MX2010011357A - Plantas de pepino resistentes al mildiu velloso. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a líneas de pepino con resistencia aumentada al Mildiú Velloso; la presente invención también se refiere a partes de plantas de pepino provenientes de líneas que tienen resistencia aumentada al Mildiú Velloso, incluyendo semillas capaces desarrollar plantas de pepino con resistencia aumentada al Mildiú Velloso; además, provee procedimientos para producir esas plantas por selección asistida por marcadores genéticos.

Description

PLANTAS DE PEPINO RESISTENTES AL MILDIÚ VELLOSO REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACION DADAS Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. de Serie 61/045,551 presentada el 16 de abril del 2006 cuya descripción completa se incorpora a la presente por referencia.

INCORPORACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias que está contenido en el archivo nombrado "SEMS025WOsequencelisting.txt", el cual tiene 4 kilobites (según se midió en Microsoft Windows®) y se creó el 15 de abril del 2009, se presentó con el mismo por presentación electrónica y se incorpora a la presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a plantas de pepino que tienen resistencia al Downy Mildew (Mildiú velloso) y a procedimientos para obtenerlas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El pepino (Cucumis sativus L.) es una hortaliza popular que ha sido cultivada durante varios miles de años y se la cultiva en todo el mundo. Las plantas de pepino se cultivan en un rango amplio de climas y en campos, así como en invernaderos. Los dos tipos principales de frutos de pepino cultivados comercialmente hoy en día son para mercado fresco (rebanado) y procesamiento (encurtido).

El Mildiú Velloso (DM, por sus siglas en inglés)) es causado por el hongo Pseudoperonospora cubensis (P.c), que causa pérdidas significativas en cultivos de muchas especies de Cucurbitáceas, incluyendo al pepino. La enfermedad se encuentra en todo el mundo y especialmente en condiciones húmedas, temperadas. La enfermedad afecta tanto a plantas de invernadero como a las cultivadas en el campo. El DM es una de las principales enfermedades de las Cucurbitáceas pudiendo reducir el rendimiento y la calidad de los frutos, y pudiendo matar plántulas susceptibles.

Los síntomas de infección por DM son variables. Los síntomas iniciales incluyen lesiones agudas, irregulares, amarillas en la superficie superior de las hojas, las que eventualmente se hacen más distintas en ambas caras de la hoja. La cara inferior de las hojas puede exhibir un crecimiento gris-blanquizco, marrón o azul claro, particularmente bajo condiciones húmedas. Este crecimiento son esporas producidas en la superficie inferior de la lesión. Un amarillamiento general de las hojas afectadas ocurre típicamente a medida que las lesiones coalescen en una sola lesión grande, eventualmente causando que la hoja se marchite y muera. La enfermedad puede progresar muy rápido, matando follaje en cosa de unos pocos días, y resultando en poca producción de frutos de baja calidad. Los frutos del pepino no se afectan directamente, pero la extensa defoliación expone a los frutos a quemaduras de sol. Una vez que aparece en un cultivo, el DM se esparce rápidamente por el viento, o salpicaduras de agua de lluvia y/o agua de riego. El manejo y prevención de la enfermedad ' requiere destrucción de todas las plantas provenientes de criaderos infectados y desinfección de las instalaciones. La emergencia de una nueva aislación de DM también ha superado a algunas líneas resistentes previamente conocidas. Así, hay una necesidad de nuevas variedades de pepino que tengan resistencia al DM.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención provee un procedimiento para producir plantas de pepino con resistencia al Mildiú velloso, que comprende los pasos de (a) cruzar una planta de pepino con número de acceso Pl 197088, con una segunda planta de pepino que tenga uno o más rasgos deseables; y (b) seleccionar al menos una planta de pepino de la primera progenie resultante del cruzamiento, que comprende resistencia al Mildiú velloso y al rasgo deseado. En una modalidad, se provee un procedimiento en el cual el rasgo deseado se selecciona del grupo que consiste de: tamaño, forma, color, apariencia superficial del fruto; número de semillas, tamaño de semillas, número de lóculos, espesor del pericarpio y resistencia; sabor, amargor, presencia de tubérculos, vida en almacenamiento, vigor de la planta, forma de la hoja, largo de la hoja, color de la hoja, altura de la planta, sí la planta es determinada o no, tiempo a madurez, adaptación a cultivo en el campo, adaptación a cultivo en invernadero, calidad de frutos aceptable para el mercado y resistencia a una o más enfermedades u organismos causantes de enfermedades seleccionados del grupo que consiste de: marchitez por Verticillium, nemátodos causantes de nudos radiculares, Virus del Mosaico del Tabaco, costra del pepino, mildiú pulverulento, Target spot, Virus del Mosaico del Pepino, marchitez por Fusarium, Virus de Mancha Anular de Papaya y Virus del Mosaico Amarillo del Zucchini (zapallo italiano).

En modalidades específicas, la selección de la primera progenie comprende identificar la presencia de uno o más de primeros marcadores genéticos en la primera progenie, que esté genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia al Mildiú velloso. En otra modalidad, la selección de la primera progenie comprende, además, seleccionar la progenie basado en la presencia de una pluralidad de marcadores genéticos provenientes de la segunda planta del pepino presente en la progenie. En aún otras modalidades, el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de los marcadores CAPs_21826, CAPs_ENK60, CAPs_ENK59, CAPs_17170, CAPs_ 7179, CAPs_18229, CAPs_17563/66 y CAPs_ENK70.

En ciertas modalidades, el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de CAPs_ENK60, CAPs_17170 y CAPs_17563/66.

En una modalidad adicional, el método comprende, además, el paso de: (c) cruzar la progenie de la planta consigo misma o con una tercera planta para producir una progenie de plantas de una generación subsiguiente. En otra modalidad, el procedimiento comprende, además, los pasos de: (d) cruzar la progenie de plantas de la generación subsiguiente consigo mismas o con una segunda planta; y (e) repetir los pasos (c) y (d) durante 3-10 generaciones adicionales para producir una planta pura de pepino derivada de la planta de pepino con acceso PI197088. En una modalidad, el procedimiento puede definirse como uno en el cual dichas plantas de progenie de una generación subsiguiente se seleccionan para cruzamiento basado en la presencia de resistencia al Mildiú velloso y al rasgo deseado. En ciertas modalidades, las plantas de la progenie en una generación subsiguiente se seleccionan en cada generación para cruzamiento basado en la presencia de la resistencia al Mildiú velloso y al rasgo deseado. En otras modalidades, el procedimiento puede definirse como uno en el cual la selección de plantas de la progenie de una generación subsiguiente comprende identificar la presencia de uno o más primeros marcadores genéticos en la primera progenie, que estén genéticamente ligados a un locus que contribuye a la resistencia al Mildiú velloso. En modalidades particulares, la selección de la planta de la progenie de una generación subsiguiente comprende, además, seleccionar la progenie basado en la presencia de una pluralidad de marcadores genéticos provenientes de la segunda planta de pepino presente en la progenie. En otras modalidades, se repite el paso (e) un suficiente número de generaciones para obtener una línea pura de pepino que comprende resistencia al Mildiú velloso y también comprende los rasgos agronómicos de la segunda planta de pepino.

En otro aspecto, la invención provee una planta producida por el procedimiento, en que se repite el paso (e) un número suficiente de generaciones para obtener una línea pura de planta de pepino que comprende resistencia al Mildiú velloso y también los rasgos agronómicos de la segunda planta de pepino.

En aún otro aspecto, se provee una semilla de una línea de pepino seleccionada del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY y GPN33-1093GY, muestras representativas de semillas de dichas líneas se han depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953, y Número de Acceso ATCC PTA-8954. Las semillas y plantas de los mismos de las líneas, 03/8020-20 TUP03 DMFL 1, 03/8024-19 TUP03 DMFL 1 y 03/8039-5 TUP03 DMFL 1 también se proporcionan En aún otro aspecto, la invención provee un cultivo de planta proveniente de semilla de una línea de pepinos que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024- 19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1. También, la invención provee una parte de tal planta. En ciertas modalidades, la parte de la planta se selecciona del grupo que consiste de una hoja, fruto, polen, óvulo y una célula.

En aún otro aspecto, la invención provee una planta de pepino o parte de la misma, que tiene todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de pepino seleccionada del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1.

Otro aspecto de la invención provee un cultivo de tejidos de células regenerables de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1. En ciertas modalidades, el cultivo de tejidos comprende células o protoplastos provenientes de una parte de planta que se selecciona del grupo que consiste de embriones, meristemas, cotiledones, polen, hojas, anteras, raíces, extremos de raíces, pistilos, flores, semillas y tallos. También, la invención provee una planta de pepino regenerada desde el tejido, en que la planta regenerada expresa todas las características fisiológicas y morfológicas de una planta que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024- 19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1.

En otro aspecto, la invención provee un procedimiento para producir semillas de pepino, que comprende cruzar la planta seleccionada del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 consigo misma o con una segunda planta de pepino. En una modalidad, la semilla es una semilla híbrida F1. En otro aspecto, la invención provee una planta híbrida F1 producida por el cultivo de la semilla.

En aún otro aspecto, la invención provee un procedimiento para producir semilla de una línea de plantas de pepino ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , que comprende los pasos de: (a) cruzar una planta de pepino de una línea que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154- 021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , con una segunda planta de pepino; y (b) permitir que se formen semillas derivadas de una línea de plantas de pepino ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1.

En un aspecto adicional, la invención provee un procedimiento para propagar vegetativamente una línea de plantas de pepino ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , que comprende los pasos de: (a) recolectar tejido capaz de ser propagado desde una planta según la reivindicación 16; (b) cultivar ese tejido para obtener brotes proliferados; y (c) hacer arraigar esos brotes proliferados para obtener plántulas enraizadas. En una cierta modalidad, el procedimiento además comprende hacer crecer plantas desde esas plántulas enraizadas.

En aún otra modalidad, se provee un procedimiento para introducir un rasgo deseado dentro de una línea de pepino, que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1, 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , que comprende (a) cruzar una planta de una línea seleccionada del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , con una segunda planta de pepino que comprende un rasgo deseado, para producir una progenie F1 ; (b) seleccionar una progenie F1 que comprende el rasgo deseado; (c) cruzar la progenie F1 seleccionada con una planta de una línea seleccionada del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039- 5_TUP03_DMFL_1 , para producir una progenie de retro-cruza; (d) seleccionar la progenie de retro-cruza que comprende al rasgo deseado y la característica fisiológica y morfológica de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; y (e) repetir los pasos (c) y (d) tres o más veces en sucesión, para producir una cuarta progenie o superior de retro-cruza que comprende al rasgo deseado. Otra modalidad de la invención es una planta de pepino producida por tal procedimiento.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir una línea de planta de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , que comprende un rasgo deseado agregado, el procedimiento comprende introducir un transgén que confiere el rasgo deseado dentro de una planta de pepino de una línea que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1.

Aún otro aspecto de la invención provee una planta de una línea de pepino que exhibe uno o más rasgos que se seleccionan del grupo que consiste de: resistencia a la Mancha angular de la hoja, Antracnosis raza 1 , Costra (sarna) del Pepino, Mildiú velloso, Mildiú Pulverulento, Mancha Anular de Papaya, Mosaico Amarillo del Zucchini, Virus del Mosaico del Pepino y " frutos de calidad aceptable por el mercado, en que la combinación de rasgos se controla por medios genéticos para la expresión de tal uno o más rasgos encontrados en la línea de pepino seleccionada del grupo que consiste de: ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1. Una semilla de una planta producida por tal procedimiento es otra modalidad de la invención.

La invención también provee, en otro aspecto, un procedimiento para determinar el genotipo una línea de plantas de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1, que comprende obtener una muestra de ácidos nucleicos desde dicha planta y detectar en dichos ácidos nucleicos una pluralidad de polimorfismos. En modalidades particulares, el procedimiento comprende, además, el paso de almacenar los resultados del paso de detección de la pluralidad de polimorfismos, en un medio legible por computador.

Así, el medio legible por computador producido por la obtención de una muestra de ácidos nucleicos desde dicha planta, detectando en dichos ácidos nucleicos una pluralidad de polimorfismos y almacenando los resultados del paso de detección de la pluralidad de polimorfismos en un medio legible por computador es otro aspecto de la invención.

En aún otro aspecto, la invención provee un procedimiento para producir pepinos que comprende: (a) obtener una planta de la presente invención, en que la planta se ha cultivado hasta la madurez; y (b) recolectar los pepinos desde la planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra un mapa genético (izquierda) y un gráfico LOD (derecha) para efectos de marcadores en reacción de Mildiú velloso en 148 familias F3, desde la población de pepinos L088 (Lucinde x Pl 197088). Las líneas entre el mapa genético y el gráfico LOD proveen posiciones de referencia para tres de los marcadores, para ayudar en las comparaciones de posición en el mapa y marcación LOD.

