de pacientes antes y después del alemtuzumab en intervalos de 3 meses. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) La Figura 1G es una gráfica que muestra la apoptosis pasiva de células T CD4+ y CD8+ que provienen de controles sanos, pacientes en pre-tratamiento y a los 9 meses posteriores al alemtuzumab. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) La Figura 1 H es una gráfica que muestra la apoptosis mediada por Fas de células T CD4+ y CD8+ que provienen de controles sanos, pacientes en pre-tratamiento y a los 9 meses posteriores al alemtuzumab. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) Las Figuras 2A a 2C son gráficas que muestran la expresión de mRNA de caspasa 3 con respecto a la expresión de mRNA de beta-actina en (2A) células T CD3+, (2B) monocitos CD14+, y (2C) células B CD19+, respectivamente, ya sea inmediatamente ex-vivo o después del estímulo con MBP o estímulo policlonal (anticuerpos anti-CD3/28). (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) La Figura 3 son esquemas y una gráfica que muestran que la autoinmunidad después del alemtuzumab se asocia con apoptosis excesiva de células T. El porcentaje de apoptosis de células T que es pasiva (Un), mediada por Fas, o es en respuesta al estímulo por MBP o TSHr en aquellos sin autoinmunidad (Ge et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 3041-3046 (2004)) o aquellos con autoinmunidad secundaria (Ge et al., 2004) se muestra en esquemas separados. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) Las Figuras 4A y 4B son esquemas y gráficas que muestran que rhlL-21 induce apoptosis de células T in vitro. Éstas muestran que (4A) las células T CD4+ y (4B) células T CD8+, respectivamente, sin estimular o estimuladas de manera policlonal (anti-CD3/CD28), entran en apoptosis en respuesta a rhlL-21 en una forma dependiente de la dosis. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001 ) Las Figuras 5A a 5D son gráficas que muestran que rhlL-21 induce la proliferación de células T in vitro. La Figura 5A es una gráfica que muestra el índice de proliferación de células T CD4+ y CD8+ sin estimular en respuesta a rhlL-21. La Figura 5B es una gráfica que muestra el Indice de proliferación de células T CD4+ y CD8+ estimuladas de manera policlonal (anti-CD3/CD28) en respuesta a rhlL-21. La Figura 5C es una gráfica que muestra la frecuencia del precursor de células T CD4+ y CD8+ sin estimular en respuesta a rhlL-21. La Figura 5D es una gráfica que muestra la frecuencia del precursor de células T CD4+ y CD8+ estimuladas de manera policlonal en respuesta a rhlL-21. (* p<0.05, ** p<0.01 , . *** p<0.001 ) La Figura 5E son esquemas que muestran el número de células CD4+ o CD8+ sin estimular o estimuladas de manera policlonal (anti-CD3/CD28) en diferentes canales en ausencia de, o en respuesta a, rhlL-21.

La Figura 6A es una gráfica que muestra la IL-21 sérica antes y después del tratamiento con alemtuzumab en 15 pacientes con, y 15 pacientes sin, autoinmunidad secundaria. (* p<0.05, ** p<0.01 , *** p<0.001) La Figura 6B es una gráfica que muestra los niveles (pg/ml) de IL-21 sérica en pre-tratamiento en los pacientes no autoinmunes (los que no tuvieron autoinmunidad posterior al alemtuzumab) y los pacientes autoinmunes (los que tuvieron autoinmunidad posterior al alemtuzumab).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa en nuestro descubrimiento de que la ocurrencia de autoinmunidad secundaria en un paciente con MS después de la terapia de agotamiento de linfocitos (por ejemplo, después del tratamiento con alemtuzumab) se asocia con IL-21 elevada en el paciente. Hemos descubierto que la IL-21 se eleva en comparación con lo normal (véase las discusiones a continuación) incluso antes de la terapia en pacientes con MS que después desarrollan autoinmunidad secundaria posterior a la terapia. También hemos descubierto que, después de la terapia de agotamiento de linfocitos, la IL-21 se eleva aún más dramáticamente en esos mismos pacientes, en comparación con pacientes con MS sin signos de autoinmunidad secundaria, cuya IL-21 se eleva en un mucho menor medida. De esta manera, los niveles de IL-21 son predictivos de la ocurrencia de autoinmunidad secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos en un paciente con MS. También hemos descubierto que los genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978 se asocian con IL-21 elevada en un individuo; de esta manera, la genotipificación de un paciente con MS para la presencia o ausencia de estos genotipos específicos de SNP también ayuda a predecir el riesgo de desarrollar autoinmunidad secundaria en el paciente después del agotamiento de linfocitos. .

Describimos primero el tratamiento con alemtuzumab (CAMPATH-1 H) que complica la autoinmunidad, en 1999 (Coles ef al., 1999), y hemos continuado observando esta complicación de, lo que se reconoce cada vez más como, una terapia sumamente efectiva para la esclerosis múltiple temprana recurrente-remitente (Coles ef a/., J.Neurology 253, 98-108 (2006); Coles ef al. , 1999 y 2008). Nuestros estudios descritos a continuación implicaban una serie de cohortes de pacientes disponibles y se enfocaron en comprender este "modelo" sin precedentes de autoinmunidad humana que ocurre en un subconjunto de pacientes con MS tratados por alemtuzumab.

El estado inmune se altera radicalmente después de la exposición al alemtuzumab. Las células T que se regeneran en el ambiente linfopénico generado por el alemtuzumab son altamente proliferativas y se polarizan hacia la auto-reactividad. Sin embargo, estas célujas son sumamente inestables y de vida corta. Aunque su destino no se ha abordado directamente con anterioridad (King ef al., Cell 117, 265-277 (2004)), nosotros demostramos que estas células mueren rápidamente por apoptosis. Los niveles altos y sostenidos de apoptosis de células T pueden explicar por qué una dosis única de alemtuzumab induce linfopenia de células T que dura varios años aún cuando la vida media del alemtuzumab circulante sea de sólo seis días y los precursores hematológicos no se agotan (Gilleece et al., Blood 82, 807-812 (1993)).

Contra esos antecedentes, demostramos que los pacientes con autoinmunidad secundaria tienen tasas superiores de apoptosis de células T, pero no mayor linfopenia de células T, que aquellos sin autoinmunidad, lo que sugiere un ciclo celular aumentado en este grupo. Estas perturbaciones del ciclo de las células T se asocia con la expresión significativamente más alta de IL-21 sérica, que hemos encontrado determinada genéticamente por lo menos en algunos casos. Además, la susceptibilidad a la autoinmunidad asociada con linfopenia se manifiesta antes del agotamiento de linfocitos, con niveles de IL-21 en pre-tratamiento que predicen con precisión (valor predictivo positivo de más de 70%, por ejemplo, 83%, y valor predictivo negativo de más de 62%, por ejemplo, 72%) el desarrollo de la autoinmunidad de meses de a años después de la exposición al alemtuzumab. Sin desear limitarse por teoría alguna, consideramos que, al estimular los ciclos de expansión y muerte de células T en exceso, la IL-21 aumenta las oportunidades fortuitas para que las células T encuentren auto-antígenos y se rompa la tolerancia, lo que por tanto promueve la autoinmunidad.

En resumen, nuestros hallazgos proporcionan la primera exploración de autoinmunidad inducida por linfopenia en el hombre, y proporcionan un marco conceptual para comprender la autoinmunidad asociada con linfopenia, que va más allá del contexto estrecho de tratar la esclerosis múltiple con alemtuzumab. El concepto es -que el primer agotamiento terapéutico de linfocitos, y en segundo lugar la sobreproducción généticamente restringida de IL-21 , conducen a un estado en exceso del ciclo de las células T y una supervivencia reducida, lo que promueve la autoinmunidad en humanos. Estos hallazgos proporcionan las bases para la presente invención.

Esta invención proporciona métodos para manejar pacientes con MS cuando se considera la terapia de agotamiento de linfocitos, tal como la terapia con alemtuzumab. Por ejemplo, nuestra invención proporciona métodos para identificar un paciente con MS que tiene IL-21 elevada en comparación con la norma (es decir, niveles de IL-21 en sujetos control como se describe a continuación), y métodos para identificar un paciente con MS que está en riesgo incrementado de desarrollar autoinmunidad secundaria después del agotamiento de linfocitos. Estos métodos comprenden la etapa de medir IL-21 (por ejemplo, niveles intracelulares o extracelulares de proteína, niveles de transcritos de RNA, o niveles de actividad de IL-21 ; véase las discusiones a continuación) en una muestra de sangre del paciente, y de comparar el valor de IL-21 con el valor normal de IL-21. Alternativamente, en vez de o además del análisis de sangre, se puede genotipificar al paciente para la presencia o ausencia de uno o más de los genotipos de SNP de A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, donde la presencia de uno, dos o los tres genotipos se asocia con IL-21 elevada. Como se discute anteriormente, la IL-21 elevada se asocia con un riesgo incrementado de desarrollar autoinmunidad secundaria en el paciente con MS después del agotamiento de linfocitos, en comparación con pacientes con MS que no tienen IL-21 elevada.

La identificación de un paciente por los métodos de la invención puede seguirse por una serie de etapas adicionales contempladas por la invención. Por ejemplo, el paciente puede ser informado del riesgo incrementado de desarrollar autoinmunidad secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos, o la falta de tal riesgo, con base en su nivel o genotipo de IL-21. De esta manera, la invención permitirá la asesoría individualizada de los riesgos de la terapia antes de comprometerse a la terapia. El proveedor de asistencia médica puede considerar opciones terapéuticas en vista del riesgo de autoinmunidad secundaria, y proporcionar una recomendación, incluyendo, por ejemplo, administrar un antagonista de IL-21 antes, durante, o después de la terapia de agotamiento de linfocitos, o seleccionar un régimen de tratamiento que no implique agotamiento de linfocitos.

