MX2011000314A - Verificacion de tratamiento. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para verificar la efectividad de un tratamiento, en donde dicho tratamiento comprende un inhibidor diseñado para tratar una enfermedad que comprende actividad normal de la trayectoria de Ras/RafIMEK/ERK.

Description

VERIFICACION DE TRATAMIENTO CAMPO TECNICO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la formación de imágenes in vivo, y en particular a la aplicación de formación de imágenes in vivo para el tratamiento de verificación. Específicamente, la. presente invención es adecuada para el tratamiento de verificación de melanoma con agentes que actúan en la trayectoria de Ras/Ra f/ EK/ERK.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Se conoce que un número de agentes de formación de imágenes in vivo basados en péptidos RGD son adecuados para la detección de expresión de integrina, y se describen por ejemplo en WO 2002/26776, WO 2003/006491, WO 2005/012335 y WO 2006/54904. Estos agentes de formación de imágenes tienen por objeto integrinas de superficie de célula y se piensan que son útiles en el diagnóstico de una variedad de estados de enfermedad relacionados con angiogénesis. Esta referencia de la técnica previa también enseña la utilidad de los agentes de formación de imágenes basados en péptido RGD en el tratamiento de verificación de estados de enfermedad relacionados con angiogénesis.

Fisiológicamente, la trayectoria de señalización Ras/Raf/MEK/ERK (MEK: cinasa de proteína activada por mitógeno/cinasa relacionada con señal extracelular; ERK: cinasa relacionada con señal extracelular) juega un papel central en la regulación de una variedad de funciones celulares, incluyendo proliferación celular, diferenciación, sobrevivencia, inmortalización y angiogénesis (revisado -en Peyssonnaux y Eychene Biology of the Cell 2001; 93: 3-62). La trayectoria es altamente conservada entre todos los eucariotes, y juega un papel integral en la transducción de varias señales extracelulares en los núcleos. Se cree que la acción conjunta de los factores de crecimiento y las integrinas activa la trayectoria de señalización Ras/Raf/MEK/ERK para dar como resultado en angiogénesis (Hood y otros J. Cell Biol. 2003;· 162(5) : 933- 43). Esto se soporta por el hecho de que la inhibición de la expresión de integrina a?ß3 suprime la señalización ERK que lleva a apoptosis endotelial y a la inhibición de angiogénesis (Eliceiri y otros J Cell Biol. 1998; 140: 1255-1263). Además de esta señalización "exterior-interior", se mostró un mecanismo de señalización "interior-exterior" paralelo. Woods y otros (Mol. Cell Biol. 2001; 21 (9): 3192-205) demostraron que la inhibición farmacológica de MEK1 en líneas celulares de melanoma humano llevó a una expresión reducida de las integrinas a6 y ß3 de la superficie celular.

La función aberrante o inapropiada de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK se identificó en un rango de enfermedades, en particular la activación consecutiva de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK en el comportamiento oncogénico de cánceres.

Las mutaciones de activación de Ras se encontró en alrededor de 30% de todos los cánceres (Bos Cáncer Research 1989; 49(17): 4682-9), incluyendo en 9-15% de melanomas. Las mutaciones sin sentido somático B-raf que confieren la activación consecutiva son más frecuentes en melanoma y se encontraron en 60-66% de melanomas cutáneos malignos (Davis y otros, Nature 2002; 417: 949 954). La mutación más frecuente en B-raf (80%) es un ácido glutámico para la sustitución de valina en la posición 599 (V599E). Estas mutaciones B-raf aumentan la actividad de cinasa basal de B-raf y se pensó que desacoplan la señalización de Ras/Raf/MEK/ERK de los estímulos de proliferación ascendente incluyendo Rías y la activación de receptor de factor de crecimiento, dando como resultado la activación constitutiva de ERK. Se demostró que las proteínas B-Raf mutadas son esenciales para la viabilidad celular de melanoma y la transformación (Hingorani y otros, Cáncer Res. 2003; 63: 5198-5202).

En los últimos años, se publicó un número de resúmenes y papeles científicos que se relacionan con la evaluación para el tratamiento de cáncer de compuestos que inhiben B-Raf (Eisen y otros Br. J. Cáncer 2006; 95P: 581-6; Gatzemeier y otros Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2006; 24: resumen 7002: Wu y otros simpósium de cáncer de próstata. San Francisco, CA, E.U.A. feb 24-26, 2006: resumen 259; y, Flaherty y otros Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2003; 22: 410). Además, existieron varias publicaciones que se relacionan con la evaluación para el tratamiento de cáncer de compuestos que inhiben MEK (Sebolt-Leopold y otros Nat. Med. 1999; 5: 810-6; Sebolt-Leopold y otros Nat. Rev. Cáncer 2004; 4: 937-47; Alessi y otros J. Biol Chem. 1995; 270(46): 27489-94; Haas y otros Melanoma Res. 2006; 16: S92- S93, Adjei y otros J. Clin. Oncol. 2008; 26(13): 2139-46; y, Mackin y otros J. Surgical Res. 2006; 130(2): 262).

Se pudiera esperar que la inhibición de B-Raf o MEK trate efectivamente melanomas que tienen mutaciones de activación de Ras o B-Raf. Sin embargo, una proporción de melanomas podría no responder a tal tratamiento. Con el fin de seleccionar el mejor régimen de tratamiento, sería valioso ser capaz de distinguir entre melanomas que son (i) sensibles o (ii) no sensibles a inhibidores de B-Raf o MEK.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método que supera los problemas antes descritos de la técnica previa. El método de la inversión utiliza la formación de imágenes ¡n vivo para verificar la efectividad de tratamientos de melanoma, y como tal es mínimamente invasor. El método de la invención puede utilizarse al observar la respuesta previa a un tratamiento, y puede ayudar a decidir si un tratamiento particular es adecuado, o debe continuarse. Así como es útil al verificar la efectividad de tratamientos aprobados para uso clínico, el método de la invención encuentra aplicación en el desarrollo de nuevos tratamientos, por ejemplo en la determinación de dosis y regímenes óptimos, y para identificar a sujetos que muy probablemente respondan al tratamiento.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención proporciona un método para verificar la efectividad de un inhibidor, en donde dicho inhibidor' es un inhibidor de B-raf, MEK1/2 (MEK: cinasa de proteína activada por m itogen/ci nasa relacionada con señal extracelular), o ERK 1/2 (ERK: Cinasa relacionada con señal extracelular), dicho inhibidor se utiliza para tratar a un sujeto que sufre de melanoma, dicho método comprende: (a) en un primer punto en el tiempo, llevar a cabo un procedimiento de formación de imágenes in vivo en dicho sujeto para generar una primera imagen in vivo de una región de interés, en donde dicha región de interés comprende dicho melanoma, y en donde dicho procedimiento de formación de imágenes in vivo comprende: (i) la administración a dicho sujeto de un agente de formación de imágenes in vivo que comprende un vector etiquetado con una porción de formación de imágenes in vivo, en donde dicho agente de formación de imágenes in vivo se une a una integrina a?ß3 con un Ki de <10 nM en un ensayo de unión competitivo para integrina a?ß3 en donde el valor Ki se determina por la competencia con equistatina; (¡i) permitir al agente de formación de imágenes in vivo administrado del paso (i) unirse a la integrina a?ß3 expresada por dicho melanoma; (iii) detectar señales emitidas por la porción de formación de imágenes in vivo del agente de formación de imágenes in vivo unido del paso (ii); y (iv) convertir las señales detectadas en el paso (iii) a una primera imagen in vivo representativa de la expresión de integrina a?ß3 en la superficie de dichas células de melanoma en dicha región de interés; (b) tratar a dicho sujeto con dicho inhibidor; (c) en un segundo punto en el tiempo, repetir el procedimiento de formación de imágenes in vivo como se define en el paso (a) para generar una segunda imagen in vivo de dicha región de interés; y, (d) comparar dicha primera imagen in vivo con dicha segunda imagen in vivo, con lo cual una disminución en dichas señales detectadas en dicho segundo punto en el tiempo indica la efectividad de dicho inhibidor al tratar dicho melanoma.