La figura 2 ilustra datos de resistencia al Mildiú velloso para ciertos marcadores adicionales en una región QTL identificada que contribuye a la resistencia al Mildiú velloso, mostrando correlación entre resistencia al DM y posición del marcador.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención provee plantas de pepino y, en particular, líneas de pepino {Cucumis sativus) que tienen resistencia al Mildiú Velloso (DM). Tales líneas de pepino pueden designarse como variedades de pepino resistentes al DM. También se provee los procedimientos para producir las líneas de pepino resistentes a DM. También se describe aquí los marcadores moleculares que están ligados a loci de rasgos cuantitativos, que contribuyen a la resistencia al DM e híbridos F1 de plantas de pepino resistentes a DM. A través del uso de los marcadores, una persona con entrenamiento en el arte puede aumentar el grado de resistencia al DM en plantas selectas de pepino, para una predisposición aumentada a la resistencia al DM. Los QTLs identificados en esta forma pueden combinarse con uno o más de otros QTLs que también contribuyen a la resistencia al DM, según se desee.

Las plantas de pepino resistentes al DM de la presente invención pueden llevar uno o más alelos que confieren resistencia al DM, que se han introducido dentro de los pepinos desde una línea designada Pl 197988 que comprende la resistencia al DM, pero que de otra forma comprende características agronómicas pobres. Las plantas de pepino resistentes al DM resultantes de la presente invención exhiben, sorprendentemente, rasgos agronómicos de élite, en combinación con la resistencia al DM, mientras carecen de rasgos deletéreos.

Las plantas de pepino resistentes al DM pueden tener hojas grandes que forman un dosel sobre el fruto. La enredadera es típicamente indeterminada y crece sobre espalderas o sobre el suelo. Las plantas de pepino resistentes al DM pueden tener hojas verde oscuro, verdes, verde claro a amarillas y, ocasionalmente, amarillas a marrón. Las hojas de las plantas de pepino resistentes al DM varían en tamaño, pero típicamente tienen 200-250 mm de largo y 150-200 mm de ancho y, usualmente, son simples, alternas, palmeadas y lobuladas.

Los frutos maduros de plantas de pepino resistentes al DM de la presente invención pueden variar desde verde claro a verde mediano o aún verde oscuro y, típicamente, el color de un fruto individual varía desde un color más claro en el lado floral, hasta un color más oscuro en el lado del pecíolo. El color puede estar moteado con pecas amarillas. El fruto del pepino resistente al DM es, típicamente alargado y cilindrico con extremos redondeados o romos, pero también puede ser recto o curvado, y usualmente de 25-30 cm de largo a madurez de cosecha, aunque el fruto puede ser comestible a los 11-14 cm. Típicamente, la piel del fruto puede ser lisa, áspera y gruesa; la piel puede ser dura o blanda con un número variado de tubérculos. La carne del fruto usualmente es de color crema, con o sin franjas y con un sabor libre de amargor.

Como se usa aquí, una "planta de pepino testigo susceptible" se refiere a una planta de pepino susceptible al Mildiú velloso (susceptible al DM), que incluye parientes comercialmente disponibles y silvestres de las plantas modernas de pepino. En un aspecto, la planta de pepino testigo susceptible es la variedad MARAM, SMR58 o SPRINT 440. También puede utilizarse una "planta de pepino testigo resistente" al evaluar variedades de pepino resistentes a DM. En una modalidad, tal testigo es una planta de pepino no susceptible al DM, pero que es agrícolamente indeseable, por ejemplo, la variedad Pl 197088. Similarmente, algunos testigos pueden tener resistencia intermedia, por ejemplo, testigos con resistencia intermedia al DM pueden ser DMP21 , GP14, LLP-1 o POINSETT 76. Como se describe aquí, una línea testigo de pepino se hace crecer bajo condiciones medioambientales similares a las de la línea de pepino a comparar, de acuerdo con la presente descripción.

Como se usa aquí, una "planta híbrida de pepino" incluye a una planta resultante, directa o indirectamente, de cruzamientos entre poblaciones, cepas o cultivares dentro de la especie Cucumis sativus. También como se usa aquí, una "planta híbrida de pepino" se refiere también a plantas resultantes, directa o indirectamente, de cruzamientos entre diferentes variedades o genotipos.

Como se usa aquí, un "progenitor femenino" se refiere a una planta de pepino que recibe polen de una línea macho-donante, tal polen poliniza exitosamente a un óvulo. El progenitor femenino puede ser cualquier planta de pepino que sea receptora de polen. Tales progenitores femeninos pueden ser, por ejemplo, macho-estériles debido a macho-esterilidad génica, citoplásmica o debido a que se han sometido a emasculación manual de los estambres. La macho-esterilidad génica o citoplásmica puede manifestarse de diferentes maneras, tales como polen estéril, flores malformadas o sin estambres, esterilidad posicional y esterilidad funcional.

Como se usa aquí, la "macho-esterilidad citoplasmática" se refiere a plantas que no son usualmente capaces de reproducirse por auto-fecundación, pero capaces de reproducirse por fecundación cruzada.

Como se usa aquí, "ligación" es un fenómeno en el cual los alelos en el mismo cromosoma tienden a segregar juntos más a menudo que lo esperable por azar, sí su transmisión fuera independiente.

Como se usa aquí, un "marcador" es un indicador de la presencia de uno o más fenotipos, genotipos o polimorfismos. Los marcadores incluyen, pero sin que sea limitación, polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), secuencias polimórficas divisibles amplificadas (CAPs), polimorfismos con largo de fragmento amplificado (AFLPs), polimorfismos con largo de fragmento de restricción (RFLPs), repeticiones de secuencias simples (SSRs), inserciones/eliminaciones (INDEL(s)), repeticiones de secuencias inter-simples (ISSR) y secuencias polimórficas de ADN amplificadas al azar (RAPD). Preferiblemente, un marcador se hereda en forma co-dominante (ambos alelos en un locus en un heterocigoto diploide son fácilmente detectables), sin un componente de vahanza medioambiental, es decir, heredabilidad de 1. Como se usa aquí, un "marcador de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico capaz de ser un marcador para detectar un polimorfismo, fenotipo o ambos, asociado con resistencia al DM.

Como se usa aquí, una "característica deseable" o "rasgos deseables" que pueden introducirse por cruzamiento dentro de plantas de pepino resistentes al DM puede estar dirigida al fruto o a la planta de pepino. Los rasgos deseables a introducir dentro de plantas y frutos de pepino pueden seleccionarse independientemente. Los rasgos deseables del fruto del pepino que pueden seleccionarse independientemente incluyen, pero sin que sea limitación: tamaño, forma, color, apariencia superficial, número de semillas, tamaño de semillas, número de lóculos, espesor del pericarpio y aspereza del fruto; sabor, amargor, presencia de tubérculos y vida en almacenamiento. Los rasgos deseables de plantas de pepino que pueden seleccionarse independientemente incluyen, pero sin que sea limitación: vigor de la planta, forma de la hoja, largo de la hoja, color de la hoja, altura de la planta, sí la planta es o no determinada, época de madurez, adaptación al cultivo en el campo, adaptación a cultivo en invernadero y resistencia a una o más enfermedades o a organismos causantes de la enfermedad tales como la marchitez causada por Verticillium, nemátodos causantes del nudos en raíces, Virus del Mosaico del Tabaco, sarna del Pepino, Antracnosis raza 1 , mildiú pulverulento, (es decir, el causado por Erysiphe cichoracearum o Sphaerotheca fuliginea), Target spot, Virus del Mosaico del Pepino y marchitez por Fusaríum. Cualquier combinación de rasgos deseables del fruto del pepino, rasgos de la planta del pepeno o rasgos de la planta y fruto del pepino pueden combinarse con un rasgo de resistencia al DM.

La resistencia al DM de una planta de pepino provista aquí puede definirse potencialmente como resistencia total o parcial. La resistencia al DM de una planta de pepino provista aquí puede medirse por cualquier medio disponible en el arte.

En un aspecto, la resistencia al DM de una planta de pepino se determina usando un puntaje de enfermedad por desarrollo de lesiones cloróticas y/o necróticas, después de inoculación o infección con DM en hojas de pepino, usando una escala de síntomas de 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% y más de 60% de la lesión cubriendo el área foliar. Un puntaje de 0% en al enfermedad indica una planta completamente resistente.

En otro aspecto, la resistencia al DM se determina obteniendo puntajes de la enfermedad por desarrollo de síntomas después de una o más tandas de inoculación o infección con DM en hojas y/o cotiledones de pepino. La resistencia en una prueba de hojas puede calibrarse en la escala: Valor del índice Síntomas 1 Ausencia de síntomas 2 Pocas lesiones necróticas pequeñas con expansión limitada 3 Pocas lesiones cloróticas y algunas lesiones necróticas con expansión limitada 4 Gran clorosis con expansión angular, con lesiones necróticas limitadas 5 Gran clorosis con expansión angular con lesiones necróticas expandidas Las pruebas se evalúan una vez que se han desarrollado los síntomas en testigos susceptibles (es decir, cultivares Maram o SMR58). La línea Pl 197088 puede usarse como testigo "resistente"; el cultivar Poinsett 76 puede usarse como testigo para evaluar niveles "intermedios" de resistencia/susceptibilidad a P. cubensis. Se efectúan tres observaciones en cada parcela, una en cada extremo y una en el medio. Se calcula el índice promedio de enfermedad para cada parcela. Esos se promedian para las tres repeticiones y se determina la desviación estándar. Se determina el índice de enfermedad que varía para las categorías "Resistente", "Resistencia Intermedia" y "Susceptible". En general, se prueba varias veces las variedades antes de hacer una determinación final de resistencia a la enfermedad. índices de 1-5 indican niveles variables de resistencia o susceptibilidad. Un puntaje de 1-2 después de una o más tandas de inoculación o infección y, preferiblemente dos o más tandas de infección, indica una planta resistente. Un puntaje de 3 después de una o más tandas de inoculación o infección, preferiblemente dos o más tandas de infección, indica una planta con resistencia intermedia. Un puntaje de 4-5 indica una planta susceptible. Los puntajes en esta escala de 1-5 se correlacionarían con una escala de 1-9, en que 1=1 , 2=3, 3=5, 4=7 y 5=9.

En un aspecto de la invención, se analiza una planta por resistencia al DM, resistencia parcial o susceptibilidad, por análisis de imagen de tejido foliar, usando alrededor de tres hojas por planta, capturadas en una imagen digital. Se efectúa el análisis de imagen para determinar el porcentaje de tejido dañado y derivar una calificación de la enfermedad. El software de análisis de imagen y los procedimientos usados para cuantificar diferencias visuales en dos o tres dimensiones son aquellos establecidos en Bright, 1987 (J. Microspcopy 148:51-87) y Bickmore y colaboradores, 1999 (Geol. Mat. Res. 1 (5): 1-19). Con respecto a análisis de imagen: las "muy resistentes" exhiben desde alrededor de 0% y 5% del área foliar de síntomas con lesiones cloróticas y/o necróticas; las "resistentes" están entre 1% y 20% del área foliar con síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas; las "substancialmente resistentes" están entre 20% y 30% del área foliar con síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas; las "medianamente resistentes" están entre 40% y 50% del área foliar con síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas; las "parcialmente resistentes" tienen menos o el 50% del área foliar con síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas; las "medianamente susceptibles" tienen entre 50% y 60% del área foliar con síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas; y las "susceptibles" tienen entre 60% y 100% del área foliar con síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas. Una planta resistente puede caracterizarse por otros aspectos, como se establece aquí o por el uso de otros medios tales como PCR cuantitativo, para determinar el nivel de infección.

Las líneas de pepino que tienen resistencia o resistencia parcial al DM demuestran un nivel reducido de síntomas en relación con una línea testigo no-resistente de pepino, después de la inoculación o infección con DM. El nivel de síntomas puede usarse como un indicador de la resistencia al DM. Los síntomas de enfermedad medidos pueden ser síntomas de cualquier enfermedad asociada con infección por DM. Los síntomas pueden seleccionarse del grupo que consiste de ampollas foliares, necrosis, frutos blandos, mosaico, venas cloróticas, manchas foliares cloróticas, mosaico clorótico y/o verde claro en hojas, lesiones en frutos o combinaciones de los mismos. En un aspecto, una línea de pepino resistente al DM demuestra una reducción de los síntomas foliares de lesiones cloróticas y/o necroticas de al menos o mayor que 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% en relación con una línea de pepino testigo no-resistente. En otros aspectos, las hojas de una planta de pepino resistente al DM demuestran menos de 15% o menos de 10% o menos de 5% o menos de 2% de área con síntomas, cuando se la expone al DM. En otro aspecto, la planta de pepino pertenece a una variedad de pepino o cultivar y, en otro aspecto, la planta de pepino es una línea pura de la planta de pepino.

En otro aspecto, las plantas y variedades de pepino provistas aquí demuestran poco o ningún síntoma de lesiones cloróticas y/o necroticas después de inoculación o infección con DM. En algunos aspectos, una planta de pepino resistente al DM demuestra síntomas de lesiones cloróticas y/o necroticas en menos del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% del área superficial de la hoja de pepino.

Las plantas de pepino resistentes al DM pueden exhibir un retraso en el inicio de los síntomas de lesiones cloróticas y/o necroticas, en relación con una planta de pepino testigo no-resistente. En algunas modalidades, las plantas de pepino resistentes al DM exhiben un retardo de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 o más días en el inicio de los síntomas de lesiones cloróticas y/o necroticas, en relación con una planta de pepino testigo. En otras modalidades, las plantas de pepino resistentes al DM exhiben un retardo de al menos 7 o más días, 10 o más días o 14 o más días, en el inicio de los síntomas de lesiones cloróticas y/o necróticas, en relación con una planta de pepino testigo.

