MX2010008966A - Reactivo de medicion de plaqueta, kit de reactivo de medicion de plaqueta, y metodo de medicion de plaqueta. - Google Patents

Abstract

Se describe un reactivo para la medición de plaquetas que comprende hidrogenosulfato de azul de Nilo, o azul de Nilo y un ácido, un kit de reactivo para la medición de plaquetas que comprende el reactivo para la medición de plaquetas, y un método para las medición de plaquetas que utiliza el reactivo o kit de reactivo.

Description

REACTIVO DE MEDICION DE PLAQUETA, KIT DE REACTIVO DE MEDICION DE PLAQUETA, Y METODO DE MEDICION DE PLAQUETA La presente invención se refiere a un reactivo para medición de plaquetas, un kit de reactivo para medición de plaquetas y un método para medición de plaquetas utilizando el mismo. Más específicamente, la presente invención se refiere al reactivo para medición de plaquetas que comprende azul de Nilo, particularmente hidrogenosulfato de azul de Nilo.

Antecedentes de la Invención Se han conocido métodos en los cuales los glóbulos, es decir leucocitos, reticulocitos, eritrocitos y similares se miden rápidamente utilizando un principio de citometría de flujo.

Como uno de tales métodos de medición, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,114,173 describe un método para contar y detectar reticulocitos, eritrocitos y plaquetas en muestras de sangre entera así como una composición de reactivo utilizado para el método. Específicamente, los reticulocitos se tiñen con una mezcla de reactivo que contiene un tinte catiónico, particularmente Oxazine 750, y su señal de luz dispersada y señal de absorbencia de luz se miden utilizando la citometría de flujo. Entonces, los eritrocitos y reticulocitos en muestras de sangre son diferenciados por la diferencia en señales de absorbencia, y el grupo de eritrocitos y reticulocitos y plaquetas son diferenciados por la diferencia en señales de luz dispersada, para determinar números totales de cada especie.

Breve Descripción de la Invención Problema Técnico Se ha conocido que los glóbulos rojos fragmentados, lípidos y similares que se encuentran en la sangre son similares en tamaño como las plaquetas, de modo que afectan las mediciones de contaminantes. Especialmente, las muestras que contienen pocas plaquetas para las cuales la transfusión de sangre puede ser requerida son más significativamente afectadas por estos contaminantes durante las mediciones. Tal problema puede ocurrir en el método descrito en la Patente Norteamericana No. 6,114,173. Sin embargo, la Patente Norteamericana No. 6,114,173 no describe que las plaquetas son medidas previniendo cualquier efecto por los contaminantes.

Además, los tintes que pueden teñir plaquetas pueden degradarse en una solución con el transcurso del tiempo. Las medidas de plaquetas mediante citometría de flujo se realizaron detectando la luz dispersada y fluorescencia obtenida aplicando luz a las células tiñeron con tinte las muestras. Sin embargo, cuando se utiliza una solución de tinción en la cual la cantidad del tinte contenido para teñir la plaqueta se ha disminuido, la luz o fluorescencia dispersada exacta no puede obtenerse, y los resultados de medida exacta no pueden obtenerse.

La presente invención se ha alcanzado en vista de las circunstancias anteriores, y se desea para proporcionar un reactivo y un kit se reactivo para medición de plaquetas que permita la medición de plaquetas con una exactitud mayor previniendo el efecto de los contaminantes que pueden ser contenidos en muestras y prevenir la detección de plaquetas y que tienen alta estabilidad en almacenamiento. La presente invención también se desea para proporcionar un método para medición de plaquetas que permite la medición de plaquetas con una exactitud mayor.

Medios para solucionar los problemas Por lo tanto, la presente invención proporciona un reactivo para medición de plaquetas que comprende, como un tinte para teñir la plaquetas, azul de Nilo que tiene un ion de hidrogenosulfato como un contraión.

La presente invención también proporciona un kit de reactivo para medición de plaquetas que comprende: un primer reactivo que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, azul de Nilo que tiene un ion de hidrogenosulfato como contraión, y un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante.

Además, la presente invención proporciona un método para la medición de plaquetas que comprende las etapas de: mezclar un primer reactivo que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, azul de Nilo que tiene un ion de hidrogenosulfato como un contraión y una muestra con o sin agregar un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante para preparar una muestra de medición; aplicar luz a las células en la muestra de medición obtenida para detectar luz dispersada y fluorescencia emitidas desde las células; y detectar plaquetas contenidas en la muestra de medición basada en la luz dispersadas y fluorescencia detectadas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un reactivo para medición de plaquetas que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, azul de Nilo que tiene un ion de ácido inorgánico como un contraión y ácido.

Además, la presente invención proporciona un kit de reactivo para medición de plaquetas que comprende: un primer reactivo que comprende, como un tinte para teñir las plaquetas, azul de Nilo que tiene un ion de ácido inorgánico como un contraión y un ácido, y un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante.

Además, la presente invención proporciona un método para la medición de plaquetas que comprende las etapas de: mezclar un reactivo para la medición de plaquetas que comprende azul de Nilo y un ácido y una muestra con o sin agregar un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante para preparar una muestra de medición; aplicar luz a las células en la muestra de medición obtenida para detectar luz dispersada y fluorescencia emitidas desde las células; y detectar plaquetas contenidas en la muestra de medición basada en la luz dispersadas y fluorescencia detectadas.

Como se utiliza en la presente, "azul de N i I o " significa tintes que consisten del compuesto que se representa mediante, por ejemplo, la siguiente fórmula (II): en donde X" es un anión; y está en la forma de una sal con el contraión representado por X". En la presente especificación, los tintes representados por la fórmula (II) en la cual el contraión representado por X" que no está específicamente limitado se llama simplemente "azul de Nilo", y los tintes representados por la fórmula (II) en la cual el contraión está definido específicamente se llaman "azul de Nilo XXX (XXX significa una sal con un ion particular)". Por ejemplo, el tinte que tiene un ion sulfúrico (1/2 S 0 2") como un contraión se llama "sulfato de azul de Nilo" y el tinte que tiene un ion de hidrogenosulfato (HS04-) como un contraión se llama "hidrogenosulfato de azul de Nilo".

Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 muestra recipientes que pueden contener el kit de reactivo para medición de plaquetas de la presente invención.

La Fig. 2 es una vista frontal de la constitución esquemática de un analizador de muestra.

La Fig. 3 es un diagrama de bloque que muestra la constitución esquemática del analizador de muestra.

La Fig. 4 es una vista plana esquemática que muestra la constitución de una sección de detección.

La Fig. 5 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 9.

La Fig. 6 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 10.

La Fig. 7 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 11.

La Fig. 8 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 12.

La Fig. 9 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo de tinte del Ejemplo Experimental 13.

La Fig. 10 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 9.

La Fig. 11 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de sangre que contiene partículas de lípido utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 9.

La Fig. 12 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 10.

La Fig. 13 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de sangre que contiene partículas de lípido utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 10.

La Fig. 14 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por las medidas de muestras utilizando el reactivo para medición de plaquetas de los Ejemplos Experimentales 14 a 24.

La Fig. 15 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medida de una muestra utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 25.

La Fig. 16 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 45.

La Fig. 17 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 46.

La Fig. 18 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 47.

La Fig. 19 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de plaqueta utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 48.

La Fig. 20 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados utilizando el reactivo para medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 45.

La Fig. 21 muestra los diagramas de dispersión obtenidos por la medición de sangre que contiene partículas de lípido utilizando el reactivo para la medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 45.

Descripción de los Número de Referencia A Primer recipiente B Segundo recipiente 1 analizador de muestra 2 Unidad de medición 3 Unidad procesadora de datos 4 Sección de control 5 Sección de detección 6 Sección de preparación de muestra 7 Interfaz 8 Sección de control 9 Sección de análisis de datos 10 Sección de exhibición 11 Sección de operación 12 Interfaz 51 Célula de flujo 52 Fuente de luz láser 53 lentes de aplicación de luz 54 y 57 Fotodiodos 54a tapón de haz 54b Amplificador 55 Lente de condensación lateral 56 Espejo dicroico 57 Fotodiodo 57a y 58b Amplificadores 58 Fotomultiplicador 58a filtro óptico Mejor Modo para Realizar la Invención <Reactivo para la medición de plaquetas> Los presentes inventores han encontrado que las plaquetas pueden ser claramente distinguidas de los contaminantes en sangre tal como componentes de glóbulo distintos de las plaquetas o partículas de lípido usando azul de Nilo como tinte para teñir plaquetas en métodos para medición de plaquetas mediante citometría de flujo.

Además, los presentes inventores han conducido estudios extensos para las condiciones para la medición de plaquetas utilizando azul de Nilo y encontraron que los reactivo para medición de plaquetas tienen estabilidad de almacenamiento superior cuando (1) contiene hidrogenosulfato de azul de Nilo; o (2) contiene azul de Nilo y un ácido, para terminar la presente invención.

En la fórmula (II) anterior, el anión (contraión) de X incluye un ion de ácido inorgánico tal como ion sulfúrico (1/2 de S042"), ion de cloruro (Cl~), ion de hidrogenosulfato (HS04 ), ion perclórico (CIO4").