El "sujeto" de la invención puede ser cualquier sujeto ser humano o animal. Preferiblemente el sujeto de la invención es un mamífero. Muy preferiblemente, dicho sujeto es un cuerpo de mamífero intacto in vivo. En una modalidad especialmente preferida, el sujeto de la invención e's un ser humano.

En el contexto de la presente invención, el término "trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK" toma el significado conocido en la técnica, es decir, una trayectoria de transducción de señal que comprende una cadena de cinasa de proteína que finalmente actúa para regular la actividad de factores de transcripción. En respuesta a una variedad de señales que incluyen factores de crecimiento, citosinas, radiación UV, y agentes que inducen tensión, los miembros de familia Raf se reclutan a la membrana de plasma después de la unión de Ras cargado con trifosfato de guanosina (GTP), que resulta en la fosforilación y la activación de proteínas Raf. Las proteínas Raf activadas entonces fosforilan y activan la cinasa MAPK/ERK112 (MEK1/2) que a su vez fosforila y activa la cinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2). Con la activación, los ERK se trastocan desde el citoplasma hacia los núcleos lo que resulta en la fosforilación y la regulación de la actividad de factores de transcripción tales como Elk-I y Myc. La actividad aberrante de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK está asociada con la metástasis de tumor.

Un "inhibidor de B-raf, cinasa MAPK/ERK 112 (MEK1/2). o cinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2)" es un compuesto que apunta a la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK a través de la inhibición de B-raf, MEK1/2 o ERK1/2, respectivamente. MEK1/2 y ERK1/2 son cinasas de proteína descendentes de B-Raf en la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK. El paso de "tratar" a dicho sujeto con dicho inhibidor se lleva a cabo mediante la administración de dicho inhibidor a dicho sujeto en una composición farmacéutica adecuada.

Hablando ampliamente, una "composición farmacéutica" comprende un agente activo junto con un portador biocompatible, en una forma adecuada para administración a mamífero. Cuando dicho agente activo es un inhibidor de B-raf, EK1/2 o ERK1/2, el "portador biocompatible" es un vehículo farmacéuticamente aceptable en donde se incorpora el agente activo,' para que la composición sea fisiológicamente tolerable, es decir, pueda administrarse al cuerpo de mamífero sin toxicidad o incomodidad indebida. La elección del portador biocompatible depende de la ruta de administración. Los inhibidores del método de la presente invención pueden administrarse oralmente, tal como en la forma de tabletas, cápsulas, gránulos o polvos; sublingual; bucal; parenteralmente, tal como mediante técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, o intraesternal (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acusas inyectables estériles); nasalmente, tal como mediante aerosol de inhalación; tópicamente, tal como en la forma de una crema o ungüento; rectalmente tal como en la forma de supositorios; en formulaciones de unidad de dosis que contienen vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos.

La cantidad de inhibidor que puede combinarse con los materiales de portador para producir una composición farmacéutica en una forma de dosis individual variará dependiendo del huésped tratado, y el modo particular de administración. Preferiblemente, las composiciones de inhibidor deben formularse para que una dosis de entre 0.01-100 mg/peso corporal/día del inhibidor pueda administrarse a un sujeto. También se debe entender que una dosis específica y un régimen de tratamiento para cualquier sujeto dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del inhibidor específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, sexo, dieta, tiempo de aplicación, índice de expresión, combinación de fármaco, y el juicio del médico tratante y la severidad de la enfermedad particular que se trata. La cantidad de un inhibidor de la composición también dependerá del inhibidor particular.

Se selecciona un inhibidor preferido a partir de agentes que inhiben (i) B-Raf, tal como BAY 43-9006, PLX 4032 y CHIR-265; y (ii) MEK, tal como PD184352, PD098059, PD0325901, AZD6244, y U0126. Cada uno de estos ahora se describe en detalle adicional.

BAY 43-9006 (sorafenib/Nexavar®, Bayer Pharmaceuticals) es un inhibidor de multicinasa con un amplio espectro de actividad antitumoral en la proliferación de angiogénesis de célula de cáncer (Wilhelm y otros Cáncer Res. 2004; 64: 7099-7109). Uno de sus objetivos es B-Raf. La eficacia de BAY 43-9006 en cáncer pulmonar de célula no pequeña, cáncer de próstata, y melanoma se ha sometido a la valoración en una prueba fase II asignada aleatoriamente (Eisen y otros Br. J. Cáncer 2006; 95P: 581-6) y en estudios clínicos fase II de brazo individual (Gatzemeier y otros Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2006; 24: resumen 7002; y Wu Simpósium de Cáncer de Próstata. San Francisco, CA, E.U.A. 1 o Febrero 24-26, 2006: resumen 259). Se desarrollaron otros medicamentos que pueden tener afinidad y especificación superior para inhibición B-Raf comparado con BAY 43-9006 son PLX 4032 y CHIR-265, ambos de los cuales han sido, o se están evaluando en pruebas Fase I (Flaherty y otros Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2003; 22: 410; y www.plexxicon.com).

PD184352 (CI-1040, Pfizer) es un inhibidor de molécula pequeña selectivo, oral de MEK 1/2. PD184352 fue el primer inhibidor MEK reportado para inhibir crecimiento tumoral in vivo (Sebolt-Leopold y otros Nat. Med. 1999; 5: 810-6; y Se.bolt-Leopold y otros Nat. Rev. Cáncer 2004; 4: 937-47). PD0325901 (Pfizer), un inhibidor MEK de segunda generación ingresó al desarrollo clínico y pareció tener buenas propiedades farmacológicas, cuyos investigadores esperan traducir en mejor eficacia anticáncer. En estudios fase II el tejido tumoral al que se le realizó una biopsia demostró supresión ERK fosforilada en todos los niveles de dosis y en todos los tipos de tumor, incluyendo melanoma, mama, colon, y pulmón.

PD098059 bloquea la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK al inhibir la activación de MEK 1/2 por Raf y no inhibe la fosforilación de otros sustratos de cinasa Raf o MEK, que indican que ejerce su efecto al unirse a la forma inactiva de MEK1/2. PD098059 también actúa como un inhibidor específico de la activación de MEK en células Swiss 3T3, suprimiendo por 80-90% su activación por una variedad de agonistas (Alessi y otros J. Biol Chem. 1995; 270(46): 27489-94).

AZD6244 (Astra Zeneca) es un inhibidor MEK que se mostró que bloquea el crecimiento de melanoma que lleva B-Raf V600E in vitro e in vivo (Haas y otros Melanoma Res. 2006; 16: S92-S93). La prueba fase I en un grupo de 57 pacientes con cáncer se documentó al reportar que AZD6244 es bien tolerada con inhibición demostrable de fosforilación de ERK en la dosis fase II recomendada (Adjei y otros J. Clin. Oncol. 2008; 26(13): 2139-46). Recientemente, Astra Zeneca y Merck anunció una colaboración para investigar un tratamiento que comprende AZD6244 y MK-2206 (www.astrazeneca.com). MK-2206 interactúa con la trayectoria de cinasa fosfatidilinositol-3.

U0126 bloquea la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK por inhibición de MEK. Las líneas de célula de cáncer HepG2 (hepatoma), Ht-29 (colon), MiaPaca (páncreas) y Panc-1 (páncreas) se trataron con U0126 durante 45 minutos a concentraciones que varían desde 20-50 uM, y se mostró que ' tienen actividad considerable en líneas celulares probadas (Mackin y otros J. Surgical Res. 2006; 130(2): 262).

"Verificación de la efectividad" de cualquiera de tales inhibidores comprende la selección de una característica medible del tejido enfermo que el inhibidor busca tratar. En el caso de la presente invención, la característica medible es la actividad de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK, que se infiere de nivel de expresión de integrina a?ß3.