En un aspecto, la planta de pepino es una plántula al momento de la inoculación o infección. En algunos aspectos, la planta de pepino es una plántula en la etapa de desarrollo de 4, 5, 6, 7 u 8 hojas cuando se la inocula. En un aspecto, los síntomas de la enfermedad pueden medirse en cualquier momento después del desafío patogénico de una planta de pepino. En otros aspectos, los síntomas pueden medirse a los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más días después de la inoculación. En otro aspecto, la planta de pepino tiene cualquier edad en el momento de la inoculación o infección.

En otro aspecto, los síntomas de enfermedad pueden observarse después del desafío con DM en una planta completa o parte de la misma, por ejemplo, un esqueje.

Las plantas de pepino resistentes al DM de la presente invención pueden exhibir un aumento en el rendimiento de frutos después de inoculación o infección con DM, en relación con una planta de pepino testigo inoculada con DM. En un aspecto, las plantas de pepino resistentes exhiben un aumento de 2%, 5%, 10%, 15%, 20% o mayor de rendimiento de frutos, basado en la masa total, número o volumen total de frutos, en relación con una planta de pepino testigo, después de una o más tandas de inoculación o infección con DM.

La presente invención provee e incluye plantas de pepino que exhiben resistencia a una o más razas de DM. En algunas modalidades, las plantas de pepino de la presente invención exhiben resistencia a 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más razas de DM.

La presente invención provee una semilla de planta de pepino capaz de producir una planta con resistencia al DM. En un aspecto, la planta de pepino puede ser una variedad de polinización abierta, una línea» pura de progenitor híbrido o una línea macho-estéril. En otro aspecto, la invención provee semillas de una planta de pepino capaces de producir una planta híbrida de pepino que tiene resistencia al DM.

Las plantas de pepino de la presente invención pueden ser líneas de pepino adaptadas para producción de pepinos de invernadero o de campo. En un aspecto, las plantas de pepino de la presente invención están adaptadas para la producción de pepinos de invernadero.

También, la presente invención provee un pepino híbrido con resistencia al DM. En otro aspecto, la presente invención provee un pepino híbrido que exhibe resistencia al DM después de inoculación o infección con DM.

Las plantas de pepino comercialmente valiosas representan un aspecto de la presente invención. En un aspecto, ciertas características del pepino, incluyendo por ejemplo, tamaño, forma, color, peso, sabor y rendimiento del fruto pueden ser importantes para el valor comercial del cultivo. El tamaño y forma del fruto pueden ser de particular interés sí los pepinos se cultivan para procesamiento, tal como encurtidos. La presente invención provee una planta de pepino que produce un fruto de pepino con un largo de alrededor de 11, 12, 13 o 14 cm o mayor. En otro aspecto, la planta de pepino de la presente invención produce un fruto de pepino con un largo entre aproximadamente 11 y 13 cm, 12 y 14 cm y 11 y 14 cm.

En algunos aspectos, una planta de pepino de la presente invención puede producir un fruto de pepino con un peso a la cosecha de alrededor de 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 y 125 gramos o mayor. En otros aspectos, la planta de pepino de la presente invención produce un fruto del pepino con un peso a cosecha entre alrededor de 80 hasta alrededor de 125 gramos, desde alrededor de 90 hasta alrededor de 115 gramos, desde alrededor de 100 hasta alrededor de 120 gramos, desde alrededor de 90 hasta alrededor de 125 gramos, desde alrededor de 95 hasta alrededor de 125 gramos, desde alrededor de 100 hasta alrededor de 125 gramos o desde alrededor de 115 hasta alrededor de 125 gramos. El peso del fruto se mide pesando frutos individuales en una balanza.

Los frutos maduros de pepino producidos por plantas resistentes al DM de la presente invención pueden tener un diámetro desde alrededor de 10, 11 , 12, 13 o 14 mm o mayores. En algunas modalidades, el diámetro del fruto del pepino puede variar desde alrededor de 10 hasta alrededor de 11 mm o desde alrededor de 10 hasta alrededor de 12 mm o desde alrededor de 11 hasta alrededor de 13 mm o desde alrededor de 12 hasta alrededor de 14 mm o desde alrededor de 13 hasta alrededor de 14 mm.

Un atributo del fruto del pepino tal como forma, peso o tamaño puede medirse o evaluarse en una variedad de momentos. En un aspecto, un atributo se mide después del cultivo en una cámara de cultivo. En otro aspecto, un atributo se mide al momento de la cosecha. En aún otro aspecto, un atributo se mide después del almacenamiento del fruto del pepino en condiciones ambientales durante uno, dos, tres cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece días, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas o cinco semanas después de cosecha.

En una modalidad, un fruto del pepino de una planta de pepino con resistencia al DM tiene una clasificación de calidad global de frutos de 1 , 3, 5, 7 o 9, en que la calidad de frutos se mide por inspección visual, con una escala simple que varía desde 1= excelente hasta 9 = pobre: Los puntajes 1 = excelente, 3 = sobre el promedio, 5 = promedio, 7 = bajo el promedio, 9 = pobre; en comparación con el híbrido estándar comercial cultivado en el área. La Calidad del Fruto se refiere a color, forma, largo y diámetro del fruto.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a cultivos de tejido de las plantas de pepino aquí descritas. Como se usa aquí, el término "cultivo de tejido" indica una composición que comprende células aisladas de uno o más tipos o una colección de tales células organizadas en partes de una planta. El cultivo de tejidos incluye, pero sin estar limitado a, composiciones que comprenden protoplastos y callos. También, los cultivos de tejido incluyen, pero sin que sea limitación, composiciones que comprenden células de plantas que están presentes en tejidos intactos de plantas o partes de plantas, tales como embrión, hoja, pedúnculo, pedicelo, antera, meristemas, ápice y segmentos de raíz, muñón y tallo, explantes y similares. En un aspecto, un cultivo de tejido comprende embriones, protoplastos, células meristemáticas, polen, hojas, anteras o células derivadas desde tejidos inmaduros de esas partes de plantas. Los medios para preparar y mantener cultivos de tejidos vegetales son bien conocidos en el arte. Los ejemplos de procesos de cultivo de tejidos y regeneración de pepinos están descritos, por ejemplo en Fillatti y colaboradores, 1987 (Bio/Technology, 5:726-730). En algunos aspectos, el cultivo de tejido de plantas de pepino descrito aquí se refiere al cultivo de protoplastos, callos o células de plantas que se aislaron desde o están presentes en partes intactas de las plantas resistentes al DM aquí descritas. En otro aspecto, el cultivo de tejidos se refiere al cultivo de protoplastos, callos o células de plantas que se aislaron desde o están presentes en partes intactas de plantas de una o más líneas de la planta de pepino resistentes al DM, seleccionadas del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 y la progenie resistente al DM de las mismas, incluyendo aquellas producidas por cruzamientos o retro-cruzamientos. En aún otro aspecto, el cultivo de tejido de plantas de pepino aquí descrito, se refiere al cultivo de protoplastos, callos o células de plantas que se aislaron desde o están presentes en partes intactas de plantas resistentes al DM aquí descritas.

Una vez producidas las plantas resistentes al DM, las plantas mismas pueden cultivarse de acuerdo con procedimientos convencionales. Puede obtenerse la progenie resistente al DM a través de reproducción sexual. Las semillas resultantes de la reproducción sexual pueden recuperarse desde frutos de plantas resistentes al DM y plantadas o cultivadas como medios de propagación. La progenie resistente al DM también puede obtenerse desde plantas resistentes al DM a través de reproducción asexual. Los protoplastos o propágulos (es decir, esquejes, mugrones o raíces) pueden recuperarse desde plantas resistentes al DM o partes de las mismas y pueden emplearse para propagar plantas resistentes al DM.

La presente invención también provee e incluye un contenedor de semillas de pepino, en el cual las plantas de pepino cultivadas desde más del 50% de las semillas tienen resistencia o resistencia parcial al DM. En otro aspecto, las plantas de pepino cultivadas desde más del 55%, 65%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las semillas de pepino del contenedor tienen resistencia al DM. Otro aspecto de la invención se refiere a semillas de una planta de pepino seleccionada del grupo que consiste de todas las líneas depositadas, como se refirió previamente y la progenie resistente al DM de las mismas, en que las plantas de pepino cultivadas desde alrededor del 50% o desde más del 50% de las semillas tienen resistencia o resistencia parcial al DM.

El contenedor de semillas de pepino puede contener cualquier número, peso o volumen de semillas. Por ejemplo, puede contener desde alrededor de 10, 25, 50, 200, 400, 700, 1.000, 2.000, 3.000 o más semillas. En otro aspecto, el contenedor puede contener desde alrededor de 1 , 5, 10, 15, 25, 100, 250, o 1.000 gramos de semilla. Alternativamente, el contenedor puede contener desde alrededor de 0.028, 0.056, 0.113, 0.226, 0.28, 0.453, 0.90, 1.81 , 3.62 o 5.43 o más kg de semilla.

Los contenedores de semillas de pepino pueden ser cualquiera disponible en el arte. Por ejemplo, un contenedor puede ser una caja, una bolsa, un paquete, una valija, un rollo de cinta, una lámina delgada, una lata o un tubo.

La presente invención incluye y provee un contenedor de frutos de pepino provenientes de plantas del pepino con resistencia al DM. En un aspecto, el contenedor contiene desde alrededor de 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100 o más frutos de pepino. En aún otro aspecto, la presente invención provee una enredadera de pepino que tiene frutos del pepino provenientes de una planta con resistencia al DM.

Un aspecto de la invención se refiere a frutos de pepinos secos o procesados de otra forma, producidos por una planta de pepino que tiene un genoma que comprende uno o más locus genéticos que dan origen a resistencia al DM, cuando se expresan en una planta de pepino. Los frutos procesados de pepino incluyen, pero sin estar limitados a pulpa del fruto, pepinos en compota, enlatados, encurtidos, picados, rebanados o estrujados. En algunos aspectos, los frutos de pepino secos, encurtidos, o procesados de otra forma son el fruto de plantas de pepino que se seleccionan de una o más del grupo que consiste de todas las líneas depositadas como se refirió previamente y las progenies resistentes al DM de las mismas.

La presente invención provee una planta de pepino de línea pura que tiene resistencia al DM, en que la resistencia se exhibe cuando la planta está en contacto con el DM. En un aspecto, la planta de pepino de línea pura deriva del acceso Pl 1907088.

La presente invención incluye y provee plantas de C. sativus que tienen uno o más alelos para la característica de resistencia al DM. Las plantas de pepino resistentes al DM pueden se heterocigotas u homocigotas para la característica de resistencia al DM. En una modalidad, la característica de resistencia al DM puede estar ligada a variaciones en un gen simple (es decir, ligadas a uno o más alelos en un solo gen). En otra modalidad, la característica de resistencia al DM puede estar ligada a variaciones en uno o más de un locus de característica cuantitativa (QTL). En aún otra modalidad, las plantas de pepino resistentes al DM son homocigotas para la característica de resistencia al DM.

La presente invención provee una planta de pepino de C. sativus con un genoma que comprende uno o más locus genéticos que proveen resistencia al DM desde una planta no-C. sativus. En algunos aspectos, la planta de pepino resistente al DM se selecciona del grupo que consiste de todas las líneas depositadas, anteriormente referidas y a la progenie resistente al DM de las mismas. En un aspecto, el locus genético derivado desde una planta de pepino resistente al DM puede identificarse usando marcadores genéticos.

La presente invención provee una planta de pepino de C. sativus resistente a DM que tiene menos o igual al 50% de su genoma derivado de una planta no-C. sativus resistente al DM. En otro aspecto, una planta de pepino de C. sativus resistente al DM puede tener 50%, 25%, 12.5%, 6%, 3% o menos ADN nuclear derivado de una planta no-C. sativus resistente al DM. En otros aspectos, una planta de C. sativus resistente al DM puede tener 50%, 25%, 12.5%, 6% o 3% o menos de su ADN nuclear derivado desde otro miembro del género Cucumis que sea resistente al DM.

La presente invención provee progenies de plantas de pepino con resistencia al DM. Como se usa aquí, la progenie incluye no solo, sin limitación, a los productos de cualquier cruzamiento (sea retro-cruzamiento o de otra forma) entre dos plantas, sino a todas las progenies cuyo pedigrí se retro-traza al cruzamiento original. En un aspecto de la presente invención, la progenie contiene desde alrededor de 50%, 25%, 12.5% o menos ADN nuclear proveniente de una planta de pepino resistente al DM y expresa al material genético que provee resistencia al DM.

Una modalidad de la presente invención provee una planta de pepino resistente al DM, que contiene un marcador genético ligado a uno o más locus de resistencia al DM. El "locus de resistencia al DM" significa un locus que contribuye a la resistencia al DM, tanto solo como en combinación con uno más de otro locus de resistencia al DM. "Contribuye a la resistencia al mildiú velloso" significa que el grado de resistencia al mildiú velloso se aumenta en la planta correspondiente, tanto cuando el locus está solo como en combinación con uno o más otros locus.

