MX2010013628A - Metodo para seleccionar compuestos que inhiben la neurodegeneracion. - Google Patents

Abstract

Se presentan métodos para seleccionar compuestos que inhiben la neurodegeneración. La muda de APP puede ser un marcador útil para la neurodegeneración y compuestos que inhiben la muda de APP son útiles como inhibidores de neurodegeneración. Tales compuestos pueden ser útiles en el tratamiento y/o prevención de varias enfermedades, alteraciones neurológicas y daños neuronales y pueden mejorar el crecimiento, regeneración o sobrevivencia de células neuronales mamíferas o tejido.

Description

METODO PARA SELECCIONAR COMPUESTOS QUE INHIBEN NEURODEGENERACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en g os para seleccionar compuestos que inhiben la de euronas . Más específicamente, los métodos invo ción de compuestos que inhiben la muda de APP d és de un evento de disparo por degeneración neuro ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varios ligandos y receptores que pertene familia del factor de necrosis de tumor (TNF) ificados en el arte. Incluidos entre tales li ntran factores alfa de necrosis de tumor ("T r-beta de necrosis de tumor ("TNF-beta" o "li ), linfotoxina-beta ( "LT-beta" ) , ligando CD30 Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, CYTOKINEREFERENCE, , 2000, pages 377-411; Locksley et al . , Cell, 1 ); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 83:1881 (1986); Deal J. Immunol., 17:689 (1987); Pittiet al . , J. Bi 2687-12690 (1996); Wiley et al . , Imunity, ); Browning et al . , Cell, 72:847-856 (1993); ture, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 published J WO 97/25428 published July 17, 1997; Marste Biol., 8:525-528 (1998); Chicheporticheet al., , 272:32401-32410 (1997); Hahneet al., J. E 185-1190 (1998); W098/28426 published July 46751 published October 22, 1998; WO/98/18921 , 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (19 J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider e Med. , 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyayet al., inado como TR9, también conocido en la litera ro 21 de la superfamilia del receptor de TNF o DcR2, osteoprotegerina (OPG) , RANK y Apo-3 inado como DR3 o TRAMP) (véase, por ejemplo eReviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, 305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. O , 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol . , 7 : ) Wallach, Cytokine Reference, Academic Pre as 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-50 a Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohmane Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhauset a Acad. Sci.USA, 87:3127-3131 (1990); EP 417,563, de marzo de 20, 1991; Loetscheret al., Cel ); Schallet al., Cell, 61:361 (1990); Smith ee, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. N USA, 88:2830-2834 (1991); Goodwinet al., Mol. Ce (1997) ; vonBulowet al., Science, 278:138-14 on et al., Cell, 47:545-554 (1986) ; Radekeet al. 93-597 (1987) ; Pan et al., FEBSLett . , 431:351-356 La mayoría de estos miembros de la fa tor de TNF comparten la estructura' represen tores de superficie celular que incluyen celulares, de transmembrana e intracelulares, mi son encontrados de manera natural como proteína carecen de un dominio de transmembrana y celular. La porción extracelular de los TNF enen un patrón de secuencia de aminoácidos repe ples dominios ricos en cisteína (CRD) , inic no NH2.

Para revisiones de la familia de TNF de l tores, véase, en general Wallach, CYTOKINE micPress, 2000, pages 377-411; Locksleyet a lásmica(Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998 én patentes estadounidenses 6,358,508; 6 ,078; 6,949,358). Se ha reportado que la sobreex n ciertas líneas celulares transfectadas da como osis y activación tanto de NF-kB como de JNK (P Letüers, 431:351-356 (1998)). En un modelo iente de DR6 células T fueron substa ioradas en activación de JNK y cuando ratones n atacados con antígeno de proteína, se encontr as T hiperproliferaban y mostraban una po nda hacia una respuesta de Th2 (mientras enciación de Thl no fue afectada equival et al.i J. Exp. Med. , 194:1441-1448 (2001)). S s que la disrupción apuntada de DR6 dio como enciación de T auxiliar 2 (Th2) mejoradain vit supra) . Varios usos de agonistas de DR6 o antag ente resistentes tanto al inicio como el ava medad de CNS en comparación con compañeros de c stre (WT) . Así, DR6 puede estar involucrado en tración y función de leucocito en la inducción y alomielitis autoinmune experimental (Schmidt e ol-, 175:2286-2292 (2005)).

En tanto que varios miembros de la familia ceptor de TNF han sido identificados por tener idades y propiedades biológicas, muy pocos dos y receptores han sido reportados estar invol ones neurológicas-relacionadas . Por ejemplo, WO2 cado el 26 de agosto de 2004 describe la inhib ejo de ligando/receptor de CD95(Fas) en un mode tratar lesión de espina dorsal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Tales anticuerpos antagonistas de DR6 pueden ío anticuerpos monoclonales , anticuerpos q uerpos humanizados o anticuerpos humanos. E idades de la invención, el antagonista de ender un anticuerpo anti-DR6 que se enlaza al p ominio extracelular de DR6 o fragmento del nalmente se puede enlazar a un polipéptido d ende los aminoácidos 1-349 o 42-349 de la F nativamente, el antagonista de DR6 puede comp uerpo anti-APP que se enlaza a un polipéptido nalmente se puede enlazar a un polipéptido d ende los aminoácidos 66-81 de la Figura IB (SEQ I Los antagonistas de DR6 contemplados tambié oadhesinas de DR6 , variantes de DR6, fragmento s modificadas covalentemente de los mismos o pr n de los mismos, también como antagonistas de hibe el enlace de DR6 a APP. Los antagonistas os usados en tales métodos incluyen anticuerp an a DR6 o APP, también como polipéptidos de DR6 nalmente, los antagonistas de DR6 son seleccion n estos métodos al observar su habilidad para i e entre DR6 y APP. En ciertas modalidades de la métodos son usados por ejemplo para inhibir la mejorar el crecimiento y/o sobrevivencia d nales en un cultivo de tejido in vitro. Lo mplan el uso de un solo tipo de molécula antag o una combinación de dos o más tipos de antago Modalidades de la invención también provee mejorar el crecimiento o regeneración o sobrevi as o tejidos neuronales en mamíferos, que istrar a un mamífero una cantidad efectiva de a arse a DR6. En otras modalidades de la inve onista de DR6 usado en tales métodos puede comp uerpo que se enlaza a DR6 e inhibe su hábil arse a APP. Alternativamente, el antagonista de ender una inmunoadhesina de DR6, polipéptid ado a un polímero no proteináceo seleccionado consiste de polietilenglicol, propileng xialquileno o una variante de polipéptido de oadhesinas de DR6 empleadas en los método ender un receptor de DR6 soluble fusionado a una una inmonoglobulina. Todavía además, los antag e la invención pueden incluir moléculas pequeñas .

Modalidades de la invención también provee el tratamiento de alteraciones neurologicas que istrar a un mamífero una cantidad efectiva de a R6. En modalidades opcionales, los métodos mpleadas en los métodos pueden comprender un re soluble fusionado a una región de Fe uglobulina. Los anticuerpos anti-DR6 empleado os se pueden enlazar a un receptor de DR6 que minóacidosl-349 o 42-349de la Figura 1A.

Modalidades de la invención también incluye diagnosticar un paciente con una alteración neu ptible a una alteración neurológica, que compren uestra del paciente y probar la muestra en cu ncia de una variante de polipéptidos de DR6 que ncia de polipéptido que difiere de la sec éptido de DR6 de SEQ ID NO: 1. Comúnmente, os, la variante de polipéptido es identificada afinidad por un polipéptido de APP que difie dad observada por la secuencia de polipéptido D NO: 1. ción incluyen además moléculas identificadas métodos. Opcionalmente, la molécula de inter uerpo que se enlaza , a APP, un anticuerpo que se un polipéptido de DR6 soluble.

Modalidades de la invención también uerpos que son capaces de enlazarse específi do de APP, receptor de DR6 y/o son aptos d idades biológicas asociadas con DR6 y/o su(s) co-receptores y son- útiles en el tratamiento aciones neurológicas . En modalidades particu en anticuerpos que se enlazan específicamen ncía de dominio extracelular del polipéptid rito adicionalmente en los ejemplos a cont uerpos representativos son aquellos que se enlaz y que son seleccionados adicionalmente en cu idad para inhibir el enlace entre DR6 094, o PTA-8096, respectivamente se enlaza. En u nvención es concerniente con un anticuerpo ant ende el anticuerpo 3F4.4.8, 4B6.9.7, o 1E5.5.7 m ños la misma afinidad por DR6 y/o exhibe por lo actividad biológica y/o potencia como el .8, 4B6.9.7, o 1E5.5.7. En todavía otras m culares, se provee la línea de célula de hibr ce el anticuerpo monoclonal 3F4.4.8, 4B6.9.7, o itado como ATCC como número de acceso PTA-8095, -8096, respectivamente y el anticuerpo 3F4.4.8, .7 secretado por el hibridoma depositado con la o de acceso PTA-8095, PTA-8094, o ctivamente .

También se proveen anticuerpos monoclonale dos, que comprenden anticuerpos que se e éptido de DR6 e inhiben competitivamente el e a o regiones variables derivadas del anticuer .7, o 1E5.5.7.

En todavía otro aspecto, la invención es co moléculas de ácido nucleico aisladas que codi uerpos, anti-DR6 o fragmentos de anticuerpo de s mismas, vectores que comprenden tales molécula ico, células huésped que comprenden tales mol nucleico y métodos para producir anticuerpos y ticuerpo en los mismos.

La invención es concerniente además con com comprenden antagonista (s ) de DR6 como se defi nte y un portador. El portador puede ser un able farmacéuticamente y la composición puede s un (os) agente (s) adicional (es) .

En un aspecto adicional, la invención es co artículos de manufactura que comprenden un rec o del recipiente. En tales kits, la composición onista de DR6 efectivo para inhibir la apoptosis un tipo de célula neuronal mamífera, la etiquet íente o un inserto de empaque incluido en dicho indica que la composición puede ser usada para osis en por lo menos un tipo de célula neuronal nalmente, el kit incluye elementos adicionales gundo recipiente que comprende una solución regu ceptable farmacéuticamente y/o instrucciones par onista de DR6 para inhibir la apoptosis en por l de célula neuronal mamífera.

La invención provee además el uso de los an R6 y composiciones descritas en la presente ración o manufactura de un medicamento para miento de alteraciones neurológicas en i yendo para uso en el tratamiento de enfe nal y puede ser usado como terapia para enfer aciones neurológicas, tales como pero no li medad de Alzheimer y para la degeneración aso n.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A muestra la secuencia de nucle de DR6 humano (F G 1A-1, SEQ ID NO: 2), su sec ácidos derivada (FIG 1A-2, SEQ ID N0:1) tambié ma de su arquitectura de dominio (FIG 1A-3) . En R6, se indican las fronteras de dominio en l yen el péptido de señal supuesto, porciones d en cisteína, dominio de transmembrana y d e. En este esquema, se indican fronteras d stas del péptido de señal supuesto, porciones en cisteína, dominio de transmembrana y d :9). Véase, por ejemplo entrada P05067UniProtKB/ velación asociada que incluyen aquella concern rma ID P05067-1, isoforma ID P05067-4 e is 7-8, respectivamente (htt : / /expasy. org/uniprot/ La Figura 2A muestra que DR6 es fuertemente istema nervioso central en desarrollo, incluyend ces y comisurales de espina dorsal y neuronas íz dorsal, en etapas de desarrollo E10.5-E12.5. uestra la proteina DR6 expresada sobre axones ares . La Figura 2C muestra el mARN de DR6 ex nas de diferenciación.

La Figura 3 muestra una representación esqu eración axonal y muerte de célula neuronal en u obrevivencia de explante de espina dorsal; intro es de siARtXT interferentes de ARN junto con pl sa GFP en neuronas comisurales embriónicas élula neuronal en el análisis de sobrevivencia l .

La Figura 6 proporciona un esquema m rafías de neuronas que muestran la regulación d señalización intracelular corriente abajo de DR ición farmacológica de cinasa N-terminal c- e la degeneración axonaly muerte de célula neuro sis de sobrevivencia de explante.

La Figura 7 "muestra los efectos neuro-prot uerpos DR6 antagonísticos sobre la sobrevi neuronas motrices espinales e interneuronas en on entero ex vivo .

La Figura 8 provee fotografías de secciones al cervicales E15.5 inmunoteñidas con antic sa 3. que muestra que la pérdida de DR6 da como sminución de muerte de célula neuronal en espin presencia y ausencia de factores de c tróficos. La Figura 9C provee fotografías de cé ran que la degeneración axonal inducida por dada en ratones DR6 knockeados .

La Figura 10A provee fotografías de neu ran que anticuerpos anti-DR6 inhiben la degene resultante de abandono de factor de crecimiento de diversas neuronas privadas del factor tr a 10B provee datos fotográficos adicionales lizaciones de teñido de túnel de cuerpos óticos en neuronas comisurales, sensoriales y mo ran que los anticuerpos anti-DR6 inhiben la de versas neuronas privadas del factor trófico.

La Figura 11A provee fotografías de urales que muestran que la degeneración de axón ser retardada mediante DR6-Fc. La Figura 1 rafías de estudios de axones sensoriales nulos s de desarrollo E12.5 que muestran que un inh secretasa (BACE) puede bloquear la desaparición nlace de DR6-AP de axones sensoriales en se ono de NGF.

La Figura 13A provee fotografías de datos arios procedimientos de Western blotting en éptidos de células neuronales fueron sondeadas e superior izquierda) o el anticuerpo anti-N-A ior derecha), también como polipéptidos : (1) sel uanto a su habilidad para enlazarse a DR6 y adas con anticuerpo anti-N-APP (parte inferior, ión hacia abajo"). Estos datos identifican la rsora amiloide (APP) como un ligando ectodomini 6.La Figura 13B provee fotografías de datos ob s experimentos de inmunoabsorción que per 6 se enlaza a APP elaborado por células culti a 14C provee fotografías de células que muestra receptor principal para N-APP sobre axones sens os sitios de enlace de APP son agotados signific s células neuronales de ratones nuloa DR6. La F e fotografías de células que muestran que los a bloquean la función de DR6 disrumpen las int el ectodominio de DR6 y N-APP.

La Figura 15A provee fotografías de neu ran que el anticuerpo policlonal a APP N-termin egeneración axonal en un análisis de axón comi a 15B provee fotografías de neuronas que muestra uerpos policlonales a APP N-terminal , también uerpos monoclonales anti-APP 22C11 inhiben la de l local inducida por la remoción de NGF. La F e fotografías de neuronas que muestran que la de nas que muestran que los anticuerpos de DR6 qu nción fallan en bloquear la degeneración axonal beta.

La Figura 17A provee fotografías de neu ran que la degeneración axonal es retardad ición de J K y caspasa-8 corriente arriba, p sa-3 corriente abajo. La Figura 17B provee foto nas motrices de cultivos de explante de E12.5 qu la caspasa-3 funciona en cuerpos celulares, cas s . La Figura 17C provee fotografías de riales que muestran que mientras que la caspas rida para la degeneración de axón, BAX lo es. rovee fotografías de neuronas comisurales que mu aspasa-3 funciona en cuerpos celulares, mientr sa-6 funciona en axones . procedimientos que involucran el uso de kits y nibles comercialmente se llevan a cabo en g do con los protocolos y/o parámetros definido cante a no ser que se indique de otra manera.

Antes de que los presentes métodos y anál itos, se comprenderá que esta invención no está etodología, protocolos, líneas celulares, es les o géneros de animales, constructos y culares descritos ya que pueden por supuest én se comprenderá que la terminología usada en l or el propósito de describir modalidades pa ente y no pretende limitar el alcance de la ción que .estará limitada solamente ndicaciones adjuntas.

Se debe notar que, como se usan en la pres reivindicaciones adjuntas, las formas singula ximadamente" .

Todas las publicaciones mencionadas en la incorporadas en la presente por referencia para ibir los métodos y/o materiales en relación con ublicaciones son citadas. Las publicaciones cit nte son citadas por su revelación antes de la ntación de la presente solicitud. Nada en la pre pretado como una admisión de que los inventores ho a anticiparse a las publicaciones en virt de prioridad anterior o fecha previa de la s, las fechas de publicación reales pueden ser uellas mostradas y requieren verificación indepe FINICIONES Los términos "proteína precursora amiloide yen las varias isoformas de polipéptidos codifi 0 de sitio de proteína de NCBI de PubMed P050 me de exón alternativo produce tres isoformas p 95, 751 y 770 aminoácidos (Véase, por ejemploKa e 325: 733-736 (1987); Kitaguchiet al., Nature (1988); Ponte et al., Nature 331: 525-527 (1 et al.,' Nature 331: 528-532 (1988)) . Dos rmas (App75i and APP77o ) contienen un inserto de 5 s altamente homólogo a la familia de Kunitz de i roteasa de serina (KPI) y son expresados ubicua aste, la isoforma más corta que carece de la p APP695 es expresada predominantemente en el oso, por ejemplo en neuronas y células gliales es denominado frecuentemente W APP neuronal" (v ío Tanziet al., Science 235: 880-884 (1988); Ne n 1: 669-677 (1988); and Haaset al., J. Neurosci. (1991)) . Las isoformas de APP incluyendo las 6 celular de polipéptido de APP N-terminales solub ??ß, respectivamente y la retención de fragu nales membrana-afianzados correspondientes C83 samiento subsecuente de C83 mediante gama ce polipéptidosP3. Esta es la ruta secretoria p ?-amiloidogénica . Alternativamente, el procesa secretasapresenilina/nicastrina-moderada de C99 éptidos beta amiloides, amiloide-beta 40 (Abe ide-beta 42 (Abeta42) , componentes principales ides y los fragmentos C-terminales citotóxicos, , gama-CTF(57) y gama-CTF (59). La evidencia sugi tancia relativa de cada evento de escisión de de célula. Por ejemplo, las células no riblemente procesan APP mediante ruta(s) de alfa escinde APP dentro de la secuencia de A beta nte esto la formación de A beta. (Véase, po que son ya sea 40 (Abeta40) o 42 aminoácidos a2) (véase, por ejemplo Seubertet al. 1993 Natur Suzuki et al. 1994 Science 264:1336-1340; and 996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970).

Los términos "APP", "proteína de APP" y "p ?P" cuando son usados en la presente abarcan sec aturales y variantes de APP y fragmentos procesa s . Estos términos abarcan APP expresada en una v eros, en los que se incluyen. La APP puede ser enamente, tal como se presenta naturalment dad de linajes de tejido humano o puede ser nte métodos recombinantes o sintéticos. Una ncia natural" comprende un polipéptido que tien ncia de aminoácidos como una APP derivada de la ejemplo, las isoformas 695, 751 y 770 o sadas de las mismas) . Así, una APP de secuenci ene, por ejemplo, un secuencia de dominio extr ejemplo, formas procesadas empalmadas alternativ sadas proteolíticamente) y variantes alélica ntan de manera estable en la naturaleza. Las va ueden incluir fragmentos o mutantes de cancela e secuencia natural .

Los polipéptidos de APP útiles en modalida ción incluyen aquellos descritos anteriormen entes ejemplos no limitantes. Estas formas il n ser seleccionadas para uso en varias modalida ción. En algunas modalidades de la inven éptido ¦ de APP comprende una isoforma de APP tud tales como las isoformas APP695 y/o APP75i adas en las Figuras IB-ID. En otras modalida ción, el polipéptido de APP comprende una sada post-traduccionalmente de APP, por ej 6 (4) : 327-31) , un tipo II de cobre (véase, po et al., FEBS Letters 349 (1) : 109-116 (1994)) o idor de proteasa de Kunitz (véase, por ejemplo Nature; 331 ( 6156) : 525-7 (1988)) . En algunas moda nvención, el polipéptido de APP incluye una vada que comprende un epítopo reconocido onista de DR6 revelado en la presente tal uerpo o inmunoadhesina de DR6, por ejemplo amino e APP695 , una secuencia que comprende el epítop el anticuerpo monoclonal 22C11 (véase, por ejemp ., J. Biol. Chem. 268(35) : 26571-26577 (1993)) .

En ciertas modalidades de la inven éptido de APP no comprende uno o más dominios o ífieos, por ejemplo un polipéptido de APP que os aminoácidos N-terminales o C- terminales (po olipéptido de N-APP humano recombinante humano r ios o secuencias, por ejemplo un polipéptido d ende un ectodominio N-terminal (o por lo menos u mismo que se observa que está enlazado por un a R6 tal como un anticuerpo monoclonal 22C11) p io o secuencia que es C-terminal a uno o más ión de secretasa tal como un secuencia beta ta) (por ejemplo, sAPPa o sAPPp) .

El término wdominio extracelular" "ectod " se refiere a una forma de APP, que está ese e de dominios de transmembrana y dominios cito ariamente, el ECD soluble tendrá menos de 1% ios de transmembrana y citoplásmicos , y prefer á menos de 0.5% de tales dominios. Se compre squier dominios de transmembrana identificado éptidos de la presente invención son identif do con criterios usados sistemáticamente en el PP como es definido posteriormente en la pres por lo menos aproximadamente 80%, preferiblemen aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, riblemente por lo menos aproximadamente 90%, 94%, más preferiblement por lo menos aproximada 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de a una APP humana que tiene una secuencia de a ada en las Figuras IB-ID, o un fragmento solu , o un dominio extracelular soluble de la mis ntes incluyen, por ejemplo, polipéptidos de APP, más residuos de aminoácidos son agregados a, o término N o . C de las secuencias de plena l ncias maduras de las Figuras IB- ID, o polipépti onde uno o más residuos de aminoácidos son ins lados de la secuencia interna o dominios del po s que se incluyen variantes de otra especie, pe tor de DR6 humano es una proteína de 655 a e Figura 1A-2) que tiene una secuencia de señal oácidos 1-41) ,. un dominio extracelular (aminoá ' un dominio de transmembrana (aminoácidos do por un dominio citoplásmico (aminoácidos 370 no "receptor de DR6" cuando es usado en la prese tor de secuencia natural y variantes de recept nos abarcan el receptor de DR6 expresado en un míferos, incluyendo humanos. El receptor de DR6 sado endógenamente como ocurre naturalmente dad de linajes de tejido humano, o puede ser nte métodos recombinantes o sintéticos. Un nr e secuencia natural" comprende un pplipeptido qu secuencia de aminoácidos como un receptor de DR naturaleza. Así, un receptor de DR6 de secuenc tener la secuencia de aminoácidos del receptor a estable en la naturaleza (por ejemplo nativamente empalmadas) y variantes alélicas ntan de manera estable en la naturaleza. Las va tor pueden incluir fragmentos o mutantes de c eceptor de DR6 de secuencia natural.