Con el fin de verificar que es valioso, los puntos de tiempo particulares se seleccionan en donde, si el inhibidor es efectivo al tratar el tejido enfermo, una reducción en la actividad de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK en las células del tejido enfermo se anticipará. Por ejemplo, el "primer punto en el tiempo" puede seguir útilmente el diagnóstico de que el sujeto sufre de melanoma, y antes de que se aplique el inhibidor al sujeto. Un "segundo punto en el tiempo" se selecciona después de que ha comenzado el tratamiento con el inhibidor. Cuando el tiempo necesario para que el inhibidor tome efecto se conoce, este punto en el tiempo puede elegirse para estar cerca de este tiempo. En otros casos, especialmente en donde se evalúa un nuevo candidato de fármaco, este tiempo puede no conocerse así que un segundo punto en el tiempo necesita determinarse empíricamente. Cuando la actividad de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK disminuye con el tiempo, esto es una indicación de que el inhibidor ha sido efectivo. En una modalidad preferida del método de la invención, pueden seleccionarse puntos en el tiempo adicionales para verificar el progreso de tratamiento con el inhibidor a través del período de tratamiento completo, hasta un punto final definido tal como remisión de la enfermedad.

Se anticiparán que melanomas que comprenden una mutación en el gen B-Raf responden bien a inhibidores de B-Raf, MEK1/2 o ERK1/2. Por lo tanto, un melanoma preferido en el método de la invención es melanoma que comprende una mutación en el gen B-raf, en particular la mutación que resulta de la substitución de V599E.

El término "formación de imágenes in vivo" como se utiliza aquí se refiere a aquellas técnicas que producen imágenes de forma no invasiva de todo o parte del aspecto interno del sujeto de la invención. Los métodos de formación de imágenes in vivo preferidos para uso en la presente invención son la tomografía calculada de emisión de fotón individual (SPECT), tomografía de emisión de positrón (PET), y formación de imágenes de resonancia magnética (MRI). Los métodos de formación de imágenes in vivo muy preferidos son SPECT o PET, PET siendo especialmente preferido. La preferencia para PET en el método de la invención es debido a su excelente sensibilidad y resolución, para que puedan observarse incluso cambios relativamente pequeños en una lesión con el tiempo. Los escáneres PET miden por rutina concentraciones de radiactividad en el rango picomolar. Los escáneres micro-PET ahora se acercan a una resolución espacial de aproximadamente 1 mm, y los escáneres clínicos aproximadamente 4-5 mm.

El método de formación de imágenes in vivo de la presente invención comienza con la "administración" a dicho sujeto en un agente de formación de imágenes in-vivo, en donde dicho agente de formación de imágenes in vivo comprende un lector etiquetado con una porción de formación de imágenes in vivo. La administración parenteral se prefiere para la administración de un agente de formación de imágenes in vivo, muy preferiblemente la administración intravascular. Siguiendo la administración, el agente de formación de imágenes in vivo se deja unirse a una integrina a?ß3 expresada por el dicho melanoma. El agente de formación de imágenes in vivo se selecciona para que se una a integrina a?ß3 con un Ki de <10 nM, preferiblemente <5 nM. Para determinar Ki, puede utilizarse un ensaya de unión competitivo conocido para integrina a?ß3 en donde el valor Ki se determina por la competencia con equistatina (Kumar y otros J Pharmacol Exp Ther. 1997; 283: 843-853).

El término "etiquetado con una porción de formación de imágenes in vivo" significa que la porción de formación de imágenes in vivo es una parte constitutiva del vector, por ejemplo un átomo 1C, 18F. Alternativamente, la porción de formación de imágenes in vivo forma parte de un grupo químico que se conjuga al vector, y una porción enlanzadora opcional une el vector y la porción de formación de imágenes in vivo juntas. La "porción de formación de imágenes in vivo" comprende un átomo que emite señales que pueden detectarse externamente a dicho sujeto que sigue la administración. Las porciones de formación de imágenes in vivo de la invención se describen a continuación.

El "vector" es un compuesto químico que une la integrina a?ß3. Como se discutió en la sección de la técnica previa, tales compuestos incluyen péptidos que contienen RGD y péptidomimetico correspondientes, así como anticuerpos monoclonales. Por definición, la equistatina y derivados de la misma que se unen a integrina a?ß3 también son vectores adecuados. Un "péptidomimetico" es un compuesto que contiene elementos estructurales no típicos que es capaz de imitar o antagonizar las acciones biológicas de un péptido padre natural. Los métodos para obtener agentes de formación de imágenes in vivo que comprenden tales vectores se describen en la técnica (ver, por ejemplo: Hau y otros Circulation 2005; 111: 3255-3260; Bach-Gansmo y otros J Nucí Med 2006; 47 :1434-1439; Sipkins y otros Nature Medicine 1998; 4(5): 623-6; Ellegala y otros (Circulation 2003; 108: 336-41; Winter y otros, Circulation 2003; 108: 2270-4). Adecuadamente, cuando el vector es un péptido que contiene RGD, está entre 5 y 20 aminoácidos de largo, preferiblemente entre 6 y 12, muy preferiblemente entre 8 y 10. Algunos péptidos RGD preferidos se describen en más detalle a continuación.

Una "porción enlazante" de la presente invención es un radical bivalente de la fórmula -(L)n- en donde: cada L es independientemente -C( = 0)-, -CR'2-, -CR' = CR'-, -C=C-, -CR'2C02-, -C02CR'2! -NR'-, -NR'CO-, -CONR'-, -NR'(C = 0)NR'-, -NR,(C = S)NR'-, -S02NR'-, -NR'S02-: -CR'2OCR'2-, -CR2SCR2-, -CR'2NR'CR'2-, un grupo cicloheteroalquileno de C4.8, un grupo cicloalquileno de C4-8, un grupo arileno de C5.12, un grupo heteroarileno de C3-12. un aminoácido, un poliaquilen glicol, ácido poliláctico o una porción de ácido pollglicolico; n es un entero del valor 1 a 15; cada grupo R' es independientemente H o alquilo de Ci. 0, alquiladlo de C3.10, alcoxialquilo de C2.io. hidroxialquilo de C10, fluoroalquilo de Ci.i0, ó 2 ó más grupos R', junto con los átomos a los cuales se unen forman un anillo carboxílico, heterocíclico, saturado o no saturado.

Preferiblemente, la porción enlazante es una cadena de entre 10 y 100 átomos, muy preferiblemente entre 10 y 50 átomos. Los grupos L preferidos son -C( = 0)-, -CH2-, - NH-, -NHC( = 0)-, -C( = 0)NH-, -CH2-0-CH2-, y aminoácidos. Específicamente excluidas están las porciones enlazantes en donde 2 ó más grupos carbonilos se enlazan, o en donde 2 ó más átomos heterogéneos se enlazan. El experto en la técnica entenderá que éstos no son químicamente factibles, o son demasiado reactivos o inestables para ser adecuados para uso en la presente invención.

Se selecciona una porción de formación de imágenes in vivo preferida de: (a) un ion metálico radioactivo; (b) un halógeno radioactivo emisor que emite gamma; (c) un no metal radioactivo que emite positrón; (d) un ion metálico paramagnético.

Las porciones de formación de imágenes in vivo (a)-(c) se prefieren, (c) siendo muy preferida.

El paso de "detectar" del método de la invención involucra la de las señales emitidas por la porción de formación de imágenes in vivo del agente de formación de imágenes in vivo por medio de un detector sensible a dichas señales. Ejemplos de señales emitidas por la porción de formación de imágenes en vivo que son adecuadas para usarse en la presente invención son aquellas que pueden detectarse externamente a dicho sujeto que sigue la administración.

El paso de "convertir'' del método de la invención se lleva a cabo por una computadora que aplica un algoritmo de reconstrucción a las señales detectadas para generar un grupo de datos. Este grupo de datos típicamente se manipula para generar dichas primeras y segundas imágenes in vivo, que ilustran áreas dentro del sujeto representativas de la expresión de integrina a p3 en la superficie de las células. El grupo de datos también puede evaluarse antes/sin la generación de cualquier imagen de in vivo para observar cambios en el tiempo en la cantidad y la intensidad de las señales detectadas. Sin embargo, la producción de imágenes in vivo se prefiere ya que puede obtenerse más información, por ejemplo, la ubicación y el tamaño del tejido enfermo.

Debido a la asociación conocida entre la activación de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK y la expresión de integrina a?ß3 (Woods y otros Molecular and Cellular Biology 2001; 21 (9): 3192-3205), los presentes inventores proponen que la expresión de integrina a„ß3 puede utilizarse como un marcador sustituto de la actividad de la trayectoria Ras/Raf/MEK/ERK.