El proveedor de asistencia médica también puede considerar planes de manejo de riesgos para un paciente que elige someterse a una terapia de agotamiento de linfocitos. Por ejemplo, el proveedor de asistencia médica puede informar al paciente de una necesidad de monitoreo intensificado para el desarrollo de autoinmunidad secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos, en vista de su riesgo incrementado de desarrollar autoinmunidad secundaria. El proveedor de asistencia médica también puede recomendar un régimen de monitoreo apropiado después de la terapia de agotamiento de linfocitos. Un régimen de monitoreo apropiado para pacientes en riesgo puede incluir, sin limitación, el monitoreo más frecuente de la autoinmunidad secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos en un intervalo de, por ejemplo, una semana, dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, o un año. El monitoreo puede necesitar continuarse durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo, más de un año, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, o más, dado que algunos pacientes pueden no presentarse con autoinmunidad secundaria hasta mucho después de un año posterior a la terapia de agotamiento de linfocitos. El monitoreo intensificado también puede implicar, por ejemplo, un examen médico más completo (por ejemplo, más análisis de sangre) por un especialista para cualquier signo de autoinmunidad secundaria. Más aún, los farmacéuticos o el personal clínico que distribuye un fármaco de agotamiento de linfocitos a un paciente para tratar la MS, pueden requerir asesorar el paciente sobre el riesgo incrementado de desarrollar autoinmunidad secundaria después del uso del fármaco, en caso de que el paciente tenga un nivel elevado de IL-21 y/o tenga los genotipos particulares de IL-21 , descritos en este documento, que se han asociado con IL-21 sérica elevada. También puede requerirse que los farmacéuticos o el personal clínico obtengan el consentimiento informado del paciente antes de distribuir el fármaco al paciente.

Pacientes con esclerosis múltiple Los métodos y composiciones de esta invención pueden utilizarse en el contexto de cualquier forma de MS, por ejemplo, MS recurrente-remitente, MS progresiva primaria, y MS progresiva secundaria. Los pacientes con MS, en el contexto de esta invención, son a los que se ha diagnosticado una forma de MS, por ejemplo, por la historia de síntomas y el examen neurológico con la ayuda de pruebas tales como formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), punciones lumbares, pruebas de potencial provocado, y análisis de laboratorio de muestras de sangre.

La esclerosis múltiple ("MS"), también conocida como esclerosis diseminada, es un padecimiento autoinmune en el que el sistema inmunitario ataca el sistema nervioso central, lo que conduce a desmielinización (Compston and Coles, 2008). La MS destruye una capa adiposa llamada vaina de mielina que se envuelve y aisla eléctricamente las fibras nerviosas. Casi cualquier síntoma neurológico puede parecer con la enfermedad, y a menudo progresa a la incapacidad física y cognoscitiva (Compston and Coles, 2008). La MS toma varias formas. Nuevos síntomas pueden presentarse en ataques distintos (formas recurrentes), o acumularse lentamente con el tiempo (forma progresiva) (Lublin et al., Neurology 46 (4), 907-1 1 (1996)). Entre ataques, los síntomas pueden desaparecer completamente (remisión), pero a menudo ocurren problemas neurológicos permanentes, especialmente a medida que la enfermedad avanza (Lublin et al., 1996). Varios subtipos o patrones de progresión se han descrito, y son importantes para el pronóstico así como para las decisiones terapéuticas. En 1996 la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple de Estados Unidos estandarizó cuatro definiciones de subtipos: recurrente-remitente, secundaria progresiva, primaria progresiva, y recurrente progresiva (Lublin ef al., 1996).

El subtipo recurrente-remitente se caracteriza por ataques agudos imprevisibles, llamados exacerbaciones o recaídas, seguidos por períodos de meses a años de calma relativa (remisión) sin nuevos signos de actividad de la enfermedad. Esto describe el curso inicial de la mayoría de los individuos con MS (Lublin ef al., 1996).

La MS progresiva secundaria empieza con un curso de recurrencia-remisión, pero evoluciona subsecuentemente a un deterioro neurológico progresivo entre ataques agudos sin ningún período definido de remisión, aún cuando pueden aparecer recaídas ocasionales y remisiones secundarias (Lublin ef al., 1996).

El subtipo progresivo primario se caracteriza por una progresión gradual pero constante de incapacidad sin ninguna remisión obvia después de que aparecen los síntomas iniciales de la MS (Miller ef al., Lancet Neurol 6 (10), 903-12 (2007)). Se caracteriza por la progresión de la incapacidad desde el comienzo, sin, o sólo ocasionales y menores, remisiones y mejorías (Lublin ef al., 1996). La época del comienzo para el subtipo progresivo primario es generalmente posterior a los otros subtipos (Miller ef al., 2007)).

La MS recurrente progresiva se caracteriza por un deterioro neurológico constante con ataques agudos que pueden o pueden no seguirse por cierta recuperación. Este es el menos común de todos los subtipos descritos anteriormente (Lublin et al., 1996).

También se han sido descritos casos con comportamiento no estándar, a veces referidos como formas inciertas de MS (Fontaine, Rev. Neurol. (París) 157 (8-9 Pt 2): 929-34 (2001 )). Estas formas incluyen la enfermedad de Devic, esclerosis concéntrica de Baló, esclerosis difusa de Schilder, y esclerosis múltiple de Marburg (Capello et al., Neurol. Sci. 25 Supl 4: S361-3 (2004); Hainfellner et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr. 55 (12): 1194-6 (1992)).

Agotamiento de linfocitos en pacientes con esclerosis múltiple Como se utiliza en este documento, "agotamiento de linfocitos" es un tipo de inmunosupresión por reducción de linfocitos circulantes, por ejemplo, las células T y/o las células B, que tiene como resultado una linfopenia. El agotamiento prolongado de linfocitos se observa cuando, por ejemplo, se utiliza el trasplante autólogo de médula ósea (BMT) o la irradiación linfoide total para tratar la esclerosis múltiple. Véase, por ejemplo, Cox et al., Eur. J. Immunol. 35, 3332-3342 (2005). Por ejemplo, el agotamiento de linfocitos puede lograrse por el uso combinado de timoglobulina, ciclofosfamida e irradiación de cuerpo completo. El agotamiento de linfocitos en pacientes con MS también puede lograrse por una serie de tratamientos farmacológicos. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD52, CAMPATH-1 H (alemtuzumab), se ha utilizado en terapia de agotamiento de linfocitos para tratar a pacientes con MS. Se ha demostrado que la linfopenia inducida por CAMPATH-1 H reduce efectivamente la inflamación del sistema nervioso central tanto clínica como radiológicamente (Coles ef al., Ann. Neurol. 46, 296-304 (1999); Coles ef al., 2008).

Otros agentes también pueden utilizarse en la terapia de agotamiento de linfocitos para tratar a pacientes con MS. Estos agentes pueden ser los que ocasionan la muerte celular de los linfocitos o inhiben las funciones de los linfocitos. Estos incluyen, sin limitación, (1 ) agentes que se orientan a células que llevan CD52, tales como agentes biológicamente similares a alemtuzumab, es decir, otros anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, o humanos) que se unen al mismo o a un epítopo diferente, como el alemtuzumab, o compiten con el alemtuzumab por la unión a CD52, y polipéptidos CD52 solubles que compiten con el CD52 de la superficie celular por la unión al o los ligandos de CD52; (2) biomoléculas tales como péptidos, proteínas, y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, o humanos) que se orientan a las moléculas de la superficie celular de los linfocitos, tales como anticuerpos anti-CD4, anticuerpos ant¡-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-TCR, y anticuerpos anti-integrina (por ejemplo, natalizumab); (3) citotoxinas (por ejemplo, agentes inductores de apoptosis, ciclofosfamida, agentes alquilantes, e intercalantes del DNA) suministrados especifica o inespecíficamente a los linfocitos; y (4) las. porciones de unión a antígenos de los anticuerpos mencionados anteriormente. Los anticuerpos pueden incluir, sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos bifuncionales, anticuerpos oligoclonales, y anticuerpos policlonales.

El término "porción de unión a antígenos", como se utiliza en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente al mismo antlgeno que el anticuerpo completo del que se deriva la porción. Ejemplos de "porción de unión a antígenos" incluyen, sin limitación, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento dAb, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, scFv, y un diacuerpo. Los anticuerpos y las porciones de unión a antígenos de los mismos, útiles en esta Invención, pueden elaborarse por cualquier método, bien conocido en la técnica.

Cualquiera de las terapias de agotamiento de linfocitos mencionadas anteriormente puede ocasionar linfopenia y, en algunos pacientes, la linfopenia conduce a autoinmunidad secundaria.

Autoinmunidad secundaria en pacientes con MS La autoinmunidad se refiere en este documento como "autoinmunidad secundaria" cuando surge posterior al comienzo de una primera enfermedad ("primaria"), por ejemplo, una enfermedad autoinmune "primaria". La autoinmunidad secundaria surge a veces en pacientes con MS que tienen, o que han tenido linfopenia posterior, por ejemplo, a una terapia de agotamiento de linfocitos. En algunos individuos, la autoinmunidad secundaria surge poco después de la terapia de agotamiento de linfocitos (por ejemplo, el tratamiento con alemtuzumab). En otros individuos, la autoinmunidad secundaria puede no surgir, hasta meses o años después de la terapia de agotamiento de linfocitos; en algunos de esos individuos, en el momento en que desarrollan la inmunidad secundaria, la recuperación sustancial de linfocitos (conteo de linfocitos totales) puede haber ocurrido, de modo que ya no pueden estar linfopénicos.