El término "dominio extracelular" o WECD" forma de receptor de DR6 , que está esencialment ios de transmembrana y dominios cito ariamente, el ECD soluble tendrá menos de 1% ios de transmembrana y citoplásmicos , y prefer á menos de 0.5% de tales dominios. Se compre squier dominios de transmembrana identificados éptidos de la presente · invención son identif do con criterios empleados sistemáticamente e identificar aquel tipo de dominio hidrofó eras exactas de un dominio de transmembrana pue imadamente 85%, 86%/ 87%, 88%, 89%, más prefe lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, riblemente por lo menos aproximadamente 95%, 96%, de identidad de secuencia de aminoácidos con tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostr a 1A, o un fragmento soluble de la misma, o u celular soluble de la misma. Tales variantes inc ío, polipéptidos de DR6 en donde uno o más re ácidos son agregados a, o cancelados del término secuencias de plena longitud o secuencias madu a 1A, o polipéptidos de DR6 en donde uno o más r ácidos son insertados o cancelados de la se ios internos del polipéptido, incluyendo var especie, pero excluye un polipéptido de DR6 de al. Opcionalmente, la variante de DR6 comprende le del receptor de DR6 que comprende los aminoác señales intracelulares o rutas de se celulares en células o tejido neuronal, ya sea tu, in vivo o ex vivo. A manera de ejemplo, un a R6 puede bloquear parcial o plenamente, i alizar la habilidad del receptor de DR6 para acti señales intracelulares o rutas de se celulares en células neuronales o tejido neuron resultado apoptosis o muerte celular en las o neuronal. El antagonista de DR6 puede ac ear parcial o plenamente, inhibir o neutra nte una variedad de mecanismos, en los que se in mitados a, bloquear, inhibir o neutralizar el e do cognato a DR6 , formación de un complejo entre do cognato (por ejemplo, APP) , oligomeriz tores de DR6, formación de un complejo entre el 6 y co-receptor heterólogo, enlace de un ligand iores de DR6 (dímeros, agregados) o formas de opolímeros de DR6, moléculas pequeñas ta idores farmacológicos de la cascada de señali incluyendo inhibidores de molécula pequeña y pép idad de JNK de cinasa N-terminal de Jun, i cológicos de actividades de cinasas de proteína funcionan corriente arriba de JNK en la ducción de señal, inhibidores farmacológicos del la proteína de andamio JIP-1, inhibidores farm lace de JNK a sus sustratos tales como c-Jun o ctor de transcripción de AP-1, inhibidores farm osforilación moderada por JNK de sustratos t do de dominio de enlace de JNK (JBD) y/o dominio strato de JNK y/o inhibidor de péptido que compr osforilación de sustrato de JNK, moléculas peq ean el enlace de ATP a JNK, y moléculas peq rovascular/isquemia cerebral, en modelos in medades neurodegenerativas, tales como modelos d medad de Parkinson; modelos de ratón de enfe imer; modelos de ratón de esclerosis lateral a modelos de ratón de atrofia muscular espinal SM tón/rata de isquemia cerebral focal y global, po o de oclusión de arteria carótida común o m ión de arteria cerebral media; o cultivos d o ex vivo. Los varios análisis se pueden llevar tos de análisis in vitro o in vivo conocidos, t ibe posteriormente en la presente o como es cono y descritos en la literatura (Véase, por ejempl l., Trends in Genetics, 22:281-289 (2006); Flemi Rx, 2:495-503 (2005); Wong et al., Nature Neu -639 (2002)). Una modalidad de un análisis para antagonista de DR6 bloquea parcial o plenamente, Por ejemplo, ácido nucleico cromosomal, mit y/o bacteriano presente en muestra de tejido. o nucleico" abarca ya sea una u otra o ambas heb ula de ácido nucleico de doble hebra e incluye entó o porción de una molécula de ácido nucleico ¾Gen" significa cualquier secuencia de ácid ción de la misma con un papel funcional en la co nscripción de una proteína o regulación de otra ica. El gen puede consistir de todos los ácidos nsables por codificar una proteína funcional o orción de los ácidos nucleicos responsables por presar una proteína. La secuencia de ácido nucl ner una anormalidad genética dentro de exones, iones de inicio o terminación, secuencias de secuencias reguladoras o regiones adyacentes D ácido aspártico lie I isoleuci T treonina Leu L leucina S serina Tyr Y tirosina E ácido glutámico Phe F fenilala P prolina His H histidin G glicina Lys K lisína A alanina Arg R arginina C cisteína Trp W triptófa V valina Gln Q glutami M metionina Asn N asparagi En las figuras, se pueden emplear otra naciones de una sola letra o de tres letras para entificar dos o más aminoácidos o nucleótido ináceos . En modalidades preferidas, el péptido purificado (1) a un grado suficiente para obten 15 residuos de secuencia de aminoácido N-t na mediante el uso de un secuenciador de ifugación, o (2) a homogeneidad mediante SDS-ciones no reductoras o reductoras utilizando ssie o preferiblemente, teñido de plata eneidad mediante técnicas espectroscopicas más de péptido. El material aislado incluye ína in situ dentro de células recombinantes , o menos un componente de su medio ambiente n á presente. Ordinariamente, sin embargo, el ína aislado será preparado mediante por lo menos rificación . wPor ciento (%) de identidad de sec ácidos" con respecto a las secuencias identific as que están dentro de la habilidad de imentados en el arte pueden determinar iados para medir la alineación, incluyendo algo ación necesarios para obtener la alineación máxi ncías de plena longitud que son comparadas. Por a presente, los valores de por ciento de ide ácidos pueden ser obtenidos utilizando el pr tadora de comparación de secuencias, ALIGN-2, c enentech, Inc. y el código fuente del cual ntado con documentación del usuario en la o hos Reservados de los Estados Unidos de ngton, DC, 20559, registrado bajo el No. TXU5 tro de Derechos Reservados de los Estados ea. El programa ALIGN-2 está disponible públic de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, CA. etros de comparación de secuencia son estableci cocerse cuando hebras complementarias están pre dio ambiente menor que su temperatura de fusión, alto es el grado de identidad deseado entre la s ncía hibridizable, más alta será la temperatur puede ser usada. Como resultado, se sigue raturas relativas más altas tenderán a ciones de reacción más severas, mientras raturas más bajas menos. Para detalles y e onal de severidad de, reacciones de hibridizaci el et ' al . , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOL science Publishers, (1995) .

"Condiciones de alta severidad", como se resente, son identificadas por aquellas que: (1 fuerza iónica y alta temperatura para el lavad odio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil al 0.1% a 50°C; (2) emplean durante la hibrid odio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C n lavado de alta severidad que consiste de SSC ene EDTA a 55°C.

"Condiciones moderadamente severas" pu ificadas como se describe por Sambrook et al., NG: A LABORATORY MANUAL , New York: Cold Spri , 1989, e incluyen incubación durante toda la no a solución que comprende: formamida al 20%, SSC M, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio , solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrana g/ml de ADN de esperma de salmón sometido a nte desnaturalizado, seguido por lavado de los 1 x a una temperatura de aproximadamente 37 °C co experimentado reconocerá como ajustar la te a iónica, etc. como sea necesario para compensa como longitud de sonda y los semejantes. dificacion enlazado operativamente en un organis cular. Las secuencias de control que son apropi riontes, por ejemplo, incluyen un promotor, opc secuencia de operador, y un sitio de enlace de células eucariónticas son conocidas por tores, señales de poliadenilacion y mejoradores.

El ácido nucleico está "'enlazado opera o está colocado en una relación funcional ncia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para ncia o líder secretorio es enlazado operativame un pol.ipéptido si es expresado como una pre-pr cipa en la secreción del polipéptido; un p ador está enlazado operativamente a una sec icación si afecta la transcripción de la secuen de enlace de ribosoma está enlazado operativam ncia de codificación si está colocado para fac efiere a un compuesto o composición que es co nado directa o indirectamente a un reactivo tal de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la reactivo al cual es conjugado o fusionado. El por sí mismo ser detectable (por ejemplo, mar isótopo o marcadores fluorescentes) o, en el c dor enzimático, puede catalizar la alteración mpuesto o composición de sustrato que es detecta Como se usa en la presente, el noadhesina" designa moléculas semejantes a anti nen la especificidad de enlace de una proteína "ad esina") con las funciones efectoras de antes de inmunoglobulina . Estructuralmen oad esinas comprenden una fusión de una sec ácido con la especificidad de enlace desead ente del sitio de reconocimiento y enlace de a *Anticuerpo receptor de DR6", "anticuerpo cuerpo anti-DR6" es usado en un sentido am irse a anticuerpos que se enlazan a por lo menos receptor de DR6, preferiblemente un recepto o, tal como la secuencia de DR6 mostrada en la F secuencia de dominio extracelular de l nalmente, el anticuerpo de DR6 es fusionado o secuencia o molécula heteróloga. Preferibl ncia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo ejos de orden superior o complejos oligomé no "anticuerpo anti-DR6" y sus equivalentes gr an específicamente los anticuerpos monoclonales itos en la sección de ejemplos a con nalmente, el anticuerpo de DR6 se enlaza al r pero no se enlaza o reacciona de manera cr uier receptor adicional de la familia del rmas de polipéptidos de APP descritas específi resente. Preferiblemente, el anticuerpo de A uerpo antagonista de DR6. Por ejemplo, en los mé cación y/o identificación de antagonistas de DR an en la presente, una o más isoformas de AP ón de las mismas pueden ser usadas como inmun izar un animal (por ejemplo, un ratón como pa so para generar un anticuerpo monoclonal) y/o seleccionar una biblioteca de compuestos (por ej oteca de anticuerpos recombinante) . Polipéptid os útiles en modalidades de la invención inc Íentes ejemplos no limitantes. Estas formas il n ser seleccionadas para uso en varias modalida ción. En algunas modalidades de la inve éptido de APP comprende una isoforma de APP tud, tales como las isoformas APP695 y/o APP75i ., FASEB J. 2003; 17 (12 ): 1739-41 ) , un dominio de iña (véase, por ejemplo Rossjohn et al., Wat . 1999 Apr; 6 ( ) : 327-31 ) , un dominio tipo II e, por ejemplo Hesse et al., FEBS Letters 349(1) ) ) o un dominio inhibidor de proteasa de uni ejemplo Ponte et al., Nature; 331 { 6156 ): 525-7 ( as modalidades de la invención, el polipépti ye- una secuencia observada que comprende u ocido por un antagonista de DR6 revelado en la como un anticuerpo o inmunoadhesina de DR6 , po ácidos 22-81 de APP695 , una secuencia que coi po enlazado por el anticuerpo monoclonal 22C11 ( lo, Hilbich et al., J. Biol. Chem. , 268(35): 2 )). En ciertas modalidades de la invención, el p APP no comprende uno o más dominios o Ífieos, por ejemplo un polipéptido de APP que idades de la invención comprenden uno o más d ncias pero no otros dominios o secuencias, por éptido de APP que comprende un ectodominio N-te o menos una porción del mismo que se observ ado por un antagonista de DR6 tal como el lonal 22C11) pero no un dominio o secuencia nal a uno o más sitios de escisión de secretasa, secuencia beta amiloide (Abeta) (por ejemplo, ) . Opcionalmente, el anticuerpo anti-APP in e del polipéptido de APP a DR6 y se enlaz éptido de APP a concentraciones de 10 µg ml a se describe en la presente, y/o como es med sis de enlace a base de célula cuantitativo .

El término "anticuerpo" en la presente es u do más amplio y cubre específicamente a lónales intactos, anticuerpos policlonales , a anticuerpo de una sola cadena; y a especí fieos formados a partir de fragmentos de an "Anticuerpos naturales" son usualmente glic rotetraméricas de aproximadamente 150,000 estas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y do as (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlaz a pesada mediante un enlace de disulfuro ras que el número de enlaces de disulfuro varia as pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobu a pesada y ligera también tiene puentes de dis cadena espaciados regularmente. Cada cadena pes extremo un dominio variable (VH) seguido por un ios constantes. Cada cadena ligera tiene u ble en un extremo (VL) y un dominio constante e mo; el dominio constante de la cadena ligera est el primer dominio constante de la cadena pesa ibuida igualmente en todos los dominios var uerpos. Está concentrada en tres segmentos nes hipervariables o regiones que deter ementaria tanto en la cadena ligera como en los bles de cadena pesada. Las porciones más rvadas de los dominios variables son llamadas la tructura (FR) . Cada uno de los dominios variabl as pesadas y ligeras naturales comprenden cuatr an extensamente una configuración de hoja nte tres regiones hipervariables, que forman y en algunos casos forman parte de la estructu s regiones hipervariables en cada cadena son ntamente en proximidad estrecha mediante las FRs nes hipervariables de la otra cadena, contrib ción del sitio de enlace de antígeno de anticuerp et al . , SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMU OLOGICAL agmento de "Fe" residual, cuyo nombre refleja su cristalizar rápidamente. El tratamiento co ce un fragmento de F(ab' )2 Que tienen dos sitios itígeno y es todavía capaz de reticulación de antí "Fv" es el fragmento de anticuerpo m ene un sitio de reconocimiento de antígeno y e de antígeno completo. Esta región consiste de dominio variable de cadena pesada y un domini adena ligera en fuerte asociación no covalente. iguración en que las tres regiones hipervariable io variable interactúan para definir un sitio de eno sobre la superficie del dímero ctivamente, las seis regiones hipervariables ificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Si n solo dominio variable (o la mitad de un Fv que ente tres regiones hipervariables específicas uerpo. Fab'-SH es la designación en la presente cual el (los) residuo (s) de cisteina de los antes lleva por lo menos un grupo libre entos de anticuerpo de F(ab')2 originalmen cidos como pares de fragmentos de Fab' q ínas de engozne entre ellos. Otros acoplamiento agmentos de anticuerpo también son conocidos.

Las "cadenas ligeras" de a noglobulinas) de cualquier especie de vertebra signadas a uno de dos tipos claramente distintos, (K) y lambda (?) , en base a las secuencias de a s dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoá io constante de sus cadenas pesadas, los a n ser asignados a clases diferentes. Hay cin ipales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, estos dominios están presentes en una sola éptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv s un enlazador de polipéptido entre los dominios ermiten que el scFv forme la estructura desead e de antígeno. Para una revisión de scFv véase he Pharmacology of Monoclonal Antibodies, v burg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, 1994) .

El término "diacuerpos " se refiere a frag uerpo pequeños con dos sitios de enlace de antig entos comprenden un dominio variable de cadena p a un dominio variable de cadena ligera (VL) en a de polipéptido (VH - VL) . Al usar un enlazad iado corto para permitir el apareamiento entr ios en la misma cadena, los dominios son f arse con los dominios complementarios de otra a estable en la naturaleza que pueden estar pr dades menores. Los anticuerpos monoclonales son ífieos, siendo dirigidos contra un solo sitio a s, en contraste con las preparaciones de ncionales (policlonales) que incluyen uerpos diferentes dirigidos contra minantes (epítopos), cada anticuerpo monoe ido contra un solo determinante sobre el antíge su especificidad, los anticuerpos monoclon josos en que son sintetizados por el cultivo de contaminar por otras inmunoglobulinas . El m clonal" indica el carácter del anticuerpo por se a población sustancialmente homogénea de anticue interpretado que requiere la preparación del algún método particular. Por ejemplo, los a lonales a ser usados de acuerdo con la presente íricamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobu cuales una porción de la cadena pesada y/o ica con u homologa a secuencias correspondi uerpos derivados de una especie particular o per clase o subclase de anticuerpo particular, en esto de la (las) cadena (s) es idéntica con u h ncias correspondientes en anticuerpos derivados ié o pertenecientes a otra clase o sub- uerpo, también como fragmentos de tales anticu que exhiban la actividad biológica deseada ounidense No. 4,816,567; Morrison et al., Pr Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los a ricos de interés en la presente incluyen a atizados" que comprenden secuencias de enlace d ominio variable derivadas de un primate no hu ío, mono del viejo mundo, tales como babuino, m cuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o o que tiene la especificidad, afinidad y das . En algunas instancias, los residuos de ctura (FR) de la inmunoglobulina humana son re residuos no humanos correspondientes. Ade uerpos humanizados pueden comprender residuos q trados en el anticuerpo receptor o en el or. Estas" modificaciones son realizadas par onalmente el desempeño del anticuerpo. En ge uerpo humanizado comprenderá sustancialmente to ienos uno, y comúnmente dos, dominios variable s todos o sustancialmente todos los bucles hipe sponden a aquellos de una inmunoglobulina no o sustancialmente todas las FR son aquella ncia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo én comprenderá opcionalmente por lo menos una ón que determina la complementareidad" o " lo, residuos 24-34 <L1), 50-56 <L2) y 89-97 ( io variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50- 2 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Sequences of Proteins of I munological Interest c Health Service, National Institutes of Health, (1991) ) y/o aquellos residuos de un "bucle hipe ejemplo, residuos 26-32 (L-l) , 50-52 (L2) y 91-9 ominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53 01 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . Residuo de "e siduos "FR" son aquellos residuos de dominio rentes a los residuos de región hipervariable en en la presente .

Un anticuerpo "que se enlaza" a un an rés es un apto de enlace a aquel antígeno con af ólogo(s), tal como uno o más agentes citotóxico, nte esto un "inmunoconjugado" .

Un anticuerpo "aislado" es uno que ificado y separado y/o recuperado de un compone ambiente natural. Componentes contaminantes de nte natural son materiales que interferirían co iagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, ir enzimas, hormonas y otros solutos proteiná ináceos . En modalidades preferidas, el anticu icado (1) a mayor de 95% en peso de anticuerpo, termina por el método de Lowry, y más preferibl 9% en peso, (2) a un grado suficiente para obte 15 residuos de secuencia de aminoácido N-t na mediante el uso de un secuenciador de ifugación, o (3) a homogeneidad mediante SDS- ciones reductoras o no reductoras utilizando éptido marcador tiene suficientes residuos para po contra el cual un anticuerpo puede ser elabor er alguna otra función, tal como la habil merizarse (por ejemplo, como ocurre con. pép n dominios de cremallera de leucina) , y toda ientemente corto de tal manera que en ge fiere con la actividad del anticuerpo o polipé éptido marcador de preferencia también es basta tal manera que un anticuerpo marcador-espec iona sustancialmente de manera cruzada con otros éptidos marcadores apropiados tienen en gener seis residuos de aminoácidos y usualmente entre 8 a aproximadamente 50 residuos de a eriblemente, entre alrededor de 10 a aproximad úos) .

Los términos "receptor dé Fe" o "FcR" son u ipalmente en los dominios citoplásmicos de las tor de activación FCYRIIA contiene una po ación a base de tirosina de inmunoreceptor (IT io citoplásmico . El receptor inhibidor FcyRlIB orción de inhibición a base de tirosina de inmu ) en su dominio citoplásmico. (véase Daéron, A ol. 15:203-234 (1997)) . Los FcR son revisados en f Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel omethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. 126:330-41 (1995) . Otros FcR, en los que se íos a ser identificados en el futuro, son abarca no wFcR" en la presente. El término también i tor neonatal, FcRn, que es responsable ferencia de IgG maternas al feto (Guyer et ol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immuno ) ) . Los FcR en la presente incluyen polimorfis efiere ampliamente a compuestos de alcohol pol polioles pueden ser cualquier polímero de poli leno) soluble en agua, por ejemplo, y pueden a lineal o ramificada. Los polioles preferidos los sustituidos en una o más posiciones de hid upo químico, tal como un grupo alquilo que tiene atro átomos de carbono. Comúnmente, el poli (alquilenglicol) , preferiblemente poli (etilenglic mbargo, aquellos experimentados en el arte recon polioles, tales como por ejemplo, poli (propile ímeros de polietileno-propilenglicol, pueden ser zando las técnicas para conjugación descrit nte para PEG. Los polioles incluyen aque idos en el arte y aquellos disponibles publicame de fuentes disponibles comercialmente tales co ration. aciones neurologicas degenerativas o mejorar la élulas o tejido neural dañado y ayudar a res on de nervio apropiada Los términos "que trata", "tratamiento" y se usan en la presente, se refieren a terapia ia profiláctica y terapia preventiva. El trat istración consecutiva se refiere a tratamiento una base diaria sin interrupción en tratamiento días. El tratamiento o administración interm miento o administración de manera intermitente, atamiento que no es consecutivo, sino más bien c aleza .