En una modalidad preferida, el vector del agente de formación de imágenes in vivo es un péptido RGD. Un número de tales agentes de formación de imágenes in vivo se conoce en la técnica, y se enseña para ser útil en la formación de imágenes in vivo de expresión de integrina a?ß3 (ver, por ejemplo Zhang y otros Cáncer Res. 2007; 67(4): 1555-62, Beer y otros Clin. Cáncer Res. 2006; 12(13): 3942-9, WO 02/26776, WO 2003/006491, WO 2005/12335 y ).

Un agente de formación de imágenes in vivo basado en péptido RGD preferido para usarse en el método de la invención es de la Fórmula I: en donde: W, y W2 son independientemente una porci'ón enlazante opcional, en donde dicha porción enlazante es como se definió anteriormente; y, Z1 y Z2 son independientemente (i) un grupo que comprende una porción de formación de imágenes in vivo, (ii) una porción de azúcar, o (¡ii) hidrógeno, siempre que al menos uno de Z, y Z2 sea una porción de formación de imágenes in vivo.

La parte de péptido del agente de formación de imágenes in vivo de la Fórmula I puede sintetizarse al utilizar métodos conocidos de síntesis química pero particularmente útil es la metodología de fase sólida de errif íeld que emplea un sintetizador de péptido automatizado (J. Am. Chem. Soc. 1964; 85: 2149). Los procedimientos estándares para la estrategia de síntesis se describen en E. Atherton & R.C. Sheppard "síntesis de péptido de fase sólida: un acercamiento práctico, 1989, IRL Press, Oxford.

Se utiliza una resina de síntesis con un grupo enlazante lábil de ácido, al cual el residuo de aminoácido de C-terminal protegido deseado se une mediante la formación de unión de amida. Por ejemplo, la denominada resina AM de amida Rink con un enlace derivado de (dimetoxifenil-aminometil)-fenoxi puede aplicarse (Rink, Tetrahedron Lett. 1987; 30: 3787). La separación acidolítica del péptido de esta resina generará una amida de péptido. Alternativamente, una resina O-Bis-(aminoetil) etilen glicol tritilo (Barios y otros Liebigs Ann. Chem. 1988; 1079) puede utilizarse que, con la separación acidolítica genera un péptido con un control de amino primario.

El etiquetar el vector con una porción de formación de imágenes in vivo para obtener el agente de formación de imágenes in vivo puede llevarse a cabo convenientemente por medio de un "compuesto precursor", que es un derivado del vector que se dirige a la expresión a?ß3, diseñado para que la reacción química con una forma química conveniente de la porción/porciones de formación de imágenes in vivo deseada ocurra específicamente en el sitio, puede conducirse en un número mínimo de pasos (idealmente en un paso individual); y sin la necesidad de purificación significativa (idealmente en ninguna purificación adicional), para dar el agente de formación de imágenes in vivo deseado. Tales compuestos precursores son sintéticos y pueden obtenerse convenientemente en una buena pureza química.

El compuesto precursor puede proporcionarse como parte de un equipo, que es particularmente conveniente para la preparación de agentes de formación de imágenes in vivo radioetiquetados en radiofarmacias. Tal equipo puede contener un cartucho que puede conectarse a un sintetizador automatizado adecuadamente adaptado. El cartucho puede contener, además del compuesto precursor, una columna para remover cualquier ion radioactivo no deseado, y un contenedor apropiado conectado para permitir que se evapore la mezcla de reacción y permitir que el producto se formule como se requiera. Los reactivos y los solventes y otros consumibles requeridos para la síntesis también pueden incluirse junto con un disco compacto que transporta el software que permite al sintetizador operarse en una forma para satisfacer los requerimientos de los clientes para concentración radiactiva, volúmenes, tiempo de entrega, etc. Convenientemente, todos los componentes del equipo son desechables para minimizar la posibilidad de contaminación entre corridas, y también puede ser estéril y con calidad asegurada.

El compuesto precursor opcionalmente puede comprender uno o más grupos protectores para ciertos grupos funcionales del vector. El término "grupo protector" significa un grupo que inhibe o suprime reacciones químicas indeseables, pero que está diseñado para ser suficientemente reactivo y que puede separarse del grupo funcional en cuestión bajo condiciones suficientemente medias que no modifiquen el resto de la molécula. Después de la desprotección se obtiene el producto deseado. Los grupos protectores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se eligen adecuadamente de, por ejemplo para grupos amina: Boc (en donde Boc es ter-butiloxicarbonilo), Fmoc (en donde Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo), trifluoroacetilo, aliloxicarbonilo, Dde [es decir 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)etilo] o Npys (es decir 3-nitro-2-piridin sulfenilo); y para grupos carboxilo: metil éster, ter-butil éster, o bencil éster. Para grupos de h i d r o x i I o ., los grupos protectores adecuados son: metilo, metilo, etilo o ter-butilo; alcoximetilo o alcoxietilo; bencilo; acetilo; benzoilo; tritilo (Trt) o trialquilsililo tal como tetrabutildimetilsililo. Para grupos tiol, los grupos protectores adecuados son: tritilo y 4-metoxibencilo. El uso de grupos protectores adicionales se describe en 'Grupos Protectores en Síntesis- Orgánica", Theorodora W. Greene y Peter G.M. Wuts, (3era edición, John Wíley & Sons, 1999).

Preferiblemente, cuando está presente, la porción enlanzadora actúa como una porción biomodificadora. Una "porción biomodificadora" tiene la función de modificar la farmacocinética y los índices de limpieza de sangre del agente de formación de imágenes in vivo. Un ejemplo de una porción biomodificadora adecuada es una basada en un bloque de construcción PEG monodisperso que comprende 1 a 10 unidades de dicho bloque constructor. Adicionalmente, dicha porción biomodificadora también puede representar 1 a 10 residuos de aminoácido. Los residuos de aminoácido preferidos para dicha porción biomodificadora son aminoácidos cargados tales como Usina y ácido glutámico, o aminoácidos no naturales cargados tales como ácido cistéico y fosfonoalanina. Además, pueden incluirse los aminoácidos glicina, el ácido aspártico y serina. En una modalidad preferida, la porción biomodificadora comprende una estructura similar a PEG monodispersa , el ácido 17-amino-5-oxo-6-asa-3,9, 12, 15-tetraoxaheptadecanoico de la Fórmula II: en donde m es igual a un entero de 1 a 10 y en donde la unidad de C-terminal es una porción amida. La porción biomodificadora actúa para modificar la farmacocinética y los índices de eliminación en sangre de los agentes de formación de imágenes in vivo. La función de la porción biomodificadora de la presente invención es para disminuir la absorción en los tejidos y aumentar la excreción a través de los ríñones, con lo cual resulta en menos interferencia de fondo y proporciona una mejor imagen in vivo. La porción biomodificadora además puede representar una porción preferencialmente derivada de ácido glutárico y/o succínico y/o una unidad basada en polietilen glicol y/o una unidad de la Formula II como se ilustró anteriormente. Para los propósitos de la presente invención, uno de los propósitos primarios de la porción biomodif icadora es reducir la aplicación de tejido de fondo del agente de formación de imágenes in vivo. Esto asegura la detección óptima de la señal emitida del agente de formación de imágenes in vivo específicamente unido relativo a la señal de fondo. La naturaleza de la porción enlazadora no debe interferir con la afinidad del agente de formación de imágenes in vivo para sus receptores objetivo. Además, la porción enlazadora no debe actuar para aumentar la aplicación de hígado de fondo del agente de formación de imágenes in vivo, como puede ocurrir sí, por ejemplo, se fuera a utilizar una unidad basada en polietilenglicol demasiado grande.