La autoinmunidad secundaria que surge en pacientes linfopénicos con MS puede ser cualquier tipo de padecimiento autoinmune diferente a MS incluyendo, pero sin limitarse a, autoinmunidad de la tiroides (por ejemplo, enfermedad de Graves), trombocitopenia inmune (ITP), enfermedad de Goodpasture, neutropenia autoinmune, anemia hemolltica autoinmune y linfopenia autoinmune. Las técnicas para diagnosticar y monitorear estas enfermedades autoinmunes se conocen bien por los expertos en la técnica, incluyendo la valoración de síntomas y examen médico, tal como el análisis de sangre. La invención contempla el uso de cualquier método conocido. Por ejemplo, pueden determinarse niveles de auto-anticuerpos en los fluidos corporales de un paciente (por ejemplo, la sangre) para detectar signos de autoinmunidad. Específicamente, pueden medirse anticuerpos anti-nucleares, anticuerpos anti-músculo liso, y anticuerpos anti-mitocondriales. En caso de que se detecten anticuerpos anti-nucleares, pueden realizarse ensayos adicionales para medir anticuerpos anti-DNA de doble hebra, anticuerpos anti-ribonucleoproteínas, y anticuerpos anti-La. Los anticuerpos anti-peroxidasa tiroidea (TPO) y anti-receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) pueden medirse para detectar enfermedades autoinmunes de la tiroides; si los anticuerpos anti-TPO o anticuerpos anti-receptor de TSH se detectan, puede medirse si la función de la tiroides está afectada al medir los niveles de T3 libre, T4 libre y TSH. Los anticuerpos anti-plaquetas pueden medirse para detectar la trombocitopenia autoinmune; y una medición de los niveles de plaquetas en sangre puede servir para determinar si la presencia de anticuerpos anti-plaquetas ocasiona una reducción en el número de plaquetas.

Medición de IL-21 En los métodos de esta invención, la IL-21 puede medirse por una serie de técnicas. La IL-21 es un miembro de la familia de citocinas relacionadas con gamma-c, y tiene una potente actividad para promover la proliferación de células T y B y la citotoxicidad de las células citolíticas naturales (NK). La IL-21 se expresa principalmente por células T CD4+ activadas (por ejemplo, células Th17) y es importante en las respuestas inmunes de cooperadores T tipo I (Th1 ) (Weiss ef al., Expert Opin Biol. Ther. 7, 1705-1721 (2007); Sivakumar ef al., Immunology 112, 177-182 (2004)). El gen IL-21 humano codifica un precursor polipeptídico de 162 residuos de aminoácidos y una protelna madura completamente procesada de 133 residuos de aminoácidos (alrededor de 15 kDa); el gen se ubica en el cromosoma humano 4q26-27 (Sivakumar ef al., 2004). El receptor para IL-21 (IL-21 R) se ha encontrado en células B periféricas en reposo, células mononucleares activadas de sangre periférica, y en el centro germinal de nodos linfáticos humanos (Marleau ef al., J. Leukocyte Biol. 78, 575-584 (2005)).

Los métodos para medir IL-21 se conocen bien por los expertos en la técnica. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, una muestra de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva, o liquido cefalorraquídeo) se obtiene de un paciente, y se mide el nivel de IL-21 en la muestra, por cualquier ensayo adecuado para detección de proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción asociada a enzimas (ELISA). Los equipos comerciales de ELISA para la medición de IL-21 humana se encuentran disponibles, por ejemplo, de KOMABIOTECH (Seúl, Corea), Bender edSystems (Burlingame, CA), y eBioscience (San Diego, CA).

Alternativamente, los niveles del transcrito de IL-21 en células que producen IL-21 (por ejemplo, células Th17) obtenidas del paciente, pueden medirse por análisis de Northern blot y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR). Los métodos para aislar células Th17 se conocen bien en la técnica, y el aislamiento puede realizarse al utilizar equipos disponibles comercialmente, por ejemplo, los equipos de iltenyi Biotec (Auburn, CA), y eBioscience (San Diego, CA). En algunas modalidades, los niveles de IL-21 se miden por tinción de citocinas y citometría de flujo, en la que un anticuerpo anti-IL-21 , ligado a una porción perceptible, se utiliza para detectar el nivel intracelular de IL-21 en las células que producen IL-21 del paciente. La IL-21 también puede medirse en función de la actividad en un ensayo biológico, por ejemplo, al medir respuestas proliferativas de las células T a una combinación de IL-21 e IL-15 al utilizar, por ejemplo, CFSE (succinimidil éster de carboxifluoresceína) (Zeng ef al., Curr. Protoc. Immunol. 78:6.30.1-6.30.8 (2007)). Otro método para medir IL-21 se basa en la fosforilación de tirosinas inducida por IL-21 de Stat3 en células T CD8(+) esplénicas al utilizar un análisis basado en citometría de flujo (Zeng ef al., 2007). Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente otros medios adecuados para medir IL-21.

En los métodos de esta invención, el valor de referencia (o índice) para determinar si un paciente tiene IL-21 elevada (anormalmente alta) es el valor de IL-21 de un sujeto control, o el valor medio de IL-21 de un grupo de sujetos control, obtenido al utilizar el mismo ensayo que se realiza en el mismo . o diferente momento. El sujeto control es un sujeto normal o sano que, en este contexto, es un individuo sin ningún padecimiento inflamatorio conocido en curso, lo que incluye sin una enfermedad autoinmune (sin ningún síntoma detectable de una enfermedad autoinmune). En algunas modalidades, los sujetos control no son linfopénicos. Un incremento del nivel de IL-21 en alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, diez veces, veinte veces, treinta veces, cuarenta veces, cincuenta veces, cien veces o más puede considerarse un incremento significativo. Ciertos análisis estadísticos pueden aplicarse para determinar si el nivel de IL-21 en una muestra de prueba es significativamente diferente al nivel de control. Tales análisis estadísticos son se conocen bien por los expertos en la técnica, y pueden incluir, sin limitación, pruebas paramétricas (por ejemplo, la prueba t de Student de dos colas) o no paramétricas (por ejemplo, la prueba de U de Wilcoxon-Mann-Whitney).

Detección de genotipos de SNP de IL-21 En algunos métodos de esta invención, se utiliza genotipificación para predecir si un paciente es propenso a tener (es decir, está en riesgo de tener o es probable que tenga) IL-21 elevada, y por tanto está en riesgo de desarrollar autoinmunidad secundaria mientras tiene linfopenia. "Genotipificación" se refiere al proceso de determinar el genotipo de un individuo por el uso de ensayos biológicos. Los métodos de genotipificación se conocen bien por los expertos en la técnica, e incluyen, sin limitación, PCR, secuenciación de DNA, sondas de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO), e hibridación a microarreglos o cuentas de DNA. La genotipificación puede ser parcial, es decir, sólo se determina una pequeña fracción del genotipo de un individuo. En el contexto de esta invención, sólo necesitan detectarse ciertos SNPs. Un SNP es una variación de la secuencia de DNA que se presenta cuando un solo nucleótido - A, T, C, o G - en una porción correspondiente del genoma, difiere entre los miembros de una especie o entre cromosomas complementarios en un individuo. A los SNPs humanos conocidos se asignan números de identificación de referencia de SNP (refSNP o rs) en el archivo del dominio público, la Base de Datos de Polimorfismos de un solo nucleótido (dbSNP) alojada en el Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI).

Los inventores presentes han descubierto que los genotipos de SNP secundarios de rs13151961 A/A, rs6822844 G/G y rs6840978 C/C se asocian con niveles significativamente superiores de IL-21 sérica, en comparación con individuos que no tienen estos genotipos. Los pacientes con MS que tienen uno o más de estos fenotipos de SNP, de esta manera, tienen una susceptibilidad incrementada a desarrollar autoinmunidad secundaria después del agotamiento de linfocitos, en comparación con pacientes con MS que no tienen estos genotipos.

Momento adecuado para obtener información sobre IL-21 Obtener información sobre IL-21 (niveles de IL-21 o genotipos de SNP relacionados con IL-21) de un paciente con MS es útil para seleccionar los regímenes de tratamiento y monitoreo posterior al tratamiento para el paciente. Cuando la información se obtiene antes de la terapia para MS, el paciente puede ser informado del riesgo relativo de desarrollar autoinmunidad secundaria después de la terapia de agotamiento de linfocitos, y las decisiones sobre el tratamiento pueden tomarse por consiguiente. El paciente también puede ser informado de una necesidad de un monitoreo intensificado posterior al tratamiento, por ejemplo, examen más frecuente y más completo por un especialista, si se clasifica como "en riesgo". De esta manera, la información sobre IL-21 mejora el manejo de los riesgos (por los médicos, farmacéuticos, y pacientes) en el tratamiento de la MS.

Obtener información sobre IL-21 , durante o después del tratamiento de la MS, también será útil para monitorear el desarrollo y tratamiento de la autoinmunidad secundaria. Como se observa anteriormente y se describe además a continuación, hemos descubierto que, después de la terapia de agotamiento de linfocitos, los pacientes con MS que continúan desarrollando autoinmunidad secundaria tienen un incremento mucho mayor en su IL-21 sérica, en comparación con pacientes con MS que no desarrollan autoinmunidad secundaria. El último grupo de pacientes con MS produce sólo un poco más de IL-21 después del agotamiento de linfocitos. De esta manera, al medir la producción de IL-21 después del tratamiento de agotamiento de linfocitos, también puede predecirse el riesgo de autoinmunidad secundaria, lo cual puede ocurrir hasta meses o años después del tratamiento.

Tratamiento de autoinmunidad secundaria Una enfermedad de autoinmunidad secundaria que surge en pacientes con MS puede tratarse con base en el tipo de enfermedad. En algunas modalidades de la presente invención, la autoinmunidad secundaria puede tratarse al utilizar una dosis efectiva de un antagonista de IL-21. Un IL-antagonista de 21 puede ser un agente terapéutico que inhibe la actividad de IL-21 , por ejemplo, un agente que inhibe la interacción entre IL-21 e IL-21 R. Una "dosis efectiva" se refiere a la cantidad de un agente inhibidor suficiente para inhibir la actividad de IL-21 en un paciente, de tal modo que los síntomas de la enfermedad autoinmune secundaria se alivien o es prevengan. Los antagonistas de IL-21 pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos para las proteínas humanas IL-21 o IL-21 R, o IL-21 R soluble. Véase también, por ejemplo, la Patente de E.U. No. 7,410,780 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U. No. 20080241098, cuyas enseñanzas completas se incorporan en este documento para referencia. Las composiciones farmacéuticas que contienen un antagonista de IL-21 pueden elaborarse de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas que contienen antagonistas de IL-21 pueden administrarse a un paciente al utilizar un método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, de manera intravenosa, intramuscular o subcutánea.