Como se usa en la presente, el término "a fiere en general a cualquier condición que se be tratamiento con los antagonistas de DR6 descri nte. Esto incluye alteraciones crónicas y aguda ces, neuronas hipocampales en las que se incluy adas a neuronas piramidales de CAI de hipocampo rosencéfalo . El término células o tejido neurona irse a células neuronales que consisten de ar, axón(es) y dentrita(s) , también como a itas que pueden formar parte de tales células ne "Alteración neurológica" es usada en la pre irse a condiciones que incluyen c degenerativas , lesiones de célula o tejido terizadas por disfunción del sistema nervioso férico o por necrosis y/o apoptosis de células ne o neuronal, y los daños de célula o tejido ados con privación de factor trófico. Ej medades neurodegenerativas incluyen esclerosi iar y amiotrófica esporádica (FALS ctivamente) , enfermedad de Parkinson fa cia de cuerpo de Lewy, enfermedad de Pick, enfe ición de trinucleótido, alteración de prion y sí rager. Las lesiones o daños de células o tejido n ocurrir de una variedad de causas difer ometen la sobrevivencia o función apropiada de o neuronal, en los que se incluyen pero no lim n aguda y no aguda de, por ejemplo condiciones estringen (temporal o permanentemente) el flujo en insquemia cerebral global y focal rovascular) ; incisiones o cortes por ejemplo ral o médula espinal; lesiones o placas e nales; privación de factor (es) trófico (s) neces recimiento y supervivencia de células; exp toxinas tales como agentes quimioterapéuticos incidentales a otros estados de enfermedad t medades metabólicas crónicas tales como di re a cualquier mamífero clasificado como mamífer se incluyen humanos, vacas, caballos, perros y modalidad preferida de la invención, el mamíf o . étodos y materiales ejemplares de la invención Estudios previos han examinado el fenómeno ar durante el desarrollo del sistema nervioso (Ha J. Neurosci . , 1:60-71 (1981); Oppenheim, sci., 14:453-501 (1991); O'Leary et al., J. 2-3705 (1986); Henderson et al., Nature, 3 ); Yuen et al., Brain Dev., 18:362-368 (1996)). S erte de células neuronales juega un papel en el /o avance de varias alteraciones neurológicas , rosis lateral amiotrófica familiar y esporádic respectivamente) , enfermedad de Parkinson f imentales para examinar el papel que DR6 puede ador de sobrevivencia de célula neuronal o a neuronal . Las neuronas comisurales son dependi obrevivencia del soporte trófico de uno de sus medios, la placa de piso de la espina dorsal. E plante in vitro, la solicitante encontró que la a expresión de DR6 por la interferencia de ARN eración axonal de las neuronas comisurales. A ónales anti-DR6 fueron también probados en a vivencia de espina dorsal y se determinó que la a señalización del receptor de DR6 por anticu ífieos 3F4.4.8; 4B6.9.7; y 1E5.5.7 impidió la de l de neuronas comisurales en cultivos de ex . DR6 ha sido reportado en la literatura que de la activación de JNK (Pan et al., supra 199 supra 2001) . Así, para investigar los pápel e celular neuronal en desarrollo, la señalizaci loqueada por anticuerpos anti-DR6 en un sistema mbrión entero. Sorprendentemente, la inhibici ización de DR6 mediante ciertos anticuer íficos protegió las neuronas de médula espinal e celular en desarrollo que se presenta natura sistema. Por consiguiente, los antagonistas de anticuerpos antagonistas de DR6, pueden ser reducir la muerte de célula neuronal que aciones neurológicas tales como en degenerativas (por ejemplo, ALS, SMA, enferm imer y Parkinson, FTDP-17, enfermedad de Hunt ente cerebrovascular . Para examinar si DR6 func eceptor pro-apoptótico bona fide in vivo, la s zó fenotipos de embriones bloqueados de DR6 en l rollo E15.5. En línea con los papeles propuest o la hipótesis que la proteína precursora amil papel aunque no plenamente entendido en la enf imer (Selkoe, J". Biol . Chem. 271:18295 (1996); ., Nature Med. 2:864 (1996); Goate, et al., Natu ) ) .

Se cree que los antagonistas de D cularmente útiles en el tratamiento de varias al lógicas . Asír la presente invención provee com onistas de DR6 y métodos para inhibir, b alizar la actividad de DR6 en un mamífero que co istración de una cantidad efectiva de antagonist riblemente, la cantidad de antagonista de DR6 una cantidad efectiva para bloquear la degenerac erte de célula neuronal . Esto se puede llevar a lo, de acuerdo con los métodos descritos posteri esente y en los ejemplos. onales de los polipéptidos de DR6 y APP y anti APP son también descritas.

La invención revelada en la presente sidad de modalidades . La invención provee met ir el enlace de DR6 a APP que comprenden e éptido de DR6 y/o polipéptido de APP a u onistas de DR6 bajo condiciones en donde el enl P es inhibido. Modalidades relacionadas de la . en métodos para inhibir el enlace del polipépti omprende los aminoácidos amino 1-655 de SEQ ID éptido de APP que comprende los aminoácidos 66- : 6 (por ejemplo e???ß) , el método comprende c éptido de DR6 y el polipéptido de APP con un a do que se enlaza a DR6 o APP, en donde el a do es escogido de por lo menos uno de un anticue a a APP, un anticuerpo que se enlaza a a de hibridoma depositada como número de acces 095, PTA-8094, o PTA-8096, respectivamen éptido de DR6 soluble que comprende los aminoáci Q ID NO: 1 (por ejemplo, una inmunoadhesina de uerpo que se enlaza a APP (por ejemplo, lonal 22C11) . En ciertas modalidades de la inve onista de DR6 es un anticuerpo que se enlaz uerpo que se enlaza a APP o polipéptido de DR6 s enlazado a uno o más polímeros no pr cionados del grupo que consiste de polieti ropilenglicol y polioxialquileno .

En modalidades opcionales de estos mét éptido de DR6 es expresado sobre la superficie o más células mamíferas (por ejemplo, célula d ural, una célula de neurona sensorial o una célu z) y el enlace del uno o más antagonistas de DR6 as neuronales puede ser problemática debido a la tales células a sufrir apoptosis. Algunos nales, por ejemplo mueren en ausencia de factore como factor de crecimiento de nervio. La ista en la presente muestra que los antagonist en ser usados en tales cultivos de célula neu rar el crecimiento celular y/o regenera evivencia, por ejemplo de manera semejante al uso recimiento de nervio en tales cultivos .

En modalidades adicionales de la invenció inhibir el enlace de DR6 a APP se pueden llevar en un mamífero - que tiene una condición o lógica. Opcionalmente, la condición o ológica es esclerosis lateral amiotrófica, enfe inson, enfermedad de Huntington o enfermedad de rnativamente, la condición o alteración n éptido de DR6 soluble que comprende los aminoá EQ ID NO: 1, y un anticuerpo que se enlaza idades opcionales de la invención, la co ación neurológica es esclerosis lateral am medad de Parkinson, enfermedad de Huntington o lzheimer. Alternativamente, la condición o lógica comprende lesión de célula o tejido ne ente cerebrovascular , trauma a tejido cerebral o al o lesiones en tejido neuronal. En varias moda nvención, uno o más agentes terapéuticos adicio istrados al mamífero. En ciertas modalidades il a invención, el uno o más agentes terapéuticos a seleccionados de NGF, un inhibidor de apop idor de EGFR, un inhibidor de ß-secretasa, un in retasa, un inhibidor de colinesterasá, un anticu y un antagonista de receptor de NMDA. Opciona lonadas de la invención proveen métodos para det omposición modula el enlace entre un polipépti comprende los aminoácidos l-655de SEQ ID N nalmente aminoácidos l-354de SEQ ID NO: éptido de APP que comprende los aminoácidos 66-O : 6 (por ejemplo APP695, sAPP o sAPPp) , ende combinar la composición con DR6 y APP rar el enlace entre DR6 y APP en presenci sición con el enlace entre DR6 y APP en ausen sición; para determinar si la composición modula DR6 y APP. Opcionalmente, las diferencias en métodos son medidas vía una tecnología de reso ón superficial (SPR) (por ejemplo, como está disp re Life Sciences) . Modalidades de la invención s una molécula de interés que es identificada d stos métodos.

P que difiere de la afinidad observada de la se éptido de DR6 de SEQ ID NO: i .Modalidades relaci vención incluyen métodos para determinar si una olipéptido de DR6 que comprende los aminoácidos D NO: 1 está presente en un mamífero, el método rar la secuencia de un polipéptido de DR6 expr SEQ ID NO: 1 en el mamífero para determina nte de polipéptido de DR6 está presente en el as modalidades de estos métodos pueden incluir onal de identificar una variante de polipéptido estar presente en un mamífero como una variante P, en donde una variante de enlace de APP es car ener una afinidad de enlace por un polipéptido d rsora amiloide (APP) que comprende los aminoáci EQ ID NO: 6 (por ejemplo APP695/ sAPPa o e???ß ente de la afinidad de enlace del polipéptido d ermedad de Alzheimer.

Además de los polipéptidos de DR6 y APP de al de plena longitud descritos en la pres mpla que se pueden preparar variantes de polip /o APP. Las variantes de DR6 y/o APP pueden ser ntroducir cambios de nucleótidos apropiados a icación y/o mediante síntesis del polipéptido íos experimentados en el arte apreciarán que IO inoácidos pueden alterar procesos post-traducci éptido de DR6 yl APP, tal como cambiar el ión de sitios de glicosilación o alt terísticas de afianzamiento de membrana.

Las variaciones en los polipéptidos de DR itos en la presente se pueden hacer, por zando cualquiera de las técnicas y directr iones conservadoras y no conservadoras resu tuido o cancelado sin afectar adversamente la da pueden ser encontradas al comparar la secu éptido de DR6 con aquella de moléculas de idas homologas y minimizar el número de c ncía de aminoácidos efectuados en regiones ogia. Las sustituciones de aminoácido puede tado de reemplazar un aminoácido con otro amin propiedades estructurales y/o químicas simil el reemplazo de una leucina con una serina, lazo de aminoácidos conservadores. Las inse laciones pueden, opcionalmente estar en el int imadamente uno a cinco aminoácidos . La variación ser determinada al hacer sistemáticamente in laciones o sustituciones de aminoácidos en la s r las variantes resultantes en cuanto a onista de DR6 y/o APP. ncionales . Los fragmentos de péptido deseados tizados químicamente. Un procedimiento a ucra generar fragmentos de polipéptido mediante ática, por ejemplo mediante el tratamiento de l una enzima que se sabe que escinde proteínas idos por residuos de aminoácido particulares o gestión el ADN con sitios de restricción apr r el fragmento deseado. Todavía otra técnica ucra aislar y amplificar un fragmento de ADN qu ragmento de polipéptido deseado, mediante re a de polimerasa <PCR) . Los oligonucleótidos q érminos deseados del fragmento de ADN son emplea ores 5' y 3' en la PCR.

En modalidades particulares, sus rvadoras de interés son mostradas en la nuación bajo el encabezado de sustituciones pref o Original Sustituciones Ejemplares Sustituciones Pre a (A) val; leu; ile val rg (R) lys; gln; asn lys sn (N) gln; his; lys; arg gln sp (D) glu glu ys (C) , ser ser ln (Q) asn asn lu (E) asp asp ly .(G) pro; ala ala is (H) asn; gln; lys; arg arg ie (I) leu; val; met; ala; phe; leu norleucine eu (L) norleucina; ile; val; met; ile ala; phe ys (K) arg ; gln ; asn arg ficativamente en su efecto en mantener (a) la a cadena fundamental del polipéptido en el ár tución, por ejemplo, como una conformación d rmación helicoidal, (b) la carga o hidrofobici ula en el sitio objetivo o (c) el globlal de al. Los residuos que se presentan de manera esta aleza son divididos en grupos en base a propi a lateral comunes : idrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; idrofílieos neutros: cys, ser, thr; cidos: asp, glu; ásicos: asn, gln, his, lys, arg; residuos que influencian la orientación de cad y romáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras Res., 10:6487 (1987)), mutagenesis de cassette Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis de sele icción (Wells et al., Philos. Trans . R. Soc. Lo 15 (1986)) y otras técnicas conocidas pu uadas sobre el ADN clonado para producir el AD lipéptidos de DR6.

El análisis de aminoácido de barrido pued empleado para identificar uno o más aminoácidos secuencia contigua. Entre los aminoácidos d ridos están los aminoácidos neutros reí ños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, ína. La alanina es comúnmente un aminoácido d rido entre este grupo debido a que elimina al más allá del carbono beta y es menos pro e la conformación de cadena principal de la ingham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1 también puede ser sustituido, en general con se ar la estabilidad oxidante de la molécula ulación aberrante. Inversamente, se pueden e(s) de cisteína al polipéptido de DR6 y/o ar su estabilidad.

Modalidades de la invención reveladas en l plican a una amplia variedad de polipéptidos d as modalidades de la invención, por ejemplo un rma de APP 695, 750 o 770de plena longitud mostr as IB-ID. En otras modalidades de la invenció ende una porción n-terminal de APP que ominio de APP y que es producido a partir de un samiento post-traduccional (por ejemplo sAPPa nalmente, por ejemplo un APP puede comprender le de una de las isoformas de APP 695, 750 ta de la escisión de una secretasa, por ejemplo n que contiene el epítopo 22C11 (véase, po ich, J. Biol.Chem. 268 (35 ) : 26571-26577 (1993) ) .

La descripción a continuación es co ipalmente con la producción de polipéptidos de D ltivar células transformadas o transíectadas con contiene el ácido nucleico que codifica el poli Por supuesto, se contempla que métodos alternat bien conocidos en el arte, pueden ser emple rar los polipéptidos de DR6 y/o APP. Por ej ncía de aminoácidos apropiada o porciones de ser producida mediante síntesis de péptid zando técnicas en fase sólida (véase, por ejem al., SOLID- PHASEPEPTIDESYNTHESIS, W.H. Freeman isco, CA (1969) ; Merrifield, J. Am. Chem. Soc, (1963) ) . La síntesis de proteína in vitro uada utilizando técnicas manuales o icadas de DR6 y/o APP y/o anticuerpos de DR6 y/o miento de ADN cjue codifica polipéptidos de DR6 y/ El ADN que codifica el polipéptido de DR ser obtenido de una biblioteca de cADN preparad jido que se cree posee el mARN del polipéptido D expresa a un nivel detectable. Así, el ADN de p R6 y/o APP humano- puede ser obtenido convenient iblioteca de cADN preparada a partir de tejido que codifica el polipéptido de DR6 y/o APP pued obtenido de una biblioteca genómica o dimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, sí nucleico automatizada) .

Las bibliotecas pueden ser seleccionadas c s como oligonucleótidos de por lo menos aprox bases) diseñadas para identificar el gen de int Técnicas para seleccionar una biblioteca de conocidas en el arte. La secuencias de oligo cionadas como sondas deben ser de longitud suf ientemente no ambiguas de tal manera que los S son minimizados. El oligonucleotido es prefe do, de tal manera que puede ser detectado desp dización a ADN en la biblioteca que es sel os de marcación son bien conocidos en el arte e o de radiomarcadores como ATP 32P-marcado, bioti ción enzimática. Las condiciones de hibridizació se incluyen severidad moderada y alta sever stas en Sambrooket al., supra.

Las secuencias identificadas en tales m ción de biblioteca pueden ser comparadas y aliñ secuencias conocidas depositadas y disponibles tos públicas tales como GenBank u otras bases de es necesario, utilizando procedimientos de ext or convencionales como se describe en Sambro , para detectar precursores e intermedi samiento de mAR que pueden no haber sido t samente a cADN. ción y transformación de células huésped Las células huésped son transíectadas o tra ectores de expresión o clonación descritos en l la producción del polipéptido de DR6 y/o APP y edios nutrientes convencionales modificados iado para inducir promotores, seleccionar transf ficar los genes que codifican las secuencias des ciones de cultivo, tales como medios, temperat semejantes, pueden ser seleccionadas por el imentado sin experimentación indebida. En gen eas estándar apropiadas para tales células. El t alcio que emplea cloruro de calcio, como se d ooket al., supra, o electroporación es en gen procariontes . La infección con Agrobacteriumtum para transformación de ciertas células de pla escribe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y W icado el 29 de junio de 1989. Para células mam S paredes celulares, el método de precipitación alcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-e ser empleado. Aspectos generales de transfec ema huésped de célula mamífera han sido descri te estadounidense No. 4,399,216. Las transfor dura se llevan a cabo comúnmente de acuerdo con an Solingenet al., J. Bact., 130:946 (1977) yHs . Nati. Acad. Sci . USA, 76:3829 (1979) . Sin emba os para introducir ADN a células, tales como riontes apropiados incluyen pero no están li teria, tales como organismos gram-negativo ivo, por ejemplo, enterobacteriaceae tal como s cepas de E. coli están disponibles públicame cepa MM294 K12 de E. coli (ATCC 31,446); E. c 31,537); E. colistrain W3110 (ATCC 27,325) a 53,635). Otras células huésped procarionticas yen enterobacteriaceae tales como Escherichia, , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, S , Salmonella typhi urium, Serratia, tiamarcescans, yShígella, también como baci . subtilis and B. licheniformis (por eniformis 41P revelado en DD 266,710 publicado de 1989) , Pseudomonastales como P. aerugi tomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en tantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped 4) , que tiene el genotipo completo onA ptr3 -lac)169 degPompTkaif; E. coli W3110 cepa 37D6, notipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 ilvGkanr; E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cep utación de cancelación de deg no resistente a ca cepa de E. coliq e tiene proteasa periplásmic ada en la patente estadounidense No. 4,946,783, de agosto de 1990. Alternativamente, métodos in ción, por ejemplo PCR u otras reacciones de pol nucleico son apropiadas.

Además de los procariontes, bioseucariónticos tales como hongos filame ura son huéspedes de clonación o expresión aprop res que codifican el polipéptido aromycescerevisiaees un microorganismo ióntico inferior usado comúnmente. Otros K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichiapas 70; Sreekrishnaet al . , J. Basic Microbiol . , )); Candida; Trichodermareesia (EP sporacrassa (Case et al . , Proc. Nati. Acad. 59-5263 (1979)); Schwanniomyces chwánniomycesoccidentalis (EP 394,538 publicada re de 1990) ; yhongos filamentosos tales c loNeurospora , Penicillium, Tolypocladium (WO cada el 10 de enero de 1991) , y hués gillustales comoA. nidulans (Ballanceet al., ys. Res. Commun. , 112:284-289

[1983]; Tilburnet 5-221

[1983]; Yeltonet al., Proc. Nati. Acad. 1470-1474 (1984)) and A. niger (Kelly and Hynes, -479 (1985)). Levaduras metilotrópicas son apr resente e incluyen pero no están limitadas a lev recimiento sobre mentanol seleccionada de los optera Sf9, también como células de plantas, t VOS celulares de algodón, maíz, patata, soya, e y tabaco. Numerosas cepas vaculovirales y va as huésped de insectos permisivas correspond edes tales como Spodopterafrugiperda (oruga ti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , ogaster (mosca de fruta) y Bo byxmori ificados. Una variedad de cepas virales para tr disponibles públicamente, por ejemplo la variant raphacalifornica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyxmo virus pueden ser usados como el virus en la pr do con la presente invención, particularme feccion de células de Spodopterafrugiperda.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en c brados y la propagación de células de verte vo (cultivo de tejido) se ha -convertido as de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); -células d verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; c noma cervical humanas (HELA, ATCC CCL 2); célula o (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas ( 75); células de hígado humanas (Hep G2 , HB 806 io de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; cé eret al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 as MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma h Las células huésped son transformadas res de expresión o clonación descritos anterior roducción del polipéptido de DR6 y/o APP y cul s nutrientes convencionales modificados como sea inducir promotores, seleccionar transfor ficar los genes que codifican las secuencias dés rocedimientos . En general, el ADN es insertado (s) de endonucleasa de restricción apropiados cas conocidas en el arte. Los componentes yen en general, pero no están limitados a, uno secuencia de señal, un origen de replicación, marcadores, un elemento mejorador, un promot ncia de terminación de transcripción. La const res apropiados que contienen uno o más nentes emplea técnicas de ligación estándar idas para el técnico experimentado.

El DR6 y/o APP puede ser producido recombi olo directamente, sino también como un polip n con un polipéptidoheterólogo., que puede ncia de señal u otro polipéptido que tiene un ión específico en el término N de la proteína éptido. En general, la secuencia de señal pue os son descritos en la patente estadounid ,182) o líder de fosfatasa ácida, el líder de gl albicans {EP 362,179 publicada el 4 de abril de ñal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de 990.En la expresión de célula mamífera, se pu ncias de señal mamíferas para dirigir la secrec ína, tales como secuencias de señal de po tados de la misma especie o especie relacionada líderes secretorios virales.

Tanto los vectores de expresión como . de enen una secuencia de ácido nucleico que permi r se replique en una o más células huésped sele secuencias son bien conocidas para una va rias, levaduras y virus. El origen de replic ido pBR322 es apropiado para la mayoría de bacte ivas, el origen de plásmido 2µ es apropiado par ejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alani bacilos.

Un ejemplo de marcadores seleccionables células mamíferas son aquellos que per ificación de células competentes para tomar ico que codifica el polipéptido de DR6 yl APP, o timidinacinasa . Una célula huésped apropiada a DHFR tipo silvestre es la línea de célul íente en actividad de DHFR, preparada y propagad ibeporUrlaubet al . , Proc. Nati. Acad. Sci . USA ) . Un gen de selección apropiado para uso en l en fcrpl gene presente en el plásmido de leva chcombet al., Nature, 282:39 (1979); Kingsmanet (1979); Tschemperet al., Gene, 10:157 (1980)). provee un marcador de selección por una cepa ura que carece de la habilidad para crecer en t g et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddelet al . 44 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de p ófano (trp) (Goeddel, Nucí. Acids Res., 8:4057 6) , y promotores híbridos tales como el promot eret al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 tores para uso en sistemas bacterianos también ecuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada oper N que codifica el polipéptido de DR6 y/o APP.