Cuando o Z2 sea una porción de azúcar es muy probable que actúe como una porción biomodificadora como se definió anteriormente. Una "porción de azúcar" es un grupo de carbohidrato que usualmente es un aldehido o un derivado de cetona de un alcohol polihídrico. Puede ser un monómero (monosacárido) , tai como fructosa o glucosa, o dos azúcares unidas para formar un "disacárido. Los disacáridos incluyen azúcares tales como sacarosa, la cual se hace de glucosa y fructosa. El término azúcar incluye tanto azúcares sustituidas como no sustituidas, y derivados de azúcares. Preferiblemente, el azúcar se selecciona de glucosa, glucosamina, galactosa, galactosamina, mañosa, lactosa, fucosa y derivados de las mismas, así como ácido siálico, un derivado de glucosamina. El azúcar preferiblemente es a o ß. El azúcar especialmente puede ser una mano- o galactosa piranosida. Los grupos hidroxilo en el azúcar pueden protegerse, por ejemplo, con uno o más grupos de acetilo. La porción de azúcar es preferiblemente N-acetilada. Ejemplos preferidos de tales azúcares incluyen N-acetil galactosamina, ácido siálico, ácido neuramínico, N-acetil galactosa, y N-acetil glucosamina.

Recientemente se mostró que la conjugación, de azúcar puede alterar favorablemente la farmacocinética de agentes de formación imágenes in vivo. La carbohidratación lleva a lipofilicidad reducida de pequeños péptidos radioetiquetados y, de esa forma, a una reducción dramática de epatobiliar a favor de la excreción renal (Haubner y otros J. Nuc. Med. 2001; 42: 326-36).

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo comprende un ion metálico radioactivo, es decir, un radiometal, los radiometales adecuados pueden ser emisores de positrón tales como 64Cu, 8V, 52Fe, 55Co, 94mTc o 68Ga; o emisores ? tales como 9SmTc, 111ln, 113mln, o 67Ga.

La radiometales preferidos son 99mTc, 64Cu, 68Ga y 111ln. Los radiometales muy preferidos son emisores ?, especialmente s9mTc.

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo comprende un ion de metal paramagnético, tales iones metálicos adecuados incluyen Gd(lll), Mn(ll), Cu(ll), Cr(lll), Fe(lll), Co(ll), Er(ll), Ni(ll), Eu(lll) o Dy(lll). Los iones metálicos paramagnéticos preferidos son Gd(lll), Mn(ll) y Fe(lll), Gd(lll) siendo especialmente preferido.

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo comprende un ion metálico, preferiblemente está presente como un complejo metálico de ion metálico con un ligando sintético. Por el término "complejo metálico" se quiere dar a entender un complejo de coordinación de ion metálico con uno o más ligandos. Se prefiere fuertemente que el complejo metálico sea "resistente a transquelación ", es decir, que no se somete fácilmente a intercambio de ligando con otros ligandos potencialmente competentes para los sitios de coordinación de metal. Los ligandos potencialmente competentes incluyen otros excipientes de la preparación in vivo (por ejemplo, radioprotectores o conservadores antimicrobianos utilizados en la preparación), o compuestos endógenos in vivo (por ejemplo, glutationa, transferina o proteínas de plasma). El término "sintético" tiene su significado convencional, es decir, hecho por el hombre como opuesto ha aislado de fuentes naturales, por ejemplo, del cuerpo de mamífero. Tales compuestos tienen la ventaja de que puede controlarse completamente su fabricación y su perfil de impureza.

Los ligandos adecuados para usarse en la presente invención que forman complejos metálicos resistentes a trasquelación incluyen: agentes quelatadores, en donde 2-6, preferiblemente 2-4, átomos de donador de metal se disponen para que los anillos de quelato con 5 ó 6 miembros resulten (al tener una estructura de cadena sin coordinación de átomos de carbono o átomos heterogéneos sin coordinación que se enlazan a los átomos de donador de metal); o ligandos monodentados que comprenden átomos de donador que se unen fuertemente al ion metálico, tales como isonitrilos, fosfinas o diacenidas. Ejemplos de tipos de átomo de donador que se unen bien a metales como parte de los agentes quelatadores son: aminas, tioles, amidas, oximas, y fosfinas. Las fosfinas forman tales complejos metálicos fuertes que incluso las fosfinas monodentadas o biodentadas forman complejos metálicos adecuados. La geometría lineal de isonitrilos y diacinidos es tal que no se lleva a la incorporación fácil en agentes quelatadores, y por lo tanto típicamente se utilizan como ligandos monodentados. Ejemplos de isonitrilos adecuados incluyen alquil isonitrilos simples tert-butil isonitrilo, e isonitrilos sustituidos con éter tal como MIBI (es decir, 1-isociano-2-metoxi-2-metilpropano). Ejemplos de fosfinas adecuadas incluyen Tetrofosmin, y fosfinas monodentadas tal como tris(3-metoxipropíl)fosfina. Ejemplos de diaceninas adecuadas incluyen la serie HYNIC de ligandos, es decir, y piridinas o nicotinamidas sustituidas con hidracina.

Cuando el ion metálico es tecnecio, los agentes quelatadores adecuados que forman los complejos metálicos resistentes a transquelación incluyen, pero no se limitan a: (i) diaminadioximas; (ii) ligandos N3S que tienen un donador de tioltriamida establecido tal como MAG3 (mercaptoacetiltriglicina) y ligandos relacionados; o que tienen un donador de diamidapíridintiol establecido tal como Pica; (iií) ligandos N2S2 que tienen un donador de diaminaditiol establecido tal como BAT o ECD (es decir dímero de etilcisteinato), o un donador de amida-aminaditiol establecido tal como MAMA; (iv) ligandos N4 que son ligandos de cadena abierta o macrocíclicos que tienen un grupo donador de tetra-amina, amida triamina o diamida-diamina, tal como ' ciclam, monoxociclam dioxociclam; y, (v) ligandos N202 que tienen un donador de diaminadifenol establecido.

Los agentes quelatadores preferidos de la invención cuando la porción de formación de imágenes in vivo comprende tecnecio son diaminadioximas y tetraaminas. La estructura de, y un método para obtener, un agente quelatador de diaminadioxima preferido se describen en WO 03/006070. La estructura de, y un método para obtener, un agente quelatador tetraamina preferidos se describen en WO 06/008496.

Los ligandos antes descritos son particularmente adecuados para hacer complejo de tecnecio por ejemplo, 94mTc o 99mTc, y se describen más completamente por Jurisson y otros (Chem . Rev.1999; 99: 2205-2218). Los ligandos también son útiles para otros metales, tales como cobre (MCu o 67Cu), vanadio (por ejemplo 48V), hierro (por ejemplo, 52Fe), o cobalto (por ejemplo, 55Co).

Otros ligandos adecuados se describen en Sandoz WO 91/01144, que incluye ligandos que son particularmente adecuados para indio, itrio y gadolinio, especialmente amínocarboxilato macrocíclico y ligandos de ácido aminofosfónico. Lo ligandos que forman complejos metálicos no iónicos (es decir, neutrales) de gadolinio son conocidos y se describen en US 4885363. Particularmente preferidos para gadolinio son los quelatos que incluyen DTPA, ácido etilen diamino tetraacético (EDTA), ácido trietilen tetraamino hexaacético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1 ,4,7, 10-tetraacético (DOTA), ácido 10-(2-hidroxipropil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7-triacético (D03A) y derivados de estos.

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo es parte de un complejo metálico, una porción enlazadora asociada, como se definió aquí previamente, está preferiblemente presente. El papel de la porción enlazadora en este caso es para distanciar el complejo metálico relativamente, que resulta en la coordinación de metal, del sitio activo del péptido para que por ejemplo, no se deteriore la unión del sustrato. Esto puede lograrse por una combinación de flexibilidad (por ejemplo, cadenas alquilo simples), para que el grupo butilo tenga la libertad de colocarse lejos del sitio activo y/o rigidez tal como un separador de cicloalquilo o arilo que orienta el complejo metálico lejos del sitio activo. Las porciones enlazadoras preferidas en el contexto de estos quelatadores tienen una cadena de estructura de base que contiene de -2 a 10 átomos, preferiblemente de 2 a 5 átomos, 2 ó 3 átomos siendo especialmente preferido. Una cadena de estructura de base de grupo enlazador mínimo de 2 átomos confiere la ventaja que el quelatador está bien separado del péptido para que se minimice cualquier interacción. Además, el péptido de forma diferente es para competir efecti amente con la coordinación del quelatador al ion metálico. De esta forma, tanto las características de objetivo biológico del péptido, como la capacidad de complejo metálico del quelatador se mantienen. Esto es fuertemente preferido para que el complejo metálico se una al péptido de tal forma que el enlace no se someta a metabolismo fácil en la sangre. Esto es debido a que tal metabolismo resultará en el complejo metálico de formación de imágenes que se separa antes de que el agente de formación de imágenes in vivo llegue al sitio objetivo in vivo deseado. El péptido por lo tanto probablemente se une de forma covalente al complejo metálico a través de porciones enlazadoras que comprenden enlaces que no son fácilmente metabolizados. Tales enlaces adecuados son uniones de carbono-carbono, enlaces de amida, enlaces de urea o tiourea, o enlaces de éter.