Los azules de Nilo anteriores están disponibles en el comercio y se adquieren de, por ejemplo, Sigma Aldrich, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Nacalai Tesque, Inc., Wako Puré Chemical Industries, Ltd., Kishida Chemical Co., Ltd. y similares.

Específicamente, el hidrogenosulfato de azul de Nilo puede adquirirse de Wako Puré Chemical Industries, Ltd. and Kishida Chemical Co., Ltd.

Azul de Nilo contenido en el reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención (por ejemplo hidrogenosulfato de azul de Nilo) se contiene preferiblemente en un reactivo de tinte en una proporción de concentración para obtener la concentración de 0.05 a 5.0 ppm, más preferiblemente 0.1 a 0.6 ppm, adicionalrñente preferiblemente 0.2 a 0.5 ppm cuando el reactivo para la medición de plaquetas se mezcla con una muestra. Por ejemplo, cuando el reactivo para la medición de plaquetas se mezcla con una muestra a la proporción de dilución de 1/50, la concentración de azul de Nilo en el reactivo para la medición de plaquetas es preferiblemente 2.5 a 250 ppm.

Las plaquetas son más claramente distinguidas de componentes de glóbulo con excepción de plaquetas o contaminantes, cuando el azul de Nilo está presente dentro de la proporción de concentración anterior.

En el aspecto en el cual el reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención comprende azul de Nilo y un ácido, el ácido puede ser de un ácido orgánico o ácido inorgánico, con la preferencia de un ácido inorgánico. El ácido inorgánico incluye oxo-ácidos tal como ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido perclórico, y hidroácidos tal como ácido clorhídrico, ácido hidrofluórico, ácido hidroyódico, ácido bromhídrico, ácido cianhídrico, ácido hidroisociánico, sulfuro de hidrógeno, azida de hidrógeno.

En el aspecto anterior del reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención, el ácido está contenido en el reactivo para la medición de plaquetas en la concentración que es igual o menor que la concentración molar de azul de Nilo en el reactivo para la medición de plaquetas. Específicamente, la proporción de las concentraciones molares de azul de Nilo y el ácido en el reactivo para la medición de plaquetas es preferiblemente 10:1 a 1:1. Cuando el ácido es ácido clorhídrico, la proporción de concentraciones molares de azul de Nilo y ácido clorhídrico es preferiblemente 3:1 a 1:1. Cuando el ácido es ácido sulfúrico, la proporción de concentraciones molares de azul de Nilo y ácido sulfúrico es preferiblemente 4:1 a 1:1. Usando el ácido en las concentraciones anteriores, la reducción de la concentración del componente de tinción efectiva de azul de Nilo en el reactivo para la medición de plaquetas con tiempo puede ser prevenida efectivamente, para poder mejorar la estabilidad de almacenamiento del reactivo para la medición de plaquetas.

En el aspecto anterior del reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención, cualquier combinación de azul de Nilo y ácido puede utilizarse. Las combinaciones más preferidas son: (a) Sulfato azul de Nilo y un oxo-ácido o un hidroácido; (b) Cloruro azul de Nilo y ácido sulfúrico; y (c) hidrogenosulfato de azul de Nilo y un oxo-ácido o hidroácido.

En otro aspecto del reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención, cuando el azul de Nilo es hidrogenosulfato de azul de Nilo, el reactivo para la medición de plaquetas no necesita contener un ácido. Cuando el azul de Nilo es hidrogenosulfato de azul de Nilo, la reducción en la concentración del componente de tinción efectiva de azul de Nilo en el reactivo para la medición de plaquetas con tiempo puede prevenirse con eficacia sin un ácido, para poder mejorar la estabilidad del almacenamiento de reactivo para la medición de plaquetas.

Las siguientes dos hipótesis pueden ser dadas en cuanto a porqué los reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención en los dos aspectos anteriores han mejorado la estabilidad de almacenamiento. (1) Se considera que el azul de Nilo tiene alta estabilidad cuando está en la forma de sal de hidrogenosulfato.

Cuando un ácido se agrega al sulfato azul de Nilo, un p protón (H + ) el cual es generado por la disociación de los enlaces ácidos a SO42" de sulfato azul de Nilo para formar HSO4", de modo que HSO4" y azul de Nilo están en equilibrio de 1:1 y estabilizados.

Cuando el azul de Nilo es una sal con excepción del anterior, el ácido sulfúrico puede agregarse, de modo que HS04" generado del ácido sulfúrico puede estabilizar el azul de Nilo.

Así, el reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención puede ser uno que comprende azul de Nilo y opcionalmente un ácido para que el ion de hidrogenosulfato exista en el reactivo. (2) El azul de Nilo contiene tres átomos de nitrógeno en su grupo dietilamino, grupo amino y estructura de fenoxazina. Entre estos átomos de- nitrógeno, los átomos de nitrógeno con excepción del que forma la sal con el contraanión representado por X" en la forma anterior de la fórmula una sal de adición de ácido, para que la estabilidad de los átomos de nitrógeno y la solubilidad del tinte sean mejoradas y la estabilidad del reactivo para la medición de plaquetas sea mejorada.

Esto es, el hidrogenosulfato de azul de Nilo puede generar un protón (H + ) e ion sulfúrico (S042 ) debido a la disociación del ion de hidrogenosulfato (HS04"). Este protón puede unir a cualquiera de los átomos de nitrógeno de azul de Nilo para producir un átomo de nitrógeno prótico. Se considera que este átomo de nitrógeno prótico forma una sal intermolecular vía ácido sulfúrico, y por lo tanto la solubilidad y estabilidad del tinte pueden mejorarse.

Cuando un ácido se agrega al azul de Nilo con excepción de la sal de hidrogenosulfato, se considera que un protón y un anión generados por la disociación del ácido contribuyen a la formación de sales intermoleculares de azul de Nilo, para poder mejorar la solubilidad y estabilidad del tinte.

Así, el reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención puede ser uno que comprende azul de Nilo y opcionalmente un ácido para que el azul de Nilo pueda formar una sal intermolecular.

El reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención comprende preferiblemente un solvente orgánico soluble en agua. El solvente orgánico soluble en agua no es específicamente limitado siempre y cuando puede disolver el azul de Nilo anterior e incluye solventes próticos tal como etilenglicol, dietilenglicol , poli (etilenglicol).

El reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención puede prepararse disolviendo el azul de Nilo anterior y opcionalmente el ácido en el solvente orgánico soluble en agua en la concentración antes deseada. <Kits de reactivo para la medición de plaquetas> El reactivo anterior para la medición de plaquetas puede combinarse con un reactivo que comprende un agente amortiguante para diluir el reactivo para la medición de plaquetas que comprende el tinte para formar un kit de reactivo.

Así, la presente invención también proporciona un kit de reactivo para la medición de plaquetas que comprende: un primer reactivo que comprende hidrogenosulfato de azul de Nilo, o azul de Nilo y un ácido (más adelante también designado " reactivo de tinte"); y un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante (más adelante también designado " reactivo de dilución").

Los detalles para el primer reactivo son los mismos que los descritos antes para el reactivo para la medición de plaquetas.

El agente amortiguante contenido en el segundo reactivo puede no ser específicamente limitado siempre y cuando pueda mantener el pH del segundo reactivo dentro de una proporción deseada, y puede ser carboxilatos, fosfatos, buenos amortiguadores, taurina, trietanolamina que depende del pH deseado. El agente amortiguante se contiene preferiblemente en el reactivo de dilución para así obtener la proporción del pH del reactivo de dilución de 6.0 a 11.0, más preferiblemente 7.0 a 10.0, y además preferiblemente 8.0 a 9.5. Cuando el pH del reactivo de dilución es 6.0 o mayor, los eritrocitos llegan a ser resistentes a lisis y los glóbulos rojos fragmentados de contaminantes pueden disminuirse sobre la mezcla del reactivo de dilución y una muestra. Cuando el pH es 11.0 o abajo, la teñir no específica de glóbulos rojos fragmentados puede ser reducida.

Así, el segundo reactivo es preferiblemente un amortiguador que tiene pH de 6.0 a 11.0.

El reactivo de dilución puede comprender, además del agente amortiguante, otros componentes tal como un osmótico, un agente de aceleración de teñido para acelerar el teñido de plaquetas por azul de Nilo.

El osmótico puede ser cualquier compuesto siempre y cuando pueda mantener la presión osmótica del reactivo de dilución dentro de una proporción apropiada, e incluye sales de metales alcalinos de un ácido orgánico tal como ácido propiónico, sacáridos tal como glucosa, mañosa. Los haluros de metales alcalinos tal como NaCl y haluros de metales alcalinotérreos pueden también utilizarse. Uno o más osmóticos pueden utilizarse.