Ejemplos de secuencias de promoción apropi on huéspedes de levadura incluyen los promotore hoglycerato cinasa (Hitzemanet al., J. Bio 073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hesse Enzyme Reg. , 7:149 (1968); Holland, Biochemistr )), tales como enolosa, gliceraldehído drogenasa, hexocinasa, piruvatodeca fructocinasa, glucosa-6-fosfato isómeras sa y galactosa. Vectores y promotores apropiados xpresión de levadura son descritos adicionalme 7.

La transcripción del polipéptido de DR6 y res en células huésped mamiferas es contro ío por promotores obtenidos de los genomas de v virus de polioma, virus de fowlpox (UK 2,211,504 de julio de 1989), adenovirus (tal como adeno de papiloma bovino, virus de sarcom egalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B (SV40) , de promotores mamíferos heterólogos, p romotor- de actina o un promotor de inmunoglobu tores de choque térmico, a condición de tores sean compatibles con los sistemas de célul La transcripción de un ADN que cod éptido de DR6 y/o APP por eucariontes superiores ejorador del promotor prematuro de citomegalo ador de polioma sobre el lado posterior del cación y me oradores de adenovirus. El mejorador mado al vector en una posición 5' o 3' a la sec ica el polipéptido de DR6 y/o APP, p riblemente ubicado en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión usados en célula iónticas (levadura, hongos, insectos, plantas, os o células nucleadas de otros organismos multi én contendrán secuencias necesarias para la term cripción y para estabilización del mAKN. Tales disponibles comúnmente de las regione onalmente regiones sin traducir 3 ' de ucariónticos o virales. Estas regiones contienen cleótidos transcritos como fragmentos poliadenil on sin traducir del mARJST que codifica el polip vo de las células huésped Las células huésped usadas para pro éptido de DR6 yl APP de esta invención p vadas en una variedad de medios. Medios d cialmente tales como FIO de Ham's (Sigma) , medi o ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), ymedio icado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son apropi var las células huésped. Además, cualquiera de itos en Hamet al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barn Biochem. 102:255 (1980), patentes estadounide ,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,12 430; WO 87/00195; o Re. 30,985 pueden ser us s de cultivo para las células huésped. Cualquier s pueden ser complementados como sea nece nas y/u otros factores de crecimiento (t ina, transferina o factor de crecimiento ep íos experimentados en el arte. Las condiciones d como temperatura, pH y los semejantes, son s previamente con la célula huésped selecció sión y serán evidentes al técnico ordi imentado . ción de amplificación/expresión genética La amplificación y/o expresión genética a en una muestra directamente, por nteSouthernblotting convencional, Northern l ificar la transcripción de mARN(Thomas, Proc. N USA, 77:5201-5205 (1980) ) , inmunoabsorción SÍS de ADN) o hibridización in situ, utilizando da apropiadamente, en base en la secuencias pr resente. Alternativamente, se pueden emplear a ueden reconocer dúplex específicos, en los que s vo celular o fluidos corporales, para c tamente la expresión del producto genético. A s para teñido inmunoisoquímico y/o análisis de ra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales preparados en cualquier mamífero. Convenientem uerpos pueden ser preparados contra un polipépti ecuencia natural o contra un péptido sintético secuencias de DR6 provistas en la presente ncía exógena fusionada a ADN de DR6 y que co po de anticuerpo específico. icación del polipéptido de DR6 Las formas del polipéptido de DR6 y/o APP eradas del medio de cultivo o de lisados ed. Si está enlazado a la membrana, puede ser 1 iembrana utilizando una solución de detergente na de intercambio iónico; precipitación de etano inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una cambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; pitación de sulfato de amonio; filtración zando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de p róse para remover, contaminantes tales comoIgG ntes de metal para enlazar formas epítopo-mar éptido de DR6 y/o APP. Varios métodos de purifi ína pueden ser empleados y tales métodos son co rte y descritos por ejemplo en Deutscher, M nology, 182 (1990); Scopes, PROTEINPURIFICATION : PR ICE, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) et icación seleccionada (s ) dependerá (n) , por ejem aleza del proceso de producción usado y el poli articular producido.

Formas solubles de DR6 y/o APP pueden ser PP o fragmentos del mismo. En modalidades partici ula puede comprender una fusión del polipéptido inmunoglobulina o una región particular oglobulina. Para una forma bivalente de la inmun usión podría ser a la región de Fe de una molécu fusiones de Ig incluyen preferiblemente la susti forma soluble (dominio de transmembrana ca tivado) del polipéptido en lugar de por lo n variable dentro de una molécula de Ig. En una cularmente preferida, la fusión de inmunoglobuli gozne CH2 y CH3 o el engozne CHl, CH2 y regio molécula de IgGl . Para la producción de fu oglobulina, véase también patente estadouni ,130, expedida el 27 de junio de 1995 y Chamo ??, 14:52-60 (1996) .

Un diseño de inmunoadhesina opcional combin rico codificado retendrá por lo menos un onalmente activo, dominios de CH2 y CH3 de ante de una cadena pesada de inmunoglobulina . La én se hacen al término C de la porción de Fe de ante o inmediatamente N-terminal al CH1 de a o la región correspondiente de la cadena l preciso en el cual se hace la fusión no es s particulares son bien conocidos y pu cionados con el fin de optimizar la actividad terísticas de secreción o enlace de la inmunoadh En una modalidad preferida, la secuencia d usionada al término N de la región de Fe oglobulina (IgGi) . Es posible fusionar toda ante de cadena pesada a la secuencia de adhe go, más preferiblemente, una secuencia que comi n de engozne justo corriente arriba del sitio d cularmente como heterodímeros o heterotetrá al, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán e rias conocidas. Una unidad estructural de cuatr as es la forma en la cual existen IgG, IgD, y d de cuatro cadenas es repetida en las inmunoglo molecular más alto; IgM existe en general mero de cuatro unidades básicas retenidas con enlaces de disulfuro. Globulina de igA y ocas lina de IgG globulin pueden también existir mérica en suero. En el caso del multímero, cada o unidades pueden ser las mismas o diferentes.

Varias inmunoadhesinas ensambladas ejemplar alcance de la presente son mostradas esquemáti nuación: (a) ACL-ACL; (b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, or VLCL-ACH) ; oglobulina; CLes un dominio constante de cadena ligera d oglobulina; CHes un dominio constante de cadena pesada d oglobulina; nes un número entero mayor de 1 ; Y designa el residuo de un agente de re ente.

Por propósito de brevedad, las estructuras ente muestran elementos clave; no indican la un dominios de las inmunoglobulinas ni se mué es de disulfuro. Sin embargo, en donde tales do ridos por actividad de enlace, se debe interp presentes en los sitios ordinarios que ocup ulas de inmunoglobulina .

Alternativamente, las secuencias de adhesi Aunque no se requiere la presencia de u a de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de l ción, una cadena ligera de inmunoglobulina pod nte ya sea asociada cov lentemente a un polip n de cadena pesada de adhesina-inmunoglobulina o tamente a la adhesina. En el primer caso, ADN qu adena ligera de inmunoglobulina es co-expresado l ADN que codifica la proteina de fusión de cad hesina-inmunoglobulina. Después de la secreción, a y la cadena ligera híbrida será asociada cova proveer una estructura semejante a inmunoglob ende dos pares de cadena pesada - cadena oglobulina enlazadas por disulfuro. Métodos la preparación de tales estructuras son revé ío en la patente estadounidense No. 4,816,567, e marzo de 1989. a de IgG pueden ser aislados en base a cadas de bibliotecas de cADN derivadas de linf o de sangre periférica, mediante hibridizacion cas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) . codifican la "adhesina" y las partes de inmunogl nmunoadhesina son insertados en tándem a un ido que dirige la expresión eficiente en la ed escogidas .

En otra modalidad, el antagonista de DR6 ficado covalentemente al enlazar el polipé tor a uno de una variedad de polímeros no pro ejemplo polietilenglicol (PEG) , polipropile xialquileno , de la manera resumida en las ounidenses Nos. 4,640,835; 4,496,689; 0,417; 4,791,192 o 4,179,337, u otras moléculas s como poliglutamato . Tales formas peg-iladas ío Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988) ounidense 5,716,805; WO 94/10308; Hoppe et rs, 344:1991 (1994); Maniatis et al., Natur ) . Aquellos experimentados en el arte apreciará ncia de cremallera de leucina puede ser fusiona extremo 5 ' o 3 ' de la molécula de DR6.

Los polipéptidos de DR6 y/o APP de la ición pueden también ser modificados de tal ma r moléculas quiméricas mediante fusión del poli secuencia de polipéptido o aminoácido h riblemente, tal secuencia de polipéptido a óloga es una que actúa para oligomerizar la rica. En una modalidad, tal molécula quimérica fusión del polipéptido de DR6 y/o APP con un p dor que provee un epítopo al cual un anticue dor se puede enlazar selectivamente. El ma te. Ejemplos incluyen marcadores de poli-histidi o poli-histidina-glicina (poli-his-gli) ; el p dor de HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., , 8:2159-2165 (1988)); el marcador c-myc y los a 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 del mismo (Evan et Biol., 5:3610-3616 (1985)); y el mar proteína D de virus de Herpes Simplex (gD) y su a rsky et al., Protein Engineering, 3( ) ) .Otros polipéptidos marcadores incluyen el Fi et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)); el po de KT3 (Martin et al., Science, 255:192-194 ( do de epítopo de alfa-tubulina (Skinner et al., , 266:15163-15166 (1991)); y el marcador de p ína de gen 10 de T7 (Lutz-Freyermuth et al., P Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)). uerpos policlonales . Métodos de preparación de a lónales son conocidos para el experimentado en nticuerpos policlonales pueden ser criados en un ejemplo, mediante una o más inyecciones de izante y si se desea, un adyuvante. Comúnmente, izante y/o adyuvante serán inyectados en el nte múltiples inyecciones subcutáneas o intraper gente inmunizante puede incluir el polipéptido d (por ejemplo, un ECD de DR6 y/o APP) o una pr n del mismo. Puede ser útil conjugar el agente i proteína que se sabe que es inmunogena en el ma munizado. Ejemplos de tales proteínas inmunógena no están limitadas a hemocianina de lapa de ina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor d oya. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser yen adyuvante complete de Freund y adyuvante d uerpos monoclonales Los anticuerpos de la invención pu nativamente anticuerpos monoclonales. Los a lonales pueden ser preparados utilizando m doma, tales como aquellos descritos por K tein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hib , hámster u otro animal huésped apropiado, es mente con un agente inmunizante para producir producen o son aptos de producir anticuerpo zarán específicamente al agente in nativamente, los linfocitos pueden ser inmun .

El agente inmunizante incluirá común éptido de DR6 y/o APP (por ejemplo, un ECD de DR proteína de fusión de DR6 ECD-lgG y/o APP sAPP- En general, se usan ya sea linfocitos n de roedor, bovino y humano. Usualmente, s s de célula de mieloma de ratón o rata. Las c doma pueden ser cultivadas en un medio d iado que contiene preferiblemente una o más sust en el crecimiento o sobrevivencia de las talizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las tales carecen de la enzima hipoxantina rribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio los hibridomas incluirá comúnmente hi pteriná y timidina { "medio de HAT"), tales en el crecimiento de células deficientes de HGPR Las líneas de células inmortalizadas pref llas que se fusionan eficientemente, soportan un sión alto apropiado de anticuerpo por las cé cen anticuerpos seleccionados o son sensibles a como medio de HAT. Líneas de células inmortali TION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc., ) pp. 51-63) .

El medio de cultivo en el cual las c doma son cultivadas puede luego ser analizado en esencia de anticuerpos monoclonales dirigidos c APP. Preferiblemente, la especificidad de e uerpos monoclonales producidos por las cé doma es determinada mediante inmunoprecipi nte un análisis de enlace in vitro, inmunoanálisis (RIA) o análisis inmunoabsor a-enlazado (ELISA) . Tales técnicas y anál idos en el arte. La afinidad de enlace del lonal puede ser determinada por ejemplo me sis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. 20 (1980) o por medio de análisis de BiaCore.

Después que las células de hibridoma dés ió de ascites mediante procedimientos de purifi oglobulina convencionales tales como, por ejempl aróse, cromatografía de hidroxina patita, elec l, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales pueden tam cados mediante métodos de ADN recombinantes , t íos descritos, en la patente estadounidense No. N que codifica los anticuerpos monoclonales e mente y secuenciado utilizando proc ncionales (por ejemplo, al utilizar s nucléotido que son aptas de # enlazarse específi que codifican las cadenas pesadas y ligera uerpos monoclonales) . Las células de hibridoma s fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el colocado en vectores de expresión, que s fectados a células huésped tales como células d nunoglobulina toda o parte de la secuencia de co un polipéptido sin inmunoglobulina . De esta m ran anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que ificidad de enlace de un anticuerpo monoclonal a ismos .

Comúnmente, tales polipéptidos sin inmun ustituidos por los dominios constantes de un ant vención o son sustituidos por los dominios varia de combinación de antígeno de un anticuer ción para crear un anticuerpo bivalente quim ende un sitio de combinación de antígeno ificidad por DR6 y otros sitio de combinación d iene especificidad por un antígeno diferente.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos tambi reparados in vitro utilizando métodos conocidos roteína sintética, en los que se incluyen aqu et al., ProteinEngineering, 10:423-433 (19 dad de técnicas para la producción recomi ulación de anticuerpos son bien conocidas en íos ilustrativos de tales técnicas que son mente por aquellos experimentados en el arte son yor detalle posteriormente en la presente. uerpos humanizados En general, un anticuerpo humanizado tiene úos de aminoácido introducidos al mismo de una a. Estos residuos de aminoácido no humanos son d entemente como residuos de "importación", que s Imente de un dominio variable de "importa ización puede ser efectuada esencialmente sig o de Winter y colaboradores (Jones et al. 22-525 (1986); Riechmannet al., Nature, 3 úos de FR son sustituidos por residuos de sitio ticuerpos de roedor.

Es importante que los anticuerpos sean h retención de , alta afinidad por el antígeno edades biológicas favorables. Para obtener este uerdo con un método preferido, anticuerpos human rados mediante un proceso de análisis de las tales y varios productos humanizados co zando modelos, tridimensionales de las secuencia nanizada. Modelos de inmunoglobulina tridimension nibles comúnmente y son familiares para imentados en el arte. Están disponibles pro tadora que ilustran y despliegan e rmacionales tridimensionales probables de secu oglobulina candidatas seleccionadas. La insp despliegues permite el análisis del papel proba enciar el enlace de antígeno. uerpos humanos Los anticuerpos monoclonales humanos pu rados mediante el método de hibridoma. Líneas cel ma humano y líneas celulares de heteromieloma 0 para la producción de anticuerpos monoclonale sido descritas, por ejemplo porKozbor, J". I mu (1984) yBrodeur, et al., MONOCLONAL A TIBODY PRODUCTIO PLICATIONS, pp.51-63 ( arcel Dekker, Inc., New York Es ahora posible producir animales transgén ío, ratones) que son aptos, después de la inmuni cir un repertorio de anticuerpos humanos en au cción de inmunoglobulina endógena. Por ejempl ito que la cancelación homóciga del gen de regió adena pesada de anticuerpo (JH) en ratones qui ado adicionalmente la tecnología y han generado atones transgénicos designados como "Xenomous o son atacados con antígeno, generan a mente humanos de alta afinidad. Esto fue obtenido tegración de línea germinal de sitios de cadena a ligera humanos de megabases a ratones con canee nto de JHendógeno como se describe anterior ouse II alberga 1,020 kb de sitios de cade os que contienen aproximadamente 66 genes VH, re Hcompletas y tres regiones constantes diferentes bién alberga 800 kb de sitioKhumano que contiene egmentos de JKy genes de CK genes. Los genes pro ratones se asemejan estrechamente a aquellos umanos en todos los aspectos, incluyendo ico, ensamble y repertorio. Los anticuerpos hu sados preferencialmente con respecto a a de un bacteriófago filamentoso, tal como M1 egados como fragmentos de anticuerpo funcionales ficie de la partícula de fago. Debido a que la entosa contiene una copia de ADN de una sola a de fago, las selecciones basadas en las p onales del anticuerpo también dan como res ción del gen que codifica el anticuerpo q ias propiedades. Así, el fago imita alguna edades de la célula B. El despliegue de fago uado en una variedad de formatos, para su revis on, Kevin S. and Chiswell, David J., CurrentO turalBiology 3, 564-571 (1993). Varias fu ntos de gen V pueden ser usados para el desp Clacksonet al., I\7 ture352 , 624-628 (1991) ai lo diverso de anticuerpos anti-oxazolona a part oteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V y células V que despliegan inmunoglobulina de ta afinidad son preferiblemente replicadas y dif te el ataque de antígeno subsecuente. Este proce ser imitado al emplear una técnica cono emezcla de cadena" (Marks et al., Bio/Technol .1 ] ) .

En este método, la afinidad de anticuerpo arios" obtenidos mediante despligue de fago ada al reemplazar secuencialmente los genes de r a pesada y ligera con repertorios de variant ntan de manera estable en la naturaleza (reper de genes de dominio V obtenidos de dona izar. Esta técnica permite la producción de ant entos de anticuerpo con afinidades en el olar. Una estrategia para fabricar repert cuerpo de fago muy grandes (también conocida como torio de genes de dominio V humanos, creando q r-humano. La selección en el antígeno da como miento de variable humano apto de restaurar un e de antígeno funcional, esto es, el epítopo ime) la elección del socio. Cuando el proceso e el fin de reemplazar el dominio de V de roedor re ne un anticuerpo humano (véase, solicitud de p 3/06213, publicada el 1 de abril de 1993). A dif umanización tradicional de anticuerpos de roedo tación de CDR, esta técnica provee a letamente humanos que no tienen ninguna est úo de CDR de origen de roedor.

Como se discute en detalle posteriormen ente, los anticuerpos de la invención pueden nalmente anticuerpos monoméricos, anticuerpos ién como formas multivalentes de anticuerpos. isteína relevantes son sustituidos con otro r ácido o son cancelados para impedir la reticulaci uerpos bisespecíficos Los anticuerpos bisespecíficos son a lónales, preferiblemente humanos o humanizados, ifieldades de enlace por al menos dos entes. En el caso presente, una de las especifi e es por el receptor de DR6, la otra es por cual eno y preferiblemente, por otro receptor o su tor. Métodos para fabricar anticuerpos bisespec idos en el arte. Tradicionalmente, la binante de anticuerpos bisespecíficos está bas presión de dos pares de cadena pesada-cadena oglobulina, en donde las dos cadenas pesad ificidades (Millstein and Cuello, Nature 305 WO 93/08829 {publicada el 13 de mayo de uneckeret al . , EMBOJ. 10, 3655-3659 (1991).

De acuerdo con un procedimiento diferen rido, dominios variables de anticuerpo ificidades de enlace deseadas (sitios de combi uerpo-antígeno) son fusionados a secuencias d ante de inmunoglobulina . La fusión es preferibl ominio constante de cadena pesada de inmunoglob ende por lo menos parte de las regiones de engo Es preferido, que la primera región constante a (CHl) contenga el sitio necesario para el a ligera presente en por lo menos una de las fus que codifican las fusiones de cadena p oglobulina y si se desea, la cadena I oglobulina, son insertados a vectores de ados y son co-transí ctados a un organism rciones no son de significado particular. En una rida de este procedimiento, los anticuerpos bise compuestos de una cadena pesada de inmunoglobuli na primera especificidad de enlace en un brazo y a pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híb e una segunda especificidad de enlace) en el o encontró que esta estructura asimétrica fa ación del compuesto bisespecífico deseado de com adenas de inmunoglobulina indeseables, ya que la na cadena ligera de inmunoglobulina en solamente la molécula bisespecí fica proporciona una ación fácil. Este procedimiento es revelad icación de PCT No. WO 94/04690, publicada el 3 d Para detalles adicionales para generar a pecíficos, véase, por ejemploSureshet al., Meth. miento de infección de HIV {publicación de sol os. WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los a oconjugados pueden ser fabricados utilizando c os de reticulación convenientes. Agentes de re iados son bien conocidos en el arte y son revel te estadounidense No. 4,676,980, junto con un icas de reticulación. entos de anticuerpo En ciertas modalidades, el anticuerpo ant cuerpo APP (incluyendo anticuerpos murinos, izados y variantes de anticuerpos) es un fra cuerpo. Varias técnicas han sido desarrolladas cción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalme entos eran derivados vía digestión proteo cuerpos intactos (véase, por ejemplo Morimoto procedimiento, los fragmentos de Fv, Fab o F(a aislados directamente del cultivo de célul binante. Una variedad de técnicas para la pro entps de anticuerpo serán evidentes para imentados en el arte. Por ejemplo, la digestión uada utilizando papaína. Ejemplos de digestión descritos en WO 94 / 29348 publicada el 12 /22 /94 ounidense No. 4 , 342 , 566 . La digestión de p uerpos produce comúnmente dos fragmentos de eno idénticos, llamados fragmentos Fab, cada u de enlace de antígeno y un fragmento de Fe re miento con papaína produce un fragmento de e dos sitios de combinación de antígeno y es to ticulacion de antígeno.