Los grupos enlazadores sin péptido tal como grupos alquileno o grupos arileno tienen la ventaja de que no hay una unión de hidrógeno significativa con la parte de péptido de la Formula I para que el enlazador no interactúe con el péptido. Los grupos separadores de alquileno preferidos son -(CH2)q- en donde q es un entero de valor 2 a 5. Preferiblemente q es 2 ó 3. Los separadores de arileno preferidos son de la Formula III: en donde: a y b cada uno son independientemente 0, 1 ó 2.

Una porción enlazadora preferida aquí de esa forma es -CH2CH2-(L)P-, en donde L es como se define anteriormente y p es un entero de valor 0 a 3. Muy preferiblemente, -(L)p- es -CO- o -NR-.

Cuando el metal de formación de imágenes es tecnecio, el material de partida de tecnecio usual es pertecnetato, es decir Tc04 que es tecnecio en el estado de oxidación Tc(VII). El mismo pertecnetato no forma fácilmente complejos metálicos, por lo tanto, la preparación de complejos de tecnecio usualmente requiere la adición de un agente reductor adecuado tal como un ion estanoso para facilitar la formación de complejo al reducir el estado de oxidación del tecnecio a los estados de oxidación inferior, usualmente Tc(l) a Tc(V). El solvente puede ser orgánico o acuoso, o mezclas de los mismos. Cuando el solvente comprende un solvente orgánico, el solvente orgánico preferiblemente es un solvente biocompatible, tal como etanol o DMSO. Preferiblemente el solvente es acuoso, y muy preferiblemente es salina isotónica.

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo es un halógeno radioactivo que emite gama, el radíohalógeno se elige adecuadamente de 123l, 131l o 77Br. 125l se excluye específicamente ya que no es adecuado para uso como una porción de formación de imágenes in vivo para formación de imágenes in vivo externa. Un halógeno radioactivo que emite gama preferido para formación de imágenes in vivo es 1Z3I.

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo es radioyoduro, el agente de formación de imágenes in vivo de la fórmula I puede obtenerse por medio de un compuesto precursor que comprende un derivado que se somete a yodación , electrof ílica o nucleofílica o se somete a la condensación con un aldehido o cetona etiquetado. Ejemplos de la primera categoría son: (a) derivados organometálicos tales como trialquilestanano (por ejemplo, tri m eti I esta n i lo o tributilestanilo), o un trialquilsilano (por ejemplo, trimetilsililo) o un compuesto de órganoboro (por ejemplo, esteres de boronato u órganotrifluoroboratos); (b) un bromuro de alquilo no radioactivo para intercambio de halógeno o tosilato de alquilo, mesilato o triflato para yodacíón nucleofílica física; (c) anillos aromáticos activados hacia yodación nucleofílica (por ejemplo, aril diazonío de sal de aril yoduro, sales de aril trialquilamonio o derivados de nitroarilo).

Tales compuestos precursores comprenden: un átomo de halógeno radioactivo tal como un yoduro o bromuro de arilo (para permitir el intercambio de radioyoduro); un compuesto precursor organometálico (por ejemplo, compuesto trialquilestaño, trialqüilsililo u órganoboro); o un precursor orgánico tal como triazenos o un grupo de buena partida para sustitución nucleofílica tal como una sal de yodonio. Preferiblemente para radioyodación, el compuesto precursor comprende un compuesto precursor organometálico, muy preferiblemente trialquilestaño.

Los compuestos precursores y los métodos para introducir radioyoduro en moléculas orgánicas se describen por Bolton (J.Lab.Comp.Radiopharm. 2002; 45: 485-528). Los compuestos de órganoboro de éter de boronato adecuados y su preparación se describen por Kabalka y otros (Nucí. Med. Biol. 2002; 29: 841-843, y Nucí. Med. Biol. 2003; 30: 369-373). Los órganotrifluoroboratos adecuados y su preparación se describen por Kabalka y otros (Nucí. Med. Biol. 2004; 31: 935-938).

Ejemplos de grupos arilo a los cuales puede unirse el yoduro radioactivo se proporcionan a continuación: Ambos contienen sustitutos que permiten la fácil sustitución de radioyoduro en el anillo aromático. El residuo de tirosina permite la radioyodación para llevarse a cabo al utilizar su grupo fenol inherente.

Los sustitutos alternativos que contienen yoduro radioactivo pueden sintetizarse por yodación directa a través del intercambio de radiohalógeno, por ejemplo, El átomo de radio yoduro preferiblemente se une a través de un enlace, covalente directo a un anillo aromático tal como un anillo de benceno, o un grupo vinilo ya que se conoce que los átomos de yoduro se unen a sistemas alifáticos saturados que son propensos a metabolismo in vivo y por lo tanto a pérdida de radioyoduro.

Cuando la porción de formación de imágenes in vivo es un no metal radioactivo que emite positrón, los emisores de positrón adecuados incluyen: 11C, 13N, 50, 17F, 18F, 75Br, 76Br o 124l. Los no metales radioactivos que emiten positrones preferidos son 11C, 13N, 18F and 24l, especialmente ,1C y 18F, muy especialmente ,8F.

La radiof luoración puede llevarse a cabo a través de etiquetado directo al utilizar la reacción de fluoruro 18F con un grupo químico adecuado en un compuesto precursor que tiene un grupo de buena permanencia, tal como un bromuro de alquilo, un mesilato de alquilo o tosilato de alquilo. 18F también puede introducirse por alquilación de grupos N-halocetilo con un reactivo 18F(CH2)30H, para dar derivados -NH(CO)CH20(CH2)318F. Para sistemas arilo, el desplazamiento nucleofílico de fluoruro 18F de una sal de arilo diazonio, un compuesto aril nitro o una sal de amonio cuaternario de arilo son rutas adecuadas para derivados l8F de arilo.

Un compuesto etiquetado l8F de la invención puede obtenerse por la formación de f luorodialquilaminas 18F y formación de amida subsecuente cuando se hace reaccionar la f luorodialquilamina l8F con un precursor que contiene, por ejemplo, cloro, P(0)Ph3 o un éster activado.

Un aspecto adicional para radiofluoración, es particularmente adecuado para radiofluoración de péptidos, se describe en WO 03/080544 y utiliza acoplamiento de tiol. Un compuesto precursor que comprende uno de los siguientes sustitutos: se hace reaccionar con un compuesto de la Fórmula IV: 18 F-XX-SH (IV) en donde Yx es una porción de enlazador de la fórmula -(Lv)y-, en donde LY es como se definió previamente para L, y es 1-10 y opcionalmente incluye 1-6 átomos heterogéneos; Xx es un enlazador de la fórmula -(Lx)x-, en donde Lx es como se definió previamente para L, x es 1-30 y opcionalmente incluye 1 a 10 átomos heterogéneos; y, * define el punto de unión al resto del agente de formación de imágenes in vivo; para proporcionar agentes de formación de imágenes in vivo radiof luorados de la fórmula (IVa) o (IVb) respectivamente: (IVb) en donde X\ Yx, y *son cómo se define anteriormente.