El osmótico se contiene preferiblemente en el reactivo de dilución para ajustar la presión osmótica del reactivo de dilución de 150 a 600 mOsm/kg, y más preferiblemente 200 a 300 mOsm/kg. Ajusfando la presión osmótica dentro de la proporción anterior, la presión osmótica de la mezcla de los reactivos en el kit de reactivo y una muestra pueden estar más cercanos a la presión osmótica fisiológica, para poder prevenir la hemolisis debido a la hipotonicidad , el incremento de glóbulos rojos fragmentados pueden suprimirse y la medición de plaquetas puede ser más exacta. Cuando la presión osmótica del reactivo de dilución puede ajustarse dentro de la proporción anterior usando el agente amortiguante anterior, el osmótico no puede ser requerido.

El agente de aceleración de teñido puede ser cualquier compuesto que pueda incrementar la permeabilidad del azul de Nilo en plaquetas, e incluye tensioactivos, particularmente de manera preferible tensioactivos catiónicos.

El tensioactivo catiónico preferible es el que está representado por la siguiente fórmula (I): en. donde Rni es un grupo alquilo que tiene 8 a 12 átomos de carbono; R12, 13 y i son iguales o diferentes entre sí y son un grupo alquilo que tiene 1 a'6 átomos de carbono; e Y" es un anión.

En la fórmula anterior (I), el grupo alquilo que tiene 8 a 12 átomos de carbono de Rn puede ser lineal o ramificado e incluye, por ejemplo, octilo, decilo, laurilo, cetilo, miristilo y grupos similares.

El grupo alquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono de R12, R13 y R14 puede ser lineal o ramificado e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, pentilo, hexilo y grupos similares. Entre éstos, los grupos metilo y etilo son preferibles.

El anión de Y" es preferiblemente un ion de bromo o cloro.

Los tensioactivos catiónicos preferibles de fórmula (I) incluyen bromuro de deciltrimetilamonio (DTAB), bromuro de octiltrimetilamonio (OTAB), cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), bromuro de miristiltrimetilamonio (MTAB) y similares. Uno o más tensioactivos catiónicos pueden utilizarse.

El tensioactivo catiónico se contiene preferiblemente en el reactivo de dilución en la concentración de 50 a 20.000 ppm. La concentración particularmente preferible puede depender del tipo de los tensioactivos catiónicos y está preferiblemente de 500 a 3.000 ppm cuando se utiliza DTAB y 100 a 500 ppm cuando se utiliza LTAC. Cuando el reactivo de dilución contiene el tensioactivo catiónico en tales concentraciones, la hemolisis puede ser prevenida y el teñido de plaquetas puede acelerarse sobre la mezcla de los reactivo en el kit de reactivo para la medición de plaquetas y una muestra.

El reactivo de dilución puede comprender, además de los componentes anteriores, un conservador tal como 2-piridiltio-1 -óxido, ß-fenetilalcohol.

El agente amortiguante que se contiene en el reactivo de dilución y otros componentes que pueden contenerse opcionalmente en el reactivo de dilución pueden mezclarse con el reactivo de tinte anterior. Sin embargo, debido a que el azul de Nilo contenido en el reactivo de tinte puede degradarse con agua o un componente alcalino, el kit de reactivo separadamente comprende el reactivo de tinte y el reactivo de dilución es preferible debido a la estabilidad de almacenamiento.

El kit de reactivo para la medición de plaquetas de acuerdo con la presente modalidad puede contenerse en un primer recipiente A para contener el reactivo de tinte y un segundo recipiente B para contener el reactivo de dilución como se muestra en la Fig. 1. Cuando el reactivo de tinte y el reactivo de dilución se contienen en recipientes separados, la degradación del azul de Nilo contenida en el reactivo de tinte puede prevenirse debido al agua o un componente alcalino contenido en el reactivo de dilución, para poder proporcionar el kit de reactivo para la medición de plaquetas que tienen una estabilidad superior de almacenamiento. <Método para la medición de plaquetas> El reactivo o kit de reactivo para la medición de plaquetas se mezcla con una muestra que puede contener plaquetas, de tal modo tiñendo las plaquetas.

Así, la presente invención adicionalmente proporciona un método para la medición de plaquetas usando el reactivo o kit de reactivo para la medición de plaquetas.

El método para la medición de la presente invención comprende las etapas de: mezclar un primer reactivo que comprende hidrogenosulfato de azul de Nilo, o azul de Nilo y el ácido con una muestra para preparar una muestra de medición; aplicar luz a las células en la muestra de medición obtenida para detectar luz dispersada y fluorescencia emitidas desde las células; y detectar plaquetas contenidas en la muestra de medición basada en la luz. dispersada y fluorescencia detectadas.

En la etapa de mezclar el primer reactivo y una muestra en el método anterior, un segundo reactivo que comprende el agente amortiguante puede mezclarse adicionalmente o no mezclarse. Es preferible que el segundo reactivo se mezcle adicionalmente.

Los detalles para el primero y segundo reactivos son iguales que los descritos antes para el kit de reactivo para la medición de plaquetas.

La muestra incluye sangre (sangre entera, plasma rica en plaquetas (PRP) etc.) y el líquido de médula obtenido de organismos, particularmente de mamíferos incluyendo humanos.

La muestra puede ser sangre o fluido de médula diluido con una solución apropiada tal como amortiguador.

El primer reactivo y la muestra son preferiblemente mezclados para así obtener la concentración de azul de Nilo en la muestra de medición de 0.05 a 5.0 ppm, preferiblemente 0.1 a 0.6 ppm, y además preferiblemente 0.2 a 0.5 ppm.

El primer reactivo puede diluirse con el segundo reactivo para alcanzar la concentración anterior de azul de Nilo en la muestra de medición después de mezclar con la muestra.

Cuando se utiliza el segundo reactivo, el primero y segundo reactivos y la muestra se mezclan preferiblemente en la proporción de volumen de (primer reactivo + segundo reactivo): muestra = 100:1 a 1000:1.

Cuando se utiliza el segundo reactivo, la proporción de volumen entre el primero y segundo reactivos es preferiblemente 1:10 a 1:100, y preferiblemente 1:20 a 1:75.

Cuando el segundo reactivo se agrega en la etapa de mezclado, la orden de mezclado del primer reactivo, segundo reactivo y muestra no está específicamente limitada.

La etapa de mezclado puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 25 a 50°C, más preferiblemente de manera aproximada 35 a 45°C.

El tiempo para mezclarse es preferiblemente 10 segundos a 5 minutos, más preferiblemente 10 segundos a 2 minutos, y de manera adicional preferiblemente 10 segundos a 60 segundos.

En el método para la medición de la presente invención, la luz se aplica a las células en la muestra de medición obtenida así y se detectan luz dispersada y fluorescencia emitidas de las células.

Un aparato para aplicar luz es preferiblemente un citómetro de flujo. En el citómetro de flujo, la muestra de medición se introduce en una célula de flujo del citómetro de flujo y la luz se aplica a las células en la muestra de medición que pasa a través de la célula de flujo.

La fuente de luz del citómetro del flujo no es específicamente limitada y puede ser cualquier fuente de luz adecuada para la excitación del azul de Nilo (por ejemplo alrededor de 600 a 680 nm). La fuente de luz incluye, por ejemplo, láser semiconductor rojo y láser He-Ne. El láser semiconductor es adecuado debido a que es más barato que el láser de gas.

La luz'dispersada emitida de las células aplicadas con luz en el citómetro de flujo puede ser de luz dispersada hacia adelante (ángulo de recepción de luz de aproximadamente 0 a 20 grados) o luz dispersada lateral (ángulo, de recepción de luz de aproximadamente 90 grados). La luz dispersada hacia adelante puede ser de luz dispersada adelante a ángulo bajo (ángulo de recepción de luz de aproximadamente 1 a 5 grados) o luz dispersada hacia adelante a ángulo bajo (ángulo de recepción de luz de aproximadamente 6 a 20 grados).

La fluorescencia emitida de células aplicadas con luz en el citómetro de flujo puede detectarse seleccionando una longitud de onda de recepción de luz apropiada para azul de Nilo (aproximadamente 630 a 680 nm).

Basado en la luz dispersada y fluorescencia obtenidas antes, un diagrama de dispersión es preparado, a fin de detectar plaquetas, distinguiendo las plaquetas de contaminantes tal como componentes de glóbulos otras plaquetas, partículas de lípido. Las plaquetas así detectadas pueden también contarse. La detección y/o conteo de plaquetas es realizado preferiblemente usando un software analizador apropiado.

Las medidas de plaquetas utilizan un analizador de muestra equipado con un citómetro de flujo ahora se describen con referencia a las Figuras anexas.

La Fig. 2 es una vista frontal de la constitución esquemática del analizador de muestra. El analizador de muestra 1 es un aparato usado para pruebas hematológicas, por ejemplo, y se compone principalmente de una unidad de medición 2 y una unidad procesadora de datos 3. En la unidad de medición 2, ciertos componentes contenidos en una muestra de sangre se miden, y la unidad procesadora de datos 3 recibe los datos de medición para realizar un proceso analítico.

