MX2010012163A

MX2010012163A - Composiciones para mejorar la actividad antibacteriana de mieloperoxidasa y metodos de uso de las mismas.

Info

Publication number: MX2010012163A
Application number: MX2010012163A
Authority: MX
Inventors: Sophie Becquerelle; William Haag; Obsidiana Abril-Horpel; Shri Valvani
Original assignee: Exoxemis Inc
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2009-05-07
Publication date: 2010-11-30
Also published as: IL208438A0; KR101612140B1; KR20110021760A; BRPI0909447A2; JP2014058563A; RU2529799C2; IL208438A; JP5643189B2; CN102014950A; EP2296693A1; ZA201006308B; WO2009137697A1; EP2296693A4; EP2296693B1; CA2719706A1; AU2009244215A1; CA2719706C; AU2009244215B2; RU2014127120A; US8945540B2

Abstract

Se proporcionan métodos y composiciones para inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles al poner en contacto los microorganismos, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, con mieloperoxidasa y aminoácidos del agente mejorador de la actividad.

Description

COMPOSICIONES PARA MEJORAR LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE MIELOPEROXIDASA Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención sé refiere a métodos y composiciones para la inhibición o tratamiento de infecciones microbianas. Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos y composiciones que utilizan una combinación de aminoácidos y mieloperoxidasa para mejorar las propiedades microbicidas del sistema.

Antecedentes de la Invención Como se da a conocer en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,888,505 y 6,294,168, la mieloperoxidasa se puede utilizar para enlazarse selectivamente a y, en presencia de peróxido y haluro, para inhibir el crecimiento de microorganismos objetivo sin eliminar los microorganismos deseables o dañar significativamente otros componentes del medio, tales como células hospedantes y flora no mal, en el ambiente del microorganismo objetivo. Se ha sabido previamente que la mieloperoxidasa exhibe actividad de eliminación de microorganismos en sistemas naturales cuando se presenta con un cofactor de haluro apropiado (X") y peróxido de hidrógeno como substrato (Klebanoff, J". Bacteriol 95:2131-2138, 1968). Sin embargo, el carácter selectivo del enlace de mieloperoxidasa y la utilidad de estos sistemas REF: 213803 para aplicaciones terapéuticas, de investigación e industriales solo se han reconocido recientemente. Debido a las propiedades de enlace selectivo recientemente descubiertas de la mieloperoxidasa, cuando un microorganismo objetivo, tal como un microorganismo patógeno, tiene una capacidad de enlace para la mieloperoxidasa mayor que aquel de un microorganismo deseado, tal como los miembros de la flora normal, el microorganismo objetivo se enlaza selectivamente a la mieloperoxidasa con poco o nada de enlace de la mieloperoxidasa por el microorganismo deseado. En presencia de peróxido y haluro, la mieloperoxidasa enlazada, objetivo cataliza la oxidación de haluro y facilita la dismutación de peróxido a oxígeno molecular singulete (102) en la superficie del microorganismo objetivo, dando por resultado la eliminación selectiva del microorganismo objetivo con un mínimo de daño colateral al microorganismo o medio fisiológico deseado. De esta manera, como se da a conocer en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,888,505 y 6,294,168, la mieloperoxidasa se puede emplear como un antiséptico en el tratamiento terapéutico o profiláctico de sujetos humanos o animales para enlazarse selectivamente a y eliminar microorganismos patógenos con un mínimo de daño colateral a las células hospedantes y flora normal del hospedante .

El sistema también se puede emplear como formulaciones desinfectantes o esterilizantes para inhibir el crecimiento de microorganismos objetivo in vitro, particularmente en aplicaciones donde dispositivos biomédicos, tales como vendajes, instrumentos quirúrgicos, dispositivos de sutura, catéteres, utensilios dentales, lentes de contacto y similares son tratados antisépticamente para inhibir el crecimiento de microorganismos objetivo sin dañar las células hospedantes de un sujeto cuando el dispositivo biomédico se utiliza subsecuentemente in vivo.

Como se da a conocer en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,389,369 y 5,451,402, mientras que el sistema antiséptico de mieloperoxidasa dado a conocer en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,888,505 y 6,294,168 se ha descubierto que es sumamente efectivo en el tratamiento de microbios patógenos, se puede requerir un agente mej orador de la actividad antimicrobiana para la eliminación efectiva de microorganismos que forman levadura y esporas. La etapa de esporas del ciclo de vida microbiano se caracteriza por una inactividad metabólica y resistencia a factores ambientales que destruirían el microbio en su etapa vegetativa. La primera fase de la germinación de esporas se caracteriza por el abultamiento y un cambio de inactividad a metabolismo activo. Sigue el crecimiento vegetativo, por ejemplo, el brote y finalmente la reproducción.

La germinación de endoesporas bacterianas y esporas fúngales está asociada con un metabolismo incrementado y resistencia disminuida al calor y reactivos químicos. Para que ocurra la germinación, la espora debe percibir que el ambiente es adecuado para soportar la vegetación y reproducción. Se reporta que el aminoácido L-alanina estimula la germinación de esporas bacterianas (Hills, J. Gen. Microbiol. 4:38, 1950; Halvorson y Church, Bacteriol . Rev. 21:112, 1957). También se ha reportado que la L-alanina y la L-prolina inician la germinación de esporas fúngales (Yanagita, Aren. Mikrobiol . 26:329, 1957).

Los a-aminoácidos simples, tales como glicina y L-alanina, ocupan una posición central en el metabolismo. La transaminación o desaminación de a-aminoácidos producen los carbohidratos glicógenos o cetógenos y el nitrógeno necesario para el metabolismo y crecimiento. Por ejemplo, la transaminación o desaminación de L-alanina produce piruvato, el cual es el producto final del metabolismo glicólico (Vía de Embden-Meyerhof -Pamas) . La oxidación de piruvato por medio del complejo de piruvato deshidrogenasa produce acetil -CoA, NADH, H+ y C02. El acetil-CoA es el substrato iniciador para el ciclo del ácido tricarboxílico (Ciclo de Kreb) , el cual a su vez alimenta la cadena de transporte de electrones mitocondrial . El acetil-CoA también es la fuente de carbono final para la síntesis de ácidos grasos así como también para la síntesis de esterol . Los a-aminoácidos simples pueden proporcionar el nitrógeno, C02, equivalentes glicógenos y/o cetógenos requeridos para la germinación y la actividad metabólica que sigue.

Por consiguiente, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,389,369 y 5,451,402 dan a conocer que la acción microbicida de la mieloperoxidasa contra formas de levadura y esporulares de los microbios se pueden mejorar por medio del tratamiento de los microorganismos con mieloperoxidasa en combinación con ciertos a-aminoácidos que proporcionan un efecto estimulante sobre la brotadura de levadura, germinación de microbios esporulados y posiblemente la aceleración del metabolismo de microbios vegetativos. Los oc-aminoácidos representativos dados a conocer para este propósito incluyen glicina y los L- o D-enantiómeros de alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, fenilalanina , tirosina y los ésteres alquílicos de los mismos. Mientras que las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,389,369 y 5,451,402 dan a conocer el mejoramiento de la actividad microbicida de la mieloperoxidasa contra formas de levadura y esporulares de microbios con a-aminoácidos, estas patentes no dan a conocer el mejoramiento del sistema microbicida de la mieloperoxidasa contra bacterias no esporulares o el mejoramiento adicional de la actividad antibacteriana por medio del uso de mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos, como se da a conocer en este documento .

Breve Descripción de la Invención Esta breve descripción se proporciona para presentar una selección de conceptos en una forma simplificada que se describe adicionalmente más adelante en la Descripción Detallada. Esta breve descripción no tiene por objeto identificar las características clave del contenido reclamado, ni tiene por objeto ser utilizado como un auxiliar en la determinación del alcance del contenido reclamado.

La presente invención se dirige a composiciones y métodos para la eliminación o inhibición de infecciones microbianas, tales como infecciones bacterianas, al poner en contacto el sitio de infección con una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. En la práctica de la invención, los microorganismos susceptibles son eliminados o inhibidos por medio del contacto de los microorganismos con cantidades de mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que son efectivos en presencia de un peróxido o bromuro o cloruro, para inhibir el crecimiento de o eliminar los microorganismos .

De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona composiciones para inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles que comprenden mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa . En algunas modalidades, por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenil-alanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3-aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2,3-diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2,3-diaminopropiónico, ácido L-3-aminoisobutírico, ácido D-3-aminoisobutírico, 3 -aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En otras modalidades, por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D- treonina, L-tirosina, L-valina y D-Valina, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

En otros aspectos, la invención proporciona composiciones para inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles que comprenden mieloperoxidasa y por lo menos tres aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, 1-prolina, L-hidroxiprolina , L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3-aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3 -diaminopropionico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3 -diaminopropionico, ácido L-3-aminoisobutírico, ácido D-3-aminoisobutírico, 3 -aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En otros aspectos, por lo menos los tres aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L- hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

En algunas modalidades, las composiciones de la invención comprenden además peróxido de hidrógeno o una fuente de peróxido de hidrógeno. En este aspecto de la invención, las composiciones pueden comprender una oxidasa productora de peróxido que produce peróxido de hidrógeno en presencia de un substrato para la oxidasa. En algunas modalidades, las composiciones comprenden una oxidasa productora de peróxido que es efectiva para generar de 100 pmol a 50 µ???? de peróxido por mi por minuto cuando se encuentra en presencia de un substrato para la oxidasa.

En una modalidad, las composiciones de la invención comprenden de 1 a 50,000 g/ml de mieloperoxidasa . En otras modalidades, las composiciones de la invención comprenden de 0.1 a aproximadamente 500 mM de cada uno de por lo menos los dos aminoácidos. En una modalidad representativa, las composiciones de la invención comprenden de 10 a 5,000 µg/ml de mieloperoxidasa, de 0.3 a 50 mM de glicina, de 0.3 a 50 mM de L-alanina, de 0.3 a 50 mM de L-prolina y de 1 a 500 U/ml de glucosa oxidasa.

En otros aspectos, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto humano o animal necesitado de este tratamiento que comprenden administrar a un sitio de infección en el sujeto una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. En algunas modalidades de este aspecto de la invención, por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina , L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3-diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2, 3-diaminopropiónico, ácido L-3-amino-isobutírico, ácido D-3-aminoisobutírico, 3-aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En otras modalidades de este aspecto de la invención, por los menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D- isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

En otras modalidades, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto humano o animal necesitado de este tratamiento que comprenden administrar a un sitio de infección en el sujeto una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos tres aminoácidos que funcionan en combinación, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. En algunas modalidades, por lo menos los tres aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina , L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3 -diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3-diaminopropiónico, ácido L-3 -aminoisobutírico, ácido D-3 -aminoisobutírico, 3-aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster ¦ alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En otras modalidades, por lo menos los tres aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L- histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L- prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D- treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

En otras modalidades, la composición administrada al sujeto humano o animal puede comprender adicionalmente peróxido de hidrógeno o una fuente de peróxido de hidrógeno. En algunas modalidades, la fuente de peróxido de hidrógeno comprende una oxidasa productora de peróxido que produce peróxido de hidrógeno en presencia de un substrato para la oxidasa. Por ejemplo, la composición administrada al sujeto humano o animal puede comprender adicionalmente una oxidasa productora de peróxido que es efectiva para generar de 100 pmol a 50 µp??? de peróxido por mi por minuto cuando se encuentra en presencia de un substrato para la oxidasa.

En algunas modalidades, la composición administrada al sujeto humano o' animal puede comprender de 1 a 50,000 de mieloperoxidasa . En otras modalidades, la composición administrada al sujeto humano o animal puede comprender de 0.1 a aproximadamente 500 mM de cada uno de por lo menos los dos aminoácidos. En una modalidad representativa, la composición administrada al sujeto humano o animal puede comprender de 10 a 5,000 µ9/t?1 de mieloperoxidasa, de 0.3 a 50 mM de glicina, de 0.3 a 50 mM de L-alanina, de 0.3 a 50 mM de L-prolina, de 1 a 500 U/ml de glucosa oxidasa y de 1 a 500 mM de glucosa.

En algunos aspectos de la invención, el sujeto humano o animal a ser tratado está sufriendo de una infección microbiana de las encías, ojos, orejas, piel, tejido suave, heridas, áreas vaginales, áreas inguinales, escaras o áreas de quemaduras. En algunas modalidades, la infección es una infección polimicrobiana . En otras modalidades, la infección es causada, por lo menos en parte, por un microorganismo resistente a múltiples fármacos.

En otros aspectos, la invención proporciona métodos para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles que comprenden poner en contacto los microorganismos, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, con una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.

Descripción de las Figuras Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes de esta invención llegaran a ser apreciados más fácilmente en la medida en que los mismos lleguen a ser mejor entendidos por referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se tomen en conjunción con las figuras asociados, en donde: Las FIGURAS 1A y IB son un análisis de tiempo-eliminación de S. aureus ATCC 6538 (FIGURA 1A) y E. coli ATCC 25922 (FIGURA IB) tratados con una Solución Mejorada de MPO que contiene 9(D), 6 (O)» 3 (?) , 1(0), 0.3 (*) y 0.1(+ ) g de MPO/ml , como se describe en el Ejemplo 11 (cuyos títulos son "Staphylococcus aureus ATCC 6538" (FIGURA 1A) y "Escherichia coli ATCC 25922" (FIGURA IB) ) . La actividad bactericida rápida (reducción logarítmica >3 del inoculo inicial) se demostró utilizando el método de suspensión-neutralización. La tasa de eliminación fue mayor en las concentraciones más altas de MPO de la Solución Mejorada de MPO y el grado de eliminación incrementó con un tiempo de exposición más prolongado. En las concentraciones de 3 g de MPO/ml y superiores, no se observaron sobrevivientes detectables dentro de 5 minutos de exposición; Las FIGURAS 2A y 2B son un análisis de tiempo-eliminación de S. aureus ATCC 6538 (FIGURA 2A) y P. aeruginosa ATCC 27317 (FIGURA 2B) tratados con la Solución Mejorada de MPO que contenía 200(D), 100 (O) y 50 (?) µ9 de MPO/ml, como se describe en el Ejemplo 11 (cuyos títulos son "Staphylococcus aureus ATCC 6538" (FIGURA 2A) y nPseudomonas aeruginosa ATCC 27317" (FIGURA 2B) ) . Los aislados se sometieron a prueba en presencia de sangre entera humana al 3% por medio del método de suspensión-neutralización. El efecto de interferencia de la sangre sobre la actividad antimicrobiana de la Solución Mejorada de MPO se superó en las concentraciones de MPO más altas; Las FIGURAS 3A, 3B, 3C y 3D es un análisis de tiempo-eliminación de S. aureus ATCC 29213 (FIGURA 3A) , E. coli ATCC 25922 (FIGURA 3B) , E. faecalis ATCC 29212 (FIGURA 3C) y P aeruginosa ATCC 27853 (FIGURA 3D) tratados con la Solución Mejorada de MPO que contenía 256(D), 64 (O) , 16 (?), 4(X), 1(*), 0.025(0) y 0.06(+) µg de MPO/ml, como se describe en el Ejemplo 11 (cuyos títulos son "Staphylococcus aureus ATCC 29213" (FIGURA 3A) , "Escherichia coli ATCC 25922" (FIGURA 3B) , "Enterococcus faecalis ATCC 29212" (FIGURA 3C) y "Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853" (FIGURA 3D) ) . La actividad bactericida (reducción logarítmica >3 del inoculo inicial) se demostró utilizando un método de microdilución de caldo CLSI modificado. Los patrones comparables de eliminación se observaron con todos los organismos con la tasa de eliminación mayor en concentraciones de MPO más altas de la Solución Mejorada de MPO y el grado de eliminación incrementó con una exposición y tiempo más prolongados. En las concentraciones de 256 y 16 µg de MPO/ml, no se observaron sobrevivientes detectables para todos los organismos sometidos a prueba dentro de 30 minutos y 4 horas, respectivamente; La FIGURA 4 es un análisis de tiempo-eliminación de S. aureus ATCC 6538 en el modelo de herida de espesor completo en ratas tratadas con la Solución Mejorada de MPO que contenía 18.75(^)( 75 GU/ml (¦) y 150 (·) GU/ml, como se describe en el Ejemplo 12 (cuyo título es "Staphylococcus aureus ATCC 6538" . La recuperación del organismo de heridas no tratadas en 60 minutos (O) . Esta gráfica representa el valor log 10 CFU promedio de sobrevivientes aislados de cada grupo de tratamiento en tiempos de tratamiento de 5, 15, 30 y 60 minutos. El intervalo de confianza de 95% de cada punto de datos se muestra para cada grupo de tratamiento; La FIGURA 5 es una comparación de la actividad microbicida de una Solución Mejorada de MPO contra S. aureus Resistente a Meticilina (MRSA) y S. aureus Sensible a Meticilina (MSSA) en el modelo de herida de espesor parcial en ratas, como se describe en el Ejemplo 12 (cuyo título es "Escherichia coli ATCC 25922" . Esta gráfica representa el valor log 10 CFU promedio de sobrevivientes aislados 15 minutos después del tratamiento; y La FIGURA 6 es un análisis de tiempo-eliminación de E. coli ATCC 25922 en el modelo de herida de espesor completo en ratas tratadas con una Solución Mejorada de MPO que contenía 18.75(*), 75 GU/ml (¦) y 150 (·) GU/ml, como se describe en el Ejemplo 12. La recuperación del organismo de heridas no tratadas en 60 minutos (O) . Esta gráfica representa el valor log 10 CFU promedio de sobrevivientes aislados de cada grupo de tratamiento en tiempos de tratamiento de 5, 15, 30 y 60 minutos. El intervalo de confianza de 95% de cada punto de datos se muestra para cada grupo de tratamiento.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se dirige ampliamente a composiciones y métodos para la eliminación o inhibición de infecciones bacterianas utilizando mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. En la práctica de la invención, los microorganismos susceptibles son eliminados o inhibidos por medio del contacto de los microorganismos con cantidades de mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos, los cuales son efectivos en presencia de un peróxido y bromuro o cloruro, para inhibir el crecimiento de o eliminar los microorganismos.

En una modalidad particularmente preferida, las composiciones y métodos de la invención se utilizan como agentes antisépticos que exhiben actividad antimicrobiana mejorada de mieloperoxidasa contra un amplio rango de microorganismos patógenos que incluyen bacterias y hongos. En un aspecto, las composiciones y métodos de la invención son sumamente adecuados para el tratamiento tópico de infecciones susceptibles en un sujeto mamífero humano o no humano en sitios que permiten el contacto directo de las composiciones de la invención con la infección microbiana, tales como, por ejemplo, infecciones de la piel, ojos, orejas, boca, pasajes nasales y de seno, sitios de lesiones traumáticas, sitios quirúrgicos y similares. Para el uso en contacto con tejido del hospedante, los sistemas antisépticos se basan en el uso de mieloperoxidasa dioxigenante que exhibe afinidad selectiva por microorganismos patógenos. Como tal, la acción microbicida de alta potencia se puede dirigir a los microorganismos objetivo sin destrucción asociada de tejido del hospedante o alteración de la flora normal, es decir, la acción antiséptica es selectiva y confinada al microorganismo obj etivo .

De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona composiciones, para inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles que comprenden mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación, en presencia de peróxido y cloruro o bromuro, para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. Las composiciones pueden comprender adicionalmente peróxido de hidrógeno o una fuente de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro cuando no están disponibles de otra manera en cantidades suficientes en el sitio de uso de las composiciones. En una modalidad relacionada, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto humano o animal necesitado de este tratamiento que comprenden administrar a un sitio de infección en el sujeto una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. Nuevamente, la composición puede comprender adicionalmente peróxido de hidrógeno o una fuente de peróxido de hidrógeno, y cloruro o bromuro, para complementar cantidades que se encuentran naturalmente en el sitio de infección.

En otras modalidades, la invención proporciona composiciones y métodos para inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles in vitro, particularmente en aplicaciones donde dispositivos biomédicos, tales como vendajes, instrumentos quirúrgicos, dispositivos de sutura, catéteres, utensilios dentales, lentes de contacto y similares requieren una desinfección o esterilización y donde el dispositivo debe estar en contacto subsecuentemente con tejido del hospedante. De esta manera, las formulaciones de mieloperoxidasa de alta potencia de la invención pueden servir como preparaciones desinfectantes o esterilizantes in vitro. Al limitar el período de tiempo de disponibilidad de peróxido de hidrógeno, las formulaciones mejoradas de mieloperoxidasa se pueden hacer suficientemente potentes para asegurar la desinfección y aún la esterilización de un material o dispositivo antes del contacto con tejido del hospedante. Cualquier toxicidad potencial para la flora normal o tejido del hospedante asociada con el uso de estas formulaciones de alta potencia cesa cuando el peróxido se agota, y como tal, el material o dispositivo tratado con la formulación se puede poner en contacto con tejido del hospedante sin lavado o destoxificación adicional.

De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona métodos para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles in vitro que comprenden poner en contacto los microorganismos, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, con una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que , funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.

En todavía otros aspectos, la invención proporciona el uso de una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una infección en un sujeto humano o animal, en donde los aminoácidos funcionan en combinación, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa. En algunas modalidades, la invención proporciona el uso de una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos en la manufactura de un medicamento para la eliminación o inhibición del crecimiento de microorganismos susceptibles, en donde los aminoácidos funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa .

Las composiciones representativas de la invención comprenden (1) mieloperoxidasa (MPO) ; (2) por lo menos dos aminoácidos que mejoran la actividad; y opcionalmente , (3) peróxido de hidrógeno (H202) o una fuente de H202; y (4) cloruro o bromuro.

La mieloperoxidasa útil en la presente invención es una haluro : hidrógeno peróxido oxidorreductasa (por ejemplo, EC No. 1.11.1.7 y EC No. 1.11.1.10 conforme a the International Union of Biochemistry) para la cual el haluro, es decir, cloruro o bromuro, es el donador de electrones o agente reductor y la peroxidasa es el receptor de electrones o agente oxidante. La actividad enzimática de una solución de mieloperoxidasa se puede determinar por medio de la reacción con guayacol en presencia de peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato de sodio. La reacción genera un producto con fuerte absorbancia a 470 nm. La actividad se determina a partir de la cinética del incremento en - la absorbancia en comparación con un estándar de referencia. La actividad de mieloperoxidasa se expresa comúnmente en unidades de Guayacol/mL (GU/mL) y también se expresa como microgramos de MPO por mililitro ^g/mL) . La conversión de µg a GU de MPO se basa en 0.375 GU por µg de MPO. La actividad específica se calcula a partir de su actividad y la concentración de proteína total y se expresa en GU/mg de proteína. Las cantidades útiles de mieloperoxidasa empleadas en las composiciones de la invención variarán ampliamente dependiendo de condiciones bajos las cuales se emplean las composiciones, el ambiente de uso y el resultado deseado. Para la mayoría de propósitos, las composiciones de la invención comprenderán generalmente por lo menos aproximadamente 0.05 g/ml (0.01875 GU/ml) de mieloperoxidasa. En algunas modalidades, las composiciones de la invención comprenderán de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 µg/ml de mieloperoxidasa (es decir, de aproximadamente 0.375 a aproximadamente 18,750 GU/ml), más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,000 µg/ml de mieloperoxidasa (es decir, de aproximadamente 1.875 a aproximadamente 3,750 GU/ml) y aún más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 5,000 µg/ml de mieloperoxidasa (es decir, de aproximadamente 3.75 a aproximadamente 1,875 GU/ml).