Un aspecto adicional particularmente adecuado para radiof luoración de péptidos se describe en Poethko y otros (J.Nuc.Med , 2004; 45: 892-902), y hace uso del acoplamiento de aminoxi. La radiofluoración se lleva a cabo por la reacción de un compuesto precursor de la fórmula (V) con un compuesto de la fórmula (Va): R -* (V) 8F-XX'-R2 (Va) o, por la reacción de un compuesto precursor de la fórmula (VI) con un compuesto de la fórmula (Vía) R3-" (VI) ,8F-XXII-R4 (Vía) en donde; XXI y Xx" son grupos enlazadores -(Lx')z-, en donde LXI es como se definió previamente para L, z es 1-10 y opcionalmente incluye 1-6 átomos heterogéneos; R es una porción aldehido, una porción acetona, un aldehido protegido tal como un acetal, una acetona protegida, tal como un cetal, o una funcionalidad, tal como diol o residuo de serina N-terminal, que puede oxidarse rápida y eficientemente a un aldehido o cetona que utiliza un agente oxidante; R2 es un grupo funcional que, bajo condiciones medias tal como regulación de pH acuoso, reacciona específicamente en sitio con R1 que genera un conjugado estable. R2 pueden ser derivados de amoníaco tal como amina primaria, amina secundaria, hidroxilamina, hidrazina, hidrazida, aminoxi, fenilhidrazina, semicarbazida, o tiosemicarbazida , y preferiblemente es una hidrazina, hidrazida o grupo aminoxi; R3 es un grupo funcional que reacciona especialmente en el sitio con R4. R4 pueden ser derivados de amoníaco tal como amina primaria, amina secundaria, hidroxilamina, hidrazina, e hidrazida, aminoxi, fenilhidrazina, semicarbazida, o tiosemicarbazida, y preferiblemente es una hidrazina, hidrazida o grupo aminoxi; R4 es una porción de aldehido, una porción de acetona, una porción de aldehido protegido tal como una acetal, una acetona protegida, tal como un cetal, una funcionalidad, tal como diol o residuo de serína N-terminal, que puede oxidarse rápida y eficientemente a un aldehido o cetona al utilizar un agente oxidante; para dar un conjugado de la fórmula (VII) o (VIII), respectivamente: en donde W es -CO-NH-, -NH-, -O-, -NHCONH-, o -NHCSNH-, y preferiblemente es -CO-NH-, -NH- o -O-; Y es H, alquilo de d.6 o sustituyentes arilo de C5.6 y en donde XXI, Xx" y * son como se definió previamente.

Un agente de formación de imágenes in vivo etiquetado con ,8F preferido de la invención se describe por Indrevoll y otros (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006; 16: 6190-3). Detalles adicionales de las rutas sintéticas para derivados etiquetados 18F se describen por Bolton (J.Lab.Comp.Radiopharm. 2002; 45: 485-528).

Las porciones de formación de imágenes in vivo preferidas son aquellas que pueden detectarse externamente en una forma no invasora que sigue la administración in vivo, tal como por medio-de SPECT, PET y MRI. Las porciones de formación de imágenes in vivo más preferidas son radioactivas, especialmente iones metálicos radioactivos, halógenos radiactivos que emiten gama y no metales radioactivos que emiten positrón, particularmente aquellos adecuados para formación de imágenes que utilizan SPECT o PET, por ejemplo Te, En una modalidad preferida, W, representa una porción enlazadora, Zy comprende una porción de formación de imágenes in vivo, W2 representa una porción enlazadora opcional, y Z2 es hidrógeno, e incluye lo siguiente: Agente de formación de imágenes 1 Agente de formación de imágenes 2 Agente de formación de imágenes 3 Los métodos para la preparación de Agentes de formación de imágenes 1 y 3 se detallan en WO 2005/012335, y para la preparación de Agente de Formación de Imágenes 2 en Kenny y otros (J. Nuc. Med. 2008; 49: 879-86).

Incluso en una modalidad preferida alternativa adicional, W, representa una porción enlazadora opcional, Z2 es hidrógeno, W2 representa una porción enlazadora, y Z2 comprende una porción de formación de imágenes in vivo, por ejemplo: Agente de formación de imágenes 4 Agente de formación de imágenes 5 Agente de formación de imágenes 6 Agente de formación de imágenes 7 Los métodos para la preparación de Agentes de Formación de Imágenes 4-7 se detallan en WO 2003/006491.

Cuando el sujeto de la invención es un cuerpo de un mamífero intacto in vivo, el agente de formación de imágenes in vivo preferiblemente se administra como una composición farmacéutica. La amplia definición de una composición farmacéutica se proporcionó previamente en la especificación. Sin embargo, en esta modalidad, el agente activo es dicho agente de formación de imágenes in vivo. El portador biocompatible es un fluido, especialmente un líquido, en el cual el agente de formación de imágenes in vivo está suspendido o disuelto, para que la composición sea fisiológicamente toreable. es decir, puede administrarse al cuerpo de mamífero sin toxicidad o incomodidad indebida. El medio portador biocompatible es adecuadamente un líquido portador inyectable tal como agua estéril, libre de pirógeno para inyección; una solución acuosa tal como salina (que puede balancearse ventajosamente para que el producto final para inyección sea isotónico o no hipotónico); una solución acuosa para una o más sustancias que ajustan la tonicidad (por ejemplo, sales de cationes de plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sacarosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol o manitol), glicoles (por ejemplo, glicerol), u otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo, o polietilen glicoles, propilen glicoles y similares). El medio portador biocompatible también puede comprender solventes orgánicos biocompatibles tal como etanol. Tales solventes orgánicos son útiles para solubilizar compuestos más lipofílicos o formulaciones. Preferiblemente, el medio portador biocompatible es agua libre de pirógeno para inyección, salina isotónica o una solución de etanol acuosa. El pH del medio portador biocompatible para inyección intravenosa está adecuadamente en el rango de 4.0 a 10.5.

Tales composiciones farmacéuticas de agente de formación de imágenes in vivo se suministran adecuadamente en un contenedor que está provisto con un sello que es adecuado para punción individual o múltiple con una aguja hipodérmica (por ejemplo, una tapa de sello de septo engarzada) mientras mantiene la integridad estéril. Tales contenedores pueden contener dosis de paciente individuales o múltiples. Los contenedores de dosis múltiples preferidos comprenden un frasco de volumen individual (por ejemplo, volumen de 10 a 30 cm3) que contiene múltiples dosis de paciente, con lo cual las dosis de paciente individuales pueden retirarse en jeringas de grado clínico en varios intervalos de tiempo durante la vida útil viable de la preparación para adecuarse a la situación clínica.

Las jeringas pre-rellenas están diseñadas para contener una dosis para humano individual, o "dosis de unidad" y por lo tanto preferiblemente es una jeringa desechable u otra adecuada para uso clínico. Cuando la composición farmacéutica es una composición radiofarmacéutica, la jeringa pre-rellena opcionalmente puede estar provista con un protector de jeringa para proteger al operador de dosis radiactiva. La jeringa radiofarmacéutica adecuada protege los protectores de jeringas radiofarmacéuticas adecuados son conocidos en la técnica y preferiblemente comprenden plomo o tungsteno.

La composición farmacéutica puede prepararse de un equipo. Alternativamente, puede prepararse bajo condiciones de fabricación asépticas para dar el producto estéril deseado. La composición farmacéutica también puede prepararse bajo condiciones no estériles, seguido por la esterilización de terminal al utilizar irradiación gama, auto-separación, tratamiento de calor en seco o químico (por ejemplo, con óxido de etileno).

Los presentes inventores proponen que el método de la presente invención puede ser útil para determinar la dosis óptima y el régimen de inhibidores que se prueban en estudios clínicos que comprenden sujetos que sufren de melanoma. Otra aplicación es en la valoración de respuesta previa del paciente a estos inhibidores. Además, el método de la invención puede utilizarse para seleccionar a aquellos sujetos que muy probablemente responden al inhibidor, por ejemplo, como parte de una prueba de registro que solamente incluye pacientes que respondan muy probablemente. Cualquiera de estos inhibidores debe aprobarse para uso clínico, el método de la invención entonces puede aplicarse para permitir decisiones sobre si se continúa el tratamiento con los inhibidores, alterar la dosis, o seguir una estrategia de tratamiento diferente. Cada uno de estos usos forma un aspecto preferido del método de la invención.