La Fig. 3 es un diagrama de bloque que muestra la constitución esquemática del analizador de muestra 1. Como se muestra en la Fig. 3, la unidad de medición 2 comprende una sección de control 4 para controlar la acción de secciones respectivas; una sección de detección 5 equipada con un citómetro de flujo para detectar partículas que se analizarán en la muestra; una muestra de preparación de sección 6 para preparar una muestra de medición y proporcionar la muestra de medición preparada a la sección de detección 5; y un interfaz 7 para los datos de transmisión con la unidad procesadora de datos 3. La unidad procesadora de datos 3 comprende una sección de control 8 para controlar la acción de secciones respectivas; una sección analizadora de datos 9 para analizar los datos detectados recibidos de la unidad de medición 2; una sección de exhibición 10 que exhibe los resultados de análisis de la sección analizadora de datos 9 como diagramas de dispersión; una sección de operación 11 que acepta operaciones por un operador; y una interfaz 12 para datos de transmisión con la unidad de medición 2.

La constitución de la sección de detección 5 equipada con un citómetro de flujo ahora se describe con referencia en la Fig. 4. La Fig. 4 es una vista plana esquemática que muestra la constitución de la sección de detección. La sección de detección 5 se proporciona con una fuente de luz láser del semiconductor 52 para emitir un haz de láser hacia una célula de flujo 51. Entre la fuente de luz láser del semiconductor 52 y la célula de flujo 51, las lentes de aplicación de luz 53 que consisten de una pluralidad de lentes se proporcionan. En un eje de luz ampliado linealmente desde la fuente de luz láser del semiconductor 52, un tapón de haz 54a se proporciona para así estar opuesto a las lentes de aplicación de luz 53 a través de la célula de flujo 51, de modo que la luz directa de la fuente de luz láser del semiconductor 52 sea interrumpida por el tapón de haz 54a. En una corriente abajo adicional del eje de luz del tapón de haz 54a, se proporciona un fotodiodo 54.

Cuando una muestra de medición pasa a través de la célula de flujo 51, la luz dispersadas y señales de fluorescencia son generadas debido a un de haz de láser. Entre las señales, la luz de señal frontal se emite hacia el fotodiodo 54. Entre los haces luminosos que van a lo largo del eje de luz linealmente extendido de la fuente de luz láser del semiconductor 52, la luz directa de la fuente de luz láser del semiconductor 52 es interrumpida por el tapón de haz 54a, y el fotodiodo 54 recibe principalmente la luz dispersada que va a lo largo de la fuente de luz (más adelante designada como "luz dispersada hacia adelante"). La luz dispersada hacia adelante emitida desde la célula de flujo 51 es transducida fotoeléctricamente en el fotodiodo 54, y la señal eléctrica así generada (más adelante designada como "señal de luz dispersada hacia adelante") se amplifica en un amplificador 54b. La señal de luz dispersada hacia adelante se hace salir a la sección de control 4, que sale adicionalmente a la unidad procesadora de datos 3 vía la interfaz 7, y procesada en la sección analizadora de datos 9 de la unidad procesadora de datos 3.

Tal señal de luz dispersada hacia adelante refleja el tamaño de partículas a detectarse. Procesando la señal de luz dispersada hacia adelante en la sección analizadora de datos 9, el tamaño de las partículas a detectarse es obtenido.

En la dirección que cruza a ángulos rectos con el eje de luz linealmente extendido desde la fuente de luz láser del semiconductor 52 al fotodiodo 54 se proporciona con un lente de condensación lateral 55, para así condensar la luz lateral con el lente de condensación lateral 55 que es generado aplicando un láser de semiconductor a partículas a detectarse cruzando a través de la célula de flujo 51 (luz la cual es emitida a la dirección que cruza en ángulos rectos con el eje de luz). En la corriente abajo de la lente de condensación lateral 55 en la dirección de la luz lateral se proporciona un espejo dicroico 56, para así dividir la luz de señal recibida desde la lente de condensación lateral 55 en un componente de luz dispersado y un componente de fluorescencia. En la dirección lateral del espejo dicroico 56 (la dirección que cruza con el eje de luz que conecta la lente de condensación lateral 55 y el espejo dicroico 56) se proporciona con un fotodiodo 57 para recibir la luz dispersada lateral, y en la corriente abajo del espejo dicroico 56 en la dirección del eje de luz se proporcionan con un filtro óptico 58a y un fotomultiplicador 58. El componente de luz dispersado lateral dividido en el espejo dicroico 56 está fotoeléctricamente transducido en el fotodiodo 57, y la señal eléctrica así generada (más adelante referida como "señal de luz dispersada lateral") se amplifica en un amplificador 57a. La señal de luz dispersada lateral se hace salir a la sección de control 4, saliendo adicionalmente a la unidad procesadora de datos 3 vía la interfaz 7, y procesada en la sección analizadora de datos 9 de la unidad procesadora de datos 3.

La señal de luz dispersada lateral refleja la información interna de las partículas a detectarse (por ejemplo el tamaño nuclear de leucocitos y similares). Procesando la señal de luz dispersada lateral en los sección analizadora de datos 9, el tamaño nuclear de leucocitos y similares es obtenido.

El componente de fluorescencia lateral emitido desde el espejo dicróico 56 se selecciona dependiendo de la longitud de onda en el filtro óptico 58a y fotoeléctricamente transducido en el fotomultiplicador 58. La señal eléctrica así generada (señal de fluorescencia lateral) se amplifica en un amplificador 58b. La señal de fluorescencia lateral se hace salir a la sección de control 4, saliendo adicionalmente a la unidad procesadora de datos 3 vía la interfaz, y procesada en la sección analizadora de datos 9 de la unidad procesadora de datos 3.

La señal de fluorescencia lateral refleja la información sobre el grado de teñido de las partículas a detectarse. Procesando la señal de fluorescencia lateral en la sección analizadora de datos 9, el grado de teñido de partículas a detectarse es obtenido.

La sección analizadora de datos 9 de la unidad procesadora de datos 3 puede analizar la señal de luz dispersada hacia adelante así obtenida, la señal de luz dispersada lateral y la señal de fluorescencia para detectar las partículas a detectarse, y además pueden contar las partículas detectadas. La sección analizadora de datos 9 genera adicionalmente los diagramas de dispersión basados en los resultados de análisis de la señal de luz dispersada hacia adelante, señal de luz dispersada lateral y señal de fluorescencia. El diagrama de dispersión generado es exhibido en la sección de exhibición 10.

Utilizando tal analizador de muestra, las plaquetas pueden medirse.

Primero, en la sección de preparación de muestra 6, una muestra es mezclada con un reactivo para la medición de plaquetas o con los reactivo contenidos en un kit de reactivo para la medición de plaquetas para preparar una muestra de medición. El reactivo y kit de reactivo para la medición de plaquetas a utilizarse pueden ser el reactivo y kit de reactivo para la medición de plaquetas descrita antes. En el reactivo para la medición de plaquetas o en el reactivo de tinte del kit de reactivo para la medición de plaquetas contiene azul de Nilo, para que las plaquetas contenidas en la muestra sean tiñeron con azul de Nilo.

En la sección de preparación de muestra 6, una muestra de medición es preparada preferiblemente mezclando una muestra y el reactivo para la medición de plaquetas o los reactivo contenidos en el kit de reactivo para la medición de plaquetas para obtener la concentración de azul de Nilo en la muestra de medición de 0.05 a 5.0 ppm (0.00014 a 0.014 mmol/l), preferiblemente 0.1 a 0.6 ppm, además preferiblemente 0.2 a 0.5 ppm. La temperatura y tiempo de reacción para preparar la muestra de medición es preferiblemente las que se describen antes por la temperatura y tiempo de reacción para el reactivo para medición de plaquetas.

La muestra de medición preparada en la sección de preparación de muestra 6 entonces se proporciona a la sección de detección 5. En la sección de detección 5, la muestra de medición se introduce en la célula de flujo 51 del citómetro de flujo, y un haz de láser es aplicado desde la fuente de luz láser del semiconductor 52 a las partículas a detectarse en la muestra de medición. La señal de luz dispersada hacia adelante, señal de luz dispersada lateral y señal de fluorescencia obtenidas aplicando el haz de láser a las partículas se procesa en la sección analizadora de datos 9 de la unidad procesadora de datos 3.

En la sección analizadora de datos 9, las' plaquetas en la muestra de medición son claramente distinguidas de otros componentes tal como glóbulos rojos fracturados o partículas de lípido contenidas en la muestra basada en la señal de luz dispersada hacia delante y señal de fluorescencia. En la sección analizadora de datos 9, las plaquetas así detectadas pueden también ser contadas. Para detectar y contar plaquetas basadas en la señal de luz dispersadas hacia adelante y señal de fluorescencia, el procesamiento de señales en la sección analizadora de datos 9 es realizada preferiblemente usando un software analizador apropiado.

En lo anterior, la constitución en la cual se detectan plaquetas basadas en la señal de luz dispersada hacia adelante y señal de fluorescencia. Sin embargo, otras constituciones tal como una en el cual se detectan plaquetas basadas en la señal de luz dispersada lateral y señal de fluorescencia pueden utilizarse.