Equipos para tratar y hacer pruebas a pacientes con MS La presente invención proporciona equipos para tratar la esclerosis múltiple. Un equipo de esta invención puede contener, entre otros, un fármaco de agotamiento de linfocitos (por ejemplo, alemtuzumab), e instrucciones escritas para informar a un paciente o a un proveedor de asistencia médica sobre las contraindicaciones del fármaco, por ejemplo, el potencial de un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del tratamiento con el fármaco. El riesgo incrementado puede asociarse con, o indicarse por, (i) IL-21 elevada, o (ii) la presencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978.

En otras modalidades, la invención proporciona equipos para detectar IL-21 sérica en un paciente con MS, y/o para identificar pacientes con MS con un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos. Tales equipos pueden comprender un anticuerpo anti-IL-21 , o una porción de unión a antígenos del mismo, o un receptor de IL-21 soluble y, opcionalmente, una instrucción que se dirige a un usuario para tomar una muestra de sangre de un paciente y, opcionalmente, uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo, porción, o del receptor de IL-21 soluble a IL-21 en la muestra de sangre del paciente con MS. Tales equipos se habrán validado o aprobado por una autoridad normativa apropiada para hacer diagnóstico, médico en pacientes, tales como pacientes con MS.

Aún en otras modalidades, la invención proporciona equipos para identificar un paciente con MS que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos. Los equipos pueden comprender uno o más reactivos apropiados para identificar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de SNP seleccionados del grupo que consiste en: SNP rs13151961 , SNP rs6822844, y SNP rs6840978, en una muestra obtenida de un paciente con MS, y una instrucción que se dirige a un usuario para tomar una muestra de un paciente con MS.

Valoración de la capacidad de respuesta de las células T al tratamiento de la MS Esta invención proporciona métodos para valorar la capacidad de respuesta de las células T al tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos en un paciente con MS. Los métodos implican medir la caspasa-3 en células T obtenidas del paciente después del tratamiento. Un incremento en caspasa-3 (por ejemplo, proteína, transcrito de RNA, y/o niveles de actividad de caspasa-3) en las células T, en comparación con células T de un paciente con MS que no recibe el tratamiento, indica que las células T en el paciente tratado han respondido al tratamiento. Estos métodos se basan en nuestro descubrimiento de que las células T de personas con MS sin tratamiento son resistentes a la apoptosis, y que esta resistencia se asocia con la sub-expresión de caspasa-3. Pero, después de la terapia de agotamiento de linfocitos, la expresión de caspasa-3 aumenta significativamente en las células T, y alcanza niveles observados en personas sanas.

Las técnicas para medir caspasa-3 en células T se conocen bien en el arte. Por ejemplo, pueden obtenerse extractos celulares a partir de células T al utilizar técnicas bien conocidas en el arte, y medir los niveles de proteína caspasa-3, por ejemplo, mediante ELISA. Los equipos comerciales de ELISA, para la medición de caspasa-3 humana, se encuentran disponibles, por ejemplo, de Bender MedSystems (Burlingame, CA), EMD Chemicals, Inc. (San Diego, CA), y R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Alternativamente, los- niveles del transcrito de caspasa-3 pueden medirse en las células T, por ejemplo, mediante análisis de Northern blot o PCR cuantitativa. La caspasa-3 también puede medirse en función de la actividad en un ensayo biológico, por ejemplo, al medir su actividad de proteasa. Los equipos comerciales para medir la actividad de caspasa-3 se encuentran disponibles, por ejemplo, de Roche Applied Science (Indianápolis, IN), e Invitrogen (Carlsbad, CA).

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se comprende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Los métodos y materiales ejemplares se describen a continuación, aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento también pueden utilizarse en la práctica o experimentación de la presente invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en este documento se incorporan para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, dominará. Aunque una serie de documentos se citan en este documento, esta cita no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forma parte del conocimiento general común en la técnica. A lo largo de esta especificación y las modalidades, se entenderá que la palabra "comprenden", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitantes.

Los siguientes ejemplos tienen la intención de ilustrar los métodos y materiales de la presente invención. Las modificaciones y adaptaciones adecuadas de las condiciones y parámetros descritos, encontrados normalmente en la técnica, lo cual es obvio para los expertos en la técnica, están dentro del espíritu y el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS En los ejemplos siguientes, todos los pacientes tuvieron esclerosis múltiple recurrente-remitente y fueron participantes en uno de dos ensayos clínicos: CAMMS-223 y CAMMS-224 (REC 02/315 y 03/078) en los cuales el alemtuzumab se administró por infusión intravenosa de 12-24 mg/día durante cinco días, seguido nuevamente por tratamiento a los 12 meses. Los pacientes y controles consintieron el sangrado para propósitos de investigación (LREC 02/263) y todos estuvieron libres de la exposición a otros agentes modificadores de la enfermedad, incluyendo esteroides, durante por lo menos un mes en el momento del muestreo de sangre.

Los datos de proliferación y apoptosis de linfocitos se generaron por un estudio transversal de células ex vivo recientes, de 65 pacientes y 21 controles sanos (7 varones, edad media 34 años). Esto generó algunas hipótesis acerca del ciclo de las células T en la patogénesis de la autoinmunidad secundaria, las cuales se comprobaron en muestras disponibles a los nueve meses después del tratamiento con alemtuzumab, que se eligió como el punto más temprano en el tiempo en el cual la apoptosis de células T podría analizarse de manera robusta. De las 29 muestras disponibles en este punto en el tiempo, 10 cumplieron con nuestra definición de estudio de la autoinmunidad (1 varón, edad media 36 años) en comparación con 10 sin autoinmunidad (3 varones, edad media 38 años). La autoinmunidad se definió como el desarrollo de una enfermedad autoinmune novedosa (con o sin auto anticuerpos), o títulos significativos persistentes de auto anticuerpos (presentes en por lo menos dos ocasiones por lo menos tres meses aparte) sin enfermedad clínica. La "no autoinmunidad" se definió como la ausencia de una enfermedad autoinmune y auto-anticuerpos durante por lo menos 18 meses posteriores al alemtuzumab en este estudio. De los diez pacientes con autoinmunidad, tres tuvieron auto-anticuerpos solamente (anticuerpos antinucleares). Luego, la IL-21 sérica se midió de manera seriada en: 15 pacientes seleccionados al azar con autoinmunidad - cinco de ellos se habían estudiado como antes (tres varones, edad media 34 años; doce con autoinmunidad tiroidea, uno con la enfermedad de Goodpasture, uno con ITP, y con uno con anticuerpos antinucleares solamente), y quince pacientes seleccionados al azar sin autoinmunidad - seis de ellos se habían estudiado como antes, (cinco varones, edad media 31 años) y diecinueve controles sanos (siete varones, edad media 33 años). 73 sujetos se estudiaron para análisis genético. De éstos, 23 cumplieron con la definición de "no autoinmunidad" y 27 tuvieron autoinmunidad secundaria después del alemtuzumab (seis con auto-anticuerpos solamente: cuatro con antinucleares y dos con anticuerpos anti-músculo liso; dieciocho con autoinmunidad tiroidea, dos con ITP y con uno con enfermedad de Goodpasture). Los 23 sujetos restantes no podían clasificarse con base en la producción transitoria de auto-anticuerpos y/o por el tiempo insuficiente desde el tratamiento con alemtuzumab.

Para todo el análisis estadístico descrito en los siguientes ejemplos, los datos se analizaron utilizando SPSS 12.0.1 para Windows. Después de la valoración de la normalidad, se realizaron pruebas paramétricas (prueba de t de Student) o no paramétricas (Wilcoxon-Mann-Whitney). Los valores de P se indican a lo largo del texto, donde un valor de p<0.05 se consideró como estadísticamente significativo, modificado por una corrección de Bonferroni donde se indica.

Ejemplo 1: El alemtuzumab induce una linfopenia de células T.

Una dosis única de alemtuzumab tuvo como resultado el agotamiento de linfocitos T CD4+ y CD8+ a 5.6% y 6.8%, respectivamente, de los valores de referencia en el mes 1 , y 30.3% y 40.8%, respectivamente, en el mes 12 (datos no mostrados).

Ejemplo 2: Las células T de pacientes con esclerosis múltiple sin tratar son resistentes a la muerte celular Para diversos ensayos realizados en este Ejemplo, diferentes muestras transversales y longitudinales se utilizaron de acuerdo con la disponibilidad. Como un preludio a la medición del ciclo celular de los linfocitos después del alemtuzumab, examinamos la respuesta proliferativa de las células T, sin estimular o en cultivo con proteína básica de mielina (MBP) o el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHr), entre los pacientes con esclerosis múltiple sin tratamiento y los controles normales (Figuras 1A y 1 B).

A. Cultivos de células mononucleares periféricas Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de sangre heparinizada por centrifugación en un gradiente de densidades de Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech). PBMCs completas se suspendieron inmediatamente en medio de cultivo (RPMI) que contenía 1% de penicilina, 1% de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (Sigma S5394) y se ajustaron a una concentración de 10/ml de células viables (determinado por exclusión de azul de tripano). Para inducir la muerte celular pasiva, se incubaron PBMCs durante 72 horas en medio solo sin factores de crecimiento adicionales. La apoptosis mediada por Fas se indujo al cultivar PBMCs durante 48 horas con anti-CD28 soluble (1 Mg/ml; donado amablemente por M. Frewin, Universidad de Oxford) en placas pre-recubiertas con mAb anti-CD3 (1 g/ml -BD Pharmingen), seguido por 18 horas de incubación con anti-Fas humano activador (clon CH1 1 , 1 µg/ml - Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).