Los fragmentos de Fab producidos en la di uerpo también contienen los dominios constant ínas de engozne entre ellos. Otros acoplamiento agmentos de anticuerpos son también conocidos . ntes de glicosilación de anticuerpos Los anticuerpos son glicosilados en rvadas en sus regiones constantes (Jefferis . Immunol.65: 111-128 (1997); Wright and Morriso 6-32

[1997]). Las cadenas laterales de oligosacár oglobulinas afectan la función de la proteína Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996); Wittwe an em.29 :4175-4180 (1990)) y la interacción intr e porciones de la glicoproteína que puede a ormación y superficie tridimensional presenta oproteína (Hefferis and Lund, supra; Wyss an ent Opin. Biotech.1 : 409-416 (1996)). Los olig en también servir para apuntar una glicoproteí élulas de ovario de hámster chino (CHO) da como reducción completa en lisis moderada por c ) {Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1 que la remoción selectiva de residuos de áci izando neuramidasa no dio como resultado ninguna . La glicosilacion de anticuerpos también ha sido afecta la citotoxicidad celular dependiente de ) . En particular, las células de CHO con iada por tetraciclina de ilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) , osiltransferasa que cataliza la formación de cción, fue reportada que tiene actividad de ADC a et al. t tu e Biotech .17 : 176-180 (1999)).

Variantes de glicosilacion de anticue antes en las cuales el patrón de glicosilaci cuerpo es alterado. Alterar significa cancelar rción de carbohidrato a la cadena lateral de un agina. Las secuencias de tripeptido asparagina- agina-X-treonina, en donde X es cualquier to prolina, son las secuencias de reconocimi ón enzimática de la porción de carbohidrato a al de asparagina. Así, la presencia ya sea de stas secuencias de tripéptido en un polipéptid de glicosilacion potencial. Glicosilacion 0-e re a la anexión de uno de los azúcares tosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiamino mente serina o treonina, aunque 5-hidroxi pro xi lisina pueden también ser usados.

La adición de sitios de glicosilacion al leva a cabo convenientemente al alterar la se ácido, de tal manera que contiene una o má ncías de tripéptido descritas anteriormente (p licoproteínas recombinantes , por ejemplo anticue éuticos potenciales es raramente la célula na n esperar variaciones significativas en el silación de los anticuerpos (véase, por ejemp J. Biol. Chem. 272 : 9062-9070' (1997)). Adem ión de células huésped, factores que af silación durante la producción recombinante de a yen modo de cultivo, formulación de medios, d vo, oxigenación, pH, esquemas de purificaci antes. Varios métodos han sido propuestos para n de glicosilación obtenido en un organism cular en los que se incluyen introducir o sob tas enzimas involucradas en la producción de oli ntes estadounidenses Nos. 5,047,335; 5,5 8,299). La glicosilación o ciertos tipos de glic n ser removida enzimáticamente de la glicopro sicional de monosacárido, digestión enzimática AEC-PAD, que usa cromatografía de intercambio a pH para separar los oligosacáridos en base a os para liberar oligosacáridos por propósitos también conocidos e incluyen, sin limitación, t ático (efectuado comúnmente utilizando sidasa F/endo-p-galactosidasa) , eliminación úti ambiente alcalino fuerte para liberar prin cturas 0-enlazadas y métodos químicos que cina anhidra para liberar tanto oligosacáridos ados . uerpos ejemplares Como se describe en los ejemplos a continu uerpos monoclonales anti-DR6 han sido identifi idades opcionales, los anticuerpos de DR6 de la los a continuación.

Opcionalmente, los anticuerpos monoclonal nte invención tendrán las mismas carac gicas como cualquiera de los anticuerpos cara lricamente en los ejemplos posteriormente en l se enlazan al (los) mismo (s) epítopo(s) c uerpos. Esto puede ser determinado al llevar a c sis, tal como se describe en la presente los. Por ejemplo, para determinar si un lonal tiene la misma especificidad como los anti y/o APP a los que hace referencia específicame nte, se puede comparar su actividad en análisis titivos. Además, un epitopo al cual un anticuerp APP particular se enlaza puede ser determinado io de cristalografía del complejo entre DR6 y/o uerpo en cuestión. tor anti-DR6 y/o anticuerpo ligando de APP reve nte que es enlazado a uno o más polímeros no pr cionados del grupo que consiste de polieti ropilenglicol y polioxialquileno . Opcionalm tor anti-DR6 y/o anticuerpo ligando de APP reve nte es glicosilado o alternativamente, no glicos Los anticuerpos de la invención incluyen a /o APP "reticulados" . El término "reticulado" , c a presente, se refiere al enlace de por lo ulas de igG conjuntamente para formar una ( ula. Los anticuerpos de DR6 y/o APP pueden ser r zando varias moléculas de enlazador, preferible uerpos de DR6 y/o APP son reticulados utili ula anti-IgG, complemento, modificación química ular. Se apreciará por aquellos experimentados el complemento tiene una afinidad relativamente uerpo .

Para la producción recombinante del antic nucleico que lo codifica es aislado e inser r replicable para clonación adicional (amplific o para expresión. El ADN que codifica el anti do fácilmente y secuenciado utilizando proc ncionales (por ejemplo, al usar sondas de oligo son aptas de enlazarse específicamente a fican el anticuerpo) . Muchos vectores están di componentes de vector incluyen en general, pero ados a, uno o más de los siguientes: una se , un origen de replicacion, uno o más genes marc nto mejorador, un promotor y una secuencia de t anscripción.

Los métodos en la presente incluyen método cción de anticuerpos anti-DR6 y/o APP qui íaciones de antagonistas de DR6 En la preparación de formulaciones típic nte, se notará que la calidad o "grado" recomend nentes empleados dependerá del uso final lación. Para usos terapéuticos, es preferido qu onente(s) .sean de un grado permisible (tal co un aditivo a productos farmacéuticos.

En ciertas modalidades, se proveen composi renden antagonistas de DR6 y uno o más excipi een suficiente fuerza iónica para mejorar la s estabilidad del antagonista de DR6 , en donde la c e un pH de 6 (o aproximadamente 6) a 9 (o aprox El antagonista de DR6 puede ser preparado quier método apropiado para obtener la pureza dés eína, por ejemplo, de acuerdo con los métodos a iertas modalidades, el antagonista de DR6 es orgánico o inorgánico poliiónico, aspartato, s , succinato de sodio, acetato de sodio, cloruro sol™, Tris, sal de arginina u otros aminoácidos, ioles tales como trehalosa y sacarosa. Preferibl o más excipientes en las formulaciones que prov a es suficiente una sal. Sales que pueden ser yen pero no están limitadas a sales de sodio y ina. El tipo de sal empleado y la concentración de preferencia de tal manera que la formulación za iónica relativamente alta, lo que permit onista de DR6 en la formulación sea nalmente, la sal está presente en la formulac ntración de aproximadamente 20 mM a aproximadame La composición tiene preferiblemente un p imadamente 6) a 9 (o aproximadamente riblemente, alrededor de 6.5 a aproximadamente imadamente 6.5 a 7. Opciónalmente, la solución H es empleada a una concentración de aproximada oximadamente 50 mM en la formulación.

Particularmente para formulaciones líq laciones liofilizadas reconstituidas), puede se ir uno o más surfactantes en la composici ctantes pueden comprender por ejemplo, un surf o como TWEE ™ o PLURONICS™ (por ejemplo, poli ámero) . Preferiblemente, el surfactante orbate 20 ("Tween 20"). El surfactante opcional ado a una. concentración de aproximadamente imadamente 0.2%.

Las formulaciones de la presente invenci ir, además del (los) antagonista (s ) de DR6 y nentes descritos anteriormente, varios otros exc nentes adicionales. Opcionalmente, la formulac extrosa. Varios portadores, excipientes o estab tables farmacéuticamente opcionales son ionalmente en Remington's Pharmaceutical Scien ion, Osol, A. ed. (1980)'.

Las formulaciones en la presente tambi ener uno o más conservadores. Ejemplos incluyen decildimetilbencil amonio, cloruro de hexametoni enzalconio (una mezcla de cloruro de alquilben ÍO en la cual los grupos alquilo son compuestos a) , y cloruro de bencetonio. Otros tipos de con uyen alcoholes aromáticos, alquil parabenes t 1 o propil paraben, y m-cresol. Los antioxidante o ascórbico y metionina; conservadores (tales co octadecildimetilbencil amonio; cloruro de he uro de benzalconio, cloruro de bencetonio,-lico; alquil parabenes tales como metil o propi Las composiciones de la invención pueden laciones líquidas (soluciones líquidas o su das), y formulaciones liofilizadas , ta b laciones en suspensión.

La formulación final, si un líquido, es riblemente congelada a <20°C. Alternativam lación puede ser liofilizada y provista como p stitución con agua para inyección que opcionalm lmacenada a 2-30°C.

La formulación a ser usada para admi éutica debe ser estéril. La esterilidad se lle mente mediante filtración a través de mem ación estériles (por ejemplo, membranas de 0.2 composiciones terapéuticas en general son eoloca íente que tiene una compuerta de acceso est Ositivo de pluma de inyección (o un cartucho qu ispositivo de pluma) , tal como aquellos disponi (véase, por ejemplo, patente estadounidense 5 son apropiados para administración terapéuti lación. Una solución de inyección puede ser pr stituir la formulación antagonista de DR6 l izando por ejemplo, agua para inyección. pias que Usan Antagonista (s) de DR6 Los antagonistas de DR6 de la invención tie idades-. Los antagonistas de DR6 son útiles en la atamiento de alteraciones neurológicas . La di feros de las varias condiciones patológicas descr ente se puede hacer por el técnico experimen icas de diagnóstico están disponibles en el iten, por ejemplo, la diagnosis o detección eración rápida de subconjuntos específicos de o del sistema neural, dando como resultado e prematura. La esclerosis lateral amiotrófica { medad de neurona motriz progresiva más osticada. La enfermedad está caracterizada eración de neuronas motrices en la corteza, tall dula espinal (Siddique et al., J". Neural Trans 9-233 (1997); Siddique et al., Neurology, 47: 7-34; duscussion S34-5 (1996); Rosen et al. 59-62 (1993); Gurney et al., Science, 264:1772-17 La enfermedad de Parkinson (parálisis agita ación neurodegenerativa común que usualmente apa media a tardía. Los casos familiares y espor entan, aunque los casos familiares cuentan solo to de los casos observados . Los pacientes frec en pérdida de célula de nervios con gliosis r ces espinales y atrofia de los músculos de extr O (Monani et al., Hum. Mol. Genet. , 9:2451-245 i et al., J. Cell Biol . , 160:41-52 (2003)). S una frecuencia de 1 en 10,000 individuos y es ica más común de mortandad de infantes. En base nicio y severidad del fenotipo de enfermedad, mas han sido clasificadas en SMA tipo I (severa) rmedia) , y tipo III (suave) . Todas las tres fo medad son debidas a pérdida o mutación de la sob érica del gen de neuronas motrices (SMN1) (Mona , 2000; Monani et al., supra, 2003)).

La pérdida de célula neuronal ha sido repor o de enfermedades neurodegenerativas, en la yen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de rosis lateral amiotrófica (ALS) , y atrofi lar (SMA) . apraxia; (3) agnosia; o (4) alteraciones onamiento de ejecución; (B) los déficits sentan una disminución del funcionamiento cán deterioro significativo en el funcionamient cional; (C) el curso está caracterizado por inic sminución continua; (D) Los déficits cognitiv os a otras condiciones del sistema nervioso mico o condiciones inducidas por sustancia qu its progresivos en memoria y conocimiento; ación no es tomada en cuenta mejor por otra iátrica. Criterios alternativos mediante los , osis de la enfermedad de Alzheimer puede ser yen aquellos basados en el National Inst logical and Communicative Disorders and Stroke-A se and Related Disorder Association (NI rios del grupo de trabajo para la enfermedad de imiento, incluyendo memoria; (b) inicio entre la 90 años; y (c) ausencia de enfermedades sistémic medades del cerebro aptas de producir un s cia, incluyendo delirio. Los criterios de NI definir enfermedad de Alzheimer incluyen satis rios por probable enfermedad de Alzheimer ncia histopatológica de enfermedad de Alzh sia o biopsia.

Los criterios de diagnóstico de NINDS-ADRDA sido propuestos en Dubois et al., The Lancet en 6, Issue 8, August 2007, páginas 734-746. e brevemente a continuación, para cumplir estos probable enfermedad de Alzheimer, el individuo satisfacer el criterio A (el criterio clínico o menos uno o más de los criterios de biomarcado ados en B, C, D o É. En este contexto, el crite mación ha sido previamente controlada; (3) el de ía episódico puede ser aislado o asociado os cognoscitivos al inicio de AD o como avances rio B está caracterizado por la presencia de O temporal medio, como se muestra por ejemplo po volumen de hipocampos, corteza entorhinal, nciada en MRI con clasificaciones cualitativas ación visual (con referencia a la poblac terizada con normas^ de edad) o volumetría cuant nes de interés (con referencia a la pobla terizada de normas de edad) . El criterio terizado por un biomarcador de flujo cere al, por ejemplo bajas concentraciones de amil ntraciones de tau total incrementadas, o concentr -tau incrementadas, o combinaciones de los rio C está caracterizado por un patrón esp biol Aging 1997; 18: S1-S2); y (2) tanto evidenc genética (mutación en el cromosoma 1, 14 ó 21) rios deben estar presentes .

En los métodos de la invención, el antagoni dministrado preferiblemente al mamífero en un riblemente un portador aceptable farmacéu dores apropiados y sus formulaciones son des GTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th ed. , 1 shing Co., edited by Osol et al. Comúnmente, un iada de una sal aceptable farmacéuticamente es u lación para volver a la formulación isotónica. portador incluyen solución salina, solución de ión de dextrosa. El pH de la solución es prefe lrededor de 5 a aproximadamente 8, y más preferib edor de 7 a aproximadamente 7.5. Portadores a yen preparaciones de liberación sostenida t peritoneal, subcutánea, intramuscular, int ente, o mediante otros métodos tales como inf ran .su administración a la corriente sanguín efectiva. El antagonista de DR6 puede ta istrado mediante técnicas de perfusión aislad perfusión de tejido aislada o mediante punción i ocularmente, o punción lumbar para ejerce éuticos locales. Los antagonistas de DR6 que mente la barrera de sangre-cerebro pueden tamente, por ejemplo, intracerebralmente o al a dorsal o de otra manera, que los transportará la. barrera. Dosis y horarios efectivos istración del antagonista de DR6 pueden ser de icamente, y el hacer tales determinaciones está abilidad de aquellos experimentados en el arte, imentados en el arte entenderán que la dosific ODIES IN HUMAN DIAGNOSIS AND THERAPY, Haber et Press, New York (1977) p . 365-389. Una do a típica del anticuerpo de DR6 usada sola podrí roximadamente 1 g/Kg a hasta 100 mg/Kg de pesó por día, dependiendo de los factores m iormente..

El antagonista de DR6 puede también ser adi amífero en combinación con uno o más otro éuticos. Ejemplos de tales otros agentes te yen inhibidores del receptor del factor de c rmico (EGFR) , por e emplo, compuestos que se e tra manera interactúan directamente con EGFR e en su actividad de señalización, tal como uerpos como C225, también denominados como ce ux® (ImClone Systems Inc.). ABX-EGF plenamen tumumab, Abgenix Inc.), también como a 7498; inhibidores de EGFR de molécula pequeña pa yen OSI-774 (CP-358774, erlotinib, OSI Pharmac 83805 (CI 1033, 2-propenamida, clorhidrato de -4-fluorofenil ) amino] -7- [3- (4-morfolinil )propoxi] zolinilo] -, Pfizer Inc.); Iressa (ZD1839, gefi loro-4 ' -fluoroanilino) -7-metoxi-6- (3- linopropoxi) quinazolina, AstraZeneca) ; ZM 105 -4- (3-metilfenil-amino) -quinazolina, Zeneca) ; (3-cloro-4-fluoro-fenil) -N2- (l-metil-piperidin-4-i ido [5 , 4-d]pirimidin-2 , 8-diamina, Boehringer I 66 ( (R)-4-[4-[ (1-feniletil) amino] -lH-pi imidin-6-il] -fenol) ; (R) -6- ( 4-hidroxifen etil ) amino] -7H-pirrolo [2 , 3-d]pirimidina) ; CL-387 romofenil ) amino] -6-quinazolinil] -2-butinamida) ; - [ (3-cloro-4-fluorofenil ) amino] -3-ciano-7-etoxi-6 linil] -4- (dimetilamino) -2-butenamida) . Otros -péptidos) , inhibidores de caspasa 2-amin ituidos, inhibidores de caspasa de a-hid ituidos, inhibición mediante nitrosilación; CASP- idores de proteína, moléculas de antisentido, til-cetonas , derivados de péptido de y-cetoácid ulas antisentido, proteínas de interacción CASP ulas antisentido; CASP-6: moléculas antisentid ulas antisentido; e inhibidores de CASP-12. ionales son inhibidores mitocondriales tales co lador Bcl-2; péptidos mutantes de Bcl-2 derivado agonista de muerte de dominio de interacció eínas de inhibidor de Bax y genes de BLK y ticos. Moduladores intracelulares apropiados adic tosis son moduladores de asociación de CAS ladores antisentido de expresión de Apaf-1, pép ición de apoptosis, composiciones anti-apoptó aceuticals) que es un inhibidor de pan-casp aZeneca) que es un inhibidor de caspasa-3, tis Pharma) que es un inhibidor de caspas asa/TPA (Genentech) que disuelve coágulos aco trombolítico) .

Agentes apropiados adicionales que pu istrados, además del antagonista de DR6, idores de colinesterasa (tales como tamina, Ri astigmina, Tacrina) , antagonistas de DA (tal como Memantina) , inhibidores de agregac xidantes, moduladores de ?-secretasa, mímicos ia genética de NGF, agonistas de PPARy, inhib tasa de HMG-CoA (estatinas) , ampaquinas, bloqu de calcio, antagonistas del receptor de GABA, i a cinasa sintasa glicógeno, inmunoglobulina in istas del receptor muscarínico, moduladores del s, la condición patológica que es tratada, y lo tas de administración pero en general sería meno fueran usados individualmente.

Enseguida de la administración del antagoni amífero, la condición fisiológica del mamífero toreada de varias maneras bien conocidas para imentado .

Los efectos terapéuticos de los antagonist a invención pueden ser examinados en análisis i izando modelos de animales in vivo. Una va isis bien conocidos y modelos de animales pueden probar la eficacia de los agentes terapéuticos c aturaleza in vivo de tales modelos los hace parti ictivos de respuestas en pacientes humanos. M ales de varias condiciones neurodegenerativas iadas para examinar los procesos patológicos aso dar, por ejemplo inyección subcutánea, inyecció la, implante de bazo, implante intraperitoneal , la cápsula renal. Los modelos in vivo incluyen ente cerebrovascular/isquemia cerebral, modelos medades neurodegenerativas, tales como modelos d medad de Parkinson; modelos de ratón de enfe imer; modelos de ratón de esclerosis lateral a modelos de ratón de atrofia espinal muscular SM tón/rata de isquemia cerebral focal y global, po o de oclusión de arteria carótida común o m ión de arteria cerebral media o en cultivos o ex vivo. Los varios análisis se pueden llevar tos de análisis in vitro o in vivo conocidos, escribe posteriormente en la presente o como son l arte y descritos en la literatura (Véanse, po an et al., Trends in Genetics, 22:281-289 (2006) degener Dis. 2007; 4(5): 392-402; Mouri et al . , Jul; 21 (9) :2135-48; Minkeviciene et al . , J. Ther. 2004 Nov; 311 (2 ): 677-82 and Yuede et al acol. 2007 Sep; * 18 ( 5-6 ): 347-63 ) . Por ejemplo, el antagonistas de DR6 revelados en la presente ón cognoscitiva de ratones puede ser examinado as de reconocimiento de objetos (véase, por eur et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:4 idad de los antagonistas de DR6 revelados en l , por ejemplo, la inflamación del cerebro, nada en ratones mediante por ejemplo químico, también como protocolos de ELISA dise niveles de marcadores de inflamación tales co y la IL-10 de citocina anti-inflamatoria en fra a de ratón (véase, por ejemplo Rakover degener. Dis. 2007; 4 (5) : 392-402 ) . izando criterios individuales o múltiples con erios . Por ejemplo, la European Medicine Evaluat ) introdujo una definición de res espondientes a un grado pre-especificado de cimiento y estabilización tanto en actividades f actividades globales (véase, por ejemplo Europea uation Agency (EMEA) : Note for Guidelines on ucts in the Treatment of Alzheimer's Disease. Lon . Un número de pruebas establecidas específicas usadas solas o en combinación para evaluar la se paciente a un agente son conocidas en el arte ( plo Van Dyke et al., Am. J. Geriatr. Psychi 6) . Por ejemplo, la sensibilidad a un agente uada utilizando la Batería de Deterioro Severo ba usada para medir el cambio cognoscitivo en pac ás severo (véase, por ejemplo Schmitt et al., ntrevista del Clínico de Change Plus Caregi' lC-Plus) , una clasificación de cambio global os basada en entrevistas estructuradas tant ente como el proveedor del cuidado de la salud ( lo Schneider et al., Alzheimer Dis . Assoc. Di pl 2):22-32). La sensibilidad a un agente pue medida utilizando el Inventario Neuropsiquiátri determina la frecuencia y severidad de 12 sí ortamiento en base a una entrevista del prov ado de la salud (véase, por ejemplo Cummings ology 1994; 44:2308-2314).