EJEMPLOS La presente invención ahora se describe en detalles adicionales. Sin embargo, estos ejemplos no se desean para limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos Experimentales 1 a 8: Estabilidad de almacenamiento de reactivo para la medición de plaquetas que contenían hidrogenosulfato de azul de Nilo Para demostrar la estabilidad de almacenamiento del reactivo de tinte, los reactivos para las medición de plaquetas (reactivos de tinción) que contienen azul de Nilo mostrados en la Tabla 1 en las concentraciones mostradas en la Tabla 1 se prepararon, y absorbencia, un parámetro que refleja la concentración del componente de tinción efectiva de azul de Nilo en los reactivos de tinción, se midió para evaluar la estabilidad de almacenamiento de azul de Nilo en los reactivos de tinción.

Reactivo para la medición de plaquetas: Tinción en las concentraciones mostradas en la Tabla 1 Etilenglicol [Tabla 1] Ejemplos Tinte Concentración Experimentales 1 Hidrogenosulfato azul de Nilo 18.4 ppm (Hidrogenosulfato azul de Nilo, Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) 2 hidrogenosulfato del azul de Nilo 18.4 ppm (hidrogenosulfato azul de Nilo, Kishida Chemical Co., Ltd.) 3 Sulfato azul de Nilo 16.0 ppm (Sal de sulfato azul de Nilo, Sigma) 4 Sulfato azul de Nilo 16.0 ppm (Nile Blue, Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) 5 Sulfato azul de Nilo 16.0 ppm (Sulfato azul de Nilo, Nacalai Tesque, Inc.) 6 Sulfato azul de Nilo 16.0 ppm (Nile Blue A, Nacalai Tesque, Inc.) 7 Cloruro azul de Nilo 16.0 ppm (Cloruro azul de Nilo, Kishida Chemical Co., Ltd.) 8 Sulfato azul de Nilo 16.0 ppm (Nile Blue A, Kishida Chemical Co., Ltd.) Los reactivo de tinte obtenidos se diluyeron a 1/10 con etanol, y la absorbencia de cada reactivo de tinte se midió a 630 nm con un espectrofotómetro, en el cual el espectro de absorbencia del tinte es máximo. Las medidas de absorbencia se realizaron con utilizar etanol como una referencia. La absorbencia de los reactivos diluidos se midió después de 2-, 4- y 7-meses de almacenamiento a 45°C, y los porcentajes de cambio en absorbencia se calcularon. Los resultados de las medidas de absorbencia y porcentajes de cambio en absorbencia se muestran en las Tablas 2-1 y 2-2, respectivamente.

El "porcentaje de cambio en absorbencia" significa el porcentaje de cambio en absorbencia por el por ciento calculado usando el valor de absorbencia medido máximo como un valor estándar entre todos los valores de absorbencia obtenidos para el Ejemplo Experimental respectivo.

[Tabla 2-1] Ejemplo Inmediatamente 2 meses 4 meses 7 meses Experimental después de después después después dilución 1 0.3223 0.3141 0.3063 0.3001 2 0.3369 0.3250 0.3138 0.2799 3 0.3316 0.2919 0.2583 0.2285 4 0.3297 0.2803 0.2484 0.2178 5 0.3217 0.2729 0.2441 0.2117 6 0.3248 0.2790 0.2443 0.2119 7 0.3184 0.2696 0.2335 0.2023 8 0.3319 0.2825 0.2426 0.2234 [Tabla 2-2] Como se muestra en la Tabla 2-2, la reducción en absorbencia del reactivo de tinte del Ejemplo Experimental 1 que contuvo el hidrogenosulfato de azul de Nilo como el tinte fue 2.5%, 5.0% y 6.9% después de 2 meses, 4 meses y 7 meses, respectivamente. La reducción en absorbencia del reactivo de tinción del Ejemplo Experimental 2 que también contuvo hidrogenosulfato de azul de Nilo como el tinte fue 3.5%, 6.9% y 16.9% después de 2 meses, 4 meses y 7 meses, respectivamente.

Por una parte, la absorbencia de los reactivos de tinción de los Ejemplos Experimentales 3 a 8 que contuvieron azul de Nilo que tiene contraiones con excepción de ion de hidrogenosulfato se disminuyó por más del 10%, más del 20% y más del 30% después de 2 meses, 4 meses y 7 meses, respectivamente.

De las comparaciones con estos Ejemplos Experimentales 3 a 8, se encuentra que los reactivos de tinción que contienen azules de Nilo que tienen iones hidrogenosulfato como contraiones tienen menos reducción en absorbencia con el tiempo y la estabilidad de almacenamiento superior comparada a los reactivos de tinción que contienen azules de Nilo que tienen contraiones con excepción del ion de hidrogenosulfato.

Ejemplos Experimentales 9 a 13: La propiedad de teñido de plaqueta de los reactivo para medir plaquetas que comprende hidrogenosulfato de azul de Nilo Los siguientes experimentos se realizaron para demostrar la propiedad de teñido de plaqueta de los reactivo para medir plaquetas que comprenden hidrogenosulfato de azul de Nilo.

Los kits de reactivo que consisten de reactivos de tinción que tenían las siguientes composiciones y el reactivo de dilución se prepararon.

Reactivo de tinte Tinción para teñido de plaquetas En concentraciones mostradas en la Tabla 3 etilenglicol 1 I Reactivo de dilución Tricina (agente amortiguante) 1.8 g Cloruro de Lauriltrimetilamonio (LTAC) 0.15 g Agua purificada 11 (ajustado a pH 9.0 y presión osmótica 200 mOsm/kg.H20) Los tintes para medición de plaquetas usados fueron los mostrados en la Tabla 3 a concentraciones mostradas en la Tabla 3. Las concentraciones finales de los tienes después de mezclar los reactivos con una muestra se muestran entre paréntesis.

Las fórmulas químicas de los tintes se muestran en la Tabla 3.

El reactivo de dilución (1 mi de alícuotas) en tubos se calentó en un baño de agua a 40°C. Al reactivo de dilución se agregaron 20 µ? del reactivo de tinte y 5 µ? de sangre entera de humano sano como una muestra, y la reacción se realizó a 40°C durante 25 segundos para preparar muestras medidas. Las muestras medidas se introdujeron en una sección de detección de un citómetro de flujo que tiene una fuente de luz que emite luz con la longitud de onda de 633 nm, la luz de excitación se aplicó a las células en las muestras medidas, una señal de luz dispersada y señal de fluorescencia emitidas de las células se detectaron, las señales obtenidas se analizaron y las plaquetas en las muestras medidas se midieron. La preparación de muestras medidas y mediciones de plaquetas por citómetro de flujo se realizó en el analizador de sangre XE-2100 (Sysmex Corporation). La salida de la fuente de luz del analizador de sangre se modificó a 9W de la salida normal de 3W.

[Tabla 3] Los diagramas de dispersión obtenidos de los Ejemplos Experimentales 9 a 13 se muestran en las figs. 5 a 9, respectivamente. En cada Figura, (a) es un diagrama de dispersión que tiene el eje y de intensidad de luz dispersada hacia adelante y el eje x de intensidad de fluorescencia, y (b) es un diagrama de dispersión en el cual el eje y del diagrama de dispersión (a) se convierte a los logaritmos. En (b), el área donde aparecen las plaquetas se muestra" con una línea solida. Los resultados de medida de los Ejemplos Experimentales se muestran en la Tabla 3.

Como se muestra en las Figs. 5 a 9, cuando los Ejemplos Experimentales 9 y 10 se utilizaron que contuvieron el hidrogenosulfato de azul de Nilo como el tinte para teñido de plaquetas, las plaquetas se tiñeron comparadas suficientemente a los Ejemplos Experimentales 11 a 13 que contuvieron los tintes con excepción del azul de Nilo, de modo que las plaquetas se pudieran detectar en la región con una intensidad de fluorescencia mayor.

Así, cuando el hidrogenosulfato de azul de Nilo se utilizó como el tinte para teñido de plaquetas, las plaquetas pueden medirse con una mejor discriminación de otros componentes de glóbulo.

Después, se examinó si las plaquetas pueden teñirse específicamente usando ios reactivos de tinción de los Ejemplos Experimentales 9 y 10 que contienen hidrogenosulfato de azul de Nilo incluso cuando la sangre contiene los contaminantes tal como partículas de lípido.

Las medidas de plaqueta de sangre que contienen glóbulos rojos fragmentados y sangre que contiene partículas de lípido se realizaron con los reactivos de tinción de los Ejemplos Experimentales 9 y 10. Los procedimientos experimentales fueron los mismos como antes salvo que la sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados y sangre que contiene partículas de lípido se utilizaron en vez de sangre entera de humano sano.

Los diagramas de dispersión obtenidos de las medidas de sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados y sangre que contiene partículas de lípido que utilizan el reactivo de tinte del Ejemplo Experimental 9 se muestran en las Figs. 10 y 11. Los diagramas de dispersión obtenidos de las medidas de sangre que contienen glóbulos rojos fragmentados y sangre que contiene partículas de lípido que utilizan el reactivo de tinte del Ejemplo Experimental 10 se muestran en las Figs. 12 y 13. En cada Figura, (a) es un diagrama de dispersión que tiene el eje y de intensidad de luz dispersada hacia aderante y el eje x de intensidad de fluorescencia, (b) es un diagrama de dispersión en el cual el eje y del diagrama de dispersión (a) se convierte a los logaritmos, y (c) es una vista aumentada del área donde las plaquetas aparecen en (b). En (c), el área donde aparecen las plaquetas se muestra con una línea sólida.