En una modalidad de la invención, un marcador ligado a uno o más loci de resistencia al DM incluye uno o más de los siguientes: CAPs_21826, CAPs_ENK60, CAPs_ENK59, CAPs_17170, CAPs_17179, CAPs_ 8229, CAPsJ 7563/66 y CAPs_ENK70. En otra modalidad de la invención, los marcadores ensayados, ligados a uno o más loci de resistencia al DM incluyen a cada uno de los siguientes: CAPs_ENK60, CAPs_17170 y CAPs_17563/66.

Como se usa aquí, la ligación de dos secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo un marcador de secuencia de ácido nucleico y una secuencia de ácido nucleico de un locus genético impartiendo un rasgo deseado tal como resistencia al DM, puede ser genético o físico o ambos. En un aspecto de la invención, el marcador de ácido nucleico y el locus genético que confiere resistencia al DM están genéticamente ligados y exhiben un puntaje LOD mayor de 2.0, a juzgar por el intervalo mapeado para el rasgo de resistencia al DM basado en los métodos de máxima probabilidad descritos por Lander y Botstein, 1989 (Genetics, 121 :185-199) e implementado en el paquete de software MAPMAKER (por ejemplo, Lander y colaboradores, Genomics 1 :174-1812, (1987); parámetros por defecto). En otras modalidades, el marcador y la región que confiere resistencia al DM están genéticamente ligados y exhiben un puntaje LOD mayor de 3.0 o un puntaje LOD mayor de 6.0, 9.0, 12.0, 15.0 o 18.0. En una modalidad, el marcador y la región que contribuye a la resistencia al DM están genéticamente ligados y exhiben un puntaje LOD entre alrededor de 14 y alrededor de 20.

En otro aspecto, el marcador de ácido nucleico está genéticamente ligado a una distancia entre 0 y alrededor de 50 centimorgans (cM) al locus de resistencia al DM. En otras modalidades, la distancia entre el marcador de ácido nucleico y el locus de resistencia al DM varía entre alrededor de 0 y alrededor de 35 cM o entre alrededor de 0 y alrededor de 25 cM o entre alrededor de 0 y alrededor de 15 cM o entre alrededor de 0 y alrededor de 10 cM o entre alrededor de 0 y alrededor de 5 cM, incluyendo menos de alrededor de 4, 3, 2 o 1 cM.

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico puede estar físicamente ligada al locus de resistencia al DM. En algunos aspectos, el marcador de ácido nucleico se híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia que está dentro de alrededor de 30 Mbp o alrededor de 20 Mbp o alrededor de 15 Mbp o alrededor de 10 Mbp o alrededor de 5 Mbp de un locus de resistencia al DM.

Como se usa aquí, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse entre sí, si las dos moléculas son capaces de formar una estructura anti-paralela, de dos fibras de ácido nucleico. Las condiciones convencionales de estrictez están descritas por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Press, New York (1989) y por Haynes y colaboradores, Nucleic Acid Hybridization, A Practica! Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).

Por lo tanto, las separaciones de complementariedad completa son permisibles, mientras tales separaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble fibra. Así, para que una molécula de ácido nucleico sirva como partidor o sonda, solo necesita ser suficientemente complementaria en secuencia para ser capaz de formar una estructura estable de doble fibra bajo el particular solvente y concentración de sal usada.

Las condiciones de estrictez adecuadas que promuevan la hibridación del ADN, por ejemplo, 6.0 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45°C, seguida por un lavado de 2.0 X SSC a 50°C, son conocidas por los entrenados en el arte o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3-6. En algunas modalidades, las condiciones de hibridación pueden ser condiciones de alta, moderada o baja estrictez. Las condiciones preferidas incluyen aquellas que usan 50% de formamida, 5.0 X SSC, 1 % SDS e incubación a 42°C durante 14 horas, seguida por un lavado usando 0.2 X SSC, 1 % SDS e incubación a 65°C.

La especificidad de la hibridación puede afectarse por lavados post-hibridación. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede seleccionarse desde baja estrictez de alrededor de 2.0 X SSC a 50°C, hasta estrictez moderada de alrededor de 1.0 X SSC, a 50°C, hasta alta estrictez de alrededor de 0.2 X SSC a 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja estrictez a temperatura ambiente, alrededor de 22°C, hasta condiciones de estrictez moderada a alrededor de 50°C, hasta condiciones de alta estrictez a alrededor de 65°C. Ambas, la temperatura y la concentración de sal pueden variarse o, tanto la temperatura como la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras se cambia la otra variable. En algunos aspectos, el paso de lavado puede realizarse durante 5, 10, 15, 20, 25, 30 o más minutos. En otro aspecto, el paso de lavado se efectúa durante alrededor de 20 minutos. En aún otro aspecto, el paso de lavado puede repetirse 1 , 2, 3, 4 o más veces usando la concentración de sal seleccionada, temperatura y tiempo. En otro aspecto, el paso de lavado se repite dos veces.

El perfil de un marcador genético de una planta puede ser predictor de características agronómicas de un híbrido producido usando una línea pura. Por ejemplo, sí una planta de línea pura de perfil de marcador genético conocido y fenotipo se cruza con una segunda línea pura de perfil de marcador genético y fenotipo conocidos será posible predecir el fenotipo del híbrido F1 basado en los perfiles de marcador genético combinados de las líneas puras progenitoras. Los métodos de predicción del desempeño de híbridos desde datos de marcadores genéticos se discuten en la Patente de los EE. UU. N° 5.429.547, cuya descripción se incorpora aquí, específicamente por referencia, en su totalidad. Tales predicciones pueden hacerse usando cualquier marcador genético adecuado, por ejemplo, SSRs, INDELs, RFLPs, AFLPs, SNPs, ISSRs o isozimas.

Pueden utilizarse marcadores adicionales, tales como SSRs, marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, marcadores fenotípicos, SNPs, marcadores de isozimas o perfiles de transcripción de micro-disposición que están genéticamente ligados a o que se correlacionan con la resistencia al DM (Walton, Seed World 22-29 (Julio, 1993); Burow y Blake, Molecular Dissection of Complex Traits, 13-29, Eds, Paterson, CRC Press, New York (1988)). Los métodos para aislar a tales marcadores son conocidos en el arte. Por ejemplo, los SSRs locus-específicos pueden obtenerse seleccionando una biblioteca genómica de pepino por SSRs, secuenciación de clones "positivos", designando partidores que flanquean repeticiones y amplificando el ADN genómico con esos partidores.

La ligación genética de moléculas de marcador con resistencia al DM puede establecerse por un modelo de mapeo de genes tal como, sin que sea limitación, el modelo de marcador flanqueante y el mapeo del intervalo, basado en los métodos de máxima probabilidad descritos por Lander y Botstein, 1989 (Genetics, 121 :185-199) e ¡mplementados en el paquete de software MAPMAKER.

Se calcula un estimado de máxima probabilidad (MLE) para la presencia de un marcador, junto con un MLE asumiendo ningún efecto de característica para evitar falsos positivos. Luego, se calcula un log de una relación de probabilidades (LOD) como: LOD = log-?? (MLE para la presencia de una característica (MLE dado no ligado a característica)).

El puntaje LOD indica esencialmente cuanto más probable de surgir son los datos, asumiendo la presencia de un alelo de resistencia, más bien que en su ausencia. El valor del umbral de LOD para evitar un falso positivo, con una confianza dada, digamos 95%, depende del número de marcadores y del largo del genoma. En Lander y Botstein (1989) se establecen gráficos indicando umbrales LOD, adicionalmente descritos por Ars y Moreno-González, Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa (editores) Chapman & Hall, Londres, páginas 314-331 (1993).

La selección de poblaciones de mapeo o segregantes apropiadas son importantes en el mapeo de características. La selección de población de mapeo adecuada depende del tipo de sistemas de marcadores empleados (Tanksley y colaboradores, Molecular mapping plant chromosomes. Chromosome structure and function: Impact of New Concepts, J.P. Gustafson and R. Appels (editores), Plenum Press, New York, páginas 157-173 (1988)). Debe darse consideración a la fuente de progenitores (adaptados vs. exóticos) usados en la población mapeada. El apareamiento de cromosomas y las tasas de recombinación pueden disturbarse (suprimirse) severamente en cruzamientos amplios (adaptados vs. exóticos) y generalmente rinden distancias de ligación muy reducidas. Los cruzamientos amplios proveen usualmente poblaciones segregantes con una disposición relativamente grande de polimorfismos, cuando se las compara con progenie en cruzamientos estrechos (adaptados vs. adaptados).

Como se usa aquí, la progenie incluye, sin limitación, no solo a los productos de cualquier cruzamiento (sean retro-cruzas u otros) entre dos plantas, sino a toda la progenie cuyo pedigrí se remonte al cruzamiento original. Específicamente, tal progenie incluye, sin limitación, a plantas que tienen 50%, 25%, 12.5% o menos ADN nuclear derivado de una de las dos plantas originalmente cruzadas. Como se usa aquí, una segunda planta se deriva de una primera planta, sí el pedigrí de la segunda planta incluye a la primera planta.

La presente invención provee un complemento genético de las líneas de pepino aquí descritas. Además, se provee un complemento genético híbrido, en que el complemento se forma por la combinación de un complemento genético haploide desde líneas puras de élite de pepino aquí descritas y otro complemento genético haploide. Los medios para determinar tal complemento genético son bien conocidos en el arte.

Como se usa aquí, la frase "complemento genético" significa un agregado de secuencias de nucleótidos, cuya expresión define el fenotipo de una planta, tal como una planta de pepino C. sativus o una célula o tejido de esa planta. A modo de ejemplo, a una planta de pepino C. sativus se le establece su genotipo para determinar una muestra representativa de los marcadores heredados que posee. Preferiblemente, los marcadores se heredan en forma co-dominante, de manera que la presencia de ambos alelos en un locus diploide es fácilmente detectable y están libres de variación medioambiental, es decir, su heredabilidad es cercana o igual a 1. Este establecimiento del genotipo se efectúa preferiblemente en al menos una generación de la planta descendiente para la cual el valor numérico de la característica o características de interés también se determinan. La formación de genotipos de locus simples se expresa como un perfil de alelos marcadores, dos en cada locus de una planta diploide. La composición de marcadores alélicos de cada locus puede ser homocigota o heterocigota. La homocigocidad es una condición en que ambos alelos en un locus se caracterizan por las mismas condiciones del genoma en un locus (es decir, la misma secuencia de nucleótidos). La heterocigocidad se refiere a diferentes condiciones del genoma en un locus. Potencialmente, cualquier tipo de marcador genético podría usarse, por ejemplo, repeticiones de secuencias simples (SSRs), polimorfismo de inserción/eliminación (INDEL), polimorfismos de restricción del largo del fragmento (RFLPs), polimorfismos de largo ampliado del fragmento (AFLPs), polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) e isozimas.

Puede obtenerse considerable información genética desde una población F2 completamente clasificada, usando un sistema de marcador co-dominante (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen & Co., (1938)). Una población F2 es la primera generación de autopolinización o "sib" ("cruzamiento entre hermanos") después de que se produce una semilla híbrida. Generalmente una sola planta F1 se autopoliniza o sib para generar una población segregante para los genes codificados en el núcleo, en forma Mendeliana (1 :2:1).

En contraste con el uso de marcadores co-dominantes, el uso de marcadores dominantes a menudo requiere pruebas de progenie (es decir, F3 o retro-cruzas de familias autofecundadas) para identificar individuos heterocigotos. La información recolectada puede ser equivalente a la obtenida en una población F2 completamente clasificada. Sin embargo, este procedimiento es a menudo prohibitivo por el costo y tiempo consumidos en pruebas de progenie. Las pruebas de progenie de individuos F2 se usa a menudo en la construcción de mapas donde el error se asocia con el establecimiento del fenotipo de una sola planta o, cuando el muestreo de plantas para establecer sus genotipos afecta la capacidad de efectuar un establecimiento preciso de fenotipos o, donde la expresión de una característica está controlada por un QTL. La segregación de datos desde poblaciones de prueba de progenie (es decir, F3 o familias retro-cruzadas o autofecundadas) puede usarse en el mapeo de características. Luego, puede aplicarse la selección asistida por marcador a la progenie subsiguiente basada en asociaciones de mapa de marcador-característica (F2, F3), donde la ligación no ha sido completamente disasociada por eventos de recombinación (es decir, máximo desequilibrio).

Las líneas puras recombinantes (RlLs) (líneas genéticamente relacionadas; usualmente >F5) pueden usarse como población para mapeo. Las RlLs pueden desarrollarse autofecundando plantas F2, luego autofecundando las plantas F3 resultantes y repitiendo este proceso de autofecundación generacional aumentando, así la homocigocidad. La información obtenida desde marcadores dominantes puede maximizarse usando RlLs porque todos los loci son homocigotos o casi homocigotos. Bajo condiciones de ligación estrecha (es decir, alrededor de <10% de recombinación) los marcadores dominantes y co-dominantes evaluados en poblaciones RIL proveen más información por individuo que cualquier tipo de marcador en poblaciones retro-cruzadas (Reiter y colaboradores, 1992; Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:1477-1481 ). Sin embargo, a medida que la distancia entre marcadores se hace mayor (es decir, los loci se hacen más independientes), la información en poblaciones RIL disminuye dramáticamente en comparación con marcadores co-dominantes.