La inclusión de por lo menos dos aminoácidos que mejoran la actividad, como se describe en detalle en este documento, incrementa en gran medida la capacidad microbicida del sistema de oxidasa-mieloperoxidasa contra microorganismos susceptibles. Los aminoácidos útiles en la práctica de la invención son aquellos aminoácidos qué, cuando se utilizan en combinación y en presencia de peróxido y cloruro o bromuro, mejoran la actividad antimicrobiana del sistema antimicrobiano de mieloperoxidasa contra microorganismos susceptibles. Por lo menos dos aminoácidos se utilizan en concentraciones que no producen efectos adversos sobre la actividad de la mieloperoxidasa del sistema o efectos indeseables en el ambiente de uso de las composiciones y métodos .

En algunas modalidades, las composiciones de la invención comprenden por lo menos dos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina , L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3-aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2,3-diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2,3- diaminopropiónico, ácido L-3 -aminoisobutírico, ácido D-3-aminoisobutírico y 3 -aminobutirato de etilo, así como también los ésteres alquílicos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, tales como, por ejemplo, éster metílico de L-alanina, éster metílico de D-alanina, diclorhidrato del éster metílico de L-lisina, clorhidrato del éster metílico de glicina, clorhidrato del éster metílico de L-prolina, clorhidrato del éster etílico de L-valina y 2-aminopropanoato de etilo y aminoácidos N-sustituidos , tal como clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico.

En otras modalidades, las composiciones de la invención comprenden por lo menos dos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, así como también ésteres alquílicos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .

En algunas modalidades, las composiciones de la invención comprenden mieloperoxidasa y por lo menos tres aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de mieloperoxidasa. Por consiguiente, en algunas modalidades, las composiciones de la invención comprenden por lo menos tres aminoácidos seleccionados del grupo que cosiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L- isoleucina , D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3-aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3 -diaminopropiónico , monoclorhidrato del ácido D-2 , 3 -diaminopropiónico, ácido L-3-amino-isobutírico, ácido D-3 -aminoisobutírico y 3-aminobutirato de etilo, así como también ásteres y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, tal como, por ejemplo, éster metílico de L-alanina, éster metílico de D-alanina, diclorhidrato del éster metílico de L-lisina, clorhidrato del éster metílico de glicina, clorhidrato del éster metílico de L-prolina, clorhidrato del éster etílico de L-valina y 2 -aminopropanoato de etilo, y aminoácidos N-sustituidos, tal como clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico.

En todavía otras modalidades, las composiciones de la invención comprenden por lo menos tres aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, así como también ésteres y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En un ejemplo representativo actualmente preferido de este aspecto de la invención, las composiciones de la invención comprenden mieloperoxidasa y los aminoácidos glicina, L-alanina y L-prolina, en cantidades que son efectivas para mejorar la actividad antimicrobiana de la mieloperoxidasa.

Las cantidades útiles de los aminoácidos empleados en las composiciones de la invención variaran dependiendo de la cantidad de mieloperoxidasa en las composiciones y las condiciones presentes en el ambiente de uso. Para la mayoría de propósitos, las composiciones de la invención comprenderán generalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 mM, más preferiblemente de . aproximadamente 0.2 a aproximadamente 100 mM y aún más preferiblemente de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 50 mM de cada uno de los aminoácidos de la invención. En una modalidad representativa, por ejemplo, las composiciones de la invención comprenden de 10 a 5,000 µg/ml de mieloperoxidasa, de 0.3 a 50 mM de glicina, de 0.3 a 50 mM de L-alanina, de 0.3 a 50 mM de L-prolina y de 1 a 500 U/ml de glucosa oxidasa.

Puesto que la actividad antiséptica de las composiciones de mieloperoxidasa de la invención implica la reacción de peróxido y cloruro o bromuro para formar un hipohalito y la reacción de peróxido e hipohalito para formar oxígeno molecular singulete, la actividad de las composiciones de la invención es dependiente de la presencia, en el sitio de actividad antimicrobiana, de un peróxido y haluro adecuados. En algunas situaciones, el peróxido (por ejemplo, peróxido de hidrógeno) puede estar presente en el sitio de actividad antimicrobiana debido, por ejemplo, a la actividad de la flora de origen natural, y suficientes cantidades de cloruro pueden estar presentes en el medio ambiente fisiológico para actuar como un cofactor en la reacción de conversión. En estas situaciones, no es necesario que peróxido o haluro adicional se administre o se incluya en las composiciones de la invención. En otras situaciones, puede ser necesario o deseable proporcionar adicionalmente peróxido de hidrógeno y/o haluro en el sitio de tratamiento microbiano. Por consiguiente, las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente, si se desea, un peróxido o agente capaz de producir peróxido in vivo o in vitro y cloruro o bromuro.

Los peróxidos útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen peróxido de hidrógeno, hidroperóxidos de alquilo de la fórmula: R-OOH en donde R es hidrógeno o un grupo alquilo de cadena corta que tiene de 1 a 3 átomos de carbono y peróxidos inorgánicos, tales como boroperóxido o ureaperóxido . La actividad oxidante de los peróxidos orgánicos disminuye generalmente con el incremento de la longitud de cadena de R, de la siguiente manera : R=H >> CH3 > CH3CH2 > CH3(CH2)2 El peróxido actualmente preferido para el uso en las composiciones de la invención es peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno también se puede hacer disponible en el sitio de la actividad antimicrobiana al incluir en la composición un agente capaz de producir peróxido de hidrógeno in vivo o in vitro. Los agentes particularmente útiles para este propósito incluyen, por ejemplo, oxidasas, tales como glucosa oxidasa, colesterol oxidasa y galactosa oxidasa.

Cuando el peróxido de hidrógeno se incluye directamente en composiciones de la invención para aplicaciones in vivo, las cantidades empleadas se diseñan preferiblemente para proporcionar una actividad máxima de desinfección. El daño a las células y tejido del hospedante y a la flora normal se evita al prevenir el contacto directo durante el período de alta exposición a H202. Por consiguiente, las composiciones de la invención pueden comprender de aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 10 µp??? de peróxido de hidrógeno por mi de composición, más preferiblemente de aproximadamente 5 nmol a aproximadamente 5 µp??? de peróxido de hidrógeno por mi de composición y mucho más preferiblemente de aproximadamente 10 nmol a aproximadamente 1 µ???? de peróxido de hidrógeno por mi de composición. Los agentes capaces de producir peróxido de hidrógeno in vivo, por ejemplo, oxidasas productoras de peróxido, son particularmente útiles para el control dinámico de las cantidades de peróxido de hidrógeno presentes en el sitio de la actividad antimicrobiana. Estos agentes aumentan al máximo la actividad antimicrobiana de la composición al proporcionar y mantener una concentración de bajo nivel, estable de H202. Por consiguiente, la cantidad de estos agentes a ser empleada será sumamente dependiente del carácter del agente y el efecto deseado, pero será capaz preferiblemente de producir un nivel de régimen permanente de aproximadamente 1 pmol a aproximadamente 1 µp??? de peróxido de hidrógeno por mi de líquido por minuto, dependiendo del tipo y concentración de haluro disponible en el sitio de la actividad antimicrobiana. Cuando la formulación se debe utilizar como una solución desinfectante-esterilizante, la oxidasa y su substrato se pueden ajustar para proporcionar concentraciones de régimen permanente relativamente altas de H202 que permanecen durante el período de esterilización requerido. La acción de desinfección-esterilización se termina con el agotamiento del substrato de oxidasa o en relación a la tasa de degradación de oxidasa. Como un ejemplo representativo, cuando la oxidasa es glucosa oxidasa y su substrato es glucosa (o dextrosa) , las composiciones de la invención pueden comprender de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 3,000 U/ml, más preferiblemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1,000 U/ml, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 U/ml de glucosa oxidasa y de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1,000 mM, más preferiblemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 800 mM y aún más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mM de glucosa.

Cuando el bromuro o el cloruro se incluyen en las composiciones de la invención, el uso, selección y cantidad de bromuro y cloruro empleado en una aplicación particular dependerá de varios factores, tales como el efecto terapéutico deseado, la disponibilidad de peróxido y otros factores. Puesto que el cloruro está presente en la mayoría de medios fisiológicos en niveles suficientes para no ser limitante como el cofactor de haluro, generalmente no se requiere una fuente externa de cloruro. Cuando se desea una fuente externa de cloruro, la cantidad de cloruro empleado se encontrará preferiblemente en el rango de aproximadamente 10 µp??? de cloruro a aproximadamente 150 µp??? de cloruro por mi de solución para acercarse a las condiciones fisiológicas. Cuando se incluyen, las composiciones de la invención pueden comprender de aproximadamente 1 nmol de bromuro a aproximadamente 20 µ???? de bromuro por mi de composición líquida, más preferiblemente de aproximadamente 10 nmol de bromuro a aproximadamente 10 µ???? de bromuro por mi de composición líquida y mucho más preferiblemente de aproximadamente 100 nmol de bromuro a aproximadamente 1 µp??? de bromuro por mi de composición líquida.

La relación de haluro con respecto a peróxido es una consideración importante en la formulación de un ambiente microbicida efectivo. Por consiguiente, además de asegurar niveles efectivos de haluro y peróxido en el sitio de ataque microbiano, como se describiera anteriormente, es preferible practicar los métodos de la invención en relaciones de haluro :peróxido que proporcionan una actividad microbicida óptima. Por ejemplo, cuando el haluro es Cl", la relación de Cl" con respecto a peróxido se mantiene preferiblemente en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 40,000 en el ambiente de la actividad microbicida, más preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 40,000 y, mucho más preferiblemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 40,000. Cuando el haluro es Br", la relación de Br" con respecto a peróxido se mantiene preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 4,000 en el ambiente de la actividad micromicida, más preferiblemente, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2,000 y mucho más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,000.

Las composiciones y métodos de la invención se pueden utilizar para inhibir el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos patológicos, preferiblemente con un mínimo de daño a la flora normal . Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones de la invención son sumamente eficientes en la inhibición de organismos Gram-positivos y Gram-negativos , tales como, por ejemplo, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Grupo C de Streptococcus, Grupo F de Streptococcus, Grupo G de Streptococcus, Streptococcus pyogenes, Citrobacter freundii , Enterojacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Acintobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hidrophilia y Pasteurella multocida . Además, las composiciones de la invención son útiles en la inhibición de microorganismos que forman esporas tales como, por ejemplo, bacterias tales como Bacillus sps . y Clostridium sps . y hongos tales como Aspergillus sps., Fusarium sps., Trichophyton sps. y similares. Debido a su amplio espectro de actividad, en algunas modalidades las composiciones de la invención se pueden utilizar ventajosamente en el tratamiento de infecciones polimicrobianas . Las enfermedades polimicrobianas involucran múltiples agentes infecciosos y son referidas como complejas, complicadas, mezcladas, dobles, secundarias, sinérgicas, concurrentes, polimicrobianas o coinfecciones. Las enfermedades polimicrobianas incluyen, por ejemplo, infecciones asociadas con abscesos, infecciones oportunistas relacionadas con el SIDA, conjuntivitis, gastroenteritis, hepatitis, esclerosis múltiple, otitis media, enfermedades periodontales , enfermedades respiratorias e infecciones genitales. Además, puesto que las composiciones de la invención operan por medio de un mecanismo de acción diferente, completo que aquellas implicadas en la terapia convencional con antibióticos, en algunas modalidades las composiciones de la invención también son sumamente útiles en el tratamiento de infecciones causadas, por lo menos en parte, por agentes patógenos resistentes a múltiples fármacos, tales como MRSA {Staphylococcus aureus resistente a la meticilina) , VRSA (S. aureus resistente a la Vancomicina) , VRE (Enterococcus resistente a la Vancomicina) , Enterococcus Resistentes a la Penicilina, PRSP (Streptococcus pneumoniae resistente a la Penicilina) , Mycobacterium tuberculosis resistente al isoniazid/rimfampina y otras cepas resistentes a antibióticos de E. coli, Salmonella, Campilobacter y Streptococci . Estas bacterias son referidas en este documento como "resistentes a antibióticos" o "resistentes a fármacos" o "resistentes a múltiples fármacos" o por medio de otros términos similares que son bien entendidos en el campo.

Como se utiliza en este documento, el término "flora normal" significa bacterias que residen normalmente en o sobre superficies corporales de un hospedante saludable a niveles simbióticos. La flora normal incluye, por ejemplo, la familia de ácido láctico de bacterias en la boca, intestinos o vagina de sujetos humanos, por ejemplo, Streptococcus (viridans) en la boca y Lactobacillus sp . (por ejemplo, bacilos de Tissier y bacilos de Doderlein) en los intestinos de bebés lactantes, genitales externos, uretra anterior y vagina. Los microorganismos que constituyen la flora normal de un hospedante son bien conocidos (por ejemplo, véase Principies and Practice of Infectious Diseases, supra, Nueva York, páginas 34-36 y 161) . Se ha descubierto que la mieloperoxidasa de la invención se enlaza selectivamente a muchas bacterias y hongos patógenos con preferencia sobre la flora normal. En aplicaciones in vivo, el hospedante es tratado preferiblemente con una cantidad de mieloperoxidasa la cual no es efectiva para eliminar la flora normal del hospedante. En las aplicaciones in vitro para la desinfección-esterilización, se pueden emplear concentraciones suficientemente altas de mieloperoxidasa para asegurar la eliminación completa de todas las formas vegetativas y de levadura. Bajo estas condiciones, el daño al tejido y flora normal del hospedante se evita por medio del consumo de H202 o el sistema generador de H202 antes del contacto con el tejido del hospedante.

Las composiciones de la invención comprenden generalmente cantidades de una mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos los cuales son efectivos, en presencia de un peróxido y un haluro para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles. Las composiciones pueden comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, las composiciones se pueden proporcionar convenientemente en un portador líquido. Cualquier portador líquido se puede utilizar generalmente para este propósito, con la condición de que el portador no interfiera significativamente con las capacidades de enlaces selectivos de la mieloperoxidasa o con la actividad enzimática. Alternativamente, las composiciones se pueden proporcionar en forma sólida con activación sobre la solubilización en un líquido.

Como se expusiera anteriormente, las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente peróxido o un agente capaz de producir peróxido, tal como una oxidasa, como se describe en detalle anteriormente. El sistema de oxidasa-mieloperoxidasa conduce por sí mismo a la construcción como una formulación binaria en la cual los agentes activos de la composición se formulan en dos partes separadas para la consolidación al momento del uso. Por ejemplo, una parte de la formulación binaria puede comprender una solución que contiene la oxidasa, la mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que mejoran la actividad, por ejemplo, glicina, L-alanina y L-prolina. La segunda parte de la formulación binaria puede comprender un substrato para la oxidasa, por ejemplo, glucosa o dextrosa en el caso de la glucosa oxidasa u oxígeno molecular, 02. El substrato se puede proporcionar, por ejemplo, en la forma de una oblea sólida. Para la esterilización de un artículo, por ejemplo, un instrumento quirúrgico o un lente de contacto, la oblea del substrato se puede colocar en una cámara de esterilización junto con el artículo a ser esterilizado. La mieloperoxidasa, los aminoácidos que mejoran la actividad y la oxidasa se agregan para iniciar la esterilización. En algunas modalidades, la composición de mieloperoxidasa puede comprender adicionalmente alcohol a fin de facilitar la solubilización del substrato de oxidasa y la utilización por la oxidasa. Este sistema producirá una acción microbicida sostenida siempre y cuando esté presente suficiente substrato para impulsar la reacción.

Las composiciones de la invención se pueden administrar solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes. Los agentes terapéuticos, adicionales, representativos que se pueden utilizar en combinación con las composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, agentes antibióticos o antisépticos tales como agentes anti-bacterianos , agentes anti-fungicidas , agentes anti-virales y/o agentes anti-parasitarios . En algunas modalidades, los agentes terapéuticos adicionales pueden ser una o más penicilinas, cefalosporinas , carbacefems, cefamicinas, carbapenems, monobactams, aminoglicósidos , glicopéptidos , quinolonas, tetraciclinas , macrólidos y/o fluoroquinolonas . En algunas modalidades, los agentes terapéuticos adicionales pueden ser yodo, plata, cobre, clorhexidina, polihexanida, biguanidas, quitosan y/o ácido acético. Uno o más de los agentes terapéuticos adicionales de la invención se pueden, incorporar como parte de la misma composición o se pueden administrar por separado.

Para las aplicaciones in vivo, las composiciones antisépticas se pueden administrar en cualquier forma efectiva, farmacéuticamente aceptable para los animales de sangre caliente, incluyendo los sujetos humanos y animales, por ejemplo, en formas de dosificación tópicas, de lavado, orales, vaginales o de supositorio, como una pulverización nasal, bucal, tópica, un aerosol para la inhalación o de cualquier otra manera que sea efectiva para suministrar la mieloperoxidasa activa a un sitio de infección por microorganismos. La ruta de administración se diseñará preferiblemente para obtener un contacto directo de las composiciones antisépticas con los microorganismos infecciosos. En un aspecto de la invención, las composiciones de la invención se suministran o administran por la ruta tópica a áreas de un sujeto humano o animal que son susceptibles a la infección, tales como, por ejemplo, a las encías, ojos, oídos, piel, heridas, áreas vaginales, áreas inguinales, escaras, quemaduras, áreas bajo vendajes médicos, pañales u otras cubiertas que es probable que se humedezcan y similares .

Para las aplicaciones tópicas, el portador farmacéuticamente aceptable puede tomar la forma de líquidos, cremas, espumas, lociones, ungüentos, suspensiones, supositorios o geles y puede comprender adicionalmente solventes acuosos u orgánicos, agentes amortiguadores, emulsionantes, agentes de gelificación, humectantes, estabilizadores, surfactant.es, agentes de humedecimiento , conservadores, agentes de liberación a través del tiempo y cantidades menores de humectantes, agentes secuestradores, tintes, perfumes y otros componentes empleados comúnmente en composiciones farmacéuticas para la administración tópica. Además, las composiciones de la invención se pueden impregnar en vendajes o cubiertas para la aplicación a un sujeto.

En otra modalidad de la invención, las composiciones de la invención se pueden diseñar específicamente para aplicaciones in vitro, tal como la desinfección o esterilización de dispositivos médicos, lentes de contacto y similares, particularmente donde los dispositivos o lentes tienen por objeto ser utilizados en contacto con un paciente o usuario. Para las aplicaciones de este tipo, las composiciones se pueden proporcionar convenientemente en la forma de un líquido, crema, espuma, loción o gel y pueden ser provistas con emulsionantes, surfactantes , agentes amortiguadores, agentes de humedecimiento, conservadores y otros componentes encontrados comúnmente en composiciones de este tipo. Las composiciones de la invención se pueden impregnar en materiales absorbentes, tales como suturas, vendajes y gasa, o pueden ser recubiertas sobre la superficie de materiales de fase sólida, tales como grapas, cremalleras y catéteres para suministrar las composiciones a un sitio para la prevención de una infección microbiana. Otros sistemas de suministro de este tipo serán fácilmente aparentes para aquellas personas expertas en el campo.

Otros componentes, tales como una oxidasa para la generación de peróxido, un substrato para la oxidasa y haluro se pueden incluir, como se desee, como se describe en detalle anteriormente. Además, los componentes se pueden elaborar en una formulación individual o pueden estar separados en formulaciones binarias para el mezclado posterior durante el uso, como se puede desear para una aplicación particular. Para formulaciones individuales, un componente de sistema requerido el cual está disponible en el sitio de aplicación, tal como haluro, oxidasa, grupo protésico para la oxidasa, substrato reductor para la oxidasa u oxígeno molecular se deja preferiblemente fuera de la formulación para prevenir la reacción prematura y el agotamiento de los componentes del sistema .

Como un ejemplo ilustrativo, una composición adecuada para el uso como una solución antimicrobiana (o anti- infecciosa) puede comprender de aproximadamente 1 a 50,000 µg/ml (es decir, de aproximadamente 0.375 a aproximadamente 18,750 GU/ml) de mieloperoxidasa, de 0.1 a 500 µt???/mL (es decir, de 0.1 a 50O mM) de glicina, de 0.1 a 500 µ????/mL (es decir, de 0.1 a 500 mM) de L-prolina, de 0 a 100 µp???/???-? (es decir, de 0 a 100 mM) de L-alanina, de 0.01 a 500 unidades por mi de glucosa oxidasa y de 10 a 150 µ????/mL de cloruro. La composición anterior se combina con de 1 a 500 µ?t???/t??? (es decir, de 1 a 500 mM) de- glucosa o dextrosa y se utiliza como una solución líquida desinfectante o esterilizante.

Lo anterior se puede entender mejor en conexión con los siguientes ejemplos representativos, los cuales se presentan con el propósito de ilustración y no a manera de limitación. .

EJEMPLOS Ejemplo 1 El Efecto de L-Lisina sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre El efecto L-lisina sobre la actividad del sistema de mieloperoxidasa contra Staphylococcus aureus se demostró de la siguiente manera.

Materiales Las suspensiones bacterianas, específicamente Staphylococcus aureus en este ejemplo, se prepararon por medio del método de matraz oscilante para lograr un crecimiento de fase logarítmica tardía a estacionaria precoz. Las bacterias se desarrollaron 24 horas en caldo de soya con tripticasa (TSB, por sus siglas en inglés) a 35°C. Los cultivos se centrifugaron a 4,000 rpm durante 10 minutos y los sobrenadantes se retiraron. La pelotilla se recolectó y se lavó dos veces con solución salina normal, estéril a 0.9% (NS, por sus siglas en inglés) . Los microorganismos lavados se suspendieron y se diluyeron con solución salina normal hasta un estándar de McFarland 3, es decir, aproximadamente 109 unidades formadoras de colonias de bacterias (CFU, por sus siglas en inglés) por mL. Los conteos reales de colonias se confirman por medio de diluciones en serie (de 10"1 a 10"5 o 10"6) colocadas en placas sobre TSA y se incuban durante toda la noche a 35°C. Para obtener un inoculo objetivo de trabajo, final, aproximado de 107 CFU/mL, se utilizaron 15 microlitros de organismos por mL de mezcla de reacción final.

La glucosa oxidasa (GO) de Aspergillus Niger se adquirió de Biozyme, Inc., Reino Unido, # de Catálogo G03A, 270 U/mg) . La mieloperoxidasa de porcino (p-MPO) (Exoxemis, Inc., Little Rock, Arkansas, E.U.A., 375 U/mg) . Las soluciones madre estériles de D-glucosa y cloruro de sodio se prepararon y se utilizaron a una concentración final de 150 mM cada una. El clorhidrato de L-lisina (Spectrum Chemical # de Catálogo L1142) se preparó como una solución madre 100 mM . La catalasa (Sigma, # de Catálogo C-40) se preparó como una solución madre al 1% en solución salina, estéril al 0.9%. La sangre se recolectó por medio de una punción en la vena y se utilizó como sangre entera en el mismo día.