Los resultados de las Figs. 10 a 13 muestran que los reactivos de tinción de los Ejemplos Experimentales 9 y 10 pueden específicamente teñir plaquetas con discriminación clara de glóbulos rojos fragmentados o partículas de lípido en sangre. Así, cuando el hidrógenosulfato de azul de Nilo se utiliza para teñir plaquetas, las plaquetas pueden medirse con discriminación clara de otros componentes de glóbulo, incluso cuando la sangre contiene contaminantes tal como glóbulos rojos fragmentos o partículas de lípido.

De acuerdo con los Ejemplos Experimentales 1 y 2, se muestra que los reactivos de tinción que contienen hidrogenosulfato de azul de Nilo tienen menos reducción en absorbencia con el tiempo y estabilidad de almacenamiento superior. Además, los Ejemplos Experimentales 9 y 10 muestran que el hidrogenosulfato de azul de Nilo como el tinte para el teñido de plaquetas puede teñir específicamente las plaquetas en sangre, y que permite realizar medidas de plaquetas exactas incluso cuando la sangre contiene contaminantes tal como glóbulos rojos fragmentados o partículas de lípido.

Ejemplos Experimentales 14 a 24: Propiedades de tinción de plaqueta de reactivos para la medición de plaquetas que contienen hidrogenosulfatos azul de Nilo ¾en varias concentraciones Los reactivos de tinción se prepararon que contienen hidrogenosulfato de azul de Nilo (Merck Co.) en las concentraciones indicadas en la Tabla 4 en eti'lenglicol.

Los reactivo de tinte obtenidos se combinaron con el reactivo de dilución descrito en los Ejemplos Experimentales 9 a 13 para la medición de plaquetas en las siguientes muestras: sangre entera, de humano sano, sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados y sangre que contiene partículas de lípido, al igual que en los Ejemplos Experimentales 9 a 13.

[Tabla 4] Los diagramas de dispersión obtenidos se muestran en la Fig. 14.

Los resultados en la Fig. 14 muestran que las plaquetas se midieron suficientemente con hidrogenosulfato de azul de Nilo en todas las concentraciones probadas.

Entre éstas, cuando la muestra, sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados, se probaron con los reactivo para la medición de plaquetas de los Ejemplos Experimentales 17 a 22 (concentración final de hidrogenosulfato de azul de Nilo: 0.24 a 0.44 mg/l), las plaquetas se discriminaron más claramente de otros componentes y contaminantes de glóbulo.

Ejemplo Experimental 25: Estabilidad de almacenamiento de reactivo para la medición de plaquetas que contienen hidrogenosulfato de azul de Nilo El reactivo de tinte se preparó conteniendo 14.4 ppm de hidrogenosulfato de azul de Nilo (Merck Co.) en etilenglicol. El reactivo de tinte se almacenó a la condición de temperatura de 45°C durante 16 semanas y utilizó para la medida de muestras.

Las muestras usadas fueron sangre tomada de humano sano, sangre de plaqueta baja, sangre que contiene lípido artificial y sangre que contiene glóbulos rojos fragmentados. Las plaquetas se midieron como se describe en los Ejemplos Experimentales 9 a 13.

Los diagramas de dispersión obtenidos se muestran en la Fig. 15.

Los diagramas de dispersión en la Fig. 15 muestran que las plaquetas podrán medirse con discriminación clara de contaminantes en todas las muestras.

Estos resultados muestran que, cuando se utiliza hidrogenosulfato de azul de Nilo como el tinte para teñir plaquetas, las plaquetas pueden medirse exactamente con poco efecto de contaminantes, incluso cuando el reactivo de tinte se almacena bajo condición desfavorable para el tinte.

El cambio en concentración de tinte durante almacenamiento bajo la condición anterior se examinó por los siguientes experimentos.

La absorbencia se midió como se describe en los Ejemplos Experimentales 1 a 8 salvo que el reactivo de tinte inmediatamente después de la preparación y el reactivo de tinte después de almacenamiento de 16 semanas se diluyeron a 1/10 con etanol y la absorbencia a 628 nm se midió. Basado en la proporción de reducción en la absorbencia medida, la concentración de tinte en el reactivo de tinte después de almacenamiento de 16 semanas se calculó. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 5.

[Tabla 5] Como se muestra en la Tabla 5, la concentración de tinte en la solución no diluida después de 16 semanas de almacenamiento de calculó como 13.1 ppm. Por lo tanto, se muestra que una concentración de tinte favorable para las medidas de plaqueta puede mantenerse incluso después del almacenamiento bajo la condición anterior.

Ejemplos Experimentales 26 a 29: Estabilidad de almacenamiento de reactivo para la medición de plaquetas que contienen azul de Nilo y ácido Los experimentos se realizaron para estudiar la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo que contienen ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo se evaluó midiendo la absorbencia que es un parámetro que refleja la concentración del componente de tinte efectiva de azul de Nilo en la solución.

En las siguientes descripciones, el "porcentaje de cambio en absorbencia" significa el porcentaje de cambio en absorbencia por el por ciento calculado usando el valor de absorbencia medido máximo como un valor estándar entre todos los valores de absorbencia obtenidos del Ejemplo Experimental respectivo.

En los presentes Ejemplos Experimentales, el azul de Nilo que tiene ion sulfúrico como contraión (azul de Nilo A, Sigma) se utilizó. Este azul de Nilo se disolvió en etilenglicol a la concentración de 0.02 mmol/l para preparar la solución de azul de Nilo (Ejemplo Comparativo 1).

A 5 mi de solución azul de Nilo se agregó la siguiente sustancia en la siguiente concentración para obtener los Ejemplos Experimentales 26 a 29.

Ejemplo Experimental 26 Acido clorhídrico 2 mmol/l 27 Acido clorhídrico 0.02 mmol/l 28 Hidróxido de sodio 2 mmol/l 29 Hidróxido de sodio 0.02 mmol/l Cada solución se diluyó a 1/5 con etanol, y la absorbencia de cada solución se midió a 630 nm con un espectrofotómetro , en el cual el espectro de absorbencia de tinte es máximo. Las soluciones diluidas se almacenaron bajo la condición de temperatura de 60°C, y absorbencia a 2 semanas y 4 semanas después de que la dilución se midió para calcular el porcentaje de cambio en absorbencia. El etanol se utilizó como control en la medida de absorbencia. Los resultados de las medidas de absorbencia y porcentajes de cambio en absorbencia se muestran en las Tablas 6-1 y 6-2, respectivamente.

[Tabla 6-1] Inmediatamente Después de 2 Después de después de la semanas 4 semanas preparación Ejemplo comparativo 1 0.5158 0.5033 0.4306 26 (HCI 2m ) 0.5388 0.0800 0.0055 Ejemplo 27 (HCI 0.02 mM) 0.5319 . 0.5286 0.4741 Experimental 28 (NaOH 2 mM) 0.0065 0.0017 0.0047 29 (NaOH 0.02 mM) 0.4948. 0.4721 0.3825 [Tabla 6-2] Como se muestra en la Tabla 6-1, la absorbencia inicial del Ejemplo Comparativo 1 fue 0.5158 a el cual el ácido clorhídrico o hidróxido de sodio no se agregó. Los porcentajes de cambio en absorbencia del Ejemplo Comparativo 1 fueron, como se muestra en la Tabla 6-2, -2.4% y -16.5% en 2 y 4 semanas después de la preparación, respectivamente.

Las absorbencias iniciales de los Ejemplos Experimentales 26 y 27 que contiene ácido clorhídrico fueron, como se muestra en la Tabla 6-1, 0.5388 y 0.5319, respectivamente, y estos valores no fueron significativamente diferentes de la absorbencia inicial del Ejemplo Comparativo 1.

Los porcentajes de cambio en absorbencia del Ejemplo Experimental 26 que contienen 2 mmol/l de concentración de ácido clorhídrico fueron -85.2% y -99.0% en 2 y 4 semanas, presentando reducción significativa en absorbencia con el tiempo compararon al Ejemplo Comparativo 1. Esto muestra, que la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo fue bajada.

Por una parte, los porcentajes de cambio en absorbencia del Ejemplo Experimental 27 que contiene 0.02 mmol/l de la concentración de ácido clorhídrico fue -0.6% y -10.9% en 2 y 4 semanas, mostrando que la reducción en absorbencia con el tiempo fue moderada comparada al del Ejemplo Comparativo 1. Esto muestra que la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul del Nilo fue mejorada.

Las absorbencias iniciales de los Ejemplos Experimentales 28 y 29 que contienen hidróxido de sodio fueron, como se muestra en la Tabla 6-1, 0.0065 y 0.4948, respectivamente, mostrando que la absorbencia inicial fue bajada comparada al Ejemplo Comparativo 1.