Las poblaciones de retro-cruza pueden utilizarse como poblaciones para mapeo. Una población de retro-cruza (BC) puede crearse cruzando una Fi con uno de sus progenitores. Típicamente, las poblaciones de retro-cruza se crean para recuperar características deseables (que pueden incluir a la mayoría de los genes) desde uno del parental recurrente (el progenitor que se emplea en la retro-cruza) mientras se agrega una o unas pocas características del segundo parental, que a menudo se designa como el donante. Puede hacerse una serie de retro-cruzas con el padre recurrente, para recuperar la mayor parte de las características deseables del padre recurrente. Así, se crea una población que consiste de individuos casi iguales al padre recurrente, en que cada individuo lleva cantidades variables o un mosaico de regiones genómicas provenientes del padre donante. Las poblaciones de retro-cruza pueden ser útiles para mapear marcadores dominantes, particularmente si todos los loci del padre recurrente son homocigotos y el donante y padre recurrente tienen alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter y colaboradores, 1992; Proc. Nati. Acad.

Sci. (U.S.A.) 89:1477-1481).

La información obtenida de las poblaciones de retro-cruza, usando tanto marcadores co-dominantes como dominantes es menor que la obtenida desde poblaciones F2 completamente clasificadas porque se muestrean los eventos de recombinación que comprometen a uno, más bien que dos, gametos por planta. Sin embargo, las poblaciones de retro-cruza son más informativas (a baja saturación de marcadores) cuando se comparan con RlLs, ya que la distancia entre loci ligados aumenta en poblaciones RIL (es decir, a alrededor de 15% de recombinación). La recombinación aumentada puede ser beneficiosa para resolución de ligaciones estrechas, pero puede se indeseable en la construcción de mapas con baja saturación de marcadores.

Las líneas casi-isogénicas (NIL) creadas por muchas retro-cruzas para producir una formación de individuos que son casi idénticos en composición genética, excepto por la característica o región genómica bajo interrogación, pueden usarse como población de mapeo. Al mapear con NlLs, se espera que solo una porción de los loci polimórficos entre los parentales segreguen en la población NIL altamente homocigota. Aquellos loci que son polimórficos en una población NIL, sin embargo, es probable que estén ligados a la característica de interés.

El análisis segregante a granel (BSA) es un método desarrollado para la rápida identificación de ligación entre marcadores y características de interés (Michelmore y colaboradores, 1991 ; Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9828-9832). En el BSA, se extraen dos muestras a granel de ADN desde una población segregante, originada de un cruzamiento simple. Esas muestras a granel contienen individuos que son idénticos para una característica particular (por ejemplo, resistente o susceptible a un patógeno particular) o región genómica pero arbitraria en regiones no ligadas (es decir, heterocigotas). Las regiones no ligadas a la característica apuntada no diferirán entre las muestras a granel de muchos individuos, en el BSA.

En otro aspecto, la presente invención provee un procedimiento para producir plantas de pepino resistentes al DM que comprende: (a) cruzar una línea de pepino con resistencia al DM con una segunda línea de pepino carente de resistencia al DM, para formar una población segregante; (b) seleccionar la población por resistencia al DM; y (c) seleccionar uno o más miembros de la población que tengan dicha resistencia al DM. En un aspecto, la línea de pepinos con resistencia al DM se cruza con la segunda línea de pepinos por al menos dos generaciones (es decir, creando tanto una población F2 como una población BC1S1). En otro aspecto, se identifican plantas como resistentes al DM antes de cruzarlas. En un aspecto, las plantas pueden seleccionarse en base a una resistencia parcial o completa al DM. En un aspecto, la población segregante se auto-fecunda y la población subsiguiente se selecciona por resistencia.

En otro aspecto, la presente invención provee un procedimiento para la introgresión de resistencia al DM dentro de una planta de pepino, que comprende: (a) cruzar al menos una primera línea de pepino con resistencia al DM, con una segunda línea de pepino, para formar una población segregante; (b) seleccionar dicha población por resistencia al DM; y (c) seleccionar al menos un miembro de dicha población que exhiba resistencia al DM. En un aspecto, la línea de pepino con resistencia al DM se cruza con una segunda línea de pepino durante al menos dos generaciones (es decir, creando tanto una población F2 como una población BC1S1). En otro aspecto, se identifican plantas como resistentes al DM antes de cruzarlas. En un aspecto, la población segregante se auto-fecunda y la población subsiguiente se selecciona por resistencia.

Las plantas de pepino generadas usando el procedimiento de la presente invención pueden ser parte de o generadas desde un programa de mejoramiento. La selección del método de mejoramiento depende del modo de reproducción de la planta, la heredabilidad de la característica a mejorar y del tipo de cultivar usado comercialmente (es decir, cultivar híbrido F-i , cultivar de línea pura, etc.). A continuación se presentan aproximaciones selectas, no-limitantes, para mejorar plantas de la presente invención. Un programa de mejoramiento puede aumentarse usando selección asistida por marcador de la progenie de cualquier cruzamiento. Además, se comprenderá que cualquier cultivar, comercial o no comercial puede utilizarse en un programa de mejoramiento. Factores tales como por ejemplo, vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia al stress, resistencia a la enfermedad, ramificación, florecimiento, tamaño del fruto, calidad del fruto y/o rendimiento de frutos, en general, dictarán la selección.

Para características altamente heredables, la selección de plantas superiores individuales en una sola ubicación será efectiva, mientras para características de baja heredabilidad, la selección debería estar basada en análisis estadístico (es decir, valores promedio) obtenidos de evaluaciones replicadas de familias o plantas relacionadas. Los métodos populares de selección comúnmente incluyen selección de pedigrí, selección de pedigrí modificado, selección masal y selección recurrente. En una modalidad preferida, se emprende un programa de mejoramiento por retro-cruza o mejoramiento recurrente.

La complejidad de la herencia influye en la selección del método de mejoramiento. El mejoramiento por retro-cruza puede usarse para transferir uno o unos pocos genes favorables para una característica altamente heredable, dentro de un cultivar deseado. Esta aproximación se ha usado extensivamente para mejoramiento de cultivares resistentes a enfermedades. Varias técnicas de selección recurrente se usan para mejorar características cuantitativamente heredadas, controladas por muchos genes. El uso de selección recurrente en plantas auto-polinizadas depende de la facilidad de polinización, la frecuencia de híbridos exitosos desde cada polinización y del número de descendientes híbridos desde cada cruzamiento exitoso.

Las líneas puras pueden probarse y compararse con estándares adecuados, en entornos representativos de las áreas objetivo comerciales, por dos o más generaciones. Las mejores líneas son candidatas a progenitores para nuevos cultivares comerciales; aquellas con características aún deficientes pueden usarse como progenitores para híbridos o para producir nuevas poblaciones para selección adicional.

Un procedimiento para identificar a una planta superior es observar su desempeño en relación con otras plantas experimentales y con un cultivar estándar ampliamente cultivado. Si una sola observación no es concluyente, las observaciones replicadas pueden proveer un mejor estimado de su valor genético. Un mejorador puede seleccionar y cruzar dos o más líneas parentales, seguidas por auto-fecundación o "sib" repetida y selección, produciendo muchas nuevas combinaciones genéticas.

El desarrollo de nuevas líneas de pepino requiere el desarrollo y selección de variedades de pepino, el cruzamiento de esas variedades y la selección de cruzamientos híbridos superiores. La semilla híbrida puede producirse por cruzamientos manuales entre progenitores seleccionados, macho-fértiles o usando sistemas de macho-esterilidad. Los híbridos pueden seleccionarse por ciertas características de un solo gen, tales como color de flor, rendimiento de semillas o resistencia a herbicidas, que indiquen que la semilla es verdaderamente un híbrido. Los datos adicionales sobre líneas parentales, así como el fenotipo del híbrido influyen en la decisión del mejorador sobre si continuar o no el cruzamiento híbrido específico.

Los métodos de mejoramiento por pedigrí y selección recurrente pueden usarse para desarrollar cultivares desde poblaciones en mejoramiento. Los programas de mejoramiento combinan características deseables desde dos o más cultivares o varias fuentes de base amplia, en combinaciones de mejoramiento, desde las cuales se desarrollan cultivares por auto-fecundación y selección de fenotipos deseados en líneas parentales. Esas líneas se usan para producir nuevos cultivares. Los nuevos cultivares puede ser evaluados para determinar cuales tienen potencial comercial.

El mejoramiento por pedigrí se usa comúnmente en el mejoramiento de plantas auto-polinizadas. Se cruza a dos padres que poseen características favorables, complementarias, para producir una F-i. Se produce una población F2 auto-fecundando una o varias Fis. Se efectúa la selección de los mejores individuos de las mejores familias. Las pruebas replicadas de familias pueden comenzar en la generación F4l para mejorar la efectividad de la selección de características con baja heredabilidad. En una etapa avanzada del mejoramiento (es decir, F6 y F7), se prueban las mejores líneas o mezclas de líneas fenotípicamente similares por liberación potencial como nuevos cultivares.

Los mejoramientos por retro-cruza y por cruzamiento se han usado para transferir genes de una característica heredada en forma simple, altamente heredable en un cultivar deseable o línea pura homocigota, que es el padre recurrente. La fuente de la característica a transferir se denomina el padre donante. Se espera que la planta resultante obtenida desde un programa exitoso de retro-cruza tenga los atributos del padre recurrente (es decir, del cultivar) y la característica deseable transferida desde el padre donante. Después del cruzamiento inicial, los individuos que poseen el fenotipo del padre donante, se seleccionan y se cruzan repetidamente (retro-cruzan) con el padre recurrente. Después de múltiples generaciones de retro-cruza con selección, se espera que la línea resultante tenga los atributos del padre recurrente (es decir, del cultivar) y la característica deseada transferida desde el padre donante.

Puede conducirse un mejoramiento por cruza o por retro-cruza de una planta de pepino resistente al DM, donde el otro progenitor (segunda planta de pepino) es resistente al DM o el otro progenitor no es resistente al DM.

Las plantas de pepino generadas de la invención pueden generarse usando un procedimiento de descendiente de una sola semilla. El procedimiento de descendiente de una sola semilla, en sentido estricto, se refiere a plantar una población segregante y seleccionar luego una planta en esta y cada generación subsiguiente, para auto-fecundar y crear la próxima generación. Cuando se ha avanzado la población desde F2 al nivel de endogamia deseado, las plantas desde las cuales se derivó las líneas pueden trazarse a diferentes individuos F2. El número de plantas en una población declina en cada generación debido a falla de algunas semillas para germinar o de algunas plantas para producir, al menos una semilla. Como resultado, no todas las plantas F2 originalmente muestreadas en la población estarán representadas por una progenie, cuando se completa el avance de generación.

Las descripciones de otros métodos de mejoramiento que se usan comúnmente para diferentes características y cultivos pueden encontrarse en uno de varios libros de referencia disponibles (por ejemplo, Fehr, Principies of Cultivar Development, Volumen 1 , páginas 2-3 (1987).

En una aspecto de la presente invención, la fuente de características de resistencia al DM para usar en un programa de mejoramiento se deriva desde una planta seleccionada del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 y la progenie resistente al DM de las mismas. En otro aspecto, la fuente de la característica de resistencia al DM para usar en un programa de mejoramiento no deriva de una planta que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 y de la progenie resistente al DM de las mismas.

Otro aspecto de la invención está dirigido a una planta de línea pura de pepino que tiene resistencia al DM, en que esa resistencia se exhibe cuando esa planta está en contacto con ese DM y en que esa planta de pepino no deriva de una planta que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1. También está incluida en la invención una planta de pepino que tiene un genoma, en que ese genoma comprende locus genético que confieren resistencia al DM, en que ese locus genético contiene uno o más marcadores genéticos ligados a ese locus genético confiriendo resistencia al DM y, en que esa planta de pepino no es aquella con acceso PI197088.

En aún otro aspecto, las fuentes adicionales de resistencia al DM, para uso en un programa de mejoramiento, pueden identificarse seleccionando germoplasma de pepino por resistencia al DM. En aún otro aspecto, las plantas de pepino pueden seleccionarse por resistencia al DM por identificación del germoplasma que exhibe síntomas reducidos de la enfermedad en relación con una planta testigo de pepino, después de la inoculación o infección. En un aspecto, las plantas de pepino pueden seleccionarse por resistencia al DM usando una criba de la enfermedad tal como una criba de campo o invernadero como la que se describe en el Ejemplo 1 o Ejemplo 2.

En otro aspecto, pueden identificarse fuentes adicionales de resistencia al DM, para usar en un programa de mejoramiento seleccionando con uno o más marcadores moleculares ligados a un locus genético que confiere resistencia al DM, tales como aquellos aquí identificados.

En otro aspecto, pueden identificarse fuentes adicionales de resistencia al DM, para usar en un programa de mejoramiento, por una combinación de selección de plantas de pepino por síntomas reducidos de la enfermedad y luego seleccionando con uno o más marcadores moleculares ligados a un locus genético que contribuye a la resistencia al DM.

