CN111714496A - 小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途及在制备抗致病菌感染药中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体为小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途及在制备抗致病菌感染药中的用途。本发明利用代谢组学技术，通过分析感染致病菌小鼠血清的代谢变化，从而筛选出可提高宿主对致病菌的清除能力和抵抗能力，减少宿主体内致病菌含量，提高存活率，尤其是可提高宿主抗金葡菌/MRSA感染能力的小分子化合物。本发明针对所述小分子化合物的应用，其效果的实现是通过以代谢调节宿主免疫力为切入点，调节宿主自身的免疫力来抵抗致病菌感染，因此该方法可排除产生耐药菌的风险。另外，所述小分子化合物于抗生素协同上能够更好的起到保护宿主的作用，有利于缩短抗生素的使用周期，尽量减少耐药菌的产生。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途及在制备抗致病菌感染药中的用途。
背景技术
目前，针对金葡菌感染的疾病均利用抗生素进行治疗，导致耐药菌如 MRSA的产生屡见不鲜，因此让抗生素治疗耐药菌感染变得尴尬，新的抗生素发明跟不上细菌耐药的速度。利用抗生素治疗金葡菌感染存在的缺点，一方面是抗生素治疗产生耐药菌速度极快，致使后期耐药菌治疗无抗生素可用；另一方面是新抗生素的筛选周期很长，成本较高，同时新抗生素的使用将会伴随新耐药菌的产生。鉴于抗生素治疗存在的上述问题，急需开发新的方法来治疗针对金葡菌/耐药金葡菌引起的感染。
从宿主免疫方向来寻找新的抗感染方法是当前较热的切入点，另外宿主代谢行为已经在越来越多的研究中被指出与抗感染免疫息息相关。本发明利用代谢组学技术，以代谢调节宿主免疫力为切入点进行研究。
发明内容
本发明针对使用抗生素治疗致病菌感染疾病会产生耐药菌且新抗生素的筛选周期长等问题，利用代谢组学技术从感染小鼠的血清中筛选抗感染小分子的方法筛选出可提高宿主对致病菌清除能力和抵抗能力，减少宿主体内致病菌含量的小分子代谢物，从而提供一种所筛选小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途，以及所筛选小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途。本发明所述小分子化合物的用途之效果的实现是通过以代谢调节宿主免疫力为切入点，调节宿主自身的免疫力来抵抗致病菌感染，该方法可排除产生耐药菌的风险。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明的第一方面，提供一种小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途，所述小分子化合物包括异亮氨酸。
优选的，所述小分子化合物还包括脯氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的至少一种。
优选的，所述致病菌为金葡菌。
更优选的，所述金葡菌为抗生素敏感型金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明的另一方面，提供一种小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，所述小分子化合物包括异亮氨酸。
优选的，所述小分子化合物还包括脯氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的至少一种。
优选的，所述抗致病菌感染药含有抗生素。
更优选的，所述抗生素为万古霉素或达托霉素。
优选的，所述致病菌为金葡菌。
更优选的，所述金葡菌为抗生素敏感型金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用代谢组学技术，通过代谢组学技术-气相色谱-质谱(GC-MS) 来鉴定感染金葡菌小鼠血清的代谢变化，从而筛选出异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸和缬氨酸这四种小分子代谢物，这四种小分子代谢物可提高宿主对致病菌的清除能力和抵抗能力，减少宿主体内致病菌含量，提高存活率，尤其是可提高宿主抗金葡菌/MRSA感染的能力。本发明针对这四种小分子代谢物的应用，其效果的实现是通过以代谢调节宿主免疫力为切入点，调节宿主自身的免疫力来抵抗致病菌感染，因此该方法可排除产生耐药菌的风险。另外，这四种小分子代谢物于抗生素协同上能够更好的起到保护宿主的作用，有利于缩短抗生素的使用周期，尽量减少耐药菌的产生。
附图说明
图1为采用气相色谱-质谱(GC-MS)代谢组学筛选抗金葡菌感染的小分子化合物的技术路线图；
图2A为高、中、低亚致死剂量的Newman感染后，小鼠血清GC-MS 的主成分分析图；
图2B为高、中、低亚致死剂量的Newman感染后，小鼠血清GC-MS 的全局等级聚类分析图；
图2C为高、中、低亚致死剂量的Newman感染后，小鼠血清中4中小分子代谢物的含量分析图；