Los porcentajes de cambio en absorbencia de los Ejemplos Experimentales 28 y 29 fueron, como se muestra en la Tabla 6-2, debajo de -20% en 4 semanas después de la preparación, mostrando que la reducción en absorbencia con el tiempo fue significativa. Esto muestra que la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo se bajó.

Estos resultados experimentales sugirieron que la adición de ácido clorhídrico a ciertas concentraciones a soluciones de azul de Nilo puede mejorar la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo.

Ejemplos Experimentales 30 a 36: Efecto de proporción de concentración molar entre azul de Nilo y ácido clorhídrico en estabilidad de almacenamiento de reactivo para la medición de plaquetas Se encuentra que la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo es mejorada agregando cierta concentración de ácido clorhídrico, de acuerdo con los Ejemplos Experimentales 26 a 29.

Se considera que la reducción en la estabilidad de almacenamiento de soluciones de azul de Nilo, es decir, la reducción en la concentración del componente de tinte efectiva de azul de Nilo es debido a la degradación del componente de tinte efectiva, de modo que la concentración de ácido clorhídrico a agregarse a las soluciones debe examinarse con relación al número de moléculas de azul de Nilo.

Así, en los presentes Ejemplos Experimentales, las relaciones entre la proporción de azul de Nilo y ácido clorhídrico (proporción de concentración molar) y la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo se examinaron variando la proporción del ácido clorhídrico y azul de Nilo (proporción de concentración molar) en soluciones de azul de Nilo.

La estabilidad de almacenamiento de soluciones de azul de Nilo es examinada evaluando la absorbencia de las soluciones de azul de Nilo como similar a los Ejemplos Experimentales 26 a 29.

Como similar a los Ejemplos Experimentales 26 a 29, el azul de Nilo A (Sigma) se disolvió en etilenglicol a la concentración de 0.02 mmol/l para preparar la solución de azul de Nilo (Ejemplo Comparativo 2).

A 5 mi de la solución de azul de Nilo se agregó ácido clorhídrico en la siguiente concentración para obtener los Ejemplos Experimentales 30 a 36. Las proporciones de concentración molar entre el ácido azul e clorhídrico del Nilo en las soluciones se describen entre paréntesis.

Ejemplo Experimental 30 Acido clorhídrico 0.002 mmol/l (10: 1 ) 31 Acido clorhídrico 0.006 mmol/l (3:1 ) 32 Acido clorhídrico 0.02 mmol/l (1:1) 33 Acido clorhídrico 0.06 mmol/l (1:3) 34 Acido clorhídrico 0.2 mmol/l (1:10) 35 Acido clorhídrico 0.6 mmol/l (1:30) 36 Acido clorhídrico 2 mmol/l (1 : 00) Las soluciones de tinción obtenidas se diluyeron a 1/20 con etanol y absorbencia de cada solución se midieron a 630 nm con un espectrofotómetro, en el cual el espectro de absorbencia del tinte es máximo. Las soluciones de tinción se almacenaron bajo la condición de temperatura a 45°C, y absorbencia a 4 semanas, 9 semanas y 18 semanas después de que la preparación se medió para calcular el porcentaje de cambio en absorbencia. El etanol se utilizó como un control en la medida de absorbencia.

Los resultados de las medidas de absorbencia y porcentajes de cambio en absorbencia se muestran en las Tablas 7-1 y 7-2, respectivamente.

[Tabla 7-1] Como se muestra en la Tabla 7-1, la absorbencia inicial del Ejemplo Comparativo 2 fue 0.1342 al cual no se agregó ningún ácido clorhídrico. Los porcentajes de cambio en absorbencia del Ejemplo Comparativo 2 fueron, como se muestra en la Tabla 7-2, -10.0%, -12.5% y -26.5% en 4, 9 y 18 semanas después de la preparación, respectivamente.

Las absorbencias iniciales de los Ejemplos Experimentales 30 a 36 no fueron significativamente diferentes de la del Ejemplo Comparativo 2, como se muestra en la Tabla 7-1.

Los · porcentajes de cambio en absorbencia del Ejemplo Experimental 30 en el cuál la proporción de concentración molar entre azul de Nilo y ácido clorhídrico era 10:1 fueron -9.0%, -10.5% y -23.2% en 4, 9 y 18 semanas después de la preparación, respectivamente.

Los porcentajes de cambio eh la absorbencia del Ejemplo Experimental 31 en la cual la proporción de concentración molar entre azul de Nilo y ácido clorhídrico era 3:1 fueron -6.9%, -9.3% y -20.9% en 4, 9 y 18 semanas después de la preparación, respectivamente.

Los porcentajes de cambio en absorbencia del Ejemplo Experimental 32 en el cual la proporción de concentración molar entre azul de Nilo y ácido clorhídrico era 1:1 fueron -5.6%, -5.2% y -16.8% en 4, 9 y 1.8 semanas después de la preparación, respectivamente.

Como evidente de la comparación al Ejemplo Comparativo 2, la reducción en absorbencia de los Ejemplos Experimentales 30 a 32 en los cuales la concentración molar de ácido clorhídrico es menor que la de azul de Nilo que es moderada en cualquier momento de tiempo que el Ejemplo Comparativo 2 que no contiene el ácido clorhídrico. Así, la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo se mejora.

En particular, el Ejemplo Experimental 32 en el cual la proporción de concentración molar entre azul de Nilo y ácido clorhídrico fue 1:1 tiene mejor estabilidad de almacenamiento que otros Ejemplos Experimentales.

Ejemplos Experimentales 37 a 44: La estabilidad de almacenamiento de los reactivo para la medición de plaquetas que contienen azul de Nilo y ácido sulfúrico A continuación, la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo se estudió la cual contenía ácido sulfúrico en vez de ácido clorhídrico.

Como similar a los Ejemplos Experimentales 26 a 36, el azul de Nilo A (sigma) se diluyó en etilenglicol a la concentración de 0.02 mmol/l para preparar la solución de azul de Nilo (Ejemplo Comparativo 3).

A 5 mi de la solución de azul de Nilo se agregó ácido sulfúrico en la siguiente concentración para obtener los Ejemplos Experimentales 37 a 40. Las proporciones de concentración molar entre azul de Nilo y ácido sulfúrico en las soluciones se describen entre paréntesis.

Ejemplo Experimental 37 Acido sulfúrico 0.005 mmol/l (4: t) 38 Acido sulfúrico 0.01 mmol/l (2: 1) 39 Acido sulfúrico 0.02 mmol/l (1 : 1 ) 40 Acido sulfúrico 0.05 mmol/l (1: 2.5) Las soluciones de azul de Nilo se prepararon con de Nilo azul A que tiene ion sulfúrico como contraión (Nacalai Tesque, Inc.) en vez de azul de Nilo A (Sigma) usado en los Ejemplos Experimentales 37 a 40 (Ejemplo Comparativo 4).

A 5 mi de la solución de azul de Nilo se agregó ácido sulfúrico en la siguiente concentración para obtener los Ejemplos Experimentales 41 a 44. Las proporciones de concentración molar entre azul de Nilo y ácido sulfúrico en las soluciones se describen entre paréntesis.

Ejemplo Experimental 41 Acido sulfúrico 0.005 mmol/l (4: 1) 42 Acido sulfúrico 0.01 mmol/l (2: 1) 43 Acido sulfúrico 0.02 mmol/l (1: 1) 44 Acido sulfúrico 0.05 mmol/l (1 : 2.5) Las absorbencias inmediatamente después preparación de las soluciones de los Ejemplos Experimentales 37 a 44 se midieron. Cada solución se almacenó bajo la condición de temperatura a 45°C, y la absorbencia a 1 mes, 2 meses, 3 meses y 4 meses después de que la preparación se midió para calcular el porcentaje de cambio en absorbencia.

Los resultados de medidas de absorbencia y porcentajes de cambio en absorbencia de los Ejemplos Experimentales 37 a 40 se muestran en las Tablas 8-1 y 8-2, respectivamente.

Los resultados de las medidas de absorbencia y porcentajes de cambio en absorbencia de los Ejemplos Experimentales 41 a 44 se muestran en las Tablas 9-1 y 9-2, respectivamente.

[Tabla 8-1] [Tabla 8-2] Después de Después de 2 Después de Después de Inmediatament 1 mes meses 3 meses 4 meses e después de la preparación Ejemplo Comparativo 3 0.0% -0.1% -15.1% -22.0% -27.2% Ejemplo 37 (H2S04 0.0% 0.7% -11.8% -18.0% -23.0% Experimental 0.005 mM) 38 (H2S04 0.0% 4.2% 4.0% -8.6% -12.9% 0.01 mM) 39 (H2S04 0.0% 3.7% 0.3% -0.6% 0.0% 0.02mM) 40 (H2S04 0.0% -5.0% -4.6% -31.0% -49.7% 0.05 mM) [Tabla 9-1] [Tabla 9-2] Como es evidente en la Tabla 8-2, la reducción en absorbencia de los Ejemplos Experimentales 37 a 39 en los cuales la concentración molar de ácido sulfúrico contenida es menor que la del azul de Nilo es moderada en cualquier momento de tiempo comparada al del Ejemplo Comparativo 3 que no contiene ácido sulfúrico. Así, la estabilidad de almacenamiento de soluciones de azul de Nilo se mejora.