Metodología Utilizando técnicas estériles, las soluciones de p-MPO y glucosa oxidasa se prepararon en las concentraciones indicadas en la Tabla 1 de amortiguador de fosfato 20 mM a pH 6.5 que contenía Tween-80MR al 0.02%, 150 mEq/L de cloruro y L-lisina en ya sea 0, 1.25, 5 o 20 µ????/mL. Los Staphylococcus aureus se utilizaron para proporcionar una concentración objetivo, final de 2-3 X 107 CFU (7.4 log 10) por mL y la sangre entera venosa se utilizó para proporcionar una concentración final de 3%. Se agregó glucosa a las mezclas de reacción a . una concentración final de 150 mM, lo cual inició la reacción microbicida. El volumen final de las mezclas de reacción fue 1 mL . Las reacciones se dejaron proceder de 30 minutos a 2 horas, como fue necesario, a temperatura ambiente o a 37°C en un baño seco. En los puntos de tiempo especificados, las mezclas de reacción se trataron con 100 microlitros de una solución de catalasa, que contenía un mínimo de 100 unidades/^L, para consumir el peróxido restante y terminar la eliminación oxidante. Los conteos de placas de dilución en serie se realizaron a partir de los contenidos de cada frasquito en solución salina estéril y se inocularon en agar de soya con tripticasa (TSA) para el cultivo cuantitativo. Las placas luego se incubaron a 37°C y los conteos se tomaron en 24 horas. Después de la incubación, las unidades formadoras de colonias (CFU) se contaron como una medida de la viabilidad de los organismos y los resultados se compararon con un control de inoculo. Los resultados se muestran en la Tabla 1, como el promedio de 2 réplicas.

Tabla 1 Efecto de L-lisina sobre la Actividad.Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Viabilidad Conc. de MPO GO Promedio Promedio Reducción Reducción L-Lisina U/ml U/ml CFU/ml CFU/ml Log Log mM 30 minutos 60 minutos 30 minutos 60 minutos 0 38 3.3 6300000 0.6 0 38 3.3 700000 1 .5 5 38 3.3 6050 3.6 5 38 3.3 770 4.5 20 38 3.3 6450 3.6 20 38 3.3 620 4.6 0 38 33.3 435000 1.8 0 38 33.3 4650 3.7 5 38 33.3 6.5 5 38 33.3 6.8 20 38 33.3 5 6.6 20 38 33.3 5 6.6 0 9 0.833 8550000 0.5 0 9 0.833 6350000 0.6 1.25 9 0.833 5050000 0.7 1 .25 9 0.833 620000 1.6 Viabilidad Viabilidad Conc. de MPO GO Promedio Promedio Reducción Reducción L-Lisina U/ml U/ml CFU/ml CFU/ml Log Log mM 30 minutos 60 minutos 30 minutos 60 minutos 5 9 0.833 775000 1.5 5 9 0.833 53000 2.7 0 9 8.33 6150000 0.6 0 9 8.33 5050000 0.7 1.25 9 8.33 6200000 0.6 1.25 9 8.33 4950 3.7 5 9 8.33 675000 1.6 5 9 8.33 47 5.7 .1 0 0 25050000 0.0 i Control realizado en ausencia de sangre, aminoácido, glucosa, MPO y glucosa oxidasa.

Como se muestra en la Tabla 1, la MPO más glucosa oxidasa exhiben una potente actividad microbicida en presencia del aminoácido (AA) L-lisina. Esta combinación eliminó 10 (7) Staphylococcus aureus en presencia de 3% de sangre, mientras que la combinación idéntica sin L-lisina proporcionó una eliminación menos significativa.

Ejemplo 2 El Efecto de Aminoácidos como Agentes que Mejoran el Potencial para la Actividad An t i m i c r ob i an a del Sistema de M i e 1 o e r o i d a s a Contra Staphylococcus aureus en Presencia de S angr e El efecto de varios aminoácidos y homólogos de aminoácidos, como agentes que mejoran el potencial para la acción microbicida de MPO en presencia de sangre, se demostró por medio del siguiente procedimiento general del Ejemplo 1, excepto que cada aminoácido sometido a prueba utilizó una concentración individual de p-MPO (714 pmol/mL, lo cual es equivalente a 100 µg/mL o 38 U/mL) y una concentración individual de glucosa oxidasa (33.3 U/mL) . Los aminoácidos individuales, indicados en las Tablas 2-6 posteriores, se sometieron a prueba en una concentración individual de 5 µ????/mL y se compararon con el sistema de MPO sin aminoácidos. Los aminoácidos solos, en ausencia de MPO se sometieron a prueba para descartar su actividad microbicida. Los resultados se muestran en la Tabla 2 a la Tabla 6, como el promedio de 2 réplicas.

Tabla 2 Tipo de Aminoácido: Efecto sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Conc. de Viabilidad Log 10 Nombre Amino- Promedio (CFU+1) de Reducción de Aminoácido ácido MPO GO CFU/ml Sobrevivientes Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos 60 minutos L-Alanina 5 38 33.3 7 0.9 6.5 L-Arginina 5 38 33.3 5450000 6.7 0.6 L-Cisteína 5 38 33.3 17400000 7.2 0.1 Acido L-Glutámico 5 38 33.3 236 2.4 5.0 L-Glutamina 5 38 33.3 286 2.5 4.9 Glicina 5 38 33.3 0 0.0 7.4 L-Histidina 5 38 33.3 48000 4.7 2.7 L-Lisina 5 38 33.3 0 0.0 7.4 L-Metionina 5 38 33.3 6600000 6.8 0.6 L-Fenilalanina 5 38 33.3 0 0.0 7.4 L-Prolina 5 38 33.3 4850 3.7 3.7 L-Serina 5 38 33.3 0 0.0 7.4 L-Treonina 5 38 33.3 630000 5.8 1.6 L-T-riptófano 5 38 33.3 21150000 7.3 0.1 L-Valina 5 38 33.3 0 0.0 7.4 ninguno 0 38 33.3 5200000 6.7 0.7 ninguno1 0 23950000 7.4 0.0 ¦"¦Control realizado en ausencia de sangre, aminoácido, glucosa, MPO y glucosa oxidasa.

Tabla 3 Tipo de Aminoácido: Efecto sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Conc. de Viabilidad Log 10 Nombre AminoPromedio (CFU+1) de Reducción de Aminoácido ácido MPO CFU/ml Sobrevivientes Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos 60 minutos L-Leucina 5 38 33.3 0 0.0 7.3 L-lsoleuc¡na 5 38 33.3 ' 0 0.0 7.3 Acido L-Aspártico 5 38 33.3 620000 5.8 1.5 L-Asparagina 5 38 33.3 5950000 6.8 0.6 L-Hidroxiprolina 5 38 33.3 0 0.0 7.3 L-Ornitina 5 38 33.3 0 0.0 7.3 L-Tiros¡na 5 38 33.3 630000 5.8 1.5 D-Alanina 5 38 33.3 0.0 7.3 Anhídrido de alanina 5 38 33.3 845000 5.9 1.4 Anhídrido de glicina 5 38 33.3 830000 5.9 1.4 Taurina 5 38 33.3 830000 5.9 1.4 D-Treonina 5 38 33.3 815000 5.9 1.4 Acido pirúvico 5 38 33.3 4900000 6.7 0.6 Acido hipúrico 5 38 33.3 865000 5.9 1.4 Conc. de Viabilidad Log 10 Nombre AminoPromedio (CFU+1) de Reducción de Aminoácido ácido MPO GO CFU/ml Sobrevivientes Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos 60 minutos Acido nicotínico 5 38 33.3 4150000 6.6 0.7 ninguno 00 38 33.3 5550000 6.7 0.6 ninguno1 00 0 0 22000000 7.3 0.0 1Control realizado en ausencia de sangre, aminoácido, glucosa, MPO y glucosa oxidasa.

Tabla 4 Tipo de Aminoácido: Efecto sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra StaphylococcuB aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Aminoácido GO CFU/ml Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos Beta alanina 5 38 33.3 0 7.4 Ester metílico de L-Ala 5 38 33.3 0 7.4 L-Ala-L-ala 5 38 33.3 238500 2.0 Acido glioxílico 5 38 33.3 610000 1.6 D-Prolina 5 38 33.3 830 4.5 D-Leucina 5 38 33.3 66550 2.6 D-Lisina 5 38 33.3 5050000 0.7 Acido D-Glutámico 5 38 33.3 955000 1.4 Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Aminoácido GO CFU/ml Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos D-Triptófano 5 38 33.3 19700000 0.1 ninguno 0 38 33.3 665000 1.6 ninguno1 0 0 0 26150000 0.0 1Control realizado en ausencia de sangre , aminoácido , glucosa , MPO y glucosa oxidasa .

Tabla 5 Tipo de Aminoácido: Efecto sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Conc. de Promedio Reducción Nombre AA 1 MPO GO CFU/ml Log de Aminoácido 1 mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos D-Glutamina 5 38 33.3 18 6.1 D-lsoleucina 5 38 33.3 0 7.4 D-Ornitina 5 38 33.3 0 7.4 D-Fenilalanina 5 38 33.3 0 7.4 D-Serina 5 38 33.3 0 7.4 D-Valina 5 38 33.3 0 7.4 D-Arginina 5 38 33.3 0 7.4 Acido D-Aspártico 5 38 33.3 570000 1.6 Viabilidad Conc. de Promedio Reducción Nombre AA 1 MPO GO CFU/ml Log de Aminoácido 1 mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos D-Metionina 5 38 33.3 9400000 0.4 D-Histidina 5 38 33.3 10900 3.4 D-Tirosina 5 38 33.3 9400 3.4 ninguno 0 38 33.3 400000 1.8 ninguno 0 0 0 24700000 0.0 Como control para determinar la actividad microbicida de los aminoácidos solos, el procedimiento del Ejemplo 2 se siguió sin replicación, excepto en ausencia de glucosa, MPO y glucosa oxidasa. Los resultados se muestran en la Tabla 6 .

Tabla 6 Tipo de Aminoácido: Actividad Microbicida del Aminoácido Solo Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de AAmmiinnooáácciiddoo Aminoácido MPO GO CFU/ml Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos L-Alanina 5 0 0 24100000 0.0 L-Arginina 5 0 0 23600000 0.0 L-Cisteína 5 0 0 22400000 0.0 Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Aminoácido MPO GO CFU/ml Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos Acido L-Glutámico 5 0 0 23700000 0.0 L-Glutamina 5 0 0 24100000 0.0 Glicina 5 0 0 25300000 0.0 L-Histidina 5 0 0 22700000 0.0 L-Lisina 5 0 0 21400000 0.0 L-Metionina 5 0 0 19800000 0.1 L-Fenilalanina 5 0 o 22400000 0.0 L-Prolina 5 0 o 21600000 0.0 L-Serina 5 0 o 24100000 0.0 L-Treonina 5 0 o 23300000 0.0 L-Triptófano 5 0 o 21600000 0.0 L-Valina 5 0 o 23100000 0.0 L-Leucina 5 0 o 18700000 0.1 L-lsoleucina 5 0 o 20500000 0.0 Acido L-Aspártico 5 0 o 18600000 0.1 L-Asparagina 5 0 o 21800000 0.0 L-Hidroxiprolina 5 0 o 20400000 0.0 L-Ornitina 5 0 o 19200000 0.1 L-Tirosina 5 0 o 21600000 0.0 D-Alanina 5 0 o 19600000 0.0 Anhídrido de alanina 5 0 o 21900000 0.0 Viabilidad Nombre Corte, de Promedio Reducción de Aminoácido Aminoácido MPO GO CFU/ml Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos Anhídrido de glicina 5 0 0 20100000 0.0 Taurina 5 0 0 21600000 0.0 D-Treonina 5 0 o 20700000 0.0 Acido pirúvico 5 0 o 22100000 0.0 Acido hipúrico 5 0 o 19700000 0.0 Acido nicotínico 5 0 o 23200000 0.0 Beta alanina 5 0 o 25500000 0.0 Ester metílico de L-Ala 5 0 o 24300000 0.0 L-Ala-L-ala 5 0 o 26100000 0.0 Acido glioxílico 5 0 o 22200000 0.1 D-prolina 5 0 o 21400000 0.1 D-Leucina 5 0 o 24400000 0.0 D-Lisina 5 0 o 25100000 0.0 Acido D-glutámico 5 0 o 26200000 0.0 D-Triptófano 5 0 o 22600000 0.1 D-Glutamina 5 0 o 20500000 0.1 D-lsoleucina 5 0 o 21300000 0.1 D-Ornitina 5 0 o 20600000 0.1 D-Fenilalanina 5 0 o 24200000 0.0 D-Serina 5 0 o 23100000 0.0 D-Valina 5 0 o 20900000 0.1 Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Aminoácido MPO GO CFU/ml Log mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos D-Arginina 5 0 0 21500000 0.1 Acido D-Aspártico 5 0 0 20900000 0.1 D-Metionina 5 0 0 21100000 0.1 D-Histidina 5 0 0 22300000 0.0 D-Tirosina 5 0 0 23200000 0.0 Las Tablas 2 hasta 5 muestran el desempeño del sistema de MPO con y sin aminoácidos agregados. La Tabla 6 muestra que ningún aminoácido, ni los homólogos son microbicidas por sí mismos en ausencia de MPO.

La magnitud del mejoramiento mediado por aminoácidos es dependiente del aminoácido utilizado y varía de un mejoramiento de 0 a por lo menos 6 logaritmos bajo las condiciones de prueba.

En la Tabla 2, las pruebas con L-aminoácidos representativos demuestran la actividad incrementada del sistema de MPO cuando se utiliza con aminoácidos. Las excepciones notables son cisteína, metionina y triptófano, los cuales son aminoácidos que se esperaría que reaccionaran químicamente con los productos intermedios oxidantes producidos por el sistema de MPO, generando compuestos inactivos. La actividad de mejoramiento limitada de histidina se podría explicar por el hecho de que se esperaría que fuera sumamente reactiva para el oxígeno singulete y fuera consumida por el producto del sistema de MPO.

Las Tablas 3 y 4 tienen L-aminoácidos adicionales y muestran que los ésteres y otros homólogos cercanos de aminoácidos también tienen actividad demostrable.

En las Tablas 3, 4 y 5, una variedad de D-aminoácidos se sometió a prueba y como es el caso para los L-aminoácidos, muchos son capaces de proporcionar un mejoramiento significativo a la actividad microbicida de la formulación. Se debe observar que D-arginina, mostrada en la Tabla 5, es sumamente activa en contraste a la L-arginina esencialmente inactiva mostrada en la Tabla 2.

En general, los aminoácidos alifáticos, especialmente aquellos que contienen cadenas ramificadas son sumamente activos.

En la Tabla 6, todos los aminoácidos se sometieron a prueba solos, en ausencia de MPO para descartar su actividad microbicida.

Ejemplo 3 El Efecto de Análogos de Aminoácidos como Agentes que Mejoran el Potencial para la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre El efecto de varios aminoácidos beta, derivados de éster y aminoácidos N-sustituidos , como agentes que mejoran el potencial para la acción microbicida de p-MPO en presencia de sangre, se demostró por medio del siguiente procedimiento general del Ejemplo 2. Los análogos de aminoácidos solos, en ausencia de MPO, se sometieron a prueba para descartar su actividad microbicida.

Los resultados se muestran en la Tabla 7 y la Tabla 8 a continuación.

Tabla 7 Tipo de Análogo de Aminoácido: Efecto sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Amino- MPO GO CFU/ml Log ácido mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos Aminoácidos Beta DL-Beta-homoleucina 38 33.3 7.4 Acido 3-aminobutanoico 38 33.3 6.4 Monoclorhidrato de ácido DL-2,3-diaminopropiónico 5 38 33.3 7.4 Acido DL-3-aminoisobutírico 38 33.3 7.4 Clorhidrato de éster etílico de beta-alanina 5 38 33.3 1195000 1.3 3-Aminobutirato de etilo 38 33.3 7.4 Aminoácidos de Ester Diclorhidrato de éster metílico de L-lisina 38 33.3 7.4 Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Amino- MPO GO CFU/ml Log ácido mM U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos Clorhidrato de éster metílico de L-tirosina 38 33.3 87000 2.4 Clorhidrato de éste metílico de glicina 38 33.3 7.4 Clorhidrato de éster etílico de L-valina 38 33.3 7.4 2-Aminopropanoato de etilo 38 33.3 7.4 Aminoácidos N-Sustituidos Clorhidrato de éster metílico de sarcosina 5 38 33.3 7.4 Clorhidrato de éster metílico de L-prolina 5 38 33.3 7.4 Acido nipecótico 5 38 33.3 7.4 ninguno1 0 23150000 0.0 ¦"•Control realizado en ausencia de sangre, aminoácido, glucosa, MPO y glucosa oxidasa.

Como control para determinar la actividad microbicida de los aminoácidos solos, el procedimiento anterior se siguió sin replicación, excepto en ausencia de glucosa, MPO y glucosa oxidasa. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8 Tipo de Análogo de Aminoácido: Actividad Microbicida del Análogo de Aminoácido Solo Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Nombre Conc. de Promedio Reducción de Aminoácido Amino- MPO GO CFU/ml Log ácido mlUI U/ml U/ml 60 minutos 60 minutos Aminoácidos Beta DL-Beta-homoleucina 5 20500000 0.0 Acido 3-aminobutanoico 5 0 21300000 0.0 Monoclorhidrato de ácido DL-2,3-d¡am¡noprop¡ónico 5 20600000 0.0 Acido DL-3-aminoisobutírico 5 24200000 0.0 Clorhidrato de éster etílico de beta-alanina 5 23100000 0.0 3-Aminobutirato de etilo 5 20900000 0.0 Aminoácidos de Ester Diclorhidrato del éster metílico de L-lisina 5 21500000 0.0 Clorhidrato de éster metílico de L-tirosina 5 20900000 0.0 Clorhidrato de éster metílico de glicina 5 21100000 0.0 Clorhidrato de éster etílico de L-valina 5 22300000 0.0 2-Aminopropanoato de etilo 5 23200000 0.0 Aminoácidos N-Sustituidos Clorhidrato de éster metílico de sarcosina 5 23200000 0.0 Clorhidrato de éster metílico de L-prolina 5 23200000 0.0 Acido nipecótico 5 23200000 0.0 Como se muestra en la Tabla 7 y la Tabla 8, el sistema de MPO exhibe una potente actividad microbicida en presencia de la mayoría de los homólogos de aminoácidos sometidos a prueba. La mayoría de los compuestos seleccionados para representar los aminoácidos beta, aminoácidos de éster y homólogos de aminoácidos N-sustituidos lograron una eliminación 107 CFU de Staphylococcus aureus en presencia de 3% de sangre, mientras que las condiciones de prueba idénticas sin aminoácidos proporcionaron una reducción logarítmica menor de 1.5, como se muestra en la Tabla 2 hasta la Tabla 5. Los aminoácidos solos no exhiben ninguna actividad microbicida como se muestra en la Tabla 8.

Ejemplo 4 El procedimiento general del Ejemplo 2 se siguió para varios aminoácidos utilizando MPO en concentraciones de 25 o 100 µg/mL y los aminoácidos en concentraciones de 1.25, 5 o 20 µt???/mL (mM) durante períodos de tiempo de 30 o 60 minutos antes de enfriar rápidamente la reacción con catalasa. El valor Log 10 (CFU+1) de sobrevivientes del organismo para cada uno de los aminoácidos y condiciones se muestra en la siguiente Tabla 9 clasificado en orden de eficacia decreciente de los resultados promedio de las condiciones de prueba.

Tabla 9 Efecto de Aminoácidos sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra StaphylococcuB aureus en Condiciones Variantes de Concentración y Tiempo Condiciones de Prueba: A B C D E F G H MPO (µ??p?.) 100 100 100 100 25 25 25 25 AA (mM) 20 20 5 5 5 5 1.25 1.25 tiempo (min.) 30 60 30 60 30 60 30 60 Aminoácido: Log 10 (CFU+1) de Sobrevivientes Rango Prom.

B C D E F G Beta alanina 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.000 Ester metílico de D-Alanina 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.000 L-lsoleuc¡na 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.1 0.0 1.250 L-Leuc¡na 0.0 0.0 0.0 0.0 4.1 0.0 3.9 0.0 2.000 L-Valina 0.0 0.0 0.0 0.0 4.7 0.0 4.8 0.0 2.375 D-Valina 0.0 0.0 0.0 0.0 4.1 0.0 6.7 0.0 2.625 D-lsoleucina 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.0 1.1 2.625 D-Fenilalanina 0.0 0.0 0.0 0.0 5.1 0.0 7.2 4.9 6.500 L-Fenilalanina 0.0 0.0 0.0 0.0 7.1 0.0 7.0 4.9 7.500 L-Serina 5.8 0.0 5.0 0.0 5.0 0.0 6.8 1.8 8.000 Ester metílico de L-Alanina 0.0 0.0 0.0 0.0 7.3 0.0 7.3 0.0 8.625 L-Ornitina 6.9 0.0 6.7 0.0 7.2 0.0 7.3 0.0 12.375 L-Alan¡na 6.1 0.0 5.1 0.0 6.9 4.1 7.0 4.7 12 .875 D-Leucina 1.8 1.9 2.7 2.0 3.8 2.2 6.7 2.1 13 .625 Aminoácido: Log 10 (CFU+1 ) de Sobrevivientes Rango Prom.

L-Prolina 5.8 0.0 4.9 0.0 7.1 3.9 7.0 6.8 14.000 L-Lisina 261 0.8 0.8 0.9 0.5 5.8 1.6 6.8 3.7 14.125 D-Ornitina 6.8 0.0 5.1 0.0 7.3 3.9 7-3 5.7 15.500 D-Serina 6.0 3.9 6.0 0.0 6.8 6.5 6.7 6.0 15.625 D-Prolina 4.8 0.0 5.7 2.7 6.9 2.4 7.3 3.7 16.125 D-Tirosina 5.8 0.0 6.7 5.0 6.8 5.9 6.7 7.0 18.125 Glicina 7.0 0.0 6.0 0.0 7.2 6.8 7.3 6.9 19.625 D-Arginina 7.0 6.8 6.9 0.0 6.9 6.7 7.0 5.9 20.000 D-Histidina 6.8 3.9 5.1 4.1 7.0 6.0 6.9 5.8 20.125 D-Glutamina 6.8 4.0 5.0 0.0 7.3 7.0 7.2 7.0 21.375 D-Alanina 7.3 0.0 6.8 0.6 7.3 3.7 7.3 6.7 22.500 Acido hipúrico 6.8 5.0 7.3 5.9 7.3 5.9 6.7 5.8 24.875 L-Glutamina 7.0 5.2 7.2 0.0 7.3 7.1 6.8 7.0 25.000 Acido L-Aspártico 7.0 6.8 7.0 5.8 7.1 7.0 7.0 6.9 26.375 Acido L-Glutámico 7.3 6.0 6.9 2.8 7.1 7.0 7.3 6.7 26.875 L-Treonina 7.3 7.3 7.1 5.5 7.3 7.1 7.3 6.7 29.625 D-Treonina 7.4 5.0 7.1 5.1 7.3 6.8 7.3 6.7 29.750 Anhídrido de L-Alanina 7.1 6.0 7.2 5.8 7.2 7.3 7.2 7.2 30.250 L-Hidroxiprolina 7.2 7.3 7.2 0.9 7.3 7.3 7.4 6.1 30.625 L-Histidina 7.3 7.3 6.8 4.7 7.3 7.3 7.3 7.3 32.125 Taurina 7.3 5.1 7.3 5.0 7.3 7.0 7.3 7.1 32.625 Anhídrido de glicina 7.0 6.9 7.3 5.9 7.4 7.2 7.3 7.0 33.000 L-Tirosina 7.3 7.2 7.3 5.8 7.3 7.1 7.3 7.0 33.250 Ejemplo 5 El Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre El efecto de combinaciones de dos maneras de aminoácidos, como agentes que mejoran el potencial para la acción microbicida de p-MPO en presencia de sangre, se demostró al seguir el procedimiento general del Ejemplo 2, excepto que cada prueba contenía una sola concentración baja de MPO (12.5 µg/mL o 4.7 U/mL) y glucosa oxidasa (4.2 U/mL) y dos activadores de aminoácidos, como se indica en las Tablas 9 hasta 13 posteriores, cada uno agregado a las mezclas en una concentración final de 1.25 µp???/p??.. Cuando los mejoradores de aminoácidos se sometieron a prueba individualmente para comparación, se agregaron a las mezclas en una concentración final de 2.5 µ?????/p???.