图3A为外源补充4种小分子化合物的感染小鼠的体重变化对比图；
图3B为外源补充4种小分子化合物的感染小鼠的肾脏细菌数和肾脏脓肿数对比图；
图3C为小鼠感染Newman后其肾脏的H&E组织病理学染色图；
图4A为外源补充4种小分子化合物的小鼠在USA300感染下的存活率对比图；
图4B为外源补充4种小分子化合物的小鼠在MRSA252感染下的存活率对比图；
图5为异亮氨酸与抗生素联用的小鼠在金黄色葡萄球菌感染下的存活率图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面以具体研究及实施过程为例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
本发明的研究思路如图1所示，对不同剂量感染的小鼠血清进行GC-MS 代谢组学分析，利用主成分分析和差异分析，筛选获得抗感染靶标小分子，然后进行功能实验以验证所筛选的抗感染靶标小分子提高宿主抗致病菌感染的效果。
本发明对不同剂量感染的小鼠血清进行GC-MS代谢组学分析，利用主成分分析和差异分析，发现脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨这四种小分子化合物呈现一种逐步上升的表达模式，因此以这四种小分子化合物作为抗感染靶标小分子。
具体实验实施过程举例如下：
1.动物感染模型及血清样本的获取
(1)在感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之前，对Balb/c 小鼠通过眼球静脉获取100μL的外周全血，3000rpm离心10min后获得50μL感染前小鼠的血清样本。
(2)16h后，对上述小鼠进行3种高、中、低亚致死剂量的金葡菌感染 (0.3×107cfu、0.7×107cfu、1×107cfu/只)，感染方式为眼眶静脉。
(3)8h后，使用与上述步骤1)相同的方式对感染后的小鼠进行全血取样，离心后获取感染后小鼠的血清样本。
2.GC-MS代谢组学分析
2.1.小鼠血清代谢物样品制备
(1)往50μL小鼠的血清样本中加入等体积的第一种溶液(氯仿：甲醇体积比＝1:2)，冰上静置10min后，在12000rpm、4℃下离心10min。第一次收集上清液。
(2)收集上清后，沉淀继续用第二种溶液(纯甲醇)进行重悬，冰上静置10min后，在12000rpm、4℃下离心10min。第二次收集上清液。
(3)将第二次收集的上清液与第一次收集的上清液混合，转移至新的离心管中。
(4)加入10μL 0.1mg/mL核糖醇(Sigma)作为内标，置于旋转蒸发干燥仪中完全干燥后备用。
2.2.衍生化及GC-MS分析
(1)样品衍生化：干燥后，向2.1所制备的样品中加入80μL含有20 mg/mL盐酸甲氧胺的吡啶溶液，充分混匀后，在37℃下肟化1.5h。随后加入80μL衍生化试剂MSTFA，充分混匀后在37℃反应0.5h。取1μL衍生化的上清液到微量进样管，采用不分流注射法，注入到30m×250μm内径×0.25μm DBS-MS柱中，并运用Trace DSQ II(Thermo Scientific)进行GC-MS分析。
(2)GC-MS分离条件设定：初始温度70℃(保持5min)，以15℃/min 的速度匀速升温至270℃(保持5min)；进样量：1μL，不分流进样；进样口温度：270℃；离子源(El)温度：230℃，接口温度：270℃；四极杆温度：150℃；电离电压：70eV；载气：高纯氦气；流速1.0mL/min；扫描方式：全扫描，60-600m/z。
2.3.代谢物鉴定
使用NIST质谱数据库(NIST Mass Spectral Database，http://www.nist.gov)对GC-MS分析的色谱峰所代表的代谢物质进行鉴定。代谢物鉴定过程是基于所检测到的代谢物的El质谱碎片和数据库中所保存的标准物质质谱信息的比对。对代谢物的EI-MS质谱信息的分析基于NIST AMDIS(automated mass spectral deconvolution andidentification system)软件进行。
2.4.数据处理
得到GC-MS指纹图谱后，使用Xcalibur 2.1软件对数据进行峰积分、保留时间(RT)校正，最终得到含保留时间和峰强度的数据矩阵。根据内参标准品核糖醇的峰面积进行数据校正；为了进一步去除样本间的差异，对每个样品的总峰面积进行归一化处理，各物质的强度进行四分位标准化处理。
3.生物信息学分析获得感染靶标小分子
本实验，代谢物数据的转换和处理都在Excel表格里完成；等级聚类和主成分分析采用基于网页的在线工具-ClustVis(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)； Prism 5.0(GraphPad,La Jolla,CA,USA)用于绘制代谢物的散点分布。
脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨这四种小分子代谢物呈现一种逐步上升的表达模式，暗示了可能是宿主从低到高免疫级别的代表，因此选取这四种小分子代谢物为抗感染靶标小分子。其中，如图2A-2C所示，图2A为高、中、低亚致死剂量的Newman感染后，小鼠血清GC-MS的主成分分析图；图2B为高、中、低亚致死剂量的Newman感染后，小鼠血清GC-MS的全局等级聚类分析图；图2C为高、中、低亚致死剂量的Newman感染后，小鼠血清中4中小分子代谢物的含量分析图。