En un aspecto alternativo, la presente invención facilita el uso de un agente de formación de imágenes in vivo que se une a integrina a?ß3 en el método de la invención. Para este aspecto de la invención, la modalidad adecuada y preferida de dicho agente de formación de imágenes in vivo en dicho método se define como anteriormente para dicho método de la invención.

En otro aspecto alternativo, la presente invención facilita el uso de un agente de formación de imágenes in vivo que se une a integrina avPa en la fabricación de un medicamento adecuado para uso en el método de la invención. Para este aspecto de la invención, la modalidad adecuada y preferida de dicho agente de formación de imágenes in vivo y dicho método es como se definió anteriormente de dicho método de la invención.

La presente invención además proporciona un producto de programa de computadora para usarse para llevar a cabo el método y los usos de la invención como se describe aquí. Para este aspecto de la invención, la modalidad adecuada y preferida de dicho agente de formación de imágenes in vivo y dicho método es como se definió anteriormente para dicho método de la invención.

El ejemplo experimental a continuación demuestra la aplicación específica de un agente de formación de imágenes de enlace de integrina a?ß3 en lesiones de melanoma.

BREVE DESCRIPCION DE LOS EJEMPLOS El Ejemplo 1 presenta un experimento de formación de imágenes in vivo en donde el Agente de formación de imágenes 2 se utilizó para crear imágenes de un sujeto humano con melanoma metastático confirmado.

EJEMPLOS Abreviaciones Utilizadas en los Ejemplos Dq megabequerel(s) PET tomografia de emisión de positrón CT tomografia calculada Ejemplo 1: Melanoma Metastático de Formación de Imágenes In Vivo Formación de imágenes in vivo al utilizar Agente de Formación de Imágenes 2 (que tiene una afinidad de enlace (IC5o) a integrina a?ß3 de 11.1 nM; ver Kenny y otros J. Nuc. ed. 2008; 49: 879-86); se llevó a cabo en un paciente femenino de 60 años con melanoma metastático confirmado por biopsia. 365MBq del Agente de formación de imágenes 2 (inyectado y preparado por el método descrito en Kenny y otros, J. Nuc. Med. 2008; 49: 879-86) se administró al paciente. Los datos de formación de imágenes in vivo se adquirieron en un Rx PET/CT de descubrimiento GE (GE Healthcare).

La primera posición de cama de la adquisición de cuerpo completo inició 45 minutos después de la inyección del Agente de Formación de Imágenes 2. La duración de cada posición de cama fue de 5 minutos, y se adquirieron 5 posiciones de cama con un traslape plano 9. Los datos se corrigieren para tiempo muerto, decaída, aleatorios, dispersión y atenuación, este último utilizando una adquisición CT escalada de energía, y reconstruido con el algoritmo de reconstrucción Vue Point HD (GE Healthcare) (8 repeticiones y 21 subgrupos).

Las Figuras 1 y 2 ¡lustran la aplicación del Agente de Formación de Imágenes 2 en lesiones de melanoma metastático confirmado. Este procedimiento de formación de imágenes in vivo por lo tanto demuestra la aplicación especifica de un agente de imagen de enlace de ¡ntegrina a?ß3 en lesiones de melanoma.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para verificar la efectividad de un inhibidor, en donde dicho inhibidor es un inhibidor de B-raf, EK1/2 (MEK: cinasa de proteína activada por mitógeno/cinasa relacionada con señal extracelular) , o ERK1/2 (ERK: cinasa relacionada con señal extracelular) , dicho inhibidor se utiliza para tratar a un sujeto que sufre de melanoma, dicho método comprende: (a) en un primer punto en el tiempo, llevar a cabo un procedimiento de formación de imágenes in vivo en dicho sujeto para generar una primera imagen in vivo de una región de interés, en donde dicha región de interés comprende dicho melanoma, y en donde dicho procedimiento de formación de imágenes in vivo comprende: (i) la administración a dicho sujeto de un agente de formación de imágenes in vivo que comprende un vector etiquetado con una porción de formación de imágenes in vivo, en donde dicho agente de formación de imágenes in vivo se enlaza una integrina a?ß3 con un Ki de <10 nM en un ensayo de enlace competitivo para integrina a?ß3 en donde el valor Ki se determina mediante la competencia con equistatina; (ii) permitir que el agente de formación de imágenes in vivo administrado del paso (i) se enlace a integrina a?ß3 expresada por dicho melanoma; (iii) detectar señales emitidas por la porción de formación de imágenes in vivo del agente de formación de imágenes in vivo enlazado del paso (ii); y, (¡v) convertir las señales detectadas en el paso (iii) a una primera imagen in vivo representativa de la expresión de 5. integrina a?ß3 en la superficie de dichas células de melanoma en dicha región de interés; (b) tratar a dicho sujeto con dicho inhibidor; (c) en un segundo punto en el tiempo, repetir el procedimiento de formación de imágenes in vivo como se definió en 0 el paso (a) para generar una segunda imagen in vivo de dicha región de interés; y, comparar dicha primera imagen in vivo, con dicha segunda imagen in vivo, con lo cual una disminución en dichas señales detectadas en dicho segundo punto en el tiempo indica la efectividad 5 de dicho inhibidor para tratar dicho melanoma.

2. - El melanoma de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho melanoma comprende una mutación en el gen B-raf.

3. - El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha mutación se provoca por V599E de sustitución individual. 0

4.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho sujeto es un sujeto mamífero intacto in vivo.

5.- El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho sujeto es un sujeto humano. 5

6.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho agente de formación imágenes in vivo es de la Fórmula I: en donde: W, y W2 son independientemente una porción enlazadora opcional, en donde dicha porción enlazadora es un radical bivalente de la fórmula -(L)n- en donde: cada L es independientemente -C( = 0)-, -CRV, -CR' = CR'-, -C=C-, -CR'2C02-, -NR'-, -NR'CO-, -CONR'-, -N R'(C = 0)NR'-, -NR'(C = S)NR'-, -S02NR'-, -NR S02-, -CR'2OCR'2-, -CR'2SCR'2-, -CR'2NR'CR'2-, un grupo cicloheteroalquileno de C .8, un grupo cicloalquileno de C4.a, un grupo arileno de C5.,2, un grupo heteroarileno de C3.12, un aminoácido, un poliaquilen glicol, ácido poliláctico o una porción de ácido poliglicólico; n es un entero con un valor de 1 a 15; y en donde el grupo R' es independientemente H o alquilo de C,.io, alquilarilo de C3. 0, alcoxialquilo de C2.10l hidroxialquilo de d. io, fluoroalquilo de C,.10, ó 2 ó más grupos R', junto con los átomos a los cuales se unen forman un anillo carboxílico, heterociclico, saturado o no saturado; y ?¦) y Z2 son independientemente (i) un grupo que comprende una porción de formación de imágenes in vivo, (ii) una porción de azúcar, o (iii) hidrógeno, siempre que al menos uno de ? y Z2 sea una porción de formación de imágenes in vivo.

7. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha porción de formación de imágenes in vivo se selecciona de: (a) un ion metálico radioactivo; (b) un halógeno radioactivo que emite gama; (c) un no metal radioactivo que emite positrón; y, (d) un ion metálico paramagnético.

8. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para usarse en pruebas clínicas para determinar la dosis óptima y el régimen de un inhibidor B-Raf, MEK1/2 o ERK1/2 en el tratamiento de melanoma.

9. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la valoración de respuesta previa del paciente a un inhibidor de B-Raf, MEK1/2 o ERK1/2 en el tratamiento de melanoma.

10. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la selección de pacientes que muy probablemente respondan a un inhibidor de B-Raf, MEK1/2 o ERK1/2 en el tratamiento de melanoma.

11.- El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para usarse al tomar una decisión sobre si se continúa el tratamiento de melanoma con un inhibidor de B-Raf, MEK1/2 o ERK1/2.

12.- El uso de un agente de formación de imágenes in vivo en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho agente de formación de imágenes in vivo es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 6 ó 7.

13. - El uso de un agente de formación de imágenes in vivo en la fabricación de un medicamento adecuado para usarse en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho agente de formación de imágenes in vivo es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 6 ó 7.

14. - Un producto de programa de computadora para usarse al llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.