En otro aspecto, en programas de mejoramiento pueden usarse líneas de pepino con resistencia al DM que combinen resistencia al DM con características adicionales de interés. En un aspecto, la resistencia al DM puede combinarse con cualquier característica adicional, incluyendo características de resistencia a la enfermedad, características de rendimiento y características de calidad de frutos. Por ejemplo, pueden usarse programas de mejoramiento para combinar la característica de resistencia al DM con alelos que contribuyen al tamaño y forma del fruto del pepino. También pueden usarse programas de mejoramiento para combinar resistencia al DM con una o más características de resistencia a enfermedad. Tales características de resistencia a enfermedad incluyen, sin limitación, resistencia a: marchitez por Verticillum, nemátodos de nudo radicular, Virus del Mosaico del Tabaco, Sarna del Pepino, Mildiú pulverulento, Target spot, Virus del Mosaico del Pepino y marchitez por Fusarium. En otro aspecto, las características que se combinan pueden ser co-heredadas en cruzamientos subsiguientes.

La presente invención también provee partes de plantas de pepino resistentes al DM, producidas por el procedimiento de la presente invención. Las partes de plantas de pepino, sin limitación, incluyen células de plantas o partes de células de plantas, semillas, endospermo, meristema, flor, antera, óvulo, polen, fruto, flores, brotes, raíces, tallos u hojas, mugrones y arraigamiento. También, las partes de planta pueden incluir las partes de un fruto de pepino, que incluyen la placenta, columnela y pericarpio. En una modalidad de la presente invención, la parte de la planta es una semilla.

Además, la invención provee partes de una planta de pepino que tiene un genoma, que comprende al menos un locus genético que da origen a la resistencia al DM en la planta de pepino. En otra modalidad, las partes de planta de pepino derivan de una planta de pepino seleccionada del grupo que consiste de todas las líneas depositadas y la progenie resistente al DM de las mismas. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las características fisiológicas y morfológicas de las líneas depositadas ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 se establecen en los Cuadros 1-8 siguientes.

CUADRO 1 Características Fisiológicas v Morfológicas de la línea ASL147-2027 Mo Característica ASL147-2027 1. Tipo Pepino Uso predominante Rebanado Cultivo predominante Exterior Área con mejor adaptación en Mayoría de áreas E.U.A. 2. Madurez Días desde plántula a mercado 50-55 3. Planta Hábito Enredadera Crecimiento Indeterminado Sexo Monoico Color de la flor Amarillo 4. Fruto a Madurez Comestible Forma del Cuello del Fruto Sin cuello Ahusamiento del fruto Extremos romos o redondeados Espesor de la piel Gruesa Costillas de la piel Con Costillas Resistencia de la piel Resistente Lustre de la piel Opaco Color de la espina Blanco Calidad de la espina Gruesa Densidad de la espina Poca Sabor Libre de amargor 5. Resistencia a Insectos Áfidos (Aphis gossypii) susceptible CUADRO 2 Características Fisiológicas v Morfológicas de la Línea EUR154-1012 GY 7. Semillas Número por fruto 30-80 Peso por 1.000 semillas 30-35 g 8. Resistencia a enfermedades Sarna del Pepino (Gumosis) (Cladosporíum cucumerinum) Mildiú velloso Resistente Mildiú pulverulento {Erysiphe cichoracearum) Resistente Virus del Mosaico del Pepino Susceptible Virus de amarilleamiento de las venas del Susceptible pepino Virus del desorden atrofiado amarillo del pepino Resistencia intermedia 9. Resistencia a insectos Áfidos (Aphis gossypii) Susceptible CUADRO 3 Características Fisiológicas v Morfológicas de la Línea EUR154-1021 GY Sección transversal del extremo floral Redonda Espesor de la piel Delgada Costillas de la piel Con costillas Resistencia de la piel Baja Lustre de la piel Brillante Color de la espina Blanco Calidad de la espina Fina Densidad de la espina Baja Tubérculos (verrugas) No Sabor Libre de amargor 6. Fruto a Madurez de Cosecha Largo 35-37 cm Diámetro al medio 50-60 mm Color Amarillo Patrón de color En franjas Superficie Lisa Reticulado Ligero Fructificación Normalmente sin semillas 7. Semillas Número por fruto 30-80 Peso por 1.000 semillas 30-35 g 8. Resistencia a enfermedades Mildiú velloso Resistente Mildiú pulverulento (Erysiphe cichoracearum) Resistente Virus del Mosaico del Pepino Susceptible Virus de amarilleamiento de las venas del Susceptible pepino Virus del desorden atrofiado amarillo del Resistencia intermedia pepino 9. Resistencia a insectos Áfidos (Aphis gossypii) Susceptible CUADRO 4 Características Fisiológicas v Morfológicas de la Línea GSP 33-1094 GY.

CARACTERÍSTICA GSP 33-1094 GY 1. Tipo Pepino Uso predominante encurtido Cultivo predominante Exterior Área con mejor adaptación en E.U.A. Mayoría de las áreas 2. Madurez Días desde plántula a mercado 60-62 3. Planta Hábito Enredadera Crecimiento Indeterminado Sexo 100% flores femeninas Color de la flor Amarillo CUADRO 5 Características Fisiológicas v Morfológicas de la Línea GPN 33-1093 GY Forma del cuello del fruto Sin cuello Ahusamiento del fruto Extremos romos o redondeados Sección transversal del extremo del tallo Cuadrada Sección transversal media Cuadrada Sección transversal del extremo de la flor Cuadrada Espesor de la piel Gruesa Costillas de la piel Con costillas Resistencia de la piel Tierna Lustre de la piel Opaco Color de la espina Blanco Calidad de la espina Fina Densidad de la espina Poca Tubérculos (verrugas) Pocas, prominentes (ensalada) Sabor Sin amargor Fruto a madurez de cosecha Largo 25-30 cm Diámetro al medio 10-13 Color Crema Patrón de color Con franjas Superficie Lisa Reticulado Leve o ausente Fructificación Normalmente con semillas Semillas Número por fruto 150-200 Peso por 1000 semillas 22-25 g Resistencia a enfermedades Sarna del Pepino (Gumosis) (Cladosponum Susceptible cucumerínum) Mildiú velloso Resistente Mildiú pulverulento (Erysiphe Resistente cichoraceamm) Target Spot (Corynespora cassicola) Susceptible Virus del Mosaico del Pepino Resistente Resistencia a insectos Áfidos (Aphis gossypii) Susceptible CUADRO 6 Características Fisiológicas y Morfológicas: Línea 03/8020- 20 TUP03 DMFL 1 Patrón de color Con franjas Superficie Lisa Reticulado Leve o ausente Fructificación Normalmente sin semillas Semillas Número por fruto 150-200 Peso por 1000 semillas 22-25 g Resistencia a enfermedades Sarna del Pepino (Gumosis) Resistente (Cladosporíum cucumerínum) Mildiú velloso Resistente Mildiú pulverulento (Erysiphe susceptible cichoracearum) Virus del Mosaico del Pepino Susceptible Resistencia a insectos Áfidos (Aphis gossypii) Susceptible CUADRO 7 Características Fisiológicas v Morfológicas: Línea 03/8024- 19 TUP03 DMFL 1 Color predominante en extremo de la flor Verde uniforme Forma del cuello del fruto Sin cuello Ahusamiento del fruto Extremos romos o redondeados Sección transversal del extremo del tallo redonda Sección transversal media redonda Sección transversal del extremo de la flor redonda Espesor de la piel delgada Costillas de la piel sin costillas Resistencia de la piel Baja Lustre de la piel Brillante Color de la espina Blanco Calidad de la espina Fina Densidad de la espina Baja Tubérculos (verrugas) Ausentes Fruto a Madurez de Cosecha Largo 12-23 cm Diámetro al medio 30-45 mm Color Crema Patrón de color Con franjas Superficie Lisa Reticulado Leve o ausente Fructificación Normalmente con semillas Semillas Número por fruto 150-200 Peso por 1000 semillas 22-25 g Resistencia a enfermedades Sarna del Pepino (Gumosis) (Cladosponum susceptible cucumerinum) Mildiú velloso Resistente Mildiú pulverulento (Erysiphe cichoracearum) Resistencia Intermedia Virus del Mosaico del Pepino Resistente Resistencia a insectos Áfidos (Aphis gossypii) Susceptible CUADRO 8 Características Fisiológicas v Morfológicas: Línea: 03/8039 5 TUP03 DMFL 1 Patrón de color Con franjas Superficie Lisa Reticulado Leve o ausente Fructificación Normalmente con semillas 7. Semillas Número por fruto 150-200 Peso por 1000 semillas 22-25 g 8. Resistencia a enfermedades Sarna del Pepino (Gomosis) (Cladosporium Resistente cucumerinum) Mildiú velloso Resistente Mildiú pulverulento (Erysiphe cichoracearum) Resistencia intermedia Virus del Mosaico del Pepino Susceptible 9. Resistencia a insectos Áfidos (Aphis gossypii) Susceptible En una modalidad, la invención provee una planta de pepino resistente al DM o los frutos o semillas de la misma, en que la planta de pepino demuestra una reducción en los síntomas foliares de lesiones cloróticas y/o necróticas, en relación a plantas testigo no resistentes, cuando se inoculan o infectan con DM, y en que dichas plantas demuestran resistencia a uno o más de marchitez por Verticillum, nemátodos de nudo en raíces, Virus del Mosaico del Tabaco, sarna del pepino, mildiú pulverulento, "Target Spot", Virus del Mosaico del pepino, Virus de Mancha Anular de Papaya, Virus del Mosaico Amarillo del Zucchini y marchitez por Fusarium. En otra modalidad, aquellas plantas de pepino o sus frutos o semillas, se seleccionan desde progenies resistentes a DM, de líneas descritas en los Cuadros 1-8. En otras modalidades, una planta de pepino resistente al DM, que también demuestra resistencia a una o más de: marchitez por Verticillum, sarna del pepino, mildiú pulverulento, "Target spot", Virus del Mosaico del pepino, nemátodos, Virus del Mosaico del Tabaco, Virus de Mancha anular de Papaya, Virus del Mosaico Amarillo del Zucchini y marchitez por Fusarium exhibe una reducción mayor de 10% o mayor de 30% o mayor de 60% de los síntomas foliares de lesiones cloróticas y/o necróticas al inocularlas o infectarlas con DM. En algunos aspectos, las plantas de pepino están adaptadas para cultivo en invernadero o en el campo.

Un aspecto de la invención provee una planta de pepino resistente al DM o sus frutos o semillas, en que la planta de pepino o sus frutos expresan una o dos o tres o más características deseables, independientemente seleccionadas, además de la resistencia al DM. En una modalidad, la o las "características deseables" se seleccionan del grupo que consiste de: tamaño, forma, color, apariencia de la superficie del fruto, número de semillas, tamaño de semillas, número de lóculos, espesor y resistencia del pericarpio; sabor, amargor, presencia de tubérculos y vida en almacenamiento, vigor de planta, forma de la hoja, largo de la hoja, color de la hoja, altura de planta, sí la planta es o no determinada, tiempo a madurez, adaptación a cultivo en el campo, adaptación a cultivo en invernadero y resistencia a una o más enfermedades u organismos que las causan, tales como: marchitez por Verticillum, nemátodos de nudo en raíces, Virus del Mosaico del Tabaco, sarna del pepino, mildiú pulverulento, Mildiú Velloso, "Target spot", Virus del Mosaico del pepino y marchitez por Fusarium. En otra modalidad, la o las "características deseables" se seleccionan del grupo que consiste de tamaño del fruto, forma del fruto, color del fruto, sabor del fruto, número de semillas por fruto, tamaño de semillas, espesor del tejido del pericarpio del fruto; vida en almacenamiento del fruto, resistencia a marchitez por Verticillum, resistencia a sarna del pepino, resistencia a mildiú pulverulento, resistencia a "Target spot", resistencia a Virus del Mosaico del pepino, resistencia a nematodos, resistencia a Virus del Mosaico de Tabaco, resistencia a Virus de Mancha anular de Papaya, resistencia Virus del Mosaico Amarillo del Zucchini y resistencia a marchitez por Fusaríum. En aún otra modalidad, la o las "características deseables" se seleccionan del grupo que consiste de tamaño del fruto, forma del fruto, color del fruto, sabor del fruto, vida en almacenamiento del fruto, resistencia a sarna del pepino , resistencia a mildiú pulverulento, resistencia a "Target spot" y resistencia a Virus del Mosaico del pepino. En aún otra modalidad, la o las "características deseables" se seleccionan del grupo que consiste de tamaño del fruto, forma del fruto, color del fruto, calidad del fruto aceptable para el mercado, y la vida en almacenamiento.