Los resultados se muestran a continuación.

Tabla 10 Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mllil U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos D-Tirosina 1.25 L-Leucina 1.25 4.7 4.2 5050000 0.7 D-Tirosina 1.25 D-Glutamina 1.25 4.7 4.2 11050000 0.3 D-Tiros¡na 1.25 L-Ser¡na 1.25 4.7 4.2 11250000 0.3 D-Valina 1.25 L-Prolina 1.25 4.7 4.2 10100000 0.4 D-Valina 1.25 L-Histidina 1.25 4.7 4.2 12600000 0.3 Glicina 1.25 D-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 4250000 0.8 Ester metílico de L-Ala 1.25 D-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 11900000 0.3 Acido L-Aspártico 1.25 L-Alanina 1.25 4.7 4.2 11350000 0.3 Acido L-Aspártico 1.25 Acido L-Glutámico 1.25 4.7 4.2 13150000 0.3 Acido L-Glutámico 1.25 D-Arginina 1.25 4.7 4.2 12500000 0.3 L-Glutamina 1.25 L-Valina 1.25 4.7 4.2 11800000 0.3 L-Glutamina 1.25 Ester metílico de L-Ala 1.25 4.7 4.2 12500000 0.3 L-Glutamina 1.25 D-Valina 1.25 4.7 4.2 14850000 0.2 Glicina 1.25 L-Valina 1.25 4.7 4.2 910 4.4 L-Histidina 1.25 L-Ornitina 1.25 4.7 4.2 12250000 0.3 L-Hidroxiprolina 1.25 D-Glutamina 1.25 4.7 4.2 13750000 0.3 L-lsoleucina 1.25 D-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 4850000 0.7 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos L-Leucina 1.25 Acido L-Glutámico 1.25 4.7 4.2 8200000 0.5 L-Lisina 1.25 Acido L-Glutámico 1.25 4.7 4.2 12050000 0.3 L-Ornitina 1.25 L-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 5950000 0.6 ninguno 0 D-Tirosina 2.5 4.7 4.2 1320000 1.3 ninguno 0 L-Leucina 2.5 4.7 4.2 214500 2.1 ninguno 0 D-Glutamina 2.5 4.7 4.2 14750000 0.2 ninguno 0 L-Serina 2.5 4.7 4.2 1175000 1.3 ninguno 0 D-Valina 2.5 4.7 4.2 630000 1.6 ninguno 0 L-Prolina 2.5 4.7 4.2 1235000 1.3 ninguno 0 L-Histidina 2.5 4.7 4.2 7000000 0.5 ninguno Glicina 2.5 4.7 4.2 9100 3.4 ninguno D-Fenilalahina 2.5 4.7 4.2 7950000 0.5 ninguno 0 Ester metílico de L-Ala 2.5 4.7 4.2 7250000 0.5 ninguno Acido L-Aspártico 4.7 4.2 6900000 0.6 ninguno L-Alanina 4.7 4.2 9750000 0.4 ninguno Acido L-Glutámico 2.5 4.7 4.2 10850000 0.4 ninguno D-Arginina 2.5 4.7 4.2 14200000 0.2 ninguno L-Glutamina 2.5 4.7 4.2 14350000 0.2 ninguno L-Valina 2.5 4.7 4.2 104500 2.4 ninguno L-Ornitina 2.5 4.7 4.2 18250000 0.1 ninguno L-Hidroxiprolina 2.5 4.7 4.2 13100000 0.3 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos ninguno 0 L-lsoleucina 2.5 4.7 4.2 159500 2.2 ninguno 0 L-Lisina 2.5 4.7 4.2 16200000 0.2 ninguno 0 L-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 10550000 0.4 ninguno 0 ninguno 0 0 0 25050000 0.0 Control realizado en ausencia de sangre, aminoácido, glucosa, MPO y glucosa oxidasa.

Tabla 11 Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos D-Arginina 1.25 L-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 6650000 0.6 D-Arginina 1.25 D-Glutamina 1.25 4.7 4.2 10850000 0.4 D-Arginina 1.25 D-Histidina 1.25 4.7 4.2 6050000 0.6 D-Glutamina 1.25 D-lsoleucina 1.25 4.7 4.2 8950000 0.5 D-Histidina 1.25 D-Prolina 1.25 4.7 4.2 5100000 0.7 D-Histidina 1.25 L-Histidina 1.25 4.7 4.2 1 1250000 0.4 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 m U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos D-lsoleucina 1.25 L-Leucina 1.25 4.7 4.2 7750000 0.5 D-lsoleucina 1.25 D-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 4100000 0.8 D-Leucina 1.25 L-Histidina 1.25 4.7 4.2 10200000 0.4 D-Leucina 1.25 Ester metílico de D-Ala 1.25 4.7 4.2 7100000 0.6 D-Orn¡tina 1.25 L-lsoleucina 1.25 4.7 4.2 1 1850000 0.4 D-Ornitina 1.25 L-Ornitina 1.25 4.7 4.2 12850000 0.3 D-Fenilalanina 1.25 L-Lisina 1.25 4.7 4.2 8300000 0.5 D-Prol¡na 1.25 L-Lisina 1.25 4.7 4.2 12350000 0.3 D-Prolina 1.25 D-lsoleucina 1.25 4.7 4.2 10500000 0.4 D-Prol¡na 1.25 D-Leucina 1.25 4.7 4.2 1 1600000 0.4 D-Ser¡na 1.25 D-Treonina 1.25 4.7 4.2 12300000 0.3 D-Serina 1.25 D-Glutamina 1.25 4.7 4.2 12000000 0.4 D-Treonina 1.25 L-Lisina 1.25 4.7 4.2 1 1900000 0.4 ninguno 0 D-Arginina 2.5 4.7 4.2 14650000 0.3 ninguno 0 L-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 1 1 100000 0.4 ninguno 0 D-Glutamina 2.5 4.7 4.2 15500000 0.2 ninguno 0 D-Histidina 2.5 4.7 4.2 8000000 0.5 ninguno 0 D-lsoleucina 2.5 4.7 4.2 196000 2.1 ninguno 0 D-Prolina 2.5 4.7 4.2 1890000 1.2 ninguno 0 L-Histidina 2.5 4.7 4.2 7000000 0.6 ninguno 0 L-Leucina 2.5 4.7 4.2 200500 2.1 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos ninguno D-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 9300000 0.5 ninguno D-Leucina 2.5 4.7 4.2 313000 1.9 ninguno 0 Ester metílico de D-Ala 2.5 4.7 4.2 9500000 0.5 ninguno D-Ornitina 2.5 4.7 4.2 17950000 0.2 ninguno 0 L-lsoleucina 2.5 4.7 4.2 155500 2.2 ninguno 0 L-Ornitina 2.5 4.7 4.2 17400000 0.2 ninguno o L-Lisina 2.5 4.7 4.2 18900000 0.2 ninguno o D-Serina 2.5 4.7 4.2 945000 1.5 ninguno o D-Treonina 2.5 4.7 4.2 2020000 1.1 ninguno o ninguno 26850000 0.0 Ejemplo 6 Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos que Contienen Glicina sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Utilizando el procedimiento general del Ejemplo 5, en el cual uno de los dos aminoácidos es glicina, se produjeron los resultados mostrados en las Tablas 12 y 13.

Tabla 12 Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos con Glicina sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos Glicina 1.25 Beta-alanina 1.25 4.7 4.2 6800 3.5 Glicina 1.25 L-Valina 1.25 4.7 4.2 910 4.4 Glicina 1.25 L-Leucina 1.25 4.7 4.2 6900 3.5 Glicina 1.25 L-lsoleucina 1.25 4.7 4.2 975 4.4 Glicina 1.25 D-Valina 1.25 4.7 4.2 3330 3.8 Glicina 1.25 D-lsoleucina 1.25 4.7 4.2 0 7.4 Glicina 1.25 Ester metílico de D-Ala 1.25 4.7 4.2 125500 2.3 Glicina 2.5 ninguno 0 4.7 4.2 7050 3.5 ninguno 0 Beta-alanina 2.5 4.7 4.2 505000 1.7 ninguno L-Valina 2.5 4.7 4.2 104500 2.4 ninguno L-Leucina 2.5 4.7 4.2 200500 2.1 ninguno L-lsoleucina 2.5 4.7 4.2 73000 2.5 ninguno D-Valina 2.5 4.7 4.2 630000 1.6 ninguno D-lsoleucina 2.5 4.7 4.2 196000 2.1 ninguno Ester metílico de D-Ala 2.5 4.7 4.2 5450000 0.6 ninguno ninguno 0 0 0 0 Tabla 13 Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos con Glicina sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcua aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos Glicina 1.25 L-Alanina 1.25 4.7 4.2 209500 2.1 Glicina 1.25 D-Alanina 1.25 4.7 4.2 162500 2.2 Glicina Acido L-Aspártico 1.25 4.7 4.2 51000 2.7 Glicina Acido L-Glutámico 1.25 4.7 4.2 1100000 1.3 Glicina 1.25 L-Glutamina 1.25 4.7 4.2 765000 1.5 Glicina 1.25 L-Histidina 1.25 4.7 4.2 495000 1.7 Glicina L-Hidroxiprolina 1.25 4.7 4.2 4900000 0.7 Glicina D-Leucina 1.25 4.7 4.2 90000 2.4 Glicina 1.25 L-Lisina 1.25 4.7 4.2 680000 1.6 Glicina 1.25 L-Ornitina 1.25 4.7 4.2 4600000 0.7 Glicina 1.25 L-Prolina 1.25 4.7 4.2 162500 2.2 Glicina 1.25 L-Serina 1.25 4.7 4.2 99500 2.4 Glicina 1.25 L-Treonina 1.25 4.7 4.2 515000 1.7 Glicina 1.25 L-Tirosina 1.25 4.7 4.2 565 4.6 Glicina 1.25 D-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 4250000 0.8 Glicina 2.5 ninguno 0 4.7 4.2 10050 3.4 ninguno 0 L-Alanina 2.5 4.7 4.2 2230000 1.0 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos ninguno 0 D-Alanina 2.5 4.7 4.2 1900000 1.1 ninguno 0 Acido L-Aspártico 2.5 4.7 4.2 4700000 0.7 ninguno 0 Acido L-Glutámico 2.5 4.7 4.2 11800000 0.3 ninguno 0 L-Glutamina 2.5 4.7 4.2 12550000 0.3 ninguno 0 L-Histidina 2.5 4.7 4.2 4750000 0.7 ninguno 0 L-Hidroxiprolina 2.5 4.7 4.2 1 1450000 0.3 ninguno 0 D-Leucina 2.5 4.7 4.2 1 19000 2.3 ninguno 0 L-Lisina 2.5 4.7 4.2 1 1400000 0.3 ninguno 0 L-Ornitina 2.5 4.7 4.2 12650000 0.3 ninguno 0 L-Prolina 2.5 4.7 4.2 1500000 1.2 ninguno 0 L-Serina 2.5 4.7 4.2 835000 1.5 ninguno 0 L-Treonina 2.5 4.7 4.2 1415000 1.2 ninguno 0 L-Tirosina 2.5 4.7 4.2 890000 1.4 ninguno 0 D-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 8850000 0.4 ninguno 0 ninguno 0 0 0 25000000 0.0 Ejemplo 7 El Efecto de Combinaciones de Aminoácidos de Dos Maneras que Contienen L-Isoleucina sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre El aminoácido L-isoleucina se identificó en el Ejemplo 2 como un fuerte mej orador de la actividad del sistema de MPO contra Staphylococcus aureus. El efecto de combinaciones de dos maneras de aminoácidos individuales con L-isoleucina, como agentes que mejoran el potencial, para la acción microbicida de MPO en presencia de sangre, se examinó por lo tanto por medio del siguiente procedimiento del Ejemplo 5. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 14 a continuación.

Tabla 14 Efecto de Combinaciones de Dos Maneras de Aminoácidos con L- Isoleucina sobre la Actividad Microbicida del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Staphylococcus aureus en Presencia de Sangre Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos L-lsoleucina 1.25 Beta-alanina 1.25 4.7 4.2 13850000 0.3 L-lsoleucina 1.25 Ester metílico de D-Ala 1.25 4.7 4.2 14700000 0.3 L-lsoleucina 1.25 L-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 7900000 0.5 L-lsoleucina 1.25 Acido L-Glutámico 1.25 4.7 4.2 13950000 0.3 L-lsoleucina 1.25 D-Glutamina 1.25 4.7 4.2 13700000 0.3 L-lsoleucina 1.25 L-Alanina 1.25 4.7 4.2 16400000 0.2 L-lsoleucina 1.25 L-Hidroxiprolina 12850000 0.3 L-lsoleucina 1.25 D-Leucina 12600000 0.3 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos L-lsoleuc¡na 1.25 L-Lisina 1.25 4.7 4.2 13350000 0.3 L-lsoleucina 1.25 D-Ornitina 1.25 4.7 4.2 11850000 0.4 L-lsoleucina 1.25 L-Ornitina 1.25 4.7 4.2 14700000 0.3 L-lsoleucina 1.25 D-Fenilalanina 1.25 4.7 4.2 4850000 0.7 L-lsoleucina 1.25 L-Prolina 1.25 4.7 4.2 15950000 0.2 L-lsoleucina 1.25 L-Serina 1.25 4.7 4.2 13250000 0.3 L-lsoleucina 1.25 D-Arginina 1.25 4.7 4.2 12400000 0.3 L-lsoleucina 1.25 L-Tirosina 1.25 4.7 4.2 8450000 0.5 L-lsoleucina 2.5 ninguno 4.7 4.2 1 17000 2.4 ninguno 0 Beta-Alanina 2.5 4.7 4.2 6000000 0.7 ninguno 0 Ester metílico de D-Ala 2.5 4.7 4.2 8850000 0.5 ninguno L-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 12050000 0.3 ninguno Acido L-Glutámico 2.5 4.7 4.2 13700000 0.3 ninguno D-Glutamina 2.5 4.7 4.2 15050000 0.3 ninguno 0 L-Alanina 2.5 4.7 4.2 2215000 1.1 ninguno 0 L-Hidroxiprolina 2.5 4.7 4.2 11550000 0.4 ninguno 0 D-Leucina 2.5 4.7 4.2 163500 2.2 ninguno 0 L-Lisina 2.5 4.7 4.2 16950000 0.2 ninguno 0 L-Ornitina 2.5 4.7 4.2 19200000 0.1 ninguno 0 L-Prolina 2.5 4.7 4.2 1835000 1.2 ninguno 0 L-Serina 2.5 4.7 4.2 940000 1.5 Viabilidad Conc. Conc. Promedio Reducción Nombre de de AA Nombre de de AA MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 1 mM Aminoácido 2 2 mlUI U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos ninguno 0 D-Arginina 2.5 4.7 4.2 15000000 0.3 ninguno 0 L-Tirosina 2.5 4.7 4.2 1450000 1.3 ninguno 0 D-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 7950000 0.5 ninguno 0 D-Ornitina 2.5 4.7 4.2 17950000 0.2 ninguno 0 ninguno 0 0 0 27400000 0.0 Un análisis de datos, contenidos en la Tabla 10 hasta la Tabla 14, que compara el efecto sobre el desempeño de todas las formulaciones de dos aminoácidos combinados con el efecto de cada aminoácido individual se condujo para identificar una posible sinergia o antagonismo .

Treinta y siete aminoácidos o derivados de los mismos se examinaron individualmente. Setenta y cuatro pares de aminoácidos se sometieron a prueba bajo las condiciones estándar descritas anteriormente.

Método de Determinación de Sinergia Los cálculos para el sinergismo o antagonismo se hicieron de la siguiente manera: Para cada par de aminoácidos sometido a prueba, la CFU prevista se calculó como el promedio de sobrevivientes de CFU encontrados para los dos resultados de aminoácidos individuales que actúan solos bajo las condiciones estándar. Se debe considerar por ejemplo la primera combinación sinergista con D-isoleucina y glicina mostrada en la Tabla 11. La CFU para cada aminoácido que actúa por separado, tomada de la Tabla 11, anterior, es 196000 y 9300, respectivamente. El promedio de estos dos números es 102650, mostrado como los sobrevivientes de CFU previstos en la línea uno de la Tabla 16 posterior. La CFU Real observada para el par entonces se divide por la CFU Prevista y se multiplica por 100 para calcular el % de valor Previsto. Este valor luego se debe comparar con el valor de umbral, planteado en la siguiente sección, para determinar si el par es sinergista, antagonista o aditivo.

Cálculo de Valores de Umbral El cálculo de valores de umbral apropiados para la determinación del sinergismo y antagonismo se basó en la variabilidad de medidas de sobrevivientes de CFU replicadas. La mayoría de mediciones se hizo por duplicado. La suma acumulada de cuadrados para todos los datos duplicados, después de la transformada log 10 (CFU+1) , divididos por el número de grados de libertad que proporciona la variancia errática de los datos transformados logarítmicamente. A partir de esto, el Coeficiente de Variación (CV, por sus siglas en inglés) se calcula y se muestra en la Tabla 15.

Tabla 15 Cálculo de una Estimación Acumulada de Coeficiente de Variación de CFU Este CV se calcula sobre el rango completo de respuestas de CFU. Para la respuesta, por lo tanto, la variación normal está dentro de dos desviaciones estándar o aproximadamente de 50% a 200%. Un factor conservador de un duplicado adicional se utilizó en este punto para asegurar que se identifique el sinergismo y antagonismo real. Por lo tanto, el corte se estableció en 25% para el sinergismo y 400% para el antagonismo. La aplicación de este umbral al ejemplo anterior proporciona la conclusión obvia de que, existe una acción sinergista de D-isoleucina y glicina, puesto que la CFU real para este par fue 0 CFU, o 0% del valor previsto .

Tablas de Resultados Los resultados de cada combinación sometida a prueba se dividieron en tres Tablas--la Tabla 16 muestra las combinaciones sinergistas con respuestas menores que 25% del valor previsto, la Tabla 17 muestra las combinaciones antagonistas con respuestas mayores que 400% del valor previ sto y la Tabla 18 muestra las combinac iones adit ivas , con respuestas entre 25 % y 400 % del valor previsto .

Tabla 16 Combinaciones Sinergistas CFU Promedio Previsto de Previsto Aminoácido 1 Aminoácido 2 Real Aminoácidos vs. Real D-lsoleucina Glicina 0 102650 0.0% L-Tirosina Glicina 565 589650 0.1 % Beta-Alanina Glicina 6800 1630900 0.4% D-Valina Glicina 3330 319650 1.0% L-lsoleucina Glicina 975 69317 1.4% L-Valina Glicina 910 56900 1.6% Acido L-Aspártico Glicina 51000 3121317 1.6% Ester metílico de D-Ala Glicina 125500 3834650 3.3% L-Leucina Glicina 6900 106650 6.5% L-Alanina Glicina 209500 2370483 8.8% L-Glutamina Glicina 765000 6704650 11.4% L-Lisina Glicina 680000 5704650 1 1.9% L-Histidina Glicina 495000 2942150 16.8% D-Alanina Glicina 162500 954650 17.0% Acido L-Glutámico Glicina 1100000 6124650 18.0% L-Serina Glicina 99500 492650 20.2% L-Prolina Glicina 162500 739650 22.0% Tabla 17 Combinaciones Antagonistas CFU Promedio Previsto de Previsto Aminoácido 1 Aminoácido 2 Real Aminoácidos vs Real L-Leuc¡na D-Tiros¡na 5050000 762000 662.7% L-lsoleucina L-Alanina 16400000 2430500 674.8% L-lsoleucina D-Alanina 13850000 1690917 819.1 % D-Treonina D-Serina 12300000 1482500 829.7% L-Prolina D-Valina 10100000 1050000 961 .9% L-Serina D-Tirosina 1 1250000 1 148000 980.0% D-Prolina D-lsoleucina 10500000 1043000 1006.7% D-Prolina D-Leuc¡na 1 1600000 1052500 1102.1 % L-Tirosina L-lsoleucina 8450000 649667 1300.7% L-Prolina L-lsoleucina 15950000 799667 1994.6% L-Serina L-lsoleucina 13250000 552667 2397.5% L-Leucina D-lsoleucina 7750000 200000 3875.0% L-lsoleucina D-Leucina 12600000 172167 7318.5% Tabla 18 Combinaciones Aditivas CFU Promedio Previsto Previsto Aminoácido 1 Aminoácido 2 Real de Aminoácidos vs Real L-Fenilalanina L-Ornitina 5950000 13800000 43.1 % L-Fenilalan¡na D-Arginina 6650000 12900000 51.6% D-Histidina D-Arginina 6050000 1 1300000 53.5% L-Orn¡tina Glicina 4600000 8204650 56.1 % CFU Promedio Previsto Aminoácido 1 Aminoácido 2 Real de Aminoácidos L-Usina D-Fenilalanina 8300000 13087500 L-Treonina Glicina 515000 712150 D-Glutam¡na D-Arginina 10850000 14700000 L-Ornitina D-Ornitina 12850000 17175000 Glicina D-Leucina 90000 112150 L-Lisina Acido L-Glutámico 12050000 14857500 L-Hidroxiprolina Glicina 4900000 5934650 D-Fenilalanina D-lsoleucina 4100000 4448000 Acido L-Glutámico D-Arginina 12500000 13420000 Glicina D-Fenilalanina 4250000 4354650 L-Hidroxiprolina D-Glutamina 13750000 13330000 L-lsoleucina D-Fenilalanina 4850000 4414667 L-Ornitina L-Histidina 12250000 1 1 37500 D-lsoleucina D-Glutamina 8950000 7498000 Ester metílico de L- L-Glutamina 12500000 10325000 Ala L-Lisina D-Treonina 1 1900000 9747500 L-Lisina D-Prolina 12350000 9682500 L-lsoleucina D-Ornitina 11850000 9039667 • L-Leucina Acido L-Glutámico 8200000 6222000 D-Tirosina D-Glutamina 11050000 8060000 L-Fenilalanina L-lsoleucina 7900000 5664667 Acido L-Glutámico Acido L-Aspártico 13150000 9236667 CFU Promedio Previsto Previsto Aminoácido 1 Aminoácido 2 Real de Aminoácidos vs Real Ester metílico de L-Ala D-Fenilalanina 11900000 7975000 149.2% L-Lisina L-lsoleucina 13350000 8802167 151.7% D-Serina D-Glutamina 12000000 7872500 152.4% L-Histidina D-Histidina 11250000 6937500 162.2% L-lsoleucina D-Arginina 12400000 7364667 168.4% L-Valina L-Glutamina 11800000 6752250 174.8% L-Ornitina L-lsoleucina 14700000 8264667 177.9% D-Leuc¡na Ester metílico de D-Ala 7100000 3937500 180.3% L-lsoleucina D-Glutamina 13700000 7464667 183.5% Acido L-Aspártico L-Alanina 11350000 5482500 207.0% L-Glutamina D-Valina 14850000 7015000 211.7% L-lsoleucina L-Hidroxiprolina 12850000 5994667 214.4% L-lsoleucina Acido L-Glutámico 13950000 6184667 225.6% r-lsoleucina Glicina 94500 36650 257.8% L-Histidina D-Leucina 10200000 3045000 335.0% L-lsoleucina Ester metílico de D-Ala 14700000 3894667 377.4% L-Histidina D-Valina 12600000 3252500 387.4% Combinaciones Racémicas de Aminoácidos Los aminoácidos racémicos se pueden considerar como una mezcla 1:1 de los D- y L- isómeros. Por lo tanto, algunas mezclas racémicas se sometieron a prueba como combinaciones para identificar mezclas antagonistas, aditivas o sinergistas con base en el desempeño de los D- y L-enantiómeros individuales. Los resultados para las formas D-, L- y racémicas de cuatro aminoácidos se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19 las Racémicas Conc. de Viabilidad Promedio Reducción Nombre del AA 1 MPO GO CFU/ml Log Aminoácido 1 mM U/ml U/ml 50 minutos 50 minutos D,L-lsoleucina 2.5 4.7 4.2 64000 2.7 D,L-Leucina 2.5 4.7 4.2 650000 1.6 D,L-Fenilalan¡na 2.5 4.7 4.2 900000 1.4 D,L-Val¡na 2.5 4.7 4.2 685000 1.5 L-lsoleucina 3.5 4.7 4.2 129333 2.3 L-Leucina 3.5 4.7 4.2 204000 2.1 L-Fenilalanina 3.5 4.7 4.2 11200000 0.4 L-Valina 2.5 4.7 4.2 104500 2.4 D-lsoleuc¡na 2.5 4.7 4.2 196000 2.1 D-Leucina 2.5 4.7 4.2 215000 2.1 D-Fenilalanina 2.5 4.7 4.2 8700000 0.5 D-Valina 2.5 4.7 4.2 630000 1.6 Con base en los valores previstos en la Tabla posterior, las mezclas racémicas parecen ser aditivas excepto para r-fenilalanina la cual parece ser sinergista.