4.代谢物功能实验
将Balb/c小鼠(6周龄，体重18～20g)进行随机的分组(10只/组)，并进行一周的适应性喂养。然后进行代谢物功能实验，如下文所述：
(1)对照组和处理组分别通过腹腔注射的方式注射相同体积的PBS和代谢物(L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸)，代谢物的用量均为 0.375g kg-1；每天注射两次这些物质，每次隔12小时；一共注射3天。本试验以小鼠的体重变化、肾脏的细菌数和脓肿数、生存率来研究代谢物对宿主的保护功能；
(2)通过眼眶静脉感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Newman 菌株攻毒剂量为1×107cfu/只，为亚致死剂量；在接下来感染后的15天内，测量对照组和代谢物处理组小鼠的体重变化；在感染的第15天，对小鼠进行脱臼处死并在无菌环境下解剖获得肾脏；获得的脏器用0.5mL的生理盐水(含0.1％TritonX-100)在匀浆器下充分匀浆。本试验采用细菌平板计数的方法来调查小鼠内脏对细菌的清除能力。因此为了能够清晰地对脏器内的细菌进行计数，匀浆液要进行合适的倍比稀释，最终取3个连续稀释梯度的匀浆液(每个梯度取10μL)点板于TSB固体培养基上；平板放置于37℃培养箱培养，直至出现单克隆时，对细菌个数进行计数。用Graphpad计算对照组和给各种代谢物组之间细菌个数的差异；对肾脏脓肿个数的鉴定上，需要对组织进行组织学染色(H&E染色)。小鼠肾脏用10％福尔马林进行室温固定24h；接着，肾脏组织进行石蜡包埋处理、薄切片、苏木精-伊红染色，最后在光学显微镜下观察并对脓肿病灶进行计数。
(3)在小鼠生存率的调查上，对免疫过PBS或代谢物的小鼠进行眼眶静脉注射进行细菌的感染，这里首先使用的菌株为USA300和MRSA252，感染剂量分别为2×108cfu/只和2×109cfu/只，同样对感染后的小鼠进行为期 15的存活率观察。
以上述方法进行进行代谢物与抗生素联用的实验，抗生素分别为万古霉素(剂量浓度为60mg/kg，感染之前注射，一共注射2次，每次隔12小时) 和达托霉素(剂量浓度为25mg/kg，感染之前注射，一共注射2次，每次隔 12小时)，代谢物使用浓度如上所述。且在小鼠生存率的调查上，以Newman 为感染菌株对免疫过PBS或代谢物与抗生素的小鼠进行眼眶静脉注射进行细菌的感染，感染剂量为5×108cfu/只，观察周期为15天，记录小鼠的存活率。
功能实验结果如下。
为了研究4种氨基酸(L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸) 对金黄色葡萄球菌株Newman的抵抗作用，我们在感染小鼠之前分别单独给予这4种氨基酸，对照组为注射PBS。在给药三天之后，这些经过PBS或者不同氨基酸给药的小鼠进行Newman菌株的感染。由图3A可见，在感染了Newman后，小鼠体重逐步下降，感染第七天呈现体重下降的最低点，之后体重逐步恢复；在给予不同的氨基酸后，感染小鼠的体重同样下降，但是下降的幅度较PBS对照组的少，从感染第三天开始，氨基酸给药组的小鼠的体重与PBS对照组的小鼠的体重有显著性差异，即氨基酸给药组的小鼠有明显更高的体重。外源补充这4种氨基酸可明显恢复感染小鼠的体重。在感染的第15天后，检测小鼠肾脏的细菌含量和脓肿数，结果见图3B，肾脏细菌含量结果显示，氨基酸给药组具有更少的细菌含量，表明给予这4种氨基酸都有显著下降小鼠肾脏的细菌数；同样，肾脏脓肿数目也呈现于与细菌含量一样的表型，即减少感染小鼠的肾脏脓肿数。外源补充4种氨基酸可显著降低Newman在小鼠肾脏的存活和脓肿数目。为了进一步验证氨基酸给药组具有抗金葡菌感染的作用，对感染小鼠的肾脏进行H&E染色。图3C为小鼠感染Newman后其肾脏的H&E组织病理学染色图，H&E组织病理学染色图中蓝色区域为由金葡菌感染所致的脓肿，脓肿里面是金葡菌。由图3C可见， PBS对照组清晰可见许多的脓肿病灶，而不管是这4种氨基酸的任何一种进行给药后，H&E染色的结果都显示只有较少的脓肿病灶。综合这些结果表明，分别给予这4种氨基酸可以显著提高小鼠对金黄色葡萄球菌Newman的抵抗能力。
为了研究这4种氨基酸是否可以提高对MRSA的抵抗能力，我们选用当前2种较为常见的MRSA菌株(USA300和MRSA252)对小鼠进行致死剂量的感染，并观察小鼠的生存率。由图4A和图4B可见，外源补充这4 种氨基酸均可提高小鼠在USA300和MRSA252感染下的存活率。PBS对照组在感染USA300或MRSA252后，小鼠开始逐步出现死亡，最终在感染的第7天(感染USA300)和第5.5天(感染MRSA252)内，所有感染小鼠全部死亡，即0％的存活率。然而在注射氨基酸之后再进行同样MRSA菌株及相同剂量的感染之后，虽然小鼠也开始出现不同程度的死亡，但是所有的氨基酸给药组都在感染的第6天左右开始逐步的停止了死亡，并一直存活至感染的第15天。感染USA300组，注射L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸或 L-缬氨酸的存活率分别为40％、30％、40％或30％；感染MRSA252组，注射L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸或L-缬氨酸的存活率分别为30％、30％、 20％或30％。这些结果表明，L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸都可以在不同程度上提高小鼠抵抗MRSA感染的能力。