En otros aspectos de la invención, las plantas que llevan una o más características deseables, además de la resistencia al DM, exhiben más de 10% o más de 30% o más de 60% o más de 80% de reducción en los síntomas foliares de lesiones cloróticas y/o necróticas, en relación a una planta testigo, no-resistente, a la inoculación o infección por DM. Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un procedimiento para producir plantas de pepino resistentes al DM que comprende: cruzar una línea de pepino con resistencia al DM con una segunda planta que carece de resistencia al DM, pero que es capaz de donar una o más de las anteriores características deseables.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Cultivo de Mildiú Velloso v Selección por Enfermedad - Campo El Pseudoperonospora cubensis (Berk. et Curt.) Rostow es un patógeno obligado. Por lo tanto debe mantenérselo en plantas vivas de una cucurbitácea susceptible. En la selección para resistencia de este estudio se usaron dos aislados. El "antiguo" aislado de P. cubensis se caracteriza por su patogenicidad en ambos, zapallo y pepino. El "nuevo" aislado de P. cubensis no se considera patogénico en zapallo, pero es muy patogénico en pepino. El patógeno se almacenó a -80°C, congelando hojas o cotiledones con abundante esporulación. Aunque puede haber alguna pérdida de viabilidad de las esporas inherente al proceso de congelación, no se encontró una disminución de la viabilidad en el tiempo, una vez que las esporas se congelaron. Seis semanas antes de transplantar en el campo a las plantas huéspedes esparcidoras, se sembró pepinos huéspedes susceptibles, en una cámara con entorno controlado. A las tres semanas, se inocularon con una suspensión de esporas derivada de hojas infectadas, almacenadas en un congelador, a -80°C. Las plantas de cultivo inoculadas se mantuvieron a 20°C; una vez que se desarrolló lesiones cloróticas, se colocó a las plantas en la cámara de rocío durante la noche, para inducir esporulación. Este cultivo se transfirió semanalmente sobre plantas de pepino hasta que se las trasplantó en el campo.

Los ensayos se sembraron directamente en el campo. Se plantó hileras diseminadoras de pepino susceptible, cada tercera hilera. Cuando las hileras diseminadoras tenían dos a tres semanas, se trasplantó plantas infectadas (criadas en cámara de crecimiento) dentro de las hileras diseminadoras. Simultáneamente, se efectuó los ensayos de mejoramiento. Las parcelas se mantuvieron en buena condición hortícola, consistente con las técnicas normalmente empleadas en cultivo de pepinos en el Sudeste.

Las plantas diseminadoras, en etapa de tres a cuatro hojas, se inocularon en invernadero por nebulización con suspensión de esporas, usando una botella aspersora. El inoculo se formuló en agua destilada estéril. Después de la inoculación, se colocó las plantas en una cámara de rocío, con 100% de HR y 20°C durante 18-24 horas. Las plantas diseminadoras se trasplantaron al campo donde un aspersor instalado proveyó un período húmedo nocturno para estimular el desarrollo y esparcir la enfermedad.

Las pruebas se evaluaron una vez desarrollados los síntomas en la verificación susceptible, algunas veces denominado testigo susceptible. Los testigos usados incluían PI197088 (testigo resistente); DMP21 , GP14, LLP 1 , POINSETT 76 (testigos con resistencia intermedia) y SPRINT440, MARAM y SMR58 (testigos susceptibles). Se hizo tres observaciones en cada parcela, una en cada extremo y una en el medio. Se calculó el índice medio de enfermedad para cada parcela. Estos se promediaron para las tres repeticiones y se determinó la desviación estándar. Se determinó los rangos del índice de enfermedad para las categorías "Resistente", "Resistencia Intermedia" y "Susceptible". En general, se ensayó varias veces las variedades antes de hacer la determinación final del nivel de resistencia a la enfermedad. En la prueba de enfermedad, se usó un diseño completamente al azar. Cada línea probada se replicó tres veces - aproximadamente 40 plantas por entrada. Las líneas con disponibilidad limitada de semillas se incluyeron como una parcela de observación sin replicaciones. Los testigos se incluyeron como entradas para calibrar la severidad de la prueba. Las parcelas tenían 3.6 m de largo con un "pasillo" de 1 m entre extremos de los bloques. Se plantó una diseminadora susceptible cada tercera fila y en los bordes externos de toda la plantación.

EJEMPLO 2 Cultivo de Mildiú Velloso v Selección por Enfermedad - Invernadero El Pseudoperonospora cubensis (Berk. et Curt.) Rostow, como se describió y almacenó antes en el Ejemplo 1 , se usó también para ensayos en invernadero. Dos semanas antes de la selección de inoculación, se sembró huéspedes susceptibles de pepino en bandejas de plántulas. A la semana después de la siembra, se inoculó las plántulas con una tasa de aproximadamente 5x104 esporangios/ml. Los huéspedes inoculados se colocaron luego en una cámara de crecimiento y se mantuvieron durante siete días a alrededor de 21.11 °C. Después de siete días, se colocó a las plántulas en una cámara de rocío durante la noche, para inducir esporulación. Este cultivo se transfirió sobre huéspedes susceptibles de pepino, en base semanal.

Se plantó cortinas de cotiledones en bandejas de plántulas. Se plantó testigos susceptibles y resistentes en ambos lados de cada bandeja. Se sembró las plantas y se las mantuvo en un invernadero a 26.66°C. Se efectuó inoculación a 7-10 días para los cotiledones y en la etapa de 5a hoja para las hojas verdaderas. Las plantas se inocularon nebulizándolas con una suspensión de esporangios mediante una botella aspersora, a una concentración de aproximadamente 5x104 esporangios/ml para los cotiledones y 1x104 a 3x104 para hojas verdaderas. Después de la inoculación, se colocó las plantas en una cámara de rocío, a 100% de humedad relativa y 20°C, durante 18-24 horas.

Las pruebas se evaluaron una vez que se desarrollaron los síntomas en la verificación susceptible, algunas veces denominada el testigo susceptible. Los testigos usados fueron Pl 197088 (testigo resistente), MARAM (testigo susceptible) y SMR58 (testigo resistente). Se mantuvo a las sobrevivientes resistentes e intermedias de la aislación de cotiledones y se las trasplantó a maceteros de turba, de 7.62 cm, para inocularlas nuevamente o para trasplantarlas a bolsas de cultivo en invernadero. Las sobrevivientes resistentes e intermedias de la aislación de hojas verdaderas se trasplantaron directamente en bolsas de cultivo en invernadero.

EJEMPLO 3 Introgresión de resistencia al Mildiú Velloso en Líneas de Pepino Se encontró que la resistencia al Mildiú Velloso identificada en la línea de Introducción de Plantas Pl 197088 era estable globalmente en múltiples ubicaciones de aislación y contra ambos aislados de P. cubensis, el "antiguo" (patogénico en zapallo y pepino) y el "nuevo" emergido (no considerado patogénico en zapallo, pero muy patogénico en pepino). Sin embargo, las plantas y frutos de Pl 197088 son comercialmente inaceptables. Se mapeó un locus en PI197088 que contribuía a la resistencia al Mildiú Velloso, con marcadores moleculares, como se describe en el Ejemplo 4. Se aisló separadamente un total de alrededor de 128 líneas de pepino, usando uno o ambos aislados de DM. Se aisló ADN desde líneas resistentes para aislar polimorfismos marcadores entre progenitores donantes y recurrentes.

Incluidas en esas aislaciones están las variedades de pepino Conquistador, Crispina, DMP21 y Pl 197088, entre otras, que son resistentes o con resistencia intermedia. También se incluyó Colt, Sprint440, Talladega, Lucinde y Serena entre otras, como líneas testigo susceptible. Se recolectó muestras de tejido de cada una de las líneas resistentes al DM, para usarlas en análisis de ADN y producción de una genoteca de ADN para identificar marcadores asociados con resistencia al DM. También se obtuvo semillas desde cada una de las líneas demostrando resistencia al DM, en general, vía polinización con polen mezclado dentro de cada acceso y, donde posible, vía auto-fecundación. Las polinizaciones con polen mezclado se usaron, en general, en pepinos de tipo silvestre, ya que a menudo contienen un factor de auto-incompatibilidad.

Se hizo cruzamientos iniciales entre Pl 197088 y un padre recurrente, susceptible, para crear plantas Fi. Las plantas derivadas de esos cruzamientos se usaron para pruebas de enfermedad, como se describió en los Ejemplos 1 y/o 2. Se efectuó experimentos para aislar por resistencia al DM en una colección de líneas de élite que mostraban tipos horticulturalmente aceptables de planta y fruto y que tuvieran resistencia al DM por introgresión desde Pl 197088. Esas pruebas se efectuaron en tres localidades (Woodland, CA, Tifton, GA y Wageningen, NL) y usando dos aislados de Pseudoperonospora cubensis: un aislado "antiguo", patogénico en zapallo y pepino y el putativo aislado "nuevo", no considerado patogénico en zapallo, pero muy virulento en pepino. Simultáneamente, se determinó el genotipo de esas muestras con marcadores moleculares, para identificar un QTL que contribuyera a la resistencia al DM en Pl 197088 (ver también Ejemplo 4). Esas pruebas asocian la respuesta a la patología del DM con la presencia de un alelo de PI197088. Durante este tiempo, los mejoradores que sometieron las muestras ensamblaron todos los datos de los ensayos en esas líneas en las cuales se notan o cuantifican esos tipos de planta y frutos. Las siguientes líneas mostradas en los Cuadros 9 y 10, se aislaron por resistencia al DM.

CUADRO 9 Pedigríes de Líneas de Pepino para las cuales se Hizo un Depósito de Semillas Aislado de DM Línea de Pepino Pedigrf CUADRO 10 Marcadores Haplotipos y Puntajes de Reacción Asociados al Mildiú Velloso (DM) para cinco Marcadores en la Región QTL de Resistencia al DM. Datos representan 37 Líneas de Pepino DM= puntajes fenotípicos en prueba de patología para Mildiú Velloso.

Se probó 37 líneas de pepino por reacciones a Pseudoperonospora cubensis, en una aíslación de patología controlada. Se probó 18 plantas en tres repeticiones de seis plantas. Se determinó el genotipo de tres plantas de cada replicación (total de tres replicaciones = 9) por 5 marcadores que definían la región QTL del DM. Desde esos datos, se desarrolló marcadores de genotipo de consenso y resumen de estadísticas DM para cada línea. Esos datos se resumen en el Cuadro 10. Los cinco marcadores usados en esta prueba se seleccionaron de ocho marcadores ligados en el QTL de DM. Los cinco marcadores se seleccionaron basado en desempeño confiable en laboratorio y/o asociaciones con fenotipo DM que fueron más consistentes que los otros marcadores.

El Cuadro 10 soporta la asociación del haplotipo RES-RES-SUS- SUS-RES en los marcadores CAPs-ENK60, CAPs_ENK59, CAPs_17170, CAPs_17179, CAPs_17563/66 con un fenotipo más resistente al DM. La sustitución del alelo SUS con el alelo RES, en los marcadores CAPs-ENK60, CAPs_ENK59 y CAPs_17563/66 produce un cambio en el fenotipo, promedio DM desde 4.8 a 2.2, en pruebas donde 1 = resistente y 5= susceptible.

EJEMPLO 4 Análisis de Marcadores de Plantas de Pepino Resistentes a DM Se analizó plantas resistentes usando marcadores genéticos distribuidos a través del genoma del pepino. Los marcadores genéticos para Cucumis están disponibles desde una variedad de fuentes tales como USDA-ARS (Unidad de Cultivos Vegetales -Departamento de Horticultura, Universidad de Wisconsin-Madison). Un juego más grande de marcadores se pre-aisló en las líneas parentales y se seleccionó marcadores polimórficos, desde los marcadores pre-aislados, para una aislación subsiguiente. Luego, se estableció una correlación con la mayoría de las plantas resistentes y la presencia de alelos donantes específicos, por ejemplo como se muestra en el Cuadro 10 y en la Figura 2. La mayoría de las plantas resistentes adquirieron introgresión de ADN desde la línea donante resistente, PI19788, por ejemplo, en loci como los mostrados en la Figura 2. Se construyó un modelo de regresión múltiple para retener los marcadores que contribuyeron al fenotipo de resistencia al DM. En este análisis, los marcadores CAPs-ENK60, CAPs_17170 y CAPs_17563/66 permanecieron significativos, generando un modelo con R2 de 0.47.

Los pares de partidores y condiciones de reacción utilizadas para definir el QTL para resistencia al DM en Cucumis sp. se muestran en los Cuadros 1 1 y 12.