Tabla 20 Resultados de las Mezclas Racémicas Aminoácido CFU Real Promedio Previsto Previsto de Aminoácidos vs. Real d.l-lsoleucina 64000 162667 39% d.l-Leucina 650000 209500 310% d,l-Fenilalanina 900000 9950000 9% d -Valina 685000 367250 187% Ejemplo 8 El Efecto de la Combinación de Beta Alanina y L-Alanina sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Esporas de Bacillus subtilis en Presencia de Sangre El efecto de una combinación de dos maneras de beta alanina y L-alanina, como agentes que mejoran el potencial, para la acción microbicida de MPO contra esporas de Bacillus subtilis en presencia de sangre, se determinó siguiendo el procedimiento del Ejemplo 2. Sin embargo, en este caso cada prueba contenía una sola concentración baja de MPO (25 µg/mL o 9.4 U/mL) y glucosa oxidasa (8.3 U/mL) . Las suspensiones de Bacillus subtilis que contenían 100% de esporas, confirmado por medio de un microscopio, se obtuvieron por medio del lavado con etanol al 50% para eliminar las formas vegetativas de Bacillus subtilis . El efecto de tanto L-alanina como beta alanina solas sobre la actividad antimicrobiana de mieloperoxidasa contra esporas de Bacillus subtilis se sometió a prueba para la comparación. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 21 a continuación.

Tabla 21 El Efecto de la Combinación de Beta Alanina y L-Alanina sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa contra Esporas de Bacillus subtilis en Presencia de Sangre Nombre de Conc. Nombre de Conc. MPO GO Viabilidad Viabilidad Redu- Redu- Amino- de Amino- de U/ml U/ml Promedio Promedio cción cción ácido 1 AA ácido 2 AA 2 CFU/ml CFU/ml Log Log mM 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora Beta alanina L-Alanina 0.2 9.4 8.3 80000 2.3 Beta alanina L-Alanina 0.2 9.4 8.3 70000 2.4 Beta alanina L-Alanina 9.4 8.3 3100000 0.7 ninguno 0 L-Alanina 0.2 9.4 8.3 1200000 1.1 ninguno 0 L-Alanina 0.2 9.4 8.3 520000 1.5 ninguno 0 ninguno 9.4 8.3 3700000 0.6 Como se puede observar en la Tabla 21, la interacción de dos maneras de los aminoácidos beta alanina y L-alanina mejoró significativamente la eliminación de mielopero idasa de esporas de Bacillus subtilis en comparación con el d'es empeño del sistema de MPO con L-alanina sola o en ausencia de aminoácidos. En 2 horas, la formulación que contenía beta alanina/L-alanina demostró una reducción logarítmica de 2.4 donde la formulación con únicamente L-alanina proporcionó una reducción logarítmica de 1.5.

El carácter de la relación entre la beta alanina y L-alanina se examinó siguiendo el método de dete minación de sinergia descrito anteriormente. En 2 horas, la be'ta alanina sola exhibe 3100000 sobrevivientes de CFU y la L-alanina que actúa sola muestra 520000 CFU. El promedio de estos números es 1810000 CFU, lo cual es el valor previsto para la combinación de los dos aminoácidos. La CFU real observada para el par de beta a 1 a n i n a / L - a 1 a n i n a es 70000 CFU, lo cual representa únicamente 3.9% del valor previsto indicando una combinación sinergista.

E emplo 9 El Efecto de Combinaciones de Dos Maneras y Aminoácidos Individuales sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxidasa Contra Organismos G r am - N e g a t i v o s , Gram- Positivos y de Levadura en Presencia de Sangre El efecto de combinaciones de dos maneras de los aminoácidos glicina y valina, e individualmente beta alanina, como agentes que mejoran el potencial para la acción microbicida de MPO contra P s e udomona s aeruginosa, S t aphy 1 o c o c cu s aureus y Candida albicans, en presencia de sangre, se determinó siguiendo el procedimiento del Ejemplo 2. Cada organismo se sometió a prueba contra una sola concentración baja de MPO (25 µg/mL o 9.4 U/mL) y glucosa oxidasa (8.3 U/mL) . Los dos activadores de aminoácidos se agregaron cada uno en una concentración final de 2.5 µp???/mL y el aminoácido individual, beta alanina, se sometió a prueba en una concentración individual de 5 µ????/mL. El efecto de las formulaciones que no contenían aminoácidos sobre la actividad a n t i m i c r ob i a n a de mielo eroxidasa contra estos organismos se sometió a prueba para comparación. Los resultados se muestran en la Tabla 22, a continuación .

Ejemplo 9 El Efecto de Combinaciones de Dos Maneras y Aminoácidos Individuales sobre la Actividad Antimicrobiana del Sistema de Mieloperoxxdasa Contra Organismos Gram-Negativos , Gram- Positivos y de Levadura en Presencia de Sangre Nombre Conc. Nombre Nombre Conc. Inoculo Viabilidad Viabilidad Reducción Reduc- Nombre de de amino- de AA de amino- Conc. de Amino- de AA 3 MPO GO de Inicio Promedio Promedio Log cion organismo ácido 1 1 nM ácido 2 de AA 2 ácido 3 nM U/ml U/ml Log 10 CFU/ml CFU/ml 30 min. Log 30 min. 60 min. 60 min.

P. aeruginosa Glicina 2.5 L-Valina 2.5 Beta alanina 9.4 8.3 7.5 885000 1.5 P. aeruginosa Glicina 2.5 L-Valina 2.5 Beta alanina 9.4 8.3 7.5 2070 4.1 P. aeruginosa Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 9.4 8.3 7.5 52 5.7 10 P. aeruginosa Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 9.4 8.3 7.5 6.6 P. aeruginosa Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 9.4 8.3 7.5 210000 2.1 P aeruginosa Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 9.4 8.3 7.5 301500 2.0 C. albicans Glicina 2.5 L-Valina 2.5 Beta alanina 9.4 8.3 6.2 68500 1.3 C. albicans Glicina 2.5 L-Valina 2.5 Beta alanina 9.4 8.3 6.2 5000 2.5 15 C. albicans Glicina L-Valina Beta alanina 9.4 8 3 6.2 8500 2.2 Nombre Conc. Nombre Nombre Conc. Inoculo Viabilidad Viabilidad Reducción Reduc¬ Nombre de de amino- de AA de amino- Conc. de Amino- de AA 3 MPO GO de Inicio Promedio Promedio Log ción organismo ácido 1 1 nM ácido 2 de AA 2 ácido 3 nM U/ml U/ml Log 10 CFU/ml CFU/ml 30 min. Log 30 min. 60 min. 60 min.

C. albicans Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 5 9.4 8.3 6.2 965 3.2 5 C. albicans Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 0 9.4 8.3 6.2 151000 1.0 C. albicans Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 0 9.4 8.3 6.2 73500 1.3 5. aureus Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 5 9.4 8.3 7.4 7.4 S. aureus Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 5 9.4 8.3 7.4 7.4 S. aureus Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 0 9.4 8.3 7.4 6 50000 0.6 S. aureus Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 0 9.4 8.3 7.4 5050000 0.7 10 S. aureus Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 2.5 4.7 4.2 7.4 8100000 0.5 S. aureus Glicina 0 L-Valina 0 Beta alanina 2.5 4.7 4.2 7.4 7.4 S. aureus Glicina 1.25 L-Valina 1.25 Beta alanina 0 4.7 4.2 7.4 7.4 P. aeruginosa ninguno 0 ninguno 0 ninguno 0 7.5 28650000 28650000 0 C. albicans ninguno 0 ninguno 0 ninguno 0 6.2 1400000 1455000 0 15 S. aureus ninguno 0 ninguno 0 ninguno 0 7.4 23800000 23800000 0 Como se muestra en la Tabla 22, tanto la combinación de dos maneras de L-valina y glicina como el aminoácido individual beta alanina mejoraron significativamente la actividad microbicida del sistema de MPO en presencia de sangre contra todos los organismos sometidos a prueba en comparación con el desempeño del sistema de MPO en ausencia de aminoácidos. En el caso de P. aeruginosa, el efecto de mejoramiento de la combinación de L-valina/glicina fue de 2.1 logaritmos dentro de 60 minutos y la adición de beta alanina 5 mM sola al sistema de MPO incrementó la actividad antibacteriana por 4.6 logaritmos en 60 minutos. Contra C. albicans, el mejoramiento en la actividad microbicida proporcionado por el L-valina/glicina fue 1.2 logaritmos y 1.9 logaritmos para beta alanina. El mejoramiento más dramático se puede observar contra S. aureus a partir del efecto de beta alanina sobre el sistema de MPO, con un desempeño incrementado de 6.8 logaritmos dentro de 30 minutos. Adicionalmente , como se puede observar en la Tabla 21, el aminoácido individual beta alanina y las dos combinaciones de aminoácidos de L-valina y glicina ambas en concentraciones más bajas de aminoácido y MPO, produjeron la eliminación completa de S. aureus dentro de 60 minutos.

Ejemplo 10 Datos de Prueba in vivo para Formulaciones de MPO que Contienen Varias Combinaciones de Aminoácidos y Aditivos Un modelo in vivo se utilizó para someter a prueba la efectividad de varias combinaciones de aminoácidos en el mejoramiento de la efectividad del sistema antimicrobiano de MPO, de la siguiente manera: Las ratas macho, adultas Sprague-Dawley se utilizaron en todos los estudios. Las ratas se anestesiaron y el pelo de la espalda de cada animal se retiró con esquiladoras eléctricas y la piel se preparó. Dos sitios de heridas se prepararon sobre la espalda de cada rata. El pelo de la espalda de cada animal se retiró con esquiladoras eléctricas y los animales se anestesiaron antes de que se preparara la piel . Se crearon heridas en la piel de espesor completo al levantar la piel holgada y extirpar un área elíptica con tijeras utilizando una técnica estéril, exponiendo la aponeurosis.

Un cilindro abierto de poliestireno (2.5 cm de diámetro) se adhirió a cada sitio de tratamiento con cemento QuickTiteMR (Loctite Corp.). Cada cilindro formó una cámara de prueba hermética a líquidos, la base de la cual era la herida. La aponeurosis expuesta luego se inoculó con 200 µ? que contenían aproximadamente 107 CFU de S. aureus. Quince minutos después se trató la aponeurosis inoculada. Se deseó donde el desafío biológico incrementó, 30 µ? de sangre fresca, entera de rata se agregaron en ese momento. Después, 800 µ? de una formulación de prueba se agregaron al sitio dando por resultado un volumen total de 1.0 mL por sitio de prueba. Las formulaciones de prueba contenían mieloperoxidasa, varios aminoácidos, glucosa oxidasa y glucosa en las cantidades expuestas en las siguientes tablas.

Los sitios de control no tuvieron p-MPO administrada y fueron tratados con 800 µ? de solución salina estéril al 0.9% o amortiguador. Ambos sitios en una sola rata recibieron el mismo tratamiento.

Después de un tiempo de tratamiento predeterminado con formulación de p-MPO, un gran exceso de catalasa se agregó a cada sitio de tratamiento para detener la actividad microbicida adicional . Esto destruyó cualquier peróxido de hidrógeno restante y/o generado subsecuentemente por la formulación.

Los fluidos que permanecían en el cilindro se recuperaron por separado y la aponeurosis subyacente se cortó asépticamente, se pesó y se homogenizó. Los conteos bacterianos sobrevivientes de muestras líquidas y tejidos cortados se valoraron por medio de un cultivo cuantitativo.

Los resultados se reportan como una reducción logarítmica del inoculo inicial.

Utilizando los procedimientos anteriores, la efectividad in vivo en la inhibición de S. aureus (inoculo que contenía 2 x 107 CFU de S. aureus) de una exposición durante 5 minutos a una formulación de prueba de mieloperoxidasa mejorada de la invención que comprendía los aminoácidos L-alanina, L-prolina, y glicina se determinó en presencia de 3% sangre y sin sangre como un promedio de 8 réplicas. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 23.

Tabla 23 relación Viabilidad Log 10 % de Ala Pro Gly Glu MPO GO de Promedio (CFU+1) de Reducción sangre mM mM mM mM µ?/??? U/ml MPO/GO CFU/ml sobrevivientes Log 0 1.4 1.5 1.5 150 200 13.3 15 11620 3.9 3.4 3 1.4 1.5 1.5 150 200 13.3 15 10290 4.0 3.3 Como se muestra en la Tabla 23, la formulación de prueba de mieloperoxidasa mejorada con aminoácidos se desempeña en forma similar con y sin la presencia de sangre agregada en una exposición durante 5 minutos.

Utilizando el procedimiento anterior, el efecto in vivo de la concentración de glucosa sobre las formulaciones de prueba que contienen concentraciones variadas de L-alanina, L-prolina y glicina se determinó con un inoculo que contenía 2 x 107 CFU de S. aureus, como se muestra en la siguiente Tabla 24 como un promedio de 6 réplicas.

Tabla 24 Viabilidad Log 10 % de Ala Pro Gly Glu MPO GO Relación Promedio (CFU+1) de Reducción sangre mM mM mM mM µ^p?? U/ml de MPO/GO CFU/ml sobrevivientes Log 0% 4 5 5 150 200 13.3 15 1261 2.9 3.4 0% 4 5 5 60 200 13.3 15 3952 3.2 3.0 0% 0.4 0.5 0.5 150 200 13.3 15 4872 3.6 2.7 0% 0.4 0.5 0.5 60 200 13.3 15 1313 3.0 3.2 Como se muestra, las diferencias observadas entre los promedios de desempeño no son estadísticamente diferentes para las condiciones sometidas a prueba.

Siguiendo los procedimientos anteriores, se determinó el efecto in vivo de concentraciones variantes de L-alanina, L-prolina y glicina sobre la actividad microbicida de formulaciones de prueba que contenían mieloperoxidasa en 200 o 400 µg/ml en presencia de 6% de sangre o sin sangre. Los resultados se muestran en la Tabla 25.

Tabla 25 Log 10 relación Inoculo Tiempo Viabilidad Redu(CFU+1) Organismo sangre Pro Gly Glu MPO GO de MPO de de Exp. Promedio cción N de sobrevirespecto Inicio de Org. CFU/ml Log vientes a GO Log mM mM mM ug/ml U/ml min. S min. 5 min. 5 min.

S. aureus 0% 5 5 150 200 13.3 15 6.3 15 4 3373 2.7 3.7 S. aureus 0% 10 10 150 200 13.3 15 6.3 15 8 3053 3.1 3.4 S. aureus 0% 5 5 150 400 26.7 15 6.3 15 4 3390 3.4 2.9 S. aureus 0% 20 20 150 400 26.7 15 6.3 15 8 416 2.4 3.9 S. aureus 6% 5 5 150 200 13.3 15 6.3 15 8 41309 4.0 2.7 S. aureus 6% 10 10 150 200 13.3 15 6.3 15 8 131082 4.5 1.9 S. aureus 6% 5 5 150 400 26.7 15 6.3 15 8 89595 5.0 1.3 S. aumus 6% 20 20 150 400 26.7 15 6.3 15 8 49079 4.6 1.9 Siguiendo los procedimientos anteriores, se determinó el efecto in vivo de concentraciones escalares contra no escalares de L-alanina, L-prolina y glicina sobre la actividad microbicida de formulaciones de prueba que contenían mieloperoxidasa en 200 o. 400 µg/ml. En este contexto, escalar se refiere al cambio proporcional de la concentración de aminoácidos en colaboración con la concentración de MPO. Los resultados se muestran en la Tabla 26.

Tabla 26 Como se muestra en la Tabla 26, la formulación que contenía la concentración total más baja de aminoácidos (L- alanina 4 mM, L-prolina 4 mM y glicina 5 mM) se desempeña mejor en concentraciones de mieloperoxidasa de tanto 200 como Siguiendo los procedimientos anteriores, se determinó el efecto in vivo de formulaciones de prueba que contenían L-prolina, L-lisina y glicina o L-prolina y glicina y se descubrió que eran sumamente efectivas en la inhibición de S. aureus, como se muestra en la Tabla 27.

Tabla 27 Como se muestra en la Tabla 27, las formulaciones de prueba que contenían ya sea L-prolina, L-lisina y glicina, o L-prolina y glicina mejoran el desempeño del sistema antimicrobiano de mieloperoxidasa. Estas dos formulaciones en 200 µg/ml de MPO y una relación de MPO:GO de 15:1 proporcionaron la eliminación completa dentro de 30 minutos. Estas funcionan mejor que las formulaciones que tienen dos veces la MPO y 20 veces la GO en presencia del aditivo que se desempaña mejor, Tritón X-200 al 2%. Véase la Tabla 28 posterior.

Siguiendo los procedimientos anteriores, se determinó el efecto in vivo de una formulación de prueba que contenía el aminoácido individual L-alanina y Tritón X-200 al 2% en una relación de MPO:GO de 1.5:1. Los resultados se muestran en la Tabla 28.

Tabla 28 La formulación que contenía 2% de Tritón X-200 se desempeña de manera comparable con y sin 3% de sangre agregada, pero con el aminoácido individual L-alanina, la formulación de prueba fue significativamente menos efectiva en la inhibición de S. aureus que las formulaciones que contenían dos o más aminoácidos, como se muestra anteriormente. Este resultado se confirma en las Tablas 28 y 29 posteriores.

Siguiendo los procedimientos anteriores, se determinó el efecto in vivo de una formulación de prueba que contenía el aminoácido individual L-alanina, 1% de Tritón X- 200, una relación de MPO:GO de 3:1 y una concentración de glucosa de 90 mM. Los resultados, mostrados como el promedio de 6 réplicas, se muestran en la Tabla 29.

Tabla 29 Siguiendo los procedimientos anteriores, determinó el efecto in vivo de una formulación de prueba que contenía el aminoácido individual L-alanina en una relación de MP0:G0 de 3:1 para las tres concentraciones de MPO. Los resultados, mostrados como el promedio de 4 réplicas, se muestran en la Tabla 30.

Tabla 30 Esta formulación produjo un máximo de una reducción logarítmica de 3.8 en 30 minutos en 400 µg/ml. Sin ningún aditivo, el desempeño de esta formulación de prueba que contenía el aminoácido individual L-alanina se limita claramente en presencia de interferencias biológicas.

El efecto del curso de tiempo in vivo de una formulación de prueba que contenía L-prolina, glicina y L-alanina en una relación de MPO:GO de 15:1 se determinó para las tres concentraciones de MPO. Los resultados de los estudios de tiempo-eliminación se presentan en la FIGURA 4. Los datos se presentan como una reducción log10 en CFU/ml en puntos de tiempo designados. La Solución Mejorada de MPO demostró actividad bactericida contra S. aureus en todas las concentraciones sometidas a prueba. En esta prueba, el inoculo se incrementó a 107 CFU. Los resultados, mostrados como un promedio de 6 réplicas, se muestran en la Tabla 31.

Tabla 31 Viabilidad Promedio Log 10 (CFU+1) de Pro Gly Ala MPO GO relación de CFU/ml Sobrevivientes Reducción Log mM mM mM Hg/ml U/ml MPO/GO 5 15 30 5 15 30 5 15 30 min. min. min. min. min. min. min. min. min. 3.6 3.6 2.8 400 27 15 548 68 12 2.7 1.8 1.1 4.6 5.5 6.2 1.8 1.8 1.4 200 13 15 647 179 91 2.8 2.3 2.0 4.6 5.1 5.4 0.5 0.5 0.4 50 3 15 18286 3713 1284 4.3 3.6 3.1 3.1 3.7 4.2 0 0 0 22100000 7.3 0 0 0 23350000 7.4 0 0 0 20000000 7.3 Como se muestra en la Tabla 31, la formulación mejorada con aminoácidos dio por resultado una reducción logarítmica de 3.1 dentro de 5 minutos utilizando 8 veces menos MPO (50 que la formulación con un aminoácido individual que contenía L-alanina en 400 µ9/p?1 de la Tabla 30. La formulación mejorada con aminoácidos produjo una actividad microbicida más rápida y mayor in vivo.