B. Detección de apoptosis Las células T apoptóticas se detectaron al teñir las células con: anticuerpos monoclonales anti-humano de ratón conjugados con aloficocianina, contra CD3 (Serotec MCA463APC), CD4 (Serotec MCA1267APC) y CD8 (Serotec MCA1226APC), anexina-V conjugada con FITC y Yoduro de Propidio (BD Pharmingen). La florescencia se detectó por citometría de flujo (FACSCALIBUR; Becton Dickinson, ountain View, CA). Con base en la dispersión hacia delante y lateral, una amplia selección de poblaciones de linfocitos se extrajo para incluir linfocitos vivos y apoptóticos (que tienen FSc reducida y SSc aumentada). Por lo menos 15,000 eventos dentro de la selección de poblaciones se recolectaron y analizaron utilizando el software WinMDI 2.8. Las células apoptóticas tempranas se definieron como anexina V+PI", y las células apoptóticas tardías o necróticas como anexina V+PI+ (Aubry ef al., Cy ometry 37 , 197-204 (1999)). La muerte de células apoptóticas se definió como muerte celular total (anexina V+PI" más anexina V+PI+) bloqueada por la inhibición de pan-caspasa con Q-VD-OPh (RnD Systems OPH001 ).

C. Ensayos de proliferación Las PBMCs se cargaron con el colorante rastreador de división celular CFSE (succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína) (Lyons ef al. Methods Cell Biol. 63, 375-398 (2001 )) y se cultivaron con 50 pg/ml de proteína básica de mielina (MBP: RDI-TRK8M79/LYO) o 1 Mg/ml de dominio extracelular del receptor de la hormona estimulante de la tiroides unido a una proteína de unión a matriz (TSHr: amablemente donado por M. Ludgate, Universidad de Cardiff). Después de 10 días de tinción con CFSE en las células, identificadas por marcadores específicos de superficie (CD4, CD8), se analizó por citometría de flujo. La frecuencia de precursores (definida como la proporción de linfocitos que dejaron la población de origen para someterse a por lo menos dos divisiones celulares) y el índice de proliferación (definido como la suma de las células en todas las generaciones dividida entre el número calculado de células de origen) se calcularon utilizando Modfit LT 3.0 (Verity Software). El número absoluto de células sobrevivientes se midió por la comparación con un número fijo de cuentas inertes (BD CALIBRITE, BD Biosciences), incluidas en los cultivos.

D. Resultados No hubo diferencia en la respuesta proliferativa de las células T, sin estimular o en cultivo con proteína básica de mielina (MBP) o el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHr), entre pacientes sin tratamiento con esclerosis múltiple y los controles normales (Figuras 1A y 1 B). Por el contrario, la supervivencia de las células T de pacientes sin tratamiento con esclerosis múltiple fue > 4 veces mayor a la de los controles (p<0.005; Figura 1C), lo que sugiere que la muerte reducida de las células T es una característica de la esclerosis múltiple sin tratamiento. Confirmamos esto al demostrar que las células T de pacientes sin tratamiento son resistentes a apoptosis tanto pasiva como mediada por Fas, en comparación con los controles sanos (pasiva: 0.3% v. 6.7%, p=0.0016; y mediada por Fas: 2.9% v. 15.5%, p=0.0018; Figuras 1 E y 1 F).

Ejemplo 3: Las células T que se regeneran después del alemtuzumab son altamente proliferativas. se desvían hacia la auto-reactividad v son susceptibles a apoptosis Al utilizar los ensayos, descritos en el Ejemplo 2, encontramos que después del alemtuzumab, la proporción de células T que responden a auto-antígenos (frecuencia de precursores) y el grado de proliferación (índice proliferativo) se incrementaron significativamente en comparación con pacientes sin tratamiento y los controles sanos. Por ejemplo, en el mes 3, la proliferación de células T sin estimular fue >6.5 veces la de los pacientes sin tratamiento, y la proliferación en respuesta a MBP y estimulo por TSHr se incrementó en 900% y 700%, respectivamente (todo p<0.01 : Figuras 1A y 1 B). La apoptosis de células T también se incrementó significativamente después del alemtuzumab. En respuesta al estimulo antigénico, la proporción de células T que se someten a apoptosis a los seis meses fue 10 veces mayor a los valores de referencia (Figura 1 D; p<0.001 para todos los antlgenos) lo que resulta en menos células T viables al final del cultivo (FIG. 1 C). La apoptosis pasiva y mediada por Fas también se incrementaron después del alemtuzumab, con tasas por lo menos dobles a las observadas en el grupo testigo sano (pasiva: 24.5%, 22.2% y 17.9% a 6, 9 y 12 meses, respectivamente, en comparación con 6.7% en los controles, todo p<0.001 ; mediada por Fas 37.8%, 35.8% y 29.9% a 6, 9 y 12 meses, respectivamente, en comparación con 15.5% en los controles, todo p<0.01 ; Figuras 1 E y 1 F). La apoptosis incrementada de linfocitos después del alemtuzumab se observó en las sub-poblaciones CD4+ y CD8+ (Figuras 1 G y 1 H) y persistió durante por lo menos 18 meses después del tratamiento con alemtuzumab (datos no mostrados).

Ejemplo 4: Las células T de pacientes sin tratamiento con esclerosis múltiple sub-expresan caspasa 3 A. Análisis de mRNA PBMCs, inmediatamente ex-vivo o después de su cultivo con MBP o estimulo policlonal, se separaron positivamente, utilizando 20 µ? de cuentas magnéticas (Miltenyi Biotec; CD19 Microbeads, CD3 Microbeads, CD14 Microbeads) por 1 x 107 células cargadas en una Columna MACS® LS. Las células retenidas magnéticamente se eluyeron, lavaron y almacenaron en RNA/aíer™ a -70° C (pureza celular consistentemente 95-98%, datos no mostrados).

La expresión de Fas, FasL, Bcl-2, Bcl-X1 , Bad, Bax, Bid, Bim, Survivina, c-FLIP, y Caspasa 3, 8 y 9 se determinó por RT-PCR semi-cuantitativa. Se extrajo mRNA de células almacenadas en RNA/aíer™ utilizando el RNEASY Mini Kit (QIAgen) y se transcribió en reversa al cDNA utilizando el PRO-STAR First Strand RT-PCR Kit (Stratagene). Los oligonucleótidos y sondas de la PCR se diseñaron utilizando PRIMER EXPRESS (PE Biosystems, Foster City, CA, E.U.), y se adquirieron del servicio Oswel DNA. La información de secuencias de mRNA se obtuvo del GenBank. Se realizó PCR cuantitativa en tiempo real en un ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Perkin Elmer) utilizando PCR Mastermix que contenía ROX (Eurogentec RT-QP2X-03). Las secuencias de oligonucleótidos y sondas fueron: Bcl-2 Adelante: 5'-CCT GTG GAT GAC TGA GTA CCT GAA-3' (SEQ ID NO: 1 ), Reversa 5'-CAC CTA CCC AGC CTC CGT TA-3' (SEQ ID NO: 2), sonda etiquetada con JOE 5'-CGG CAC CTG CAC ACC TGG ATC-3' (SEQ ID NO: 3); Bcl-XI Adelante 5 -TTC AGT CGG AAA TGA CCA GAC A-3' (SEQ ID NO: 4), Reversa 5'-GAG GAT GTG GTG GAG CAG AGA-3' (SEQ ID NO: 5), sonda etiquetada con FAM 5'-TGA CCA TCC ACT CTA CCC TCC CAC CC-3' (SEQ ID NO: 6); Fas Adelante 5'-AAA AGC ATT TTG AGC AGG AGA GTA ??-3' (SEQ ID NO: 7), Reversa 5'-GGC CAT TAA GAT GAG CAC CAA-3' (SEQ ID NO: 8), sonda etiquetada con JOE 5 -CTA GAG CTC TGC CAC CTC TCC ATT -3' (SEQ ID NO: 9); FasL Adelante 5'-AAG AAA GTG GCC CAT TTA ACA G-3' (SEQ ID NO: 10), Reversa 5'-AGA AAG CAG GAC AAT TCC ATA GGT-3' (SEQ ID NO: 1 1 ), sonda etiquetada con FAM 5'-CAA CTC AAG GTC CAT GCC TCT GG-3' (SEQ ID NO: 12); Survivina Adelante 5'-CTG CCT GGC AGC CCT TT-3' (SEQ ID NO: 13), Reversa 5'-CTC CAA GAA GGG CCA GTT CTT -3' (SEQ ID NO: 14), sonda etiquetada con FAM 5'-TCA AGG ACC ACC GCA TCT CTA CAT T-3' (SEQ ID NO: 15); c-FLIP Adelante 5'-GTG GAG ACC CAC CTG CTC -3' (SEQ ID NO: 16), Reversa 5'-GGA CAC ATC AGA TTT ATC CAA ATC C -3' (SEQ ID NO: 17), sonda etiquetada con FAM 5"-CTG CCA TCA GCA CTC TAT AGT CCG AAA CAA -3' (SEQ ID NO: 18); Caspasa 8 Adelante 5'-AGG AGG AGA TGG AAA GGG AAC TT -3' (SEQ ID NO: 19), Reversa 5'-ACC TCA ATT CTG ATC TGC TCA CTT CT -3' (SEQ ID NO: 20), sonda etiquetada con JOE 5'-CTC CCT ACA GGG TCA TGC TCT ATC AGA TTT CAG -3' (SEQ ID NO: 21 ); Caspasa 3 Adelante 5 -AAG ATC ATA CAT GGA AGC GAA TCA -3' (SEQ ID NO: 22), Reversa 5'-CGA GAT GTC ATT CCA GTG CTT TTA -3' (SEQ ID NO: 23), sonda etiquetada con FAM 5'-CTG GAA TAT CCC TGG ACA ACA GTT ATA AA -3' (SEQ ID NO: 24); Caspasa 9 Adelante 5'-TGC GAA CTA ACA GGC AAG CA -3' (SEQ ID NO: 25), Reversa 5'-GAA CCT CTG GTT TGC GAA TCT C -3' (SEQ ID NO: 26), sonda etiquetada con FAM 5 -CAA AGT TGT CGA AGC CAA CCC TAG AAA ACC TTA -3' (SEQ ID NO: 27); Bad Adelante 5' CAG TGA CCT TCG CTC CAC ATC 3' (SEQ ID NO: 28), Reversa 5' -ACG GAT CCT CTT TTT GCA TAG -3' (SEQ ID NO: 29), sonda etiquetada con JOE 5'-ACT CCA CCC GTT CCC ACT GCC C-3' (SEQ ID NO: 30); Bax Adelante 5'-TTT CTG ACG GCA ACT TCA ACT -3' (SEQ ID NO: 31), Reversa 5'-GGT GCA CAG GGC CTT GAG-3' (SEQ ID NO: 32), sonda etiquetada con JOE 5'-TGT CGC CCT TTT CTA CTT TGC CAG CA-31 (SEQ ID NO: 33); Bid Adelante 5'-GCT GTA TAG CTG CTT CCA GTG TAG -3' (SEQ ID NO: 34), Reversa 5'-GCT ATC TTC CAG CCT GTC TTC TCT -3' (SEQ ID NO: 35), sonda etiquetada con JOE 5'-AGC CCT GGC ATG TCA ACA GCG TTC -3' (SEQ ID NO: 36) y Bim Adelante 5'-ACC ACA AGG ATT TCT CAT GAT ACC -3" (SEQ ID NO: 37), Reversa 5'-CCA TAT GAC AAA ATG CTC AAG GAA -3' (SEQ ID NO: 38), sonda etiquetada con FAM 5'-TAG CCA CAG CCA CCT CTC TCC CT-3' (SEQ ID NO: 39).