为了研究氨基酸是否可以协同抗生素治疗金黄色葡萄球菌的感染，本文以L-异亮氨酸为例，并选择临床常用的2种抗生素：万古霉素和达托霉素。结果由图5可见，PBS对照组的感染结果与之前相似，在感染的第6天，所有的小鼠全部死亡，存活率为0％。在单独给予抗生素或者L-异亮氨酸后，小鼠的生存率得到了提高，从0％提升为30％(L-异亮氨酸组)和50％(万古霉素和达托霉素组)；在协同使用L-异亮氨酸和万古霉素或者L-异亮氨酸和达托霉素后，小鼠的生存率得到进一步的提高，从50％升高到80％。该结果表明，异亮氨酸与抗生素联用可以明显协同提高小鼠对金黄色葡萄球菌感染的抵抗能力，即联合使用抗生素和L-异亮氨酸可以进一步提升抗生素的治疗效果，减少抗生素使用周期，降低耐药菌的产生。
本发明利用代谢组学技术从感染小鼠的血清中筛选抗感染小分子化合物，结果发现四种可以提高抗金葡菌/MRSA感染的小分子代谢物，后期的功能实验上也证实这些小分子化合物能够很好的提高宿主对金葡菌/MRSA 的抵抗，减少体内细菌含量，提高存活率；另外，在于抗生素协同上这些小分子化合物也是能够更好的起到保护宿主的作用，有望缩短抗生素的使用周期，尽量减少耐药菌的产生。
本发明是以代谢调节宿主免疫力为切入点，调节宿主自身的免疫力来抵抗金葡菌感染，这样的构思可以排除产生耐药菌的风险。方法学是利用当前主流的代谢组学技术-气相色谱-质谱(GC-MS)来鉴定感染金葡菌小鼠血清的代谢变化。我们推测：在感染低、中、高亚致死剂量的金葡菌后，宿主也将会启动由低到高的免疫级别来应对和清除感染。利用这一特点，我们对不同剂量感染的小鼠血清进行GC-MS代谢组的分析，利用组成分分析和差异分析发现其中的四种小分子化合物-脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸呈现一种逐步上升的表达模式，暗示了可能是宿主从低到高免疫级别的代表。后续的功能实验证明这四种小分子化合物确实可提高小鼠抗金葡菌/MRSA 感染的免疫力，达到了很好的保护效果；此外，小分子化合物还可以与当前主流的治疗手段-抗生素联用，达到比单独使用抗生素更好的疗效。
除上述举例中使用的抗生素和菌株外，致病菌还可以是其它金葡菌菌株或者MRSA菌株等，小分子化合物还可以与其它抗生素联用，均有利于提高与之所联用的抗生素的疗效。
以上所述仅以具体的实验实施过程为例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
Claims (10)
1.小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途，其特征在于，所述小分子化合物包括异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途，其特征在于，所述小分子化合物还包括脯氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途，其特征在于，所述致病菌为金葡菌。
4.根据权利要求3所述的小分子化合物用于提高宿主对致病菌清除能力的用途，其特征在于，所述金葡菌为抗生素敏感型金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
5.小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，其特征在于，所述小分子化合物包括异亮氨酸。
6.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，其特征在于，所述小分子化合物还包括脯氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，其特征在于，所述抗致病菌感染药含有抗生素。
8.根据权利要求7所述的小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，其特征在于，所述抗生素为万古霉素或达托霉素。
9.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，其特征在于，所述致病菌为金葡菌。
10.根据权利要求9所述的小分子化合物在制备抗致病菌感染药中的用途，其特征在于，所述金葡菌为抗生素敏感型金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
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