Ejemplo 11 Datos de Prueba In Vitro para formulaciones de MPO que Contienen Varias Combinaciones de Aminoácidos y Aditivos Cepas bacterianas Los organismos (530 cepas) seleccionados para determinar el espectro de actividad de una modalidad ilustrativa de una composición de la invención que tiene actividad mejorada ("la Solución Mejorada de MPO") para la prueba de MIC y MBC incluyeron 140 estafilococos (de los cuales 70 eran resistentes a oxacilina, 5 intermedios/resistentes a vancomicina, 4 positivos en Leucocidina de Panton Valentine [PVL] ) , 95 cepas de estreptococos ß-hemolíticos , 55 enterococos (33 susceptibles a vancomicina, 22 resistentes a vancomicina) , 148 cepas de Enterobacteriaceae (de las cuales 51 eran resistentes a ceftazidima) y 92 especies diferentes de Enterobacteriaceae (de las cuales 54 eran resistentes a ceftazidima) . Todos los aislados técnicos se obtuvieron de la colección de cultivos de Eurofins Medinet Anti - Infective Services (Herndon, Virginia, E.U.A.) y representan regiones geográficas diversas. Se derivaron originalmente de especímenes clínicos y se identificaron utilizando métodos microbiológicos estándar (véase la Tabla 33 posterior para detalles) . Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Enterococcus faecalis ATCC 29212 se utilizaron como cepas de control de calidad para la Solución Mejorada de MPO y agentes comparadores para validar el método de microdilución de caldo modificado de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formalmente NCCLS) .

Agentes Antimicrobianos La Solución Mejorada de MPO se suministra como dos soluciones acuosas separadas, empacadas en frasquitos diferentes, nombradas Concentrado y Diluyente. El Concentrado contiene p-MPO, glucosa oxidasa (GO) y aminoácidos en un vehículo de formulación acuoso, que consiste de cloruro de sodio, polisorbato-80 (Tween-80MR) en amortiguador de fosfato de sodio en Agua para Inyección. El Diluyente contiene dextrosa (glucosa) en el mismo vehículo de formulación acuoso que el Concentrado. El Concentrado y el Diluyente se mezclan juntos para generar el producto de fármaco, la Solución Mejorada de MPO.

. La composición cuantitativa de la Solución Mejorada de MPO se muestra en la Tabla 32 en tres concentraciones de MPO. Como se puede observar en esta tabla, la actividad de glucosa oxidasa y las concentraciones de aminoácidos son directamente proporcionales a la concentración de MPO. La concentración de dextrosa se mantiene entre 280 y 336 mM. Los ingredientes restantes se mantienen en concentraciones constantes .

Tabla 32 Composición Cuantitativa de la Solución Mejorada de MPO en Tres Concentraciones Nota: La concentración de MPO se expresa como unidades de guayacol (GU) por mL Solución Mejorada de MPO está comprendida po dos soluciones acuosas designadas como solución de Concentrado y solución de Diluyente que se mezclan antes del uso. La solución de Concentrado contiene MPO, GO, cloruro de sodio y agentes que mejoran la actividad antimicrobiana específicos en un vehículo de formulación acuoso. La solución de Diluyente contiene glucosa (dextrosa) en el mismo vehículo de formulación acuoso que la solución de Concentrado. Las soluciones de Concentrado y Diluyente se mezclan juntas en proporciones variantes justo antes del uso para generar el producto de fármaco, la Solución Mejorada de MPO, en una concentración deseada. La concentración de la Solución Mejorada de MPO se expresa como microgramos por MPO por mililitro ^g/ml) y también se expresa como Unidades de Guayacol de actividad de MPO por mililitro (GU/ml) . La conversión de µg a GU de MPO se basa en 0.375 GU^g de MPO. Los agentes de control de calidad incluyeron cefazolina y gentamicina obtenidos de Sigma Chemical (St. Louis, Missouri, E.U.A.) y los comparadores seleccionados que se utilizaron fueron gentamicina (Sigma Chemical) y mupirocina de litio de GlaxoSmithKline, Inc. (Filadelfia, Pensilvania, E.U.A.) . Todas las soluciones madre se prepararon inmediatamente antes de la prueba. Los rangos de concentración fueron de 0.004 a 8 µg/ml para la Solución Mejorada de MPO, de 0.06 a 64 g/ml para cefazolina, de 0.25 a 16 g/ml para gentamicina y de 0.12 a 16 µg/ml para mupirocina. Los agentes antimicrobianos utilizados para los estudios de interacción de fármacos fueron de la siguiente manera: cefazolina, ceftriáxona, ceftazidima, ciprofloxacina, doxiciclina, gentamicina, imipenem y vancomicina de GlaxoSmithKline , Inc. (Filadelfia, Pensilvania, E.U.A.).

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana La microdilución de caldo y los métodos para determinar la actividad bactericida se realizaron utilizando los procedimientos recomendados por CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, "Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents ; Guía Aprobada, documento M26-A de CLSI, CLSI, Wayne, Pensilvania, E.U.A., Septiembre de 1999; Clinical and Laboratory Standards Institute, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Estándar Aprobado, 7a ed, documento M7-A7 de CLSI, CLSI, Wayne, Pensilvania, E.U.A. Enero de 2006) . Se hicieron modificaciones al método de microdilución de caldo estándar para dar cabida a la actividad rápida in vitro de la Solución Mejorada de MPO como se describe a continuación. Cada agente antimicrobiano y solución de Concentrado se diluyó en Caldo de Mueller-Hinton ajustado respecto a los cationes de doble concentración (CAMHB, por siglas en inglés) y se suministró en charolas de microdilución. Todos los estreptococos ß-hemolíticos se sometieron a prueba en CAMHB de doble concentración com lementado con sangre de caballo lisada al 5%. Los aislados se prepararon al suspender varias colonias (de cuatro a seis) de un cultivo durante toda la noche en Agar de Soya con Tripticasa (TSA) con sangre de oveja al 5% en solución salina estéril y la densidad se ajustó a un estándar de McFarland 0.5 (~108 CFU/ml) . Las suspensiones bacterianas estandarizadas se diluyeron adicionalmente en una solución de diluyente de doble concentración de modo que aproximadamente 5 X 105 CFU/ml se mezclaron con diluciones de fármaco en serie. La adicción de solución de Diluyente a la solución de Concentrado activa el sistema de enzimas, el cual a su vez ejerce su modo rápido de acción. Las charolas de microdilución se incubaron en aire ambiental a 35 °C durante 18 a 24 horas. El valor MIC se determinó al observar la concentración más baja de agente antimicrobiano que inhibió completamente el crecimiento del organismo.

Las concentraciones bactericidas mínimas (MBCs, por sus siglas en inglés) se determinaron al realizar primero el método de microdilución de caldo modificado que se describiera anteriormente para el valor MIC de la Solución Mejorada de MPO. De la charola de microdilución, se tomaron muestras del último pocilio que contenía fármaco con crecimiento visible y cada pocilio claro después de eso. Una muestra de 10 µ? por pocilio se colocó en placas sobre TSA con sangre de oveja al 5% y se incubó en aire ambiental durante 24 horas y se examinó por el crecimiento y conteos de colonias . La MBC se determinó como la concentración antimicrobiana más baja que demostró una reducción de >99.9% en unidades formadoras de colonias con relación al tamaño del inoculo de inicio.

Parámetros de control de calidad Los rangos de MIC se establecieron para la Solución Mejorada de MPO al someter a prueba más de 20 réplicas de un lote de la Solución Mejorada de MPO contra S. aureus ATCC 29213 y E. coli ATCC 25922. Los parámetros de control de calidad luego se determinaron para la Solución Mejorada de MPO al someter a prueba tres lotes de la solución de Concentrado utilizada para la preparación de la formulación final de Solución Mejorada de MPO. La prueba se realizó en duplicado contra S. aureus ATCC 29213 y E. coli ATCC 25922. Los efectos de la modificación de la prueba de microdilucion de caldo estándar también se valoraron con antibióticos con límite de control de calidad conocidos para validar el método de microdilucion de caldo de CLSI.

Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 33, donde la formulación de la Solución Mejorada de MPO se designa como "E-MPO" .

TABLA 33 Actividad In Vitro de la Solución Mejorada de MPO y Otros Agentes Antimicrobianos Conparadores Contra un Panel de Aislados Clínicos que Consistían de 530 Enterococos, Estafilococos, Estreptococos, Enterobacteriaceae y Especies Diferentes de Enterobacteriaceae MIC µg/ml Organismo (no. de aislados sometidos a prueba) Compuesto 50% 90% Rango8 Entemcoccus faecalis(33) E-MPO 0.5 0.5 0.12-0.5 Mupirocina 32 >32 8->32 Ente coccus faecium(22) E-MPO 0.12 0.12 0.06-0.12 Mupirocina 0.25 0.25 0.06-0.5 Staphylococcus aureus(109) E-MPO 0.015 0.03 0.008-0.06 Mupirocina 0.06 0.12 =0.03->32 Staphylococcus epidermidis(31) E-MPO 0.03 0.03 0.015-0.06 Mupirocina 0.12 >32 <0.03->32 Streptococcus agalactiae(34) E-MPO 0.5 0.5 0.12-1 Mupirocina 0.5 0.5 0.12-2 Grupo C de'Streptococcus (8) E-MPO n/ab n/a 0.5-1 " Mupirocina n/a n/a 0.06-0.5 Grupo F de Streptococcus (2) E-MPO n/a n/a 1-1 Mupirocina , n/a n/a 0.25-0.25 Grupo G de Streptococcus (18) E-MPO 0.5 0.5 0.25-1 Mupirocina 0.12 0.12 0.06-0.5 Streptococcus pyogenes(33) E-MPO 0.5 0.5 0.12-0.5 MIC µ9/?t?? Organismo (no. de aislados sometidos a prueba) Compuesto 50% 90% Rango8 Mupirocina 0.12 0.25 0.06-0.5 Citrobacter freundii(20) E-MPO 0.6 0.12 0.03-0.12 Gentamicina 2 4 2->32 Enterobacter cloacae(21) E-MPO 0.12 0.12 0.06-0.12 Gentamicina 2 8 1->32 Escheríchia coli(52) E-MPO 0.25 0.25 0.12-0.5 Gentamicina 4 >32 2->32 Klebsiella pneumoniae(31) E-MPO 0.25 0.25 0.06-0.25 Gentamicina 4. >32 2->32 Proteus mirabilis(24) E-MPO 0.06 0.06 0.03-0.06 Gentamicina 8 8 2->32 Acintobacter spp.(29) E-MPO 0.12 0.12 0.06-0.12 Gentamicina 8 >32 0.5->32 Pseudomonas aemginosa(53) E-MPO . 0.06 0.06 0.03-0.12 Gentamicina 4 16 1 ->32 Aeromonas hydroph¡lia(5) E-MPO n/a n/a 0.015-0.03 Gentamicina n/a n/a 1 -4 Pasteurella multocida(5) E-MPO n/a n/a =0.004 Gentamicina n/a n/a 2-16 aRango de valores MIC para todas las cepas sometidas a prueba bn/a, no aplicable, número total de aislados menor que 10 La modificación del método de microdilución de caldo de CLSI para someter a prueba la Solución Mejorada de MPO proporciona un procedimiento eficiente para la caracterización del producto y la determinación del espectro de actividad. Los resultados de la prueba de la Solución Mejorada de MPO y fármacos comparadores, tópicos, seleccionados contra 530 aislados clínicos bacterianos mostrados en la Tabla 33 demuestran que la Solución Mejorada de MPO exhibe una potente actividad de amplio espectro contra las especies tanto Gram-positivas como Gram-negativas sometidas a prueba. Entre los enterococos, los valores MICs de la Solución Mejorada de MPO en los cuales 50% y 90% de los aislados se inhibieron (valores MIC50 y MIC9o) fueron 0.5 µ9/p?1 para E. faecalis y 0.12 µ%/t?1 para E. faecium. No se observó diferencia en la actividad de la Solución Mejorada de . .

MPO contra enterococos susceptibles a la vancomicma o resistentes a la vancomicina (VRE) . Con base en los valores MIC90S/ la Solución Mejorada de MPO fue >64 veces más activa contra E. faecalis que la mupirocina. Entre los cocos Gram-positivos, la Solución Mejorada de MPO fue más activa contra los estafilococos. Todos los valores MICs para 5. aureus y S. epidermidis , incluyendo MRSA y MRSE, fueron <0.06 µ?/???, con un valor MIC90 de 0.0 µ /p?1. La potencia de la Solución Mejorada de MPO fue comparable para las cepas tanto resistentes a la oxacilina como susceptibles a la oxacilina.

La Solución Mejorada de MPO fue sumamente activa contra las cepas positivas en PVL y VISA/VRSA demostrando una actividad equivalente en comparación con los tipos silvestres. Los valores MIC para los aislados positivos en PVL estuvieron dentro del rango de todas las cepas de S. aureus sometidas a prueba. Entre los estreptococos, la Solución Mejorada de MPO fue sumamente activa aún en presencia de CAMHB complementado con sangre de caballo lisada al 5%. Los valores MIC90 para S. agalactiae y S. pyogenes fueron ambos 0.5 µg/ml . Para los grupos de estreptococos, C, F y G, los valores MICs fueron < 1 µg/ml con un rango de MIC de 0.25 a 1 µg/ml. Con la excepción de S. agalactiae y S. pyogenes, la Solución Mejorada de MPO demostró una mayor potencia in vitro que la mupirocina por un valor MIC90. Los rangos de MIC para la mupirocina contra E. faecalís, S. aureus y S. epidermidis se extendieron a >32 µg/ml .

En conjunto, la Solución Mejorada de MPO fue sumamente activa contra la especie Enterobacteriaceae (Tabla 33) con un valor MIC90 de 0.25 µg/ml y un rango de MIC de 0.03 a 0.25 µg/ml . Entre los organismos no fermentables Gram-negativos, los valores MICs fueron <0.12 µg/ml y exhibieron un rango reducido de actividad (de <0.004 a 0.12 µg/ml) . La Solución Mejorada de MPO exhibió una excelente actividad contra P. aeruginosa (MIC90, 0.06 µg/ml) y la especie Acinetobacter (MIC90, 0.12 µg/ml) , las cuales son frecuentemente organismos difíciles de tratar. No se observó diferencia en la actividad de la Solución Mejorada de MPO contra cepas susceptibles a ceftazidima y resistentes a ceftazidima. Con base en el valor MIC90, la Solución Mejorada de MPO fue de 32 a >256 veces más activa que la gentamicina para todos los organismos Gram-negativos sometidos a prueba.

Los resultados de la prueba de MIC y MBC de aislados clínicos de agentes patógenos asociados comúnmente con infecciones de la piel y la estructura de la piel se resumen en la Tabla 34.

Tabla 34 Concentraciones Inhibitorias y Bactericidas Mínimas de la Solución Mejorada de MFO Contra Aislados Clínicos Asociados con Infecciones de la Piel y la Estructura de la Piel MIC g/mla MBC µ9 p?? Aislado (no. sometido a prueba) MICso MICoo Rango8 MBCso MBCso Rango E. faecalis (7) n/ab n/a 0.12-0.5 n/a n/a 0.5-2 S. aureus (16) · 0.015 0.03 0.015-0.03 0.015 0.03 0.015-0.03 S. agalactiae (13) 0.5 0.5 0.12-0.5 0.5 0.5 0.12-1 S. pyogenes (20) 0.5 0.5 0.12-0.5 0.5 1 0.12-1 E. coli (5) n/a n/a 0.12-0.25 n/a n/a 0.12-1 P. aeruginosa (5) n/a n/a 0.03-0.06 n/a n/a 0.06-0.5 aRango de valores MIC para todas las cepas sometidas a prueba bn/a, no aplicable, número total de aislados menor que 10 La actividad bactericida potente de la Solución Mejorada de MPO se confirmó por el rango de MBCs (0.015 a 2 µ9/p?1) . La Solución Mejorada» de MPO fue más activa contra todos los aislados de S. aureus con valores MIC y MBC idénticos (MIC50 y MBC50 = 0.015 µg/ml; MIC90 y MBC90 = 0.03 µ?/p??) .

Los métodos a base de agar no fueron aplicables para la comparación debido a las propiedades de interferencia potenciales del medio. Sin embargo, el efecto del cambio de las condiciones estandarizadas de la prueba de susceptibilidad del caldo sobre los valores MICs de cefazolina, gentamicina y mupirocina se valoró y validó por medio de la comparación de los resultados con aquel del método de microdilución de caldo de referencia de CLSI . Los parámetros de prueba in vi tro de los métodos de MIC tanto modificados como de referencia fueron similares con respecto a los medios (CAMHB) , pH (7.2) , inoculo final (5 X 10s CFU/ml) y ambiente de incubación (35°C, aire ambiental) . El cambio a una preparación de inoculo en solución de Diluyente no mostró un efecto significativo sobre los resultados de MIC esperados para los antibióticos comparadores (Clinical Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,- seventeenth informational supplement. documento M100-S17 de CLSI . ayne, Pensilvania, E.U.A., Enero de 2007). Los valores MICs de cefazolina y mupirocina para S. aureus ATCC 29213 y los valores MICs de cefazolina y gentamicina para E. coli ATCC 25922 estuvieron dentro de los rangos de control de calidad publicados previamente (documento M100-S17 de CLSI, supra) . El rango de control de calidad determinado para la Solución Mejorada de MPO para S. aureus ATCC 29212 y E. coli ATCC 25922 fue de 0.010 a 0.03 µg/ml y de 0.15 a 0.5 µg/ml , respectivamente. Se realizaron más de 20 réplicas con estos organismos y todos los resultados estuvieron dentro del rango de control de calidad establecido. Los resultados de la prueba de tres lotes de solución de Concentrado por duplicado demostraron que todos los valores MIC estaban dentro del rango de control de calidad establecido.

Como se mostró anteriormente, la actividad comparativa in vitro para la Solución Mejorada de MPO fue equivalente a o mayor que aquella de la mupirocina contra organismos Gram-positivos y fue varias veces mayor que aquella de la gentamicina para organismos Gram-negativos . No se observaron diferencias en la susceptibilidad a la Solución Mejorada de MPO entre las cepas resistentes y susceptibles estudiadas. Es de importancia que los estudios de MBC mostraron que la Solución Mejorada de MPO exhibe actividad bactericida contra S. aureus y S. pyogen.es, dos de los agentes patógenos más comunes que están asociados con infecciones serias de la piel.

Estudios de tiempo-eliminación El efecto bactericida de la Solución Mejorada de MPO se valoró por medio de dos métodos : un método de suspensión-neutralización (Tortorano, A.M. y colaboradores and the EBGA Network 2005. In vitro testing of fungicidal activity of biocides against Aspergillus fumigatus . J. Med. Microbiol . 54:955-957) y por medio de una adaptación del ensayo de tiempo-eliminación de microdilución de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; guía aprobada; documento M26-A de- CLSI, CLSI, Wayne, Pensilvania, E.U.A., Septiembre de 1999). El método de suspensión-neutralización se utilizó para valorar la tasa rápida de actividad bactericida de la Solución Mejorada de MPO y el efecto sobre su actividad biológica por la sangre como un ejemplo de material interférente . El método de CLSI también se utilizó para valorar la actividad microbicida de la Solución Mejorada de MPO por medio de una adaptación de una prueba estandarizada.

Los organismos de prueba utilizados para los estudios de tiempo-eliminación de suspensión-neutralización fueron S. aureus ATCC 6538 y E. coli ATCC 25922. Las suspensiones bacterianas se prepararon por medio del método de matraz de agitación para lograr un crecimiento de fase logarítmica tardía a estacionaria precoz. Un volumen de cultivo de 1.0 mi se aglomeró y se resuspendió en solución salina estéril a ~109 CFU/ml . El ensayo in vitro se condujo en frasquitos de centelleo de vidrio de 20 mi estériles. Los frasquitos de reacción de tiempo-eliminación se prepararon para contener 1.0 mi de la cantidad apropiada de solución de Diluyente más 15 mi de inoculo seguido por la adición de solución de Concentrado. La suspensión final contenía -107 CFU/ml y los conteos de colonias reales se confirmaron por medio de diluciones en serie. Concentraciones bajas de la Solución Mejorada de MPO, más suspensión de organismos, en una concentración final de 0.1, 0.3, 1, 3, 6 y 9 g/ml se sometieron a prueba (véase las FIGURAS 1A y IB) . Los frasquitos de tratamiento se incubaron a temperatura ambiente. La reacción enzimática luego se detuvo inmediatamente antes de la cuantificación bacteriana por medio de la adición de 100 µ? de una solución estéril al 1% de catalasa en 1, 2, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos. Un cultivo de control sin solución de Concentrado agregada se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se realizaron cultivos cuantitativos. Una muestra de 100 µ? se retiró de cada frasquito de reacción en cada punto de tiempo especificado y las diluciones en serie se prepararon en solución salina estéril. Un volumen de 100 µ? de cada dilución se aplicó para duplicar el TSA con placas de sangre de cordero al 5% y se extendió sobre la superficie con un bucle inoculante estéril. Después de la incubación durante toda la noche a 35 °C, las colonias se contaron y los conteos viables se calcularon. El efecto bactericida de la Solución Mejorada de MPO se definió como una reducción de conteos viables con relación al control de crecimiento mayor que 99.9% o 3 logio CFU/ml .

A fin de valorar el potencial del material interférente sobre la actividad de la Solución Mejorada de MPO, los estudios de tiempo-eliminación se realizaron en presencia de sangre entera de humano y rata, recolectada recientemente en tubos heparinizados en el día del experimento, utilizando el método de suspensión-neutralización descrito previamente. La Solución Mejorada de MPO en 50, 100 y 200 µg/ml se sometió a prueba contra un inoculo de ~107 CFU/ml de S. aureus ATCC 6538 y P. aeruginosa ATCC 27317 en presencia de sangre humana al 3% y la actividad bactericida se detuvo en 5, 15, 30 y 60 minutos (véase las FIGURAS 2A y 2B) . La Solución Mejorada de MPO en 400, 800 y 1,600 g/ml también se sometió a prueba contra un inoculo de ~107 CFU/ml de S. aureus ATCC 6538 en presencia de sangre de rata al 6, 12 y 24% y la actividad microbicida se detuvo en 2, 5 y 15 minutos, como se describiera anteriormente. Dos o 3 réplicas se obtuvieron para cada condición de prueba.

Los organismos de prueba utilizados para los estudios de tiempo-eliminación por medio del método de CLSI modificado incluy r-e-n—S-.- aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853. Varias colonias (de cuatro a seis) , desarrolladas en TSA con sangre de oveja al 5% durante toda la noche, se suspendieron en 3 mi de agua desionizada y las suspensiones se ajustaron a un estándar de cFarland 0.5 (~1 X 108 CFU/ml) . Esta suspensión luego se diluyó 1:10 en CAMHB pre-calentado y se incubó 1-4 horas en una incubadora vibradora a 37 °C. Cuando el cultivo alcanzó su fase de crecimiento logarítmica y la turbidez se aproximó a aquella de un estándar de McFarland 0.5, 100 µ? se retiraron y se agregaron a 10 mi de solución de Diluyente para lograr una concentración resultante de ~5 X 106 CFU/ml. Esta suspensión constituyó el inoculo para los estudios de tiempo-eliminación. Los pocilios de reacción de tiempo-eliminación se prepararon para contener 100 µ? de solución de Concentrado preparada en CAMHB e inoculo (50 µ? de solución de Concentrado y 50 µ? de inoculo preparado en solución de Diluyente) . Las concentraciones finales de MPO en la solución de Concentrado fueron cuatro veces las diluciones de la concentración más alta --0, 0.06, 0.25, 1, 4, 16, 64 y 256 µg/ml. Un pocilio de reacción idéntico que contenía caldo e inoculo pero no la solución de Concentrado constituyó el control de crecimiento de cultivo. La concentración final de células bacterianas fue -5 x 105 CFU/ml. Las charolas de microdilución se incubaron a 35 °C en aire ambiental y 10 µ? de una solución de catalasa al 1% se agregaron a cada pocilio de tiempo-eliminación en 0 , 2, 5, 15, 30 y 60 minutos y 4 y 24 horas para detener la acción antimicrobiana de la Solución Mejorada de MPO. Las muestras en serie se obtuvieron para la cuantificación. Una muestra de 100 µ? se retiró de cada pocilio en cada punto de tiempo y las diluciones en serie se prepararon en solución salina estéril. Un volumen de 100 µ? de cada dilución se aplicó para duplicar el TSA con placas de sangre de oveja al 5% y se extendió sobre la superficie con un bucle inoculante estéril . Las placas en el tiempo cero funcionaron como las placas de pureza. Después de la incubación durante toda la noche a 35°C, las colonias se contaron manualmente y los conteos viables se calcularon. La actividad bactericida se definió como una reducción del 99.9% o 3 logio CFU/ml en el conteo de colonias del inoculo inicial.