B. Resultados La expresión en células T del mRNA de caspasa 3, la caspasa efectora común para ambas rutas apoptóticas, a partir de pacientes con esclerosis múltiple sin tratamiento, se redujo en comparación con los controles; esto fue significativo para los PBMCs sin estimular y estimulados con MBP (en 78% y 87% respectivamente, ambos p<0.05, después de una corrección para comparaciones múltiples), pero no para los cultivos estimulados policlonales (Figura 2A). Una tendencia similar se observó en células CD14+ (pero no en células CD19+) aunque esta diferencia no superó la corrección para comparaciones múltiples (Figura 2B). Después del alemtuzumab, la expresión de caspasa 3 se incrementó significativamente en células T y monocitos, al alcanzar niveles observados en los controles sanos (p<0.05; Figuras 2A y 2B). La expresión de todos los otros genes probados (listados en los métodos) se mantuvo sin cambios después del alemtuzumab.

De esta manera, nuestros estudios demuestran que las células T de personas con esclerosis múltiple sin tratamiento son resistentes a la apoptosis, y esta resistencia se asocia con la sub-expresión de caspasa 3. Consistente con la posición de esta caspasa efectora en el punto de convergencia de las rutas apoptóticas extrínseca e intrínseca, hemos demostrado la resistencia de las células T a la apoptosis mediada por Fas y pasiva en nuestros pacientes. La sub-expresión de caspasa 3 se ha descrito en algunas enfermedades autoinmunes, incluyendo diabetes Tipo II (Vendrame er al., Eur J Endocrinol 152, 119-125 (2005)), tiroiditis de Hashimoto y síndrome poliendocrino autoinmune-2 (Vendrame et al., Clin J Endocrinol Metabjc (2006)). Esto, sin embargo, es un hallazgo novedoso en la esclerosis múltiple.

Ejemplo 5: La autoinmunidad secundaria después del alemtuzumab se asocia con apoptosis excesiva de células T Al haber demostrado la proliferación y apoptosis incrementada de linfocitos como una respuesta genérica al tratamiento, probamos la relación entre la apoptosis de células T y el desarrollo de autoinmunidad después del alemtuzumab, definida como el desarrollo de una enfermedad autoinmune novedosa y/o auto-anticuerpos persistentes por arriba del intervalo normal, después del alemtuzumab, sostenidos durante por lo menos 3 meses. Al utilizar esta definición, las células T derivadas de pacientes con autoinmunidad (n = 10) mostraron niveles significativamente superiores de muerte celular apoptótica en todas las condiciones de cultivo a los 9 pos-tratamiento de meses, cuando se comparan con células T de pacientes no autoinmunes (n = 10) estudiados en el mismo punto en el tiempo (sin estimular 4.7% vs. 14.4%, mediada por Fas 18.2% vs. 32.1 %, MBP 7.6% vs. 17.6%, y TSHr 9.5% vs. 25.5%, p<0.01 para todas las comparaciones; Figura 3). Si una definición más estricta de autoinmunidad se aplicaba, que era el desarrollo de una enfermedad autoinmune, excluyendo la producción de anticuerpos no patogénicos, la diferencia permanecía, a pesar de reducir el número en el grupo autoinmune a 7 (sin estimular, 4.7% vs. 15.4%; mediada por Fas, 18.2% vs. 31.7%; MBP, 7.6% vs. 20.2%; TSHr, 9.5% vs. 13.4%; p<0.02 para todas las comparaciones).

No hubo diferencia en la tasa de reconstitución de células T entre los dos grupos (por ejemplo, a 6 meses, los conteos de CD4 son 0.15 x 109/l vs. 0.19 x 109/l; y los conteos de CD8 son 0.11 x 109/l vs. 0.11 x 109/l en aquellos con y sin autoinmunidad, respectivamente), lo que sugiere un ciclo aumentado de las células T en el grupo autoinmune (datos no mostrados).

Ejemplo 6: IL-21 induce proliferación y apoptosis de células T A. Ensayos y enriquecimiento con IL-21 La IL-21 sérica se midió utilizando el equipo EBIOSCIENCE (88-7216-86) de acuerdo con las instrucciones. Las placas se leyeron utilizando un lector de microplacas (modelo 680, Bio ad) a 450 nm. PBMCs sin estimular y estimulados de manera policlonal (1 pg/ml anti-CD3 unido a la placa y 1 g/ml de anti-CD28 soluble) se enriquecieron con 5 pg/ml y 20 pg/ml de rhlL-21 (EBIOSCIENCE 14-8219). La apoptosis y proliferación de CD4+ y CD8+ se valoraron como se describe anteriormente.

B. Resultados Probamos el efecto de la IL-21 exógena sobré la apoptosis y proliferación de células T humanas in vitro. Estimular PBMCs de controles sanos con rhlL-21 condujo a un incremento en la muerte apoptótica de células T CD4+ (Figura 4A) y CD8+ (Figura 4B) sin estimular y estimuladas de manera policlonal en una forma dependiente de la dosis (p<0.05 para todas las condiciones). Enriquecer células sin estimular con rhlL-21 condujo a un incremento pequeño pero significativo en la proliferación de células T CD4+ y CD8+; con un incremento tanto en el índice proliferativo (CD4+ y CD8+: 1.07 vs. 1.25, p=0.017; y 1.09 vs. 1.32, p=0.017 respectivamente; Figura 5A) como la frecuencia de precursores (CD4+ 0.007 vs. 0.014, p=0.016; CD8+ 0.007 vs. 0.015, p=0.026 Figura 5C). La IL-21 no afectó la proporción de células T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta al estímulo policlonal (Figura 5D), lo que sugiere que ya se estimularon al máximo. La IL-21 , -sin embargo, condujo a un incremento significativo en el grado de la proliferación de células CD8+ (índice proliferativo 1 1.59 vs. 19.39, p=0.012; Figura 5B).

Ejemplo 7: La IL-21 predice el desarrollo de autoinmunidad secundaria después del alemtuzumab En todos los puntos en el tiempo en el Ejemplo 6, la concentración de IL-21 sérica fue significativamente mayor en pacientes que desarrollaron autoinmunidad secundaria, en comparación con el grupo no autoinmune (para todas las comparaciones p<0.05; Figura 6A). Examinamos todas las muestras séricas de pre-tratamiento de 84 pacientes que subsecuentemente continuaron teniendo alemtuzumab. Después de por lo menos dos años de dar seguimiento a estos pacientes, los clasificamos en el grupo "autoinmune" (n = 35: 32 pacientes con enfermedades de tiroides, un con ITP, uno con Goodpasture, y uno con Alopecia) o grupo "no autoinmune" (n = 49: pacientes sin auto-anticuerpos o con transitorios solamente (inconstantes por más de seis meses))). Estos sueros de pre-tratamiento tuvieron una concentración media de IL-21 estadísticamente mayor que los controles; sin embargo, esto se justificó completamente por los altos niveles de IL-21 en esos pacientes que continuaron desarrollando autoinmunidad secundaria. Hubo una diferencia sumamente significativa en los niveles de IL-21 de pre-tratamiento entre aquellos que siguieron desarrollando autoinmunidad (464 pg/ml) y los que no lo hicieron (229 pg/ml; p=0.0002) (Figura 6B).