Varios inhibidores de colinesterasa ( tamina, Rivastigmina y Tacrina también como Mem gonista del receptor de N-metil-D-aspartato (N bido aprobación regulatoria para el trata rmedad de Alzheimer (véase, por ejemplo Roberso én sido comparados con la inversión del p medad por aproximadamente 6 meses o 1 año, respe er por ejemplo Doraiswamy et al., Alzheimer Di d (2001) 15: 174-183). En pruebas clínicas de respondedores de tratamiento han sido pre-esp pacientes que no mostraron ningún deterioro en h les y ninguno deterioro ya sea en habilidades f ynoscitivas (véase, por ejemplo Reisberg et al., ed. 2003; 348: 1333-1341). Otra prueba de Mem entes que toman dosis estables del inhi esterasa Donepezil, caracterizaron Memantina p eneficio sobre el placebo en medidas de resultad ios de referencia en la Batería de Deterioro Sev Inventario de Actividades de Vida Diaria AD Coo tems (ADCS-ADL19) , una Inversión a Base de Entr ÍCO de Cambio Más Entrada del Proveedor del Cui aciones de Diagnóstico del Antagonista DR6 La enfermedad de de Alzheimer familiar medad de Alzheimer de inicio prematuro dominante AD) se refieren a formas no comunes de enfe imer que usualmente llegan prematuramente en idos como antes de la edad de 65 (usualmente ent de edad) que pueden ser heredados de manera omal . Estudios de la proteína precursora de ) , genes de presenilina 1 (PSENl) , y presenilina rciona evidencia de que las mutaciones en estos nsables por la mayoría de los casos observados e, por ejemplo Raux et al., J". Med. Genet. 200 Sin embargo, un número de casos observados romes siguen estando sin explicar. Los datos pres presente sugieren que variantes de polipé ucleótido del Receptor 6 de Muerte pueden ser re En este contexto , el polipéptido de ucleótidos en muestras de paciente pueden ser nte un número de medios bien conocidos en el lo, con el fin de identificar variantes que se ianera estable en la naturaleza de DR6) , en l yen, sin limitación, análisis inmunohis dización in situ, análisis de RT-PCR, análisis de muestras clínicas y líneas celulares, y an lo de tejido. Protocolos típicos para evaluar la gen de DR6 (por ejemplo, secuencias reguladoras intrones, exones y los semejantes) y productos R6 (por ejemplo, mAR de DR6, polipéptidos de jantes) pueden ser encontrados, por ejemplo en ds., 2007, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOG hern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immun (PCR Analysis) . troph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 20 -76) . En ciertas modalidades de la inven éptidos de DR6 obtenidos de células neuronales d pueden opcionalmente hacerse pasar en cultivo n ser analizadas mediante un inmunoanálisis ta sis de Western blot (véase, por ejemplo Petterma eurosci. (10) : 3624-3632 (1988) ) . Alternativam ón de, o toda la región de codificación del g . ser analizada por ejemplo mediante un an ión en cadena de polimerasa de transcriptasa in del mAR extraído de células neuronales del pa modalidades de la invención, secuencias genómi obtenidas de una célula diferente a una célula ejemplo un fibroblasto o leucocito de sangre pe analizado para determinar si estas secuencias icán un polipéptido y/o albergan una va os de Selección para Identificar Antagonistas de Modalidades de la invención incluyen mét ificar una molécula de interés que inhibe el enl P, el método comprende combinar DR6 y APP en p cia de una molécula de interés; y luego de ición de enlace de DR6 a APP en presencia ula de interés. En particular, usando la sta en la presente, se pueden identificar ulas pequeñas y otras moléculas que, por actúan con DR6 y/o APP e inhiben la interacción P. En una modalidad ilustrativa de este método, inmovilizado sobre una matriz. La habilidad de ejemplo, APP marcado con un marcador detectable marcador cromogénico, una etiqueta fluoresc rnarcador, una etiqueta magnética, o un pr ión enzimático, etc.) para enlazares al DR6 in icia de una molécula de interés. Opcionalmente idades, la molécula de interés puede ser un antic La revelación provista en la presente permi dad de protocolos usados en el arte caractericen polipéptidos tales como DR6 y APP a ser us ificar una molécula que inhibe la interacción DR6 y APP. Tales modalidades de la invención las que emplean análisis de ELISA {por ejemplo, LISA de competencia o de emparedado como se rev tes estadounidenses Nos. 6,855,508; 6,1 ,803), radioinmunoanálisis (por ejemplo, como se idad 10.24 de Ausubel et al. eds . , CURRENT PR ULAR BIOLOGY, 2007), análisis de Western lo, como se revela en Pettermann et al., J. : 3624-3632 (1988) y Ejemplo 10 a continuación), ohistológico (por ejemplo, como se revela en el ña. (Véase por ejemplo, Wilson et al., CURR. 0 CAL BIOLOGY 2001, 6, 81-85; and Zhu, H. , et al. , 293, 1201-2105) . os de Selección para Identificar Compuestos que degeneración La invención provee un método de selección as para identificar compuestos que in degeneración. Los análisis de los ejemplos demu iés de un eventb de disparo para la neurodegener dado de la superficie de las neuronas . Los inhi muda también impiden la neurodegeneración. Así, esta lectura como indicación de inhib degeneración.

El método involucra efectuar un análisis e células son cultivadas en presencia o ausenc ltivo y análisis a los cuáles un compuesto candi agregado son mostrados en la sección de riormente en la presente. En tales casos, exp vo y/o en cámaras de Campenot pueden ser cultiv ro para la degeneración (por ejemplo, privació ser iniciado en presencia o ausencia del dato.

El compuesto candidato debe inhibir la mu 10-30%, 30-50%, 50-70%, 70-90% o 90-100% inc los números enteros entre estos intervalos. La observada utilizando antisueros contra APP tale policlonal o un anticuerpo monoclonal, como s a sección de ejemplos posteriormente en la pre idor de Bax puede ser agregado al medio para i da no específica de proteína debido a degeneraci Los compuestos identificados en tales aná ejemplo, botellas, frascos y tubos de en ientes pueden ser formados de una variedad de m como vidrio o plástico, y son prefe ilizados. El recipiente contiene una composición gente activo que es efectivo para el tratai aciones neurológicas , en las que se incluyen enf imer. El agente activo en la composición es un a R6 y comprende preferiblemente anticuerpos mo DR6 o anticuerpos monoclonales anti-APP. La etiq íente indica que la composición es usada miento de alteraciones neurológicas, y pued ar instrucciones ya sea para uso in vivo o in vi aquellos descritos anteriormente. El art factura o kit incluye además opcionalmente un i te, que se refiere a instrucciones tumbradamente en empaques comerciales de rio, en los que se incluyen otras soluciones r H, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

EJEMPLOS Varios aspectos de la invención son onalmente e ilustrado a manera de ejemplos qu no de los cuales pretende limitar el alcan ción. lo 1; Expresión de DR6 en Sistema Nervios iónico y Adulto Selecciones in situ de ARN de patrones de a superfamilia del receptor de TNF en tejidos ei os se llevaron a cabo. Más específicamente, se experimentos de hibridización in situ utilizan dor de mARN (Ambion, No. Cat. 1803) siguiendo el la síntesis in vitro ele la ribosonda, de acuer colo del fabricante.

Como se muestra en la Figura 2A, se encont expresado casi exclusivamente por las enciadas, en lugar de progenitores proliferant rollo de células de ganglio de médula espinal y io de raíz dorsal en etapas E10 a E12; etapas ido que ocurre la muerte de célula ne ronal .

Como se muestra en la Figura 2B, la proteí presada en ambos cuerpos celulares y axones de n En la figura 2B, las dos fotografías . ran neuronas desde una visualización de ratón ierdo) o una proteína testigo (derecho) . rafías inferiores muestran correspondientemente a visualización de ratón bloqueado de DR6 (iz roteína testigo (derecho) . y humano de plena longitud expresado sobre la lar. Uno de tales anticuerpos, denominado mAb "3 rito adicionalmente en el Ejemplo 3 y E eriormente en la presente) , reacciona de maner o con los polipéptidos de DR6 humanos como de r o para visualizar ia expresión de DR6 sobre axon tra en la Figura 2B. Se llevó a cabo un proced do de inmunofluorescencia utilizando un protocol cido en el arte (Nikolaev et al., 2003, Cell 1 Para visualizar la expresión de DR6 en los a ron imágenes en un microscopio Axioplan-2 entos de programación de computadora Ax ración 4.5.0.0 SPl (03/2006) de Caris Zeis tions .

Como se muestra en la Figura 2C, el mARN esado ,por neuronas de diferenciación. En la Fig as a niveles axiales torácicos de embriones 5-E12.5. Se usó un kit de hibridización in situ l RN para efectuar los experimentos de ISH de acue colo del fabricante como se resumen en el ucciones del localizador de mARN (Ambion Inc., ) . La sonda de mAR radiomarcada correspondie encia anti-sentido de UTR 3' de DR6 de ratón fu na reacción de traducción in vitro utilizand script de acuerdo con el manual de instrucc icante (Ambion Inc., No. Cat. 1308-1326). Los esión de mARN de DR6 fueron visualizados útil sión de autoradiografía de Kodak (Kodak) aplic objetos con secciones transversales de tejido e omaron imágenes en el campo oscuro en el m lan-2 de Imaging Zeiss utilizando los ele amación de computadora AxioVision40 Liberación 4 : //ww .brainatlas . org/aba/ ; el Alien Brain Atl rso científico disponible públicamente que prove xpresión de aproximadamente 20,000 genes en el ) reveló que DR6 es altamente expresado en 1 ral del cerebro adulto. El mARN del DR6 es exp lo en neuronas corticales, neuronas piramidale ampales y el dentate gyrus . La proteína d esada en cuerpos celulares neuronales en la campo adulto .

Este patrón de expresión provee evidenci ás de sus papeles en el desarrollo, el DR6 pue ionar en el avance de enfermedad neurodegenerativ érdida de célula neuronal . lo 2 ; Inhibición de Expresión de DR6 rferencia de AR Impide la Degeneración Axonal d de piso, enseguida de lo cuál desarrollan requ cos adicionales . Una dependencia de las neuronas te trófico derivado al pasar de sus objetiv medios provee un mecanismo para eliminar rápid nas que se proyectan mal, lo que puede ayudar a ción de circuitos neuronales aberrantes d rollo del sistema nervioso (Wang et al., Nature, (1999) ) .

Para examinar los papeles funcionales d eración axonal y muerte celular programada de surales, un análisis de sobrevivencia de médul l a base de AR i (Kennedy et al., Cell, 78:425-4 et al., supra, 1999) se llevó a cabo (véase ones de rata E13 o embriones de ratón Ell ados en un medio L15 (Gibco) y siAR (IDT) idos que codifican proteína fluorescente verd nte al gel de matriz de colágeno (Kennedy et a ) . Los axones conmisurales son visualizados escencia de GFP mediante observación util scopio invertido .

Como se muestra en la Figura 4A, después d ultivo, en ausencia de soporte de factor trófic a placa de piso, las neuronas conmisurales suf lar programada y sus axones se degeneran (véase, et al., supra, 1999) . Tales degeneración eado notablemente cuando la expresión de DR oñas conmisurales fue regulada descendenterr culas de siAR DR6-específicas (véase, Figura rior) . Esta inhibición de degeneración axona rvada en experimentos testigo con moléculas de tamiento. Los datos sugieren que DR6 es un rec tótico importante requerido para la degeneración sajuste de DR6 expuesto a siARW de DR6 #3. Los d iores muestran audioradiogramas de: (1) mARN de stre en presencia de: siARN testigo, siARN#2, y mARN de DR6 de desajuste en presencia de: siAR ST#27 y siAR #3.

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta figura son como sigue. Para papeles fisiológicos del receptor de DR6 en de l y muerte celular programada de neuronas conmis sis de sobrevivencia de médula espinal dorsal los protocolos conocidos en el arte (Kennedy et 5-435 (1994); Wang et al., Nature 401:765-769 ( uado (con datos mostrados en la Figura 4B) . Em E13 fueron colocados en un medio de L15 tados a sus tubos neurales con los siguientes c ARN (Figura 4B) : istrados a células progenitoras dorsales troporación . Los explantes de médula espinal dor disectados, embebidos a una matriz de gel de c ltivados en un medio 0pti-MEM/Fl2 (Invitrogen) co combinante y suero de caballo al 5% (Sigma) a 3 ambiente de 5% de CO2. En el transcurso de 16 esta a la netrina-1 quimioatrayente, lo isurales crecen fuera del explante al gel de eno (Kennedy et al., Cell 78:425-435 (1994). isurales son visualizados mediante fluorescenc nte observación utilizando microscopio invertid 8 horas en cultivo en ausencia de soporte de fact ado de la placa de piso, las neuronas conmisura te celular programada y sus axones se degeneran Nature, 401:765-769 (1999)) (Figura 4B) . Sin e ama de degeneración axonal puede ser bloquead a extracción de su objeto intermedio, la placa dula espinal .

Las secuencias de siR As #2 y #3 de DR6 { do) , y el fragmento de desajuste de cAD ementario a la secuencia de siARN #3 de de DR6 álisis descrito anteriormente son como sigue: DR6 SÍRNA #2 de rata: 5 ' -AAUCUGUUGAGUUCAUGC : 11) DR6 siRNA #3 de rata: 5 ' -CAAUAGGUCAGGAAGAUG : 12) El fragmento de desajuste del cADN de DR lementario a la secuencia de siARN #3 de DR6 : 5 ' -GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG-3 ' 13) lo 3; La Inhibición de la Señalización del Recep Cell 78:425-435 (1994); ang et al . , Nature 4 )) con modificaciones resumidas en el ejemplo 2 ones de rata E13 fueron inyectados a sus tubos el constructo de plásmido que expresa GFP (cA n subclonados a la cadena fundamental del S, disponible comercialmente de BCCM/LMBP) . El p sión de GFP fue luego alimentado a células pr les mediante electroporación. Anticuerpos de blo o IgG de ratón normal testigo fueron agregados a isurales a 40 µg/ml 24 horas después de la d nes de los explantes conmisurales fueron tomada és de la deposición como se resume posteriorme nte. Para visualizar axones conmisurales que exp rnaron imágenes en el microscopio invertido de Ax {en canal de fluorescencia verde para GFP) util ntos de programación de computadora Ax KCPAGTYVSEHCTNTSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWP TCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTETEDVRCKQCARGTFSDV QNLWIKPGT ETDJWCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPS SSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARGKEDWKTLPNLQW HQQGPH GEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDI EHLPWMIPDKTHTCPPCPAPE DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF WYVDGVEVHNA TKPR DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT SDIAVEWESNGQPE YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQG V QKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 4 ) El polipéptido de fusión fue generado colos de in unoadhesina descritos previamente l., Curr Opin Immunol. 9(2) : 195-200 (1997); Haak ., J. I munol. 152 (3 ) : 1347-53 (1994)) .

Los ratones Balb/c de 9 semanas de ed izados mediante inyección con 100 µ? de inmunó e (1 mg/animal) en el curso de aproximadamente ífico de 2 ^g/ml (Cappel No. Cat. 55071) a 4° la noche. Las placas fueron lavadas tres veces c , y las placas fueron bloqueadas con 200 µ? de B ratura ambiente por 1 hora. Las placas fue as tres veces con PBS más Brij . Subsecuentem s fueron incubadas con 100 µ?/cavidad de inmuno µg/ml por 1 hora en un agitador. Las placas fu as tres veces con PBS más Brij . 100 µ? de los uerpos fueron agregados a las cavidades, incuba en el agitador. Las placas fueron otra vez la con PBS más Brij . 100 µ? de anticuerpo de H -ratón de oveja (sin cruce a humano, Cappel No. C 1000 por 1 hora. Las placas fueron lavadas tres más Brij . 50 µ? de sustrato (TMB Microwell pero 6-05) fueron agregados y las placas fueron incub tos . La reacción fue detenida con 50 µ? µ?/c ra descrito anteriormente. Varios anticuerpos mo cionados fueron luego probados en cuanto a iso ó que son del IgGl .

Cuatro de los mAb anti-DR6, identific .7.7"; W3F4.4.8"; B6.9.7"; y "1E5.5.7", fue dos en el análisis de supervivencia de médul l en cuanto a su habilidad para bloquear la de l .

Sorprendentemente, ciertos de estos mAb .4.8; 4B6.9.7; y 1E5.5.7) fueron aptos de ialmente la degeneración axonal de neuronas co ida por la privación trófica por 48 horas e e Figura 5) . Se cree que tales anticuerpos puede supervivencia neuronal, por ejemplo, al bl acción entre el ligando de DR6 supuesto y el r o al inhibir la señalización de DR6 ligando-inde FEBS Lett., 431:351-356 (1998); Zhao et al . , rimental Medicine, Vol . 194, 1441-1441, 200 nar los papeles de la señalización de DR6-J eración axonal, un análisis de supervivencia al dorsal (como se describe en el Ejemplo 2 an a cabo, excepto que la ruta de señalización eada en neuronas conmisurales al utilizar un in ido, L-J K-I ( (L) -HIV-TAT48-57-PP-JBD20 ; Calbioc entración de 1 ?. DMSO (SIGMA) y IgG de rat ? probados como testigos .

Como se muestra en la Figura 6, esta inhibi lización de JNK bloqueó parcialmente la degenerac 1 análisis de supervivencia de médula espinal d s sugieren que DR6 señala la degeneración de les por lo menos en parte por medio de la ruta d tados de úteros con saco vitelino anexado al vados en suero de rata al 100% (Harían) en nte de oxígeno al 65% por el primer día y 95% el segundo día a 37°C. Anticuerpos monoclonales ritos en los ejemplos anteriores) fueron agrega sis a una concentración final de 10 µg p uerpo IgG de ratón normal a concentraciones de eron usados como testigo.

El teñido de inmunofluorescencia con dido que reconoce anticuerpo (anticuerpo a dido de ratón, comprado de R&D Systems) fue U tar y observar microscópicamente las células ap resultados son ilustrados en la Fi endentemente, la inhibición de DR6 por los a lónales anti-DR6 3F4.4.8; 4B6.9.7; y 1E5.5.7 pro neuronas de la médula espinal contra la muerte célula neuronal en médulas espinales embrió oteñido para caspasa 3 escindida {anticuerpo a dido de ratón, comprada de R&D Systems) fue util ñeros de carnada heterólogos de DR6 fuero inados como testigos. Secciones de tejido formaldehído (PFA) -fijas fueron bloqueadas por ción de bloqueo (suero de cabra desactivada térmi Sigma) / PBS (Gibco) /Tritón al 0 . 1 % .(Sigma)) e te toda la noche a 4°C con anticuerpo primario 0 de anticuerpo a caspasa- 3 escindido de ratón, c Systems) en solución de bloqueo. Las seccion das tres veces con solución de bloqueo por eratura ambiente e incubadas con anticuerpo ución 1 : 5 0 0 de Alexa 488 anti-conejo de cabra, es, Invitrogen) por 1 hora a temperatura ambi iones fueron luego lavadas por 1 hora a t promover la muerte de célula neuronal en e oso en desarrollo in vivo.

Como se muestra en la Figura 9B, DR6 es la degeneración de axón motriz como se ver es nulos de DR6. Explantes de médula espina oñas motrices) de embriones normales tamb ones DR6 bloqueados {Zhao et al., Journal of Ex ine, Vol. 194, 1441-1441, 2001) a la etapa de fueron analizados en presencia y ausencia trófico derivado de cerebro (BDNF) y neurotrofin y NT-3 obtenido de Chemicon) .

En la Figura 9B, el panel izquierdo superi ntes de médula espinal ventral de ratones no ncía de BDNF y NT-3, mientras que panel izquierd ra explantes de médula espinal ventral d eados DR6 (KO) en presencia de BDNF y NT-3. Sim 66-270 (1993) con pocas modificaciones, ócigos DR6 o embriones E13.5 de ratón nulo de tados utilizando tijeras tratadas con alcohol y edio L15 templado (Gibco) . Utilizando las mismas ps, la región ventral del embrión fue abierta, l n removidos, las costillas cortadas y la médul a fue disectada, el tejido de meninges de los a removido con fórceps . Las placas de techo fueron preparación de libro abierto de médula es ida. La mitad ventral de la médula espinal que i nas motrices MMC y LMC fue aislada y el tejido d restante fue cortado cuidadosamente. Las médulas ales fueron transferidas con puntas amarillas qu iertas en L15 a una nueva caja pequeña con L15 a) de suero para seccionar adicionalmente a zando una aguja de tungsteno. tarde, se llevó a cabo la privación del factor tr e: el medio viejo fue tomado y las cavidades fuer emente dos veces con medio neurobasal (SIN icos) .

Medio neurobasal pre-calentado/B-27 (I arado como se describe anteriormente SIN icos) más anticuerpos de bloqueo anti-BDNF y entech, Inc.) fueron agregados a 20 µg/ml . Los po explantes fueron luego incubados a 37°C por o s .

Dos días más tarde, los explantes se fija % en PBS, permeabilizados con Tritón al 0.2% e olaev et al., 2003, Cell 112(1), 29-40) durante C, y lavados dos veces con Net Gel . Para bloquear ce no específicos, los portaobjetos fueron incuba % en PBS, a 4°C durante toda la noche. Para ación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de Cari Zeis ions .

Como se muestra en los datos revelados en a degeneración inducida por lesión es retardada ados de DR6.

En la Figura 9C de izquierda a derecha, los iores muestran neuronas de ratones normales: en actor de crecimiento de nervio (NGF) ; y 4, 8 ó -lesión, respectivamente. En la Figura 9C de i cha, los 4 paneles inferiores de izquierda tran neuronas de ratones KO de DR6 : en presencia recimiento de nervio exógeno (NGF); y 4, 8 ó 16 h ón, respectivamente.