CUADRO 11 Pares de partidores usados (SEQ ID Nos:1 a 17) Nombre del Partidor hacia adelante (5' a 3') Partidor Reverso (5' a 3') Enzima Condición de Notas Marcador Electrofore- sis CAPs 2 i TCAAGCCATAGTCTAACC CGCT AT ATCATGG ATG G CT 3% Nsil 826 CATGC AGAAAT agarose gel CAPs E GAATAGATAGGCTACACT GTATAAAACTTGAGTGAAT HpyC 3% NK.60 TTTCCCTCTTG TTAATGCATGAA H4 IV agarose gel CAPs E TGTTTCATAACTACAGCT TAG riTcrrrcrrGCTGGAC 3% N 59 TCATGTTAAATATTACT GAACC agarose gel CAPs 17 TATGGGCTATGTGAAACT AGCGTGACAACTACAAAAC 3% ?? III 170 CTT AT agarose gel Partidor hacia GTTCGTTGATCAGTGTGAT Capilarmente adelante para GATGAAG ATTTCAAT alelo CAPs 17 GAAATAAATG Pl 197088 J7 .._ CGAGGA Partidor hacia GTrCGTTGATCAGTGTGAT Capitalmente adelante para CAPs. 17 ATCGGTCTTTGCCACCTT ATTTCAAT alelo 179 rrc Lucinde CAPsJ 8 TGTTTGGAAGGGTTTCTT l lindll 3% 229 TGCCA GTCGCCAACAGT GG<¡ 1 agarose j;el CAPs 17 AGCiAGGGACAGAGA AA TCCGTTTTAGGTGATTGTCA Capilarmente 563/66 TTI GATATAAT AATACAT CAPs 1: AAAGTTGATAGTGCATGA TCCGCTTATGGGTITITGTG 3% Taql NK70~ GTTGGTAAAATA AG agarose gel CUADRO 12 Condiciones de Reacción para PCR El análisis de los marcadores genéticos se efectuó por amplificación PCR. Las reacciones PCR se condujeron como sigue: las reacciones PCR contienen 1.0 microlitros de ADN genómico de pepino (10 ng), 2 µ? 10x de Tampón PCR (Tampón I ABI PCR: parte N° N808-0006), 1.0 µ? de mezcla 10x dNTP (concentración final de cada dNTP es 250 µ?), 1 µ? de cada partidor (5 picomoles de cada partidor), 0.2 µ? de Taq Polimerasa (1 unidad) y agua estéril a un volumen total de 20 microlitros. Las reacciones PCR se incubaron durante 2 minutos a 94°C, durante 30 segundos a 94°C, durante 30 segundos a 50°C y 90 segundos a 72°C, por 35 ciclos, seguido por un solo ciclo de 72°C durante 5 minutos. Las reacciones PCR se efectuaron, por ejemplo, en una máquina ABI9700 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA).

La secuenciación del ADN genómico flanqueando los loci inicialmente aislados en la región QTL podría explicar parte de la variabilidad observada en algunos puntajes de resistencia al DM. Por ejemplo, en ciertas líneas con haplotipos resistentes, pero puntajes de resistencia variables, la variabilidad pudo ser vista cerca del marcador CAPs_17170. Así, cuando se comparó secuencias de este alelo entre dos líneas dadas, con diferentes puntajes de resistencia al DM, pudieron haber coincidido en la posición explotada para el ensayo del marcador y, así, ambas podrían definirse como del mismo genotipo. Sin embargo, las secuencias de tales líneas, en algunos casos, se encontró que diferían por ejemplo en hasta 3 SNPs en sitios cercanos pero no explotados por el ensayo de marcador.

Las plantas conteniendo un alelo(s) donante de resistencia al DM, incluyendo las líneas GSP33-1094GY y GNP33-1093, entre otras (ver Cuadros 1-8 y 13) se seleccionaron para mejoramiento adicional. Dependiendo de la estrategia de mejoramiento, las plantas seleccionadas para mejoramiento adicional pueden ser tanto homocigotas como heterocigotas para un alelo donante (resistente).

CUADRO 13 Descripciones de Líneas - Características Agronómicas Seleccionadas y Resistencia a Enfermedad para Líneas Adicionales con Introgresíón de Resistencia al DM v Líneas de Comparación. 08 Se encontró que la Línea 05-346 exhibía un fuerte vigor, con color de fruto verde oscuro y frutos cilindricos, con una relación largo/espesor de 3.2. Se encontró que la Línea GSP33-1094GY exhibía fuerte vigor, con frutos más bien largos (relación largo/espesor de 3.3/3.4) y hojas un tanto erectas con poca tendencia a hoja. La piel del fruto era algo áspera. Se encontró que la Línea 01-349 era productiva, con buena forma del fruto. La carne del fruto era firme y los frutos exhibían una relación largo/espesor promedio de 3.3. La Línea GPN33-1093GY mostró fuerte vigor. Las hojas eran algo rizadas. Sus frutos tenían espinas leves, pero la densidad de las espinas era muy baja. La relación largo/espesor promedio de los frutos fue 3.3.

Información de depósito Se efectuó o se efectuará un depósito de 1.000 semillas, hecho de las Líneas Propietarias de Seminis Vegetable Seeds ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , ya descritas y comprendidas en las reivindicaciones adjuntas, en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. 20110-2209 USA, una International Depositary Authority (IDA) como lo establece el Tratado de Budapest en la International Recognition of the Deposit of Micro-organisms for the Purposes of Patent Procedure. Los números de acceso de las líneas ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154- 1021GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 son Acceso ATCC N° PTA-9375, Acceso ATCC N° PTA-8930, Acceso ATCC N° PTA-8931 , Acceso ATCC N° PTA-8953 y Acceso ATCC N° PTA-8954, respectivamente. Las fechas de depósito fueron 15 de Julio, 2008, 11 de Febrero, 2008, 11 de Febrero, 2008, 20 de Febrero, 2008,y 20 de Febrero del 2008 respectivamente. A la concesión de la Patente, se removerán todas las restricciones sobre los depósitos, pretendiéndose que los depósitos llenen los requisitos de 37 C.F.R Sección 1.801-1.809.

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para producir plantas de pepino con resistencia al Mildiú Velloso, caracterizado porque comprende los pasos de: a) cruzar una planta de pepino con acceso Pl 197088 con una segunda planta de pepino que tiene una o más características deseables; y b) seleccionar al menos una planta de pepino de la primera progenie, resultante del cruzamiento que comprende resistencia al Mildiú Velloso y la característica deseada.

2.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la característica deseada se selecciona del grupo que consiste de: tamaño, forma, color y apariencia superficial del fruto; número de semillas, tamaño de semilla, número de lóculos; espesor y resistencia del pericarpio; sabor, amargor, presencia de tubérculos, vida en almacenamiento, vigor de planta, forma de la hoja, largo de la hoja, color de la hoja, altura de planta, sí la planta es o no determinada, tiempo a madurez, adaptación a cultivo en el campo, adaptación a cultivo en invernadero, calidad de frutos aceptable al mercado y resistencia a una o más enfermedades u organismos causantes de enfermedades que se seleccionan del grupo que consiste de marchitez por Verticillum, nemátodos de nudos radiculares, Virus del Mosaico del Tabaco, sarna del pepino, Mildiú pulverulento, Target Spot, Virus del Mosaico del Pepino y marchitez por Fusarium, Virus de Mancha Anular en Papaya y Virus del Mosaico Amarillo del Zucchini.

3. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la selección de la primera progenie comprende identificar la presencia de al menos un primer marcador genético en la primera progenie, que esté ligado a un locus que contribuya a la resistencia al Mildiú Velloso.

4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la selección de la primera progenie comprende además seleccionar la progenie basado en la presencia de una pluralidad' de marcadores genéticos provenientes de la segunda planta de pepino presente en la progenie.

5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de los marcadores CAPs_21826, CAPs_ENK60, CAPs_ENK59, CAPs_17170, CAPs_17179, CAPs_18229, CAPs_17563/66 y CAPs_ENK70.

6. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el marcador genético se selecciona del grupo que consiste de CAPs-ENK60, CAPs_17170 y CAPs_17563/66.

7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque comprende adicionalmente, el paso de: c) cruzar la planta de progenie consigo misma o con una tercera planta, para producir plantas de progenie de una generación subsiguiente.

8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de: d) cruzar la planta de progenie de una generación subsiguiente consigo misma o con una segunda planta; y e) repetir los pasos c) y d) durante 3-10 generaciones adicionales, para producir una planta de pepino pura, derivada del pepino con acceso Pl 197088.

9. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha planta de progenie de una generación subsiguiente se selecciona para cruzamiento basado en la presencia de resistencia al Mildiú Velloso y de la característica deseada.

10. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicha planta de progenie de una generación subsiguiente se selecciona en cada generación para cruzamiento, basado en la presencia de resistencia al Mildiú Velloso y de la característica deseada.

11.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque seleccionar la planta de progenie de una generación subsiguiente comprende identificar la presencia de al menos un primer marcador genético en la primera progenie, que esté ligado genéticamente a un locus que contribuye a la resistencia al Mildiú Velloso.

12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque seleccionar la plantas de progenie de una generación subsiguiente comprende, además, seleccionar la progenie basado en la presencia de una pluralidad de marcadores genéticos provenientes de la segunda planta de pepino presente en la progenie.

13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque se repite el paso e) un número suficiente de generaciones para obtener una planta de pepino de línea pura que comprende resistencia al Mildiú Velloso y, además comprende las características agronómicas de la segunda planta de pepino.

14. - Una planta producida por el procedimiento de la reivindicación 13.

15.- Una semilla de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; una muestra de semilla de dicha línea se ha depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954, respectivamente.

16.- Una planta que proviene de una semilla de la reivindicación 15.

17.- Una parte de la planta de la planta de la reivindicación 16.

18.- La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque dicha parte se selecciona del grupo que consiste de una hoja, fruto, polen, óvulo y una célula.

19. - Una planta de pepino o una de sus partes, que tiene todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de pepino de la reivindicación 16.

20. - Un cultivo de tejidos de células regenerables de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; una muestra de semilla de dicha línea se ha depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954, respectivamente.

21. - El cultivo de tejidos de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende células o protoplastos provenientes de una parte de planta que se selecciona del grupo que consiste de embriones, meristemas, cotiledones, polen, hojas, anteras, raíces, extremos de raíces, pistilo, flor, semilla y tallos.

22. - Una planta de pepino regenerada desde un cultivo de tejidos de la reivindicación 20, caracterizada porque la planta regenerada expresa todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de la reivindicación 16.

23. - Un procedimiento para producir semillas de pepino que comprende cruzar la planta de la reivindicación 16 consigo misma o con una segunda planta de pepino.

24. - Una semilla híbrida F1 producida por el procedimiento de la reivindicación 23.

25. - Una planta híbrida F1 producida cultivando la semilla de la reivindicación 24.

26.- Un procedimiento para producir una semilla de una línea de plantas de pepino ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; que comprende los pasos de: a) cruzar una planta de pepino de una línea que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-10 2GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; una muestra representativa de semilla de dicha línea se ha depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954, respectivamente, con una segunda planta de pepino; y b) permitir que se forme una semilla de una línea ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 -derivada de una planta de pepino.

27.- Un procedimiento de propagación vegetativa de la reivindicación 16, que comprende los pasos de: a) recolectar tejido capaz de ser propagado desde una planta de la reivindicación 16; b) cultivar ese tejido para obtener brotes proliferados; y c) hacer arraigar esos brotes proliferados para obtener plántulas enraizadas.

28. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente hacer crecer plantas desde esas plántulas enraizadas.

29. - Un procedimiento para introducir una característica deseada dentro de una línea de pepinos que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024- 9_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , que comprende: a) cruzar una planta de una línea que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1, una muestra de semilla de esa línea que se depositó bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954, con una segunda planta de pepino que comprende una característica deseada, para producir una progenie F1 ; b) seleccionar una progenie F1 que comprende a la característica deseada; c) cruzar la progenie F1 seleccionada con una planta de una línea que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039- 5_TUP03_DMFL_1 ; una muestra representativa de semilla de dicha línea se ha depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931, Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954, respectivamente, para producir una progenie de retro-cruza; d) seleccionar la progenie de retro-cruza que comprende a la característica deseada y a las características fisiológicas y morfológicas de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; y e) repetir los pasos c) y d) tres o más veces en sucesión, para producir cuartas progenies o superiores de retro-cruza que comprenden a la característica deseada.

30. - Una planta de pepino producida por el procedimiento de la reivindicación 29.

31. - Un procedimiento para producir una planta de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 , una muestra de semilla de esa línea se depositó bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954, respectivamente, que comprende una característica deseada agregada; el procedimiento comprende introducir un transgén que confiere la característica deseada, dentro de una planta de una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1.

32. - Una planta de una línea de pepino que exhibe una o más características que se seleccionan del grupo que consiste de: resistencia a la Mancha Angular de la Hoja, Antracnosis raza 1 , Sarna del Pepino, Mildiú Velloso, Mildiú Pulverulento, Mancha Anular de Papaya, Mosaico Amarillo del Zucchini, Virus del Mosaico del Pepino y calidad aceptable por el mercado, en que la combinación de características está controlada por medios genéticos para la expresión de tales una o más características encontradas en una línea de pepino que se selecciona del grupo que consiste de ASL147-2027, EUR154-1012GY, EUR154-1021 GY, GSP33-1094GY, GPN33-1093GY, 03/8020-20_TUP03_DMFL_1 , 03/8024-19_TUP03_DMFL_1 y 03/8039-5_TUP03_DMFL_1 ; una muestra de semilla de dicha línea se ha depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-9375, Número de Acceso ATCC PTA-8930, Número de Acceso ATCC PTA-8931 , Número de Acceso ATCC PTA-8953 y Número de Acceso ATCC PTA-8954.

33. - Una semilla de una planta de la reivindicación 32.

34. - Un procedimiento para determinar el genotipo de la planta de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende obtener una muestra de ácidos nucleicos desde esa planta y detectar en dichos ácidos nucleicos una pluralidad de polimorfismos.

35. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque comprende adicionalmente, el paso de almacenar los resultados del paso de detección de la pluralidad de polimorfismos, en un medio legible por computador.

36. - Un medio legible por computador producido por el procedimiento de la reivindicación 35.

37. - Un procedimiento para producir pepinos, caracterizado porque comprende: a) obtener la planta de la reivindicación 16, en que la plantas se cultivó a madurez; y b) recolectar los pepinos desde la planta.