Los resultados de los estudios de tiempo-eliminación por medio del método de suspensión-neutralización se presentan en la FIGURA 1. Los datos se presentan como reducción de logio en CFU con relación al inoculo inicial en puntos de tiempo predeterminados para concentraciones escalares de la Solución Mejorada de MPO sometida a prueba. La Solución Mejorada de MPO demostró una actividad bactericida muy rápida contra tanto S. aureus como E. coli.

La tasa de eliminación fue mayor en las concentraciones más altas de la Solución Mejorada de MPO y el grado de eliminación incrementó con el tiempo de exposición más prolongado. Para S. aureus, la Solución Mejorada de MPO fue bactericida produciendo una reducción mayor que 3 logi0 en el inoculo inicial (7.2 logio CFU/ml) después de 2 minutos de exposición en 6 y 9 g/ml . No se observó crecimiento detectable dentro de 5 minutos de la exposición a 3, 6 y 9 µg/ml y en 1 g/ml, se logró una reducción mayor que 3 logio dentro de. 5 minutos sin crecimiento detectable en 15 minutos de exposición. No se observó un crecimiento detectable después de 30 y 120 minutos de exposición a la Solución Mejorada de MPO en 0.3 y 0.1 g/ml, respectivamente. La Solución Mejorada de MPO demostró un patrón similar de tiempo-eliminación para E. coli. No se observó un crecimiento detectable dentro de 2 minutos de exposición a las concentraciones de la Solución Mejorada de MPO mayores que o iguales a 3 µg/ml. Después de 2 minutos de exposición a la Solución Mejorada de MPO en 1 µg/ml , se logró una reducción mayor que 3 logi0 en el inoculo inicial (6.8 logio CFU/ml). No se observó un crecimiento detectable en 1.0 g/ml dentro de 5 minutos de tratamiento. En las concentraciones más bajas de la Solución Mejorada de MPO, 0.3 y 0.1 µg/ml , no se observó un crecimiento detectable después de 15 y 60 minutos de exposición, respectivamente.

La dependencia del tiempo y la concentración de la actividad microbicida de la Solución Mejorada de MPO aún estaba presente en presencia de sangre entera de humano o rata al 3%. No se observaron diferencias significativas entre ninguna fuente de sangre. La Solución Mejorada de MPO en 200 µg/ml, la concentración más alta de MPO sometida a prueba en presencia de sangre humana al 3%, no produjo sobrevivientes detectables de S. aureus y P. aeruginosa en un inoculo inicial de 7.15 logi0 CFU/ml en menos de 5 minutos. La Solución Mejorada de MPO en una concentración de 100 µg/ml, logró una reducción mayor que 4 logio y una reducción de 5 logio dentro de 5 minutos para P. aeruginosa y S. aureus, respectivamente. En 50 g/ml, la concentración más baja de la Solución Mejorada de MPO sometida a prueba, la actividad bactericida se observó en todos los puntos de tiempo para ambos organismos (FIGURA 2) .

El efecto de interferencia de la sangre sobre la actividad antimicrobiana de la Solución Mejorada de MPO se mejoró al incrementar la concentración de MPO. En las concentraciones de la Solución Mejorada de MPO de 400 y 800 µg/ml, se logró una reducción de 7.10 logio CFU/ml de S. aureus sin crecimiento detectable dentro de 2 minutos en presencia de sangre de rata al 6 y 12%. En presencia de sangre de rata a 24%, la Solución Mejorada de MPO produjo una reducción mayor que 4 logio en 400 y 800 µg/ml y no produjo sobrevivientes detectables en 1,600 |lg/ml dentro de 2 minutos .

Los resultados de los estudios de tiempo-eliminación por medio del método de microdilución de caldo de CLSI modificado se presentan en las FIGURAS 3A-3D. Los datos se presentan como reducción de logio en CFU/ml en puntos de tiempo designados. La Solución Mejorada de MPO demostró actividad bactericida contra S. aureus en todas las concentraciones sometidas a prueba. Contra E. coli, la Solución Mejorada de MPO fue bactericida en todas las concentraciones sometidas a prueba excepto 0.06 µg/ml, la cual es 4 veces inferior a su MIC. Del mismo modo para E. faecalis y P. aeruginosa, la Solución Mejorada de MPO fue bactericida cuando se sometió a prueba en concentraciones superiores al valor MIC. Los valores MICs para E. faecalis y P. aeruginosa fueron 0.5 y 0.06 µg/ml , respectivamente. Los patrones comparables de actividad microbicida se observaron con los cuatro organismos; la tasa de eliminación fue mayor en concentraciones más altas de la Solución Mejorada de MPO y el grado de eliminación incremento con un tiempo de exposición más prolongado. En las concentraciones de la Solución Mejorada de MPO de 256 y 16 µg/ml , no se observó crecimiento detectable para todos los organismos dentro de 30 minutos y 4 horas, respectivamente. Después de 4 horas de exposición a la Solución Mejorada de MPO, una reducción mayor que 3 logio se logró en 16 µ9/p?1 para E. faecalis, en 4.0 µ /G?1 para S. aureus y en 1.0 g/ml para E. coli y P. aeruginosa . La actividad microbicida más rápida que se observó utilizando el método de suspensión-neutralización puede ser atribuida a un efecto de los medios utilizados en el método de microdilucion de caldo de CLSI .

Los estudios de tiempo-eliminación realizados por medio del método de suspensión-neutralización demostraron la tasa y el grado de actividad bactericida de la Solución Mejorada de MPO. Dependiendo de la concentración, la actividad de eliminación fue rápida dando por resultado la reducción de 6 a 7 loglO CFU/ml de ya sea S. aureus o E. coli dentro de un minuto. La actividad bactericida rápida en conjunción con los estudios de quimioluminiscencia que muestran la producción de oxígeno singulete (datos no mostrados) soportan el modo propuesto de acción en el cual el oxígeno singulete es el agente de eliminación principal. El carácter sumamente electrófilo del oxígeno singulete hace posible que oxide regiones de alta densidad de electrones en moléculas biológicas objetivo dando por resultado la destrucción de la integridad de la membrana y/o la inhibición oxidante de las enzimas requeridas para la función metabólica. A diferencia de los antibióticos tradicionales, la Solución Mejorada de MPO no parece depender del metabolismo celular del microorganismo para la inhibición del crecimiento de las células o la muerte de las células.

Puesto que no existe alguna metodología estandarizada para la prueba de tiempo-eliminación de la Solución Mejorada de MPO, los métodos tanto de suspensión-neutralización como de microdilución de caldo de CLSI se utilizaron para confirmar que sin importar el organismo sometido a prueba la actividad microbicida de la Solución Mejorada de MPO es dependiente del tiempo y la concentración. Los estudios de tiempo-eliminación por medio del método de suspensión-neutralización contra miembros o el género Candida, Aspergillus, Bacillus y Mycobacterium con formulaciones prototipo también demostraron una actividad microbicida dependiente del tiempo y la concentración, sin sobrevivientes detectables observados a través del tiempo.

Interacciones Antimicrobianas Tres cepas clínicas resistentes a múltiples fármacos se utilizaron para someter a prueba la Solución Mejorada de MPO y combinaciones antibióticas por medio de un método de titulación de damero utilizando charolas de microdilución de 96 pocilios (Moody, J. , "Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods" , páginas 5.12.1-5.12.23, en H.D. Isenberg (ed.), Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2a ed. , 2004, ASM Press, Washington, DC, E.U.A.). Los organismos de prueba incluyeron la cepa Mu50 de S. aureus de resistencia intermedia a la vancomicina (aislado NRS1 de NARSA) (Hiramatsu, K.H. y colaboradores "Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Clinical Strain With Reduced Vancomycin Susceptibility" , J. Antimicrob. Chemother. 40:135-136, 1997), E. coli (Eurofins 1075701) y P. aeruginosa (Eurofins 1445536) . La solución de concentrado y los antibióticos seleccionados se sometieron a prueba por medio del método de microdilución de caldo con CAMHB y se diluyeron en serie (dos veces) solos y en combinación. Cada pocilio en el damero contenía una combinación única de dos concentraciones de fármaco y dos hileras contenían un solo fármaco. Los rangos de concentración de los fármacos para la Solución Mejorada de MPO fueron de 0.0005 a 0.5 de 0.008 a 8 µ9/p?1 contra E. coli y contra P. aeruginosa . Los rangos de concentración de los antibióticos fueron de un cuarto o menos a dos veces sus valores MIC respectivos contra el aislado sometido a prueba. El inoculo se preparó en solución de diluyente como se describiera anteriormente, se agregó a cada pocilio de las charolas de microdilución y se incubó en aire ambiental a 35 °C. El valor MIC para cada agente antimicrobiano solo y en combinación se determinó que era la(s) concentración (es) más baja(s) sin crecimiento visiblemente detectable después de 18 a 24 horas. Los índices de concentración inhibitoria fraccionaria (FICI) se interpretaron de la siguiente manera: <0.5, sinergia; >0.5 a 4.0, sin interacción; y >4.0, antagonismo (Odds, F.C., "Synergy, Antagonism, and What the Chequerboard Puts Between Them", J. Antimicrob. Chemother. 52:1, 2003) .

En los estudios de desarrollo de resistencia por medio del método de microdilucion de caldo, los resultados de MIC para S. aureus, E. faecalis y P. aeruginosa permanecieron sin cambios después del paso en concentraciones sub-inhibitorias de la Solución Mejorada de MPO durante 21 días. Los valores MICs para tres cepas clínicas de E. coli mostraron un incremento de >4 diluciones dobles después de solo un paso del día 1 al día 2 y los valores MICs permanecieron elevados durante 21 días. El cambio en los valores MICs durante el intervalo de estudio fue de 0.12 a 8 µg/ml, de 0.25 a 8 µg/ml y de 0.5 a 8 µg/ml para cada cepa respectiva. Después de tres pasadas de cada una de estas cepas en las placas de agar libre de fármaco, los valores MICs con la reexaminación no fueron estables y disminuyeron nuevamente a <2 diluciones dobles del valor MIC de línea de referencia inicial .

Desarrollo de resistencia Las tasas mutacionales de múltiples pasos se determinaron por medio de dos métodos in vitro. Las cepas pasadas diariamente en concentraciones sub- inhibitorias de una formulación prototipo se sometieron a prueba por medio del método de suspensión-neutralización (Millichap, J. y colaboradores, "Selection of Enterococcus faecium Strains With Stable and Unstable Resistance to the Streptogramin RP 59500 Using Stepwise In Vitro Exposure" , Diagn. Microbiol . Infect. Dis. 25:15-20, 1996; Tortorano, A. M. y colaboradores, "In Vitro Testing of Fungicidal Activity of Biocides Against Aspergillus fumigatus" , J. Med. Microbiol. 54:955-957, 2005) y la Solución Mejorada de MPO se sometió a prueba en paneles de microdilucion de caldo (Silverman, J. A. y colaboradores, "Resistance Studies With Daptomycin" , Antimicrob. Agents Chemother. 45 :1799-1802 , 2001) . Tres cepas de prueba utilizadas por medio del método de suspensión-neutralización incluyeron S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 15442 y una cepa clínica de E. faecium, resistente a la vancomicina. Las suspensiones de organismos se prepararon como se describiera previamente hasta una concentración objetivo final de 107 CFU/ml . Para el tratamiento inicial, un volumen de 1.0 mi de la Solución Mejorada de MPO, en 0.1 o 0.3 µg/ml, más una suspensión de organismos se agregaron a cada frasquito de tratamiento. Los frasquitos se incubaron a 37°C en un baño seco. Después de 60 minutos, 100 µ? de catalasa entonces se agregó a cada frasquito para detener la reacción y los contenidos completos de cada, frasquito se cultivaron en medios de aislamiento. En un intento por inducir una resistencia estable, los sobrevivientes de la placa de aislamiento tratada con la Solución Mejorada de MPO más alta después de 48 horas de incubación se utilizaron para preparar el inoculo para la siguiente pasada. Cada experimento secuencial se realizó en la concentración previa más alta de la Solución Mejorada de MPO que soportaba el crecimiento y en aproximadamente dos veces esa concentración. Las pasadas se continuaron durante 25 a 30 días consecutivos utilizando las tres cepas.

Para determinar si la exposición repetida de los organismos a concentraciones sub- inhibitorias de la Solución Mejorada de MPO dio por resultado el desarrollo rápido de resistencia, se utilizó un método de pasada en serie en charolas de microdilución (Silverman, J. A. y colaboradores "Resistance Studies With Daptomycin" , Antimicrob. Agents Chemother. 45:1799-1802, 2001). Diez cepas de prueba incluyeron S. aureus (ATCC 29213, Eurofins 1288199) , E. faecalis (ATCC 29212, ATCC 51299), E. coli (ATCC 25922, Eurofins 1075701, Eurofins 1337451, Eurofins 1337019) y P. aeruginosa (ATCC 27853, Eurofins 1077561) . Los valores MICs de línea de referencia para la Solución Mejorada de MPO se determinaron como se describiera anteriormente. Los inóculos para las pruebas de MIC subsecuentes se prepararon a partir del pocilio que contenía la concentración más alta de la Solución Mejorada de MPO que permitió el crecimiento. Un panel nuevo que contenía solución de Concentrado diluida en serie en CAMHB se inoculó de nuevo con la nueva suspensión preparada en solución de Diluyente. Las pasadas se continuaron durante 21 días consecutivos y los valores MICs de la Solución Mejorada de MPO se determinaron después de cada pasada en serie. Subsecuentemente, si los valores MICs mostraron un incremento, los estudios de estabilidad se realizaron por medio de tres pasadas en serie en placas de agar libre de fármaco (TSA) durante las cuales los valores MICs se determinaron nuevamente.

En los estudios de desarrollo de resistencia por medio del método de microdilucion de caldo, los resultados de MIC para S. aureus, E. faecalis y P. aeruginosa permanecieron sin cambios después de la pasada en concentraciones sub-inhibitorias de la Solución Mejorada de MPO durante 21 días. Los valores MICs para tres cepas clínicas de E. coli mostraron un incremento de >4 diluciones dobles después de solo una pasada del día 1 al día 2 y los valores MICs permanecieron elevados durante 21 días. El cambio en los valores MICs durante el intervalo de estudio fue de 0.12 a 8 µg/ l, de 0.25 a 8 ?/p?? y de 0.5 a 8 9/t?1 para cada cepa respectiva. Después de tres pasadas de cada una de estas cepas en las placas de agar libre de fármaco, los valores MICs con la reexaminación no fueron estables y disminuyeron nuevamente a <2 diluciones dobles del valor MIC de línea de referencia inicial.

Los estudios de desarrollo-de resistencia mostraron que la Solución Mejorada de MPO y una formulación prototipo similar no se seleccionan por resistencia en S. aureus, especies Enterococus, P. aeruginosa y E. coli. Aunque tres cepas clínicas de E. coli demostraron valores MICs elevados cuando se expusieron a la Solución Mejorada de MPO, el incremento en los valores MICs no fue estable y se perdió con la pasada subsecuente sobre medios libres de antibióticos. Estos descubrimientos, junto con la tasa rápida de eliminación y el modo de acción de la Solución Mejorada de MPO, sugieren que la exposición al producto de fármaco tiene un potencial muy bajo para el desarrollo de resistencia.

Los estudios de interacción de fármacos demostraron la ausencia de antagonismo sobre la actividad de los antibióticos convencionales sometidos a prueba. Esto es importante para aplicaciones en las cuales la Solución Mejorada de MPO se puede utilizar en conjunción con terapias tradicionales con antibióticos. La Solución Mejorada de MPO también ejerce su actividad microbicida potente en presencia de sangre entera, un atributo requerido en el tratamiento de heridas quirúrgicas y traumáticas.

Como se muestra anteriormente, las composiciones mejoradas de mieloperoxidasa de la invención proporcionan una actividad bactericida potente, de espectro amplio y rápida contra organismos clínicos y de referencia que incluyen cepas susceptibles a fármacos, resistentes a fármacos y resistentes a múltiples fármacos. Su baja propensión a seleccionar resistencia y falta de interacción de fármaco- fármaco hace que las composiciones mejoradas de la invención sean ideales para el uso anti-infeccioso local/tópico para el tratamiento y prevención de infecciones en una amplia variedad de aplicaciones in vivo.

Ejemplo 12 Prueba Jn Vivo de Formulaciones Mejoradas de MPO A fin de evaluar la Solución Mejorada de MPO del Ejemplo 11 en un entorno in vivo, se emplearon tres distintos modelos de heridas. Estos modelos incluyeron una herida de escisión de espesor completo, una herida de espesor parcial y una herida" de incisión profunda en el muslo.

Agente Antibacteriano La Solución Mejorada de MPO está comprendida por dos soluciones acuosas designadas como solución de Concentrado y solución de Diluyente que se mezclan antes del uso. La solución de Concentrado contiene MPO, GO, cloruro de sodio y agentes específicos que mejoran la actividad antimicrobiana en un vehículo de formulación acuoso. La solución de Diluyente contiene glucosa (dextrosa) en el mismo vehículo de formulación acuoso que la solución de Concentrado. Las soluciones de Concentrado y de Diluyente se mezclan juntas en proporciones variantes antes del uso para generar el producto de fármaco Solución Mejorada de MPO en una concentración deseada. La concentración de la Solución Mejorada de MPO se expresa como Unidades de Guayacol de MPO por mililitro (GU/ml) y también se expresa como microgramos de MPO por mililitro. La conversión de GU a µg de MPO se basa en 0.375 GU/fig de MPO.

Cepas Bacterianas La cepa 136MR de Staphylococcus aureus, una cepa clínica de MRSA, S. aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27317 se obtuvieron de Ricerca LLC, (Concord, Ohio, E.U.A.) o the American Type Culture Collection.

Modelos de Heridas en Animales Experimentales Las ratas macho, adultas Sprague-Dawley (aproximadamente ,250 gramos) obtenidas de Charles River Laboratories, Portage, Michigan, E.U.A. , se utilizaron en cada modelo de heridas. Los animales se alojaron en jaulas individuales y se les proporcionó alimento y agua ad libitum durante todo el estudio. Para todos lo modelos de heridas, se prepararon dos sitios de heridas en cada rata. Antes de provocar las heridas, el cabello del sitio relevante se afeitó con esquiladoras eléctricas. Los animales se anestesiaron utilizando isoflurano (1-5% en 02 por vía de una máscara facial) . La buprenorfina (de 0.05 a 0.25 mg/kg IP) se administró para el dolor posoperativo cada 12 horas cuando los animales no se mantuvieron bajo anestesia por la duración del estudio (más de 5 horas) . Todos los procedimientos en animales experimentales se realizaron de acuerdo con las guías de the Institutional Animal Care y Use Committees en Ricerca LLC. (i) Modelo de herida de escisión de espesor completo Las heridas experimentales se indujeron por medio de una modificación del método reportado por Saymen, G.D. y colaboradores, "Infected Surface ound: An Experimental Model and a Method for the Quantitation of Bacteria in Infected Tissues", Applied Microbiology 23 (3 ): 509-514 , 1972. La cepa 136 R de S. aureus resistente a meticilina, S. aureus ATCC 6538 o E. coli ATCC 25922 se utilizaron como organismos de desafío. Los organismos se prepararon como una suspensión de crecimiento logarítmico tardío desarrollada en Caldo de Soya con Tripticasa. Las células se recolectaron de un matraz oscilante, se centrifugaron y se resuspendieron en solución salina amortiguada para producir una suspensión de 9 loglO CFU/ml . Esta solución madre se diluyó subsecuentemente en amortiguador para proporcionar una suspensión de trabajo de aproximadamente 7.5 loglO CFU/ml y se utilizó como el inoculo. Dos heridas en la piel se crearon en cada rata al levantar la piel holgada y extirpar un área elíptica de piel con tijeras utilizando una técnica estéril y exponiendo aproximadamente 1 a 2 cm2 de aponeurosis. Tres ratas con dos heridas cada una se utilizaron en todos los grupos de tratamiento. Un cilindro abierto de poliestireno de 2.5 era de diámetro se adhirió a la piel alrededor de cada sitio extirpado con cemento Quick TiteMR (Loctite Corp.) similar al procedimiento reportado por Breuing y colaboradores (Breuing, K. , " ound Fluid Bacterial Levéis Exceed Tissue Bacterial Counts in Controlled Porcine Partial-Thickness Burn Infections", Plast . Reconstr. Surg. 111:781-788, 2003). Cada cilindro formó una cámara de prueba hermética a líquidos, la base de la cual era la aponeurosis expuesta. La herida expuesta se inoculo al depositar 200 µL que contenían 107 CFU de la suspensión bacteriana directamente sobre la aponeurosis. Este volumen de inoculo fue suficiente para cubrir completamente la aponeurosis expuesta. Después de aplicación, se permitió que el inoculo permaneciera sobre la aponeurosis durante 15 minutos antes del tratamiento. Un volumen de 800 µL de la Solución Mejorada de MPO se agregó al sitio dando por resultado un volumen total de 1 mi por sitio de prueba. A los sitios de control, donde se agregó 800 L de solución salina estéril al 0.9% o amortiguador, no se les administró la Solución Mejorada de MPO. Ambos sitios de heridas en una rata individual recibieron el tratamiento idéntico. Después del tiempo de tratamiento de 5 , 15, 30 o 60 minutos con la Solución Mejorada de MPO, un gran exceso de solución de catalasa se agregó a cada sitio para destruir cualquier enzima restante y/o peróxido de hidrógeno generado subsecuentemente, inhibiendo en consecuencia la actividad microbicida adicional. El líquido en el cilindro se recuperó y la aponeurosis subyacente se extirpó asépticamente, se pesó y se homogenizó. Los conteos de bacterias sobrevivientes en la muestra de líquido recuperada y el homogenado de tejido para cada sitio se valoraron por separado por medio del cultivo cuantitativo utilizando diluciones en serie de 10 veces colocadas en placas sobre Agar de Soya con Tripticasa (TSA) y se incubaron a 37 °C durante toda la noche. El desempeño de tratamiento se calculó como la suma de conteos del líquido recuperado y homogenado de tejido para cada herida y se reporta como el promedio de todas las muestras en cada grupo de tratamiento.