La asociación entre linfopenia inducida y autoinmunidad se ha observado en modelos animales. Bajo condiciones linfopénicas, las células T restantes se someten a una expansión compensatoria extensa con el fin de reconstituir el sistema inmunitario. Este proceso, denominado proliferación homeostática, depende del estímulo a través del complejo TCR-auto-péptido-MHC (Ge ef al., P.N.A.S. 101, 3041-3046 (2004); Ge ef al., P.N.A.S. 98, 1728-1733 (2001 ); Kassiotis ef al., J Exp. Med. 197, 1007-1016 (2003)) y tiene como resultado una población sesgada hacia el reconocimiento aumentado de auto-antlgenos, como se observa en nuestros estudios. Además, las células T en rápida expansión adquieren el fenotipo y características funcionales de las células de memoria, incluyendo: dependencia reducida del co-estímulo, la capacidad de responder a dosis de antígeno menores que las células no sensibilizadas, y la secreción rápida de citocinas inflamatorias con un nuevo estimulo, lo que promueve aún más la falla de la auto tolerancia (Cho ef al., J Exp. Med. 192, 549- 556 (2000); Goldrath et al. J Exp. Med. 192, 557-564 (2000); Murali-Krishna ef al., J Immunol 165, 1733-1737 (2000); Wu et al., Nat Med. 10, 87-92 (2004)). Todavía, a pesar de estos cambios, la autoinmunidad no es una consecuencia inevitable de la linfopenia. En efecto, al igual que con nuestros pacientes, la mayor parte de los sujetos linfopénicos no desarrolló autoinmunidad, lo que sugiere que se requieren "co-factores" adicionales.

Hemos demostrado aquí, por primera vez en el humano, que la sobreproducción de IL-21 es el "segundo disparo" requerido en el desarrollo de la autoinmunidad secundaria después del tratamiento, exitoso bajo otras circunstancias, de la esclerosis múltiple, con un agente de agotamiento de linfocitos, tal como alemtuzumab. Nuestros estudios muestran que la autoinmunidad surge en pacientes con agotamiento de linfocitos, con mayor apoptosis de células T y ciclo celular conducido por niveles superiores genéticamente influidos de IL-21 , que son detectables aún antes del tratamiento. Aún antes del tratamiento, los pacientes que continuaron désarrollando autoinmunidad secundaria tuvieron niveles más de 2 veces superiores de IL-21 sérica que el grupo no autoinmune, lo que sugiere que la IL-21 sérica puede servir como biomarcador para el riesgo de desarrollar autoinmunidad meses a años después del tratamiento con alemtuzumab. Sin desear limitarse por teoría alguna, consideramos que, al estimular los ciclos de expansión y muerte de células T en exceso, la IL-21 incrementa la probabilidad de generar células T auto-reactivas y, por tanto, para la autoinmunidad. De esta manera, el ciclo anormal inducido por citocinas de las células T es un principio general de la autoinmunidad asociada a linfopenia.

Ejemplo 8: El genotipo de IL-21 influye en la expresión de IL-21 y se asocia con la autoinmunidad A. Genotipificación de IL-21 En total, se probaron cuatro SNPs, rs13151961 , rs6822844, rs4833837 y rs6840978, que están en una región de fuerte desequilibrio de ligamiento que contiene cuatro genes, KIAA1109-ADAD1-IL2-IL21, en el cromosoma 4q27. Los cuatro SNPs estaban disponibles como productos de Applied Biosystems Assay-On-Demand (AoD). La genotipificación de los SNP se realizó al utilizar la metodología Applied Biosystems TaqMan de acuerdo con las condiciones recomendadas del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en termocicladores de 384 pozos 9700 Viper de Applied Biosystems, después de lo cual los genotipos se denominaron en un Sistema de Detección de Secuencias (SDS) 7900 de Alta Resolución, utilizando el Software SDS Versión 2.1. Cada individuo se genotipificó por duplicado. Todos los individuos se genotipificaron adicionalmente para los factores genéticos asociados a esclerosis múltiple: HLA-DRB1 *1501, rs2104286 (IL2RA) y rs6897932 (IL7R).

B. Resultados Con el fin de determinar si hay una asociación entre la variación genética y la producción de IL-21 , genotipificamos a 73 sujetos, en quienes se había determinado la concentración de IL-21 sérica antes del alemtuzumab, para cuatro polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) que yacen dentro de un bloque de desequilibrio de ligamiento (LD) en el cromosoma 4q27 que codifica el gene IL-21. La frecuencia de alelos menores para los cuatro SNPs estuvo en concordancia con los datos publicados: rs13151961 G (14.5%), rs6822844T (14.6%), rs4833837G (38.0%) y rs6840978T (18.1 %) (Glas ef al, Am. J. Gastroenterol. 104, 1737-1744 (2009)). Encontramos que el genotipo en 3 de los 4 SNPs (rs13151961 A/A, rs6822844 G/G y rs6840978 C/C) se asoció con niveles significativamente mayores de IL-21 sérica (valores de p: 0.0076, 0.0098 y 0.0067 respectivamente). El genotipo en rs4833837 no influyó en la producción de IL-21. El LD entre rs4833837 y los otros tres SNPs es bajo (r2<0.15), por lo tanto, un SNP que yace en el haplotipo rs13151961(A)-rs6822844(G)-rs6840978(C) tiene mayor probabilidad de asociarse con la producción incrementada de IL-21. Las frecuencias de genotipos para HLA-DRB1*1501, rs2104286 (IL2RA) y rs6897932 (IL7R) no difirieron de los datos publicados para otros pacientes no seleccionados con esclerosis múltiple (Consorcio Internacional de Genética de Esclerosis Múltiple (IMSGC), Lancet Neurol. 7, 567-569 (2008); Yeo ef al., Ann Neurol 61 , 228-236 (2007)).

Por último, con el fin de abordar si el genotipo influye en la susceptibilidad a la autoinmunidad después del alemtuzumab, clasificamos a tantos pacientes como fue posible en aquellos que desarrollaron (27 sujetos) y definitivamente no desarrollaron (23 sujetos) autoinmunidad posterior al alemtuzumab. 23 pacientes no pudieron clasificarse debido a la producción .transitoria de auto-anticuerpos y/o tiempo insuficiente desde la exposición al alemtuzumab. Los genotipos (rs13151961 A/A, rs6822844 G/G, rs6840978 C/C), que mostraron asociación con una concentración superior de IL-21 sérica, también se encontraron asociados con autoinmunidad después del alemtuzumab.

Claims (80)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un paciente con esclerosis múltiple (MS) que tiene interleucina-21 (IL-21 ) elevada, en comparación con la IL-21 en un sujeto sin una enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de: medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS, con lo cual se identifica a un paciente con MS que tiene IL-21 elevada en comparación con el sujeto.

2. Un método para identificar a un paciente con esclerosis múltiple que tiene probabilidad de tener interleucina-21 (IL-21) elevada en comparación con un sujeto sin una enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o de más de los genotipos se asocia con IL-21 elevada.

3. Un método para identificar a un paciente con esclerosis múltiple (MS) que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende la etapa de: medir interleucina-21 (IL-21 ) en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde la IL-21 elevada, en comparación con la de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria en comparación con pacientes con MS sin IL-21 elevada; e informar al paciente del riesgo incrementado.

4. Un método para identificar a un paciente con esclerosis múltiple que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende la etapa de: genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia en el paciente de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o más de los genotipos mencionados se asocia con un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin el genotipo o genotipos mencionados; e informar al paciente del riesgo incrementado.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el agotamiento de linfocitos se induce por un tratamiento que se orienta a CD52.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el tratamiento que se orienta a CD52 comprende el tratamiento con un anticuerpo anti-CD52 o una porción de unión a antígenos del mismo.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el anticuerpo anti-CD52 es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

8. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el agotamiento de linfocitos se induce por un tratamiento que se orienta a CD52.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde el tratamiento que se orienta a CD52 comprende el tratamiento con un anticuerpo anti-CD52 o una porción de unión a antígenos del mismo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo anti-CD52 es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

11. Un método para seleccionar a un paciente con esclerosis múltiple (MS) en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria , después de una terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende la etapa de: medir la IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde la IL-21 elevada en el paciente, en comparación con la de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin lL-21 elevada.

12. Un método para seleccionar a un paciente con esclerosis múltiple en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria después de una terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende la etapa de: genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la, presencia de uno o de más de los SNPs indica que el paciente está en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin el genotipo o genotipos mencionados.

13. Un método para informar una decisión de tratamiento para un paciente con esclerosis múltiple, que comprende las etapas de: medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente; y seleccionar un régimen de tratamiento apropiado para la medición de IL-21.

14. Un método para informar una decisión de tratamiento para un paciente con esclerosis múltiple, que comprende las etapas de: genotipificar al paciente para la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo polinucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978; y seleccionar un régimen de tratamiento apropiado para el genotipo del paciente.

15. Un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, que comprende las etapas de: obtener información sobre (i) IL-21 en una muestra de sangre del paciente; o (ii) la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y administrar un agente terapéutico para la esclerosis múltiple al paciente.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, que además comprende, después de la etapa de administración, monitorear al paciente para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria.

17. Un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antlgenos del anticuerpo, para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, el método comprende las etapas de: obtener información sobre (i) IL-21 en una muestra de sangre del paciente; o (ii) la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y administrar el anticuerpo o porción de unión a antígenos al paciente.

18. Un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, en donde el método comprende (i) medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS y/o (ii) genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978.

19. Un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, en donde se ha encontrado que el paciente (i) tiene niveles normales de IL-21 y/o (ii) no tiene uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978.

20. Un anticuerpo para su uso de conformidad con la reivindicación 18 o 19, en donde el método comprende identificar al paciente por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

21. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17, 18, y 19, en donde el anticuerpo es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, en donde el anticuerpo es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

23. Un uso de un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, en la elaboración de un medicamento para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, el método comprende las etapas de: obtener información sobre (i) IL-21 en una muestra de sangre del paciente; o (ii) la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y administrar el anticuerpo o porción de unión a antígenos al paciente.

24. Un uso de un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, en la elaboración de un medicamento para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, en donde el método comprende (i) medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS y/o (ii) genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978.

25. Un uso de un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, en la elaboración de un medicamento para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del. cual se sabe que está en necesidad de ello, en donde se ha encontrado que el paciente (i) tiene niveles normales de IL-21 y/o (ii) no tiene uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 23, 24 o 25, en donde el método comprende identificar al paciente por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

27. El uso de conformidad con la reivindicación 23, 24, o 25, en donde el anticuerpo es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

28. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

29. Un método para reducir la ocurrencia o severidad de una enfermedad autoinmune secundaria en un paciente con esclerosis múltiple que ha sido o será tratado con una terapia de agotamiento de linfocitos, en donde la enfermedad autoinmune secundaria ocurre después del tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende la etapa de administrar un ' 5 antagonista de IL-21.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde la etapa de administrar tiene lugar antes, durante, o después del tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos.