El análisis de lesión de axon sensorial in uestra en la Figura 9C se llevó a cabo co iones E12.5 de ratón heterocigo DR6 o ratón nulo Portaobjetos de 8 cavidades de plást iertas de PDL/Laminina (Becton, Dickinson and ? llenados con 500 µ? por cavidad de medio trogen) más 50 ng/ml de NGF (Roche emicals) , más complemento B-27 X50 (Invitrogen) Glutamine X100; más Glucose X100. Los explant onados fueron colocados en cada cavidad (2-3 ex por cavidad) y colocados en una incubadora a 37 para el crecimiento. Dos días más tarde, se li nálisis de lesión de axón como sigue: la l ida al hacer dos cortes paralelos de axones s por encima y justo por debajo del explante de -cuchillo (Fine Science Tools) . Los axones sin c ierda y a la derecha de los explantes de DRG sirv igos sin lesión endógenos. Los portaobjetos con RG cortados se fijaron a 0, 4, 8, 16 y 24 no S, Ab secundario 1:500 por 1 hora a temperatura avidades fueron jaladas y se usó Fluoromount-G p portaobjetos con cubreobjetos. Para visualizar riales marcados con inmunofluorescencia, se nes en el microscopio Axioplan-2 Imaging Zeiss elementos de programación de computadora Ax ación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de Cari Zeis ions . lo 7; Los Antagonistas de Anticuerpo Anti-DR6 eración de Neuronas Como se muestra en la Figura 1??, los a DR6 inhiben la degeneración de diversas neurona factor trófico (en análisis de degeneración axona En la figura 10A de izquierda a derecha, la fotografías superiores e inferiores muestran nas sensoriales en presencia y ausencia ctivamente, mientras que las dos fotografías ran neuronas sensoriales en ausencia de NGF, ncía de anticuerpos de DR6 4B6.9.7 y anticuerp .8, respectivamente. Las dos fotografías sup iores en el lado derecho de la Figura 10A mues euronas motrices. En estas cuatro fotografías der fotografías superiores muestran neuronas mo ncía y ausencia de factores de er ctivamente, mientras que las dos fotografías tran neuronas motrices en ausencia de fa imiento, pero en presencia de anticuerpos de DR6 uerpos de DR6 3F4.4.8, respectivamente.

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta figura son como sigue. Los a DR6 4B6.9.7, IE5.5.7, 3F4.4.8, 2C7.3.7 y de 20 microgramos/ml 24 horas después de la ra 10A) . Para cultivos de explante sensorial, s el análisis de privación de NGF 48 horas desp ición. Medio neurobasal nuevo, sin NGF, uerpo de bloqueo de NGF (Genentech, Inc.) junt uerpos de DR6 indicados (4B6.9.7 ó 3F4.4.8) o I agregados a cultivos de explante sensorial ntración final de 20 microgramos/ml 48 horas des ición {Figura 10A) . Para los cultivos de explan levó a cabo un análisis de privación del factor después de la deposición. El medio neurobasal DNF , pero con los anticuerpos de bloqueo de BDNF 3 (mAb de factor trófico de bloqueo de función, ) junto con anticuerpos de DR6 indicados ( .8) o IgG testigo fueron agregados a cultivos d rial a una concentración final de 20 microgra ert 200 (en canal de fluorescencia verde izando los elementos de programación de c ision40 Liberación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de C ing Solutions .

Como se muestra en la Figura 10B, los a -DR6 inhibieron la degeneración de diversas adas de factor trófico (en análisis de apoptosis lares via un teñido de TUNEL) . En la Figura 10B, a izquierda, las dos fotografías superiores e tran datos de neuronas conmisurales . En estas ro fotografías, las dos fotografías superiores oñas conmisurales en presencia de una IgG tes cuerpo de DR6 3B11.7.7, respectivamente, mientra fotografías inferiores muestran neuronas conmis encia de anticuerpos de DR6 4B6.9.7 y los anti 3F . .8 , respectivamente . El conjunto medio euronas motrices. En estas cuatro fotografías der fotografías superiores muestran neuronas mo encía y ausencia de factores de er ectivamente, mientras que las dos fotografías tran neuronas motrices en ausencia de fa imiento, pero en presencia de anticuerpos de DR6 cuerpos de DR6 3F4.4.8, respectivamente.

La revelación de la Figura 10 sugiere que e jugar un papel importante para la función eración axonal .

Los materiales y métodos usados para ge s mostrados en esta figura, son como sigue. Como riormente, los anticuerpos de DR6 4B6.9.7, 4.8, 2C7.3.7 y 3B11.7.7 monoclonales de rat rados al inmunizar un ratón con ectodominio de D ribe en el Ejemplo 3 anterior. Los cultivos d Para cultivos de explante sensorial, el a ción de NGF se llevó · a cabo 8 horas despu ición. Medio neurobasal nuevo sin NGF, pero con loqueo de NGF (Genentech, Inc.) junto con anti 4B6.9.7 ó 3F4.4.8 o IgG testigo (Genentech, In ados a cultivos de explante sensorial a una con 1 de 20 microgramos/ml 48 horas después de la ra 10B, media) . Para cultivos de explante motriz o un análisis de privación factor trófico 48 hor a deposición. Medio neurobasal nuevo sin NT3 /BDNF cuerpos de bloqueo de BDNF y anticuerpos de bloq de factor trófico de bloqueo de función, Genent o con 4B6.9.7 ó 3F4.4.8 o IgG testigo (Genent ? agregados a cultivos de explante sensori entración final de 20 microgramos/ml 48 horas des sición (Figura 10B, derecha) . tóticos TUNNEL positivos marcados fluorescente ron imágenes en el microscopio Axioplan-2 de Ima canal de fluorescencia rojo) utilizando los el ramación de computadora AxioVision40 Liberación 4 2006) de Cari Zeiss Imaging Solutions. lo 8; Los Antagonistas de Inmunoadhesina de DR6 eración de Neuronas Como se muestra en la Figura 11A, la degen conmisural fue retardada mediante hDR6-ECD-Fc . L inmunoadhesina hDR6-ECD-Fc usada en este an rita anteriormente en el Ejemplo 3.

En la Figura 11A de izquierda a derecha, rafía provee un testigo que muestra degeneració isural a 48 horas. La segunda fotografía m eración de axón conmisural a 48 horas en prese emplo 3. Para visualizar áxones conmisuralés GFP maron imágenes en el microscopio invertido de Ax (en canal de fluorescencia verde para GFP) util ntos . de programación de computadora Ax ación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de Cari Zeis ions .

Como se muestra en la Figura 11B, hDR6-ECD- egeneración axonal sensorial inducida por el r r de crecimiento de nervio (NGF) . En la Figu erda a derecha, las tres fotografías superiore nas sensoriales privadas de NGF en presencia igo a 0, 6 y 24 horas, respectivamente, mientra fotografías inferiores muestran neuronas s das de NGF en presencia del constructo DR6-Fc a , respectivamente.

La revelación provista en la Figura os celulares en diferentes compartimientos ntes de fluido separados), análogos a cuerpos nales en un sitio del sistema nervioso que pr s a un objetivo distante en otro sitio. El a a cabo como se describe originalmente por enot et al., J. Neurosci . 11(4) : 1126-39 (1991) ientes modificaciones. Brevemente, cajas de c o de 35 mm fueron recubiertas con PDL/Laminina un rastrillo de alfileres (Tyler Research) par s, como se ilustra por ejemplo en las Figuras enot et al., supra.

Una gota de medio de cultivo (medio neuro lemento B27, 25 ng/ml de NGF, y 4 g/1 de metilcel ada sobre el sustrato raspado. Un divisor de Tef rch) fue asentado sobre grasa de silicona y uñ de silicona fue colocada en la boca de la ranur celulosa. En el transcurso de 3-5 días in v s comienzan a emerger a compartimientos iz ho como se ilustra por ejemplo en las Figuras not et al . , supra .

Para disparar la degeneración axonal local, ontiene NGF de compartimientos axonales fue sust neurobasal con un anticuerpo de bloqueo de NGF tech, Inc., 20 g/ml) . Cero horas, 6 horas o 24 uida de la privación de NGF, las neuronas s n fijadas en PFA al 4% por 30 minutos a t nte y procesadas por teñido de inmunofluoresc dor axonal TUJ-1 {Covance, dilución 1:500) para generación de axones mediante microscopía de flu ra 11B) (como se describe anteriormente en el E visualizar axones sensoriales ofluorescentemente en compartimientos axonale con el tratamiento anti-NGF en compartimiento maras de Campenot. Cero a 24 horas después de pr los axones en las cámaras de Campenot fueron f BS al 4% y visualizados mediante t ofluorescencia con TUJ-1 (1:500, Covance) / dario conjugado a un grupo fluorescencia cular Probes, BD) (Figura 11B) .

La privación de NGF disparó un patrón sorpr eración axonal , como se muestra en la Fi ficativamente, la adición de proteina de inmunoa ECD-Fc retardo el inicio de degeneración axona ma (Figura 11B, paneles inferiores) . Asír es ren que el ligando soluble puede ser requerid ón del receptor de DR6 en degeneración axo ida por la remoción de factores de crecimiento. ructo de DR6-AP para visualizar estos axones a b ficación respectivamente, mientras que las dos f iores muestran una visualización de axones s zando un constructo testigo de AP a baja ficación, respectivamente .

Como se muestra en la Figura 12B, los e de ligando de DR6 se pierden de los axones s uida de la privación de NGF .

En la figura 12B, de izquierda a derecha rafías superiores muestran una visualización de lace de DR6 sobre axones sensoriales, en donde rafía muestra neuronas sensoriales en presencia hibidor de BAX, mientras que la segunda fotograf nas sensoriales nulas Bax en presencia de NGF rafías inferiores muestran: neuronas sensor cia de NGF pero en presencia de un inhibidor ción parental PRK5 está disponible de la Becton, Company, Pharmingen División. La secuencia de e 6 murina usada para generar la proteína de fusi como sigue: SSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGT KCPAG YVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWP ICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDV QNLEWKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVP STASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPH GEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH (SEQ ID NO: 14) La línea de ratón nulo de Bax (Bax-Rl) ita previamente (Deckwerth et al., Neuron, 1 ) y fue obtenido de Jackson Laboratories. E idor de BAX fue usado a una concentración de 1 ear la muerte de célula neuronal (Bax-V5, Tocris Para generar la proteína de fusión de ecto 6-AP en el medio fue' cuantificada como sigue: 100 microlitros de la solución reguladora d arada al agregar 100 mg de fosfato de para-n a) y 15 microlitros de MgCl2 1M a 15 mi de die H 9.8) fueron mezclados con un volumen igual de icionado de células de COS transfectado icionado de testigo de células COS-1 sin trans de la reacción fue revelado durante 12-15 minut estando en el intervalo lineal (0.1-1) . Luego eacción fue ajustado al agregar 800 microlitro ilada y la O.D. fue medida a una longitud d rbancia de 405 nm. La concentración en nM fue ca rdo con la fórmula (para 100 microlitro) : C (nM) (60 / tiempo de revelado) / 30.

Para el análisis de enlace de axon sensori n situ, ya sea explantes sensoriales tipo si S, Gibco No. Cat. 14175-095, con BSA al 0.2%, NaN 2 5 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 20 mM, pH=7.0). Luego un análisis de enlace de AP al hacer una mezcla o acondicionado de DR6-AP y la solución regulad nlace (o medio acondicionado de AP testigo y l ladora del pH del enlace) , que fue aplicado dire antes de DRG en portaobjetos de cultivo de 8 ton, Dickinson and Company) e incubados por 90 eratura ambiente.

Enseguida de la incubación, las proteínas enlazar fueron lavadas al enjuagar los explant o veces con la solución reguladora del pH del e antes de DRG fueron luego fijados con formaldehí ido en PBS, por 12 minutos a temperatura amb aldehído restante fue removido al enjuagar los ex 3 veces con solución reguladora del pH de HBS {HE e, No. Cat. 1681451), durante toda la noche a t ente (Figura 12A y Figura 12B) . En un experimen paralelo, el medio acondicionado de células sfectadas fue usado para el análisis de enlace igura 12A, paneles inferiores) .

Como se ve en la Figura 12B, los sitios de P se pierden de la superficie de axon sensorial a privación de NGF, sugiriendo que el ligando rado al medio acondicionado de axón después de la ica .

Como se muestra en la Figura 12C, estudios oríales nulos de BAX a las etapas de desarro tran que un inhibidor de Beta secretasa (BA uear la desaparición de los sitios de enlace de es sensoriales enseguida del retiro de NGF. En de izquierda a derecha, las tres fotografías nte de DRG y análisis de enlace de axón de ron a cabo como se describe anteriormente para Figura 12B. El inhibidor de BACE fue usado en e a concentración final de 1 uM (InSolutio ochem/Merck) . El inhibidor de alfa-secretasa en el análisis a una concentración final de 10 albiochem) . Para visualizar axones sensoriale ivos (teñidos mediante reacción de teñido colori ida en el ejemplo 9 anterior) , se tomaron im brillante en el microscopio Axioplan-2 de Ima zando los elementos de programación de c ision40 Liberación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de C ng Solutions. lo 10: La Proteína Precursora Amiloide (APP) es to de DR6 vados tanto en neuronas sensoriales como motrice actor de crecimiento (y en presencia de un in . La inmunoabsorción central en la Figura 13A m polipéptidos de APP que unen la banda imadamente 35 kDA son observados correspondient onda de anticuerpo anti-N-APP de polipéptidos ob oñas sensoriales privadas de factor de crecim cuerpo anti-N-APP policlonal usado para los exper ern blot a dilución de 1:100 fue obtenido tific (No. Cat. RB-9023-P1) . El polipéptido in P5 fue usado a 10 µ? (Tocris Biosciences, No. idor de péptido sintético permeable a la slocacion de Bax a mitocondria) .

La observación de que APP es un ligando e DR6-asociado fue confirmada adicionalmente entados en la inmunoabsorción mostrada en la der ciones: NaCl 150 mM, NP-40 al 0.2% (Calbiochem) , adora del pH PBS IX, durante toda la noche a s de NiNTA acopladas al ectodominio de DR6-ECD-H n luego lavadas 5 veces con un exceso de 10 ión reguladora del pH de enlace (NaCl 150 mM, (Calbiochem) , en solución reguladora del pH PBS ejos de proteína DR6-ECD asociados fueron eluid ión reguladora del pH de carga de muestra trogen) ) que fueron luego separados vía electro y sondados con anticuerpo anti-N-APP. Los dato imento de tracción de DR6-ECD i spondientemente polipéptidos de APP que incluyen te a aproximadamente 35 kDA.

El análisis de inmunoabsorción de DR6-AP icionado de axón se llevó a cabo de acuerd colo descrito previamente (Pettmann et al., KCPAGTYVSEHCT MSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWP ICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDV QNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPS STASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPH GEKSS AIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH (SEQ ID NO : 15 La Figura 13B muestra otra visualización d R6 en medio acondicionado de axón mediante inmun 6-AP. Estos datos de inmunoabsorción identifican olipéptidos de APP que incluyen la APP N-termina ién como los polipéptidos de APP C99-APP y C8 isis de inmunoabsorción de DR6-AP sobre medio acó xón se llevó a cabo de acuerdo con el protocol iamente (Pettmann et al., 1988, J. Neurosci. 8( ). La proteína de fusión de ectodominio de DR6-A generada como se describe anteriormente en el CD-His recombinante de ratón fue expresada y La Figura 14A provee fotografías que muest del ectodominio de APP ocurre prematuramente des ción de NGF. En la Figura 14A, neuronas a vari remoción del factor de crecimiento fueron , teñid uerpo policlonal de N-APP en presencia de un in gregado para bloquear la degeneración axonal . De recha, estas fotografías muestran la degeneració ras, también como a 3, 6, 12 y 24 horas desp ión de NGF (y la adición de anticuerpos anti-NGF) El anticuerpo anti-N-APP policlonal us lizar la expresión de APP superficial en exper de axón de APP fue obtenido de Thermo Scientific 23-?1) . Los cultivos de explante sensoriales se como se describe en el Ejemplo 6 y 7 anterior. E rivación de NGF se llevó a cabo como se iormente en el Ejemplo 7 con la modificación axones sensoriales (inmunofluorescencia mar uerpo anti-N-APP, Thermo Scientific (No. Cat. se tomaron imágenes en el microscopio de Axio ng Zeiss (en el canal de fluorescencia rojo) elementos de programación de computadora Ax ación 4.5.0.0 SP1 ,(03/2006) de Cari Zeiss ions.

La Figura 14B provee fotografías que muestr ominio de DR6 se enlaza a APP expresada po vadas . En la Figura 14B, de izquierda a derecha rafías superiores muestran células de COS as que expresan APP, sondeadas respectivamente, (que tiene el ectodominio de DR6) . Las dos f iores muestran el receptor de p75NTR y receptor sa células sondadas con DR6-AP . El ectodominio laza p75NTR o a células que expresan el receptor colo del fabricante. Doce horas post-transfe de célula de COS-1 fue cambiado a OPTI-ME (In nta y ocho horas post-transfección, el medio acó élula de COS-1 que contiene proteínas' de D ectado y filtrado.

La cantidad de proteínas de DR6-AP en el ificada de acuerdo con el siguiente procedimi litros de solución reguladora del pH 2XAP (pr ar 100 mg de fosfato de para-nitrofenilo (Si litros de MgCl2 1 M a 15 mi de dietanolamina 2 mezclado con un volumen igual de medio acondi la de COS transfectado o medio acondicionado t las COS-1 sin transfectar. El color de la rea lado , durante 12-15 minutos, con la O.D. está valo lineal (0.1-1). El volumen de reacción tado al agregar 800 microlitros de agua destilada colo del fabricante. Dos post-transfección, la n lavadas dos veces con la solución reguladora e (HBSS, Gibco No. Cat . 14175 - 095 , con BSA al %, CaCl2 5 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 20 mM, pH=7 . 0 ) . a cabo un análisis de enlace de AP al hacer una de medio acondicionado de DR6-AP y la solución pH de enlace, que fue aplicado directamente a que sobreexpresan APP e incubadas por 90 ratura ambiente. Enseguida de la incubación, las R6-AP sin enlazar fueron lavadas mediante en uag as de COS- 1 cinco veces con la solución regulad nlace. Luego las células se fijaron con fórmal diluido en PBS, por 12 minutos a temperatura am ldehido restante fue removido al enjuagar las con solución reguladora del pH de HBS (HEP . 0 , NaCl 150 mM) . La actividad de AP endógena fue che a temperatura ambiente (Figura 14B) .

En un experimento testigo en paralelo, icionado ele células de COS sin transfectar fue álisis de enlace de AP. Los receptores de p75NT membrana expresados en células de COS-1 no n enlace específico a la proteína de fusión ra 14B) bajo las mismas condiciones experiméntal a que la interacción entre el ectodominio de DR6 ífica .

La Figura 14C provee fotografías que muestr receptor principal para N-APP sobre axones sen os sitios de enlace de APP son agotados signific as células neuronales de ratones nulos DR6. En de izquierda a derecha, las tres fotografías ran neuronas obtenidas de un ratón DR6 +/- (het) un testigo de AP, N-APP-AP y Sema3A-AP, respec n 19:539-545). La línea de ratón nulo de DR6 ( descrita previamente (Zhao et al., J. Exp. Med. 2001) . Los cultivos de explante de DRG y an e de axón de DR6 se llevaron a cabo como se iormente en el Ejemplo 9 para la Figura 12A y Fi La Figura 14D provee fotografías que mué uerpos de DR6 antagonistas disrumpen la interac todominio de DR6 y APP neuronal . En estos estud agregada a células neuronales que expresan DR lizado con anticuerpo anti-N-APP. De izquierda rimeras cuatro fotografías muestran la habilida enlazarse a DR6 sobre la superficie de ne ncía de: una IgG de control; el anticuerpo .7; el anticuerpo anti-DR6 3F4.4.8; y el anticu B6.9.7, respectivamente. La fotografía a la dere ra el teñido de DR6 sobre células utilizando u FBS al 10% (Gibco) fueron transfectadas con 15 m constructo de expresión de fusión de N-APP-His eactivo de transfección FuGene (Roche) de acuer colo del fabricante. Doce horas post-transfe de célula de COS-1 fue cambiado a OPTI- EM (In nta y ocho horas post-transfección, el medio acó élula de COS-1 que contiene proteínas de N-AP ectado y filtrado. La concentración de N-AP minada mediante análisis de Western blot con el N-APP descrito anteriormente.

La secuencia de aminoácidos de N-APP-His hu te análisis de enlace es como sigue: ALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLK^^ ILQYCQEVYPELQITNWEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRC KC FLHQER DVCETHLHWHTVA ETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKF NVDSADAEEDHHHHHH (SEQ ID NO : 10) normal (Genentech Inc) fue agregada a 20 µg/ml acondicionado de N-APP-His y la solución regu enlace en un experimento testigo.

El enlace de N-APP a células que expresan e R6 fue visualizado mediante teñido de inmunoflu el anticuerpo anti-N-APP (Thermo Scientific No. -Pl) de acuerdo con los protocolos conocidos ribe en los protocolos de los Ejemplos 6 y 7 (Oka ré, 2006, Vol . 444, 369-373). Para visualizar l -APP enlazada al receptor de DR6 sobre la lar (inmunofluorescencia marcada con , anticuerpo a o Scientific (No. Cat . RB-9023-P1 ) ) , se tomaro l microscopio Axioplan-2 de Imaging Zeiss (en rescencia rojo) utilizando los elementos de progr tadora AxioVision40 Liberación 4.5.0.0 SPl (03 Zeiss Imaging Solutions. ticuerpo anti-APP, respectivamente.

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en la Figura 15A son como sigue. El a vivencia de explante conmisural se llevó a dades indicadas del anticuerpo anti-N-APP mo Scientific No. Cat . RB- 9023-P1, dializado ext de testigo (IgG de conejo, R&D Systems) como s s protocolos del Ejemplo 2 y los datos genera a 4B. Para visualizar axones conmisurales GFP-ma on imágenes en el microscopio invertido de Axi (en canal de fluorescencia verde para GFP) ntos de programación de computadora Ax ación 4.5. 0 . 0 SPl ( 03 / 2006 ) de Cari . Zeis ions .

La Figura 15B provee fotografías que muestr uerpos APP N-terminales inhibieron la degenerac ctivamente .