Adicionalmente como es evidente en la Tabla 9-2, la reducción en absorbencia de los Ejemplos Experimentales 41 a 43 en los cuales la concentración molar de ácido sulfúrico contenida es menor que la de azul de Nilo que es moderada en cualquier momento de tiempo comparada al Ejemplo Comparativo 4 que no contiene ácido sulfúrico. Así, la estabilidad de almacenamiento de las soluciones de azul de Nilo se mejora.

En particular, los porcentajes de cambio en absorbencia después de 4 meses de los Ejemplos Experimentales 39 y 42 en los cuales la proporción de concentración molar entre azul de Nilo y ácido sulfúrico era 2:1 a 1:1 fue 0.0% y -4.2%, respectivamente, mostrando particularmente estabilidad de almacenamiento favorable de la misma.

Así, se demuestra que^a estabilidad de almacenamiento de soluciones de azul de Nilo es mejorada agregando un ácido a las soluciones de azul de Nilo en la concentración a la cual es igual o menor que la concentración molar de azul de Nilo.

Incidentemente, las concentraciones óptimas de ácido sulfúrico en las soluciones de azul de Nilo fueron diferentes entre los Ejemplos Experimentales 37 a 40 y 41 a 44. Se considera ser debido a la diferencia en pureza del azul de Nilo contenida en los reactivo de azul de Nilo comerciales, y puede estar dentro del intervalo de un error.

Ejemplos Experimentales 45 a 48: Propiedad de tinción de plaqueta de reactivos para la medición de plaquetas que contienen azul de Nilo y ácido Los siguientes experimentos se realizaron para estudiar la propiedad de teñido de plaquetas de los reactivo para la medición de plaquetas que contienen azul de Nilo.

Los reactivos para plaquetas de medición y reactivo de dilución que tienen las siguientes composiciones se prepararon. (1) Reactivos para la medición de plaquetas Tinte para teñir plaquetas A las concentraciones mostradas en la Tabla 10 Etilenglicol 1 I (2) Solución de dilución Tricina (agente amortiguante) 1.8 g Cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC) 0.15 g Agua purificada 1 I (ajustado a pH 9.0 y presión osmótica 200 mOsm/kg.H20) Los tintes para medición de plaquetas usados fueron los tintes mostrados en la Tabla 10 en las concentraciones mostradas en la Tabla 10. Las concentraciones finales del tinte en la mezcla del reactivo, solución de dilución y una muestra se muestran entre paréntesis. Las fórmulas químicas de los tintes se muestran en la Tabla 10.

Las medidas de plaquetas se realizaron como se describe en los Ejemplos Experimentales 9 a 13.

[Tabla 10] Los diagramas de dispersión obtenidos con los Ejemplos Experimentales 45 a 48 se muestran en las Figs. 16 a 19, respectivamente. En cada Figura, (a) es un diagrama de dispersión que tiene el eje y de intensidad de luz dispersada hacia adelante y el eje x de la intensidad de fluorescencia, y (b) es un diagrama de dispersión en el cual el eje y del diagrama de dispersión (a) se convierte a los logaritmos. En (b), el área donde aparecen las plaquetas se muestra con una línea sólida.

Los resultados de medida con los Ejemplos Experimentales se muestran en la Tabla 10.

Como se muestra en la Fig. 16, cuando el Ejemplo Experimental 45 se utiliza en el cual el azul de Nilo se utilizó como el tinte, el grupo de plaquetas aparece en esté que tiene alta fluorescencia en el diagrama de dispersión, mostró que las plaquetas se tiñeron suficientemente.

Por una parte, cuando los Ejemplos Experimentales 46 a 48 se utilizan, en los cuales los tintes con excepción del azul de Nilo se utilizaron, el grupo de plaquetas se concentró en el área que tiene fluorescencia baja en el diagrama de dispersión, mostrando que las propiedades de teñido de plaquetas no fueron suficientes.

Así, se sugiere que, cuando el azul de Nilo se utiliza como el tinte para la medición de plaquetas, las plaquetas pueden suficientemente teñirse comparadas con los otros tintes. Además, se sugiere que, cuando las plaquetas se tiñeron con azul de Nilo, las plaquetas pueden detectarse exactamente con intensidad de luz dispersada hacia adelante e intensidad de fluorescencia.

Después, se estudió si las plaquetas podrían estar específicamente teñidas usando el reactivo para la medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 45 que contiene azul de Nilo y un ácido incluso cuando la sangre contuvo los contaminantes tal como partículas de lípido, de acuerdo con los experimentos similares como se describe en los Ejemplos 9 a 13.

Las Figs. 20 y 21 muestran los diagramas de dispersión obtenidos midiendo la sangre que contiene glóbulos rojos fracturados y sangre que contiene partículas de lípido con el reactivo para la medición de plaquetas del Ejemplo Experimental 45. En cada Figura, (a) es un diagrama de dispersión que tiene el eje y de intensidad de luz dispersada hacia adelante y el eje x de intensidad de fluorescencia, (b) es un diagrama de dispersión en el cual el eje y del diagrama de dispersión (a) se convierte a los logaritmos, y (c) es una vista aumentada del área donde las plaquetas aparecen en (b). En (c), el área donde aparecen las plaquetas se demuestra con una línea sólida.

Los resultados en las Figs. 20 y 21 muestran que los grupos de plaquetas contenidas en las muestras aparecen en los diagramas de dispersión distintivamente de otros componentes en las muestras tal como glóbulos rojos fracturados o partículas de lípido. De acuerdo con estos resultados, se demuestra que las plaquetas pueden distintivamente detectarse y medirse exactamente con los reactivo para la medición de plaquetas de la presente invención incluso cuando la sangre contiene los contaminantes tal como glóbulos rojos fracturados o partículas de lípido.

La presente solicitud se relaciona con la Solicitud de Patente Japonesa No. 2008-36013, 2008-79785 y 2008-247484 presentada respectivamente el 18 de febrero de 2008, 26 de marzo de 2008 y 26 de septiembre de 2008, cuyas reivindicaciones, especificaciones, dibujos y extractos se incorporan en la presente por referencia.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un reactivo para la medición de plaquetas que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, un compuesto de la siguiente fórmula (III):

2. Un kit de reactivo para la medición de plaquetas que comprende: un primer reactivo que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, un compuesto de la siguiente fórmula (III): ; y un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante.

3. El kit de reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 2, en donde el segundo reactivo es un amortiguador que tiene pH de 6.0 a 11.0.

4. El kit de reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 2, en donde el segundo reactivo tiene una presión osmótica de 150 a 600 15 mOsm/kg.

5. El kit de reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 2, en donde el segundo reactivo adicionalmente comprende un agente de aceleración de teñido para acelerar el teñido de plaquetas con el tinte.

6. El kit de reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 5, en donde el agente de aceleración de teñido es un tensioactivo catiónico.

7. Un método para la medición de plaquetas que comprende las etapas de: mezclar un primer reactivo que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, un compuesto de la siguiente fórmula (III): y una muestra con o sin adicionar un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante para preparar una muestra de medición; aplicar luz a las células en la muestra obtenida de medida para detectar luz dispersada y fluorescencia emitidas desde las células; y detectar plaquetas contenidas en la muestra de medición basada en la luz detectada y fluorescencia dispersadas.

8. El método para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 7, que comprende adicionalmente una etapa de contar las plaquetas detectadas.

9. Un reactivo para la medición de plaquetas que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, un compuesto de la siguiente fórmula (II): en donde el X" es un anión seleccionado del grupo HS04-que consiste de, 1/2 S042", Cl- y CI04 "; y un ácido.

10. El reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 9, en donde el ácido es un ácido inorgánico.

11. El reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 9, en donde la proporción de concentración molar entre el tinte y el ácido es 10:1 a 1:1.

12. Un kit de reactivo para la medición de plaquetas que comprende: un primer reactivo que comprende, como un tinte para teñir plaquetas, un compuesto de la siguiente fórmula (II): (II) en donde el X" es un anión seleccionado grupo que consiste de HS04\ 1/2 S042', Cl- y CIO4"; y un ácido; y un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante.

13. El kit de reactivo para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 12, en donde la proporción de concentración molar entre el tinte y el ácido en el primer reactivo es 10:1 a 1:1.

14. Un método para la medición de plaquetas que comprende las etapas de: mezcla de un primer reactivo que comprende un compuesto de la siguiente fórmula (II): en donde X" es un anión seleccionado del grupo que consiste de HS04" de, 1/2 S 042", Cl- y CI04"; y un ácido y una muestra con o sin agregar un segundo reactivo que comprende un agente amortiguante para preparar una muestra de medición; aplicar luz a células en la muestra de medida obtenida para detectar luz dispersada y fluorescencia emitidas de las células; y detectar plaquetas contenidas en la muestra de medición basada en dispersadas luz y la fluorescencia detectadas.

15. El método para la medición de plaquetas de conformidad con la reivindicación 14, el cuál adicionalmente comprende una etapa de contar plaquetas detectadas.