31. Un antagonista de IL-21 para su uso en un método para reducir la ocurrencia o severidad de una enfermedad autoinmune secundaria en un paciente con esclerosis múltiple que 10 ha sido o será tratado con una terapia de agotamiento de linfocitos, en donde la enfermedad autoinmune secundaria ocurre después del tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos, el método comprende administrar el antagonista de IL-21 al paciente.

32. El antagonista de IL-21 de conformidad con la reivindicación 31 , en donde el antagonista de IL-21 es un anticuerpo o porción de unión a antígenos del mismo. 15

33. El uso de un antagonista de IL-21 en la elaboración de un medicamento para reducir la ocurrencia o severidad de una enfermedad autoinmune secundaria en un paciente con esclerosis múltiple que ha sido o será tratado con una terapia de agotamiento de linfocitos, en donde la enfermedad autoinmune secundaria ocurre después del tratamiento con la terapia de agotamiento de linfocitos, el método comprende administrar el antagonista de IL-21 al paciente. 20

34. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en donde el antagonista de IL-21 es un anticuerpo o porción de unión a antígenos del mismo.

35. Un régimen terapéutico para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, el régimen comprende: medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente y/o genotipificar al paciente para 25 detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978; y administrar un agente terapéutico para la esclerosis múltiple al paciente.

36. Un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, el método comprende: medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente y/o genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978; y administrar el anticuerpo o porción de unión a antígenos al paciente.

37. Un uso de un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, en la elaboración de un medicamento para su uso en un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente del cual se sabe que está en necesidad de ello, el método comprende: medir IL-21 en una muestra de sangre del paciente y/o genotipificar al paciente para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961, G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978; y administrar el anticuerpo o porción de unión a antígenos al paciente.

38. Un equipo de ensayo de inmunoabsorción asociada a enzimas (ELISA) para detectar el nivel de IL-21 sérica en un sujeto, que comprende un anticuerpo que se une a IL-21 , o una porción de unión a antígenos del anticuerpo, o un receptor de IL-21 soluble, y una instrucción que se dirige a un usuario para tomar una muestra de sangre del sujeto.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 11 , y 13, en donde la medición comprende determinar la cantidad o concentración de IL-21 o del ácido nucleico que codifica IL-21 en la muestra.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 11 , y 13, en donde la medición es de mRNA que codifica IL-21 en las células que producen IL-21 en la muestra.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, en donde las células que producen IL-21 son células Th17.

42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 11 , y 13, en donde la medición es de IL-21 intracelular.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde la medición comprende tinción de citocinas y citometría de flujo.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 11 , y 13, en donde la medición es de IL-21 sérica.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, donde la medición comprende el uso de un ensayo de inmunoabsorción asociada a enzimas (ELISA).

46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 11 , 12, y 29, en donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en: púrpura trombocitopénica inmune (ITP), enfermedad de Graves, enfermedad de Goodpasture, enfermedad autoinmune- de tiroides, anemia hemolltica autoinmune, neutropenia autoinmune y linfopenia autoinmune.

47. El método de conformidad con la reivindicación 3 o 4, en donde el agotamiento de linfocitos ocurre durante o posterior al tratamiento con una terapia de agotamiento de linfocitos.

48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 , 12, y 29, en donde la terapia de agotamiento de linfocitos se orienta a células que llevan CD52.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, en donde la terapia de agotamiento de linfocitos, que se orienta a células que llevan CD52, comprende administrar un anticuerpo que se une a CD52, o una porción de unión a antlgenos del anticuerpo.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

51. El método de conformidad con la reivindicación 49 o 50, en donde el anticuerpo compite con alemtuzumab por la unión a CD52.

52. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde el anticuerpo compite con alemtuzumab por la unión a CD52.

53. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde el anticuerpo es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 11 , 13, y 15, en donde la muestra de sangre se obtiene del paciente antes, durante, o después de la terapia para esclerosis múltiple.

55. El método de conformidad con la reivindicación 54, en donde la muestra de sangre se obtiene del paciente antes de una terapia de agotamiento de linfocitos.

56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, 29, y 30, en dónde la esclerosis múltiple es esclerosis múltiple recurrente-remitente.

57. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, 29, y 30, en donde la esclerosis múltiple es esclerosis múltiple progresiva primaria.

58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, 29, y 30, en donde la esclerosis múltiple es esclerosis múltiple progresiva secundaria.

59. Un método para valorar la capacidad de respuesta de las células T al tratamiento con una terapia de agotamiento de linfocitos en un paciente con esclerosis múltiple, que comprende: medir caspasa-3 en células T obtenidas del paciente después de la terapia, en donde un incremento en caspasa-3 en las células T, en comparación con las células T de un paciente con MS que no recibe la terapia, es indicativo de la capacidad de respuesta de las células T a la terapia.

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, en donde la terapia de agotamiento de linfocitos se orienta a CD52.

61. El método de conformidad con la reivindicación 60, en donde la terapia de agotamiento de linfocitos comprende el tratamiento con un anticuerpo anti-CD52 o una porción de unión a antigenos del mismo.

62. El método de conformidad con la reivindicación 61 , en donde el anticuerpo para CD52 es alemtuzumab o un agente biológicamente similar.

63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, en donde la medición comprende determinar la cantidad o concentración de caspasa-3 o del ácido nucleico que codifica caspasa-3.

64. Un método para identificar a un individuo que tiene probabilidad de tener interleucina- 21 (IL-21) elevada en comparación con un sujeto sin ningún padecimiento inflamatorio, que comprende la etapa de genotipificar al individuo para detectar la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o de más de los genotipos se asocia con IL-21 elevada.

65. Un método para informar a un paciente con MS sobre un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después de un agotamiento de linfocitos, que comprende las etapas de: obtener información sobre interleucina-21 (IL-21 ) en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde la IL-21 elevada, en comparación con la de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria en comparación con pacientes con MS sin IL-21 elevada; e informar al paciente sobre el riesgo incrementado o la ausencia del mismo.

66. Un método para informar a un paciente con MS sobre un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después de un agotamiento de linfocitos, que comprende las etapas de: obtener información sobre la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o más de los genotipos mencionados se asocia con un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin el genotipo o genotipos mencionados; e informar al paciente sobre el riesgo incrementado o la ausencia del mismo.

67. Un método para informar a un paciente con MS sobre una necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria después de una terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende las etapas de: obtener información sobre la IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS, en donde la IL-21 elevada en el paciente, en comparación con la de un sujeto sin una enfermedad autoinmune, indica que el paciente está en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin IL-21 elevada; e informar al paciente sobre dicha necesidad o la ausencia de la misma.

68. Un método para informar a un paciente con MS sobre una necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria después de una terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende las etapas de: obtener información sobre la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844, y C/C en el SNP rs6840978, en donde la presencia de uno o de más de los SNPs indica que el paciente está en necesidad de un monitoreo intensificado para el desarrollo de una enfermedad autoinmune secundaria, en comparación con pacientes con MS sin el genotipo o genotipos mencionados; e informar al paciente sobre dicha necesidad o la ausencia de la misma.

69. Un método para informar un régimen para monitorear a un paciente con MS después de una terapia de agotamiento de linfocitos, que comprende las etapas de: obtener información sobre (i) IL-21 en una muestra de sangre del paciente; o (¡i) la presencia o ausencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y seleccionar un régimen de monitoreo apropiado para el paciente con base en la información.

70. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65-69, en donde la etapa de obtención tiene lugar antes del agotamiento de linfocitos.

71. El método de conformidad con la reivindicación 69, en donde el régimen de monitoreo comprende medir auto-anticuerpos en el paciente.

72. Un método para distribuir un fármaco de agotamiento de linfocitos a un paciente para tratar la esclerosis múltiple, que comprende las etapas de: asesorar al paciente sobre el riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del tratamiento con el fármaco, en donde el riesgo incrementado se asocia con (i) IL-21 elevada; o (ii) la presencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961, G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978; y proporcionar el fármaco al paciente después del asesoramiento.

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, que además comprende obtener el consentimiento informado del paciente, antes la etapa de provisión.

74. El método de conformidad con la reivindicación 73, en donde el fármaco es un anticuerpo anti-CD52.

75. El método de conformidad con la reivindicación 74, en donde el fármaco es alemtuzumab.

76. Un equipo para tratar la esclerosis múltiple, que comprende: un agente terapéutico de agotamiento de linfocitos; y una instrucción escrita para informar a un proveedor de asistencia médica o a un paciente sobre el potencial de un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del tratamiento con el agente, en donde el riesgo incrementado se asocia con (i) IL-21 elevada; o (ii) la presencia de uno o más genotipos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: A/A en el SNP rs13151961 , G/G en el SNP rs6822844 G/G, y C/C en el SNP rs6840978.

77. El equipo de conformidad con la reivindicación 76, en donde el agente es un anticuerpo anti-CD52.

78. El equipo de conformidad con la reivindicación 77, en donde el agente es alemtuzumab.

79. Un equipo para identificar a un paciente con esclerosis múltiple (MS) que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende: un anticuerpo anti-interleucina-21 (IL-21) y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo a IL-21 en una muestra de sangre del paciente con MS.

80. Un equipo para identificar a un paciente con esclerosis múltiple que está en riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad autoinmune secundaria después del agotamiento de linfocitos, que comprende: uno o más reactivos adecuados para identificar el genotipo de uno o más polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) seleccionados del grupo que consiste en: SNP rs13151961 , SNP rs6822844, y SNP rs6840978, en una muestra obtenida de un individuo.