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta Figura 15B son como sigue. E ivación de NGF se llevó a cabo en cámaras de Cam scribe anteriormente en el Ejemplo 8. Anticuerpo nal usados en el análisis fueron anticuerpo lonal (Thermo Scientific No. Cat. RB-9023-P1, samente) o anticuerpo monoclonal 22C11 (22C11, zado extensamente) . IgG normal (IgG de co ms) fue agregada como un experimento testigo. La inmunofluorescencia de axones sensoriales con (1:500, Covance) se llevó a cabo como se descri los 1, 7 y 8. Para visualizar axones sensoriale ofluorescentemente en compartimientos axonale as de Campenot, se tomaron imágenes en el m lan-2 de Imaging Zeiss utilizando los ele CE-I) respectivamente. Las tres fotografías infe Figura 15C muestran correspondientemente ivadas en presencia de NGF) también como: un t un inhibidor de BACE, y N-APP (y BACE-I) respect Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta Figura 15C son como sigue. El ivación de NGF se llevó a cabo en cámaras de Cam scribe anteriormente en el Ejemplo 8. Los amino recombinantes humanos 19-306 usados en este n comprados de Novus (Novus Biologicals, . 0351-P01) . N-APP fue agregada a 3 µg/ml j idor de BACE (concentración final de 1 µ?, 2, Calbiochem/Merck) , al tiempo de privación d idor de BACE fue usado en el análisis a una con de 1 uM (InSolution OM99-2, Calbiochem/M ción de inmunofluorescencxa de axones sensor vadas en presencia de inhibidor de BACE a ar inducida por N-APP. En la Figura 15D, de iz ha, las tres fotografías superiores muestran vadas en presencia de un ARNi testigo. Estas f iores muestran un testigo también como neuronas µg/ml de N-APP o 0.1 µg/ml de N-APP , respectiva fotografías inferiores muestran neuronas cult ncia de un ARNi de APP. Estas fotografías ran un testigo, también como neuronas cultiva de N-APP o 0.1 µg/ml de N-APP, respectivamente .

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta Figura 15D son como sigue. en cultivos de explante conmisurales se llevó a describe en el Ejemplo 2. Los aminoácidos binantes humanos 19-306 usados en este anális ado de Novus {Novus Biologicals, No. Cat . H0000 amación de computadora AxioVision40 Liberación 4. 006) de Cari Zeiss Imaging Solutions. ío 12 ; DR6 es Requerido para la Degeneraci ida por APP pero No la Degeneración Disparada po Como se muestra en la Figura 16A, la acti es requerida para la degeneración axonal induci En la Figura 16A de izquierda a derecha, rafías superiores muestran neuronas obtenidas de +/- (het) . La primera fotografía muestra neuron xpuestas a Abeta o N-APP, la segunda fotografí nas expuestas a Abeta, y la tercera fotografí nas expuestas a N-APP. Las tres fotografías ran neuronas obtenidas de un ratón de DR6 -/- erda a derecha, la primera fotografía inferio binantes humanos 19-306 usados en este aná ados de Novus (Novus Biologicals, No. Cat. H0000 aminoácidos beta amiloides humanos recombina s en este análisis fueron comprados de Chemicon iumano ultrapuro, No. Cat. AG912, .Chemicon). ado a explantes conmisurales a 3 µ?G/ml, 24 hor la deposición, junto con el inhibidor de ácidos beta amiloides humanos recombinantes 1- ado a explantes conmisurales a una concentració oras después de la deposición, junto con el in . El . inhibidor de BACE fue usado en el análi ntración final de 1 µ? (InSolution ochem/Merck) . Los explantes conmisurales fueron las cantidades indicadas de N-APP o Abeta por onales . Los datos fueron recolectados 48 horas eposición de explante conmisural. Para visualiz nas en presencia de BACE-I y neuronas en pre I y Abeta. En la Figura 16B, las dos f iores muestran neuronas en presencia de BACE-I uerpo anti-DR6 4B6.9.7, y luego neuronas en pre I, Abeta y anticuerpo anti-DR6 3F4.4.8.

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta Figura 16B son como sigue. C nte conmisural y análisis de sobrevivencia se 1 como se describe en el Ejemplo 2. Los aminoác ides humanos recombinantes 1-42 usados en este n comprados de Chemicon (Abeta 1-42 humano ultr AG912, Chemicon). El inhibidor de BACE fue us sis a una concentración final de 1 uM (InSoluti ochem/Merck) . Los aminoácidos beta amiloides binantes 1-42 fueron agregados a explantes conm concentración de 3 uM, 24 horas después de la d con ectodominio de DR6 como se describe en el rior. Como se indica, los anticuerpos de DR6 desi resente son anticuerpos 4B6.9.7 y 3F4.4.8 uerpos de DR6 descritos en el Ejemplo 3. Para xones conmisurales GFP-marcados , se tomaron imág scopio invertido Axiovert 200 de Zeiss (en el escencia verde de GFP) utilizando los ele amación de computadora AxioVision40 Liberación 4. 006) de Cari Zeiss Imaging Solutions. ío 13; Señalización de DR6 Intracelular Las caspasas son factores importantes en l e celular programada (véase, por ejemplo Grutte . Opin. Struct. Biol . 10(6}:649-55 (2000); Kuid e 384 (6607) :368-72 (1996): y Finn et al., J. .-1333-41 (2000)), y algunas caspasas están asoc a Figura 17A, la degeneración axonal es retarda ición de JNK y la caspasa-8 corriente arriba, p spasa-3 corriente abajo.

En la figura 17A, las dos fotografía erda, en orden descendente, muestran neuronas s stas a NGF y anticuerpo anti-NGF, respectivamen a 11A, las cuatro fotografías en la derecha, ndenté, muestran neuronas sensoriales expu uerpo anti-NGF y un inhibidor de JNK; anticuerp inhibidor de caspasa-8; anticuerpo anti-NGF y un AX; y anticuerpo anti-NGF y un inhibidor de ctivamente .

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta Figura 17A son como sigue. E rivación de NGF en las cámaras de Campenot se li se describe anteriormente en el Ejemplo 8. El in de ratón nulo de Bax (Bax-Rl) fue descrita p werth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 199 ida de Jackson Lab. La marcación por inmunoflu xones sensoriales con el anticuerpo de TUJ ice) se llevó a cabo como se describe en los Eje 8. Para visualizar axones sensoriales ofluorescentemente en compartimientos axonale as de Campenot, se tomaron imágenes en el m lan-2 de Imaging Zeiss utilizando los ele amación de computadora de AxioVision40 Liberaci (03/2006) de Cari Zeiss Imaging Solutions.

Figura 17B provee fotografías de neuronas m ivos de explante de neurona motriz E12.5 y muest asa-3 funciona en cuerpos celulares, mientra sa-6 funciona en axones.

En la Figura 17B, de izquierda a derecha, ntración de 10 µ? (Z-DEVD-FMK, No. Cat. iochem) . El inhibidor de caspasa-6, Z-VEID-FMK, Ste análisis a 10 uM (Z-VEID-FMK, No. Cat. 55037 nson and. Company PHARMINGEN División) . El an vivencia de médula espinal ventral de neurona a cabo como se describe en el Ejemplo 6 ant ción por inmunofluorescencia de axones mot uerpo TUJl (1:500, Covance) se llevó a cabo ibe en los Ejemplos 1, 7 y 8. Para visualiz ces marcados inmunofluorescentemente, se tomaro i microscopio Axioplan-2 de Imaging Zeiss utili ntos de programación de computadora Ax ación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de Cari Zeis ions .

La Figura 17C provee fotografías de ríales cultivadas por 5 días y luego expuestas or 16, 24 y 48 horas, respectivamente.

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en la Figura 17C son como sigue. El a ción de NGF en cámaras de Campenot se llevó a ca ibe anteriormente en el Ejemplo 8 anterior. La nulo de Bax (Bax-Rl) fue descrita previamente ., Neuron 17:401-411, 1996) y fue obtenida fro El anticuerpo de NGF fue usado en el análisis de F en el compartimiento axonal de cámaras de -NGF #911 de función monoclonal, Genentech, 20 ción por inmunoflúoresceneia de axones sensor uerpo TUJl (1:500, Covance) se llevó a cabo ibe en los Ejemplos 1, 7 y 8. Para visualiz riales marcados inmunofluorescentemente en compa les de las cámaras de Campenot, se tomaron imág scopio Axioplan-2 de Imaging 2,eiss (en jrafías superiores muestran un análisis de GFP de Lgo en comparación con neuronas cultivadas con un aspasa-3 o caspasa-6, respectivamente. Las tres f iores muestran correspondientemente un análisis te celular) de neuronas testigo, en compar >nas cultivadas con un inhibidor de caspasa-3 o ctivamente .

Los materiales y métodos usados para ge mostrados en esta Figura 17D son como sigue. Lo plante conmisural y análisis de sobrevivencia s bo como se describe en el Ejemplo 2. La muert amada en cuerpos celulares conmisurales fue visu vos de explante conmisural mediante análisis se describe en el Ejemplo 7 anterior. Los surales se fijaron en PFA/PBS al 4% y proces ción de muerte celular programada (apoptosis) a ochem) . El inhibidor de caspasa-6, Z-VEID-FMK, e análisis a una concentración de 10 µ? (Z-VEI 550379, Becton, Dickinson and Company, ion) . Para visualizar axones conmisurales GFP-ma on imágenes en el microscopio invertido de Axiov (en el canal de fluorescencia verde para GFP) elementos de programación de computadora Ax ación 4.5.0.0 SPl (03/2006) de Cari Zeiss ions . Para visualizar cuerpos de célula apoptóti ivos marcados fluorescentemente, se tomaron imág scopio Axioplan-2 de Imaging Zeiss (en escencia rojo para TUNNEL) utilizcindo los ele amación de computadora AxioVision40 Liberación 4. 006) de Cari Zeiss Imaging Solutions. ío 14; Actividad Antagonista de DR6 en Modelos de ógicos asociados con este síndrome que son obse modelo de animal (véase, por ejemplo Moechars science 91 (3 ): 819-830 (1999)). Una variedad s murinas transgénicas tales como las líneas tr y JNPL3 expresan polipéptidos asociados a tes y exhiben además pérdida de célula neuronal . es transgénicos APP23 y J PL3 proveen modelos al nfermedad de Alzheimer. en los cuales antagonist n ser administrados (véase, por ejemplo McGowa s in Genetics 22(5) (2006).

Los ratones transgénicos S03D1 G93A ex éptido mutante de superóxido dismutasa humano es elevados de expresión de caspasa-3, tam osis de neurona motriz. Los ratones transgénico proveen un modelo de esclerosis lateral amiotr ser usado para examinar los efectos de antago delo de enfermedad de Huntington que puede ser u ar los efectos de antagonistas de DR6 sobre los ógicos asociados con este síndrome que son obse modelo de animal (véase, por ejemplo Wang et al. sci. 26: 633-641 (2007)). Los ratones transgéni presan el producto de proteína del gen de Park-2 alidades que se asemejan a la enfermedad de Par n neuronas que son más susceptibles a apop ias de ratones tipo silvestre (véase, por ejos et al., J. Neurochem. 97(4): 934-46 (20 es transgénicos PK-KO proveen un modelo de enfe nson que puede ser usado para caracterizar los onistas de DR6 sobre los procesos patológicos ste síndrome que son observados en este modelo s, un número de líneas de ratón transgénicos t es Smn-/-SMN2, ratones transgénicos que report 15 (2): 275-280 (2004); Ferri et al . , Cu Apr 15; 13 ( 8 ) : 66 -73 ; y Rossol et al . , J. Ce ien 163 (4) :801-812 (2003)) . Tales líneas génicas proveen consecuentemente modelos de al muscular que pueden ser usados para carácte os de antagonistas de DR6 sobre los procesos p ados con este síndrome que son observados en es imal .

Modelos de animales de condiciones o al lógicas que incluyen aquellas indicadas ant n ser usados para examinar los efectos de los an R6 revelados en la presente, por ejemplo u uerpos que se enlazan a DR6 (por ejemplo, el lonal 3F4.4.8, 4B6.9.7 ó 1E5.5.7), y/o una o les de DR6 que se enlazan a APP (por ejemplo ende los aminoácidos 1-354 de SEQ ID NO: 1), y/o grupo de prueba de estos animales puede istrado con un antagonista de DR6 seleccionado protocolo de administración específico (por ej ción intraperitoneal de un anticuerpo antagonist /Kg de peso corporal para cada inyección cada d un período de seis meses) . Las condiciones p s de prueba se pueden hacer variar de acuerd icas estándar, por ejemplo: al administrar ente del antagonista de DR6 (por ejemplo, 1, de peso corporal) ; al administrar un programa ntagonista de DR6 (por ejemplo, una inyección c n período de 12 meses) ; al administrar un anta iferente (por ejemplo, una inmunoadhesina de DR6) ombinación de agentes (por ejemplo, el antagonis mbinación con un inhibidor de colinesterasa) ; al de administración diferente (por ejemplo, admi . Por ejemplo, muestras que comprenden células n tejido u órgano especifico (por ejemplo, el c s de prueba y testigo .de estos animales p ados mediante una técnica tal como micros ancia magnética y/o análisis inmunohistoquimico. omparar el estatus de células neuronales en est e, por ejemplo Petrik et al., Neuromolec .-216-29 (2007)). Alternativamente, muestras obt grupos pueden ser evaluadas mediante una técnic scopía de multi-fOtones con el fin de demostrar como trayectoria de neurita alterada, pérdida ítica o adelgazamiento de dendritas (véase, po et al., Nat. Neurosci. 7:1181-1183 (2004) : y J. Neurosci. 25:7278-7287 (2005)) . Alterna tras de sangre u otras muestras de tejido obt grupos pueden ser sometidas a protocolos ice 274, 99-102 (1996); Janus et al;, Nature 4 ) ; Morgan et al., Nature 408:982-985 (2000); y E Behav. Brain Res. 1988, 31:47-59). Los resu raciones entre los grupos de prueba y grupo identes de animales permitirán a aquellos expe arte examinar los efectos de antagonistas de D s modelos de animales .

Los Ejemplos 1-13, los datos incluidos en caracterización asociad de estos datos evidenci onistas de DR6 , por ejemplo, inhibirán la apo as neuronales in vivo. En particular, los Eje iores enseñan por ejemplo que: (1) DR6 induce ap amplia variedad de células neuronales; (2) A do cognato para DR6 que se enlaza a DR6 y d osis moderada por DR6; y (3) antagonistas de en la interacción de enlace de DR6/APP onistas de DR6, como se describe en la presente. ío 15: Tratamiento de anticuerpo de Ra.l (" Ra* 3 (W3F4.4.8") y Ra.4 en un modelo de animal al muscular La atrofia espinal muscular (SMA) es una urona motriz recesiva que afecta las neuronas m erno anterior de la médula espinal y se cree q a reducción de proteína de SMN (neurona vivencia) . Un modelo de animal de SMA es la líne génico que tiene la designación de cepa N2*delta7) 4299Ahmb Tg ( SMN2 ) 89Ahmb SmnltmlMsd/J ( e.g. Le et al., Human Molecular Genetics 14( ) . Este ratón mutante triple alberga do génicos y un solo mutante objetivo.

N2*delta7 ) 4299Ahmb consiste de un axon7 que care debilidad muscular son evidentes y se esivamente más pronunciados en la siguiente La que los ratones muestran una marcha imiento en las extremidades posteriores y una t La sobrevivencia media es de aproximadamente t es mutantes triples exhiben además respuestas de derezamiento superficial, geotaxis negativa y a ilados pero no a la estimulación táctil. La z espontánea y fuerzas de agarre tam ficativamente deteriorados en estos ratones (v ío Butchbachet al., NeurobiolDis . 27(2):207-19 siguientes protocolos están diseñados para deter os de ciertos anticuerpos, tales como a onistas de DR6 y dosis sobre la sobreviven ral y tono muscular de ratones modelo de SMA delt Como se indica anteriormente, ratones usado y miércoles. El genotipado puede ser efectuado variedad de metodologías conocidas en el loutilizando selecciones de servicio de geno atizados para mutaciones transgénicas , knockea a y knockeadas hacia adentro en biopsias c nibles comercialmente de compañías de d ular tales como Transnetyx Inc. Tales datos de disponibles comúnmente en el transcurso de és del nacimiento.

Los ratones nacidos por ejemplo en el lunes n ser usados en experimentos ilustrativos. Lo n ser dosificados IP iniciando en P3. Un número studio puede ser: (1) por ejemplo en promedio, s y 5 hembras) testigos con vehículo tales il; (2) por ejemplo en promedio 10 KO (5 m as) con una primera dosis del anticuerpo respe Los anticuerpos 4B6.9.7, IE5.5.7, 3F4.4.8 n ser almacenados a 4°C. Esos anticuerpos p tados a temperatura ambiente antes de la dosifi ecesario. Se pueden usar vehículos típicos tales ras que los anticuerpos monoclonales 4B6.9.7, .8, y 2C7.3.7 en este ejemplo fueron generados secuencia de polipéptido de DR6 humana como i estos anticuerpos reaccionan tanto con humano rata y DR6 de ratón como se muestra por los como la degeneración de axón y análisis de itos en el ejemplo 7.

En una modalidad ilustrativa, los antagonis ados pueden ser anticuerpos antagonistas: .7, 3F4.4.8 y 2C7.3.7; el número de grupos de t anticuerpo pueden ser dos (con 10 animales por de administración puede ser IP y el intervalo da animal en el estudio (véase el protocolo de rativo provisto a continuación) .

El día de nacimiento (PO) los cachorros p dos utilizando una tinta no tóxica aplicada bajo uestra de cola recortada es tomada para el genot tados pueden estar normalmente disponibles curso de 48 horas) . En el día del experimento sas con neonatos pueden ser traídas a la sala ex ismo tiempo cada día y dejados sin alterar por minutos antes de que comiencen las pruebas . Los n ser probados primero en la prueba de geotaxis ubo de ensayo (2 pruebas consecutivas en el o) . Un cachorro puede ser colocado en el bloque que todos los cachorros en la carnada son probad los cachorros son devueltos a su represa (los n ser mezclados con su carnada de jaula para mi xaminados en cuanto a diferencias mediante prot n en los que se incluyen geotaxis . Geotaxis idad del animal para orientarse por sí mismo ado cara hacia abajo sobre una plataforma inclin a mide la coordinación motriz y el sistema vestib La evaluación de sobrevivencia puede ser zando el análisis de Kaplan-Meier con Mantel-Co a post-hoc.

Para analizar datos con mediciones repetid del tiempo, se pueden emplear modelos de efecto ién conocidos como modelos de A OVA mezclad dimiento está basado en la estimulación de proba ,de la estimación de momento como el análisis d as repetidas típicas, pero es más robusto ntes debido a fatalidades de ratón con el paso d los modelos pueden ser ajustados utili suero de 4B6.9.7, IE5.5.7, 3F4.4.8 y 2C7.3.7 ito de material Los siguientes materiales han sido deposita can Type Culture Collection, 10801 Univer sas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Este depósito fue hecho bajo las estipulaciones del itud de patente extranjera o estadounidense, lo que ocurr a disponibilidad de la progenie al determinado por el entes y marcas de los Estados Unidos de América que ti smo de acuerdo con 35 U.S.C. § 122 y las reglas del com o con las mismas (incluyendo 37 CFR § 1.14 con ular a 886 OG 638) .

El cesionario de la presente solicitud ha acordad o de los materiales en el depósito muere o se pierde o e es cultivado bajo condiciones apropiadas, los mater menté reemplazados en notificación con otro del ibilidad del material depositado no será interpretada co llevar a la práctica la invención en contravención a l dos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuer de patentes.

La descripción escrita anterior se considera sufi tir al experimentado en el arte llevar a la práctica la

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para seleccionar compuestos q urodegeneración, caracterizado porque comprende: (a) cultivar neuronas que expresan APP ficie y (b) estimular la muda de APP en dichas ne ncia o ausencia de un compuesto candidato; en' donde una reducción de la muda observada ncia de dicho compuesto candidato, en comparaci observada de APP en ausencia de dicho compuesto a que dicho compuesto candidato es inhi degeneración . 2. El método de conformidad con la reivind terizado porque la muda es estimulada por la pri r trófico . 3. El método de conformidad con la reivind eterizado porque el compuesto candidato reduc rvada en comparación con la muda observada en au uesto candidato por 10-30%. 8. El método de conformidad con la reivind eterizado porque el compuesto candidato reduc rvada en comparación con la muda observada en pr O compuesto candidato por 30-50%. 9. El método de conformidad con la reivind Cterizado porque el compuesto candidato reduc rvada en comparación con la muda observada en a O compuesto candidato por 50-70%. 10. El método de conformidad con la reivind Cterizado porque el compuesto candidato reduc rvada en comparación con la muda observada en a o compuesto candidato por 70-90%. 11. El método de conformidad con la reivind en donde una reducción de neurodegeneracion resencia de dicho compuesto candidato, en compa eurodegeneración observada en ausencia de dicho dato indica que el compuesto candidato es un in degeneración . 13. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque la neurodegeneracion es esti ivación del factor trófico. 14. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque el factor trófico es NGF. 15. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque las neuronas son neuronas se 16. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque las neuronas son neuronas mo 17. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque la muda es estimulada degeneración observada en ausencia del compuesto 50-50%. 20. El método de conformidad con la reivi caracterizado porque el compuesto candidato degeneración observada en comparación degeneración observada en ausencia del compuesto 0-70%. 21. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque el compuesto candidato degeneración observada en comparación degeneración observada en ausencia del compuesto 0-90%. 22. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque el compuesto candidato degeneracion observada en comparación degeneracion observada en ausencia del compuesto