Para el modelo de heridas de espesor completo, el valor log 10 (CFU+1) promedio de sobrevivientes se calculó a partir de los datos no procesados. Los intervalos de confianza del 95% sobre los promedios se calcularon a partir del error estándar del promedio y el valor t que refleja el número aproximado de grados de libertad. La actividad de la Solución Mejorada de MPO exhibió una dependencia al tiempo y la concentración en tres concentraciones diferentes de p-MPO, 18.75, 75 y 150 GU de MPO/ml, en un modelo de escisión de espesor completo. Como se muestra en la FIGURA 4, la Solución Mejorada de MPO que contenía 75 GU de MPO/ml y 150 GU de MPO/ml produjo la eliminación casi completa de un inoculo mayor que 7 logio de S. aureus ATCC 6538 dentro de 15 minutos. El tratamiento con la Solución Mejorada de MPO en ambas concentraciones dio por resultado una reducción mayor que 4 logio CFU dentro de 5 minutos. Cuando la concentración se disminuyó a 18.75 GU de MPO/ml, aún se logró una reducción de aproximadamente 3 log10 CFU dentro de 5 minutos . El número logarítmico de CFU por herida recuperado de las heridas tratadas con la Solución Mejorada de MPO fue estadísticamente diferente (p< 0.05) de tanto el inoculo (7.3 logi0) como los controles de infección no tratados (7.25 logio) para todas las concentraciones y puntos de tiempo sometidos a prueba.

El efecto de la Solución Mejorada de MPO sobre las heridas inoculadas con E. coli ATCC 25922 se muestra en FIGURA 6. Como se observa con S. aureus, los conteos bacterianos disminuyeron rápidamente dentro de 5 minutos después del tratamiento con la Solución Mejorada de MPO. La eliminación casi completa del inoculo aplicado (7.2 logi0) se observó dentro de 5 minutos en heridas tratadas con la Solución Mejorada de MPO que contenía 150 GU de MPO/ml.

Estos resultados confirmaron la actividad rápida y dependiente del tiempo y la concentración de la Solución Mejorada de MPO contra S. aureus y E. coli en un ambiente que comprendía exudados de tej ido y heridas .

No se observó una diferencia significativa entre la actividad bactericida de la Solución Mejorada de MPO contra MRSA y MSSA en heridas, 15 minutos después del tratamiento (FIGURA 5) . En ambos casos, la recuperación de los organismos viables de los grupos de tratamiento indicó una disminución aproximada de 5 logio en CFU del control de inoculo. El grado de eliminación después de 15 minutos de exposición al tratamiento se comparó con el inoculo ya que los resultados previos no indicaron ninguna disminución o incremento apreciable en la viabilidad bacteriana durante hasta una hora después de la inoculación bacteriana del sitio de la herida (FIGURA 5 y FIGURA 6) . Estos descubrimientos corroboran la actividad in vitro de la Solución Mejorada de MPO descrita en el Ejemplo 11 contra organismos tanto resistentes como susceptibles a la meticilina (MIC90, 0.03 µg de MPO/ml) . (ii) modelo de Heridas de Espesor Parcial Se utilizó Staphylococcus aureus ATCC 6538 como el organismo de desafío. El inoculo se preparó como se describiera anteriormente para la herida de escisión de espesor completo. Las heridas experimentales consistieron de dos sitios de 10 mm x 7 mm en la línea media de la espalda de cada rata, un sitio que está adelante cerca de los hombros y un sitio que está caudal . La herida se logró por medio de la abrasión controlada de la piel. La piel se pellizcó utilizando los dedos para formar un pliegue y se frotó con un rallador utilizando 10 pasadas fuertes. Esto produjo una herida con una ligera depresión (es decir, aproximadamente 1/3 a 1/2 el espesor de la piel) con algún sangrado menor, el cual se secó con papel secante. Las pruebas se organizaron en 4 a 5 grupos de tratamiento por experimento con cada tratamiento administrado a 3 ratas. Cada una de las ratas tenía 2 heridas que proporcionaban 6 sitios de heridas por grupo experimental. Veinticinco microlitros de un inoculo de 106 CFU/ml se suministró en el centro de la herida expuesta y se frotó durante 10 segundos sobre el área de la herida completa utilizando una espátula estéril de polipropileno. Veinte minutos después de la aplicación del inoculo, 1 mi de ya sea la Solución Mejorada de MPO o placebo se aplicó con una torunda de algodón durante 30 segundos en el sitio de la herida. Una gasa saturada que contenía 3 mi de la Solución Mejorada de MPO o placebo entonces se aplicó a cada herida y la herida se cubrió con TegadermMR. Todos los sitios tratados se recolectaron en 3 o 24 horas después de la inoculación y se cultivaron por los organismos viables. El TegadermMR y la gasa se retiraron y la herida completa se extirpó abajo a la aponeurosis, se colocó en un tubo estéril tarado, se pesó y 1 rol de solución salina, fría, estéril al 0.9% se agregó a cada tubo. El tejido luego se homogenizó y los conteos bacterianos sobrevivientes en el homogenado de tejido recuperado para cada sitio se valoraron por medio de un cultivo cuantitativo utilizando diluciones en serie de 10 veces, se colocaron en placas en TSA y se incubaron a 37°C durante toda la noche.

Los desempeños de tratamiento se reportan como el promedio de los conteos de la muestra de tejido recuperada para cada grupo de tratamiento.

El valor log 10 (CFU+1) promedio de sobrevivientes se calculó a partir de los datos sin procesar. Los intervalos de confianza del 95% en los promedios se calcularon a partir del error estándar del promedio y el valor t que reflejaba el número apropiado de grados de libertad. El grado de la actividad de la Solución Mejorada de MPO (E-MPO) en 75, 150 o 300 GU de MPO/ml se valoró en 3 y 24 horas después del tratamiento en el modelo de heridas de espesor parcial como se muestra en la siguiente Tabla 35. Esta Tabla presenta el valor log 10 promedio de sobrevivientes de CFU aislados 3 y 24 horas después de los diversos tratamientos. El intervalo de confianza del 95% de cada uno se muestra para cada grupo de tratamiento. Se observaron diferencias significativas entre el control de placebo y los grupos tratados con la Solución Mejorada de MPO con respecto al número de CFU viables de S. aureus recuperadas de las muestras de tejido.

Tabla 35 Modelo de Escisión de Espesor Parcial - Actividad Microbicida in vivo de la Solución Mejorada de MPO Contra S. aureus ATCC 6538 ?representa los grupos de tratamiento que son estadísticamente diferentes del placebo o los controles' de infección Después de una aplicación individual de la Solución Mejorada de MPO en 150 GU/ml, el número promedio de organismos aislados de las heridas fue aproximadamente 0 . 8 logio CFU (~ 6 CFU) en 3 horas. Esto representó una reducción mayor que 3 log10 en comparación con el control de infección.

Las aplicaciones individuales de la Solución Mejorada de MPO que contenían MPO en 75, 150 y 300 GU/ml se examinaron para determinar una respuesta a la dosis y se compararon con el control de placebo en 24 horas . El tratamiento utilizando la Solución Mejorada de MPO en 75 GU/ml redujo el número de organismos recuperados a 5.3 logio. Sin embargo, esta reducción no fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo tratado con placebo con una, recuperación de 6.2 logi0 CFU (p=0.15) . Después de una aplicación individual de la Solución Mejorada de MPO en 150 GU/ml, el número de organismos recuperados de las heridas fue aproximadamente 1.1 logio CFU menor que el control de placebo (p<0.01) . Las heridas tratadas con la Solución Mejorada de MPO en 300 GU/ml contenían aproximadamente 4.4 logio CFU en comparación con 6.2 logio CFU recuperadas del grupo de control tratado con placebo (p=0.01). Estos descubrimientos indican que existe una respuesta a la dosis en 24 horas para la Solución Mejorada de MPO contra S. aureus y un efecto sostenido en la reducción del nivel de contaminación de las heridas después de un tratamiento individual . (iü) Modelo de Heridas por Incisión Profunda en los Muslos La cepa 136^ de S. aureus resistente a meticilina o Pseudomonas aeruginosa se utilizaron como los organismos de desafío y los inóculos se prepararon como se describiera anteriormente. Las heridas consistieron de una incisión en ambos muslos de cada rata cuando se utiliza MRSA y una incisión en solo un muslo para P. aerugínosa. Para cada pierna, la columna vertebral, el trocánter mayor y las rodillas se marcaron y se trazó una linea desde la rodilla hasta el trocánter mayor, hacia la columna vertebral. La piel se cortó utilizando tijeras de aproximadamente 3 cm a lo largo de la línea centrada sobre el trocánter mayor y la piel se socavó sobre los bordes a aproximadamente 1 cm. La incisión profunda se hizo abajo del nivel del fémur inferiormente y dentro de los músculos glúteos superiormente. La profundidad de la herida se confirmó al tocar el eje del fémur utilizando fórceps. Las pruebas con S. aureus se organizaron en 3 grupos de tratamiento por experimento; la Solución Mejorada de MPO, el tratamiento con solución salina y los controles no tratados. Diez ratas se utilizaron para comparar la Solución Mejorada de MPO con la solución salina, con una pierna que recibía la Solución Mejorada de MPO y la otra pierna que era tratada con solución salina. Adicionalmente , 5 animales recibieron la Solución Mejorada de MPO en la pierna izquierda y 5 animales la recibieron en la pierna derecha. Dos ratas recibieron la inoculación y no recibieron tratamiento, dando por resultado 4 heridas para los controles no tratados .

Las pruebas con P. aerugínosa también se organizaron en 3 grupos de tratamiento por experimento con 4 ratas utilizadas para la Solución Mejorada de MPO, los tratamientos con solución salina y los controles no tratados, respectivamente. Cada una de las ratas tuvo una sola herida proporcionando 4 sitios de herida por grupo experimental. Un inoculo de 100 µ??? de una suspensión de organismos de 109 CFU/ml se suministró en la profundidad de la herida utilizando una pipeta estéril. Sesenta (60) minutos después de la inoculación con S. aureus, las heridas se trataron ya sea una vez con 2.5 mi de la Solución Mejorada de MPO en 75 GU/ml o dos veces, con 15 minutos de separación, con 10 mi de la Solución Mejorada de MPO en 300 GU/ml (véase la Tabla 36) . Sesenta (60) minutos después de la inoculación con P. aeruginosa , las heridas se trataron dos veces, con 15 minutos de separación, con 5 mi de la Solución Mejorada de MPO en 300 GU/ml (véase la Tabla 37) . La totalidad de la Solución Mejorada de MPO y los tratamientos con solución salina se aplicaron utilizando una jeringa con una aguja para alimentación forzada. Las heridas tratadas se cerraron utilizando dos sujetadores de piel inmediatamente después del segundo tratamiento mientras que las heridas de control no tratadas se cerraron inmediatamente después de la inoculación bacteriana. La valoración de la herida se realizó en el día 4. Una evaluación de cada herida se realizó y se asignó un registro de infectividad . Dos métricas claves de infección se utilizaron para determinar el registro de infectividad, específicamente el área de induración y la presencia o ausencia de purulencia. El área de induración se midió en mm cuadrado utilizando un calibrador y la presencia de purulencia se determinó al abrir quirúrgicamente cada herida. El registro de infectividad se asignó al valor del área de induración y si estaba presente la purulencia el registro de infectividad se incrementó por 25%. No hubo reducción del registro de infectividad si la purulencia estaba ausente.

Los registros de infectividad promedio se determinaron a partir de datos acumulados de múltiples experimentos por medio de PROC MIXEDMR (SAS, SAS Institute, Cary, Carolina del Norte, E.U.A.), utilizando un modelo con heridas anidadas dentro de ratas y ratas anidadas dentro de experimentos . Tanto las ratas como los experimentos se consideraron como variables aleatorias en este modelo. Las comparaciones por pares de los valores promedio se hicieron utilizando la prueba t. El efecto de la Solución Mejorada de MPO sobre el progreso de la infección por la cepa resistente a meticilina de S. aureus o Pseudomonas aeruginosa se determinó en 4 días después de la inoculación en el modelo de heridas por incisión profunda en el muslo. Como se muestra en la siguiente Tabla 36, ninguno de los grupos tratados con la Solución Mejorada de MPO (E-MPO) fue estadísticamente diferente de los otros. El * representa grupos de tratamiento que son estadísticamente diferentes de placebo y el # representa grupos de tratamiento que son controles de infección estadísticamente diferentes.

El registro de infectividad para los grupos tratados con la Solución Mejorada de MPO se comparó con la clasificación de infectividad de los grupos tratados con solución salina y no tratados en 4 días después del tratamiento, como se muestra en las siguientes Tablas 36 y 37 .

Tabla 36 Modelo de Heridas por Incisión Profunda en el Muslo - Actividad Microbicida In vivo de la Solución Mejorada de MPO Contra S . aureus N es el número de piernas por grupo de tratamiento. * representa los grupos de tratamiento que son estadísticamente diferentes del placebo. # representa los grupos de tratamiento que son estadísticamente diferentes de los controles de infección.

Tabla 37 Modelo de Heridas por Incisión Profunda en el Muslo - Actividad Microbicida In vivo de la Solución Mejorada de MPO Contra P. aeruginosa N es el número de piernas por grupo de tratamiento. * representa los grupos de tratamiento que son estadísticamente diferentes del placebo. # representa los grupos de tratamiento que son estadísticamente diferentes de los controles de infección.

Los animales inoculados con MRSA se trataron ya sea dos veces con 10 mi de la Solución Mejorada de MPO en 300 GU/ml o una vez con 2 . 5 mi de la Solución Mejorada de MPO en 75 GU/ml. Las inspecciones de las heridas 4 días después del tratamiento indicaron una incidencia más alta de presencia de purulencia para todas las heridas no tratadas ( 59 % ) en comparación con las heridas tratadas con solución salina ( 25 % ) y los grupos de tratamiento con la Solución Mejorada de MPO (10% en tanto 300 GU/ml y 75 GU/mL) .

El registro de infectividad promedio de 110 para animales tratados dos veces con 10 mL de la Solución Mejorada de MPO en 300 GU/ml fue estadísticamente diferente (valor P<0.05) de aquel de los dos tratamientos con solución salina y los grupos no tratados que tenían registros de infectividad de 216, 195 y 303, respectivamente (Tabla 36). No se pudieron discernir diferencias estadísticas (p>0.05) entre la concentración alta/volumen alto y la concentración baja/volumen bajo de los tratamientos con la Solución Mejorada de MPO.

Como se muestra también en la Tabla 36, la disminución simultánea de la concentración y el volumen de la Solución Mejorada de MPO, de 10 mi aplicados dos veces en 300 GU/ml a 2.5 mi aplicados una vez en 75 GU/ml, dio por resultado un registro de infectividad de 84 que es estadísticamente diferente (valor p<0.05) de los registros de infectividad de 216, 195 y 303 obtenidos para los animales tratados con 2.5 mL de solución salina aplicada una vez, los animales tratados con 10 mi de solución salina aplicada dos veces y los animales no tratados, respectivamente. No se pudieron discernir diferencias estadísticas (p>0.05) entre la concentración alta/volumen alto y la concentración baja/volumen bajo de los tratamientos con la Solución Mejorada de MPO.

El cambio en el organismo de S. aureus a P. aeruginosa condujo a un incremento en la gravedad del modelo y letalidad cuando ambas piernas se inocularon (datos no mostrados) por lo tanto se utilizó una sola pierna por animal cuando los animales se inocularon con P. aeruginosa. Adicionalmente , puesto que la P. aeruginosa se puede volver sistémica después de la administración localizada, el uso de las dos piernas de animales para diferentes tratamientos fue poco aconsejable y fue probable que condujera a resultados confusos^ Como se muestra en la Tabla 37, el registro de infectividad promedio de 86 para animales tratados dos veces con 5 mL de la Solución Mejorada de MPO en 300 GU/ml fue estadísticamente diferente (valor p<0.05) de tanto el grupo tratado con la solución salina (IS=705) como el grupo no tratado (1032) . La observación en el día 4 condujo a una incidencia más alta de purulencia para todas las heridas no tratadas (50%) en comparación con las heridas tratadas con solución salina (25%) y los grupos de tratamiento con la Solución Mejorada de MPO (0%) .

Específicamente, estos resultados demuestran la actividad letal dependiente de la dosis y el tiempo de la Solución Mejorada de MPO contra S. aureus y E. coli en el modelo de infección de heridas de espesor completo. La Solución Mejorada de MPO fue efectiva en la reducción de cargas bacterianas en presencia de exudados de heridas después de una aplicación individual, e importantemente, sin la adición de antibióticos utilizados convencionalmente . Este efecto letal es rápido y se traduce en recuperaciones bacterianas reducidas en comparación con los controles tratados con placebo o no tratados, aún 24 horas después del tratamiento con la Solución Mejorada de MPO.

En resumen, estos resultados microbicidas acoplados con el espectro amplio, la actividad bactericida rápida, la baja propensión a seleccionar resistencia y la falta de interacción de fármaco- fármaco observados en los estudios in vitro soportan fuertemente el uso de las composiciones de la invención para el tratamiento, prevención y reducción de infecciones in vivo.

Mientras que las modalidades ilustrativas han sido ilustradas y descritas, se apreciará que se pueden hacer varios cambios en las mismas sin apararse del espíritu y alcance de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición para inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles, caracterizada porque comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para aumentar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, 1-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3-diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3 -diaminopropiónico, ácido L-3-amino-isobutírico, ácido D- 3-aminoisobutírico, 3 -aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D- isoleucina , L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende por lo menos tres aminoácidos, los cuales se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3 -diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3-diaminopropiónico, ácido L-3-amino- isobutírico, ácido D-3 -aminoisobutírico, 3-aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque por lo menos los tres aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, Drleucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, o un éster alquílico. o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además peróxido de hidrógeno o una fuente de peróxido de hidrógeno .

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la fuente de peróxido de hidrógeno es una oxidasa productora de peróxido que produce peróxido de hidrógeno en presencia de un substrato para la oxidasa.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una oxidasa productora de peróxido que es efectiva para generar de 100 pmol a 50 µ???? de peróxido por mi por minuto cuando está en presencia de un substrato para la oxidasa.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende de 1 a 50,000 µg/ml de mieloperoxidasa .

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende de 0.1 a aproximadamente 500 mM de cada uno de por lo menos los dos aminoácidos .

11. Una composición, caracterizada porque comprende de 10 a 5,000 µ /p?1 de mieloperoxidasa, de 0.3 a 50 mM de glicina, de 0.3 a 50 mM de L-alanina, de 0.3 a 50 mM de L-prolina y de 1 a 500 U/ml de glucosa oxidasa.

12. Un método para tratar un sujeto humano o animal necesitado de este tratamiento, caracterizado porque comprende administrar a un sitio de infección en el sujeto una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D- alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina , L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3-aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2,3-diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2,3-diaminopropiónico, ácido L-3-aminoisobutírico, ácido D-3-aminoisobutírico, 3 -aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alan-ina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición comprende por lo menos tres aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina, D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3 -diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3 -diaminopropiónico, ácido L-3-aminoisobutírico, ácido D-3-aminoisobutírico, 3 -aminobutirctto de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque por lo menos los tres aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición comprende además peróxido de hidrógeno o una f ente de peróxido de hidrógeno .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la fuente de peróxido de hidrógeno comprende una oxidasa productora de peróxido que produce peróxido de hidrógeno en presencia de un substrato para la oxidasa.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición comprende una oxidasa productora de peróxido que es efectiva para generar de 100 pmol a 50 µp??? de peróxido por mi por minuto cuando está en presencia de un substrato para la oxidasa.

20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición comprende de 1 a 50,000 g/ml de mieloperoxidasa .

21. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición comprende de 0.1 a aproximadamente 500 mM de cada uno de por lo menos los dos aminoácidos .

22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición comprende de 10 a 5,000 g/ml de mieloperoxidasa, de 0.3 a 50 mM de glicina, de 0.3 a 50 mM de L-alanina, de 0.3 a 50 mM de L-prolina, y de 1 a 500 U/ml de glucosa oxidasa.

23. El método dé conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el sujeto humano o animal está sufriendo de una infección microbiana de las encías, ojos, orejas, piel, tejido suave, heridas, áreas vaginales, áreas inguinales, escaras o áreas de quemaduras.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la infección es una infección polimicrobiana .

25. Un método para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles, caracterizado porque comprende poner en contacto los microorganismos, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, con una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos que funcionan en combinación para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.

26. El uso de una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una infección en un sujeto humano o animal, en donde los aminoácidos funcionan en combinación, en presencia de peróxido de hidrógeno y cloruro o bromuro, para mejorar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.

27. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D- isoleucina , L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina , D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3 -diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3 -diaminopropiónico, ácido L-3-aminoisobutírico, ácido D-3 -aminoisobutírico, 3 -aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

28. El uso de conformidad con la reivindicación 26 o 27, en donde por lo menos los dos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L-isoleucina, D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

29. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde la composición comprende por lo menos tres aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L- isoleucina , D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina, D-valina, aminoácidos beta, tal como beta alanina, L-beta-homoleucina , D-beta-homoleucina, ácido 3 -aminobutanoico, monoclorhidrato del ácido L-2 , 3-diaminopropiónico, monoclorhidrato del ácido D-2 , 3 -diaminopropiónico, ácido L-3-aminoisobutírico, ácido D-3 -aminoisobutírico, 3 -aminobutirato de etilo, clorhidrato de éster metílico de sarcosina y ácido nipecótico, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos .

30. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en donde por lo menos los tres aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, L-alanina, D-alanina, anhídrido de L-alanina, L-glutamina, ácido L-glutámico, anhídrido de glicina, ácido hipúrico, L-histidina, L-leucina, D-leucina, L- isoleucina , D-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, D-fenilalanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, taurina, L-treonina, D-treonina, L-tirosina, L-valina y D-valina, o un éster alquílico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

31. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde la composición comprende además peróxido de hidrógeno o una fuente de peróxido de hidrógeno.

32. El uso de conformidad con la reivindicación 31, en donde la fuente de peróxido de hidrógeno comprende una oxidasa productora de peróxido que produces peróxido de hidrógeno en presencia de un substrato para la oxidasa.

33. El uso de conformidad con la reivindicación 32, en donde la composición comprende una oxidasa productora de peróxido que es efectiva para generar de 100 pmol a 50 mol de peróxido- por mi por minuto cuando está en presencia de un substrato para la oxidasa.

34. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la composición comprende de 1 a 50,000 µg/ml de mieloperoxidasa .

35. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la composición comprende de 0.1 a aproximadamente 500 mM de cada uno de por lo menos los dos aminoácidos.

36. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde la composición comprende de 10 a 5,000 g/ml de mieloperoxidasa, de 0.3 a 50 mM de glicina, de 0.3 a 50 mM de L-alanina, de 0.3 a 50 mM de L-prolina y de 1 a 500 U/ml de glucosa oxidasa.

37. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el sujeto humano o animal está sufriendo de una infección microbiana de las encías, ojos, orejas, piel, tejido suave, heridas, áreas vaginales, áreas inguinales, escaras o áreas de quemaduras .

38. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde la infección es una infección polimicrobiana .

39. El uso de una composición que comprende mieloperoxidasa y por lo menos dos aminoácidos en la manufactura de un medicamento para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos susceptibles, en donde los aminoácidos funcionan en combinación para aumentar la actividad microbicida de la mieloperoxidasa.